WO2004055211A2 - Compositions et methodes pour la detection et le traitement de pathologies neurodegénératives - Google Patents

Compositions et methodes pour la detection et le traitement de pathologies neurodegénératives Download PDF

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WO2004055211A2
WO2004055211A2 PCT/FR2003/003700 FR0303700W WO2004055211A2 WO 2004055211 A2 WO2004055211 A2 WO 2004055211A2 FR 0303700 W FR0303700 W FR 0303700W WO 2004055211 A2 WO2004055211 A2 WO 2004055211A2
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WO
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pgd2s
disease
exon
neurodegenerative
polypeptide
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PCT/FR2003/003700
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Inventor
Fabien Schweighoffer
Annelies Resink
Laurent Desire
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Exonhit Therapeutics Sa
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to compositions and methods for the detection and treatment of neurodegenerative pathologies. It describes in particular the identification of new metabolic pathways and new molecular targets involved in the development of neurodegenerative pathologies, as well as diagnostic and therapeutic approaches based on a modulation of these pathways or the activity of these targets.
  • the invention describes in particular the presence, in affected patients, of molecular alterations in the prostaglandin PGD2 synthesis pathway and allows the development of effective and specific therapeutic and diagnostic strategies.
  • the invention also relates to methods, tools, constructions and compositions adapted to the implementation of these strategies.
  • Alzheimer's disease is the leading cause of dementia and the most common neurodegenerative disease. This progressive disease is characterized by memory loss and a deterioration in language skills, orientation and judgment. The nature of the symptoms, often confused with the physiological inconveniences associated with old age, their severity as well as the age of their appearance, vary according to the individuals. This contributes to the difficulty of establishing a diagnosis in the early stages of the disease.
  • Intracellular neurofibrillary aggregates of the tau protein appear to be well correlated with the severity of dementia.
  • Senile plaques formed by intra aggregation and extracellular beta-amyloid peptide characterize regions of alterations of neurons and glial cells.
  • APP Amyloid Precursor Protein
  • PSI and PS2 presenilins 1 and 2
  • Ado E apolipoprotein E
  • an effective diagnostic test particularly early, would allow patients to benefit, from the onset of the disease, from treatment with acetylcholinesterase inhibitors such as tacrine, donepezil and rivastigmine, under more effective conditions than at present.
  • acetylcholinesterase inhibitors such as tacrine, donepezil and rivastigmine
  • the present application now describes the identification of new metabolic pathways and new molecular targets involved in the development of neurodegenerative pathologies, as well as diagnostic and therapeutic approaches based on a modulation of these pathways or the activity of these targets.
  • the invention describes in particular the presence, in affected patients, of molecular alterations in the prostaglandin PGD2 synthesis pathway and allows the development of effective and specific therapeutic and diagnostic strategies.
  • the patented DATAS technique was applied to mRNAs of brains controlled and affected by Alzheimer's disease.
  • the two groups correspond to individuals of equivalent ages so as not to introduce an aging-related bias.
  • PGD2S Prostaglandin D2 Synthase
  • This DATAS fragment corresponds at nucleotides 517 to 670 of the sequence from the Refseq library listed under the number nm_000954.
  • Exon 6 carries the stop codon of PGD2S, exon 7 being non-coding.
  • PGD2S is a protein located in the Golgi apparatus and also secreted into the cerebrospinal fluid from the choroid plexus. PGD2S plays a key role in the synthesis of prostanoids. It is involved in the production of prostaglandin D2 ("PGD2") which is the major prostaglandin produced in the central nervous system, acting as a neuromodulator and as a mediator of inflammatory phenomena. PGD2 is a precursor of prostaglandins J2.
  • prostaglandins are ligands for the PPAR gamma nuclear receptors and are involved in the growth of neurites and the increase in acetylcholinesterase activity.
  • PGD2 is formed by isomerization of PGH2 through the action of PGD2 synthase. Any alteration of the structure of PGDS2 can consequently lead to an alteration of its function and therefore to an alteration of the viability and functionality of neurons and in particular cholinergic neurons, which is particularly vulnerable in Alzheimer's disease.
  • prostaglandin D2 synthase is a bi-functional molecule.
  • PGD2S has the capacity to bind and therefore to transport lipophilic molecules such as retinoic acid into the cerebrospinal fluid.
  • retinaldehyde dehydrogenase an enzyme involved in the synthesis of retinoic acid, is mainly expressed in the choroid plexus just like PGD2S. It is therefore likely to consider PGD2S as a ligand for retinoic acid capable of carrying this molecule in the cerebrospinal fluid and therefore of regulating its local concentration.
  • the neurons which respond more particularly to retinoic acid during development and in adulthood correspond to the sites of significant synaptic plasticity.
  • One of the characteristics best correlated with cognitive decline during the progression of Alzheimer's disease is the loss of synaptic plasticity.
  • the present invention makes it possible to propose that this anomaly is consecutive to a deregulation of the expression of the mRNA of the PGD2S which results in an anomaly of regulation of the transport, the storage or the re-release of the retinoic acid necessary not only to neuronal viability but also to correct neuronal plasticity.
  • inhibition of PGD2S activity can lead to an increase in the concentration of PGH2, which has been shown to promote aggregation of the beta-amyloid peptide.
  • PGE2 stimulates the production by astrocytes of proinflammatory cytokines, IL6 and 1TL1, thus probably participating in the neurodegenerative processes.
  • PGE2 selectively blocks glycinergic neurotransmission which is inhibitory and therefore PGE2 promotes the phenomenon of excitotoxicity.
  • thyroid hormones and more particularly thyroxine which is capable of protecting the hippocampal neurons against stress induced in ischemic conditions, are capable of binding to PGD2S.
  • the importance of thyroid hormones in Alzheimer's disease is evidenced by the risk factor represented by hypothyroidism and by the association between thyroid defect and Down syndrome. It should be noted that the relevance of the association between PGD2S, thyroid hormones and Alzheimer's disease is reinforced by the presence of elements of transcriptional response to thyroid hormones in the promoter of the PGD2S gene.
  • a defect in thyroid hormones decreases the expression of PGD2S and a defect in PGD2S interferes with their transport, these two phenomena being able to contribute to the alteration of neurons and in particular cholinergic neurons.
  • the present invention makes it possible in particular to propose the detection of any modification of the PGD2S protein, of its messenger, gene, or of their expression, for the purposes of diagnosis of Alzheimer's disease or other neurodegenerative diseases.
  • the present invention also provides the bases for research and therapeutic use, for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease, of PGD2S activating compounds, in particular of compounds making it possible to compensate, at the level of forms of the unaltered enzyme, the effects of impaired function seen in patients.
  • the present invention also provides the bases for research and therapeutic use, for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease, of compounds making it possible to preferentially direct the conversion of PGH2 to PGD2, and not towards PGE2.
  • neurodegenerative diseases in particular Alzheimer's disease
  • inhibitors of PGE2 synthase in order to compensate for the lack of activity of PGD2S discovered by the inventors.
  • the invention also makes it possible to propose the combined use of cyclooxygenase inhibitors and PPAR agonists for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • the invention thus now offers new therapeutic and diagnostic approaches more specific to these pathologies, and also makes it possible to design more effective combination therapies.
  • a first object of the invention lies more particularly in a method for detecting a predisposition, the presence or the stage of development of a neurodegenerative disease in a subject, in particular Alzheimer's disease, comprising a step determining the presence, in a sample isolated from said subject, of an alteration in the PGD2S locus.
  • alteration is a form of splicing, the presence or relative amount of which increases or decreases in affected patients.
  • Another subject of the invention resides in a method of selecting or identifying compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising a step of determining the capacity of a test compound to increase the activity of PGD2S.
  • Another subject of the invention relates to a process for the selection or identification of compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising a step of determining the capacity of a test compound to decrease the activity of PGE2S.
  • the invention also relates to a method for producing a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising (i) the selection of active compounds according to the above methods, (ii) the synthesis of a compound thus selected or of a functional analog thereof and (iii) packaging of said compound or analog in the presence of a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also relates to the combined use of a PGE2S inhibitor and a PGD2S agonist for the preparation of a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, as well as a corresponding treatment method.
  • Another aspect of the invention resides in the combined use of a cyclooxygenase inhibitor and a PPAR agonist for the preparation of a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, as well as in a corresponding processing method.
  • the invention is particularly suitable for the detection, screening, diagnosis, monitoring or treatment, early or not, of Alzheimer's disease in humans.
  • neurodegenerative disease means any pathology linked to neuronal loss, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis and Huntington's chorea.
  • the invention is particularly suitable for the diagnosis or treatment of Alzheimer's disease.
  • PGD2S locus designates any sequence or any PGD2S product in a cell or an organism. This term notably includes nucleic acid sequences, coding or not, as well as protein sequences, mature or not.
  • the term PGD2S locus therefore includes all or part of genomic DNA, including its coding and / or non-coding regions (introns, regulatory sequences, etc.), RNAs (messengers, pre-messengers, etc.) and proteins (precursor, mature, soluble, secreted forms, etc.) of PGD2S, present in an organism, tissue or cell.
  • PGD2S gene refers to any nucleic acid encoding a PGD2S polypeptide. It can be genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), synthetic or semi-synthetic, mRNA, synthetic RNA, etc. It may be a recombinant or synthetic nucleic acid produced by techniques known to those skilled in the art, such as artificial synthesis, amplification, enzymatic cleavage, ligation, recombination, etc., from biological sources, available sequences or commercial material.
  • a PGD2S gene is typically in double-stranded form, although different forms may exist within the meaning of the invention.
  • the PGD2S gene sequence is available in certain databases, such as in particular RefSeq, No.
  • PGD2S gene sequences within the meaning of the invention can be isolated from samples, collections or synthesized. They may be sequences hybridizing under high stringency with a nucleic acid coding for the sequence SEQ ID NO: 1 presented below.
  • PGD2S polypeptide more particularly designates any polypeptide encoded by a PGD2S gene as defined above.
  • a specific example is provided below (SEQ ID NO: 1), corresponding to the sequence referenced in Genbank under the number NP_000945.1.
  • PGD2S polypeptide also includes, in the broad sense, any biologically active natural variant of the sequence identified above, which may result from polymorphisms, splicing, mutations, insertions, etc. Alteration
  • the alteration in the PGD2S locus can be of a diverse nature, such as in particular one or more mutations, insertions, deletions and / or splices in the gene or the RNA encoding PGD2S. It is advantageously a splicing, for example the appearance of a form of splicing of PGD2S or the modification of the relationship between different forms of splicing or between a non-spliced form and splicing forms .
  • the invention describes in particular the appearance of alternative forms of the mRNA encoding PGD2S in patients suffering from neurodegenerative pathology, and in particular of forms altered at the level of exon 6. Other forms can be envisaged and followed as part of this application.
  • PGD2S More specifically denotes a polypeptide whose primary structure is modified compared to the sequence presented above, this modification possibly resulting from one or more mutations, substitutions, deletions or insertions of one or more residues, said form being present in certain pathological tissues.
  • a particular form is represented in the sequences SEQ ID NO: 2 and 3, which represents a particular diagnostic or therapeutic target according to the invention.
  • combined use indicates that the different (typically two) active ingredients are administered to the subject so as to exert a combined therapeutic action.
  • combined use does not necessarily imply single packaging or simultaneous administration.
  • the two types of agents can be used separately or spaced over time, to produce a combined therapeutic action in a patient.
  • the active ingredients can be packaged separately, or in the same packaging but in separate containers.
  • the active agents can be administered according to different protocols, routes and dosages. In the case of simultaneous administration, this can be carried out at the same site or at different sites and routes of administration.
  • simultaneous administration this can be carried out at the same site or at different sites and routes of administration.
  • separate packaging generally remains more practical. Treatment
  • treatment designates preventive, curative or palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down the progression of the disease ), etc.
  • the treatment can also be carried out in combination with other active agents.
  • the invention makes it possible to improve the neuronal viability in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the viability of cholinergic neurons.
  • the invention makes it possible to improve the neuronal functionality in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the functionality of cholinergic neurons.
  • Another particular aspect of the invention relates to the improvement of cognitive function in subjects suffering from neurodegenerative pathology.
  • Another particular aspect of the invention relates to the improvement of neuronal plasticity in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular synaptic plasticity.
  • Another particular aspect of the invention relates to the improvement of the transport, storage and / or re-release of retinoic acid in the cerebrospinal fluid in subjects suffering from neurodegenerative pathology.
  • the present application now describes new methods for detecting, screening or monitoring the progress (and / or effectiveness of a treatment) of a pathology neurodegenerative or a predisposition to such a pathology in a subject, based on a determination of the presence of an alteration in the PGD2S locus.
  • the determination is typically carried out in a sample isolated from said subject, such as a sample of blood, urine, tissue, saliva, etc. It can be a biological fluid, a biopsy, etc., typically cerebrospinal fluid.
  • the sample preferably comprises nucleic acids or proteins.
  • the sample can be subjected to different treatments, for example lysis, centrifugation, purification, enrichment, etc., so as to make accessible or facilitate access to the proteins and / or nucleic acids which it contains. .
  • the determination of the presence of the alteration in the PGD2S locus can be carried out by various techniques, such as sequencing, selective hybridization, selective amplification and / or immunological detection, etc.
  • Methods that can be used to determine the presence or the quantity (absolute or relative) of proteins are based, for example, on immunoenzymatic reactions, such as ELISA, RIA, EIA, etc.
  • Techniques that can be used to determine the presence or the quantity (absolute or relative) of genes or RNA are for example PCR, RT-PCR, ligation chain reaction (LCR), the technique of PCE or TMA (" Transcriptional Mediated Amplification ”), gel migration, electrophoresis, in particular DGGE (“ denaturing gel gradient electrophoresis ”), etc.
  • the present application demonstrates, for the first time, a deregulation of the PGD2S locus in brains suffering from neurodegenerative disease, and therefore provides a reliable method of detection or diagnosis of these pathologies, in particular from the early phases, thus allowing optimization of the monitoring. patient therapy.
  • a particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with a nucleic probe specific for the PGD2S gene, and demonstrating hybridization.
  • the probe is more particularly specific to an altered form of the PGD2S gene, for example a mutated, deleted or spliced form.
  • the application describes the demonstration of a deregulation of the expression of the PGD2S mRNA in the affected brains, leading to the production of altered forms of the RNA, in particular of forms comprising one or more deletions, in particular a deletion in the region encoding the C-terminal part of PGD2S.
  • a specific variant has been highlighted, in which exon 6 in particular is deleted.
  • the probe used is specific for an altered form of PGD2S in which all or part of exon 6 is deleted. In another embodiment, the probe used is specific for an altered form of PGD2S in which all or part of an exon is deleted.
  • Other alterations are alterations in the structure of the RNA, especially in the 5'- and / or 3 '- untranslated regions.
  • a particular object of the invention also resides in a nucleic probe, characterized in that it comprises a complementary and specific sequence of a nucleic acid encoding a PGD2S polypeptide deleted from all or part of an exon, in particular of exon 6.
  • a probe of the invention comprises a complementary and specific sequence of a nucleic acid coding for a PGD2S polypeptide deleted from residues 517 to 670 of the coding sequence nm_000954.
  • a probe according to the invention typically comprises from 10 to 2000 nucleotides, preferably from 20 to 1000, more preferably from 30 to 800, and is generally single-stranded.
  • a particular example of a probe is represented by an oligonucleotide specific and complementary to a region of at least one nucleic acid as defined above.
  • the oligonucleotide is typically single-stranded, and generally has 10 to 100 bases.
  • the oligonucleotides and / or nucleic probes according to the invention can be labeled, for example by means of radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent markers, etc.
  • a probe complementary to a spliced (or deleted) domain, or to a retained domain, or to a junction region formed by splicing (typically) is used. or a deletion).
  • a complementary and specific probe of the region of the mRNA formed by the junction of nucleotides 516 and 671 is specific of the form spliced and allows its detection.
  • sequence of a particular variant of the invention is represented in the sequences SEQ ID NO: 2 (nucleic acid) and SEQ ID NO: 3 (corresponding sequence in amino acids).
  • sequence SEQ ID NO: 2 nucleic acid
  • SEQ ID NO: 3 corresponding sequence in amino acids.
  • the underlined residues correspond to exon 3
  • the bold residues correspond to intron retention (with the stop codon underlined)
  • the double-underlined residues correspond to exon 4.
  • the probes of the invention are complementary to a nucleic sequence comprising these junctions, in particular a nucleic sequence comprising ACAGTA or CAGGCC.
  • Special probes and molecules according to the invention are therefore nucleic acid molecules comprising a sequence chosen from ACAGTA and CAGGCC, preferably from TACAGTAC and CCAGGCCG, or their complementary strand.
  • Such molecules are typically single-stranded, optionally labeled, preferably less than 100 bases in length.
  • Another particular method for determining the presence of an alteration in the PGD2S locus involves contacting a sample from a subject with a nucleic acid primer or a pair of nucleic acid primers allowing the amplification of at least a portion of the PGD2S gene, and the detection of an amplification product.
  • the primer or the pair of primers used allows the amplification of a portion of the PGD2S gene specific for an altered form, for example of a portion comprising a mutation, deletion or splicing site.
  • the primer or pair of primers allows the amplification of all or part of an exon, for example exon 6, of the PGD2S mRNA, or of a region formed by the junction between two domains separating a spliced domain.
  • a particular object of the present application also relates to a pair of nucleic primers, characterized in that it comprises a 5 'primer and a 3' primer, each being complementary and specific to a region of the PGD2S gene and allowing the amplification of a portion of the specific nucleic acid of an altered form of PGD2S, in particular of a spliced, mutated or deleted form.
  • a primer according to the invention is typically single-stranded, and advantageously composed of 3 to 50 bases, preferably from 3 to 40 and even more preferably from 3 to 35 bases.
  • a preferred embodiment resides in a primer consisting of a single-stranded nucleic acid comprising from 3 to 50 nucleotides complementary to at least part of a region bordering (i) a mutation, (ii) an insertion or (iii ) an exon of the PGD2S gene (and in particular RNA), said mutation, insertion being present and / or said exon being spliced, in whole or in part, in pathological tissues, in particular exon 6.
  • bordering Indicates that the region is generally at most 300 ⁇ b distant from the targeted region (eg, from the mutation or the start of the exon or of the inserted sequence), more preferably from 200, 150, 100 or 50 at most.
  • the primers used allow the amplification of a junction as defined above.
  • a primer used is complementary to a junction as defined above (that is to say overlaps one of these junctions).
  • a primer can comprise, for example, a sequence chosen from ACAGTA and CAGGCC, preferably from TACAGTAC and CCAGGCCG, or their complementary strand.
  • Another particular method for determining the presence of an alteration in the PGD2S locus comprises sequencing all or part of the RNA coding for PGD2S obtained from a sample from a subject, and highlighting a altered sequence.
  • the nucleic acids of the sample can be treated before detection, for example by purification, amplification, cleavage, selection, etc.
  • Another particular method for determining the presence of an alteration in the PGD2S locus comprises bringing a sample from a subject into contact with a specific ligand for an altered PGD2S protein, in particular an antibody, and highlighting of a complex (eg, antigen-antibody).
  • a specific ligand for an altered PGD2S protein in particular an antibody
  • highlighting of a complex eg, antigen-antibody
  • the invention shows the presence of alterations of the PGD2S locus in patients, leading to the expression of altered forms of the PGD2S protein. It can be mutated, deleted forms or particular splices, the presence or relative amount of which is characteristic of the pathology.
  • the present invention therefore includes the detection of these protein forms, by means of specific ligands, as indicators of the subject's pathological state.
  • another subject of the invention relates to any antibody capable of binding, preferably selectively, to a PGD2S polypeptide as defined above, in particular to an altered form of a PGD2S polypeptide.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal. It can also be fragments and derivatives of antibodies having substantially the same antigenic specificity, in particular antibody fragments (eg, Fab, Fab'2, CDRs), humanized, polyfunctional, single-stranded antibodies (ScFv) , etc.
  • Antibodies can be produced using conventional methods, including immunizing an animal and recovery of serum (polyclonal) or spleen cells (so as to produce hybridomas by fusion with appropriate cell lines).
  • polyclonal antibodies from various species are described in the prior art.
  • the antigen is combined with an adjuvant (eg, Freund's adjuvant) and administered to an animal, typically by subcutaneous injection. Repeated injections can be given. Blood samples are collected and immunoglobulin or serum are separated.
  • Conventional methods of producing monoclonal antibodies include immunizing an animal with an antigen, followed by the recovery of spleen cells which are then fused with immortalized cells, such as myeloma cells. The resulting hybridomas produce monoclonal antibodies and can be selected by limiting dilutions so as to isolate the individual clones.
  • the Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced by digestion using a protease according to conventional techniques.
  • the invention also relates to a method for producing antibodies, comprising the injection (non-therapeutic) of a polypeptide as defined above or of an immunogenic fragment thereof into a non-human animal and the recovery of the antibodies or antibody producing cells.
  • the preferred antibodies are antibodies specific for altered forms of PGD2S, in particular for splicing forms, in particular deleted from all or part of the region encoded by an alternative exon, in particular by exon 6.
  • a particular variant of the PGD2S protein according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 3.
  • the 11 C-terminal residues constitute a sequence not present in the wild-type protein, and therefore represent a specific target for a diagnostic approach.
  • a particular object of the invention relates to a ligand (preferably an antibody or a fragment or variant as defined above) specific for the peptide TCPNDAAHTQA or for an epitope contained therein.
  • Another subject of the invention relates to the use of this peptide or of an epitope contained therein as immunogen for the production antibody.
  • Another object of the invention relates to the use of such specific ligands for the detection of a neurodegenerative pathology in a subject, according to the methods described above.
  • the invention relates to hybridomas producing the monoclonal antibodies described above and their use for producing said antibodies.
  • the antibodies can be coupled to heterologous fragments such as toxins, markers, drugs or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the markers can be chosen from radio-markers, enzymes, fluorescent agents, magnetic particles, etc.
  • the ligand e.g., antibody
  • the probe used can be in so ⁇ ub ⁇ e form or immobilized to a support. Immobilization on a support is advantageous, in particular for revealing the formation of the complex.
  • another object of the invention relates to a (product comprising a) support on which one or more nucleic acids or antibodies as defined above are immobilized.
  • the support can be solid, flat or not, regular or not, such as for example nylon, glass, plastic, metal, fiber, ceramic, silica, polymer, etc., or any other compatible material.
  • the nucleic acids or antibodies are preferably immobilized at one end, under conditions leaving the molecule accessible for a hybridization or immunological reaction, respectively.
  • the nucleic acids or antibodies can be precisely arranged on the support, and deposited in several copies.
  • Another object of the invention resides in a kit which can be used for implementing a method as defined above comprising i. a pair of primers or a probe or an antibody as defined above, and ii. the reagents necessary for amplification or for a hybridization or immunological reaction.
  • the methods and tools described above are particularly suitable for the detection and / or monitoring of Alzheimer's disease in subjects, including at early stages, and can thus make it possible to propose more effective therapeutic protocols.
  • Another object of the invention resides in methods of selection or identification of compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, as well as in the tools (eg, vectors, cells, etc.) usable for this purpose. effect.
  • the methods are based on the selection of compounds having the capacity to modulate a metabolic pathway identified in the invention, in particular the activity of PGD2S or PGE2S.
  • the invention indeed shows that the development of neurodegenerative pathologies is associated with a deregulation of the expression of PGD2S, leading to a deregulation of the PGH2 conversion pathways.
  • Compounds capable of directing the conversion of PGH2 to PGD2, or of promoting or stimulating this conversion, constitute candidates for the correction of these deregulations and therefore for the treatment of neurodegenerative pathologies.
  • the invention relates to a method of selecting or identifying compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising a step of determining the capacity of a test compound to increase l of PGD2S.
  • the process is advantageously carried out in vitro or ex vivo, in a cellular or acellular system.
  • the invention relates to a method for selecting or identifying compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising a step of determining the capacity of a test compound to decrease the activity of PGE2S.
  • this method comprises an additional step, carried out before, after or concomitantly, intended to test the absence of a pronounced inhibitory effect of the compound on the activity of PGD2S.
  • the process is advantageously carried out in vitro or ex vivo, in a cellular or acellular system.
  • the selection methods are advantageously carried out ex vivo or in vitro, in a cellular or acellular system. They can also be performed (or validated later) by tests in non-human mammals. These can be binding tests or functional tests (measurement of expression, activity, phenotype, etc.).
  • the determination of the activity of the target polypeptide may include a determination of the synthesis (e.g., transcription, translation, etc.), of the processing, of the transport or of the biological function of the polypeptide.
  • the methods of the invention comprise the selection of compounds which bind to the target polypeptide (PGD2S or PGE2S) or to the corresponding gene or RNA, or to a fragment thereof. Binding to the corresponding polypeptide, gene or RNA can be measured by various techniques, such as displacement of a labeled ligand, gel migration, electrophoresis, etc. It can be carried out in vitro, for example using the polypeptide or the gene immobilized on a support.
  • the invention therefore relates to a method of selecting compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising the incubation of a test compound with a target molecule chosen from a PGD2S polypeptide or PGE2S, a nucleic acid encoding it and a fragment thereof, under conditions allowing interaction between said test compound and said target molecule and, determining the formation of a complex between said test compound and said molecule target.
  • the compounds capable of forming such a complex can then be tested for other biological properties, in other systems.
  • the fragment used advantageously comprises at least at least 10 consecutive residues, preferably at least 20, from the entire target molecule.
  • the target polypeptide can be a wild-type polypeptide or an altered form as defined above, for example the form described in the sequences SEQ ID NO: 2 and 3.
  • the methods of the invention comprise the selection of compounds modulating the expression of the target polypeptide (PGD2S or PGE2S) or of the corresponding RNA.
  • the modulation of expression can be determined by assaying the RNAs or proteins, or by means of a reporter system.
  • This variant can be carried out in an acellular system or, preferably, in a cellular system.
  • the invention therefore relates to a process for selecting compounds active on neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising the in vitro or ex vivo incubation of a test compound with a (population of ) cell (s) expressing a target molecule chosen from a PGD2S or PGE2S polypeptide, a nucleic acid encoding the latter and a fragment thereof, and the determination of the ability of the test compound to modulate the expression of said target molecule, including its quantity in the cell.
  • the cells used in this variant can be any compatible cell, in particular eukaryotic or prokaryotic cells. Among the prokaryotic cells, mention may in particular be made of bacteria such as E. coli.
  • yeast cells or cells of mammals, insects or plants can be primary cultures or lines.
  • a cell is used which naturally expresses the target molecule, or which is modified to express said molecule, in particular recombinant cells.
  • Such recombinant cells can be prepared by the introduction of a recombinant nucleic acid expressing the polypeptide, or of a vector comprising the latter.
  • a cell expressing a target polypeptide is typically incubated with a test compound and the expression of said polypeptide is measured.
  • the level of expression measured in the presence of the test compound is advantageously compared to that observed in the absence of the test compound.
  • Compounds Capable of inhibiting (eg, reducing) the expression of PGE2S or increasing the expression of PGD2S constitute compounds of interest.
  • the selection methods can be carried out in different formats, such as for example multi-well plates, by testing multiple candidate compounds in parallel.
  • the invention also relates to recombinant polypeptides, nucleic acids, vectors and cells which can be used for implementing the methods described above.
  • the invention relates to any variant of splicing of a PGD2S polypeptide, in particular a variant comprising a deletion of all or part of the region encoded by exon 6. It also relates to variants of PGD2S polypeptide comprising one or more mutations, deletions, substitutions or deletions, characteristics of pathological tissue in patients with neurodegenerative disease.
  • the invention also relates to any nucleic acid encoding a polypeptide as defined above, as well as any vector comprising such a nucleic acid.
  • the vector can be a plasmid, cosmid, episome, artificial chromosome, virus, phage, etc. Mention may be made of various commercial plasmids such as pUC, pcDNA, pBR, etc.
  • the viral vectors mention may be made of retroviruses, adenoviruses, AAVs, herpesviruses, etc.
  • nucleic acids in particular single-stranded, optionally labeled, comprising a sequence chosen from ACAGTA and CAGGCC, preferably from TACAGTAC and CCAGGCCG, or their complementary strand.
  • polypeptides comprising the sequence TCPVDAAHTQA.
  • Another particular product of the invention is a nucleic acid encoding the human PGD2S protein, lacking residues 517 to 670.
  • Another subject of the invention relates to recombinant cells comprising a nucleic acid or a vector as defined above.
  • the cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the invention also relates to a method for producing a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, comprising (i) the selection of active compounds according to the above methods and (ii) the packaging said compound or a functional analog thereof in the presence of a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the functional analog is typically a compound derived from the active compound identified, by chemical modification, in particular with the aim of improving its activity or its pharmacokinetics, or with the aim of reducing its toxicity.
  • the functional analog may be a "pro-drug" of the identified compound.
  • Techniques for preparing functional analogs are well known to those skilled in the art, for example molecular modeling, coupling of NO groups, etc. The method can in this regard comprise an intermediate step of synthesis of the selected compound or of the functional analog thereof.
  • Another object of the invention lies in the use of a product as defined above (polypeptide or nucleic acid) for the in vitro diagnosis of a neurodegenerative disease, or for the monitoring of such diseases, or for l identification of active compounds.
  • the invention also relates to the use of a PGD2S agonist or PGE2S antagonist compound for the treatment of a neurodegenerative pathology, as well as a corresponding method of treatment.
  • the invention relates in particular to the combined use of a PGE2S inhibitor and a PGD2S agonist for the preparation of a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, as well as a method of corresponding treatment.
  • PGD2S agonist designates any compound stimulating or mimicking the activity of PGD2S in a cell. They are advantageously selective agonist compounds, that is to say in particular without a direct substantial activating effect on the activity of PGE2S.
  • PGE2S antagonist designates any compound which decreases the activity of PGD2S in a cell, preferably selectively, that is to say in particular without direct substantial inhibitory effect on the activity of PGD2S.
  • Such compounds can be chemical, peptide, antibody, antisense, etc. compounds. They can be selected or characterized or produced according to the methods described above.
  • Another aspect of the invention resides in the combined use of a cyclooxygenase inhibitor and a PPAR agonist for the preparation of a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease, as well as in a corresponding processing method.
  • the cyclooxygenase inhibitor is preferably a Cox2 inhibitor, in particular a specific Cox2 inhibitor. Mention may in particular be made, as specific examples, of the following compounds: Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, 1,5-diarylpyrazole derivatives, etc.
  • the PPAR agonist is advantageously a gamma PPAR agonist, preferably chosen from troglitazone, pioglitazone and rosiglitazone.
  • Another aspect of the invention resides in a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a cyclooxygenase inhibitor, in particular of Cox-2, and a PPAR agonist, in particular of PPAR gamma, for a combined use for the preparation of a medicament for the treatment of neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease.
  • the compounds can be administered by any method known to those skilled in the art, preferably by oral route or by injection, typically by intraperitoneal, intra-cerebral, intravenous, intra-arterial or infra-muscular route.
  • the doses administered can be adjusted by those skilled in the art. Typically, from 0.01 mg to 100 mg / kg approximately are injected, for inhibiting compounds of a chemical nature.
  • the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose. It is understood that repeated injections can be carried out, possibly in combination with other active agents or any pharmaceutically acceptable vehicle (eg, buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • the compounds of the invention can be formulated in the presence of any pharmaceutically acceptable vehicle (for example buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • the pharmaceutically acceptable vehicle or excipient can be chosen from buffer solutions, solvents, binders, stabilizers, emulsifiers, etc.
  • Buffer or diluent solutions include calcium phosphate, calcium sulfate, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, sodium chloride, starch, powdered sugar and hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (for delayed release).
  • Binders are for example starch, gelatin and filling solutes such as sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc.
  • Natural or synthetic gums can also be used, such as alginate, carboxymethylcellulose, methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, etc.
  • Other excipients are for example cellulose and magnesium stearate.
  • Stabilizing agents can be incorporated into the formulations, such as for example polysaccharides (acacia, agar, alginic acid, guar gum and fragacanth, chitin or its derivatives and cellulose ethers.
  • Solvents or solutes are for example the Ringer solution, l , distilled water, phosphate buffers, phosphate salt solutions, and other conventional fluids.
  • Another subject of the invention relates to a method for improving neuronal viability in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the viability of cholinergic neurons, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PGD2S agonist, optionally in combination with a PGE2S inhibitor.
  • Another subject of the invention relates to a method for improving the neuronal viability in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the viability of cholinergic neurons, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PPAR agonist, possibly in combination with a cyclooxygenase inhibitor.
  • Another subject of the invention relates to a method for improving the neuronal functionality in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the functionality of cholinergic neurons, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PGD2S agonist, possibly in combination with a PGE2S inhibitor.
  • Another subject of the invention relates to a method for improving neuronal functionality in subjects suffering from neurodegenerative pathology, in particular the functionality of cholinergic neurons, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PPAR agonist, possibly in combination with a cyclooxygenase inhibitor.
  • Another subject of the invention relates to a method for improving cognitive function in subjects suffering from neurodegenerative pathology, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PGD2S agonist, optionally in combination with a PGE2S inhibitor .
  • Another subject of the invention relates to a method for improving cognitive function in subjects suffering from neurodegenerative pathology, comprising the administration to a subject of an effective amount of a PPAR agonist, optionally in combination with a cyclooxygenase inhibitor.
  • the invention can be used in mammals, in particular in humans.
  • the DATAS technique (WO99 / 46403) has been applied to mRNAs of human brains with Alzheimer's disease.
  • the two groups correspond to individuals of equivalent ages so as not to introduce an aging-related bias.
  • PGD2S Prostaglandin D2 Synthase
  • This DATAS fragment corresponds at nucleotides 517 to 670 of the sequence from the Refseq library listed under the number nm_000954.
  • Exon 6 carries the stop codon of PGD2S, exon 7 being non-coding.
  • the PGD2S sequence is provided in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the identification of this fragment indicates a deregulation of the expression of the PGD2S mRNA in the brains affected by Alzheimer's disease compared to the control brains, which results in a deletion of the C-terminal end of the PGD2S.
  • compositions for the treatment of neurodegenerative diseases are provided.
  • the active compounds demonstrated in the context of the present invention can be used for the treatment of neurodegenerative pathologies. These compounds are in particular chosen from PGD2S agonists, PGE2S antagonists, and combinations thereof, optionally in combination with cyclooxygenase inhibitors and / or PPAR gamma agonists.
  • compositions comprise one or more vehicles or excipients chosen from buffer solutions, solvents, binders, stabilizers, amulsifier, etc.
  • Buffer or diluent solutions include dicalcium phosphate, calcium sulfate, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, sodium chloride, starch, powdered sugar and hydroxy propyl ethyl cellulose (HPMC) (for delayed release).
  • Binders are for example starch, gelatin and filling solutes such as sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc.
  • Natural or synthetic gums can also be used, such as alginate, carboxymethylcellulose, methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, etc.
  • Other excipients are for example cellulose and magnesium stearate.
  • Stabilizing agents can be incorporated into the formulations, such as for example polysaccharides (acacia, agar, alginic acid, guar gum and tragacanth, chitin or its derivatives and cellulose ethers.
  • Solvents or solutes are for example the Ringer solution, l , distilled water, phosphate buffers, phosphate salt solutions, and other conventional fluids.

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Abstract

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la détection et le traitement de pathologies neurodegénératives. Elle décrit notamment l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, d'altérations moléculaires dans la voie de synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques. L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en oeuvre de ces stratégies.

Description

COMPOSITIONS ET METHODES POUR LA DETECTION ET LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES NEURODEGENERATIVES
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la détection et le traitement de pathologies neurodégénératives. Elle décrit notamment l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, d'altérations moléculaires dans la voie de synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques. L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en œuvre de ces stratégies.
La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive, est caractérisée par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à l'orientation et au jugement. La nature des symptômes, souvent confondus avec les désagréments physiologiques liés à la vieillesse, leur sévérité ainsi que l'âge de leurs apparitions, varient selon les individus. Ceci contribue à la difficulté d'établir un diagnostic aux stades précoces de la maladie.
L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de neurones de l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué dans le raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont particulièrement affectés par cette déplétion.
Une autre anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de la maladie d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires de protéines. Des agrégats neurofibrillaires intracellulaires de la protéine tau semblent bien corrélés avec la gravité de la démence. Des plaques séniles formées par agrégation intra et extracellulaire de peptide beta-amyloïde caractérisent des régions d'altérations de neurones et de cellules gliales.
Il est cependant remarquable de noter que ces zones d'agrégation ne correspondent pas aux sites de la déplétion en synapses caractéristique du déclin des fonctions cognitives.
Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes sont associés au développement de la maladie. L'APP (Amyloid Precursor Protein ; précurseur du peptide beta amyloide), les présénilines 1 et 2 (PSI et PS2) et l'apolipoprotéine E(Apo E). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes aboutissent à une production accrue de peptide beta amyloïde, les mécanismes qui président aux pertes synaptiques et neuronales restent mal connus. Plusieurs hypothèses et mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent différents phénomènes: - le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide beta amyloide ;
- les phénomènes inflammatoires et la réponse immunitaire réactionnels ;
- les défauts d'hormones sexuelles ;
- les défauts d'insuline ; et
- l'hypothyroïdisme.
D'autres hypothèses soulignent le rôle des modifications des influx de calcium et de l'excitotoxicité. Toutefois, aucun élément ne permet de rentre compte de la vulnérabilité particulière des neurones cholinergiques.
Les traitements actuellement disponibles, basés sur l'utilisation d'inhibiteurs d'acétylcholinestérase, ne font qu'améliorer de façon transitoire les fonctions cognitives des patients et ne représentent pas une approche thérapeutique susceptible de ralentir la progression de la maladie d'Alzheimer et encore moins de la guérir.
Si de récentes observations soulignent la possibilité d'intervenir pharmacologiquement au niveau du métabolisme du cholestérol ou par des approches d'immunothérapie dirigée contre le peptide beta amyloide (ou peptide Aβ), il existe clairement un besoin de mieux comprendre les chemins de signalisation qui aboutissent à la mort neuronale, de façon à identifier d'autres cibles d'intérêt thérapeutique que les évidentes protéases qui participent à la maturation du peptide Aβ.
En outre, la mise à disposition d'un test de diagnostic efficace, notamment précoce, permettrait aux patients de bénéficier, dès le début de la maladie, d'un traitement par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, dans des conditions plus efficaces qu'à l'heure actuelle.
La présente demande décrit maintenant l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, d'altérations moléculaires dans la voie de synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques.
De façon à identifier le répertoire des événements d'épissage et liés également à toute autre modification qualitative des ARNm, la technique DATAS, brevetée, a été appliquée à des ARNm de cerveaux contrôles et atteints de la maladie d'Alzheimer. Les deux groupes correspondent à des individus d'âges équivalents de façon à ne pas introduire de biais lié au vieillissement. Parmi les clones identifiés figure un fragment d'ARNm correspondant à la Prostaglandine D2 Synthase (« PGD2S »), recouvrant une partie de l'exon 5, l'exon 6 ainsi qu'une partie de l'exon 7. Ce fragment DATAS correspond aux nucléotides 517 à 670 de la séquence de la banque Refseq répertoriée sous le numéro nm_000954. L'exon 6 porte le codon stop de la PGD2S, l'exon 7 étant non-codant.
L'identification de ce fragment indique une dérégulation de l'expression de l'ARNm de la PGD2S dans les cerveaux atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux cerveaux contrôles, qui aboutit à une délétion de l'extrémité C-terminale de la PGD2S. La PGD2S est une protéine localisée dans l'appareil de Golgi et également sécrétée dans le liquide céphalorachidien à partir du plexus choroïde. La PGD2S joue un rôle clef dans la synthèse des prostanoïdes. Elle intervient dans la production de la prostaglandine D2 (« PGD2 ») qui est la prostaglandine majeure produite dans le système nerveux central, agissant comme un neuromodulateur et comme un médiateur des phénomènes inflammatoires. La PGD2 est un précurseur des prostaglandines J2. Ces prostaglandines sont des ligands des récepteurs nucléaires PPAR gamma et sont impliquées dans la croissance des neurites et l'augmentation de l'activité de l'acétylcholinestérase. La PGD2 est formée par isomérisation de la PGH2 grâce à l'action de la PGD2 synthase. Toute altération de la structure de la PGDS2 peut par conséquent aboutir à une altération de sa fonction et par conséquent à une altération de la viabilité et de la fonctionnalité des neurones et notamment des neurones cholinergiques, particulièrement vulnérable dans la maladie d'Alzheimer.
D'autre part, la prostaglandine D2 synthase est une molécule bi-fonctionnelle. En plus de ses propriétés catalytiques, la PGD2S possède la capacité de lier et donc de véhiculer dans le liquide céphalorachidien des molécules lipophiliques telles l'acide rétinoïque. Il est remarquable de noter que la rétinaldéhyde déshydrogénase, enzyme intervenant dans la synthèse de l'acide rétinoïque, est exprimée de façon majoritaire au niveau du plexus choroïde tout comme la PGD2S. Il est donc vraisemblable d'envisager la PGD2S comme un ligand de l'acide rétinoïque capable de véhiculer cette molécule dans le liquide céphalorachidien et donc de réguler sa concentration locale. Les neurones qui répondent plus particulièrement à l'acide rétinoïque au cours du développement et à l'âge adulte correspondent aux sites de plasticité synaptique importante. L'une des caractéristiques les mieux corrélées avec le déclin cognitif au cours de la progression de la maladie d'Alzheimer est la perte de la plasticité synaptique. La présente invention permet de proposer que cette anomalie est consécutive à une dérégulation de l'expression de l'ARNm de la PGD2S qui a pour conséquence une anomalie de régulation du transport, du stockage ou du re-largage de l'acide rétinoïque nécessaire non seulement à la viabilité neuronale mais aussi à une plasticité neuronale correcte. De plus, l'inhibition de l'activité de la PGD2S peut entraîner une augmentation de la concentration de PGH2, dont il a été montré qu'elle favorise l'agrégation du peptide beta — amyloïde. En outre, il existe une autre voie de conversion de la PGH2, conduisant à la synthèse de PGE2, grâce à l'action de la PGE2 synthase récemment clonée. La PGE2 stimule la production par les astrocytes de cytokines proinflammatoires, l'IL6 et 1TL1, participant ainsi vraisemblablement au processus neurodégénératifs. De plus, la PGE2 bloque sélectivement la neurotransmission glycinergique qui est inhibitrice et donc la PGE2 favorise le phénomène d'excitotoxicité.
En outre, les hormones thyroïdiennes et plus particulièrement la thyroxine qui est capable de protéger les neurones de l'hippocampe contre le stress induit dans des conditions ischémiques, sont capables de se lier à la PGD2S. L'importance des hormones thyroïdiennes dans la maladie d'Alzheimer est attestée par le facteur de risque que représente l'hypothyroïdisme et par l'association entre défaut thyroïdien et syndrome de Down. Il est à remarquer que la pertinence de l'association entre PGD2S, hormones thyroïdiennes et maladie d'Alzheimer est renforcée par la présence d'éléments de réponse transcriptionnelle aux hormones thyroïdiennes dans le promoteur du gène de la PGD2S. Ainsi donc un défaut d'hormones thyroïdiennes diminue l'expression de la PGD2S et un défaut de PGD2S interfère avec le transport de celles-ci, ces deux phénomènes pouvant concourir à l'altération des neurones et notamment des neurones cholinergiques.
L'identification, par les inventeurs, d'altérations structurales et/ou fonctionnelles affectant la protéine PGDS2 chez des patients permet donc de proposer de nouvelles cibles et de nouvelles voies moléculaires pour le traitement ou le diagnostic de pathologies neurodégénératives, ainsi que pour le criblage de composés actifs.
La présente invention permet notamment de proposer la détection de toute modification de la protéine PGD2S, de son messager, gène, ou de leur expression, à des fins de diagnostic de la maladie d'Alzheimer ou autres maladies neurodégénératives. La présente invention fournit également les bases pour la recherche et l'utilisation thérapeutique, pour le traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, de composés activateurs de la PGD2S, notamment de composés permettant de compenser, au niveau des formes de l'enzyme non altérées, les effets liés à l'altération de la fonction observée chez les patients.
La présente invention fournit également les bases pour la recherche et l'utilisation thérapeutique, pour le traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, de composés permettant d'orienter préférentiellement la conversion de la PGH2 vers la PGD2, et non pas vers la PGE2. Outre l'utilisation de composés permettant la stimulation de la PGD2S, il peut en effet être proposé d'utiliser des inhibiteurs de la PGE2 synthase afin compenser le défaut d'activité de PGD2S découvert par les inventeurs.
L'intérêt de ces stratégies thérapeutiques découlant des informations présentées dans la présente invention apparaît sur la figure 1. Ces stratégies thérapeutiques sont à placer notamment en regard des tentatives de traitement qui ont été réalisées à l'aide d'inhibiteur d'activités cyclooxygénases, et plus particulièrement des inhibiteurs de cox2. Il est permis d'anticiper que ces stratégies présenteront une faible efficacité. En effet, les conséquences attendues de l'inhibition de la synthèse de PGH2 sont non seulement une inhibition de la production de PGE2 et donc de ses conséquences délétères pour le système nerveux central, mais aussi une inhibition des synthèses de PGD2 et PGJ2 et donc de leurs effets favorisant la viabilité et la fonctionnalité neuronale, voie métabolique identifiée par les inventeurs.
Dans ce contexte, sur la base des voies métaboliques caractérisées par les inventeurs, l'invention permet également de proposer l'utilisation combinée d'inhibiteurs de cyclooxygénases et d'agonistes de PPAR pour le traitement de maladies neurodégénératives . L'invention offre ainsi à présent des nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques plus spécifiques de ces pathologies, et permet également de concevoir des thérapies de combinaisons plus efficaces.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans une méthode de détection d'une prédisposition, de la présence, ou du stade d'évolution d'une maladie neurodégénérative chez un sujet, notamment de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la présence, dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, d'une altération dans le locus PGD2S. De préférence, l'altération est une forme d'épissage dont la présence ou la quantité relative augmente ou diminue chez les patients atteints.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à augmenter l'activité de la PGD2S.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus, (ii) la synthèse d'un composé ainsi sélectionné ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci et (iii) le conditionnement dudit composé ou analogue en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne également l'utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante.
Un autre aspect de l'invention réside dans l'utilisation combinée d'un inhibiteur de cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans une méthode de traitement correspondante.
D'autres éléments et aspects de l'invention sont notamment des protéines et acides nucléiques correspondant, codant des formes nouvelles de PGD2S, des vecteurs et cellules les contenant, des sondes et amorces spécifiques, ainsi que d'autres constructions, compositions et kits utiles à la mise en œuvre des méthodes ci-avant.
L'invention est particulièrement adaptée à la détection, au dépistage, au diagnostic, au suivi ou au traitement, en phase précoce ou non, de la maladie d'Alzheimer chez l'homme.
DEFINITIONS
Maladie Neurodégénérative: Au sens de l'invention, on entend par maladie neurodégénérative, toute pathologie liée à une perte neuronale, telle que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la Chorée de Huntington. L'invention est tout particulièrement adaptée au diagnostic ou au traitement de la maladie d'Alzheimer.
Locus PGD2S :
Dans le contexte de l'invention, le terme locus PGD2S désigne toute séquence ou tout produit PGD2S dans une cellule ou un organisme. Ce terme comprend notamment les séquences nucléiques, codantes ou non, ainsi que les séquences protéiques, matures ou non. Le terme locus PGD2S inclut donc tout ou partie de l'ADN génomique, y compris ses régions codantes et/ou non-codantes (introns, séquences régulatrices, etc.), des ARN (messagers, pré-messagers, etc.) et des protéines (formes précurseurs, matures, solubles, sécrétées, etc.) de PGD2S, présentes dans un organisme, tissu ou cellule.
Le terme « gène PGD2S » désigne tout acide nucléique codant un polypeptide PGD2S. II peut s'agit d'ADN génomique (ADNg), complémentaire (ADNc), synthétique ou semi-synthétique, d' ARNm, d' ARN synthétique, etc. Il peut s'agir d'un acide nucléique recombinant ou de synthèse, produit par les techniques connues de l'homme du métier, telles que la synthèse artificielle, l'amplification, le clivage enzymatique, la ligation, la recombinaison, etc., à partir de sources biologiques, de séquences disponibles ou de matériel commercial. Un gène PGD2S est typiquement sous forme double-brin, même si des formes différentes peuvent exister au sens de l'invention. La séquence de gènes PGD2S est disponible dans certaines banques de données, comme notamment RefSeq, n° NM_000954 (voir également White et al., JBC 267(32) (1992) 23202-23208). D'autres séquences de gènes PGD2S au sens de l'invention peuvent être isolées à partir d'échantillons, de collections ou synthétisées. Il peut s'agir de séquences hybridant en condition de stringence élevée avec un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO : 1 présentée ci-après.
Le terme polypeptide PGD2S désigne plus particulièrement tout polypeptide codé par un gène PGD2S tel que défini ci-avant. Un exemple spécifique est fourni ci-après (SEQ ID NO : 1), correspondant à la séquence référencée dans Genbank sous le numéro NP_000945.1.
1 MATHHTLWMG LALLGVLGDL QAAPEAQVSV QPNFQQDKFL GRWFSAGLAS 51 NSSWLREKKA ALSMCKSWA PATDGGLNLT STFLRKNQCE TRTMLLQPAG 101 SLGSYSYRSP HWGSTYSVSV VETDYDQYAL LYSQGSKGPG EDFRMATLYS 151 RTQTPRAELK EKFTAFCKAQ GFTEDTIVFL PQTDKCMTEQ
Le terme polypeptide PGD2S inclut également, au sens large, tout variant naturel biologiquement actif de la séquence identifiée ci-dessus, pouvant résulter de polymorphismes, épissage, mutations, insertions, etc. Altération
L'altération dans le locus PGD2S peut être de nature diverse, telle que notamment un(e) ou plusieurs mutations, insertions, délétions et/ou épissages dans le gène ou l'ARN codant PGD2S. Il s'agit avantageusement d'un épissage, par exemple de l'apparition d'une forme d'épissage de PGD2S ou de la modification du rapport entre différentes formes d'épissage ou entre une forme non-épissée et des formes d'épissage. Dans ce contexte, l'invention décrit notamment l'apparition de formes alternatives de l'ARNm codant PGD2S chez des patients atteints de pathologie neurodégénérative, et notamment de formes altérées au niveau de l'exon 6. D'autres formes peuvent être envisagées et suivies dans le cadre de la présente demande. Un forme altérée de PGD2S désigne plus spécifiquement un polypeptide dont la structure primaire est modifiée par rapport à la séquence présentée ci-dessus, cette modification pouvant résulter d'une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions ou insertions de un ou plusieurs résidus, ladite forme étant présente dans certains tissus pathologiques. Une forme particulière est représentée dans les séquences SEQ ID NO: 2 et 3, qui représente une cible diagnostique ou thérapeutique particulière selon l'invention.
Utilisation combinée
Le terme « utilisation combinée » indique que les différents (typiquement deux) principes actifs sont administrés au sujet de manière à exercer une action thérapeutique combinée. Toutefois, l 'utilisation combinée n'implique pas nécessairement un conditionnement unique ou une administration simultanée. Ainsi, les deux types d'agents peuvent être utilisés de manière séparée ou espacée dans le temps, pour produire une action thérapeutique combinée chez un patient. Dans ce cas, les principes actifs peuvent être conditionnés séparément, ou dans un même packaging mais dans des conteneurs séparés. En outre, les agents actifs peuvent être administrés selon des protocoles, voies et dosages différents. Dans le cas d'une administration simultanée, celle-ci peut être réalisée en un même site ou en des sites et voies d'administration différents. En outre, s'il peut être envisagé un conditionnement sous forme de mélange, un conditionnement séparé reste généralement plus pratique. Traitement
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif ou palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents actifs.
Selon un aspect particulier, l'invention permet d'améliorer la viabilité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la viabilité des neurones cholinergiques.
Selon un autre aspect particulier, l'invention permet d'améliorer la fonctionnalité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la fonctionnalité des neurones cholinergiques.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration de la fonction cognitive chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration de la plasticité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment de la plasticité synaptique.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration du transport, du stockage et/ou du re-largage de l'acide rétinoïque dans le liquide céphalorachidien chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative.
OUTILS ET METHODES DE DIAGNOSTIC
La présente demande décrit à présent de nouveaux procédés de détection, dépistage ou de suivi de l'évolution (et/ou de l'efficacité d'un traitement) d'une pathologie neurodégénérative ou d'une prédisposition à une telle pathologie chez un sujet, basés sur une détermination de la présence d'une altération dans le locus PGD2S.
La détermination est réalisée typiquement dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, tel que un échantillon de sang, urine, tissu, salive, etc. Il peut s'agir d'un fluide biologique, d'une biopsie, etc., typiquement de liquide céphalorachidien. L'échantillon comprend préférentiellement des acides nucléiques ou des protéines. Lorsque cela est souhaitable, l'échantillon peut être soumis à différents traitements, par exemple lyse, centrifugation, purification, enrichissement, etc., de manière à rendre accessible ou à faciliter l'accès aux protéines et/ou acides nucléiques qu'il contient.
La détermination de la présence de l'altération dans le locus PGD2S peut être effectuée par différentes techniques, telles que le séquençage, l'hybridation sélective, l'amplification sélective et/ou la détection immunologique, etc. Des méthodes utilisables pour déterminer la présence ou la quantité (absolue ou relative) de protéines sont basées par exemple sur des réactions immuno-enzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence ou la quantité (absolue ou relative) de gènes ou d'ARN sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA (« Transcriptional Mediated Amplification »), la migration sur gel, Pélectrophorèse, notamment la DGGE (« denaturing gel gradient electrophoresis »), etc.
La présente demande démontre, pour la première fois, une dérégulation du locus PGD2S dans les cerveaux atteints de maladie neurodégénérative, et fournit donc une méthode fiable de détection ou diagnostic de ces pathologies, notamment dès les phases précoces, permettant ainsi d'optimiser le suivi thérapeutique des patients.
Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde nucléique spécifique du gène PGD2S, et la mise en évidence d'une hybridation. La sonde est plus particulièrement spécifique d'une forme altérée du gène PGD2S, par exemple d'une forme mutée, délétée ou épissée. La demande décrit la mise en évidence d'une dérégulation de l'expression de l'ARNm de PGD2S dans les cerveaux atteints, conduisant à la production de formes altérées de l'ARN, notamment de formes comprenant une ou plusieurs délétions, en particulier une délétion dans la région codant la partie C-terminale de la PGD2S. Ainsi, un variant spécifique a été mis en évidence, dans lequel l'exon 6 notamment est délété. Dans un mode particulier de mise en œuvre, la sonde utilisée est spécifique d'une forme altérée de PGD2S dans laquelle tout ou partie de l'exon 6 est délétée. Dans un autre mode de réalisation, la sonde utilisée est spécifique d'une forme altérée de PGD2S dans laquelle tout ou partie d'un exon est délétée. D'autres altérations sont des altérations portant sur la structure de l'ARN, notamment dans les régions 5'- et/ou 3 '-non traduites.
Dans ce contexte, un objet particulier de l'invention réside également dans une sonde nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété de tout ou partie d'un exon, notamment de l'exon 6. A titre d'exemple spécifique, une sonde de l'invention comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété des résidus 517 à 670 de la séquence codante nm_000954.
Une sonde selon l'invention comprend typiquement de 10 à 2000 nucléotides, de préférence de 20 à 1000, plus préférentiellement de 30 à 800, et est généralement simple-brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un acide nucléique tel que défini ci-avant. L'oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Les oligonucléotides et/ou les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc. Pour la détection de formes d'épissages du gène PGD2S ou de délétions, on utilise typiquement une sonde complémentaire d'un domaine épissé (ou délété), ou d'un domaine retenu, ou d'une région de jonction formée par un épissage (ou une délétion). Ainsi, pour détecter la forme PGD2S délétée des résidus 517-670, il est possible d'utiliser une sonde complémentaire et spécifique de la région de l'ARNm formée par la jonction des nucléotides 516 et 671. Une telle région est spécifique de la forme épissée et permet sa détection.
La séquence d'un variant particulier de l'invention est représentée dans les séquences SEQ ID NO: 2 (acide nucléique) et SEQ ID NO: 3 (séquence correspondante en acides aminés). Dans la séquence SEQ ID NO: 2, reproduite ci-dessous, les résidus soulignés correspondent à l'exon 3, les résidus en gras correspondent à la rétention d'intron (avec le codon stop souligné), et les résidus en double-souligné correspondent à l'exon 4.
TCGCTCTCCCACACCΆCTGGCACCAGGCCCCGGTCACCCGCTCTGCTGCAGGAGAΆTGGCTACTCATCΆCACGCT GTGGATGGGACTGGCCCTGCTGGGGGTGCTGGGCGACCTGCAGGCAGCACCGGAGGCCCAGGTCTCCGTGCAGTC CAACTTACAGCAGGACAAGTTCCTGGGGCGCTGGTTCATCGCGGGCCTGGCCTACAACTCGAGCTGGCTCCGGGA GAAGAAGGCGGCGTTGTCCATGTGCAAGTCTGTGGTGGCCCCTGCCACGGATGGTGGCCTCAACCTGACCTCCAC CTTCCTCAGGAAAAACCAGTGTGAGACCCGAACCATGCTGCTGCAGCCCGCGGGGTCCCTCGGCTCCTACAGCTA CCGGAGTCCCCACTGGGGCAGCACCTACTCCGTGTCAGTGGTGGAGACCGACTACGACCAGTACGCGCTGCTGTG CAGCCAGGGCAGCAAGGGCCCTGGCGAGGACTTCCGCATGGCCACCCTCTACAGTACGTGCCCCGTGGACGCCGC CC-AC-ACGCΑG<-CCTGACCAGAGGGGGCTCCCC^
CTCCGΤCTCCACCCTGTCCCAGGCCGAACCCAGACCCCAGGTCTGAGTTAAAGGAGAAATTCAACGCCTTCTGCA GGCCAGGGGCTTCACAGAGGATACCATTGTTCTTCCTGGCCCCAAAACCGATAAGTGCATGACGGAAACAATAGG AATCCCCAGGGCTGAAGCTGGGAATCCGGCAGGCAGGTGAACCCCAG
Dans ce variant, il existe donc deux jonctions nouvellement créées, entre l'exon 3 et l'intron d'une part, et entre l'intron et l'exon 4 d'autre part. Ces nouvelles jonctions représentent des régions cibles spécifiques pour des approches diagnostiques. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, les sondes de l'invention sont complémentaires d'une séquence nucléique comprenant ces jonctions, notamment d'une séquence nucléique comprenant ACAGTA ou CAGGCC. Des sondes et molécules particulières selon l'invention sont donc des molécules d'acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi ACAGTA et CAGGCC, de préférence parmi TACAGTAC et CCAGGCCG, ou leur brin complémentaire. De telles molécules sont typiquement simple-brin, éventuellement marquées, de préférence d'une longueur inférieure à 100 bases.
Une autre méthode particulière pour déterminer la présence d'une altération dans le locus PGD2S comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce nucléique ou une paire d'amorces nucléiques permettant l'amplification d'une portion au moins du gène PGD2S, et la mise en évidence d'un produit d'amplification. Préférentiellement, l'amorce ou la paire d'amorces utilisée permet l'amplification d'une portion du gène PGD2S spécifique d'une forme altérée, par exemple d'une portion comprenant un site de mutation, délétion ou d'épissage. Dans un mode particulier de mise en œuvre, l'amorce ou la paire d'amorces permet l'amplification de tout ou partie d'un exon, par exemple de l'exon 6, de l'ARNm de PGD2S, ou d'une région formée par la jonction entre deux domaines séparant un domaine épissé.
A cet égard, un objet particulier de la présente demande concerne également une paire d'amorces nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une amorce 5' et une amorce 3', chacune étant complémentaire et spécifique d'une région du gène PGD2S et permettant l'amplification d'une portion de l'acide nucléique spécifique d'une forme altérée de PGD2S, notamment d'une forme épissée, mutée ou délétée. Une amorce selon l'invention est typiquement simple-brin, et avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases. Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins d'une région bordant (i) une mutation, (ii) une insertion ou (iii) un exon du gène (et notamment de l'ARN) PGD2S, ladite mutation, insertion étant présente et/ou ledit exon étant épissé, en tout ou en partie, dans les tissus pathologiques, notamment l'exon 6. Le terme « bordant » indique que la région est généralement distante de 300ρb au plus de la région ciblée (e.g., de la mutation ou du début de l'exon ou de la séquence insérée), plus préférentiellement de 200, 150, 100 ou 50, au plus.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, les amorces utilisées permettent l'amplification d'une jonction telle que définie ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation particulier, une amorce utilisée est complémentaire d'une jonction telle que définie ci-dessus (c'est-à-dire chevauche une de ces jonctions). Une telle amorce peut comprendre, par exemple, une séquence choisie parmi ACAGTA et CAGGCC, de préférence parmi TACAGTAC et CCAGGCCG, ou leur brin complémentaire.
Une autre méthode particulière de détermination de la présence d'une altération du locus PGD2S comprend le séquençage de tout ou partie de l'ARN codant PGD2S obtenu à partir d'un échantillon provenant d'un sujet, et la mise en évidence d'une séquence altérée.
Pour les méthodes de l'invention, les acides nucléiques de l'échantillon peuvent être traités avant détection, par exemple par purification, amplification, clivage, sélection, etc.
Une autre méthode particulière de détermination de la présence d'une altération du locus PGD2S comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un ligand spécifique d'une protéine PGD2S altérée, notamment un anticorps, et la mise en évidence d'un complexe (e.g., antigène-anticorps).
Comme indiqué, l'invention montre la présence d'altérations du locus PGD2S chez les patients, conduisant à l'expression de formes altérées de la protéine PGD2S. H peut s'agir de formes mutées, délétées ou d'épissages particuliers, dont la présence ou la quantité relative est caractéristique de la pathologie. La présente invention inclut donc la détection de ces formes protéiques, au moyen de ligands spécifiques, comme indicateurs de l'état pathologique du sujet.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne tout anticorps capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un polypeptide PGD2S tel que défini ci-dessus, notamment à une forme altérée d'un polypeptide PGD2S. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l' immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées sont décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous- cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés. Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'irnmunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles.
L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection (non thérapeutique) d'un polypeptide tel que défini ci-avant ou d'un fragment immunogène de ce dernier à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps. Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques de formes altérées de PGD2S, notamment de formes d'épissage, notamment délétées de tout ou partie de la région codée par un exon alternatif, notamment par l'exon 6.
Un variant particulier de la protéine PGD2S selon l'invention comprend la séquence SEQ ID NO:3. Dans cette séquence, les 11 résidus C-terminaux constituent une séquence non présente dans la protéine sauvage, et représentent donc une cible spécifique pour une approche diagnostique. Ainsi, un objet particulier de l'invention concerne un ligand (de préférence un anticorps ou un fragment ou variant tels que définis précédemment) spécifique du peptide TCPNDAAHTQA ou d'un épitope contenu dans celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ce peptide ou d'un épitope contenu dans celui-ci comme immunogène pour la production d'anticorps. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de tels ligands spécifiques pour la détection d'une pathologie neurodégénérative chez un sujet, selon les méthodes décrites précédemment.
L'invention concerne des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci- dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.
Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues telles que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc.
Pour la mise en œuvre des méthodes de détection, le ligand (e.g., anticorps) ou la sonde utilisé peuvent être sous forme soïubïe ou immobilisée à un support. L'immobilisation sur un support est avantageuse, notamment pour la révélation de la formation du complexe.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs acides nucléiques ou anticorps tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les acides nucléique ou anticorps sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation ou immunologique, respectivement. Les acides nucléiques ou anticorps peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en œuvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci- avant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.
Les procédés et outils décrits ci-avant sont particulièrement adaptés à la détection et/ou au suivi de la maladie d'Alzheimer chez des sujets, y compris à des phases précoces, et peuvent ainsi permettre de proposer des protocoles thérapeutiques plus efficaces.
OUTILS ET METHODES DE SELECTION
Un autre objet de l'invention réside dans des procédés de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans les outils (e.g., vecteurs, cellules, etc.) utilisables à cet effet.
Les procédés sont basés sur la sélection de composés ayant la capacité de moduler une voie métabolique identifiée dans l'invention, notamment l'activité de la PGD2S ou de la PGE2S. L'invention montre en effet que le développement de pathologies neurodégénératives est associé à une dérégulation de l'expression de la PGD2S, conduisant à une dérégulation des voies de conversion de la PGH2. Des composés capables d'orienter la conversion de PGH2 en PGD2, ou de favoriser ou stimuler cette conversion, constituent des candidats pour la correction de ces dérégulations et donc pour le traitement des pathologies neurodégénératives.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à augmenter l'activité de la PGD2S. Le procédé est avantageusement réalisé in vitro ou ex vivo, en système cellulaire ou acellulaire. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S. De préférence, ce procédé comprend une étape supplémentaire, réalisée avant, après ou de manière concomitante, destinée à tester l'absence d'effet inhibiteur prononcé du composé sur l'activité de la PGD2S. Le procédé est avantageusement réalisé in vitro ou ex vivo, en système cellulaire ou acellulaire.
Les procédés de sélection sont avantageusement réalisés ex vivo ou in vitro, en système cellulaire ou acellulaire. Ils peuvent également être réalisés (ou validés ultérieurement) par des essais chez des mammifères non-humains. Il peut s'agir de tests de liaison ou de tests fonctionnels (mesure d'une expression, d'une activité, d'un phénotype, etc.). La détermination de l'activité du polypeptide cible peut comprendre une détermination de la synthèse (e.g., transcription, traduction, etc.), de la maturation, du transport ou de la fonction biologique du polypeptide.
Dans une première variante, les méthodes de l'invention comprennent la sélection des composés se liant au polypeptide cible (PGD2S ou PGE2S) ou au gène ou à l'ARN correspondant, ou à un fragment de ceux-ci. La liaison au polypeptide, au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. Elle peut être réalisée in vitro, par exemple en utilisant le polypeptide ou le gène immobilisé sur un support. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne donc un procédé de sélection de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant l'incubation d'un composé test avec une molécule cible choisie parmi un polypeptide PGD2S ou PGE2S, un acide nucléique codant celui-ci et un fragment de ceux-ci, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit composé test et ladite molécule cible et, la détermination de la formation d'un complexe entre ledit composé test et ladite molécule cible. Les composés capables de former un tel complexe peuvent ensuite être testés pour d'autres propriétés biologiques, dans d'autres systèmes. Le fragment utilisé comporte avantageusement au moins 10 résidus consécutifs, de préférence au moins 20, provenant de la molécule cible entière. Le polypeptide cible peut être un polypeptide sauvage ou une forme altérée telle que définie précédemment, par exemple la forme décrite dans les séquences SEQ ID NO: 2 et 3.
Dans une deuxième variante, les méthodes de l'invention comprennent la sélection des composés modulant l'expression du polypeptide cible (PGD2S ou PGE2S) ou de l'ARN correspondant. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur. Cette variante peut être réalisée en système acellulaire ou, préférentiellement, en système cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne donc un procédé de sélection de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant l'incubation in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une (population de) cellule(s) exprimant une molécule cible choisie parmi un polypeptide PGD2S ou PGE2S, un acide nucléique codant celui-ci et un fragment de ceux-ci, et la détermination de capacité du composé test à moduler l'expression de ladite molécule cible, notamment sa quantité dans la cellule. Les cellules utilisées dans cette variante peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes. Parmi les cellules procaryotes on peut citer notamment les bactéries telles que E. coli. Parmi les cellules eucaryotes, on peut mentionner les cellules de levure ou les cellules de mammifères, d'insectes ou de plantes. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées. On peut citer les cellules COS, CHO, 3T3, HeLa, etc. On utilise typiquement une cellule exprimant naturellement la molécule cible, ou modifiée pour exprimer ladite molécule, notamment des cellules recombinantes. De telles cellules recombinantes peuvent être préparées par introduction d'un acide nucléique recombinant exprimant le polypeptide, ou d'un vecteur comprenant celui-ci.
Pour la mise en œuvre d'un test fonctionnel cellulaire, on incube typiquement une cellule exprimant un polypeptide cible avec un composé test et on mesure l'expression dudit polypeptide. Le niveau d'expression mesuré en présence du composé test est avantageusement comparé à celui observé en l'absence du composé test. Les composés capables d'inhiber (e.g., de réduire) l'expression de PGE2S ou d'augmenter l'expression de PGD2S constituent des composés d'intérêt.
Les procédés de sélection peuvent être réalisés en différents formats, comme par exemple en plaques multi-puits, en testant en parallèle de multiples composés candidats.
L'invention concerne également des polypeptides, acides nucléiques, vecteurs et cellules recombinantes utilisables pour la mise en œuvre des méthodes décrites ci-avant. En particulier, l'invention concerne tout variant d'épissage d'un polypeptide PGD2S, notamment un variant comprenant une délétion de tout ou partie de la région codée par l'exon 6. Elle concerne aussi des variants de polypeptide PGD2S comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions ou délétions, caractéristiques de tissus pathologiques chez des patients atteints de maladie neurodégénérative.
L'invention concerne également tout acide nucléique codant un polypeptide tel que défini ci-avant, ainsi que tout vecteur comprenant un tel acide nucléique. Le vecteur peut être un plasmide, cosmide, épisome, chromosome artificiel, virus, phage, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc.
Des exemples particuliers de produits selon l'invention sont notamment des acides nucléiques, notamment simple-brin, éventuellement marqués, comprenant une séquence choisie parmi ACAGTA et CAGGCC, de préférence parmi TACAGTAC et CCAGGCCG, ou leur brin complémentaire.
D'autres exemples de produits selon l'invention sont notamment des polypeptides comprenant la séquence TCPVDAAHTQA.
D'autres exemples de produits selon l'invention sont représentés par les séquences SEQ ID NO: 2 et 3, ou leurs fragments. Un autre produit particulier de l'invention est un acide nucléique codant la protéine PGD2S humaine, dépourvu des résidus 517 à 670.
Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinantes comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. Les cellules peuvent être procaryotes ou eucaryotes.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus et (ii) le conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. L'analogue fonctionnel est typiquement un composé dérivé du composé actif identifié, par modification chimique, notamment dans le but d'améliorer son activité ou sa pharmaco-cinétique, ou dans le but de réduire sa toxicité. L'analogue fonctionnel peut être une « pro-drogue » du composé identifié. Des techniques de préparation d'analogues fonctionnels sont bien connues de l'homme du métier, par exemple la modélisation moléculaire, le couplage de groupes NO, etc. Le procédé peut à cet égard comprendre une étape intermédiaire de synthèse du composé sélectionné ou de l'analogue fonctionnel de celui-ci.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un produit tel que défini ci-avant (polypeptide ou acide nucléique) pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénératives, ou pour le suivi de telles maladies, ou pour l'identification de composés actifs.
TRAITEMENT
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé agoniste de PGD2S ou antagoniste de PGE2S pour le traitement d'une pathologie neurodégénérative, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante. L'invention concerne notamment l'utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante.
Le terme agoniste de PGD2S désigne tout composé stimulant ou mimant l'activité de PGD2S dans une cellule. Il s'agit avantageusement de composés agonistes sélectifs, c'est-à-dire notamment sans effet activateur substantiel direct sur l'activité de la PGE2S
Le terme antagoniste de PGE2S désigne tout composé diminuant l'activité de PGD2S dans une cellule, préférentiellement de manière sélective, c'est-à-dire notamment sans effet inhibiteur substantiel direct sur l'activité de la PGD2S.
De tels composés peuvent être des composés chimiques, peptidiques, des anticorps, antisens, etc. Ils peuvent être sélectionnés ou caractérisés ou produits selon les méthodes décrites ci-avant.
Un autre aspect de l'invention réside dans l'utilisation combinée d'un inhibiteur de cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans une méthode de traitement correspondante.
L'inhibiteur de cyclooxygénase est préférentiellement un inhibiteur de Cox2, notamment un inhibiteur spécifique de Cox2. A titre d'exemples spécifiques, on peut citer notamment les composés suivants : Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, dérivés 1,5-diarylpyrazole, etc.
L' agoniste de PPAR est avantageusement un agoniste de PPAR gamma, choisi de préférence parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone.
Un autre aspect de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de cyclooxygénase, notamment de Cox-2, et un agoniste de PPAR, notamment de PPAR gamma, en vue d'une utilisation combinée pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
Les composés peuvent être administrés par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra- péritonéale, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou infra-musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (ex., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).
A cet effet, les composés de l'invention peuvent être formulés en présence de tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (par exemple tampons, solutions salines, isotoniques, en présence d'agents stabilisants, etc.). Le véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique peut être choisi parmi des solutés tampons, solvants, liants, stabilisants, émulsifiants, etc. Des solutés tampons ou diluants sont notamment le phosphate de calcium, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (pour libération retard). Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment l'alginate, la carboxymethylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc. D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des agents stabilisants peuvent être incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, gomme guar et fragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose. Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels. Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la viabilité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la viabilité des neurones cholinergiques, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PGD2S, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de PGE2S.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la viabilité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la viabilité des neurones cholinergiques, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PPAR, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de cyclooxygénase.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la fonctionnalité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la fonctionnalité des neurones cholinergiques, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PGD2S, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de PGE2S.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la fonctionnalité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment la fonctionnalité des neurones cholinergiques, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PPAR, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de cyclooxygénase.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la fonction cognitive chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PGD2S, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de PGE2S.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour améliorer la fonction cognitive chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un agoniste de PPAR, éventuellement en combinaison avec un inhibiteur de cyclooxygénase.
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.
EXEMPLES
Identification d'une altération de PGD2S
La technique DATAS (WO99/46403) a été appliquée à des ARNm de cerveaux humains contrôles et atteints de la maladie d'Alzheimer. Les deux groupes correspondent à des individus d'âges équivalents de façon à ne pas introduire de biais lié au vieillissement. Parmi les clones identifiés figure un fragment d'ARN correspondant à la Prostaglandine D2 Synthase (« PGD2S »), recouvrant une partie de l'exon 5, l'exon 6 ainsi qu'une partie de l'exon 7. Ce fragment DATAS correspond aux nucléotides 517 à 670 de la séquence de la banque Refseq répertoriée sous le numéro nm_000954. L'exon 6 porte le codon stop de la PGD2S, l'exon 7 étant non-codant. La séquence de la PGD2S est fournie dans la séquence SEQ ID NO :1.
L'identification de ce fragment indique une dérégulation de l'expression de l'ARNm de la PGD2S dans les cerveaux atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux cerveaux contrôles, qui aboutit à une délétion de l'extrémité C-terminale de la PGD2S.
Compositions pour le traitement des maladies neurodégénératives
Les composés actifs mis en évidence dans le cadre de la présente invention peuvent être mis en œuvre pour le traitement de pathologies neurodégénératives. Ces composés sont notamment choisis parmi des agonistes PGD2S, des antagonistes PGE2S, et des combinaisons de ceux-ci, éventuellement en association avec des inhibiteurs de cyclooxygénase et/ou des agonistes PPAR gamma. On peut citer comme composés spécifiques des anticorps anti-PGE2S (ou des fragments ou dérivés de ceux-ci), des antisens anti-PGE2S, des ARN inactivant PGE2S (siARN, ribozymes, etc.), des molécules mimant ou stimulant la synthèse ou l'activité biologique de PGD2S, des inhibiteurs de Cox2 choisis parmi Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, et des dérivés 1,5-diarylpyrazole ; des agonistes de PPAR gamma choisis parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone.
Ces composés peuvent être formulés de différentes manières, et notamment sous forme solide, liquide, de gel, sirop, poudre, aérosol, soluté injectable, etc. Des compositions typiques comprennent un ou plusieurs véhicules ou excipients choisis parmi des solutés tampons, solavnts, liants, stabilisants, amulsifiant, etc. Des solutés tampons ou diluant sont notamment le dicalcium phosphate, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl ethyl cellulose (HPMC) (pour libération retard). Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment l'alginate, la carboxymethylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc. D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des agents stabilisants peuvent être incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, guar gum et tragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose. Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection d'une prédisposition, de la présence, ou du stade d'évolution d'une maladie neurodégénérative chez un sujet, comprenant une étape de détermination de la présence, dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, d'une altération dans le locus PGD2S.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'altération dans le locus PGD2S est une mutation, une insertion, une délétion et/ou un épissage dans le gène ou l'ARN codant PGD2S, ou dans la protéine correspondante.
4. Méthode selon la revendication 3, comprenant la détermination de la présence d'une forme d'épissage de PGD2S ou de la modification du rapport entre différentes formes d'épissage.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'altération est détectée par séquençage, hybridation sélective et/ou amplification sélective.
6. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'un variant d'un polypeptide PGD2S, notamment d'un variant d'épissage comprenant une délétion de tout ou partie de la région codée par un exon épissé chez des patients atteints de maladie neurodégénérative, en particulier de l'exon 6.
7. Acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 6.
8. Vecteur comprenant un acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 6.
9. Sonde nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété de tout ou partie d'un exon, notamment de l'exon 6.
10. Sonde selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend de 10 à 2000 nucléotides, de préférence de 20 à 1000, plus préférentiellement de 30 à 800, et en ce qu'elle est simple-brin.
11. Sonde selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est complémentaire d'un domaine épissé, ou d'un domaine retenu, ou d'une région de jonction formée par un épissage dans l'ARN de PGD2S.
12. Paire d'amorces nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une amorce 5' et une amorce 3', chacune étant complémentaires et spécifique d'une acide région du gène PGD2S et permettant l'amplification d'une portion de l'acide nucléique spécifique d'une forme altérée de PGD2S, notamment d'une forme épissée.
13. Paire d'amorces selon la revendication 12, caractérisée en ce que les amorces sont simple-brin, composées de 3 à 50 bases, de préférence complémentaires d'une partie au moins d'une région bordant un exon du gène PGD2S qui est épissé, en tout ou en partie, dans les tissus pathologiques, notamment de l'exon 6.
14. Procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à augmenter l'activité de la PGD2S in vitro ou ex vivo.
15. Procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, comprenant une première étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S in vitro ou ex vivo, et une étape supplémentaire, réalisée avant, après ou de manière concomitante à la première, destinée à tester l'absence d'effet inhibiteur prononcé du composé sur l'activité de la PGD2S.
16. Procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon la revendication 14 ou 15 et (ii) le conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
17. Utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
18. Utilisation combinée d'un inhibiteur de cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'inhibiteur de cyclooxygénase est un inhibiteur de Cox2, choisi de préférence parmi les composés suivants : Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, et dérivés 1,5-diarylpyrazole.
20. Utilisation selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que l'agoniste de PPAR est un agoniste de PPAR gamma choisi de préférence parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone.
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