Compositions et Méthodes pour détecter les pathologies affectant la transmission neuromusculaire
La présente invention concerne des compositions et des méthodes in vitro, ex vivo ou in vivo de diagnostic de pathologie affectant la transmission neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique. La présente invention a trait plus spécifiquement à l'identification ou à la détection de l'expression du gène RTN3, permettant ainsi de diagnostiquer, de suivre l'évolution, éventuellement lors d'un traitement thérapeutique, d'un désordre lié à une affection neuromusculaire, telle que la sclérose latérale amyotrophique. Elle concerne aussi les différentes isoformes du gène RTN3, des sondes et des anticorps spécifiques de ces isoformes. Elle concerne également des procédés pour identifier, caractériser ou cribler des composés capables de moduler l'expression du gène RTN3, notamment l'expression de ses isoformes. Elle concerne également des méthodes de traitement de pathologie présentant un affection neuromusculaire.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie progressive pour laquelle il n'existe à l'heure actuelle que des techniques de physiologie globale (estimation du nombre d'unités motrices, force musculaire, capacité respiratoire) pour en faire le diagnostic et en évaluer l'évolution. En effet, en l'absence de marqueurs biologiques, le diagnostic précoce de la SLA repose actuellement sur l'analyse des symptômes et des signes cliniques. Le diagnostic de la SLA est défini par les critères d'El Escorial basés sur le type de neurones atteints (moteurs inférieurs ou supérieurs), sur la localisation des signes (bulbe, moelle cervicale, thoracique ou lombaire). Le degré de certitude du diagnostic est déterminé en fonction du nombre de critères remplis, la SLA certaine étant définie par une atteinte conjointe des neurones moteurs inférieurs et supérieurs dans le bulbe et au moins deux régions de la moelle épinière. Ce type de diagnostic est difficile à établir au début de la maladie et certains patients ne présentent pas les caractéristiques nécessaires à la classification.
Certains marqueurs biologiques sont toutefois utilisés pour le diagnostic. Ainsi, la présence d'une mutation SOD1 certifie le diagnostic de SLA. Cependant, étant donné que seulement 1 à 2 % des cas de SLA sont liés à de telles mutations, son absence n'a aucune signification. D'autres marqueurs ont été évoqués (dosage de la 3-nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2), mais leur utilisation en tant qu'outil-diagnostic est impossible en raison de leur non-spécificité à la
SLA. Le manque de sensibilité de ces moyens explique que la maladie est trop souvent reconnue tardivement, ce qui conduit à un retard dans la prise en charge de la maladie et notamment dans la mise en route des traitements neuroprotecteurs appropriés.
La présente invention propose un nouveau marqueur moléculaire détectable notamment à partir des biopsies musculaires et permettant de diagnostiquer le désordre de façon précoce. Les biopsies musculaires présentent l'avantage de correspondre à des prélèvements faciles et peu traumatisants pour les patients. La précocité des modifications de ce marqueur moléculaire permet un suivi de membres de familles à risque (prédiction), un diagnostic rapide et sûr, dès les premiers signes cliniques, un suivi de l'évolution de la maladie et de l'influence de traitements appropriés. Cette invention est applicable à d'autres pathologies où la transmission neuromusculaire est affectée, par exemple les myopathies.
Le marqueur moléculaire correspond plus spécifiquement à un produit du gène RTN 3. Le gène RTN 3 fait partie de la famille des gènes Réticulons dont différents membres ont récemment été étudiés et clones. La famille des réticulons (ou précédemment appelée Neuron-Specific Protein, NSP) est caractérisée par l'existence d'isoformes obtenus par épissage et/ou usage de promoteur alternatifs. Les inventeurs ont identifié et caractérisé le gène RTN3 et ses différentes isoformes.
Les inventeurs ont montré que le gène RTN3 est composé de 9 exons et s'étend sur 78 Kb. Les exons 1 et 4 à 9 codant le domaine RTN composent la séquence décrite par Moreira et al. (isoforme VI). Les exons nouvellement décrits dans la présente invention sont les exons 2, 3.1, 3.2 et 3.3. L'exon 3.2 correspond à la présence d'un site accepteur d'épissage dans l'exon 3.1, et l'exon 3.3 est synthétisé à partir d'un promoteur alternatif. Les séquences nucléotidiques et protéiques correspondant aux différents exons sont décrites dans le listage de séquence sous les SEQ ID indiquées dans le tableau 1.
L'invention concerne donc un polynucléotide comprenant, ou consistant, en une séquence nucléotidique sélectionnée parmi les séquences SEQ ID N° 30, 32, 34, et 36. Elle concerne également les séquences complémentaires de celles-ci ou des fragments de celles-ci. De préférence, les fragments comportent au moins 8 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 12, 15, 25 ou 50.
De plus, l'invention concerne un polypeptide comprenant, ou constistant, en une séquence
d'acides aminés sélectionnée parmi les séquences SEQ ID No 31, 33, 35, et 37. Elle concerne également des fragments de celles-ci. De préférence, les fragments comportent au moins 6 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 12, 15, 25 ou 50. L'invention concerne les acides nucléiques codant pour ces polypeptides.
Tableau 1
Les isoformes du gène RTN3 sont au nombre de sept, une seule (isoforme VI) ayant été précédemment décrite par Moreira et al. (Genomics, 1999 May 15 ;58(l)73-81 ; Genbank accession number : AF059524). En effet, Moreira et al ont décrit seulement 7 exons et une taille de 15 Kb pour le gène RTN 3 (Genbank Accession N°: AF059529). Les isoformes sont produites soit par épissage alternatif, soit par l'usage de promoteurs alternatifs. Au niveau protéique, ces isoformes se caractérisent par une région C terminale appelée domaine RTN (codée par les exons 4 à 9) et fortement homologue chez tous les gènes de la famille RTN.
Les différentes isoformes de RTN 3 sont plus précisément décrites dans le Tableau 2. Les séquences nucléotidiques et protéiques correspondant aux différentes isoformes sont décrites dans le listage de séquence sous les SEQ ID indiquées dans le tableau 2.
L'invention concerne les isoformes I, II, III, IV, V, et VII du gène RTN3 au niveau protéique et nucléotidique. Ainsi, elle concerne un polynucléotide comprenant, ou
consistant en, une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID 50, 52, 54, 56, 58, et 62 ainsi que leur séquence complémentaire. Elle concerne également un polypeptide comprenant, ou consistant en, un séquence sélectionnée par les séquences SEQ ID N° 51, 53, 55, 57, 59 et 63. Par ailleurs, l'invention concerne un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant, ou consistant, en un séquence sélectionnée par les séquences SEQ ID N° 51, 53, 55, 57, 59 et 63.
Par une étude immunologique utilisant un anticorps dirigé contre le domaine RTN (développé au laboratoire), les inventeurs ont mis en évidence l'existence d'isoformes protéiques pouvant correspondre aux isoformes d'ARN identifiées par leur étude in silico (Poids moléculaires attendus). De même, les inventeurs ont montré que l'expression de certaines isoformes du gène RTN3 peuvent être régulée en fonction des tissus, du développement cellulaire et de situations pathologiques (axotomie, myopathies) alors que l'expression d'autres isoformes est stable.
Ainsi, l'invention concerne tout vecteur comprenant un polynucléotide tel que décrit ci- dessus, toute cellule hôte comprenant un vecteur ou un polynucléotide tel que décrit ci- dessus, toute cellule exprimant un polypeptide recombinant tel que décrit ci-dessus, tout animal transgénique non-humain exprimant un polypeptide recombinant tel que décrit ci- dessus ou knock-out pour une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IV, V ou Vu. L'invention concerne également un procédé de production d'une ou plusieurs isoformes recombinantes parmi les isoformes I, II, III, IV, V et VII comprenant la transformation d'une cellule hôte par un ou plusieurs acides nucléiques codant pour la ou les isoformes à produire, et l'expression de la ou les isoformes.
L'invention concerne également un anticorps spécifique d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IV, N, et NIL De préférence, l'anticorps ne reconnaîtra pas l'isoforme NI. De préférence, l'épitope de l'anticorps selon la présente invention est localisé dans l'exon 2, 3.1, 3.2 ou 3.3. L'épitope peut également se situer à la jonction entre les exons 1 et 2, 1 et 3.1, 1 et 3.2, 2 et 3.1, 2 et 3.2, 3.1 et 4, 3.2 et 4, ou 3.3 et 4.
L'invention concerne tout oligonuclétide capable de bloquer ou de diminuer l'expression d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IN, N, et NIL De préférence, cet oligonucléotide n'aura aucun effet sur l'expression de l'isoforme NI. De préférence, cet oligonucléotide est un antisens ou un RΝAi. De préférence, cet oligonucléotide s'hybride spécifiquement avec l'exon 2, 3.1, 3.2 ou 3.3. Cet oligonucléotide peut également être spécifique des jonctions entre les exons 1 et 2, 1 et 3.1, 1 et 3.2, 2 et 3.1, 2 et 3.2, 3.1 et 4,
3.2 et 4, ou 3.3 et 4. De préférence, cet oligonucléotide contient au moins 8 nucléotides, de préférence au moins 10, 12, 15 ou 20 nucléotides.
En outre, l'invention concerne une sonde polynucléotidique spécifique d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, H, III, IV, V, et VII. De préférence, cette sonde s'hybride spécifiquement avec l'exon 2, 3.1, 3.2 ou 3.3. Cette sonde peut également être spécifique des jonctions entre les exons 1 et 2, 1 et 3.1, 1 et 3.2, 2 et 3.1, 2 et 3.2, 3.1 et 4, 3.2 et 4, ou
3.3 et 4. L'invention concerne également une amorce ou un couple d'amorces d'amplification spécifique d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IV, V, et VIL De préférence, l'une des amorces s'hybride spécifiquement avec l'exon 2, 3.1, 3.2 ou 3.3. Cette amorce peut également être spécifique des jonctions entre les exons 1 et 2, 1 et 3.1, 1 et 3.2, 2 et 3.1, 2 et 3.2, 3.1 et 4, 3.2 et 4, ou 3.3 et 4. De préférence, cette amorce d'amplification ou cette sonde contient au moins 8 nucléotides, de préférence au moins 10, 12, 15 ou 20 nucléotides.
A partir de ces observations, il est proposé ici des outils de diagnostic pour cette pathologie où la transmission neuromusculaire est affectée. Ces travaux représentent en effet la démonstration de la modification de l'expression du gène RTΝ-3 dans une pathologie neurodégénérative. La présente invention repose donc sur la découverte que l'expression du gène RTN 3, et notamment de certaines isoformes de celui-ci, est modulée chez des sujets présentant une pathologie liée à une affection neuromusculaire, telle que la sclérose latérale amyotrophique, cette modulation étant également constatée bien avant
l'apparition des signes cliniques et des troubles moteurs de la maladie. Les inventeurs ont utilisé un modèle isomorphe de la SLA constitué par une lignée de souris exprimant une forme mutée de la superoxyde dismutase a cuivre/zinc (souris SOD1 G86R). Ils ont ainsi trouvé de façon surprenante que l'expression de l'ARNm RTN3 est réprimée dans les moelles lombaires de souris SOD1 G86R bien avant l'apparition des premiers troubles moteurs (dès 75 jours). De même, ils ont découvert que cette répression est accentuée avec l'âge, à 90 et 105 jours. L'étude par RT-PCR de l'expression de RTN3 dans le muscle gastrocnémien montre que cet ARNm est exprimé de façon ectopique chez des animaux SOD1 G86R et ceci bien avant l'apparition des premiers troubles moteurs. En effet, cette expression est détectable dès 75 jours et les animaux utilisés pour ces expériences sont asymptomatiques, les premiers troubles moteurs apparaissant après 105 jours. De plus, le niveau d'expression de cet ARNm augmente avec l'âge. Ces expériences montrent que l'expression ectopique de RTN 3 est précoce dans les muscles.
H a été également étudié les niveaux d'expression des différents membres de la famille des réticulons. Les résultats montrent l'expression dans les muscles gastrocnémiens des gènes RTN 1A et 1C, RTN 2M (isoforme spécifique des tissus musculaires), et des isoformes du gène NogoA et NogoC (ou RTN 4). H a été également détecté une expression ectopique de l'isoforme NogoA associée à une répression de l'isoforme NogoC. Ces modifications semblent cependant plus tardives dans le décours de la pathologie, mais précèdent l'apparition des premiers troubles moteurs visibles (105 jours).
De plus, les inventeurs ont mis en évidence l'existence d'une corrélation entre le niveau d'expression d'une isoforme d'un poids moléculaire de 50 Kd et l'état de dénervation chez des patients atteints de sclérose amyotrophique (Voir exemples).
Ainsi, l'expression ectopique et précoce du gène RTN-3, et notamment de certaines isoformes de celui-ci, dans un tissu facilement accessible à la biopsie peut servir de marqueur moléculaire dans une pathologie neurodégénérative, telle que la sclérose latérale amyotrophique.
A ce titre, un premier objet de l'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un sujet, cette méthode comprenant la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3, in vitro, ex vivo ou in vivo, de préférence in vitro, ou ex vivo.
De préférence, la pathologie présentant une affection neuromusculaire est l'ALS ou une myopathie. De préférence, la méthode comprend la détection de la modulation de l'expression d'une ou plusieurs isoformes associées à une affection neuromusculaire. De préférence, la modulation de l'expression d'une ou plusieurs isoformes est une augmentation de l'expression, l'augmentation de l'expression étant indicative d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire tel que l'ALS ou une myopathie.
L'invention concerne donc une méthode pour évaluer l'évolution d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un patient comprenant la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3, in vitro, ex vivo ou in vivo, de préférence in vitro, ou ex vivo. De préférence, la pathologie présentant une affection neuromusculaire est l'ALS ou une myopathie. La méthode comprend de préférence une étape de comparaison au niveau d'expression chez le patient à un moment antérieur. De préférence, la méthode comprend la détermination de l'expression d'une ou plusieurs isoformes associées à une affection neuromusculaire. De préférence, une augmentation de l'expression d'une ou plusieurs isoformes, de préférence associées à une affection neuromusculaire, dans les muscles squelettiques est révélatrice d'une augmentation de l'affection neuromusculaire. Au contraire, une diminution de l'expression d'une ou plusieurs isoformes associées à une affection neuromusculaire dans les muscles squelettiques est révélatrice d'une diminution de l'affection neuromusclaire.
Un autre objet de la présente invention est relatif à des outils de diagnostic de cette pathologie ou de suivi de l'évolution de cette pathologie, notamment lors d'un traitement thérapeutique approprié.
Ainsi, l'invention concerne une méthode permettant de déterminer l'efficacité chez un patient d'un traitement contre une pathologie présentant une affection neuromusculaire comprenant la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3, in vitro, ex vivo ou in vivo, de préférence in vitro, ou ex vivo. De préférence, la pathologie présentant une affection neuromusculaire est l'ALS ou une myopathie. La méthode comprend de préférence une étape de comparaison au niveau d'expression chez le patient avant le traitement ou à un moment plus précoce du traitement. De préférence, la méthode comprend la détermination de l'expression d'une ou plusieurs isoformes associées à une affection neuromusculaire. De préférence, une augmentation de l'expression d'une ou plusieurs isoformes, de préférence associées à une affection neuromusculaire, ou une expression stable dans les muscles squelettiques est révélatrice d'une inefficacité du traitement. Au contraire, une diminution de l'expression
d'une ou plusieurs isoformes, de préférence associées à une affection neuromusculaire, dans les muscles squelettiques est révélatrice de l'efficacité du traitement.
Un autre objet de la présente invention est un procédé pour identifier ou caractériser un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'un produit du gène RTN3, comprenant une étape consistant à mettre en contact au moins un composé-test avec un système biologique capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3, suivie d'une étape consistant à évaluer la capacité du composé-test à moduler cette expression. L'invention concerne tout particulièrement l'identification ou la caractérisation d'un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'une ou plusieurs isoformes associées à une affection neurmusculaire. De préférence, les composés intéressants présentent la capacité de diminuer l'expression d'une ou plusieurs isoformes, de préférence associées à une affection neuromusculaire, dans les muscles squelettiques.
Plus généralement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un produit d'expression du gène RNT3 comme marqueur d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique ou une myopathie.
Dans le contexte de la présente invention, un sujet ou un patient inclut tout sujet ou patient mammifère et de préférence un sujet ou un patient humain.
Par produit d'expression du gène RTN3, on entend, selon l'invention, tout composé dérivant de ce gène, notamment par duplication, transcription, traduction, amplification, transcription inverse, et inclut, en particulier, tout ADN, ARNm, ADN artificiel, ADN synthétique ou semi-synthétique codant un polypeptide RTN3, ou un polypeptide RTN3. Plus particulièrement, un produit d'expression du gène RTN3 peut désigner une isoforme ou un ensemble d'isoformes au niveau polynucléotidique ou protéique. De manière plus spécifique, un polypeptide humain RTN3 est un polypeptide présentant une séquence en acides aminés sélectionnée parmi le groupe constitué de SEQ ID N°: 2, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 ou un de leurs variants, fragments ou homologues. Le polypeptide murin RTN3 inclut le polypeptide présentant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1, ou un de ses variants ou homologues. Les variants, fragments ou homologues comprennent tout polypeptide ou polynucléotide RTN3 résultant d'un polymorphisme, d'altérations ou de variations naturelles, telles qu'épissages, formes tronquées ou tout autre polypeptide ou polynucléotide obtenu essentiellement de manière naturelle présentant, respectivement, des aminoacides ou des nucléotides délétés ou substitués. De manière plus spécifique, un polynucléotide humain RTN3 est un polynucléotide présentant une séquence
nucléotidique sélectionnée parmi le groupe constitué de SEQ ID N°: 50, 52, 54, 56, 58, 60 et 62, une séquence complémentaire de celles-ci ou un de leurs variants, fragments ou homologues.
Ainsi, la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène RTN 3 peut être réalisée de différentes manières, notamment en évaluant (en mesurant, en déterminant ou en dosant) la quantité ou la présence du produit d'expression de ce gène à partir d'un échantillon biologique extrait du sujet, en particulier à partir d'un échantillon cellulaire ou tissulaire, tel qu'une biopsie musculaire, ou à partir d'un fluide biologique, tel que le sang, du sujet. De préférence, l'échantillon biologique proviend d'une biopsie musculaire. De préférence, l'échantillon biologique comprend un échantillon de muscle squelettique.
Plus particulièrement, le produit d'expression du gène RTN3 correspond à un produit transcrit ou traduit de ce gène, tel que les ARNm ou les pré-ARN ainsi que les polypeptides comme les protéines, les fragments ou les peptides correspondants, etc.. Le produit d'expression du gène RTN3 peut être plus spécifiquement une ou plusieurs isoformes particulières, de préférence associées à une affection neuromusculaire.
A cet égard, dans une première variante de l'invention, la détection de la modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3 comprend la détermination de la quantité ou de la présence du polypeptide RTN3 exprimé dans un échantillon biologique extrait d'un sujet.
La présence ou la quantité d'un polypeptide RTN3 peut être déterminée par une méthode connue de l'homme de l'art, incluant des tests immunologiques (ELISA, EIA, RIA, etc.). Ce test peut utiliser tout agent présentant une affinité spécifique pour le polypeptide RTN3, de préférence un anticorps dirigé contre des épitopes spécifiques de RTN3, un fragment ou un dérivé de cet anticorps (anticorps anti-RTN3). De plus, ce test peut également être réalisé avec un agent présentant une affinité spécifique pour une isoforme de RTN3 ou un groupe d'isoformes. De préférence, cet agent est un anticorps dirigé contre des épitopes spécifiques d'une isoforme ou d'un groupe d'isoformes.
Le X indique qu'un anticorps reconnaissant l'exon ou le segment d'exon reconnaît l'isoforme.
La présente invention a donc également pour objet un anticorps qui se lie à un polypeptide RTN3. L'anticorps est de préférence obtenu par un ou plusieurs programmes d'immunisation d'un animal avec un polypeptide RTN3 tel que décrit ci-dessus. A ce titre, un objet de la présente invention inclut une méthode de préparation d'un anticorps, cette méthode comprenant l'injection à un mammifère non-humain d'un polypeptide RTN3 tel que décrit précédemment et la récupération de l'anticorps, du sérum ou des cellules produisant des anticorps à partir dudit mammifère.
L'anticorps peut être monoclonal ou polyclonal ainsi que des fragments ou des dérivés, en particulier les fragments ou dérivés de ces anticorps présentant la même spécificité antigénique. Ainsi, sont inclus les fragments d'anticorps, tels que Fab, Fab'2, CDRs, etc., les anticorps humanisés, polyfonctionnels ou simple chaîne (ScFv). Us peuvent être obtenus par des méthodes conventionnelles, incluant l'immunisation d'un animal et récupération du sérum ou des cellules spléniques (pour produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Les méthodes de production d'anticorps polyclonaux de diverses espèces, incluant les souris, rongeurs, primates, chevaux, cochons, lapins, etc., sont notamment décrites par Vaitukaitis et al., 1971. L'antigène est combiné avec un adjuvant (par exemple l'adjuvant de Freund) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée, puis les immunoglobulines (ou le sérum) sont séparées de l'échantillon sanguin prélevé.
Les méthodes de production d'anticorps monoclonaux de diverses espèces, telles que décrites ci-dessus, peuvent être trouvées, par exemple, dans Harlow et al (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988) ou dans Kohler et al (Nature 256 (1975) 495). Brièvement, ces méthodes comprennent une étape d'immunisation d'un animal avec l'antigène, suivie d'une étape de récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes obtenus produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par des dilutions pour isoler des clones individuels.
Les anticorps peuvent être produits aussi par sélection à partir de banques combinatoires d'immunoglobulines, tel que décrit notamment par Ward et al (Nature 341 (1989) 544).
Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être préparés par digestion avec des protéases selon des techniques conventionnelles. Les anticorps humanisés peuvent être préparés selon la technique précédemment décrite (Jones 1986). Par ailleurs, des anticorps humanisés peuvent également être préparés par injection d'un polypeptide RTN3 en tant qu'antigène à un animal transgénique présentant le répertoire entier des gènes des anticorps humains, afin de produire des cellules produisant des anticorps anti-RTN3, puis par immortalisation des cellules ainsi obtenues. Les cellules immortalisées ainsi préparées produisent l'anticorps humain attendu. Cette méthode est décrite en détail dans les brevets suivants (WO 96/33735 ; EP 822 830 ; US 6,150,584).
Ainsi, afin d'identifier la protéine RTN3 ou ses différentes isoformes, des anticorps polyclonaux ont été produits à partir de la séquence protéique humaine SEQ ID n°l. Les épitopes choisis présentent une très forte homologie avec la séquence murine correspondante afin d'obtenir des anticorps polyclonaux présentant des réactions croisées entre l'homme et la souris. Deux programmes d'immunisation ont permis l'obtention d'anticorps reconnaissant spécifiquement le domaine Réticulon (région C terminale) et le domaine spécifique de l'isoforme RTN3 (Région N terminale).
Des lapins ont été immunisés avec deux peptides pour chaque programme d'immunisation. La position des peptides est indiquée sur les séquences protéiques de RTN3 (voir les exemples).
Les anticorps obtenus sont d'une part des anticorps anti-domaine réticulon de la protéine
RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes :
SEQ ID n°3: CYΛAGIARDQTKSINE-CONH2
SEQ ID n°4: CKIQAKLPGIAKKKAE
Les anticorps obtenus sont d'autre part des anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes :
SEQ ID n°5: MAEPSAATQSHSISSC-CONH2
SEQ ID n°6: SSFGAEPSAPGGGC-CONH2
Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues, tels que des toxines, marqueurs, actifs pharmaceutiques ou autres agents thérapeutiques, de manière covalente ou non, directement ou par le biais d'un agent de couplage ou un « linker ». Les marqueurs incluent les radiomarqueurs, les enzymes, les marqueurs fluorescents, des particules magnétiques, etc.. Les méthodes d'utilisation de tels fragments hétérologues sont illustrées, par exemple, dans les brevets US4.277.149 et US 3.996.345.
Les anticorps de la présente invention ont des applications variées, incluant l'utilisation pour le diagnostic, pour Timmuno-purification ou pour la détection d'un polypeptide RTN3 dans un échantillon (e.g., biopsie musculaire). En particulier, ils peuvent être utilisés in vitro dans le cadre de méthodes de criblage, telles que décrites ci-dessous, ou pour détecter ou quantifier la présence ou la quantité de polypeptides RTN3 dans un échantillon prélevé chez un sujet, typiquement une biopsie musculaire d'un mammifère, en particulier d'un être humain.
Alternativement, les complexes anticorps anti-RTN3 -polypeptide RTN3 peuvent être révélés et ou quantifiés en utilisant un deuxième réactif (e.g., un anticorps), marqué, qui se lie audit anticorps anti-RTN3, par exemple.
Selon une autre variante de l'invention, les produits d'expression du gène RTN3 sont les ARNm du gène RTN3. Les ARNm du gène RTN3 peuvent être détectés par des techniques classiques et en particulier soit par des méthodes d'amplification, telles que les techniques RT-PCR ou RT-PCR semi-quantitative à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque ou pour certaines isoformes, soit par des expériences de transfert d'ARN messagers sur membrane et d'hybridation avec des sondes spécifiques de chaque ou de certaines isoformes, de type expériences de Northern blot.
Les ARNs messagers totaux et les protéines utilisés pour ces expériences peuvent être extraits de tissus biologiques, tels que tissus musculaires, ou de fluides biologiques, tels que le sang, par les techniques classiques et couramment employées.
Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (Ligase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification), PCE (an enzyme amplified immunoassay) et ADNb (branched DNA signal amplification).
Selon un mode particulier de l'invention, la détection de la présence ou de la quantité d'ARNm comprend l'extraction d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, en particulier de biopsies musculaires, in vitro or ex vivo, la synthèse d'ADNc, une étape d'amplification (PCR) avec des amorces d'oligonucléotides, de préférence spécifiques d'un ou plusieurs ARNm RTN3, et l'analyse des produits PCR.
Selon un autre mode particulier de l'invention, la détection de la présence ou de la quantité d'ARNm comprend l'extraction d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, en particulier de biopsies musculaires, in vitro ou ex vivo, la mise en contact desdits ARNm avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique d'un ou plusieurs ARNm RTN3 dans des conditions permettant l'hybridation avec lesdits ARNm, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.
Typiquement, la détection d'ARN du gène RTN3 est réalisée par: - l'obtention d'ARN totaux ou messagers à partir d'un échantillon biologique, tel qu'une biopsie musculaire,
- la synthèse d'ADNc par reverse transcription,
- une amplification par PCR (polymerase chain reaction) de l'ADNc en présence d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du gène RTN3, - la détection (ou quantification) du produit PCR, en particulier par mise contact avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique d'un ou plusieurs ARNm RTN3 (détection indirecte), en particulier dans des conditions permettant l'hybridation, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.
De façon plus spécifique, l'étape d'amplification par PCR peut correspondre à plusieurs étapes d'amplification, la première consistant à une amplification PCR à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du domaine Réticulon présentant un consensus pour l'ensemble des gènes de cette famille et qui est commune à l'ensemble des isoformes de ce gène, la deuxième correspondant à la mise en évidence de la région spécifique à l'isoforme du gène considéré (RTN3) à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques d'un ou plusieurs ARNm RTN3.
L'amplification RT-PCR d'ARNm du gène RTN3 peut être réalisée en utilisant des amorces spécifiques du RTN3. Des exemples de telles amorces sont les séquences SEQ ID NO: 7 et 8. Dans le cas où l'on utilise également des amorces spécifiques du domaine réticulon, on peut mettre en œuvre les amorces de SEQ ID NO: 9 et 10. Bien entendu, d'autres amorces peuvent être dessinées par l'homme du métier pour l'étape d'amplification. Les amorces sont de préférence de 15-25 bases de long. Notamment, il peut être intéressant d'utiliser des amorces spécifiques d'une ou plusieurs isoformes de RTN3, de préférence des isoformes associées à une affection neuromusculaire.
Aussi, une sonde spécifique du gène RTN3 peut être l'acide nucléique de SEQ ID NO: 11 ou son brin complémentaire, ou un de ses fragments, de préférence le fragment est d'au moins 15, et mieux de 20-30 bases. Notamment, il peut être intéressant d'utiliser des sondes spécifiques d'une ou plusieurs isoformes de RTN3, de préférence des isoformes associées à une affection neuromusculaire. La sonde peut être marquée en utilisant toute technique connue, telle que radioactivité, fluorescence, enzymatique, chimique, etc. La présente invention n'est pas liée ou limitée par ces techniques particulières de détection ou de marquage, d'autres méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées.
La séquence SEQ ID NO: 11 est la suivante (N représentant une des 4 bases : A, C, G ou T). Elle correspond à une séquence nucléotidique du clone R.42 (voir les exemples): CTTCTACAACCTTTTTAATAATCNTTTNATCTCTTCGAGTCTTTGTTTA AAAAAACAAAACCGAAAAAACCCTCTCATGTAACACAGAAACCTTTC NTNTTATTTTAACACAGCAGCAGCAACAAAGAAAAGAGCAAACTGTG GAGGCTTCCAGTGCAGAACGAGGTCCCTTGTTAGGAGACCCCATAGA CCATGGGTGCGTTCACTTCCTGGGAGGGCAGAGCATGGTGATGGAGT GTTGTCTACAGTGGAAATGAAAGATTCAAAAT
Les produits d'expression du gène RTN3 se situent généralement dans les cellules. Ainsi, la détection de ces derniers comprend généralement une étape de traitement de l'échantillon pour rendre accessible ces produits d'expression à un agent d'affinité. Ce traitement peut être mis en oeuvre par toute technique conventionnelle de fixation, ou toute autre méthode classiquement utilisée en (immuno)histologie.
Comme décrit ci-dessus, la présente invention permet le diagnostic ou le suivi d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, telle que la SLA ou une myopathie par l'évaluation ou la détermination de l'expression anormale d'un produit du gène RTN3. Cette expression anormale d'un produit du gène RTN3 peut correspondre à une surexpression ou à une sous-expression d'un ARNm RTN3 ou d'un polypeptide RTN3, une modification ou l'apparition d'un ARNm RTN3 ou d'un polypeptide RTN3 due à un épissage, une mutation, une délétion, etc. Généralement, l'expression réprimée de l'ARNm RTN3 dans les moelles lombaires du sujet ou son expression ectopique dans le muscle squelettique, par exemple gastrocnémien, est indicatif d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, telle que la SLA ou une myopathie.
Tel qu'indiqué ci-dessus, la détection d'un produit du gène RTN3 peut être déterminée par une détermination relative d'un produit d'expression de ce gène contenue dans un échantillon biologique. Selon un mode particulier, la présence ou la quantité d'un produit d'expression de RTN3 dans un échantillon est comparée à une valeur moyenne calculée à partir d'un échantillon de sujet non susceptible de présenter cette pathologie.
La méthode de diagnostic selon la présente invention peut être utilisée seule ou en combinaison avec d'autres marqueurs, tels que mutation de SOD1, dosage de la 3- nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d' épissage du transporteur au glutamate EAAT2, détection d'une expression ectopique de l'isoforme NogoA ou d'une répression de l'isoforme NogoC.
Ainsi, selon un mode spécifique, la méthode de diagnostic comprend en outre une ou plusieurs étapes de détection d'un autre marqueur biologique choisi parmi : mutation SOD1, dosage de la 3-nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2, détection d'une expression ectopique de l'isoforme NogoA et détection d'une répression de l'isoforme NogoC, cette (ou ces) étape(s) de détection étant mise(s) en œuvre selon des méthodes identiques à celles décrites ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des kits utilisables dans le cadre de la méthode de diagnostic décrite ci-dessus comprenant au moins un des réactifs de détection de l'expression d'un des produits du gène RTN3 dans un échantillon. Les réactifs peuvent inclure des anticorps, des sondes, des amorceurs, des supports, etc.
Un autre objet de la présente invention est un procédé pour identifier ou caractériser un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'un produit du gène RTN3, comprenant a) une étape consistant à mettre en contact au moins un composé-test avec un système cellulaire capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3, b) suivie d'une étape consistant à évaluer la capacité du composé-test à moduler cette expression, notamment en sélectionnant les systèmes cellulaires ayant une expression modifiée par rapport au même système cellulaire n'ayant pas été mis en contact avec ledit composé-test.
La méthode peut être mise en œuvre pour sélectionner ou identifier des activateurs ou des inhibiteurs de l'expression du gène RTN3 ou de son activité.
Selon une variante de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de criblage des composés identifiés à l'étape b) par leur mise en contact avec un système cellulaire exprimant un produit d'au moins un gène de la famille des réticulons autre que RTN3, en particulier RTN1 ou 2. Cette étape supplémentaire permet de déterminer les composés-test qui modulent de manière sélective l'expression du gène RTN3.
La présente invention permet de cribler différents types de composés, notamment des composés synthétiques, incluant des produits organiques, des lipides, des polysaccharides, peptides, protéines, acides nucléiques (par exemple, des séquences antisens, RNAi), etc. Ces composés à tester peuvent être d'origines diverses, naturelle ou synthétique. Ils peuvent correspondre à une substance organique ou minérale, isolée ou en mélange avec d'autres substances. Us peuvent provenir de banques de composés (e.g., obtenues par chimie combinatoire).
Le composé-test peut être défini ou non en terme de structure et/ou de composition. Par exemple, les composés peuvent être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé, mais de structure indéfinie, un mélange de plusieurs composes caractérisés et connus ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. Des exemples de telles
compositions incluent des échantillons tissulaires, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc.
En général, l'activité de ces composés est inconnue et la méthode selon l'invention est mise en oeuvre pour identifier des composés présentant la propriété recherchée (e.g. ; modulation de l'expression du gène RTN3). Cependant, dans les cas où l'activité du composé-test est connue, la méthode de criblage peut être utilisée pour caractériser ladite activité en terme de spécificité, d'efficacité, etc. et/ou pour optimiser cette activité en testant des dérivés de ce composé-test .
Ce procédé de criblage peut être réalisé dans n'importe quel dispositif approprié, tels que des tubes, des boites, etc. Les boites peuvent être à plusieurs puits, ce qui permet de tester plusieurs composés en parallèle.
D'autres aspects de la présente invention résident dans les kits pour réaliser les méthodes décrites ci-dessus, les cultures cellulaires, les supports et autres réactifs.
Comme mentionné précédemment, la présente invention propose des compositions et des méthodes pour détecter l'expression du gène RTN3 et cribler des composés capables de moduler cette expression. La présente invention décrit donc des compositions et des méthodes permettant la détection spécifique de cette expression. Le procédé de criblage selon l'invention peut être adapté à un criblage à haut débit, «high throughput », permettant à un grand nombre de composés d'être testé rapidement, et permet ainsi l'identification de composés éventuellement spécifiques de la modulation de l'expression du ène RTN3.
Le système cellulaire utilisé dans le procédé de criblage selon l'invention doit donc être capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3 tel que défini ci-dessus. Ce système inclut notamment une cellule hôte comprenant un acide nucléique ou un vecteur codant pour RTN3 tel que défini ci-dessus. Ainsi, la séquence d'acide nucléique introduite dans cette cellule hôte doit être capable de coder pour une séquence protéique RTN3, en particulier SEQ ID NO. 1, 2, 51, 53, 55, 57, 59, 61 ou 63. Selon un mode particulier, la cellule hôte comprend un acide nucléique, de préférence un acide nucléique comprenant
une séquence sélectionnée parmi le groupe constitué de SEQ ID NO 50, 52, 54, 56, 58, 60, et 62, éventuellement inclus dans un vecteur, de SEQ ID 11, tel que décrit ci-dessus.
Le vecteur contenant la séquence d'acide nucléique telle qu'indiquée ci-dessus peut être d'origine variée. Il peut être un phage, un plasmide, épisome; chromosome artificiel, virus, etc.. Typiquement, les vecteurs plasmidiques peuvent être ceux dérivés des plasmides commercialement disponibles (pUC, pBR322, pcDNA, etc.). D'autres vecteurs préférés sont des virus, ne particulier des virus recombinants, tells que ceux dérivés de rétrovirus, baculovirus ou lentivirus, AAVs, adenovirus, herpesvirus, etc. Les vecteurs peuvent être préparés selon des méthodes classiques couramment employées, en introduisant la molécule d'acide nucléique codant pour RTN3 ou un fragment de ce dernier dans un site de clonage approprié du vecteur. Le vecteur peut en outre comprendre des séquences régulatrices, telles que des promoteurs, des signaux de terminaison, des séquences stimulatrices, des séquences inhibitrices, etc. des origines de réplication, des gènes marqueurs, etc. Des exemples de promoteurs incluent les promoteurs permettant l'expression constitutive, régulée ou sélective de tissu, faibles ou forts, d'origine cellulaire, virale ou synthétique, tels que RVS-LTR, SV40-IE, promoteur CMV-IE, promoteurs de gènes domestiques (PGK, etc.), promoteurs de bactéries ou de phages (T7, Lac, Trp, etc.), etc.
Les vecteurs peuvent être utilisés pour exprimer un acide nucléique tel que décrit ci-dessus in vitro, ex vivo or in vivo. En particulier, ils peuvent être utilisés pour exprimer un polypeptide RTN3 ou un ARNm du gène RTN3 dans une cellule, in vitro or ex vivo.
La cellule recombinante ou cellule hôte peut être tout type cellulaire cultivable, tel que des cellules eucrayotes ou procaryotes, incluant les bactéries, levures, des cellules d'insectes, de plantes ou de mammifères, etc.. La celule peut être une lignée cellulaire ou une culture primaire. Des exemples de cellules sont E. coli, Saccharomyces, Kluyveromyces, des cellules d'insecte, des fibroblastes de mamifère ou des celllules embryniques, HEK, CHO, COS, 3T3, 293, etc.
De manière préférée, la cellule hôte est une cellule qui n'exprime pas naturellement le polypeptide RTN3 murin ou humain. De telles cellules hôtes sont avantageusement utilisés dans le procédé de criblage, car elles permettent d'obtenir une sélectivité accrue.
Un objet de l'invention est la préparation de cellules exprimant les polypeptides RTN3, cette méthode comprenant l'introduction dans des cellules in vitro une molécule d'acide nucléique ou un vecteur tel que défini ci-dessus et la sélection des cellules qui expriment les polypeptides RTN3. L'introduction de l'acide nucléqiue ou du vecteur peut être réalisée par des moyens techniques classiques, tels que transfert d'ADN direct, transfection par un lipide, électroporation, etc. Les cellules sont cultivées dans un milieu approprié et stockées selon des méthodes conventionnelles.
Le procédé de criblage comprend donc une étape de contact du composé-test avec un système cellulaire exprimant un produit du gène RTN3, notamment avec la cellule hôte décrite ci-dessus, suivi d'une étape d'évaluation de la capacité du composé-test à moduler l'expression du gène RTN3.
Ainsi, cette étape d'évaluation peut être réalisée de manière identique à celle décrite ci- dessus dans le cadre du procédé de diagnostic, notamment à l'aide d'anticorps, éventuellement marqués, en particulier les anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 et de préférence dirigés contre les épitopes de séquences SEQ ID n°5 et 6. Alternativement, les complexes anticorps anti-RTN3-polypeptide RTN3 peuvent être révélés et/ou quantifiés en utilisant un deuxième réactif (e.g., un anticorps), marqué, qui se lie audit anticorps anti-RTN3, par exemple.
Selon une autre variante, l'étape d'évaluation peut être réalisée à partir des ARN produits par le système cellulaire. Les méthodes de détection d'ARN sont notamment celles décrites ci-dessus pour le procédé de diagnostic. Ainsi, les ARNm du gène RTN3 peuvent être détectés par des techniques classiques et en particulier par des méthodes d'amplification, telles que les techniques RT-PCR ou RT-PCR semi-quantitative à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme, soit par des expériences de transfert d'ARN messagers sur membrane et d'hybridation avec des sondes spécifiques, de type expériences de Northern blot. Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (Ligase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification), PCE (an enzyme amplified immunoassay) et ADNb (branched DNA signal amplification).
La révélation ou la quantification de l'effet produit par le composé-test sur la modulation de l'expression du gène RTN3 est réalisée par comparaison des résultats obtenus avec et en l'absence du composé-test sur le système cellulaire.
Les résultats peuvent correspondre à des mesures qui peuvent être obtenues en utilisant diverses techniques qui dépendent en particulier des moyens mis en œuvre (marquage par fluorescence, radiomarqueurs, ...). Par exemple, la mesure peut être l'évaluation par densité optique ou de fluorescence émise.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un anticorps spécifique de RTN3, de préférence un anticorps spécifique d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IV, V, VI et VII.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un oligonuclétide capable de bloquer ou de diminuer l'expression de RTN3, de préférence d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, III, IV, V, VI et VIL De préférence, cet oligonucléotide est un antisens ou un RNAi.
De plus, l'invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps dirigés contre RTN3 ou d'un oligonuclétide capable de bloquer ou de diminuer l'expression de RTN3 tels que décrits ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, par exemple de l'ALS ou d'une myopathie.
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être injectés par voie systémique ou orale, de préférence systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 μg et 500 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 10 mg kg, typiquement entre 0,1 et 10 mg/kg. En outre, des
injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre, en outre, d'autres agents ou principes actifs. De préférence, les composés ou compositions selon la présente sont administrés de telle manière et à de tel dosage que les composés ou compositions sont délivrés à des doses efficaces au niveau des muscles squelettiques.
L'invention concerne également des méthodes de traitement d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un patient nécessitant des soins comprenant l'aclriiinisfration d'une dose efficace d'anticorps spécifique de RTN3, de préférence un anticorps spécifique d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, H, III, IV, V, VI et VIL De préférence, la pathologie présentant une affection neuromusculaire est l'ALS ou une myopathie
L'invention concerne également des méthodes de traitement d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un patient nécessitant des soins comprenant l'ao ninistration d'une dose efficace d'un oligonuclétide capable de bloquer ou de diminuer l'expression de RTN3, de préférence d'une ou plusieurs isoformes parmi les isoformes I, II, RI, IV, V, VI et VIL De préférence, cet oligonucléotide est un antisens ou un RNAi. De préférence, la pathologie présentant une affection neuromusculaire est l'ALS ou une myopathie
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.
Légende des figures
Fig.lA. : Identification du clone R42. : (a) identification à l'aide du programme Cluster Unigene (banque de données) du groupe de séquence Mm.21606 correspondant à l'ADNc du gène RTN3 et (b) alignement de la séquence du clone R42 le cluster Mm.21606.
Fig.lB. : Représentation schématique de l'organisation du gène RTN3
Fig.2. : Etude de l'expression de l'ARNm RTN3 dans le muscle gastrocnémien au cours de la pathologie chez les souris SOD1 G86R
Fig. 2A : L'ARNm RTN3 est détecté par des expériences de RT-PCR semi-quantitatives. La bande spécifique RTN3 apparaît dès 75 jours (n=3) et son intensité augmente à 90 (n=3) et 105 jours (n=4).
Fig. 2B : Les ARNm des différents membres de la famille des réticulons sont détectés par des expériences de RT-PCR semi-quantitatives à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme.
Dans le figures Fig. 2A et 2B, les ADNc obtenus par reverse transcription d'ARN totaux extraits de muscle gastrocnémien sont soumis à une étape de PCR avec des nombres de cycles permettant la linéarité du signal (n=3). Les expériences sont standardisées avec le gène domestique G3PDH. Les expériences de RT-PCR ont été réalisées à l'aide d'ARNs extraits de muscles gastrocnémiens de souris mâles sauvages (+) et de souris mâles SOD1 G86R (M) de mêmes portées.
Fig. 2C : Représentation schématique des modifications d'expression des ARNm des gènes de la famille des réticulons RTN2M, RTN3, NogoA et NogoC.
Figure 3 : Représentation schématique de la structure génomique des gènes RTN3 humain et murin. Les exons (1, 2, 3.1, 3.2, 4 à 9 représentés approximativement à l'échelle, sont alignés sur la séquence génomique humaine (Ace N° GenBank : AP 000753) et murine (Ace N° GenBank : NT039683). La taille des Mitrons (de a à h) est indiquée en kilobase (kb). Les flèches marquent la position putative du départ de la transcription à partir des promoteurs alternatifs à l'origine des isoformes I à VI (exons 1-2-3.1-3.2-4 à 9 ; voir page 4) ou l'isoforme VI (exons 3.3-4 à 9 ; voir page 4).
Exemples
Matériel biologique
La lignée de souris transgéniques utilisée dans cette étude correspond à la lignée SOD1 G86R décrite par Ripps et coll. (1995). Cette lignée exprime la mutation G -> R en position 86 sur le gène SOD1 murin, mutation identifiée dans le gène SOD1 de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique. Cette lignée est maintenue sous forme
hétérozygote, la mutation ponctuelle créant un site de restriction Fspl utilisé pour le typage des souris.
Identification du clone
Le clone R.42 a été identifié par criblage différentiel à partir d'une banque soustractive d'ADNc correspondant aux ARN messagers réprimés dans notre modèle animal de sclérose latérale amyotrophique. Cette banque a été réalisée par la méthode de PCR-select selon les conseils du fabricant (PCR-select DNA Subtraction Kit; CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) à partir d'ARN messagers poly A+ isolés de moelles épinières lombaires de souris mâles SOD1 G86R et de souris mâles WT de mêmes portées âgées de 75 jours à l'aide du Kit "n RNA isolation kit" de Boehringer Mannheim.
Les populations d'ADNc soustraits ont été directement clones dans le vecteur pCR2.1 en utilisant le kit TOPO T/A (TOPO T/A cloning kit; Invitrogen). Les clones individuels ont été repiqués dans des plaques de microtitration et utilisés comme glycerol- stocks.
Les clones positifs ont été identifiés par hybridation différentielle de sondes radioactives sur des filtres dupliqués de nitiocellulose (Zeta-Probe membranes; BioRad) dot blottés avec des fragments PCR obtenus à partir des clones d'ADNc des banques soustraites. Pour cette méthode décrite par von Stein et coll (1997), nous avons utilisé des sondes d'ADNc radioactives au 32P préparées à partir de 2 μg d'ARN totaux de moelles épinières lombaires extraits soit de souris mâles SOD1 G86R ou de souris contrôles de mêmes portées âgées de 75 jours .
Toutes les étapes de PCR ont été réalisées sur des plaques de microtitration en utilisant un appareil Hybaid Omnigene Thermocycler 96 puits.
Les clones positifs identifiés ont été amplifiés à partir des Glycérol-stocks et soumis au séquençage de l'insert sur les deux brins (DNA Sequencer, Applied Biosystems). Une recherche dliomologie de séquences réalisée à l'aide des programmes BLAST sur les banques de données de séquences GenBank du National Center for Biotechnology Information (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a révélé 96% d'homologie avec la séquence de la région 3' non-codante du gène RTN-3 (GenBank Ace N° : NM053076) entre les positions 2421 et 2677 de TARN messager de RTN3.
La séquence nucléique de l'insert porté par le clone R42 est donnée en SEQ ID n°l 1.
Confirmation du clone et mise en évidence des variations d'expression
La confirmation de la répression de l'expression du gène RTN3 (identifié par la caractérisation du clone R.42) a été obtenue par des expériences de Northern blot et des expériences de RT-PCR semi-quantitatives.
* Les ARN totaux ont été extraits de moelles épinières lombaires et des muscles gastrocnémiens de souris SOD1 G86R et de souris contrôles de même portée âgées de 75, 90 et 105 jours. Les tissus sont congelés au moment du prélèvement puis extraits par la méthode au guanidinium thiocyanate-phenol-chloroforme (Chomczynski and Sacchi, 1987).
* Les ARNs totaux sont extraits par la méthode au guanidinium thiocyanate-phenol- chloroforme à partir des tissus biopsiques humains congelés dans l'azote liquide au moment du prélèvement.
- Northern Blot :
Les ARN totaux (20 a 30 μg) des moelles épinières lombaires et des muscles gastrocnémiens des souris SOD1 G86R et de souris contrôles des différents âges ont été déposés sur gel d'agarose et transférés sur filtre de nitrocellulose par capillarité. Les ARNs transférés ont été hybrides avec une sonde radioactive préparée à l'aide de l'ADNc R.42. Les résultats sont présentés figure 3A et montrent la sous-expresssion de l'ARNm RTN3 chez la souris pathologique.
- RT-PCR semi-quantitatives :
Deux μg d'ARN totaux ont été retrotranscrits par la transcriptase inverse de MoMuLV (Promega) par la méthode des hexamères aléatoires dans des conditions de réaction standart. Les ADNc ainsi obtenus ont été utilisés dans des expériences de PCR semi- quantitatives en utilisant les oligodesoxynucléotides (ODN) choisis dans la séquence codante du gène RTN3.
Séquences des oligodesoxynucléotides pour les expériences de RT-PCR :
Pour chaque gène étudié (RTN1, RTN2 et RTN3) par RT-PCR semi-quantitative, plusieurs paires d'oligonucléotides ont été dessinés. La première paire permet la mise en évidence d'un fragment PCR correspondant à la région connue sous le nom de domaine Réticulon présentant un consensus pour l'ensemble des gènes de cette famille et qui est commune à l'ensemble des isoformes de ce gène. La deuxième (et troisième paire le cas échéant) d'oligo permet la mise en évidence de la région spécifique à chaque isoforme du gène considéré. Chaque paire d'oligonucléotides est constituée d'un oligonucléotide "forward" (F) et d'un oligonucléotide "reverse" (R) délimitant respectivement l'extrémité 5' et 3' du fragment PCR.
RTN3 domaine RTN SEQ ID No. : 9 (ODN F) : TCTGGCAGCCTTCAGTGTTA SEQ ID No. : 10 (ODN R) : CCATCGCAGCATTCATGTAG
domaine spécifique RTN3
SEQ ID No. : 7 (ODN F) : CCTACGTCTCTCTTCACCCTTC SEQ ID No. : 8 (ODN R) : ACATCTCGCCAGAAAATCAGA
RTN1 : domaine RTN
SEQ ID No. : 12 (ODN F) : CTTCTGTACTGGCGGGACAT SEQ ID No. : 13 (ODN R) : CCGTAGCTCCTTCAGAGTGC
domaine spécifique RTN1A
SEQ ID No. : 14 (ODN F) : GTCACTGCCCCTGTCAAGAT SEQ ID No. : 15 (ODN R) : TGCAGCAGATGGTTCTGTTC
domaine spécifique RTN1C
SEQ ID o. : 16 (ODNF) : CCACCAAGATGGACTGTGTG
SEQIDNo. : 17 (ODNR) : TGTAGATGCGGAAGCTGATG
RTN2:
domaineRTN
SEQ IDNo. : 18 (ODNF) : TTGACCAGTATGTGGGGTTG SEQ IDNo. : 19 (ODNR) : GATCCGGAGACTGATGCTGT
domaine spécifique RTN2 cerveau (B)
SEQ ID No. : 20 (ODN F) : GAACGTTTGTCCCAGCAGAT SEQ ID No. : 21 (ODN R) : ACAGAAGGGGGACGGTAAAC
domaine spécifique RTN2 musculaire (Mus) SEQ DD No. : 22 (ODN F) : GTCTGCAACCGCTCTCTTG SEQ ID No. : 23 (ODN R) : CTTTGCGGTAAACCCTGAGA
NogoA murin :
SEQ ID No. : 24 (ODN F) : CAGGTGATGTACGCTCTGGA SEQ ID No. : 25 (ODN R) : TGAGGGAAGTAGGGATGTGC
NogoC murin :
SEQ ID No. : 26 (ODN F) : TGCATAATTTGTAATTGCTGCTG SEQ ID No. : 27 (ODN R) : GGCAATGTAGGCCGTTACAC
Les résultats obtenus sont présentés figure 2 et confirment la modulation du gène RTN3.
Génération des anticorps Anti-RTN3 = épitopes
Afin d'identifier la protéine RTN3 ou ses différentes isoformes, des anticorps polyclonaux ont été produits (Eurogentec) à partir de la séquence protéique humaine (voir annexe). Les épitopes choisis présentent une très forte homologie avec la séquence murine correspondante afin d'obtenir des anticorps polyclonaux présentant des réactions croisées entre l'homme et la souris. Deux programmes d'immunisation a permis l'obtention d'anticorps reconnaissant spécifiquement le domaine Réticulon (région C terminale) et le domaine spécifique de l'isoforme RTN3 (Région N terminale).
Des lapins ont été immunisés avec deux peptides pour chaque programme d'immunisation. La position des peptides est indiquée sur les séquences protéiques (voir annexe).
* Anticorps anti-domaine réticulon de la protéine RTN3 dirigé contre les épitopes suivants
SEQ ID No. 3: CYVGIARDQTKSIVE-CONH2 SEQ ID No. 4: CKIQAKLPGIAKKKAE
* Anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 dirigé contre les épitopes suivants :
SEQ ID No. 5: MAEPSAATQSHSISSC-CONH2 SEQ ID No. 6: SSFGAEPSAPGGGC-CONH2
La position de ces peptides sur SEQ ID No. 1 et 2 est la suivante :
SEQ ID No. 3 est à la position des résidus de 209 à 222 de SEQ ID1
SEQ ID No. 3 est à la position des résidus de 1 à 16 et de 208 à 221 de SEQ ID 2
SEQ ID No. 4 est à la position des résidus de 17 à 29 et de 225 à 237 de SEQ ÏÏD1 SEQ ID No.4 est à la position des résidus de 17 à 29 et de 224 à 236 de SEQ ID2 SEQ ID No. 5 est à la position des résidus de 1 à 16 de SEQ ID1
La spécificité des anticorps a été confirmée par des expériences de Western Blot sur des extraits protéiques de muscles gastrocnémiens.
Identification des isoformes = Séquences
Les différences de résultats entre les expériences de Northern et de RT-PCR suggèrent l'existence de plusieurs isoformes pour les transcrits RTN3. L'existence d'isoformes pourrait être commune à l'ensemble des gènes de la famille des réticulons.
A l'aide d'outils informatiques (TblastN ; TbalstP), les inventeurs ont recherché dans les banques de données de séquences ESTs humaines traduites l'existence de séquences présentant le domaine RTN (tout ou en partie) mais différant de la séquence connue dans la région N terminale. La comparaison des séquences codantes ainsi identifiées et la séquence du génome humain a permis la mise en évidence de la structure du gène RTN3. La recherche d'ESTS murine a permis de trouver une structure parfaitement identique pour le gène RTN3.
Les inventeurs ont montré que le gène RTN3 est composé de 9 exons et s'étend sur 78 Kb. Les exons 1 et les exons 4 à 9 codant le domaine RTN composent la séquence décrite par Moreira et coll. Les exons nouvellement décrits par notre travail sont les exons 2, exons 3.1, 3.2 et 3.3. L'exon 3.2 correspond à la présence d'un site accepteur d'épissage dans l'exon 3.1 et l'exon 3.3 est synthétisé à partir d'un promoteur alternatif mis en évidence par l'existence de séquences ESTs présentant une extension de la région 5'UTR de l'exon 3.
Tableau 3 : Jonction exon-intron chez l'homme et la souris.
Les séquences nucléiques des extrémités 5' et 3' des exons (en capitale) et sites donneur et accepteur au niveau des jonction intron/exon du gène RTN3 humain et de souris tels que déduits des alignements entre les séquences génomiques de RTN3 humain (GenBank Ace
N° AP000753) ou de souris (GenBank Ace N° 039683) et les séquences d'ESTs couvrant les différents exons du gène RTN3.
Les séquences d'intron sont indiquées en minuscule sauf pour les sites donneur et accepteur en gras et en capitale. Tous les sites d'épissage sont définis selon les règles de consensus ; commence avec GT et finit avec AG. Les exons et les mirons sont numérotés comme indiqué dans la figure 3 et la taille des exons et introns est donnée. Les homologies entre humain et souris sont mises en évidence par une astérisque.
Corrélation entre l'état d'atrophie musculaire et les taux d'expression des isoformes de RTN3 chez des patients atteints de SLA
La SLA est une affection neurodégénérative caractérisée par une atteinte du système moteur. D'un point de vue histopathologique, l'atrophie du muscle squelettique est une des caractéristiques principales de la maladie. Ainsi, la défaillance motrice peut être mis en rapport avec le degré d'atrophie musculaire. De même, une diminution de la taille des fibres musculaires témoigne de la présence d'atrophie.
L'étude que les inventeurs ont réalisé a eu pour but d'une part l'analyse histologique des échantillons de tissu musculaire squelettique des patients SLA et d'autre part l'expression des isoformes de RTN3 sur ces mêmes échantillons. L'analyse histologique, réalisée sur des cryo-coupes transversales des faisceaux musculaires, est basée sur la classification des fibres musculaires selon leur vitesse de contraction, celle-ci étant en rapport avec l'activité de l'enzyme ATPase myofibrilaire. En effet, cette activité enzymatique est dépendante des conditions d'acidité ou d'alcalinité du milieu de réaction, ce qui permet la coloration spécifique des différents types de fibres selon le pH choisi. Ainsi, les tailles des fibres de type I (lentes ou oxydatives) et de type II (rapides ou glycolytiques) sont mesurées à l'aide d'un système d'analyse d'images (logiciel Lucia G version 4.61) et mises en rapport avec les taux d'expression des isoformes de RTN3, ceux-ci obtenus par Western blot et exprimés en unités arbitraires de densité optique (logiciel Multi-Analyst version 1.1).
Les résultats ont permis de montrer l'existence d'une corrélation significative entre le degré d'atrophie musculaire concernant les fibres glycolytiques et le niveau d'expression des
isoformes de RTN-3 migrant aux alentours de 50 kDa. En effet, la diminution de la taille des fibres est inversement proportionnelle à l'augmentation de l'expression de la protéine. Dans le cas des fibres oxydatives, la tendance est similaire mais pas significative. Par contre, le degré d'atrophie musculaire ne corrèle pas avec le niveau d'expression des isoformes de RTN-3 migrant aux alentours de 20 kDa (Figure 1). L'ensemble de ces résultats indique que certaines isoformes de RTN-3 peuvent nous informer sur l'évolution de processus histopathologiques caractéristiques de la maladie, et suggèrent une utilisation à visée diagnostic.
REFERENCES
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