FR2841261A1 - Compositions et methodes pour detecter les pathologies affectant la transmission neuromusculaire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des compositions et des méthodes in vitro, ex vivo ou in vivo de diagnostic de pathologie affectant la transmission neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique. La présente invention a trait plus spécifiquernent à l'identification ou à la détection de l'expression du gène RTN3, permettant ainsi de diagnostiquer, de suivre l'évolution, éventuellement lors d'un traitement thérapeutique, d'un désordre lié à une affection neuromusculaire, telle que la sclérose latérale amyotrophique. Elle concerne également des procédés pour identifier, caractériser ou cribler des composés capables de moduler l'expression du gène RTN3.

Description

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Compositions et Méthodes pour détecter les pathologies affectant la transmission neuromusculaire La présente invention concerne des compositions et des méthodes in vitro, ex vivo ou in vivo de diagnostic de pathologie affectant la transmission neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique. La présente invention a trait plus spécifiquement à l'identification ou à la détection de l'expression du gène RTN3, permettant ainsi de diagnostiquer, de suivre l'évolution, éventuellement lors d'un traitement thérapeutique, d'un désordre lié à une affection neuromusculaire, telle que la sclérose latérale amyotrophique. Elle concerne également des procédés pour identifier, caractériser ou cribler des composés capables de moduler l'expression du gène RTN3.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie progressive pour laquelle il n'existe à l'heure actuelle que des techniques de physiologie globale (estimation du nombre d'unités motrices, force musculaire, capacité respiratoire) pour en faire le diagnostic et en évaluer l'évolution. En effet, en l'absence de marqueurs biologiques, le diagnostic précoce de la SLA repose actuellement sur l'analyse des symptômes et des signes cliniques. Le diagnostic de la SLA est défini par les critères d'El Escorial basés sur le type de neurones atteints (moteurs inférieurs ou supérieurs), sur la localisation des signes (bulbe, moelle cervicale, thoracique ou lombaire). Le degré de certitude du diagnostic est déterminé en fonction du nombre de critères remplis, la SLA certaine étant définie par une atteinte conjointe des neurones moteurs inférieurs et supérieurs dans le bulbe et au moins deux régions de la moelle épinière. Ce type de diagnostic est difficile à établir au début de la maladie et certains patients ne présentent pas les caractéristiques nécessaires à la classification.

Certains marqueurs biologiques sont toutefois utilisés pour le diagnostic. Ainsi, la présence d'une mutation SOD1 certifie le diagnostic de SLA. Cependant, étant donné que seulement 1 à 2 % des cas de SLA sont liés à de telles mutations, son absence n'a aucune signification. D'autres marqueurs ont été évoqués (dosage de la 3-nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2), mais leur utilisation en tant qu'outil-diagnostic est impossible en raison de leur nonspécificité à la SLA. Le manque de sensibilité de ces moyens explique que la maladie est trop souvent reconnue tardivement, ce qui conduit à un retard dans la prise en charge de

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la maladie et notamment dans la mise en route des traitements neuroprotecteurs appropriés.

La présente invention propose un nouveau marqueur moléculaire détectable notamment à partir des biopsies musculaires et permettant de diagnostiquer le désordre de façon précoce. Les biopsies musculaires présentent l'avantage de correspondre à des prélèvements faciles et peu traumatisants pour les patients. La précocité des modifications de ce marqueur moléculaire permet un suivi de membres de familles à risque (prédiction), un diagnostic rapide et sûr, dès les premiers signes cliniques, un suivi de l'évolution de la maladie et de l'influence de traitements appropriés. Cette invention est applicable à d'autres pathologies, telles que les myopathies, où la transmission neuromusculaire est affectée.

Le marqueur moléculaire correspond plus spécifiquement à un produit du gène RTN 3.

Le gène RTN 3 fait partie de la famille des gènes Réticulons dont différents membres ont récemment été étudiés et clonés. La famille des réticulons (ou précédemment appelée Neuron-Specific Protein, NSP) est caractérisée par l'existence d'isoformes obtenus par épissage et/ou usage de promoteur alternatifs.

A partir de ces observations, il est proposé ici des outils de diagnostic pour cette pathologie où la transmission neuromusculaire est affectée. Ces travaux représentent en effet la démonstration de la modification de l'expression du gène RTN-3 dans une pathologie neurodégénérative. La présente invention repose donc sur la découverte que l'expression du gène RTN 3 est modulée chez des sujets présentant une pathologie liée à une affection neuromusculaire, telle que la sclérose latérale amyotrophique, cette modulation étant également constatée bien avant l'apparition des signes cliniques et des troubles moteurs de la maladie. Les inventeurs ont utilisé un modèle isomorphe de la SLA constitué par une lignée de souris exprimant une forme mutée de la superoxyde dismutase a cuivre/zinc (souris SOD1 G86R). Ils ont ainsi trouvé de façon surprenante que l'expression de l'ARNm RTN3 est réprimée dans les moelles lombaires de souris SOD1 G86R bien avant l'apparition des premiers troubles moteurs (dès 75 jours). De même, ils ont découvert que cette répression est accentuée avec l'âge, à 90 et 105 jours.

L'étude par RT-PCR de l'expression de RTN3 dans le muscle gastrocnémien montre que cet ARNm est exprimé de façon ectopique chez des animaux SOD1 G86R et ceci bien

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avant l'apparition des premiers troubles moteurs. En effet, cette expression est détectable dès 75 jours et les animaux utilisés pour ces expériences sont asymptomatiques, les premiers troubles moteurs apparaissant après 105 jours. De plus, le niveau d'expression de cet ARNm augmente avec l'âge. Ces expériences montrent que l'expression ectopique de RTN 3 est précoce dans les muscles.

Il a été également étudié les niveaux d'expression des différents membres de la famille des réticulons. Les résultats montrent l'expression dans les muscles gastrocnémiens des gènes RTN lA et 1C, RTN 2M (isoforme spécifique des tissus musculaires), et des isoformes du gène NogoA et NogoC (ou RTN 4). Il a été également détecté une expression ectopique de l'isoforme NogoA associée à une répression de l'isoforme NogoC. Ces modifications semblent cependant plus tardives dans le décours de la pathologie, mais précèdent l'apparition des premiers troubles moteurs visibles (105 jours).

Ainsi, l'expression ectopique et précoce du gène RTN-3 dans un tissu facilement accessible à la biopsie peut servir de marqueur moléculaire dans une pathologie neurodégénérative, telle que la sclérose latérale amyotrophique.

A ce titre, un premier objet de l'invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic (ou d'évaluation de l'évolution) d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un sujet, cette méthode comprenant la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3, in vitro, ex vivo ou in vivo.

Un autre objet de la présente invention est relatif à des outils de diagnostic de cette pathologie ou de suivi de l'évolution de cette pathologie, notamment lors d'un traitement thérapeutique approprié.

Un autre objet de la présente invention est un procédé pour identifier ou caractériser un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'un produit du gène RTN3, comprenant une étape consistant à mettre en contact au moins un composé-test avec un système biologique capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3, suivie d'une étape consistant à évaluer la capacité du composé-test à moduler cette expression.

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Plus généralement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un produit d'expression du gène RNT3 comme marqueur d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique ou une myopathie.

Dans le contexte de la présente invention, un sujet ou un patient inclut tout sujet ou patient mammifère et de préférence un sujet ou un patient humain.

Par produit d'expression du gène RTN3, on entend, selon l'invention, tout composé dérivant de ce gène, notamment par duplication, transcription, traduction et inclut, en particulier, tout ADN, ARNm, ADN artificiel, ADN synthétique ou semi-synthétique codant le polypeptide RTN3, ou le polypeptide RTN3. Des polypeptides et acides nucléiques correspondants ont été précédemment décrits (chez l'homme : Moreira et al., Genomics, 1999 May 15 ;58(1)73-81). De manière plus spécifique, le polypeptide humain RTN3 inclut le polypeptide présentant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2 et le polypeptide murin RTN3 inclut le polypeptide présentant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1, ou un de leurs variants ou homologues. Les variants ou homologues comprennent tout polypeptide RTN3 résultant d'un polymorphisme, d'altérations ou de variations naturelles, telles qu'épissages, formes tronquées ou tout autre polypeptide obtenu essentiellement de manière naturelle présentant des aminoacides délétés ou substitués.

Les séquences en acides aminés sont les suivantes.

Séquenceprotéique de RTN3 murin : Q9ES97. Reticulon protein gi#13633928#sp#Q9ES97#RTN3~MOUSE Reticulon protein 3 SEQ ID No. 1 : MAESSAATQSPSVSSSSSGAEPSALGGGGGSPGACPALGAKSCGSSCAVHDLIFW RDVKKTGFVFGTTLIMLLSLAAFSVISWSYLILALLSVTISFRVYKSVIQAVQKS EEGHPFKAYLDVDITLSSEAFHNYMNAAMVHVNKALKLIIRLFLVEDLVDSLKL AVFMWLMTYVGAVFNGITLLILAELLVFSVPIVYEKYKTQIDHYVGIARDQTKSI VEKIQAKLPGIAKKKAE

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Séquenceprotéique de RTN3 humain : 095197. Reticulon protein gi#13633880#sp#O95197#RTN3~HUMAN Reticulon protein 3 (Neuroendocrine-specific protein-like 2) (NSP-like protein II) (NSPLII) SEQ ID No. 2 : MAEPSAATQSHSISSSSFGAEPSAPGGGGSPGACPALGTKSCSSSCAVHDLIFWR DVKKTGFVFGTTLIMLLSLAAFSVISVVSYLILALLSVTISFRIYKSVIQAVQKSEE GHPFKAYLDVDITLSSEAFHNYMNAAMVHINRALKLIIRLFLVEDLVDSLKLAVF MWLMTYVGAVFNGITLLILAELLIFSVPIVYEKYKTQIDHYVGIARDQTKSIVEKI QAKLPGIAKKKAE Ainsi, la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène RTN 3 peut être réalisée de différentes manières, notamment en évaluant (en mesurant, en déterminant ou en dosant) la quantité ou la présence du produit d'expression de ce gène à partir d'un échantillon biologique extrait du sujet, en particulier à partir d'un échantillon cellulaire ou tissulaire, tel qu'une biopsie musculaire, ou à partir d'un fluide biologique, tel que le sang, du sujet.

Plus particulièrement, le produit d'expression du gène RTN3 correspond à un produit transcrit ou traduit de ce gène, tel que les ARNm ou les pré-ARN ainsi que les polypeptides comme les protéines, les fragments ou les peptides correspondants, etc..

A cet égard, dans une première variante de l'invention, la détection de la modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3 comprend la détermination de la quantité ou de la présence du polypeptide RTN3 exprimé dans un échantillon biologique extrait d'un sujet.

La présence ou la quantité d'un polypeptide RTN3 peut être déterminée par une méthode connue de l'homme de l'art, incluant des tests immunologiques (ELISA, EIA, RIA, etc.). Ce test peut utiliser tout agent présentant une affinité spécifique pour le polypeptide RTN3, de préférence un anticorps dirigé contre des épitopes spécifiques de RTN3, un fragment ou un dérivé de cet anticorps (anticorps anti-RTN3).

La présente invention a donc également pour objet un anticorps qui se lie à un polypeptide RTN3. L'anticorps est de préférence obtenu par un ou plusieurs programmes d'immunisation d'un animal avec un polypeptide RTN3 tel que décrit ci-dessus. A ce

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titre, un objet de la présente invention inclut une méthode de préparation d'un anticorps, cette méthode comprenant l'injection à un mammifère non-humain d'un polypeptide RTN3 tel que décrit précédemment et la récupération de l'anticorps, du sérum ou des cellules produisant des anticorps à partir dudit mammifère.

L'anticorps peut être monoclonal ou polyclonal ainsi que des fragments ou des dérivés, en particulier les fragments ou dérivés de ces anticorps présentant la même spécificité antigénique. Ainsi, sont inclus les fragments d'anticorps, tels que Fab, Fab'2, CDRs, etc., les anticorps humanisés, polyfonctionnels ou simple chaîne (ScFv). Ils peuvent être obtenus par des méthodes conventionnelles, incluant l'immunisation d'un animal et récupération du sérum ou des cellules spléniques (pour produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).

Les méthodes de production d'anticorps polyclonaux de diverses espèces, incluant les souris, rongeurs, primates, chevaux, cochons, lapins, etc., sont notamment décrites par Vaitukaitis et al., 1971. L'antigène est combiné avec un adjuvant (par exemple l'adjuvant de Freund) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée, puis les immunoglobulines (ou le sérum) sont séparées de l'échantillon sanguin prélevé.

Les méthodes de production d'anticorps monoclonaux de diverses espèces, telles que décrites ci-dessus, peuvent être trouvées, par exemple, dans Harlow et al (Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988) ou dans Kohler et al (Nature 256 (1975) 495).

Brièvement, ces méthodes comprennent une étape d'immunisation d'un animal avec l'antigène, suivie d'une étape de récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes obtenus produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par des dilutions pour isoler des clones individuels.

Les anticorps peuvent être produits aussi par sélection à partir de banques combinatoires d'immunoglobulines, tel que décrit notamment par Ward et al (Nature 341 (1989) 544).

Les fragments Fab ou F (ab')2 être préparés par digestion avec des protéases selon des techniques conventionnelles. Les anticorps humanisés peuvent être préparés selon la technique précédemment décrite (Jones 1986).

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Ainsi, afin d'identifier la protéine RTN3 ou ses différentes isoformes, des anticorps polyclonaux ont été produits à partir de la séquence protéique humaine SEQ ID n 1. Les épitopes choisis présentent une très forte homologie avec la séquence murine correspondante afin d'obtenir des anticorps polyclonaux présentant des réactions croisées entre l'homme et la souris. Deux programmes d'immunisation ont permis l'obtention d'anticorps reconnaissant spécifiquement le domaine Réticulon (région C terminale) et le domaine spécifique de l'isoforme RTN3 (Région N terminale).

Des lapins ont été immunisés avec deux peptides pour chaque programme d'immunisation. La position des peptides est indiquée sur les séquences protéiques de RTN3 (voir les exemples).

Les anticorps obtenus sont d'une part des anticorps anti-domaine réticulon de la protéine RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes : SEQ ID n 3: CYVGIARDQTKSIVE-CONH2 SEQ ID n 4: CKIQAKLPGIAKKKAE Les anticorps obtenus sont d'autre part des anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes : SEQ ID n 5: MAEPSAATQSHSISSC-CONH2 SEQ ID n 6: SSFGAEPSAPGGGC-CONH2 Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues, tels que des toxines, marqueurs, actifs pharmaceutiques ou autres agents thérapeutiques, de manière covalente ou non, directement ou par le biais d'un agent de couplage ou un linker . Les marqueurs incluent les radiomarqueurs, les enzymes, les marqueurs fluorescents, des particules magnétiques, etc.. Les méthodes d'utilisation de tels fragments hétérologues sont illustrées, par exemple, dans les brevets US4. 277.149 et US 3.996.345.

Les anticorps de la présente invention ont des applications variées, incluant l'utilisation pour le diagnostic, pour l'immuno-purification ou pour la détection d'un polypeptide RTN3 dans un échantillon (e. g., biopsie musculaire). En particulier, ils peuvent être utilisés in vitro dans le cadre de méthodes de criblage, telles que décrites ci-dessous, ou pour détecter ou quantifier la présence ou la quantité de polypeptides RTN3 dans un échantillon prélevé chez un sujet, typiquement une biopsie musculaire d'un mammifère, en particulier d'un être humain.

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Alternativement, les complexes anticorps anti-RTN3-polypeptide RTN3 peuvent être révélés et/ou quantifiés en utilisant un deuxième réactif (e. g., un anticorps), marqué, qui se lie audit anticorps anti-RTN3, par exemple.

Selon une autre variante de l'invention, les produits d'expression du gène RTN3 sont les ARNm du gène RTN3. Les ARNm du gène RTN3 peuvent être détectés par des techniques classiques et en particulier soit par des méthodes d'amplification, telles que les techniques RT-PCR ou RT-PCR semi-quantitative à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme, soit par des expériences de transfert d'ARN messagers sur membrane et d'hybridation avec des sondes spécifiques, de type expériences de Northern blot.

Les ARNs messagers totaux et les protéines utilisés pour ces expériences peuvent être extraits de tissus biologiques, tels que tissus musculaires, ou de fluides biologiques, tels que le sang, par les techniques classiques et couramment employées.

Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (Ligase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification), PCE (an enzyme amplified immunoassay) et ADNb (branched DNA signal amplification).

Selon un mode particulier de l'invention, la détection de la présence ou de la quantité d'ARNm comprend l'extraction d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, en particulier de biopsies musculaires, in vitro or ex vivo, la synthèse d'ADNc, une étape d'amplification (PCR) avec des amorces d'oligonucléotides, et l'analyse des produits PCR.

Selon un autre mode particulier de l'invention, la détection de la présence ou de la quantité d'ARNm comprend l'extraction d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, en particulier de biopsies musculaires, in vitro ou ex vivo, la mise en contact desdits ARNm avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm RTN3 dans des conditions permettant l'hybridation avec lesdits ARNm, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.

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Typiquement, la détection d'ARN du gène RTN3 est réalisée par: - l'obtention d'ARN totaux ou messagers à partir d'un échantillon biologique, tel qu'une biopsie musculaire, - la synthèse d'ADNc par reverse transcription, - une amplification par PCR (polymerase chain reaction) de l'ADNc en présence d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du gène RTN3, - la détection (ou quantification) du produit PCR, en particulier par mise contact avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm RTN3 (détection indirecte), en particulier dans des conditions permettant l'hybridation, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.

De façon plus spécifique, l'étape d'amplification par PCR peut correspondre à plusieurs étapes d'amplification, la première consistant à une amplification PCR à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du domaine Réticulon présentant un consensus pour l'ensemble des gènes de cette famille et qui est commune à l'ensemble des isoformes de ce gène, la deuxième correspondant à la mise en évidence de la région spécifique à l'isoforme du gène considéré (RTN3) à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques des ARNm RTN3.

L'amplification RT-PCR d'ARNm du gène RTN3 peut être réalisée en utilisant des amorces spécifiques du RTN3. Des exemples de telles amorces sont les séquences SEQ ID NO: 7 et 8. Dans le cas où l'on utilise également des amorces spécifiques du domaine réticulon, on peut mettre en #uvre les amorces de SEQ ID NO: 9 et 10. Bien entendu, d'autres amorces peuvent être dessinées par l'homme du métier pour l'étape d'amplification. Les amorces sont de préférence de 15-25 bases de long.

Aussi, une sonde spécifique du gène RTN3 peut être l'acide nucléique de SEQ ID NO: 11ou son brin complémentaire, ou un de ses fragments, de préférence le fragment est d'au moins 15, et mieux de 20-30 bases. La sonde peut être marquée en utilisant toute technique connue, telle que radioactivité, fluorescence, enzymatique, chimique, etc. La présente invention n'est pas liée ou limitée par ces techniques particulières de détection ou de marquage, d'autres méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées.

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La séquence SEQ ID NO: 11est la suivante (N représentant une des 4 bases : A, C, G ou T). Elle correspond à une séquence nucléotidique du clone R. 42 (voir les exemples): CTTCTACAACCTTTTTAATAATCNTTTNATCTCTTCGAGTCTTTGTTT AAAAAAACAAAACCGAAAAAACCCTCTCATGTAACACAGAAACCTT TCNTNTTATTTTAACACAGCAGCAGCAACAAAGAAAAGAGCAAACT GTGGAGGCTTCCAGTGCAGAACGAGGTCCCTTGTTAGGAGACCCCA TAGACCATGGGTGCGTTCACTTCCTGGGAGGGCAGAGCATGGTGAT GGAGTGTTGTCTACAGTGGAAATGAAAGATTCAAAAT Les produits d'expression du gène RTN3 se situent généralement dans les cellules. Ainsi, la détection de ces derniers comprend généralement une étape de traitement de l'échantillon pour rendre accessible ces produits d'expression à un agent d'affinité. Ce traitement peut être mis en #uvre par toute technique conventionnelle de fixation, ou toute autre méthode classiquement utilisée en (immuno)histologie.

Comme décrit ci-dessus, la présente invention permet le diagnostic ou le suivi d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, telle que la SLA ou une myopathie par l'évaluation ou la détermination de l'expression anormale d'un produit du gène RTN3. Cette expression anormale d'un produit du gène RTN3 peut correspondre à une surexpression ou à une sous-expression d'un ARNm RTN3 ou d'un polypeptide RTN3, une modification ou l'apparition d'un ARNm RTN3 ou d'un polypeptide RTN3 due à un épissage, une mutation, une délétion, etc. Généralement, l'expression réprimée de l'ARNm RTN3 dans les moelles lombaires du sujet ou son expression ectopique dans le muscle gastrocnémien est indicatif d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, telle que la SLA ou une myopathie.

Tel qu'indiqué ci-dessus, la détection d'un produit du gène RTN3 peut être déterminée par une détermination relative d'un produit d'expression de ce gène contenue dans un échantillon biologique. Selon un mode particulier, la présence ou la quantité d'un produit d'expression de RTN3 dans un échantillon est comparée à une valeur moyenne calculée à partir d'un échantillon de sujet non susceptible de présenter cette pathologie.

La méthode de diagnostic selon la présente invention peut être utilisée seule ou en combinaison avec d'autres marqueurs, tels que mutation de SOD1, dosage de la 3-

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nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2, détection d'une expression ectopique de l'isoforme NogoA ou d'une répression de l'isofonne NogoC.

Ainsi, selon un mode spécifique, la méthode de diagnostic comprend en outre une ou plusieurs étapes de détection d'un autre marqueur biologique choisi parmi : mutation SOD1, dosage de la 3-nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2, détection d'une expression ectopique de l'isoforme NogoA et détection d'une répression de l'isoforme NogoC, cette (ou ces) étape (s) détection étant mise (s) en#uvre selon des méthodes identiques à celles décrites ci- dessus.

La présente invention a également pour objet des kits utilisables dans le cadre de la méthode de diagnostic décrite ci-dessus comprenant au moins un des réactifs de détection de l'expression d'un des produits du gène RTN3 dans un échantillon. Les réactifs peuvent inclure des anticorps, des sondes, des amorceurs, des supports, etc.

Un autre objet de la présente invention est un procédé pour identifier ou caractériser un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'un produit du gène RTN3, comprenant a) une étape consistant à mettre en contact au moins un composé-test avec un système cellulaire capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3, b) suivie d'une étape consistant à évaluer la capacité du composé-test à moduler cette expression, notamment en sélectionnant les systèmes cellulaires ayant une expression modifiée par rapport au même système cellulaire n'ayant pas été mis en contact avec ledit composé- test.

La méthode peut être mise en #uvre pour sélectionner ou identifier des activateurs ou des inhibiteurs de l'expression du gène RTN3 ou de son activité.

Selon une variante de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de criblage des composés identifiés à l'étape b) par leur mise en contact avec un système cellulaire exprimant un produit d'au moins un gène de la famille des réticulons autre que RTN3, en particulier RTN1 ou 2. Cette étape supplémentaire permet de déterminer les composés- test qui modulent de manière sélective l'expression du gène RTN3.

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La présente invention permet de cribler différents types de composés, notamment des composés synthétiques, incluant des produits organiques, des lipides, des polysaccharides, peptides, protéines, acides nucléiques (par exemple, des séquences antisens), etc. Ces composés à tester peuvent être d'origines diverses, naturelle ou synthétique. Ils peuvent correspondre à une substance organique ou minérale, isolée ou en mélange avec d'autres substances. Ils peuvent provenir de banques de composés (e.g., obtenues par chimie combinatoire).

Le composé-test peut être défini ou non en terme de structure et/ou de composition. Par exemple, les composés peuvent être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé, mais de structure indéfinie, un mélange de plusieurs composes caractérisés et connus ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. Des exemples de telles compositions incluent des échantillons tissulaires, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc.

En général, l'activité de ces composés est inconnue et la méthode selon l'invention est mise en oeuvre pour identifier des composés présentant la propriété recherchée (e. g. ; modulation de l'expression du gène RTN3). Cependant, dans les cas où l'activité du composé-test est connue, la méthode de criblage peut être utilisée pour caractériser ladite activité en terme de spécificité, d'efficacité, etc. et/ou pour optimiser cette activité en testant des dérivés de ce composé-test .

Ce procédé de criblage peut être réalisé dans n'importe quel dispositif approprié, tels que des tubes, des boites, etc. Les boites peuvent être à plusieurs puits, ce qui permet de tester plusieurs composés en parallèle.

D'autres aspects de la présente invention résident dans les kits pour réaliser les méthodes décrites ci-dessus, les cultures cellulaires, les supports et autres réactifs.

Comme mentionné précédemment, la présente invention propose des compositions et des méthodes pour détecter l'expression du gène RTN3 et cribler des composés capables de moduler cette expression. La présente invention décrit donc des compositions et des méthodes permettant la détection spécifique de cette expression. Le procédé de criblage selon l'invention peut être adapté à un criblage à haut débit, high throughput ,

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permettant à un grand nombre de composés d'être testé rapidement, et permet ainsi l'identification de composés éventuellement spécifiques de la modulation de l'expression du gène RTN3.

Le système cellulaire utilisé dans le procédé de criblage selon l'invention doit donc être capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3 tel que défini ci-dessus. Ce système inclut notamment une cellule hôte comprenant un acide nucléique ou un vecteur codant pour RTN3 tel que défini ci-dessus. Ainsi, la séquence d'acide nucléique introduite dans cette cellule hôte doit être capable de coder pour une séquence protéique RTN3, en particulier SEQ ID NO. 1 ou 2. Selon un mode particulier, la cellule hôte comprend un acide nucléique, éventuellement inclus dans un vecteur, de SEQ ID 11, tel que décrit ci-dessus.

Le vecteur contenant la séquence d'acide nucléique telle qu'indiquée ci-dessus peut être d'origine variée. Il peut être un phage, un plasmide, épisome ; artificiel, virus, etc.. Typiquement, les vecteurs plasmidiques peuvent être ceux dérivés des plasmides commercialement disponibles (pUC, pBR322, pcDNA, etc. ). D'autres vecteurs préférés sont des virus, ne particulier des virus recombinants, tells que ceux dérivés de rétrovirus, baculovirus ou lentivirus, AAVs, adenovirus, herpesvirus, etc. Les vecteurs peuvent être préparés selon des méthodes classiques couramment employées, en introduisant la molécule d'acide nucléique codant pour RTN3 ou un fragment de ce dernier dans un site de clonage approprié du vecteur. Le vecteur peut en outre comprendre des séquences régulatrices, telles que des promoteurs, des signaux de terminaison, des séquences stimulatrices, des séquences inhibitrices, etc. des origines de réplication, des gènes marqueurs, etc. Des exemples de promoteurs incluent les promoteurs permettant l'expression constitutive, régulée ou sélective de tissu, faibles ou forts, d'origine cellulaire, virale ou synthétique, tels que RVS-LTR, SV40-IE, promoteur CMV-IE, promoteurs de gènes domestiques (PGK, etc. ), promoteurs de bactéries ou de phages (T7, Lac, Trp, etc. ), etc.

Les vecteurs peuvent être utilisés pour exprimer un acide nucléique tel que décrit cidessus in vitro, ex vivo or in vivo. En particulier, ils peuvent être utilisés pour exprimer un polypeptide RTN3 ou un ARNm du gène RTN3 dans une cellule, in vitro or ex vivo.

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La cellule recombinante ou cellule hôte peut être tout type cellulaire cultivable, tel que des cellules eucrayotes ou procaryotes, incluant les bactéries, levures, des cellules d'insectes, de plantes ou de mammifères, etc.. La celule peut être une lignée cellulaire ou une culture primaire. Des exemples de cellules sont E. coli, Saccharomyces, Kluyveromyces, des cellules d'insecte, des fibroblastes de mamifère ou des celllules embryniques, HEK, CHO, COS, 3T3, 293, etc.

De manière préférée, la cellule hôte est une cellule qui n'exprime pas naturellement le polypeptide RTN3 murin ou humain. De telles cellules hôtes sont avantageusement utilisés dans le procédé de criblage, car elles permettent d'obtenir une sélectivité accrue.

Un objet de l'invention est la préparation de cellules exprimant les polypeptides RTN3, cette méthode comprenant l'introduction dans des cellules in vitro une molécule d'acide nucléique ou un vecteur tel que défini ci-dessus et la sélection des cellules qui expriment les polypeptides RTN3. L'introduction de l'acide nucléqiue ou du vecteur peut être réalisée par des moyens technqiues classiques, tels que transfert d'ADN direct, transfection par un lipide, électroporation, etc. Les cellules sont cultivées dans un milieu approprié et stockées selon des méthodes conventionnelles.

Le procédé de criblage comprend donc une étape de contact du composé-test avec un système cellulaire exprimant un produit du gène RTN3, notamment avec la cellule hôte décrite ci-dessus, suivi d'une étape d'évaluation de la capacité du composé-test à moduler l'expression du gène RTN3.

Ainsi, cette étape d'évaluation peut être réalisée de manière identique à celle décrite cidessus dans le cadre du procédé de diagnostic, notamment à l'aide d'anticorps, éventuellement marqués, en particulier les anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 et de préférence dirigés contre les épitopes de séquences SEQ ID n 5 et 6. Alternativement, les complexes anticorps anti-RTN3-polypeptide RTN3 peuvent être révélés et/ou quantifiés en utilisant un deuxième réactif (e. g., un anticorps), marqué, qui se lie audit anticorps anti-RTN3, par exemple.

Selon une autre variante, l'étape d'évaluation peut être réalisée à partir des ARN produits par le système cellulaire. Les méthodes de détection d'ARN sont notamment celles

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décrites ci-dessus pour le procédé de diagnostic. Ainsi, les ARNm du gène RTN3 peuvent être détectés par des techniques classiques et en particulier par des méthodes d'amplification, telles que les techniques RT-PCR ou RT-PCR semi-quantitative à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme, soit par des expériences de transfert d'ARN messagers sur membrane et d'hybridation avec des sondes spécifiques, de type expériences de Northern blot. Alternativement, d'autres méthodes de détection d'acides nucléiques peuvent être employées, telles que les méthodes LCR (Ligase Chain Reaction), TMA (Transcription Mediated Amplification), PCE (an enzyme amplified immunoassay) et ADNb (branched DNA signal amplification).

La révélation ou la quantification de l'effet produit par le composé-test sur la modulation de l'expression du gène RTN3 est réalisée par comparaison des résultats obtenus avec et en l'absence du composé-test sur le système cellulaire.

Les résultats peuvent correspondre à des mesures qui peuvent être obtenues en utilisant diverses techniques qui dépendent en particulier des moyens mis en #uvre (marquage par fluorescence, radiomarqueurs, ...). Par exemple, la mesure peut être l'évaluation par densité optique ou de fluorescence émise.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront dans la partie expérimentale suivante, qui doit être regardée à titre illustratif, ne limitant en aucune façon l'étendue de la protection recherchée.

Légende des figures Fig.lA. : Identification du clone R42., alignement de la séquence du clone R42 avec le groupe de séquence Mm. 21606 obtenu par le programme Cluster Unigene (banque de données) et identification de cette séquence comme la région non traduite de l'ADNc RTN3 (96% d'homologie).

Fig.lB. : Représentation schématique de l'organisation du gène RTN3

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Fig.2. : Etude de l'expression de l'ARNm RTN3 dans le muscle gastrocnémien au cours de la pathologie chez les souris SOD1 G86R Fig. 2A : L'ARNm RTN3 est détecté par des expériences de RT-PCR semi-quantitatives.

La bande spécifique RTN3 apparaît dès 75 jours (n=3) et son intensité augmente à 90 (n=3) et 105 jours (n=4).

Fig. 2B : LesARNm des différents membres de la famille des réticulons sont détectés par des expériences de RT-PCR semi-quantitatives à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme.

Dans le figures Fig. 2A et 2B, les ADNc obtenus par reverse transcription d'ARN totaux extraits de muscle gastrocnémien sont soumis à une étape de PCR avec des nombres de cycles permettant la linéarité du signal (n=3). Les expériences sont standardisées avec le gène domestique G3PDH. Les expériences de RT-PCR ont été réalisées à l'aide d'ARNs extraits de muscles gastrocnémiens de souris mâles sauvages (+) et de souris mâles SOD1G86R (M) de mêmes portées.

Fig. 2C : schématique des modifications d'expression des ARNm des gènes de la famille des réticulons RTN2M, RTN3, NogoA et NogoC.

Exemples Matériel biologique
La lignée de souris transgéniques utilisée dans cette étude correspond à la lignée SOD1 G86R décrite par Ripps et coll. (1995). Cette lignée exprime la mutation G-> R en position 86 sur le gène SOD1 murin, mutation identifiée dans le gène SOD1 de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique. Cette lignée est maintenue sous forme hétérozygote, la mutation ponctuelle créant un site de restriction Fspl utilisé pour le typage des souris.

Identification du clone

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Le clone R. 42 a été identifié par criblage différentiel à partir d'une banque soustractive d'ADNc correspondant aux ARN messagers réprimés dans notre modèle animal de sclérose latérale amyotrophique. Cette banque a été réalisée par la méthode de PCR-select selon les conseils du fabricant (PCR-select DNA Subtraction Kit; CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) à partir d'ARN messagers poly A+ isolés de moelles épinières lombaires de souris mâles SOD1 G86R et de souris mâles WT de mêmes portées âgées de 75 jours à l'aide du Kit "mRNA isolation kit" de Boehringer Mannheim.

Les populations d'ADNc soustraits ont été directement clonés dans le vecteur pCR2.1 en utilisant le kit TOPO T/A (TOPO T/A cloning kit ; Les clones individuels ont été repiqués dans des plaques de microtitration et utilisés comme glycerol-stocks.

Les clones positifs ont été identifiés par hybridation différentielle de sondes radioactives sur des filtres dupliqués de nitrocellulose (Zeta-Probe membranes ; BioRad) dot blottés avec des fragments PCR obtenus à partir des clones d'ADNc des banques soustraites. Pour cette méthode décrite par von Stein et coll (1997), nous avons utilisé des sondes d'ADNc radioactives au 32P préparées à partir de 2 g d'ARN totaux de moelles épinières lombaires extraits soit de souris mâles SOD1 G86R ou de souris contrôles de mêmes portées âgées de 75 jours .

Toutes les étapes de PCR ont été réalisées sur des plaques de microtitration en utilisant un appareil Hybaid Omnigene Thermocycler 96 puits.

Les clones positifs identifiés ont été amplifiés à partir des Glycérol-stocks et soumis au séquençage de l'insert sur les deux brins (DNA Sequencer, Applied Biosystems). Une recherche d'homologie de séquences réalisée à l'aide des programmes BLAST sur les banques de données de séquences GenBank du National Center for Biotechnology Information (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a révélé 96% d'homologie avec la séquence de la région 3' non-codante du gène RTN-3 (GenBank Ace N : NM053076) entre les positions 2421 et 2677 de l'ARN messager de RTN3.

La séquence nucléique de l'insert porté par le clone R42 est donnée en SEQ ID n l 1.

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Confirmation du clone et mise en évidence des variations d'expression
La confirmation de la répression de l'expression du gène RTN3 (identifié par la caractérisation du clone R. 42) a été obtenue par des expériences de Northem blot et des expériences de RT-PCR semi-quantitatives.

* Les ARN totaux ont été extraits de moelles épinières lombaires et des muscles gastrocnémiens de souris SOD1 G86R et de souris contrôles de même portée âgées de 75,90 et 105 jours. Les tissus sont congelés au moment du prélèvement puis extraits par la méthode au guanidinium thiocyanate-phenol-chloroforme (Chomczynski and Sacchi, 1987).

* Les ARNs totaux sont extraits par la méthode au guanidinium thiocyanate-phenolchloroforme à partir des tissus biopsiques humains congelés dans l'azote liquide au moment du prélèvement.

- Northem Blot : Les ARN totaux (20 a 30 g) des moelles épinières lombaires et des muscles gastrocnémiens des souris SOD1 G86R et de souris contrôles des différents ages ont été déposés sur gel d'agarose et transférés sur filtre de nitrocellulose par capillarité. Les ARNs transférés ont été hybridés avec une sonde radioactive préparée à l'aide de l'ADNc R. 42. Les résultats sont présentés figure 3A et montrent la sous-expresssion de l'ARNm RTN3 chez la souris pathologique.

- RT-PCR semi-quantitatives : Deux g d'ARN totaux ont été retrotranscrits par la transcriptase inverse de MoMuLV (Promega) par la méthode des hexamères aléatoires dans des conditions de réaction standart. Les ADNc ainsi obtenus ont été utilisés dans des expériences de PCR semiquantitatives en utilisant les oligodesoxynucléotides (ODN) choisis dans la séquence codante du gène RTN3.

Séquences des oligodésoxynucléotides pour les expériences de RT-PCR :

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Pour chaque gène étudié (RTN1, RTN2 et RTN3) par RT-PCR semi-quantitative, plusieurs paires d'oligonucléotides ont été dessinés. La première paire permet la mise en évidence d'un fragment PCR correspondant à la région connue sous le nom de domaine Réticulon présentant un consensus pour l'ensemble des gènes de cette famille et qui est commune à l'ensemble des isoformes de ce gène. La deuxième (et troisième paire le cas échéant) d'oligo permet la mise en évidence de la région spécifique à chaque isoforme du gène considéré. Chaque paire d'oligonucléotides est constituée d'un oligonucléotide "forward" (F) et d'un oligonucléotide "reverse" (R) délimitant respectivement l'extrémité 5' et 3' du fragment PCR.

RTN3: domaine RTN SEQ ID No. : 9 (ODN F) : TCTGGCAGCCTTCAGTGTTA SEQ ID No. : 10 (ODN R) : CCATCGCAGCATTCATGTAG domaine spécifique RTN3 SEQ ID No. :7 (ODN F) : CCTACGTCTCTCTTCACCCTTC SEQ ID No. : 8 (ODN R) : ACATCTCGCCAGAAAATCAGA RTN1: domaine RTN SEQ ID No. : 12 (ODN F) : CTTCTGTACTGGCGGGACAT SEQ ID No. : 13 (ODN R) : CCGTAGCTCCTTCAGAGTGC domaine spécifique RTN1A SEQ ID No. : 14 (ODN F) : GTCACTGCCCCTGTCAAGAT SEQ ID No. : 15 (ODN R) : TGCAGCAGATGGTTCTGTTC domaine spécifique RTN1C SEQ ID No. : 16 (ODN F) : CCACCAAGATGGACTGTGTG SEQ ID No. : 17 (ODN R) : TGTAGATGCGGAAGCTGATG RTN2:

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domaine RTN SEQ ID No. : 18 (ODN F) : TTGACCAGTATGTGGGGTTG SEQ ID No. : 19 (ODN R) : GATCCGGAGACTGATGCTGT domaine spécifique RTN2 cerveau (B) SEQ ID No. : 20 (ODN F) : GAACGTTTGTCCCAGCAGAT SEQ ID No. : 21 (ODN R) : ACAGAAGGGGGACGGTAAAC domaine spécifique RTN2 musculaire (Mus) SEQ ID No. : 22 (ODN F) : GTCTGCAACCGCTCTCTTG SEQ ID No. : 23 (ODN R) : CTTTGCGGTAAACCCTGAGA NogoA murin : SEQ ID No. : 24 (ODN F) : CAGGTGATGTACGCTCTGGA SEQ ID No. : 25 (ODN R) : TGAGGGAAGTAGGGATGTGC NogoC murin : SEQ ID No. : 26 (ODN F) : TGCATAATTTGTAATTGCTGCTG SEQ ID No. : 27 (ODN R) : GGCAATGTAGGCCGTTACAC Les résultats obtenus sont présentés figure 2 et confirment la modulation du gène RTN3.

Génération des anticorps Anti-RTN3 = épitopes
Afin d'identifier la protéine RTN3 ou ses différentes isoformes, des anticorps polyclonaux ont été produits (Eurogentec) à partir de la séquence protéique humaine (voir annexe). Les épitopes choisis présentent une très forte homologie avec la séquence murine correspondante afin d'obtenir des anticorps polyclonaux présentant des réactions croisées entre l'homme et la souris. Deux programmes d'immunisation a permis l'obtention d'anticorps reconnaissant spécifiquement le domaine Reticulon (région C terminale) et le domaine spécifique de l'isoforme RTN3 (Région N terminale).

Des lapins ont été immunisés avec deux peptides pour chaque programme d'immunisation. La position des peptides est indiquée sur les séquences protéiques (voir annexe).

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* Anticorps anti-domaine réticulon de la protéine RTN3 dirigé contre les épitopes suivants : SEQ ID No. 3 : SEQ ID No. 4 : * Anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 dirigé contre les épitopes suivants : SEQ ID No. 5 : SEQ ID No. 6: SSFGAEPSAPGGGC-CONH2 La position de ces peptides sur SEQ ID No. 1 et 2 est la suivante : SEQ ID No. 3 est à la position des résidus de 209 à 222 de SEQ ID1 SEQ ID No. 3 est à la position des résidus de 1 à 16 et de 208 à 221 de SEQ ID 2 SEQ ID No. 4 est à la position des résidus de 17 à 29 et de 225 à 237 de SEQ ID1 SEQ ID No. 4 est à la position des résidus de 17 à 29 et de 224 à 236 de SEQ ID2 SEQ ID No. 5 est à la position des résidus de 1 à 16 de SEQ ID1 La spécificité des anticorps a été confirmée par des expériences de Western Blot sur des extraits protéiques de muscles gastrocnémiens.

Identification des isoformes Séquences
Les différences de résultats entre les expériences de Northern et de RT-PCR suggèrent l'existence de plusieurs isoformes pour les transcrits RTN3. L'existence d'isoformes pourrait être commune à l'ensemble des gènes de la famille des réticulons.

Les isoformes sont mises en évidence par la méthode "Smart RACE-PCR" (CLONTECH). Plusieurs fragments PCR pour les régions 3' ont été identifiés et confirmés par PCR utilisant des ODN spécifiques de séquences internes au gène RTN3.

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REFERENCES Ripps, M. E., Huntley, G. W., Hof, P.R., Morrison, J. H., Gordon, J. W. (1995) Transgenic mice expressing an altered murine superoxyde dismutase provide an animal model of amyotrophic latéral sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 689-693.

Von Stein, O.D., Thies, W.G., Hofmann, M. (1997) A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes. Nucleic Acids Res 25,2598-2602.

Chomczynski, P. & Sacchi, N.(1987) Single step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162,156-159.

Claims (25)

REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire chez un sujet, cette méthode comprenant la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène codant pour RTN 3, in vitro ou ex vivo.
1. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la pathologie présentant une affection neuromusculaire est la sclérose latérale amyotrophique ou une myopathie.
2. 3. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détection d'une modulation de l'expression d'au moins un produit du gène RTN 3 est réalisée en évaluant la quantité ou la présence du produit d'expression de ce gène à partir d'un échantillon biologique extrait du sujet, en particulier à partir d'un échantillon cellulaire ou tissulaire, tel qu'une biopsie musculaire, ou à partir d'un fluide biologique, tel que le sang, du sujet.
3. 4. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est une biopsie musculaire.
4. 5. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le produit d'expression du gène RTN3 est un composé dérivant de ce gène obtenu par duplication, transcription, traduction et inclut, en particulier, tout ADN, ARNm, ADN artificiel, ADN synthétique ou semi-synthétique codant le polypeptide RTN3, ou le polypeptide RTN3.
5. 6. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le produit d'expression du gène RTN3 est le polypeptide RTN3 7 Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le polypeptide RTN3 est le polypeptide RTN3 humain, en particulier le polypeptide présentant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 1, ou le polypeptide murin RTN3, en particulier le polypeptide présentant la séquence en acides aminés SEQ ID NO: 2, un de leurs variants ou homologues.
6. 8. Méthode selon l'une des revendications 6 ou 7, dans laquelle la présence ou la quantité de polypeptide RTN3 est déterminée par un test immunologique, en particulier en utilisant un anticorps anti-RTN3, éventuellement marqué.

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7. 9. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle le produit d'expression du gène RTN3 est un ARNm du gène RTN3.
8. 10. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que les ARNm du gène RTN3 sont détectés par des méthodes d'amplification, telles que les techniques RT-PCR ou RT-PCR semi-quantitative à l'aide d'oligonucléotides spécifiques pour chaque isoforme, ou par des expériences de transfert d'ARN messagers sur membrane et d'hybridation avec des sondes spécifiques, de type expériences de Northem blot.
9. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que la détection est réalisée par l'extraction in vitro or ex vivo d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, la mise en contact desdits ARNm avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm RTN3 dans des conditions permettant l'hybridation avec lesdits ARNm, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.
10. 12. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la sonde d'acide nucléique spécifique des ARNm RTN3 est la séquence nucléotidique SEQ ID NO. 11ou son brin complémentaire, ou un de ses fragments.
11. 13. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que la détection d'ARN du gène RTN3 est réalisée par l'extraction d'ARN total à partir d'extrait de tissus biologiques, en particulier de biopsies musculaires, in vitro or ex vivo, la synthèse d'ADNc et amplification par PCR des ARNm RTN3 à l'aide d'amorces spécifiques du RTN3, suivie par une analyse des produits PCR obtenus.
12. 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'étape d'amplification par PCR comprend plusieurs étapes d'amplification, la première consistant à une amplification PCR à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du domaine Réticulon présentant un consensus pour l'ensemble des gènes de cette famille et qui est commune à l'ensemble des isoformes de ce gène, la deuxième correspondant à la mise en évidence de la région spécifique à l'isoforme du gène considéré (RTN3) à l'aide d'amorces d'oligonucléotides spécifiques des ARNm RTN3

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13. 15. Méthode selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que les amorces d'oligonucléotides spécifiques des ARNm RTN3 sont les séquences SEQ ID NO: 7 et 8.
14. 16. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que les amorces spécifiques du domaine réticulon sont les amorces de SEQ ID NO: 9 et 10.
15. 17. Méthode selon l'une des revendications précédentes 9 à 16, caractérisée en ce que la détection du produit du gène RTN3 est déterminée par : - l'obtention d'ARN totaux à partir d'un échantillon biologique, tel qu'une biopsie musculaire, - la synthèse d'ADNc par reverse transcription, - une amplification par PCR (polymerase chain reaction) de l'ADNc en présence d'amorces d'oligonucléotides spécifiques du gène RTN3, - la détection (ou quantification) du produit PCR, en particulier par mise contact avec une sonde d'acide nucléique, avantageusement marquée, spécifique des ARNm RTN3 (détection indirecte), en particulier dans des conditions permettant l'hybridation, suivie d'un dosage des formes hybrides obtenues, avantageusement marquées.
16. 18. Méthode selon l'une des revendications précédentes 9 à 17, caractérisée en ce que l'expression réprimée de l'ARNm RTN3 dans les moelles lombaires du sujet ou son expression ectopique dans le muscle gastrocnémien est indicatif d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, telle que la SLA ou une myopathie.
17. 19. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la présence ou la quantité d'un produit d'expression de RTN3 dans un échantillon est comparée à une valeur moyenne calculée à partir d'un échantillon de sujet non susceptible de présenter cette pathologie.
18. 20. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que comprend en outre une ou plusieurs étapes de détection d'un autre marqueur biologique choisi parmi : mutation SOD1, dosage de la 3-nitrotyrosine dans le LCR, analyse des variants d'épissage du transporteur au glutamate EAAT2, détection d'une expression ectopique de l'isoforme NogoA et détection d'une répression de l'isoforme NogoC.

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19. 21. Utilisation d'un produit d'expression du gène RNT3 comme marqueur d'une pathologie présentant une affection neuromusculaire, en particulier la sclérose latérale amyotrophique ou une myopathie 22. Kit ou outils de diagnostic utilisables dans une méthode selon l'une des revendications 1 à 20, comprenant au moins un des réactifs de détection de l'expression d'un des produits du gène RTN3 dans un échantillon.
20. 23. Anticorps anti-domaine réticulon de la protéine RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes : SEQ ID n 3: CYVGIARDQTKSIVE-CONH2 SEQ ID n 4: CKIQAKLPGIAKKKAE 24. Anticorps anti-domaine spécifique de la protéine RTN3 dirigés contre les épitopes de séquences suivantes : SEQ ID n 5: MAEPSAATQSHSISSC-CONH2 SEQ ID n 6: SSFGAEPSAPGGGC-CONH2 25. Procédé pour identifier ou caractériser un composé ayant la capacité de moduler l'expression d'un produit du gène RTN3, comprenant a) une étape consistant à mettre en contact au moins un composé-test avec un système cellulaire capable d'exprimer au moins un produit du gène RTN 3, b) suivie d'une étape consistant à évaluer la capacité du composé-test à moduler cette expression, notamment en sélectionnant les systèmes cellulaires ayant une expression modifiée par rapport au même système cellulaire n'ayant pas été mis en contact avec ledit composé-test.
21. 26. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en qu'il comprend en outre une étape de criblage des composés identifiés à l'étape b) par leur mise en contact avec un système cellulaire exprimant un produit d'au moins un gène de la famille des réticulons autre que RTN3, en particulier RTN1 ou 2.
22. 27. Procédé selon la revendication 25 ou 26, caractérisé en ce que le système cellulaire est une cellule hôte comprenant un acide nucléique ou un vecteur codant pour RTN3.

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23. 28. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique introduite dans cette cellule hôte est capable de coder pour une séquence protéique RTN3, en particulier SEQ ID NO. 1 ou 2.
24. 29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que la cellule hôte comprend un acide nucléique de SEQ ID 11.
25. 30. Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que l'évaluation de la capacité du composé-test à moduler l'expression du gène RTN3 correspond à une révélation ou une quantification de l'effet produit par ledit composé-test par comparaison des résultats obtenus avec et en l'absence du composé-test sur le système cellulaire.