KR20190083110A

KR20190083110A - 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물 및 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트

Info

Publication number: KR20190083110A
Application number: KR1020180000652A
Authority: KR
Inventors: 임혜인; 김백선
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2019-07-11
Also published as: KR102574799B1

Abstract

본 발명은 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 바이오마커 조성물 및 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 금단증상을 나타내는 동물모델에서 특이적 발현 양상을 나타내었고, 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 바이오마커 miR-137을 조절할 수 있는 효과를 가지음을 확인한 바, RAVER2 단백질을 이용하여 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 관련된 제약 및 의료 사업에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물 및 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트{Bio-marker for drug addiction diagnosis and kit for drug addiction diagnosis}

본 발명은 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 바이오마커 조성물 및 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 RAVER2 단백질에 기반한 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 "마약(narcotics)"은 아편 및 이의 유도체와 유사한 효과를 가지는 화합물을 의미하고, 사전적으로는 모르핀, 코케인, 노스카핀, 파파베린, 테바인, 헤로인 등의 습관성 또는 중독성 약물을 포함하는 양귀비 식물로부터 유래된 자연 배합물인 아편성 약물 또는 아편 유사 약물로 정의된다. 어떠한 화합물이 마약으로 분류되기 위해서는 "감정 및 행동의 중대한 변화"를 유발할 수 있어야 하고, "혼수의 무통"의 상태를 유발할 수 있어야 하며, 의존성, 내성 및 중독과 같은 심각한 위험을 나타낼 수 있음을 입증하여야 한다.

이러한 마약의 남용으로 약물에 대한 의존성이 생기고, 사용할 때마다 양을 늘려야 효과가 생기는 내성(tolerance)가 생긴 것으로, 마약을 사용하지 않으면 온 몸에 견디기 힘든 이상을 일으키는 금단 증상(withdrawal symptoms)이 생기는 현상을 마약 중독(drug addiction)이라고 한다.

마약중독자들은 중독성 마약을 사용하지 않으면 정상적인 생활을 할 수 없는 상태가 되며, 어느 특정 부분에 몰입하게 되는 성향을 보이는 외에 편집성정신분열증, 심장장애, 혈압상승, 구토, 호흡곤란, 감각능력상실, 의식상실, 악몽, 착란상태 등의 증세를 보이게 된다.

현재까지 이러한 마약 중독 혹은 금단증상을 판별하기 위한 진단 방법으로 외형 및 행동 분석과 소변, 혈액 검사 혹은 눈동자 검사 등을 수행하였으나, 이는 정확도가 낮고, 마약에 노출되어 있는 마약 복용 중이거나 중단한지 얼마 안되었을 때, 병리학적 증상이 있는 경우에만 적용이 가능하다.

따라서 이러한 병리학적인 증상을 보이는 원인을 규명하기 위해 여러 연구들이 수행되어 왔으나, 이러한 원인의 해결 및 마약 금단 증상을 진단하기 위한 연구개발이 많이 이뤄지지 않고 있는 실정이다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 마이크로 RNA를 이용하여 마약 중독여부를 판별하고자 한 문헌이 공지되었으나, 이 역시 상당히 제한적이고 복잡한 전처리 실험과정을 거쳐야 하며, 많은 처리시간과 노동력이 필요하다는 문제점과 더불어, 마약에 지속적으로 노출된 상태에서의 증상에 관한 것이 대부분이라는 한계점이 있다.

특허문헌 1. 대한민국공개특허공보 제10-2017-0125493호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 마약 중독 또는 금단증상을 신속하고 정확하게 진단 및 분석할 수 있는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물, 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트 및 마약 중독 또는 금단증상을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 마약 중독 또는 금단증상을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질을 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, RAVER2 단백질을 유효성분으로 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 RAVER2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 마약은 메스암페타민, 암페타민, 코카인, 엑스터시 및 메칠페니테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 메스암페타민일 수 있다.

상기 RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 마약 금단증상을 겪고 있는 동물로부터 분리된 생물학적 시료에서 발현이 감소하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, RAVER2 단백질 또는 RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물을 제공한다.

상기 RAVER2 단백질의 발현을 측정하는 제제는 상기 RAVER2 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 리간드 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.

상기 RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여 상기 조성물을 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여 마약 중독 또는 금단증상 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.

a) 피검체로부터 분리된 시료에서 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

b) 상기 a)에서 선택된 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료의 해당 단백질 혹은 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 시료는 뇌 조직일 수 있다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여 다음 단계를 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 치료 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

a) RAVER2 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 후보물질이 처리된 세포 또는 동물모델로부터 RAVER2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 상기 2) 단계에서 측정한 RAVER2 단백질의 발현 수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면 RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 금단증상을 나타내는 동물모델에서 특이적 발현 양상을 나타내었고, 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있는 바이오마커 miR-137을 조절할 수 있는 효과를 가지음을 확인한 바, RAVER2 단백질을 이용하여 마약 중독 또는 금단증상을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 관련된 제약 및 의료 사업에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 실험예 1. 나.에 따른 각 그룹별로 선조체에서의 miR-135a, miR-135b, miR-137, miR-139-5p, miR-132의 발현양을 측정한 데이터이다.
도 1b는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 miR-137 유전자를 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 통해 1-2주, 3-4주간 주입한 실험군(exposure)과, 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 군에서 주사를 중단한 다음, 경과하는 시간(1-2주, 3-4주, 5-6주, 7-8주)에 따라 혈액을 채취한 금단 실험군(withdrawal)으로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다.
도면에는 4주의 주사 주입하는 과정으로부터 연속적인 시간으로 계산하여, 5-6W, 7-8W, 9-10W, 11-12W로 표기하였다.
도 1c는 도 1a의 선조체에서의 miR-137 발현양에 대한 도 1b의 혈액에서의 miR-137 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 1d는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별로 miR-132 유전자 발현양상을 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 통해 1-2주, 3-4주간 주입한 실험군(exposure)과, 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 군에서 주사를 중단한 다음, 경과하는 시간(1-2주, 3-4주, 5-6주, 7-8주)에 따라 혈액을 채취한 금단 실험군(withdrawal)으로부터 miR-132의 발현양을 비교한 결과이다.
도면에는 4주의 주사 주입하는 과정으로부터 연속적인 시간으로 계산하여, 5-6W, 7-8W, 9-10W, 11-12W로 표기하였다.
도 1e는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별 혈액으로부터 miR-135a 유전자 발현양상을 분석하기 위한 것이다.
도 2a는 본 발명의 실험예 2에 따른 금단 증상이 유도된 생쥐 동물모델의 실험설계를 도시한 개략도이다.
도 2b는 본 발명의 실험예 2. 나에 따른 각각의 그룹별로 메스암페타민 금단 증상을 1, 3, 6주간 유도한 후, 선조체를 분리하고, 이로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다.
도 2c는 본 발명의 실험예 2. 다에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 miR-137 유전자를 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 통해 2주 동안 주입한 후, 주입을 중지하고 1, 3, 6주가 경과한 경우(withdrawal)에 동물모델의 혈액으로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다.
도 2d는 도 2b의 선조체에서의 miR-137 발현양에 대한 도 2c의 혈액에서의 miR-137 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명의 실험예 3. 나에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 단백질을 규명하기 위한 것으로, 금단 증상을 유도한 후, 선조체로부터 hnRNPA1, hnRNPA3, hnPNPDL, hnRNPU, PTBP-1, RAVER2, SYNCRIP 및 YBX1의 mRNA 발현양을 비교한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 실험예 4. 나에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 단백질을 규명하기 위한 것으로, 금단 증상을 유도한 후(1주, 3주, 6주), 선조체로부터 RAVER2 단백질 발현양을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(좌측)와 qPCR 결과 그래프(우측)이다.
도 4a는 RAVER2 mRNA의 염기서열과 miR-137의 염기서열을 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 실험예 5에 따르면 HEK293TN 세포에서의 루시퍼라제 활성 측정 결과이다. 각각 세포들에 대해 루시퍼라제 벡터를 통해 군(miR-137)과 대조군에서 RAVER2 3'UTR의 발현양을 측정하였다.
도 4c는 렌티바이러스 벡터의 개략적인 구조와 렌티바이러스 벡터를 이용한 세포내 RAVER2 단백질 발현 억제하는 실험설계를 도시한 도면이다.
도 4d는 본 발명의 실험예 5에 따르면 SH-SY5Y 세포에서 형광현미경이미지이다., 각각 세포들에 대해 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에 대한 것이다.
도 4e는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 RAVER2 mRNA 발현양을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4f는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 RAVER2 단백질의 발현양을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과(좌측)와 qPCR로 측정한 그래프(우측)이다.
도 4g, h는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 miR-137 발현양을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137 발현양을 qPCR로 분석한 그래프이고, 도 5c는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137 발현양을 qPCR로 분석한 그래프이다.
도 5b, 도 5d 및 도 5e는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137을 이용한 ROC 커브 분석 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면은 RAVER2 단백질을 유효성분으로 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "RAVER2 단백질"은 인간에서 678개, 생쥐에서 673개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 분자량이 74 kDa의 단백질로, 서열번호 1로 표시될 수 있다.

또한, 상기 RAVER2 단백질의 mRNA 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있다(인간 NM_018211.3)(서열번호 2), (생쥐 NM_183024.1)(서열번호 3).

본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로, 상기 진단은 마약 중독 여부뿐만 아니라 마약을 중단한 이후 나타나는 마약 금단 증상 등을 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 목적상, 진단은 마약에 의한 중독 또는 금단 상태 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

또한 "바이오 마커"란 진단용 마커 또는 진단 마커로도 쓰일 수 있으며, 생물학적 시료에서 마약 중독 또는 금단 증상 발생 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 마약 금단 증상이 유도된 동물모델에서 RAVER2 단백질 발현의 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(mRNA) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

상기 "마약 중독"이란 의존성이 강한 약물인 마약을 투여, 섭취하게 됨으로써 일어나는 증독을 포괄적으로 지칭하고, 마약 의존성의 한 종류이며, 신체적, 정신적 손상과 같은 감정삼태임에도 불구하고 계속적으로 마약을 찾거나 마약을 취하게 되는 자가통제능력이 결핍된 상태로, 마약에 장기간 노출되어 있는 상태라고 정의될 수 있다.

또한 "마약 금단"이란 의존성이 강한 약물인 마약을 반복적으로 투여하고, 상기 마약에 대한 의존성이 높은 상태에서 마약을 취하지 않는 철회기간(withdrawal period) 동안에 마약을 취하고자 하는 갈망(craving)이 유도되고, 이로 인해 발생하는 다양한 정신질환 등의 증상들을 포괄적으로 지칭한다.

상기 마약은 메스암페타민, 암페타민, 코카인, 엑스터시 및 메칠페니테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 메스암페타민일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, RAVER2가 마약 중독 또는 마약 금단 증상이 유도된 동물모델에서 특이적으로 감소되었음을 확인하였는 바, RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 마약 금단 증상을 겪고있는지 여부를 진단할 수 있는 바이오마커 조성물로 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 RAVER2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물에 관한 것으로, 이를 이용하여 피검체로부터 마약의 중독 또는 금단 증상을 진단할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마약을 장기간 투여한 후, 중단하여 마약 금단 증상이 유발된 동물모델을 제작하였다. 제작된 동물모델은 뇌조직에서 RAVER2가 감소하는 것을 발견하였다.

이에 본 발명자들은 상기 동물모델에서 RAVER2의 발현양상에 따라 마약 중독, 금단증상과 관련된 miR-137의 발현양상을 비교하였고, 그 결과 RAVER2로 인해 miR-137의 발현을 제어할 수 있음을 확인하였다. 이는 상기 RAVER2의 발현이 저하되면 동물모델에서 마약 중독 또는 금단 증상을 진단할 수 있음을 나타내는 것이다. 즉 RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 금단 증상을 진단하는 miR-137과 동등한 경향의 발현양상을 보이므로 RAVER2 단백질의 비정상적인 감소를 통해 마약 중독 또는 금단 증상을 진단 및 확인할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서 "RAVER2 단백질 또는 RAVER2를 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제"란 상기와 같이 마약 중독 또는 마약 금단 증상이 유도된 동물 혹은 동물모델의 생물학적 시료에서 발현이 증가하는 마커인 RAVER2의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하여, 이의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.

상기 RAVER2 단백질의 발현을 측정하는 제제는 상기 RAVER2 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 RAVER2 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 마약 중독 또는 마약 금단증상 진단용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머 레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 RAVER2 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

상기 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 RAVER2 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트에는 RAVER2 단백질 또는 RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키트는 바이오마커 조성물과 진단용 조성물을 포함하고 있고, 이에 대한 설명은 앞서 구체적으로 서술하였으므로, 중복되는 내용은 상술한 내용을 참고할 수 있다.

본 발명에 의하면 피검체에서 분리된 시료에서 RAVER2 단백질 및 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소되면 마약 중독 또는 마약 금단증상을 겪고있는 것으로 판정할 수 있다.

즉, 본 발명은, a) 피검체로부터 분리된 시료에서 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

b) 상기 a)에서 선택된 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료의 해당 단백질 혹은 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 통해 마약 중독 또는 금단증상 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공할 수 있다.

여기서, RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준 측정이란, 피검체로부터 분리된 시료에서 마약 중독 또는 마약 금단증상을 진단할 수 있는 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하기 위한 것으로, 상기 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자에 대하여 특이적으로 결합하는 생체분자를 이용하여 확인하는 것일 수 있다.

상기 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준 측정은 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 단백질의 발현 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.

RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자는 mRNA의 발현 수준을 통해 확인할 수 있으며, 상기 mRNA 발현수준은 역전사 중합효소 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR), 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR), 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.

상기 시료는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액 또는 조직일 수 있고, 상기 조직은 뇌 조직일 수 있고, 바람직하게는 뇌 조직일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 a) RAVER2 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;

c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 상기 2) 단계에서 측정한 RAVER2 단백질의 발현 수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 통해 마약 중독 또는 금단증상 치료 후보물질을 스크리닝할 수 있다.

상기 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실험예 1. 메스암페타민 금단 원숭이 동물모델

가. 실험동물 및 메스암페타민 금단 동물모델 준비

본 실험에서 2-3세 게잡이 원숭이(Macaca Fascicularis)를 실험동물로 사용하기 위해 준비하였고, 실험과정은 표준 포유류 식이를 12시간 당 120 g으로 제한하였으며 물을 원하는 대로 섭취하게 하였고, 안전성평가연구소(Korea Institute of Toxicology)의 동물 보호 및 사용위원회의 엄격한 인가에 따라 처리하였다.

상기 실험동물은 1 주 이상의 적응기간을 가지게 하였고, 일반 행동이상여부를 관찰하여 이상이 관찰되는 동물은 본 실험에 사용하지 않았다. 모든 실험동물은 실험기간동안 항온, 항습이 가능한 사육장에서 12 시간 채광, 12 시간 차광의 조건에서 식수와 사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

본 발명에서는 아래와 같이 5마리 동물을 두가지 그룹(2마리의 대조군과 3마리의 실험군)으로 무작위로 할당하였다.

대조군 : 메스암페타민이 아닌 sterile saline 0.5㎖/㎏을 정맥 내로 주 6일 동일한 시간에 4 주간 반복 주사한 후, 8 주간 주사를 중단한 군(control).

1~2주 실험군 : 메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하였고, 구체적으로 첫째 주에는 주당 6일, 0.1~0.3㎎/㎏을 하루에 1번씩 주사, 둘째 주에는 주당 6일, 0.2-0.4㎎/㎏을 하루에 2번씩 주사한 군(1-2W Exposure).

3~4주 실험군 : 메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하였고, 구체적으로 첫째 주에는 주당 6일, 0.1~0.3 ㎎/㎏을 하루에 1번씩 주사, 둘째 주에는 주당 6일, 0.2-0.4㎎/㎏을 하루에 2번씩 주사, 셋째 주에는 주당 6일, 0.3~0.5㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사, 그리고 넷째 주에는 주당 6일, 0.6㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사한 군(3-4W Exposure).

금단 실험군 : 메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 3~4주 실험군과 같이 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하여 4 주간 주입한 후, 8 주간 주사를 중단하여 메스암페타민에 의한 금단증상이 유도된 군(Meth 또는 Withdrawal).

나. 각 군의 미상(caudate)과 조가비핵(putamen)으로부터 qPCR 을 통해 miR -135a, miR -135b, miR -137, miR -139-5p, miR -132의 발현양상 비교

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 동일 면적의 선조체(striatum) 부분을 취하여 RNA를 분리한 후, miR-135a, miR-135b, miR-137, miR-139-5p, miR-132의 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 1a는 본 발명의 실험예 1. 나에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 유전자를 분석하기 위한 것으로, 금단 증상을 유도한 후, 선조체로부터 miR-135a, miR-135b, miR-137, miR-139-5p, miR-132의 발현양을 비교한 결과이다. 이에 따르면 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 원숭이 동물모델(실험군)의 선조체에서 qPCR을 통해 miRNA 중에서 miR-137이 증가되고 있음을 확인하였다.

다. 각 군의 혈액으로부터 qPCR 을 통해 miR -135a, miR -135b, miR -137, miR -139-5p, miR -132의 발현양상 비교

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 혈액을 취하여 RNA를 분리한 후, miR-135a, miR-135b, miR-137, miR-139-5p, miR-132의 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 1b는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 miR-137 유전자를 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 통해 1-2주, 3-4주간 주입한 실험군(exposure)과, 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 군에서 주사를 중단한 다음, 경과하는 시간(1-2주, 3-4주, 5-6주, 7-8주)에 따라 혈액을 채취한 금단 실험군(withdrawal)으로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다.

도면에는 4주의 주사 주입하는 과정으로부터 연속적인 시간으로 계산하여, 5-6W, 7-8W, 9-10W, 11-12W로 표기하였다.

도 1c는 도 1a의 선조체에서의 miR-137 발현양과 혈액에서의 miR-137 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

도 1d는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별로 miR-132 유전자 발현양상을 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 통해 1-2주, 3-4주간 주입한 실험군(exposure)과, 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 군에서 주사를 중단한 다음, 경과하는 시간(1-2주, 3-4주, 5-6주, 7-8주)에 따라 혈액을 채취한 금단 실험군(withdrawal)으로부터 miR-132의 발현양을 비교한 결과이다.

도 1e는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별 혈액으로부터 miR-135a 유전자 발현양상을 분석하기 위한 것이다.

도 1b 내지 도 1e에 나타난 바와 같이 금단증상이 유발한 후부터는 동물모델의 혈액으로부터 miR-137이 감소됨을 확인하였다. 또한 실험군에서 선조체와 혈액에서 miR-137 발현양상을 비교한 결과 역상관성을 보이고 있음을 확인하였다.

나아가 실험군의 선조체에서, 금단 증상에 의해 발현양상의 변화가 있던 miR-132와 miR-135a는 혈액 시료에서는 변화가 검출되지 않음을 알 수 있다.

실험예 2. 메스암페타민 금단 생쥐 동물모델

가. 실험동물 및 메스암페타민 금단 동물모델 준비

본 실험에서 만 7주령 이상의 생쥐를 실험동물로 사용하기 위해 준비하였고, 실험과정은 표준 설치류 식이와 물을 원하는 대로 섭취하게 하였고, 한국과학기술연구원(Korea Institute of Science and Technology)의 동물 보호 및 사용위원회의 엄격한 인가에 따라 처리하였다.

상기 실험동물은 1 주 동안 적응기간을 가지게 하였고, 일반 행동이상여부를 관찰하여 이상이 관찰되는 동물은 본 실험에 사용하지 않았다. 모든 실험동물은 실험기간동안 항온, 항습이 가능한 사육장에서 12 시간 채광, 12 시간 차광의 조건에서 식수와 사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

본 발명에서는 아래와 같이 열여섯마리 이상의 동물을 두가지 그룹(8마리 이상의 대조군과 8마리 이상의 실험군)으로 무작위로 할당하였다(도 2a 참조).

대조군 : 메스암페타민이 아닌 sterile saline 5.0㎖/㎏을 정맥 내로 주 6일, 매일 동일한 시간에 2 주간 반복 주사하고 1, 3, 6 주간 주사를 중단한 군(control),

금단 실험군 : 메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하였고, 구체적으로 첫째 주에는 1-3일에는 0.5~1.5㎎/㎏을 하루에 1번씩 주사, 첫째 주의 4-6일에는 1.5-2.5㎎/㎏을 하루에 2번씩 주사, 둘째 주의 1-3일에는 2.5-3.5㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사, 그리고 둘째 주의 4-6일에는 4.0㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사하였으며, 이후 1, 3, 6 주간 주사를 중단하여(1, 3, 6 withdrawal time) 메스암페타민에 의한 금단증상이 유도된 군(meth)

나. 각 군의 선조체(dorsal striatum)으로부터 qPCR 을 통해 miR -137의 발현양상 비교

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 동일 면적의 선조체(dorsal striatum) 부분을 취하여 RNA를 분리한 후, miR-137의 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 2b는 본 발명의 실험예 2. 나에 따른 각각의 그룹별로 메스암페타민 금단 증상을 1, 3, 6주간 유도한 후, 선조체를 분리하고, 이로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다. 이에 따르면 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 생쥐 동물모델(실험군)의 선조체에서도 miRNA 중에서 miR-137이 지속적으로 증가되고 있음을 확인하였다.

다. 각 군의 혈액으로부터 qPCR 을 통해 miR -137의 발현양상 비교

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 혈액을 취하여 RNA를 분리한 후, miR-137의 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 2c는 본 발명의 실험예 1. 다에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 miR-137 유전자를 분석하기 위한 것으로, 메스암페타민을 2주 동안 매일 주입한 후, 주입을 중지하고 1, 3, 6주가 경과한 경우(withdrawal)에 동물모델의 혈액으로부터 miR-137의 발현양을 비교한 결과이다.

도 2d는 도 2b의 선조체에서의 miR-137 발현양에 대한 도 2c의 혈액에서의 miR-137 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

도 2c, d에 나타난 바와 같이 금단 증상이 유도된 생쥐 동물모델의 혈액에서 miR-137이 지속적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 금단 증상이 유도된 생쥐 동물모델에의 선조체와 혈액에서 miR-137 발현양을 비교한 결과, 역상관성을 보이고 있음을 확인하였다.

종합하면, 실험예 1, 2를 통해 miR-137 유전자가 마약(특히 메스암페타민)이 지속적으로 노출되고 있는 중독 증상을 비롯하여 마약의 중단에 의한 금단증상과도 관련성이 있는 유용한 바이오마커임을 확인하였다.

실험예 3. 마약 중독 또는 금단 증상과 관련하여 단백질 규명-1

가. 실험동물 및 메스암페타민 금단 원숭이 동물모델 준비

본 실험에서 만 2-3세 게잡이 원숭이 (Macaca Fascicularis)를 실험동물로 사용하기 위해 준비하였고, 실험과정은 표준 포유류 식이를 12시간 당 120 g으로 제한하였으며 물을 원하는 대로 섭취하게 하였고, 안전성평가연구소(Korea Institute of Toxicology)의 동물 보호 및 사용위원회의 엄격한 인가에 따라 처리하였다.

본 발명에서는 실험예 1에 따라 5마리 동물을 두가지 그룹(2마리의 대조군과 3마리의 실험군)으로 무작위로 할당하였다.

대조군 : 메스암페타민이 아닌 sterile saline 0.5ml/㎏을 정맥 내로 주 6일, 매일 동일한 시간에 4 주간 반복 주사하고, 8 주간 주사를 중단한 군(control),

실험군 : 메메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하였고, 구체적으로 첫째 주에는 주당 6일, 0.1~0.3㎎/㎏을 하루에 1번씩 주사, 둘째 주에는 주당 6일, 0.2-0.4㎎/㎏을 하루에 2번씩 주사, 셋째 주에는 주당 6일, 0.3~0.5㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사, 그리고 넷째 주에는 주당 6일, 0.6㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사하여 4 주간 주입한 후, 8 주간 주사를 중단하여 메스암페타민에 의한 금단증상이 유도된 군(Meth 또는 Withdrawal).

나. 금단 증상과 관련된 새로운 표적유전자 발굴

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 동일 면적의 선조체(striatum) 부분을 취하여 미상(caudate)과 조가비핵(putamen)으로부터 RNA를 분리한 후, hnRNPA1, hnRNPA3, hnPNPDL, hnRNPU, PTBP-1, RAVER2, SYNCRIP 및 YBX1의 mRNA 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 3a는 본 발명의 실험예 3. 나에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 단백질을 규명하기 위한 것으로, 금단 증상을 유도한 후, 선조체로부터 hnRNPA1, hnRNPA3, hnPNPDL, hnRNPU, PTBP-1, RAVER2, SYNCRIP 및 YBX1의 mRNA 발현양을 비교한 결과이다. 이에 따르면 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 원숭이 동물모델(실험군)의 선조체에서 qPCR을 통해 RAVER2(RNA결합 단백질의 한 종류)의 mRNA가 감소됨을 확인하였다.

실험예 4. 마약 중독 또는 금단 증상과 관련하여 단백질 규명-2

가. 실험동물 및 메스암페타민 금단 생쥐 동물모델 준비

본 발명에서는 앞서 실험예 2와 동일하게 열여섯마리 이상의 동물을 두가지 그룹(8마리 이상의 대조군과 8마리 이상의 실험군)으로 무작위로 할당하였다(도 2a 참조).

대조군 : 메스암페타민이 아닌 sterile saline 5.0ml/㎏을 정맥 내로 주 6일, 동일한 시간에 2 주간 반복 주사하고 1, 3, 6 주간 주사를 중단한 군(control),

금단 실험군 : 메스암페타민(methamphetamine)을 중독 또는 노출 유도를 위해 점진적 용량증가(ramp-up) 프로토콜을 사용하였고, 구체적으로 첫째 주에는 1-3일에는 0.5~1.5㎎/㎏을 하루에 1번씩 주사, 첫째 주의 4-6일에는 1.5-2.5㎎/㎏을 하루에 2번씩 주사, 둘째 주의 1-3일에는 2.5-3.5㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사, 그리고 둘째 주의 4-6일에는 4.0㎎/㎏을 하루에 3번씩 주사하였으며, 이후 1, 3, 6 주간 주사를 중단하여 (1, 3, 5 withdrawal time) 메스암페타민에 의한 금단증상이 유도된 군(meth)

상기 가.에서 제조된 두 가지 그룹으로부터, 동일 면적의 선조체(striatum) 부분을 취하여 RNA를 분리한 후, RAVER2 단백질 발현양을 qPCR을 통해 확인하였다.

도 3b는 본 발명의 실험예 4. 나에 따른 각각의 그룹별로 금단증상과 관련된 단백질을 규명하기 위한 것으로, 금단 증상을 유도한 후(1주, 3주, 6주), 선조체로부터 RAVER2 단백질 발현양을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과(좌측)와 qPCR 결과 그래프(우측)이다. 이에 따르면 메스암페타민에 의한 금단 증상이 유도된 생쥐 동물모델(실험군)의 선조체에서 RAVER2의 단백질이 금단기간(1주(W), 3주(W), 6주(W)) 동안 지속적으로 감소되어있었음을 확인하였다.

실험예 5. 렌티바이러스 벡터를 이용한 세포내 RAVER2 단백질 발현 억제

가. 세포배양, 트랜스펙션 및 바이러스 감염

무한하게 증식하는 인간 배아 신장 세포주인 HEK293TN을 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지(Hyclone)에서 배양 및 유지시켰다. 이후 각 세포주내에서 RAVER2의 발현을 인위적으로 감소시키기 위하여, shRAVER2 서열(5'-GGATGAAGGTAGTTACGTTGG-3')을 포함한 렌티바이러스 컨스트럭트(construct)를 사용하였다. 렌티바이러스 생산은 SBI 제조사의 설명에 따라 진행하였다. 리포펙타민(lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 상기 세포들을 pPACK 플라스미드, 대조군 또는 shRAVER2 렌티바이러스 벡터로 각각 트랜스펙션시켰다. 대조군 또는 shRAVER2-함유 렌티바이러스로 상기 세포들을 감염시키고, 2 일간 배양한 후 수확하였다.

도 4a는 RAVER2 mRNA의 염기서열과 miR-137의 염기서열을 도시한 것이다. 이에 따르면 RAVER2와 miR-137은 서로 상호작용을 갖는 서열임을 알 수 있다.

나. 루시퍼라제 어세이 ( luciferase assay)

miR-137 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 Human pre-microRNA Expression Construct Lenti-miR-137 (System Biosciences, Mountain View, CA)과 대조군 벡터, 그리고 루시퍼라제 어세이를 위한 루시퍼라제 벡터 miRNA 3ㅄUTR target expression clone for Human RAVER2 (Genecopoeia, Rockville, MD)를 이용하였다. 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여, HEK293TN 세포를 먼저 miR-137 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 또는 대조군 벡터로 트렌스펙션시킨 뒤, RAVER2 3'UTR 서열을 포함하는 루시퍼라제 벡터를 포함하는 플라스미드 DNA 2 ㎎으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후에 세포들을 용해시키고, Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit (Genecopoeia, Rockville, MD, USA)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

도 4b는 본 발명의 실험예 5에 따르면 HEK293TN 세포에서의 루시퍼라제 활성 측정 결과이다. 각각 세포들에 대해 루시퍼라제 벡터를 통해 군(miR-137)과 대조군에서 RAVER2 3'UTR의 발현양을 측정하였다.

도 4b에 나타난 바와 같이 루시퍼라제 활성을 측정한 결과 miR-137은 RAVER2를 감소시키고 있음을 확인하였다.

다. 렌티바이러스를 통해 shRAVER2 가 도입된 세포에서의 RAVER2 발현 분석

도 4c는 렌티바이러스 벡터의 개략적인 구조와 렌티바이러스 벡터를 이용한 세포내 RAVER2 단백질 발현 억제하는 실험설계를 도시한 도면이다.

또한, 도 4d는 본 발명의 실험예 5에 따르면 SH-SY5Y 신경세포주에서 형광현미경이미지로, 각각 세포들에 대해 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에 대한 것이며, 도 4e는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 RAVER2 mRNA 발현양을 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 4f는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 RAVER2 단백질의 발현양을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과(좌측)와 qPCR로 측정한 그래프(우측)이다.

도 4d 내지 도 4f에 니타난 바와 같이 실험예 6을 통해 제조된 렌티바이러스를 이용한 유전자 이식 기법을 통해 RAVER2의 발현을 인위적으로 억제시킨 세포는, 성공적으로 RAVER2 발현이 억제됨을 확인하였다.

도 4g, h는 본 발명의 실험예 5에 따르면 렌티바이러스 벡터를 통해 군(shRAVER2군)과 대조군에서 miR-137 발현양을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 신경세포에서 분비되는 miR-137의 양이 감소됨을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 RAVER2 단백질이 효과적으로 miR-137를 조절할 수 있음을 확인하였다.

또한 RAVER2 단백질이 억제될 경우 miR-137의 양도 감소되는 것을 확인하였고, 따라서 본 발명에 따른 RAVER2 단백질은 miR-137을 제어하는 상위물질이고, miR-137은 앞서 살펴본 바와 같이 마약 중독 또는 마약 금단 증상과 관련이 있음을 재확인하였으므로, 전체적인 결과를 볼 때, RAVER2 단백질을 통해 마약 중독 또는 마약 금단 증상을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

또한 상기 RAVER2 단백질의 활성화 정도를 통해 마약 중독 또는 마약 금단 증상을 치료 또는 예방할 수 있는 효과를 평가할 수 있으므로, 이를 이용하여 마약 중독 또는 마약 금단 증상을 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 할 수 있다.

실험예 6. 금단 증상 환자에서의 유전자 발현 양상 분석

가. 샘플 수득

메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자로부터 혈액을 채취하였다. 상기 환자는 강남을지병원 중독브레인센터로부터 수득하였다. 고지에 입각한 동의는 헬싱키 선언에 따라 제공되었고, 이에 따라 모든 환자로부터 서면 동의서를 얻었으며, 모든 실험은 국립부곡병원과 한국과학기술연구원 위원회로부터 승인을 받아 진행되었다.

나. miR -137 발현양 분석

도 5a는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137 발현양을 qPCR로 분석한 그래프이고, 도 5c는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자군을 금단 3개월 이하(WD≤0.25)와 3개월 초과(WD>0.25)로 나눠 혈액에서 miR-137 발현양을 qPCR로 분석한 그래프이다.

도 5에 나타난 바와 같이 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137이 현저히 감소되어있으며, 금단 3개월 이하와 3개월 초과로 나뉜 환자들 간의 혈액 miR-137 발현양은 차이가 없이, 대조군에 비해 균등하게 감소되어있음을 qPCR로 확인하였다.

다. ROC 분석

도 5b, 도 5d 및 도 5e는 메스암페타민 금단기간을 거치고 있는 환자의 혈액에서 miR-137을 이용한 ROC 커브 분석 결과이다.

이에 따르면 수득한 샘플로부터 miR-137 유전자를 사용하여 ROC 커브 분석을 실시하였다, 그 결과 ROC 커브를 통해 혈액 miR-137이 메스암페타민 금단 유무를 발견할 수 있음을 확인하였다.

게다가 혈액에서 miR-137의 발현양은 금단 기간에 상관 없이 메스암페타민 금단 유무를 발견할 수 있음을 확인하였다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Bio-marker for drug addiction diagnosis and kit for drug addiction diagnosis <130> HPC7733 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAVER2 protein <400> 1 Val Thr Gly His Ser Lys Gly Tyr Gly Phe Val Glu Tyr Met Lys Lys 1 5 10 15 Asp Phe Ala Ala Lys Ala Arg Leu Glu Leu Leu Gly Arg Gln Leu Gly 20 25 30 Ala Ser Ala Leu Phe Ala Gln Trp Met Asp Val Asn Leu Leu Ala Ser 35 40 45 Glu Leu Ile His Ser Lys Cys Leu Cys Ile Asp Lys Leu Pro Ser Asp 50 55 60 Tyr Arg Asp Ser Glu Glu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Ser Val His Lys 65 70 75 80 Pro Val Phe Cys Gln Leu Ala Gln Asp Glu Gly Ser Tyr Val Gly Gly 85 90 95 Phe Ala Val Val Glu Tyr Ser Thr Ala Glu Gln Ala Glu Glu Val Gln 100 105 110 Gln Ala Ala Asp Gly Met Thr Ile Lys Gly Ser Lys Val Gln Val Ser 115 120 125 Phe Cys Ala Pro Gly Ala Pro Gly Arg Ser Thr Leu Ala Ala Leu Ile 130 135 140 Ala Ala Gln Arg Val Met His Ser Asn Gln Lys Gly Leu Leu Pro Glu 145 150 155 160 Pro Asn Pro Val Gln Ile Met Lys Ser Leu Asn Asn Pro Ala Met Leu 165 170 175 Gln Val Leu Leu Gln Pro Gln Leu Cys Gly Arg Ala Val Lys Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gly Thr Pro His Ser Leu Pro His Leu Met Asn Pro Ser Ile 195 200 205 Ser Pro Ala Phe Leu His Leu Asn Lys Ala His Gln Ser Ser Val Met 210 215 220 Gly Asn Thr Ser Asn Leu Phe Leu Gln Asn Leu Ser His Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ala Gln Gln Gln Leu Met Lys Phe Glu Asn Ile His Thr Asn Asn Lys 245 250 255 Pro Gly Leu Leu Gly Glu Pro Pro Ala Val Val Leu Gln Thr Ala Leu 260 265 270 Gly Ile Gly Ser Val Leu Pro Leu Lys Lys Glu Leu Gly His His His 275 280 285 Gly Glu Ala His Lys Thr Ser Ser Leu Ile Pro Thr Gln Thr Thr Ile 290 295 300 Thr Ala Gly Met Gly Met Leu Pro Phe Phe Pro Asn Gln His Ile Ala 305 310 315 320 Gly Gln Ala Gly Pro Gly His Ser Asn Thr Gln Glu Lys Gln Pro Ala 325 330 335 Thr Val Gly Met Ala Glu Gly Asn Phe Ser Gly Ser Gln Pro Tyr Leu 340 345 350 Gln Ser Phe Pro Asn Leu Ala Ala Gly Ser Leu Leu Val Gly His His 355 360 365 Lys Gln Gln Gln Ser Gln Pro Lys Gly Thr Glu Ile Ser Ser Gly Ala 370 375 380 Ala Ser Lys Asn Gln Thr Ser Leu Leu Gly Glu Pro Pro Lys Glu Ile 385 390 395 400 Arg Leu Ser Lys Asn Pro Tyr Leu Asn Leu Ala Ser Val Leu Pro Ser 405 410 415 Val Cys Leu Ser Ser Pro Ala Ser Lys Thr Thr Leu His Lys Thr Gly 420 425 430 Ile Ala Ser Ser Ile Leu Asp Ala Ile Ser Gln Gly Ser Glu Ser Gln 435 440 445 His Ala Leu Glu Lys Cys Ile Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Gly Asp Tyr 450 455 460 Ala Gln Val Ser Ser Leu Arg Asn Glu Lys Arg Gly Ser Ser Tyr Leu 465 470 475 480 Ile Ser Ala Pro Glu Gly Gly Ser Val Glu Cys Val Asp Gln His Ser 485 490 495 Gln Gly Thr Gly Ala Tyr Tyr Met Glu Thr Tyr Leu Lys Lys Lys Arg 500 505 510 Val Tyr <210> 2 <211> 4376 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens ribonucleoprotein, PTB binding 2 (RAVER2), mRNA <400> 2 cccgggcctc ctcccgcttt ctctctccgc ttcccctgga gcctccgagg agtccgcagc 60 cgctgggcgc ccgggaagat ggcggcggcg gcgggagacg gcggcggcga ggggggcgcg 120 ggcctgggca gcgcggcggg gctggggccg gggccggggc tgcgcgggca gggcccctca 180 gccgaagcgc acgagggcgc cccggacccg atgcccgccg cgctgcaccc tgaggaggtc 240 gccgcgcgac tgcagcggat gcagcgggag ctgagcaacc gcaggaaaat cctggtgaaa 300 aacctgcccc aggacagcaa ctgccaggaa gttcatgatt tgttaaaaga ctatgactta 360 aaatattgtt atgtggacag aaataaacga acagcttttg ttaccttatt gaatggggaa 420 caagcccaga acgcaattca gatgtttcat caatattctt ttagaggaaa agacttaata 480 gtccagcttc agccaacaga tgctttgttg tgtattacca acgtgcccat ttcttttaca 540 tcagaagagt ttgaagaact tgttcgtgct tatggaaata ttgagagatg ttttctggtc 600 tatagtgaag ttactggcca ttccaaaggc tatggatttg tggaatacat gaaaaaggac 660 tttgctgcaa aggctagact ggagctattg ggtagacagt tgggagcatc agcactcttt 720 gcacaatgga tggatgttaa tctattggct tcagagctca ttcattctaa gtgcctttgt 780 attgataaac tccccagtga ctacagggat tcagaagagc tgttgcaaat tttttccagt 840 gtccataaac ctgtgttttg ccagcttgca caggatgaag gtagttacgt tggtggcttt 900 gcagtggttg aatatagcac tgcggagcag gctgaagagg tccagcaggc agcagacggt 960 atgaccatca agggcagcaa agtccaggtt tccttctgtg ctcctggagc gccagggcga 1020 agtacattag cagcattgat agcggctcaa cgtgtgatgc acagtaatca aaagggctta 1080 cttccagagc caaatccagt acaaattatg aaaagtttaa acaaccctgc catgttgcaa 1140 gttcttctac agccccagtt atgtggacga gctgttaaac cagccgttct tggaacacct 1200 cacagcttgc cacatctgat gaatccatcc atctctcctg catttttaca tttgaataaa 1260 gcacatcaga atctttctca tataccactg gcacaacaac aattaatgaa gtttgagaat 1320 attcatacta ataataaacc cggcttactt ggagagcccc cagctgtggt acttcagact 1380 gcactaggga tagggtcagt gcttccattg aaaaaggagt tgggacatca tcatggagaa 1440 gcacataaaa catctagcct gattccaact caaacaacga taacagctgg aatgggcatg 1500 ttaccattct ttccaaatca gcacattgct ggacaggctg ggccagggca cagtaatact 1560 caggagaaac agccagccac ggtgggaatg gcagaaggaa atttctcagg gtcgcagcct 1620 tatcttcaga gctttccaaa ccttgctgct ggaagcttgc tggtgggaca ccataagcag 1680 cagcaaagcc agccaaaagg cacagagata agttcagggg ctgcctctaa gaatcaaact 1740 tcactcttgg gagaaccacc aaaagaaatt cggctcagta aaaatccata cttgaatttg 1800 gcaagtgtgt tgcccagtgt gtgcttatca tcccctgcaa gtaaaaccac tcttcataag 1860 actggaattg caagcagcat tctggatgca atctctcagg gaagtgaatc acaacacgca 1920 ttggaaaagt gcattgctta ttctccacct tttggtgatt atgcacaggt gtcatcttta 1980 agaaatgaaa agcgaggctc atcatatctc atctctgccc cagaaggtgg ttcagtggaa 2040 tgtgttgacc agcattctca gggcacagga gcatattaca tggaaactta cttaaaaaag 2100 aagcgagtat actgagttaa gctctctcct aataaccccc taaggttctc tgcagtatct 2160 ctgctgttca tcgctgcctt aacttcattc aaactagcca tatcctttaa atacgggttt 2220 atagtttccc agaaggaact gtgttgtgca gcaggcagaa atgccaaata aaaaatagca 2280 ataagaagag acatcaattg aggacatttt ccactagagt cagatgcatc ttaatcagtg 2340 tgctaactta caatccattg gagaaactaa caatgttcca atattccttg atttaggact 2400 gggaataatt ctgacaccat atataaaaga agtttgaagc aataaatggg aaacagtgtt 2460 gtttcctgag ccttagaaga atgagtttct tataagccaa tgtgcatttc aatttacttt 2520 ccctagaagt aattgcattt atagattttt aggacttttc ctagaactac aagggtgcaa 2580 gtaccaaatg tgctgatggt aatattataa agatgctcta catgcacact caattacgcc 2640 cacaccagcc atgcaaaatt aaacccggta agagagtgac agtgatatcc aaggtatcca 2700 ctactaccga tgctttaaga tgttgtttac catttatacc ttctgtgaaa aatagaaggt 2760 attttaagaa aagtaacttt ggtgatctaa taaaagggtt tggcaaacta caccctgggt 2820 ccacatttgg tctaccaccc gcttttgtgc tgcctgcaag ctaagactaa tgtttacatt 2880 tttaaatggt tggaggaaaa aagaaaactt atgacatgaa atttatatga aattcagatt 2940 tcagtgtcca taaataaact tttattggga cgttgccatg ctcattcatt tacgtgttgt 3000 ctgtggcact cttacgctac aagggcagaa ctgattagct tcaacagaga ctgtatggcc 3060 tacaaagacc atatggccta aaatttcaag tatctggcca tttatatata gtttgctgat 3120 ccctgatcta atagcactaa ttctaatagc aactattcct ttcaattcac ctaaagacag 3180 acctttagcc tttagacaga cttgtaagtg gaaaggaaca tgggtttctg tgctcatttc 3240 atagcgtaga ctagtaatga tctaatgact agaatggggc ctattttgat cactaaatgc 3300 cctattattt ccacaatata gtatagtaaa gcagtcaata ctgcactttc tgatggagtc 3360 ttaaggagtc acagtattta taaccatttt gagctaataa gctatacctc actctctgct 3420 ttctctctca ctctttttga tagtgtgtta gggtgaaaaa tcagttattt aacccaattt 3480 acttgtgaaa gaagttttat ctttatggac tatgatgact tttgacatca ccatttcttg 3540 aagaccttgg tattaaatgc atgagaaacc ttttgccatc tagaaatttc taagtttgtt 3600 tatgttataa gactgtaatt aattgatagg gaatttggga tctcaatccg gggctttttg 3660 aaatcagatc attaaatatc tcgtcacttt ggggacttgt tatttttaac tatgatgtgg 3720 atatcctgtt ttaattatga agtctagaat tggtacatat gttgtatgct ttgtaaagaa 3780 tttcacttgg tctaatttat tgcatatact agcttctgtt ggaaaatgac tgacagctag 3840 aaagtttaag gtaatttcta agtatactac ctataagtaa ctgataagaa ttaggcatca 3900 ttcagtgata tagcagatga ctaatgggtt tttcaggccc tgcacttctc tttcccattt 3960 tcctgttgca ttcagcctct tcaatgctta gtcacacctc cactatagta caaacaaaca 4020 aacaaacaga agaaaggaaa gatggtgaat tttgcaacag agctgcaaaa agtcagtcag 4080 tcaaagcagg aagaggttga aggaactaaa acaaacaaac aaaggtgtct ggactacagc 4140 acagtggaca tgccatccat actggcctgt gccccgttat caatcactgg gcacaacagt 4200 gaagaagtgc aaatcaagtg gtgtttgttt gtttgttagt agtaaggacc gtaacccacc 4260 ccttcctccc cccaaaacta tactgttatt tttctatgta agcaaattgt ttgaaatgct 4320 ttgaaaatga aatcttaata ttaaaaggca tatgcatgta aaaaaaaaaa aaaaaa 4376 <210> 3 <211> 4006 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus ribonucleoprotein, PTB-binding 2 (Raver2), mRNA <400> 3 cgcccccgcg cggcctctcc gctttctctc ccgcttcgct ccggcctctc cgagtctgca 60 gcggggcgcc gggaagatgg cggcgcgggg aggcggcgcg gggggcgcgg gctcgggatc 120 cggaccctct gctgggacgg cgggggaggc cgcggagccc gcgctgcgcc cgggggaggt 180 ggctgcgctg cacccccagg aggtggctgc acggctgcag cggatgcgac gggagctgag 240 caaccggcgg aaaatcctag tgaaaaacct gccccaggac agcagctccc aggaggttca 300 tgagttatta caggactatg agctaaagta ttgctatgtg gacaggaata aacgaacagc 360 ttttgttacc ttattgaatg gggagcaggc gcagagcgcg attcagaggt ttcatcagtt 420 ttctttccga ggcagagagt tgacagtgca gctgcagccc acagacgctc tcttgtgcat 480 caccaacctg cccatctcct tcaccttaga agagtttgaa gaactcgtcc gtgcctatgg 540 caacatcgag agatgttttt tggtctacag tgaagttact ggccactcca aaggctacgg 600 gtttgtggag tacatgaaga aggactttgc tgccaaggcc agactggagc tactgggcag 660 gcagatggga gcctcggcgc tcttcgcaca gtggatggat gttaatctct tggcctcgga 720 gctcatccat tctaagtgcc tttgtataga taaactcccc agtgactaca gcgattcgga 780 agagctcttg caactttttt ccggtatcca taaacctgtg ttttgccagc ttgcacagga 840 tgaaggaagt cacggtggtg gctttgcggt ggttgaatat agcactgcgg agcatgccga 900 agaggttcag caggtggcag atggcatcac catcaagggg agccaagttc aactgtcctt 960 ctgcgcccca ggagcaccag ggcgaagcac tctagcagtc ctcatagcag ctcagcgcgc 1020 gatgcacagt aatcaaaagg gattactgcc agaacccaat ccggtacaga ttatgaaaag 1080 tttaaacaac cctgccatgt tacaagttct tctgcagccc cagctatgcg gacgagccat 1140 gaagccagtt ctcggagtcg cgcccagctt atctcacctg ctgagtccgt cactcccctc 1200 cgccatctta cacttcagta aagcacagca gagctcagct gtgggtaata catcgtcctt 1260 aatccttcag aacctgtctc ccttgccctt gatacagcaa cagttgatga agtttgacaa 1320 tgcccacact aacaataagc ctggcttgct gggagagcct cctgccatgg tactgcagcc 1380 tgctctggcg atagggccac cgcttccact gaaaacggac ctgggacacc atggcgaagc 1440 acacaaaaca tctaacctga ttccacctca gacgacattg gcagccgggc tgggcatgct 1500 gccgttcttc tcaaaccagc tccctgctgg acaagccggc ccggggcgtg ggaccactca 1560 ggagaaacag tccgcttcgg tgagcattag cgaagctagc ttctcagggt cgcagcatta 1620 cctgcagacc ttcccaggcc ttcctgctgg aggcccgctg acgggcaacc agaagacacc 1680 gcagagccag ccaaaaggca cagaggttgc ctctaagaat cagacttcac tcttgggaga 1740 accaccaaaa gagatccggc tcagtaaaaa tccatatttg aatttggcaa gtgtgctacc 1800 cagtgtgtgc ctatccactg caggtaaagg catgcctccg aagactggaa ttgcgagcaa 1860 cattctggat gcgatctctc agggaagtga gtcccagcat gcactggaga agtgcatcgc 1920 ctattctcca tccatcgagg attatgccca ggcatcctcc ttgaggaatg agaagcgagg 1980 ctcctcctat ctcatctctg ccccagaagg aggcccggta gaactcgctg gccagcaccc 2040 tcaggacacc ggagtgagct acacagaaac ctacttgaaa aagaagcgtg tgtactaagc 2100 tccgggtctc ctgcccgcct gctgcggcgc ggcgcctgct gctcatcgct gccttaactt 2160 cattcacact agccatatcc tttctatacg ggtgtctgac ttcccagaag gaactgtcat 2220 gcagcaggca gatcagccaa atacccacct agcaataaga aacaccactg gtcgagggca 2280 tttccactag cattagatgt gtcttaatcc acgtgataag gactccgctc acaggagagt 2340 cagcattcca atagtccttg tttcgggcct gggaacaatt ttgacatcat 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Claims

RAVER2 단백질을 유효성분으로 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 RAVER2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마약은 메스암페타민, 암페타민, 코카인, 엑스터시 및 메칠페니테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 RAVER2 단백질은 마약 중독 또는 마약 금단증상을 겪고 있는 동물로부터 분리된 생물학적 시료에서 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 바이오마커 조성물.
RAVER2 단백질 또는 RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제를 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 RAVER2 단백질의 발현을 측정하는 제제는 상기 RAVER2 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 리간드 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 RAVER2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 측정하는 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 조성물.
제1항 또는 제5항에 따른 조성물을 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트.
제8항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단용 키트.
a) 피검체로부터 분리된 시료에서 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a)에서 선택된 RAVER2 단백질 혹은 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료의 해당 단백질 혹은 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 마약 중독 또는 금단증상 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법.
제10항에 있어서,
상기 시료는 뇌 조직임을 특징으로 하는 마약 중독 또는 금단증상 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법.
a) RAVER2 단백질을 발현하는 세포 또는 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 후보물질이 처리된 세포 또는 동물모델로부터 RAVER2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 상기 2) 단계에서 측정한 RAVER2 단백질의 발현 수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 마약 중독 또는 금단증상 치료 후보물질을 스크리닝하는 방법.