JPH08501925A

JPH08501925A - 糖蛋白ｐに対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH08501925A
Application number: JP6501138A
Authority: JP
Inventors: チァンフリグリア、マウリツィオ
Original assignee: イスティテュート・スペリオーレ・ディ・サニタ
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1993-06-16
Publication date: 1996-03-05
Also published as: DE69322783T2; ITRM920457A1; GR3029773T3; FI945865A; CZ318194A3; ATE174967T1; HU216877B; US5766946A; EP0648276B1; ES2130271T3; DK0648276T3; FI945865A0; NO944887L; EP0648276A1; KR100301189B1; NO944887D0; ITRM920457A0; SK155494A3; NZ253139A; CZ284847B6

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト糖蛋白質Ｐ（Ｐｇｐ）の構造上連続し、且つ細胞外に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体を規定するものであり、そのエピトープは、好ましくはヒトＰｇｐの第４の細胞外ループに位置して、且つ特に配列番号１のペプチド中に含まれる、特異的に連続したエピトープを形成するアミノ酸配列から成り立つている。本発明に従って提起された抗体は、ヒトＰｇｐと特異的に且つ強い結合力で結合し、それ故細胞集団が極めて低い割合でしか存在しない時、或いはヒトＰｇｐが非常に低濃度でしか発現していない時に、ヒトＭＤＲ細胞の同定に用いる事ができる。このモノクローナル抗体は、抗体全体或いは、それの抗原結合フラグメントであり、また組換えＤＮＡ技術により調製される事ができる。このモノクローナル抗体は、ヒトＰｇｐを発現している細胞を、例えば不均一な細胞集団に含まれている時に同定したり或いは精製するのに有効であり、また細胞、例えば腫瘍細胞の複合薬剤耐性の状態を監視するのに有効である。

Description

【発明の詳細な説明】糖蛋白Ｐに対するモノクローナル抗体本発明はＰ−糖蛋白質（Ｐｇｐ）に特異性を持つモノクローナル抗体に関するものである。特にヒトＰｇｐの細胞外エピトープに対するモノクローナル抗体とその作成及び診断と治療上の使用に関するものである。本願は、本明細書の末尾に記載されているかっこ内の文献番号により示された種々の文献を参照にしている。コーラーとミルシュタインによって開発された（１）モノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞系の製造に用いる体細胞融合の技法は、単一の抗原決定基に対し明確な特異性を持つている無制限の数の均一抗体産物を作る事を可能にした。抗体により認識されて反応する蛋白抗原決定基部分は、エピトープとして知られており明細書中でもそう呼ぶが、１ケ或いはそれ以上の特異的エピトープを形成するアミノ酸配列から成り立つている。糖蛋白質Ｐは細胞系或いはヒト癌細胞の表面で過発現される細胞膜蛋白質であり、これ等の細胞は先天的或いは後天的な複合薬物耐性（ＭＤＲ）の表現型を提示している。この蛋白質の発現によって、非ＭＤＲの親細胞にとって毒性となる細胞静止（cytostatic）薬物濃度下で、細胞は活発に増殖する能力を与えられる。クローン化されたＰｇｐのｃＤＮＡを用いての移入（transfection）の研究は、ＭＤＲ表現型を伝達する際のこの蛋白質の直接的な役割を実証した（２）。Ｐｇｐはエネルギー依存性の薬物流出ポンプとして働くと孝えられている。Ｐｇｐのアミノ酸配列は、受容体細胞におけるＭＤＲ表現型を与えている遺伝子の塩基配列から推論された（２、３、４）。Ｐｇｐの二次構造は、その一次構造の解析から予想された。即ち６ケの親水性細胞外ループと二つのＡＴＰ結合配列をコードする２ケの大きな細胞外ドメインを介して１２ケの疏水性膜貫通型ヘリックスから構成されている膜貫通型蛋白である。Ｐｇｐに対する数多くの異なったモノクローナル抗体が単離され性格づけされた。これ等のいくつかはセンシアリー（Cenciarelli）他により再調査されている（５）。ごく最近では、Ｐｇｐの細胞質ドメインに対して特異性を持つモノクローナル抗体についての記述もある（６、７、８）。然しながら、特異的なエピトープを形成しているアミノ酸配列が特徴づけられたＰｇｐに対するモノクローナル抗体は、Ｐｇｐの細胞質ドメインと反応するか或いは蛋白質のアミノ酸配列の不連続部分を含む細胞外のエピトープと反応するかどちらかである。例えばジョージ他（８）は、ハマダとツルオ（９）により報告されたモノクローナル抗体ＭＲＫ−１６のエピトープの位置は、アミノ酸配列から予想可能な６ケの細胞外ペプチドループの中、ふたつのループ（１番目と４番目）に存在するペプチドから成る事を決定をしている。Ｐｇｐに対するモノクローナル抗体は、診断と治療への使用が提案されてきた。例としては、ヒトの細胞上のＰｇｐ発現レベルを検査し、それによって細胞の複合薬物耐性の状態を調べたりするのに使える。またこの抗体は、Ｐｇｐにより伝達されるＭＤＲを阻止する用途もある（７）。既知のＰｇｐに対するモノクローナル抗体のいずれも、連続するエピトープを形成しているアミノ酸配列から成るヒト特異的な糖蛋白質Ｐの細胞外エピトープを認識しない。しかも、例えば低濃度でＭＤＲ細胞に発現した時或いは、ＭＤＲ細胞の細胞群の割合がわずかしかない時に、Ｐｇｐの低濃度を認識し得る抗体の必要性は続いている。この様なヒト特異的なエピトープやＰｇｐの低濃度を認識し得るモノクローナル抗体は、免疫的検査にとって有効である。上述の体細胞融合の技法を用いて、未知のヒトＰｇｐの連続的な細胞外エピトープに対し撰択的に且つ高親和性で結合する事が出来るモノクローナル抗体（ＭＭ４.１７）を分泌するハイブリドーマが得られている。従って、本発明は連続的なエピトープを形成しているアミノ酸配列から成るヒトＰｇｐの構造的に連続し且つ細胞上に位置するエピトープを認識するモノクローナル抗体を提供するものである。本明細書において、ヒト“Ｐｇｐ”はヒトＭＤＲ１遺伝子産物を指示する。また“モノクローナル抗体”と言う語は、抗体の全分子と、ＦＡｂ、Ｆ（Ａｂ’）₂ 、ＦＶフラグメント及び単一ドメイン抗体を含むそれの抗原結合フラグメントを包含するものであり、そしてまた、ハイブリドーマ細胞系から誘導される産物に限定するものでなく、組換えＤＮＡ技術により作られた、即ちＤＮＡ配列をコードしているクローン化された抗体から発現された場合の抗体分子と抗原結合フラグメントをも含んでいる。抗体により認識されるエピトープを形成しているアミノ酸配列は、ヒトＰｇｐの細胞外ループのどれかに位置している。エピトープを形成しているアミノ酸配列はヒトＰｇｐの第４番目のループ上に位置している事が好ましい。このエピトープが、ＦＴＲＩＤＤＰＥＴＫＲＱＮＳＮＬ（付属の配列リストの配列番号１）を持つヒトＰｇｐペプチドに含まれる事がより好ましい。このエピトープが、配列番号１に含まれる残基２から９までの８アミノ酸残基から成るペプチドの中の５連続アミノ酸残基を包含している事がより一層好ましい。また、この５アミノ酸が、配列番号１に含まれる残基３から７までのアミノ酸残基である事が更により好ましい。本発明の個々の具体的記述においては、モノクローナル抗体は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む可変ドメインのアミノ酸配列を有しており、各ＣＤＲは、後述の配列番号２と３に同じかそれに相当するＣＤＲの変異体（即ち、モノクローナル抗体ＭＭ４.１７の重鎖上の可変ドメインのＣＤＲｓ）である。配列番号２と３の中に示されるアミノ酸配列において、ＣＤＲ１はアミノ酸残基３２から３６番まで、ＣＤＲ２はアミノ酸残基５１から６７番まで、ＣＤＲ３はアミノ酸残基１００から１１１番までに相当する。配列番号２と３の中に示されるアミノ酸配列の残りは、枠組み領域（Ｎ末端からＣ末端に向ってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と並んでいる）から成っており、可変ドメインの抗原結合能に本質的に影響を与えずに他の枠組み領域に変える事ができる。本明細書において、ＣＤＲ配列の変異体は、参照ＣＤＲ配列、例えば配列番号２と３の中に示されるアミノ酸配列を持つＣＤＲ１、ＣＤＲ２、或いはＣＤＲ３との相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の配列を持つものである。驚くべきことに既知のモノクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体ＭＭ４.１７は、ＭＤＲ細胞に対して非常に高い親和性を持っており、ＣＥＭ−ＶＢＬ１０細胞が獲得した複合薬剤耐性の最小濃度さえ検出できる（１０、１１）。ＭＭ４.１７はまたＣＥＭ−ＶＢＬ１６細胞が獲得した複合薬剤耐性を検出できる（１１）。この細胞のビンブラスチンに対する相対的抵耐性（ＲＲ）は６. ２５である。ＣＥＭ−ＶＢＬ１０とＣＥＭ−ＶＢＬ１６細胞は、ビンブラスチンを夫々１０ng／ml及び１６ng／ml含む培地で撰択して得られた薬剤感受性ＣＥＭ細胞系（文献１１参照、ＡＴＣＣＣＣＬ１１９として寄託済）のＭＤＲ誘導体である。従って特に優先する具体化においては、本発明はＰｇｐに対してＭＭ４.１７と同じ結合親和性を持つ本発明のモノクローナル抗体、例えばＣＥＭ−ＶＢＬ１０或いはＣＥＭ−ＶＢＬ１６細胞、或いは同様なＭＤＲ細胞が獲得した複合薬剤耐性を検出できるモノクローナル抗体を含んでいる。薬剤感受性親ＣＥＭとＭＤＲ誘導体細胞系ＣＥＭ−ＶＢＬ１０、ＣＥＭ−ＶＢＬ１００のＰｇｐに対するＭＭ４.１７抗体と既報の抗−Ｐｇｐ抗体Ｃ２１９（１５）、Ｃ４９４（１５）、ＪＳＢ１（１６）、ＭＲＫ−１６（９）及びＭＣ５７（５）の結合親和性の比較は、後述の実施例６に示される。ＭＤＲ細胞系ＣＥＭ−ＶＢＬ１０）、ＣＥＭ−ＶＢＬ１６及びＣＥＭ−ＶＢＬ１００は、ベック他（１１）により記載されたものでありまた彼等から入手できる。ベック他の記載のようにして、同様のＭＤＲ細胞系は事実上得ることができる。本発明によるモノクローナル抗体は標準的な技法で調製され得る。ハイブリドーマ細胞系は、ヒトＭＤＲ細胞で免疫した動物から得た脾臓細胞を用いて体細胞融合の技法により調製され得る。適当なヒトＭＤＲ細胞系は、ベック等（１１）により記載されたＭＤＲ細胞系ＣＥＭ−ＶＢＬ１００、或いは類似のＭＤＲ細胞系の様な薬剤感受性親細胞系から誘導されたＭＤＲ細胞系を含めて用いる事ができる。ＣＥＭ−ＶＢＬ１００はＡＴＣＣＣＣｌ１１９としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された薬剤感受性ＣＥＭ細胞系のＭＤＲ誘導体である。より簡便には、ヒトＰｇｐの細胞外ドメインに相当するペプチド或いはそれのフラグメントを免疫化に用いる事ができる。適当なヒトＰｇｐの細胞外ドメインペプチドは用いる事ができる。例として、配列番号１のペプチド或いは上述したその断片の様な、Ｐｇｐの第４ループに対応するペプチド或いはその断片は抗原として用いる事ができる。好ましくは高い親和性のモノクローナルの世代を促進する免疫化の操作、例えばシャンフリグリア他の方法（１２）及び類似の操作が用いられる。目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、薬剤感受性細胞と比較してヒトＭＤＲ細胞に撰択的に結合する能力と、構造的に連続して細胞表面に位置するエピトープに特異的である細胞に対する撰択により同定する事が出来る。ヒトＰｇｐの構造的に連続的な細胞外ドメイン或いは、その部分に対し対応するペプチド、例えば上述の好ましいペプチドを、目的のモノクローナル抗体を選抜するのに用いる事が好ましい。モノクローナル抗体は細胞培養と腹水技法を用いてハイブリドーマ細胞系から調製される。抗体フラグメントは酵素的切断の様な適当な技法を用いて調製される。組換え型産物は、分子全体かフラグメントのモノクローナル産物をコードするＤＮＡ配列を用いて、適当な宿主細胞の形質転換か細胞内への移入、及び目的産物を作る為の形質転換された宿主細胞の培養を含む操作により作られる。免疫蛍光法か免疫化学法により正常並びに腫瘍組織中のＰｇｐの存在を検出したり、また試験管内テストでＭＤＲ表現型により細胞を同定したり、更にＰｇｐが存在する特異的細胞集団（幹細胞、ＨＩＶで感染された細胞、Ｔリンパ球）を濃厚にする方法に対して、本抗体を有効的に使用する事が出来る。従って本発明はまた、適当に標識された、例えば蛍光標識された本発明に従うモノクローナル抗体および免疫精製或いは免疫濃縮にとって適した形状、例えばモノクローナル抗体がポリマー粒子の様な適当な固相に固定化された形状の製品を含んでいる。本発明のモノクローナル抗体を産生する、形質転換した宿主細胞系を含むハイブリドーマや他の細胞系は、また本発明にまれる。ＭＤＲ細胞或いはヒトＰｇｐを検出する為の本発明のモノクローナル抗体を特異的な試薬として含んでいる免疫的診断薬キットは、また本発明に含まれる。この様なキットは、代表的には本発明の適当に標識されたモノクローナル抗体、例えば蛍光標識の抗体を含んでいる。本発明はまた、不均一な細胞集団に存在するヒトＰｇｐを発現している細胞の同定或いは精製に対する本発明のモノクローナル抗体の使用を含んでいる。更に本発明はまた治療薬剤、例えばＭＤＲを逆転させるための、本発明のモノクローナル抗体の使用および本モノクローナル抗体を含む治療用組成物を含む。本モノクローナル抗体は、ＭＤＲにより提示された癌処置を含む臨床の問題のいずれの状況においても用いる事ができる。治療の成分は、代表的には調剤的に受入れ可能な担体或いはエキシピエント（excipient）と組合せた本発明に従う抗体を含んでいる。本発明は、生きたままのＣＥＭ細胞と、そのＭＤＲ変異株上のヒトＰｇｐ発現をＦＡＣＳで解析した結果を示めすグラフである添付した図で指示している以下の実施例において図解のみにより記述される。ＦＡＣＳの解析はモノクローナル抗体ＭＭ４.１７（１は薬物感受性ＣＥＭ、２はＣＥＭ−ＶＲＬ２０、３はＣＥＭ−ＶＲＬ４０、４はＣＥＭ−ＶＲＬ８０、５はＣＥＭ−ＶＲＬ１００。横座標は蛍光強度、縦座標は細胞数）を用いて決定された。実施例実施例１マウスの免疫化及び脾臓細胞とミエローマ細胞系Ｓｐ２−０１／Ａｇ．１４（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）のハイブリッド形成性質が既知でＣＥＭ−ＶＢＬ１００として知られているヒトＴリンパ芽球細胞系のＭＤＲ変異体でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫する（１１）。ＣＥＭの親細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）からのＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞の誘導はベック他（１１）により述べられており、この細胞系及びＣＥＭの他のＭＤＲ誘導系はベックから入手できる。ＣＥＭ−ＶＢＬ１００系の細胞はビンブラスチン１００ ng／ml又は比較的高濃度の多くの細胞静止剤存在下、活発に増殖する。親和性の高いモノクローンを得るための免疫操作は、大体はシャンフリグリア他（１２）による方法を用い、適当に改良した。免疫化操作は次のとおりである、すなわちＰＢＳに再懸濁した１×１０⁷個のＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞を、生きたまま前処理なしで、１５日毎に１０ヶ月間腹膜内に投与する。最終回の免疫では、処置したマウスからとる脾臓細胞の細胞融合の３日前に、２×１０⁷個の細胞（ＰＢＳに再懸濁する）をそれぞれ尾静脈及び腹膜内に同数ずつ投与する。２５×１０⁶個の脾臓細胞は，無血清培地で十分に洗浄した後、リンパ球と同様の方法で前処理した１０×１０⁶個のＳｐ２−０１／Ａｇ.１４ミエローマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）と、試験管内で混合する。その後、脾臓細胞とミエローマ細胞の混合物は、シャンフリグリア他（１２）の方法で処理する。要約すると、得られた異核共存体をマイクロタイター・プレート（コスター）上に配置し、ＨＡＴ培養培地（Ｈ＝ヒポキサンチン、Ａ＝アミノプテリン、Ｔ＝チミジン、ギブコ）中で選別した後、クローン化されたハイブリドーマを得る。細胞増殖を認めた細胞培養液の上澄液は、ＣＥＭの薬剤感受性の親細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）と、また同時にＣＥＭ−ＶＢＬ１００変異体と間接免疫蛍光法により試験を行い、ＭＤＲ免疫細胞と選択的に反応し、薬剤感受性の親細胞系とは交叉反応しない免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを同定する。このように選別したハイブリドーマ細胞系から、イソタイプＩｇＧ２ａ、ｋの免疫グロブリンを分泌し、ＭＭ４.１７として知られる細胞系を同定した。この系はＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞に反応性が高いが、これは、図１に示すように、強い免疫蛍光シグナルにより証明され、流動細胞蛍光定量法により決定された。流動細胞計測法は、ＦＩＴＣを結合したＦ（Ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（カペル、ウエスト・チェスタ、ＰＡ、ＵＳＡ）による標準的な方法を用いて行った。染色後、細胞を１％ホルムアルデヒドを含むｐＨ７.２のＰＢＳで固定し、４８８nmの一定波長の光を放射する１５nWのアルゴン・イオン・レーザーを備えたベンチ・トップ・フロー・サイトメーター（FACScan、ベクトンディキンソン）により分析した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜洗浄により得られた栄養分供給のための単層細胞（支持細胞層）の細胞１個につき０.５個の濃度で、ＭＭ４.１７ハイブリドーマを９６穴マイクロタイター・プレートに植えつける。ＨＴを含む培地（１００μＬ）を各穴に加え、１０〜１４日間培養した後、クローンを上記の方法により更に２回サブクローニングする。サブクローンはクローン化されていない系により産生されたものと同じ性質の抗体を分泌する。ＭＭ４.１７ハイブリドーマは、上澄液から大量のモノクローナル抗体を得るため試験管内で培養し、腹水形成を促進するため、フロイント不完全アジュバントで前処理した同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射する。マウスの免疫化及びハイブリドーマ細胞系の選別には、ＣＥＭ−ＶＢＬ１００の代わりに、同様のＭＤＲヒト細胞なら何を用いてもよい。実施例２モノクローナル抗体ＭＭ４.１７のヒトＭＤＲ１−Ｐ−糖蛋白質の特性ハイブリドーマ細胞系ＭＭ１６６.４.１７（ＭＭ４.１７として既知）の上澄液は、ＣＥＭ細胞のヒトＭＤＲ変異体とのみ結合し（文献１０及び１１に記載）、ＣＥＭの薬剤感受性の親細胞系とは全く反応しない。２サイクルのクローニングの後、ＩｇＧ２ａ）ｋモノクローナル免疫グロブリンを分泌するクローン化したハイブリドーマ細胞系を単離し、性質を調べ、ハイブリドーマ・セル・バンクを無マイコプラズマの大量培養により確立する。このセル・バンクからバイアル試料を解凍し、ハイブリドーマ細胞の安定性、無菌性及び特異性について試験した。更にワーキング・セル・バンクも作製し、そこから性質の一貫したかつ均一のバッチのモノクローナル抗体が、精製した又は粗製の形で得られる。図１は、ＣＥＭ細胞及び様々なレベルの相対耐性（ＲＲ）を有するＣＥＭ細胞のＭＤＲ変異体に対する、モノクローナルＭＭ４.１７の蛍光特性を示す。これらのデータからＭＭ４.１７がごく低いレベルのＲＲ及びＭＤＲ細胞でのＰ−糖蛋白質の発現の変異を認識する能力をもつことが明らかである。ＭＭ４.１７モノクローナルは、試験した種々のヒト細胞系のＭＤＲ変異体のみを強く染色し、齧歯類由来の細胞は薬剤感受性のものでも薬剤耐性のものでも有意に染色しない。ＭＭ４. １７抗体の特異性は体細胞遺伝学の研究によっても確かめられる。齧歯類の薬剤感受性細胞系とＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞の体細胞融合により得られる相互に特異的なハイブリッドは、ＭＤＲの表現型に従い、ＭＤＲ１遺伝子及びＭＭ４.１７抗体により認識される抗原決定基を分離する。実施例３ＭＭ４.１７抗体により認識される糖蛋白質Ｐのエピトープの同定ヒト又はマウスの糖蛋白質Ｐ（２、３、４）の細胞外に位置するドメインをコードするｃＤＮＡ都分から推定されるアミノ酸配列をもつペプチドを合成する。これらのペプチドを、ＭＭ４.１７抗体を分泌するハイブリドーマの培養上澄液と処理する。Ｐｇｐ（配列番号１）の４番目の細胞外ループの７３９から７５４番目の残基に対応するペプチドが、ＭＭ４.１７抗体と反応する能力があるということを示すのにＥＬＩＳＡ試験が用いられる。予想したＰ−糖蛋白質の細胞外のドメインによるその他のペプチドは，抗体とは反応しない。また、予想されるマウスのｍｒｄｌ細胞外ドメインの同等の部分に対応するマウスのペプチドとは結合を検出できなかった。例えば、ヒトとマウスのペプチド配列には比較的高度の相同性があるにもかかわらず、ＭＭ４.１７は、マウスのｍｄｒｌ−Ｐ−糖蛋白質の４番目の細胞外ループの分枝を表現するペプチドとは交叉反応しない。ＭＭ４.１７抗体と反応する能力を有する最小の配列を明らかにするために、配列番号１に含まれ、部分的に重複する一連の７０個のテトラペプチドからデカペプチドまでのペプチドを合成し、ＭＭ４.１７抗体とのＥＬＩＳＡ試験に供した。一連のペプチドは、テトラペプチドからデカペプチドまでを含む１０個の組からなり、最初の組は配列番号１の１番目から４番目のアミノ酸残基に対応するテトラペプチドと、１番目から１０番目のアミノ酸残基に対応するデカペプチドからなり、２番目の組は配列番号１の２番目から５番目のアミノ酸残基に対応するテトラペプチドと、２番目から１１番目のアミノ酸残基に対応するデカペプチドからなり、以下それぞれ連続したテトラペプチドからデカペプチドまでの組からなる。ＥＬＩＳＡ試験の結果、配列番号１の２番目から９番目の残基を構成するオクタペプチドが最適かつ最小のエピトープであることがわかった。最初のスレオニンそして更には最後のスレオニンの欠損が、ＭＭ４.１７抗体との結合能が顕著に欠如していることの原因である。種々のペプチドの抗体結合の分析により次のことが明らかとなった：（１）最適かつ最小の配列がどちらの方向に伸張しても結合は有意に減少する：（２）配列番号１の４番目から９番目の残基を構成するヘキサペプチドは、結合能のある全ペプチドで見出されるので、抗体認識部位の中核部分を表現している；（３）ＭＭ４.１７抗体の特異性は、配列番号１の３番目から８番目、４番目から９番目、４番目から８番目からなるペプチドのような短いものから得られた結合能の値が大変有意である点で際立っている。実施例４ＭＭ４.１７のヒトＭＤＲ１遺伝子産物に対する特異性ＭＭ４.１７モノクローナル抗体のｍｄｒ特異性は、最適最小ペプチド内の特異的なエピトープ形成アミノ酸配列に対する相同性により選別された他の哺乳類の、ｐ−糖蛋白質遺伝子の予測されるアミノ酸配列のオクタペプチドとの結合を試験することにより決定できる。ＭＭ４.１７モノクローナル抗体は、ヒトｍｄｒ遺伝子族ＭＤＲ３（マウスのｍｄｒ２やハムスターのｐｇｐ３糖蛋白質中に同一の配列がある）とも、ＭＤＲＩ最適最小エピトープ形成ペプチドに最も類似したマウスのｍｄｒｌ、ｍｄｒ３及びハムスターのｐｇｐｌ、ｐｇｐ２Ｐ−糖蛋白質ペプチドとも結合しない。実施例５ＭＭ４.１７抗体の重鎖の可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列の同定オーランディ他（１４）の報告にあるように、ＭＭ４.１７の重鎖の可変ドメイン及びその超可変部分のｃＤＮＡ配列がコーディングされた。そのｃＤＮＡ及び対応するアミノ酸の予想配列は、配列番号２の中に下記のように示され、そのアミノ酸配列単独で配列香号３とする。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号２及び３に示す重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の５１残基目から６７残基目（ＣＤＲ２）及び１００残基目から１１１残基目（ＣＤＲ３）である。実施例６ＭＭ４.１７のＭＤＲ及び薬剤感受性細胞上のＰｇｐに対する結合親和性の、既出のモノクローナルとの比較ＭＭ４.１７及び既出のモノクローナルＣ２１、Ｃ４９４、ＪＳＢｌ、ＭＲＫ −１６及びＭＣ５７について、抗体の蛍光ラベル体の染色の度合を測定する流動細胞計測法により、ＣＥＭ、ＣＥＭ−ＶＢＬ１０及びＣＥＭ−ＶＢＬ１００への結合を比較した。得られた結果を下表に示す。モノクローナルは精製した形で同じ蛋白質濃度（１０μｇ）で用いた。その結果から、ＭＭ４.１７はＭＤＲ細胞系に対して実質上高い結合親和性を有し、CEM−VBL10細胞系に確実に結合するモノクローナルであることが明らかである。上記表中の参照番号は以下の意味を持っている。１−細胞質エピトープ認識（細胞はモノクローナル抗体染色に対し固定されるか或いは透過性が高められる必要がある。２−反応性のレベル：より高い蛍光強度を除いて染色された細胞の中、−，無；＋−，５〜３０％；＋，３０以上〜６０％；＋＋，６０以上〜９０％；＋＋＋，９０以上〜１００％：＋＋＋＋，１００％。３−細胞の蛍光特性は反応性の重復範囲を現わす。４−生きたままのヒトＭＤＲ細胞中の細胞外エピトープ認識。参考文献１．コーラーＧ.とミルシュタインＣ.（１９７５）、ネイチャー、２５６、４９５２．ウエダ他（１９８７）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、８４、３００４−３００８３．シェーン他（１９８６）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、６、４０３９−４０４４４．シェーン他（１９８７）、セル、４７、３８１−３８９５．センシアリー他（１９９１）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、４７、５３３−５４４６．アセシ他（１９９３）、キャンサー・リサーチ、５３、３１０−３１７７．メクトナーとロニンソン（１９９２）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、８９、５８２４−５８２８８．ジョージ他（１９９３）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６８、１７９２−１７９８９．ハマダとツルオ（１９８６）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、８３、７７８５−７７８９ 10．シャンフリグリア他（１９９０）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、４５、９５−１０３ 11．ベック他（１９７９）、キャンサー・リサーチ、３９、２０７０−２０７７ 12．シャンフリグリア他（１９８６）、メソード・イン・エンザイモロジー、１２１、１９３−２１０ 13．ウイラー他（１９９３）、第８４回ＡＡＣＲ年会会報、要旨Ｎｏ.１８３７、３０９ページ 14．オーランディ他（１９８９）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、８６、３８３３−３８３７ 15．カートナー他（１９８５）、ネイチャー、３１６８２０−８２３ 16．シェパー他（１９８８）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、４２、３８９−３９４配列表（１）一般情報：（Ｉ）出願人：（Ａ）名称：イスティテュート・スペリオーレ・ディ・サニタ（Ｂ）街：ビアレ・レジナ・エレナ２９９番（Ｃ）市：ローマ００１６１（Ｅ）国：イタリア（Ｆ）郵便番号（ジップ）：００１６１（Ｇ）電話：００３９６４４４４９９０（Ｈ）テレファックス：００３９６４４４００６７（Ｉ）テレックス：ＲＭ６１００７１（II）発明の標題：糖蛋白質Ｐに対するモノクローナル抗体（III）配列の数：４（IV）コンピューター解読形式：（Ａ）媒介様式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエアー：パテントインリリース＃１.０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）（Ｖ）現出願データー：出願番号：ＷＯＰＣＴ／ＥＰ９３／（２）配列番号１の情報：（Ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）位相：線状（II）分子様式：ペプチド（III）仮説：否（Ｖ）断片様式：内部（VI）原材料：（Ａ）有機体：ホモサピエンス（ＸＩ）配列記述：配列番号１：（２）配列番号２の情報（Ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：３６９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎮：一本（Ｄ）位相：線状（II）分子様式：ＤＮＡ（ゲノム）（III）仮説：否（IV）アンチ・センス：否（Ｖ）断片様式：内部（VI）原材料：（Ａ）有機体：ムス（Ｍｕｓ）筋（Ｂ）系統：ＢＡＬＢ／ｃ（IX）特徴：（Ａ）名前／鍵：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１..３６９（IX）配列記述：配列番号２：（２）配列番号３の情報（Ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１２３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）位相：線状（II）分子様式：蛋白質（XI）配列記述：配列番号３：（２）配列番号４の情報：（Ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：８アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）位相：線状（II）分子様式：ペプチド（III）仮説：否（Ｖ）断片様式：内部（VI）原材料：（Ａ）有機体：ホモサピエンス（XI）配列記述：配列番号４：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年６月１０日【補正内容】請求の範囲１．エピトープを形成する連続的アミノ酸配列から成るヒトＰｇｐの構造上連続して細胞外に位置するエピトープを認識し、また実施例６において前述した如く、流動細胞計測法の実験において実質的にテストされた時に、Ｐｇｐに対して生きているＣＥＭ−ＶＢＬ１０細胞の９０％以上染める事ができる結合親和性を持つモノクローナル抗体。２．エピトープを形成するアミノ酸配列が、ヒトＰｇｐの第４の細胞外ループに位置している、請求項１記載のモノクローナル抗体。３．エピトープを形成するアミノ酸配列が、配列番号１のペプチドに含まれる、請求項２記載のモノクローナル抗体。４．エピトープを形成するアミノ酸配列が、配列番号１の残基２から９までから成る８アミノ酸配列の中で少なくとも５残基連続したアミノ酸を含む、請求項３記載のモノクローナル抗体。５．５残基連続したアミノ酸が配列番号１の残基３から７までである、請求項４記載のモノクローナル抗体。６．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号２或いは３であるＣＤＲ自身かＣＤＲ変異体を有する可変ドメインを含むヒトＰｇｐのモノクローナル抗体。７．各ＣＤＲが配列番号２或いは３に対応するＣＤＲと少なくとも７０％相同である、請求項６記載のモノクローナル抗体。８．蛍光標識されたか、或いは固相上に固定化された、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。９．ヒトＭＤＲ細胞、或いはヒトＰｇｐの細胞外ドメインもしくはそれのフラグメントに対応するペプチドで免疫された動物から得た脾臓細胞の体細胞融合を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体の調製方法。１０．構造的に連続するヒトＰｇｐの細胞外ドメイン、もしくはそれの一部に対応するペプチドが、目的のモノクローナル抗体の選出に用いられる、請求項９記載の方法。１１．請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよび形質転換された宿主細胞系。１２．ヒトＭＤＲ細胞、或いはヒトＰｇｐを検出する為に請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を特異的試薬として含む、免疫的診断キット。１３．不均一な細胞集団の中に存在してヒトＰｇｐを発現する細胞を生体内で同定、或いは精製する為の、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１４．治療剤としての、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１５．ＭＤＲを逆転させるための、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１６．治療剤として利用する為の、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。１７．薬理学的に許容可能な担体或いはエキシピエント（excipient）と組合せた請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、治療用組成物。１８．ＭＤＲを逆転するための薬剤を調製する為の、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．エピトープを形成する連続的アミノ酸配列から成るヒトＰｇｐの構造上連続して細胞外に位置するエピトープを認識する、モノクローナル抗体。２．エピトープを形成するアミノ酸配列が、ヒトＰｇｐの第４の細胞外ループに位置している、請求項１記載のモノクローナル抗体。３．エピトープを形成するアミノ酸配列が、配列番号１のペプチドから成る、請求項２記載のモノクローナル抗体。４．エピトープを形成するアミノ酸配列が、配列番号１の残基２から９までから成る８アミノ酸配列の中で少なくとも５残基連続したアミノ酸を含む、請求項３記載のモノクローナル抗体。５．５残基連続したアミノ酸が配列番号１の残基３から７までである、請求項４記載のモノクローナル抗体。６．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号２或いは３であるＣＤＲ自身かＣＤＲ変異体を有する可変ドメインを含むヒトＰｇｐのモノクローナル抗体。７．各ＣＤＲが配列番号２或いは３に対応するＣＤＲと少なくとも７０％相同である、請求項６記載のモノクローナル抗体。８．ＭＭ４．１７モノクローナル抗体と同様のＰｇｐに対する親和性を有する、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。９．蛍光標識されたか、或いは固相上に固定化された、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。１０．ヒトＭＤＲ細胞、或いはヒトＰｇｐの細胞外ドメインもしくはそれのフラグメントに対応するペプチドで免疫された動物から得た脾臓細胞の体細胞融合を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体の調製方法。１１．構造的に連続するヒトＰｇｐの細胞外ドメイン、もしくはそれの一部に対応するペプチドが、目的のモノクローナル抗体の選出に用いられる、請求項１０記載の方法。１２．請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマおよび形質転換された宿主細胞系。１３．ヒトＭＤＲ細胞、或いはヒトＰｇｐを検出する為に請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体を特異的試薬として含む、免疫的診断キット。１４．不均一な細胞集団の中に存在してヒトＰｇｐを発現する細胞を生体内で同定、或いは精製する為の、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１５．ＭＤＲを逆転させるための治療剤としての、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１６．ＭＤＲを逆転させるための、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体の利用。１７．薬理学的に許容可能な担体或いはエキシピエント（excipient）と組合せた請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、治療用組成物。