CA2051651A1 - Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d'histocompatibilite - Google Patents
Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d'histocompatibiliteInfo
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Abstract
2051651 9112332 PCTABS00105 L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints caractérisés par leur capacité à reconnaître spécifiquement un complexe formé par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogène ou un peptide caractéristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaître et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMH d'haplotype non spécifique du peptide. Elle vise aussi l'application de ces anticorps au diagnostic de pathologies dues à des agents infectieux ou à des dérèglements cellulaires impliqués par exemple dans des tumeurs ou des maladies autoimmunes.
Description
~091/12332 2 ~ PCT/FR91/00121 Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associé
à un antigène majeur d'histocompatibilite.
L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associé à un antigène majeur d'histocompatibilitè. L'invention concerne aussi les applications de ces anticorps au diagnostic et au traitement et le cas échéant à la prévention de certaines pathologies.
On connait l'intérêt des molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (molécules du CMH) en tant que structures membranaires de reconnaissance permettant au systeme immunitaire de reconnaitre le soi du non-soi. Une fonction majeure des molécules de CMH est de présenter des antigènes aux lymphocytes T.
Selon 1'appartenance ~e la molécule du CMH à la classe I ou à la classe II, le complexe formé par la molécule du CMH et 1'antigene est reconnu respectivement par des cellules T cytotoxiques ou par des cellules T auxiliaires capables d'activer la synthèse de l'anticorps par les lymphocytes B.
Des travaux ont d~ja permis de mettre en évidence l'existence d'anticorps reconnaissant un antigene associé à une molécule de CMH. Par exemple, Van Leuveen et al (J. Exp. Med. (1979) 150, 1075-1083) ont décrit l'existence, chez une malade atteinte d'anémie, d'un sérum polyclonal contenant des anticorps capables de lyser specifiquement des lymphocytes portant 1'antigène H-Y associé a une molecule de CMH du type HLA-A2.
Cependant les resultats connus jusqu!à prèsent montrent qu'il n'a pas ete possible de produire ni d'identifier et de caracteriser des anticorps monoclonaux restreints, c'est-à-dire spécifiques du complexe formé par un antigène determiné et une ., . .- - . . .; . .
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WO9ltl2332 ! ~ PCT/FR91/00121 molecule de CMH specifique de cet antigene, également determinee. :
A cet égard, plusieurs equipes ayant tenté de mettre au point des modèles expérimentaux en vue de produire des anticorps monoclonaux restreints, ont publié des résultats négatifs.
Par exemple, l'equipe de Tamminen et al utilisant comme antigène du virus grippal Influenza tvpe A, souche H3N2 (X-31) (Tamminen et al., Eur. J. Immunol.
(1987) 17, 999-1006) et egalement le groupe de Rubin, Malissen, Jorgensen et Zeuthen utilisant comme antigène l'insuline (Rubin et al., Res. Immunol.
(1989) 140,...) ont publié des résultats négatifs, c'est-à-dire qu'ils n'ont pas reussi à produire des anticorps restreints. L'équipe de Klinman a décrit des résultats positifs (Wylie et al., J. Exp. Med. (1982) lSS, 403-414 ; Frescher and Klinman, J. Exp. Med.
(1986) 164, 196-210). Cependant les travaux de Klinman et al. montrent que les anticorps monoclonaux produits reconnaissent des cellules transformees par un virus oncogene SV40, sans que l'antigene reconnu, ni la -molécule du CMH impliquée, soient identifiees.
Les difficultés rencontrees pour la preparation des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention peuvent être attribuées a différents facteurs et en particulier à la mise au point d'une technique particuliere de préparation des anticorps et également a des techniques tres sensibles pour le criblage.
Les inventeurs se sont intéressés au rôle que pourraient présenter des anticorps monoclonaux restreints pour le diagnostic mais aussi le traitement de différentes pathologies.
Ils ont eté capables de remedier aux difficultés rencontrees jusqu'a présent et ont obtenu des anticorps monoclonaux restreints caractéristiques d'un complexe constitue par un antigène en association avec ~091/12332 PCT/FR91/00121
à un antigène majeur d'histocompatibilite.
L'invention concerne des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associé à un antigène majeur d'histocompatibilitè. L'invention concerne aussi les applications de ces anticorps au diagnostic et au traitement et le cas échéant à la prévention de certaines pathologies.
On connait l'intérêt des molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (molécules du CMH) en tant que structures membranaires de reconnaissance permettant au systeme immunitaire de reconnaitre le soi du non-soi. Une fonction majeure des molécules de CMH est de présenter des antigènes aux lymphocytes T.
Selon 1'appartenance ~e la molécule du CMH à la classe I ou à la classe II, le complexe formé par la molécule du CMH et 1'antigene est reconnu respectivement par des cellules T cytotoxiques ou par des cellules T auxiliaires capables d'activer la synthèse de l'anticorps par les lymphocytes B.
Des travaux ont d~ja permis de mettre en évidence l'existence d'anticorps reconnaissant un antigene associé à une molécule de CMH. Par exemple, Van Leuveen et al (J. Exp. Med. (1979) 150, 1075-1083) ont décrit l'existence, chez une malade atteinte d'anémie, d'un sérum polyclonal contenant des anticorps capables de lyser specifiquement des lymphocytes portant 1'antigène H-Y associé a une molecule de CMH du type HLA-A2.
Cependant les resultats connus jusqu!à prèsent montrent qu'il n'a pas ete possible de produire ni d'identifier et de caracteriser des anticorps monoclonaux restreints, c'est-à-dire spécifiques du complexe formé par un antigène determiné et une ., . .- - . . .; . .
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WO9ltl2332 ! ~ PCT/FR91/00121 molecule de CMH specifique de cet antigene, également determinee. :
A cet égard, plusieurs equipes ayant tenté de mettre au point des modèles expérimentaux en vue de produire des anticorps monoclonaux restreints, ont publié des résultats négatifs.
Par exemple, l'equipe de Tamminen et al utilisant comme antigène du virus grippal Influenza tvpe A, souche H3N2 (X-31) (Tamminen et al., Eur. J. Immunol.
(1987) 17, 999-1006) et egalement le groupe de Rubin, Malissen, Jorgensen et Zeuthen utilisant comme antigène l'insuline (Rubin et al., Res. Immunol.
(1989) 140,...) ont publié des résultats négatifs, c'est-à-dire qu'ils n'ont pas reussi à produire des anticorps restreints. L'équipe de Klinman a décrit des résultats positifs (Wylie et al., J. Exp. Med. (1982) lSS, 403-414 ; Frescher and Klinman, J. Exp. Med.
(1986) 164, 196-210). Cependant les travaux de Klinman et al. montrent que les anticorps monoclonaux produits reconnaissent des cellules transformees par un virus oncogene SV40, sans que l'antigene reconnu, ni la -molécule du CMH impliquée, soient identifiees.
Les difficultés rencontrees pour la preparation des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention peuvent être attribuées a différents facteurs et en particulier à la mise au point d'une technique particuliere de préparation des anticorps et également a des techniques tres sensibles pour le criblage.
Les inventeurs se sont intéressés au rôle que pourraient présenter des anticorps monoclonaux restreints pour le diagnostic mais aussi le traitement de différentes pathologies.
Ils ont eté capables de remedier aux difficultés rencontrees jusqu'a présent et ont obtenu des anticorps monoclonaux restreints caractéristiques d'un complexe constitue par un antigène en association avec ~091/12332 PCT/FR91/00121
2 3 ~ ~ ~ v une molécule du CMH reconnaissant spécifiquement cet antigène.
L'invention a donc pour objet des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant des antigènes associés à des molecules du CMH. Entrent également dans le cadre de l'invention, des souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux restreints.
L'invention concerne aussi des compositions pour le diagnostic de la presence d'une infection ou d'un déreglement cellulaire susceptible de générer un état tumoral ou une maladie autoimmune.
L'invention se rapporte aussi a des compositions pour le traitement d'infections ou de dérèglements cellulaires tels que décrits ci-dessus.
Elle vise de plus un procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints de l'invention.
Les antigènes dont il est question dans les paragraphes précédents et qui constituent l'une des deux entités du complexe reconnu par les anticorps restreints selon l'invention, sont soit des peptides tels qu'issus de la déqradation de protéines provenant d'un agent infectieux ou pathogene soit des peptides issus d'un dysfonctionnement (déregulation) cellulaire ou encore des protéines degradées du soi. Ces peptides peuvent par exemple être obtenus par coupure enzymatique par exemple par les enzymes du lysosome ou de l'appareil de Golgi.
La formation du complexe necessite egalement que le peptide et la molécule du CMH soient capables de se lier entre elles.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints, ces peptides sont avantageusement obtenus par voie de synthese chimique selon les methodes classiques de synthèse des peptides.
Ils peuvent aussi être prépares à partir de proteines naturelles par exemple des proteines issues WO91~12332 2 ~ PCT/FR91/00121 d'agents pathogènes ou des proteines mises en jeu lors de dérèglements cellulaires de type tumoral ou de type auto-immun, notamment des proteines mutées.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés par leur capacite à reconnaître spécifiquement un complexe forme par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogene ou un peptide caracteristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaitre et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMH d'haplotype qui ne fixe pas le peptide (non specifique du peptide).
Pour déterminer la specificité du couple peptide-molécule du CMH de classe I, on peut effectuer un test tel que décrit par BOUILLOT et al, ~Nature, 1989, vol. 339, p.473-475). Conformément a ce test, un peptide dont on recherche la spécificité vis-a-vis de la molécule de CMH est incubé avec une molecule de CMH
connue, sur des cellules marquees avec un isotope radioactif tel que le chrome 51. Après cette incubation, la suspension est mise en presence de lymphocytes cytotoxiques (CTL) specifiques du peptide.
Lorsque les cellules CTL lysent les cellules mises en présence du peptide et de la molecule du CMH, on peut en déduire que la molécule du CMH a une affinité
spécifique pour le peptide.
De la même manière, il existe divers tests qui permettent de reperer l'association fonctionnelle et specifique d'un peptide a un antigene du CMH de classe II. On peut par exemple, mettre en oeuvre le test de Sette et al (P.N.A.S. (1989), Vol. 86, p3296-3300).
Les anticorps ci-dessus définis sont designes par le terme anticorps monoclonaux restreints.
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Selon un mode de realisation particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont encore caracterisés en ce qu'ils sont dépourvus ou pratiquement depourvus de reaction à l'~gard du peptide contre lequel ils sont dirigés, présent a l'état isolé et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout, la molécule du CMH seule.
Un anticorps pratiquement depourvu de la capacite ~ reconnaitre un peptide seul est selon l'invention, un anticorps qui présente avec ce peptide une réaction inférieure à deux fois le signal correspondant au bruit de fond.
Un anticorps reconnaissant faiblement une molecule de CMH seule reconnait cette molécule de CMH
suivant une reaction qui est de l'ordre de l/lO à l/5 de la reaction existant dans les mêmes conditions avec le complexe peptide-CMH spécifique.
Pour déterminer si un anticorps monoclonal obtenu répond aux définitions de l'invention, une réaction immunoenzymatique de type ELISA, telle que decrite ci-apres ~ titre d'exemple, peut être realisée.
La réaction immunoenzymatique est effectuée d'abord au moyen du réactif ~ base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple soit a l'uréase, soit à la phosphatase alcaline, sur un surnageant de culture d'hybridomes. La réaction est ensuite confirmée par l'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple par exemple a la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont par exemple des cellules spléniques préalablement incubées avec le peptide contre leguel on veut former les anticorps (5 a 50~g/ml pour 107 cellules à 37-C pendant une à deux heures). Les cellules sont fixees sur plaques de polyvinyle selon la technique decrite par Ternynck et Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immuno-.. . , ~ . : , . . : . : . .
,, ~. . : ,. .. , - . ,. , ~: . .. . :, . . .
r~ ~ j 6 enzymatiques - Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Des temoins utilisés pour vérifier l'appartenance des anticorps monoclonaux restreints à l'invention et qui par conséquent ne doivent pas donner une reaction positive avec les anticorps monoclonaux retreints de l'invention sont constitués d'une part par l'un ou l'autre des constituants pris separément, a savoir le peptide contre lequel on souhaite former des anticorps monoclonaux restreints ou les cellules portant la molécule du CMH correspondante seule sans ledit peptide, et d'autre part par l'un ou l'autre de ces constituants en association avec un partenaire non relié c'est-à-dire non spécifique (le peptide different de celui contre lequel on veut obtenir des anticorps monoclonaux restreints associé à la molécule de CMH étudiée ou le peptide contre lequel on souhaite produire des anticorps monoclonaux restreints, associé
a une molécule du CMH non spécifique).
~ a reaction positive ci-dessus est marquee par une densité optique (D.O) supérieure a au moins deux fois celle observée pour les puits qui contiennent tous les composants de la reaction excepté les anticorps restreints.
Les anticorps monoclonaux restreints de l'invention, ont l'avantage de présenter une sélectivité importante ce ~ui les rend particulièrement interessants dans leur application au diagnostic, au traitement et le cas écheant à la vaccination.
Les peptides reconnus par les anticorps de l'invention peuvent être caractéristiques d'agents pathogènes tels que des virus, des bacteries, des parasites, par exemple le plasmodium ou des champignons notamment des levures pathogènes.
7 2 ~
Il peut s'agir egalement des peptides representant des antigènes mineurs d'histo compatibilite, de peptides caractéristiques de dérèglements cellulaires de type tumoral ou cancereux ou encore de type auto-immum.
Selon un mode de realisation preféré de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont caractérises en ce que les peptides reconnus présentent de 7 à 25, de préférence une dizaine d'acides amines.
Pour la présentation de certains antigènes par les molécules du CMH, la présence d'un peptide ayant une longueur en acides aminés voisine de ce gui est donné dans ce qui précède peut suffire a la réaction de fixation avec les molécules de CMH et à celle de reconnaissance par les anticorps de l'invention.
Pour la préparation et la determination des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention on peut également avoir recours à des antigenes constitues par un peptide associé à une forme solubilisée et/ou soluble de la molecule de CMH qui lui est spécifique pour une espece donnée. Dans le cas de l'utilisation de la forme solubilisee, celle ci est préparée par solubilisation avec un détergent ionique tel que le triton XlOO ou le NP40 ou avec un détergent non ionique tel que l'octyl -~D-glycopyranoside, la solubilisation étant suivie d'une chromatographie d'affinite. Pour preparer la molécule sous forme solubilisée on se réfèrera à la technique décrite par STALLCUP K et al (J. of Immunology, 1981, vol. 127, page 923).
Dans le cas de l'utilisation de la molecule soluble de CMH celle ci est obtenue depourvue de sa partie transmembranaire par genie génetique.
Cette molécule soluble peut être préparée par un hôte cellulaire modifié par insertion du gène codant WO9l/l2332 PCT/FR9l/00121 v~
pour la molecule de CMH que l'on souhaite expri~er, ce gène étant depourvu de la séquence codant pour la partie transmembranaire de la molécule. Compte te~u de la suppression de cette séquence, on lie la chaîne lourde et la chaîne légère de la molécule de CMH avec un polylinker de type GGGS. Le gène est incorpore dans l'hôte dans des conditions telles que ses elements de régulation sont reconnus par l'hôte cellulaire. Un hôte cellulaire approprié est par exemple une cellule d'insecte.
Des anticorps monoclonaux restreints particuliers sont caracterisés en ce que le peptide reconnu est spécifique d'un rétrovirus humain HIV et notamnent en ce qu'il s'agit des peptides de la protéine gag par exemple le peptide gag5 (GHQAAMEMLKE) ou le peptide gag p25 synthétisé par Neosystem (Strasbourg, référence SP89-158) (séquence 263-277), ou des peptides de la protéine interne pl4 (nucléoprotéine) notamment le peptide X16F décrit par Claverie JM et al dans Eur jour Imm 1988 vol 18 p 1547-1553.
D'autres anticorps monoclonaux restreints selon l'invention sont dirigés contre des peptides tels que les suivants :
.le peptide de 1'autoantigène de la protéine basique de myéline MPB 1 a 11 décrit par Wraith.D et al dans (Cell 1989 vol. 59 p 247-255), .le peptide de la sous-unité ~ du récepteur de l'acétylcholine décrit par Mozes et al (EMB0 journal 1989 vol 8 p 4049-4052~, .le peptide de la chaine ~ de l'insuline décrit par Gradehandt et al, (Immunological Reviews, (1988) vol.
106, p59 a 75), .le peptide de l'enveloppe du virus de l'hépatite B, Chisari et al (Cell 1989 vol 59 p 1145-1156).
Des anticorps selon l'invention peuvent aussi être caracterisés en ce que la molécule du CNH humain . , , ~ . :,.~ . . .: ~ .
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reconnue est de divers haplotypes (par exemple HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7, HLA-~12, HLA-B27, HLA-B37, HLA-CW3) de classe I comme de classe II (par exemple HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5).
Un anticorps monoclonal restreint particulier selon l'invention est l'anticorps qui reconnait un peptide de la proteine p25 (gag) de HIV, notamment le peptide gag5, en association avec une molécule de CMH
d'haplotype HLA-B27 ou HLA-All.
L'invention concerne aussi un procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints de l'invention. Un premier procédé adapté à la production de ces anticorps monoclonaux restreints est caracterise en ce que:
- on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec des cellules spléniques isogèniques recouvertes d'un peptide détermine, avec des cellules de myelome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyethylène glycol, les cellules spleniques etant en excès par rapport aux cellules myelomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ, - on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique ELISA, effectuée avec un réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple à une enzyme par exemple l'urease, ou la phosphatase alcaline ou la peroxydase, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi selectionnés.
Une autre technique telle que la technique par la cytotoxicite peut être utilisee pour le criblage.
Entrent également dans le cadre de l'invention les hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux restreints ci-dessus. Ces hybridomes sont les produits , . . , : .
de fusion de cellules de myélomes et de cellules spléniques d'un animal prealablement immunise avec le peptide-antigène, dans des conditions telles que 1'antigène contre lequel sont formés les anticorps, est constitué par un complexe comportant le peptide ci-dessus associe ~ une molécule de CMH.
De préference les, hybridomes résultent de la fusion des cellules spléniques ci-dessus decrites avec un myelome de type HGPRT par exemple: X63-Ag8, NS-l ou SP2/O.
La réalisation des hybridomes est faite d'après le protocole de ~ohler et Milstein (Nature, 1974, 256:495- 497~.
. Les cellules lymphocytaires ou non, normales ou tumorales apportant la molécule de CMH sont de préférence d'haplotype H-2d, H-2b, H-2~, H-2q ou H-2s chez la souris, mais il pourra s'agir également de cellules exprimant des molécules de CMH humaines (ou d'une autre espece) chez des souris transgeniques (exprimant le même CMH humain) ou non transgeniques.
L'invention se rapporte aussi à des cellules lymphocytaires ou non, humaines ou animales, par exemple de souris, recouvertes d'un peptide ou d'un polypeptide de préférence immunogene, contre lequel on veut préparer des anticorps monoclonaux restreints.
Un second procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention consiste a réaliser la fusion entre des cellules B du sang immortalisées avec le virus d'Epstein Barr et des lymphocytes B humains préalablement mis en contact avec des peptides contre lesquels on cherche a former des anticorps ~onoclonaux restreints.
Les cellules B prealablement mises au contact des peptides contre lesquels on cherche à former des anticorps monoclonaux, peuvent être prelevées dans le sang periphérique d'un donneur préalablement immunise i, . . ~ . , : , ................ ` .' ' :, . ` '` . ' ` .
`' ~091/12332 PCT/FR91/00121 ~ ~ S ~
avec le peptide, lorsqu'il n'est pas toxique pour ce donneur. Ces lymphocytes B peuvent aussi être obtenus par culture in vitro au contact des peptides, la recupération des cellules 3 recouvertes de peptides etant precedée d'un ou plusieurs cycles de stimulation.
Enfin, les anticorps restreints ou des molecules analogues telles que la partie Fab de ces anticorps, ou des analogues des récepteurs des cellules T ayant la capacité de reconnaitre le complexe CMH-peptide peuvent être obtenus dans E.coli ou d'autres micro -organismes, selon les techniques de Huse et al (Science, (1989), 246, 1275), Ward et al (Nature, (1989), 341, 544) Bird et al (Science, (1988), 242, 423); ou d'autres auteurs.
Conformément à ces techniques, on introduit à
l'aide de vecteurs appropries, les gènes amplifiés par la technique PCR, codant pour les anticorps monoclonaux restreints ou les gènes codant pour les recepteurs de cellules T spécifiques murins ou humains ou d'autres espèces, dans E.coli, dans des conditions permettant leur expression. Puis, on realise un criblage afin de déterminer celles des molécules exprimées qui presentent la spécificit~ requise pour la reconnaissance du complexe peptide-molécule du CMH.
Le criblage peut être effectué selon la méthode decrite précedemment.
La technique ci-dessus peut également être mise en oeuvre en introduisant des séquences de gènes codant pour les anticorps restreints ou les recepteurs de cellules T spécifiques, ou encore des mutants de ces séquences.
Les genes ou fragments de gènes codant pour les anticorps monoclonaux restreints sont obtenus par extraction de l'ADN des cellules immunes, dont la préparation est decrite ci-dessus.
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WO91~12332 PCT/FR91/00121 .., ''i',1i~i1 L'invention se rapporte donc à des anticorps ou a des analogues, produits dans E.coli ou dans d'autres micro-organismes, à des anticorps monoclonaux restreints humains ou dlautres espèces (par exemple obtenus chez le rat ou le hamster par des techniques analogues à celles décrites précedemment ou obtenus selon les méthodes de Borrebaeck et al, P.N.A.S.
(1988), vol. 85, p.3995-3999).
Les anticorps de l'invention présentent un grand intérêt pour différentes applications. Ils peuvent être utilisés par exemple pour des applications au diagnostic d'infections ou pour le diagnostic de déreglements cellulaires tels qu'ils se manifestent dans certains cancers ou maladies autoiNmunes.
L'invention se rapporte a cet égard a une composition pour le diagnostic de la présence de peptides associés a des molecules de CMH dans un échantillon biologique testé, caracterisee en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux restreints tels que décrits précédemment.
Cette composition de diagnostic peut être mise en oeuvre soit sur un échantillon biologique, soit dans un organisme vivant.
Selon cette derniere application, on aura recours aux techniques de diagnostic pratiquées en imagerie médicale.
Dans cette hypothese, 1'anticorps monoclonal restreint est marqué par une substance radioactive ou par une substance pouvant être rendue visible par les techniques de fluorochrome ou de LASER.
Pour le diagnostic d'une pathologie déterminée, dans laquelle interviennent des antigènes tels que décrits precédemment, il est nécessaire de prendre en consideration l'haplotype des molecules du CMH
presentes chez le patient chez lequel est realisee la detection.
: :: :- - ................... : - . , , : . ~, :.~. ', ' : ,: ' ' WO 91/12332 PCI/FR9ltO0121 2.,.~ 3 L'invention vise aussi un kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique d'une infection par un organisme pathogène ou pour le diagnostic dlun cancer, d'une maladie autoimmune ou d'un autre derèglement cellulaire, caractérise en ce qu'il comprend:
- des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention, ayant la specificite recherchee compte tenu du diagnostic à effectuer, - des moyens pour révéler la présence d'un conjugué de -type complexe (antigene-molécule ou peptide-molecule ~ -du CMH) lié avec l'anticorps. ~ -L'echantillon biologique utilise est avantageusement un echantillon de serum ou tout autre fluide biologique. -~
Entre également dans le cadre de l'invention un test pour la détection in vitro d'une infection ou d'un déreglement cellulaire, comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact de l'échantillon biologique ~ -avec des anticorps selon l'invention, - détection de la présence d'un conjugué du type anticorps-complexe (antigéne-molécule ou peptide-molecule du CMH). ~-L'application au diagnostic, des anticorps de l'invention peut être utilisée pour détecter un virus tel que le virus HIV du SIDA, ou encore pour detecter des tumeurs ou des déreglements autoimmuns.
Selon un mode de réalisation de l'invention on peut aussi rendre les anticorps monoclonaux restreints cytotoxiques.
Les anticorps de l'invention peuvent alors entrer ~ titre de principe actif dans une composition pharmaceutique pour le traitement des infections ou des dérèglements ci-dessus par exemple par compétition notamment dans le cas ou ils ne sont pas cytotoxiques.
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~ ,i J ~ 3~; i 14 Dans ce cas, ils sont melangés avec un vehicule pharmaceutique acceptable.
Des substances capables de rendre les anticorps cytotoxiques sont des toxines, des antibiotiques, des isotopes radioactifs.
De tels anticorps peuvent être utilisés en immunothérapie.
L'invention vise aussi une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, a titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints conformes a l'invention. De tels anticorps formules dans une composition pharmaceutique pourraient être utilisés notamment comme agents competiteurs pour bloquer l'action de cellules T
spécifiques, particulierement dans des pathologies autoimmunes.
Entre egalement dans le cadre de l'invention l'application des anticorps monoclonaux restreints à
titre de vaccin, pour stimuler la production d'anticorps anti-idiotypiques notamment dans le cas des maladies autoimmunes.
Des compositions vaccinantes selon l'invention comprennent donc à titre de principe actif, des AcM
restreints ci-dessus décrits. Les anticorps anti-idiotypiques produits par l'injection des AcM
restreints reconnaissent et eliminent les cellules T
autoréactives.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.
EXEMPLES
ETABLISSENENT DES HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS
DE TYPE RESTREINT.
Immunisation Des souris de lignee BALB/c (H-2d~ sont immunisees par injection intra-péritonéale i.p. de .: - --. : .- - . -: . .;~
~091tl2332 PCT/FR91/00121 2 3 ~
cellules spléniques isogénigues couvertes de peptide.
Il s'agit en l'occurrence du peptide de la nucléoprotéine du virus grippal denommé NPl47-158R'.
Les cellules splenigues sont incubees au préalable avec le peptide à raison de 107 cellules pour lOO~g de peptide dans un volume de lml de milieu de culture (DMEM + 2% de sérum de veau foetal). L'incubation se fait dans une etuve à C02 (5%) pendant l heure. Les souris reçoivent 3 injections intra-péritonéales à
raison d'une injection par semaine. Un intervalle de 3 semaines sépare la 3ème de la 4ème injection qui précède le sacrifice et le prélèvement de la rate.
Trois jours séparent la 4ème injection du prelèvement de la rate. La 4ème injection se fait par deux voies:
0,5ml de la suspension est injectee par voie intra-péritonéale, 0,5ml par voie intra-veineuse.
Fusion cellulaire Les cellules spléniques sont obtenues à partir de la rate après dissociation en milieu DMEM I 5% de serum de veau foetal. Les globules rouges sont lyses au moyen du chlorure d'ammonium (NH4Cl) à 0,83% et les lymphocytes sont ensuite lavés trois fois en DMEM + 5%
de sérum de veau foetal.
Le partenaire de fusion est constitue par 3 myelomes HGPRT', à savoir X63-Ag8, NS-l et SP2/0.
Autrement dit, les lymphocytes sont fusionnés soit avec le myélome X63, NS-l ou SP2/0 séparément. La fusion se fait au moyen du polyéthyléne glycol (PEG
1500) de la firme MERCK, à raison de lO lymphocytes pour une cellule de myélome. Le protocole est base sur celui décrit par Xohler et Milstein (Nature, 1974, 256:495-497) rappelé ci-après: les lymphocytes et les cellules de myélome (X63, NS-l et SP2/0) sont mis ensemble dans la proportion indiquee en haut. Les trois préparations (lymphocytes plus X63 ou plus NS-l ou plus SP2/0) sont centrifugees pendant lO minutes à
.. , ., ,' , ~ ......................................... .
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WO91tl2332 2 ~ PCT/FR91/00121 250g et à 4 C. Les surnageants sont enlevés en laissant cependant un film de liquide au-dessus du culot cellulaire. Les tubes sont mis a 37-C dans un bain marie. On ajoute goutte a goutte lml d'une solution de polyethylène glycol 1500 (solution de 50%
de PEG 1500 dans RPMI à pH 7) sur le culot cellulaire.
L'operation devant durer 1 minute, est suivie par 1'addition de 2Oml de DMEM plus 10% de sérum de veau foetal. Le tout est laissé encore trois minutes dans le bain marie a 37-C puis les tubes sont centrifugés pendant 15 minutes a 250g et a +4-C. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont lavees une fois avec 20ml de DMEM +10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont remises ensuite dans une solution de DNEM plus 10~ de sérum de veau foetal auquel est ajoute le milieu HAT (solution mère HAT 100X:
Hypoxanthine à 1,36mg/ml, Aminopterine à 0,018mg/ml et Thymidine à 0,76mg/ml). Les suspensions cellulaires sont distribuées dans les puits de plaques de culture en plastique (NUNCLON, 96 puits) à raison de 200 ~1 par puits et contenant 10.000 cellules. On ajoute ensuite 50.000 cellules spléniques normales, ou de pr~férence de cellules spleniques normales irradiées a 300 rad, dans chaque puits a titre de "cellules de remplissage". Les cellules sont incubees ainsi pendant 7 a 10 jours dans une étuve à CO2 (5~) et à 37 C.
CRIBLAGE
Au bout de 7 à 10 jours, le surnageant de chaque puits est préleve et soumis au criblage par la réaction immunoenzymatique "ELISA". Elle est effectuée d'abord au moyen du réactif à base d'anticorps conjugue anti-Ig de souris couple ~ l'urease puis confirmée ensuite par l'anticorps conjugué anti-lg de souris couplé à la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont des cellules spleniques prealablement incubées avec le peptide NP 147-158R- (5 , ; ,. . . ~ . . . - . :
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WO91tl2332 PCT/FR91/00121 l7 2 ~ ., J~
à 50~g/ml pour 107 cellules) a 37 C pe~dant une ~ deux heures. Elles sont fixées sur plaques de polyvinyle (Dynatech) selon la technique décrite par Ternynck et Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immuno-enzymatiques- Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
- Les puits ayant donne une valeur en densité
optique (D.O) supérieure au moins de deux fois celle du témoin négatif (reaction des cellules cibles avec l'anticorps conjugué sans surnageant de culture) sont selectionnés. Les surnageants des mêmes puits sont testés aussi sur les cellules non couvertes de peptide et de même haplotype pour s'assurer que la réaction observee n'est pas due aux "autoanticorps". De même le test sur le peptide en question, fixe seul (sans cellules) directement sur la plaque, confirme ainsi que les surnageants sélectionnés réagissent seulement avec les cellules couvertes de peptide.
La sélection étant effectuée, les puits sont soumis a des clônages et sous-clônages pendant 3 à 4 fois. A chaque clônage et sous-clônage, les surnageants sont examinés de nouveau sur les mêmes critéres decrits en haut. En même temps, la réaction immunoenzymatique est appliquée pour déterminer l'isotype de l'hybridome. A ce stade est effectuée para}lelement la réaction en vue de dé~erminer la restriction, autrement dit, la réaction devant être observée seulement avec l'haplotype recherché, en l'occurrence H-2d.
EN CONCLUSION:
Trois hybridomes ont eté obtenus présentant les caractéristiques des anticorps de type dit restreint, en ce sens qu'ils reagissent seulement avec des cellules spléniques d'un haplotype précis (H-2d) couvertes de peptide (NP 147-158R-). Ces trois clônes WO 91/12332 PCl`t~R9ltO0121 sont denommés N6.6, S.2.2 et X5.3 d'isotype IgG2b,K, Ig~,K et IgG2b,K respectivement.
EFFETS IN VIVO D'UN ANTICORPS RESTREINT SPECIFIQUE DE
PEPTIDE SUR LA CROISSANCE TUMORALE.
L'expérience a pour but de tester la capacite d'un anticorps restreint anti-peptide, d'inhiber la croissance in vivo des cellules tumorales ayant éte mises en contact avec le peptide spécifique.
PROTOCOLE EXPERIMENTAL
. . _ .
Des souris DBA/2 (~-2d) sont reparties en 4 groupes comportant chacun quatre souris. Elles ont reçu, par injection sous-cutanee, une suspension de cellules du mastocytome P815 (il s'agit de cellules tumorales transplantables qui, une fois injectees aux hôtes syngéniques (souris DBA/2) provoquent le developpement d'une tumeur létale). -Dans le ler groupe, des cellules p815 seules sont injectées aux souris DBA/2, ce groupe sert de témoin de croissance des cellules P815 sur l'hôte syngenique.
Les souris du second groupe ont reçu des cellules P815 en mélange avec l'anticorps res*reint a raison de 5 ~g/106 cellules (il s'agit de l'anticorps X5.3, sous clone X.5.3.7.T). Ces souris servent de témoins ayant reçu des cellules et des anticorps seuls.
Les souris du 3eme groupe ont reçu des cellules P815 incubées pendant 1 heure à 37-C avec le peptide NPR- de la nucléoproteine du virus grippal à raison de 10 ~g/106 cellules. C'est le groupe témoin ayant reçu les cellules et le peptide seul.
Les souris du 4ème groupe ont reçu des cellules P815 incubées avec le peptide et mises ensuite en presence de 1'anticorps restreint X5.3.7.T dans les mêmes conditions et proportions que les groupes témoins 2 et 3.
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.
~O91/12332 PCT/FR91/00121 19 ~ n,~ 3 ~
Un même nombre de cellules P815 (lQ5 cellules/souris) est injecté à chaque souris qui est suivie individuellement quant au developpement d'une tumeur sous-cutanée. Les resultats sont exprimes d'une -part en diamètre moyen des tumeurs pour chaque groupe, en pourcentage de souris présentant une tumeur visible et enfin en pourcentaqe de tumeurs létales.
RESULTATS
1) Evolution des tumeurs sur l'~ôte s~nqénique iniecté avec les cellules P815 Le développement de la tumeur sur les souris DBA/2 injectées avec différentes preparations est représenté par la courbe des diamètres moyens des tumeurs de chaque groupe en fonction du temps (figure 1) ' .
En particulier on peut noter, au 24ème jour après l'injection des cellules :
- la présence de 4 tumeurs sur 4 souris dans chacun des trois groupes témoins (cellules P815 seules, cellules P815 + anticorps seuls, cellules P815 + peptide seul), avec un diamètre moyen de 7,5; 10,25 et 7,75 mm respectivement.
- la présence de deux tumeurs sur 4 souris dans le groupe expérimental (cellules P815 + peptide +
anticorps) avec un diamètre moyen de 4,5 mm.
2) Develo~Pement des tumeurs letales Le nombre de tumeurs letales pour chaque groupe en fin d'expérience est le suivant :
Groupe 1 (cellules P815 seules) : 3/4 Groupe 2 (cellules P815 + anticorps seuls) : 4/4 Groupe 3 (cellules P815 + peptide seul) : 4~4 Groupe 4 (cellules P815 + peptide + anticorps) :
2/4.
Pour 1'ensemble des témoins (groupe 1 + 2 + 3) on observe : 11 tumeurs letales sur 12, soit un WO 91/12332 ~ PCI~/FR91/00121 pourcentage de 92% comparé à 2 tumeurs sur 4 ou 50%
pour le groupe expérimental.
HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS RESTREINTS ANTI-PEPTIDE DE L'ALBUMINE DE L'OEUF DE POULE OVA7c~ OU
I20X ASSOCIE A H-2 Kb.
Ce peptide OVA2s3.2n ou plus simplement I20R de 20 acides aminés dont la composition est la suivante IINFEXLTEWTSSNVMEERK est reconnu en association avec la molécule CMH de classe I (H-2 Xb) par les l,vmphocytes T cytotoxiques spécifiques (Carbone et Bevan, J. Exp. Med., 198g, 169:603; J. Exp. Med., 1990, 171:377).
En utilisant le même procéde que celui decrit pour le peptide du virus grippal NPR- un hybridome (9.3.2) a eté obtenu, qui reconnait en test ELISA et en test de cytotoxicité complément dependante, le peptide I20X en présence de lymphocytes exprimant H-2 X~. Les témoins constitués soit par des cellules exprimant H-2 X~ en 1'absence du peptide ou des preparations ou le peptide (I20K) est incubé avec des cellules portant un haplotype différent (H-2 ~) ne sont pas reconnus.
Les etudes relatives à ces anticorps monoclonaux restreints anti-peptide OVA253.2n reprennent les mêmes schémas expérimentaux gue ceux appliqués dans l'étude des anticorps restreints anti-peptide NPR'. De plus il est particulierement intéressant dans le cas de la molecule X~ de pouvoir étudier la reconnaissance du peptide en association avec les molécules ~ (K~) mutantes provenant des souris de la série C57Bl/6.
TECHNIQUES UTILISEES DANS L'ETUDE DES ANTICORPS
RESTREINTS, AUTRES QUE CELLES DECRITES PRECEDEMMENT
1) Cytotoxicite comPlément déPendante utilisant des cibles marquées au 51Cr ,.
. ~ '~ ~`' '' .
.. . .
La technique d~rivant de celle utilis~e par Cerottini et al dans 1'~tude de la cytolyse à
mediation cellulaire ou CMC a ete appliquée ~Cerottini et al, 1974, J. Exp. Ned., 140 : 703). Bri~vement les cellules cibles (cellules du CMH d'haplotype déterminé
+ peptide) sont marquées par le chrome (Cr) radioactif 51 sous forme de chromate de sodium (NA2s1cro~). On incube les cellules cibles (ou les cellules témoins sans peptide) en présence du monoclonal spécifique. Le pourcentage de lyse spécifique est déduit en mesurant le chrome radioactif libéré dans le surnageant. Dans le cas des expériences avec l'anticorps monoclonal restreint X5.3 la technique a été modifiée en ajoutant un anticorps secondaire, en l'occurence, l'anticorps de Lapin anti-Immunoglobuline de Souris. Ensuite est ajouté le complément de Lapin. L'anticorps secondaire ayant reconnu l'anticorps X5.3, active le complement qui permet la lyse. A titre d'exemple, dans notre cas, l'anticorps restreint dénomme X5.3, sous-clone X5.5.7/T lyse 30% de cibles specifiques (cellules P8l5-H-2d + peptide) et O~ quand les cellules P815 ne sont pas mises au contact prealable avec le peptide.
2) ImmunoPrécipit-ation après marauaae de surface ~ar l'iode radioactif 125 Des cellules cibles (cellules + peptide) ou témoins, (cellules sans peptide) sont marquee ~ l'iode radioactif 125 par la méthode utilisant l'enzyme lactoperoxydase (Marchalonis, J.J., Biochem. J., 1969, 113 : 291). Apr~s marquage, les cellules sont lysees par un détergent, le Triton X-l00 en présence d'inhibiteurs d'enzyme. Le lysat est incubé avec un anticorps non-relié (anticorps témoin) en presence des billes de sépharose-protéine A. Après centrifugation, le lysat est incube avec l'anticorps sp~cifique (anticorps restreint). Le complexe est adsorbe sur ~' ' ~ ' ' " . " , ' ~ f~ ~,' .J '~
billes de sépharose-proteine A, lavé, récupere et analysé en electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE~.
Les résultats ont montré que l'anticorps restreint donne une bande de précipitation, après autoradiographie, quand les cellules portant l'haplotype correspondant sont incubées avec le peptide. (En l'absence du peptide les resultats, pour cette expérience, sont extrèmement faibles mais ne semblent pas absolument négatifs).
L'invention a donc pour objet des anticorps monoclonaux restreints reconnaissant des antigènes associés à des molecules du CMH. Entrent également dans le cadre de l'invention, des souches d'hybridomes productrices des anticorps monoclonaux restreints.
L'invention concerne aussi des compositions pour le diagnostic de la presence d'une infection ou d'un déreglement cellulaire susceptible de générer un état tumoral ou une maladie autoimmune.
L'invention se rapporte aussi a des compositions pour le traitement d'infections ou de dérèglements cellulaires tels que décrits ci-dessus.
Elle vise de plus un procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints de l'invention.
Les antigènes dont il est question dans les paragraphes précédents et qui constituent l'une des deux entités du complexe reconnu par les anticorps restreints selon l'invention, sont soit des peptides tels qu'issus de la déqradation de protéines provenant d'un agent infectieux ou pathogene soit des peptides issus d'un dysfonctionnement (déregulation) cellulaire ou encore des protéines degradées du soi. Ces peptides peuvent par exemple être obtenus par coupure enzymatique par exemple par les enzymes du lysosome ou de l'appareil de Golgi.
La formation du complexe necessite egalement que le peptide et la molécule du CMH soient capables de se lier entre elles.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints, ces peptides sont avantageusement obtenus par voie de synthese chimique selon les methodes classiques de synthèse des peptides.
Ils peuvent aussi être prépares à partir de proteines naturelles par exemple des proteines issues WO91~12332 2 ~ PCT/FR91/00121 d'agents pathogènes ou des proteines mises en jeu lors de dérèglements cellulaires de type tumoral ou de type auto-immun, notamment des proteines mutées.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont caractérisés par leur capacite à reconnaître spécifiquement un complexe forme par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogene ou un peptide caracteristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaitre et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMH d'haplotype qui ne fixe pas le peptide (non specifique du peptide).
Pour déterminer la specificité du couple peptide-molécule du CMH de classe I, on peut effectuer un test tel que décrit par BOUILLOT et al, ~Nature, 1989, vol. 339, p.473-475). Conformément a ce test, un peptide dont on recherche la spécificité vis-a-vis de la molécule de CMH est incubé avec une molecule de CMH
connue, sur des cellules marquees avec un isotope radioactif tel que le chrome 51. Après cette incubation, la suspension est mise en presence de lymphocytes cytotoxiques (CTL) specifiques du peptide.
Lorsque les cellules CTL lysent les cellules mises en présence du peptide et de la molecule du CMH, on peut en déduire que la molécule du CMH a une affinité
spécifique pour le peptide.
De la même manière, il existe divers tests qui permettent de reperer l'association fonctionnelle et specifique d'un peptide a un antigene du CMH de classe II. On peut par exemple, mettre en oeuvre le test de Sette et al (P.N.A.S. (1989), Vol. 86, p3296-3300).
Les anticorps ci-dessus définis sont designes par le terme anticorps monoclonaux restreints.
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Selon un mode de realisation particulier de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont encore caracterisés en ce qu'ils sont dépourvus ou pratiquement depourvus de reaction à l'~gard du peptide contre lequel ils sont dirigés, présent a l'état isolé et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout, la molécule du CMH seule.
Un anticorps pratiquement depourvu de la capacite ~ reconnaitre un peptide seul est selon l'invention, un anticorps qui présente avec ce peptide une réaction inférieure à deux fois le signal correspondant au bruit de fond.
Un anticorps reconnaissant faiblement une molecule de CMH seule reconnait cette molécule de CMH
suivant une reaction qui est de l'ordre de l/lO à l/5 de la reaction existant dans les mêmes conditions avec le complexe peptide-CMH spécifique.
Pour déterminer si un anticorps monoclonal obtenu répond aux définitions de l'invention, une réaction immunoenzymatique de type ELISA, telle que decrite ci-apres ~ titre d'exemple, peut être realisée.
La réaction immunoenzymatique est effectuée d'abord au moyen du réactif ~ base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple soit a l'uréase, soit à la phosphatase alcaline, sur un surnageant de culture d'hybridomes. La réaction est ensuite confirmée par l'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple par exemple a la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont par exemple des cellules spléniques préalablement incubées avec le peptide contre leguel on veut former les anticorps (5 a 50~g/ml pour 107 cellules à 37-C pendant une à deux heures). Les cellules sont fixees sur plaques de polyvinyle selon la technique decrite par Ternynck et Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immuno-.. . , ~ . : , . . : . : . .
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r~ ~ j 6 enzymatiques - Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
Des temoins utilisés pour vérifier l'appartenance des anticorps monoclonaux restreints à l'invention et qui par conséquent ne doivent pas donner une reaction positive avec les anticorps monoclonaux retreints de l'invention sont constitués d'une part par l'un ou l'autre des constituants pris separément, a savoir le peptide contre lequel on souhaite former des anticorps monoclonaux restreints ou les cellules portant la molécule du CMH correspondante seule sans ledit peptide, et d'autre part par l'un ou l'autre de ces constituants en association avec un partenaire non relié c'est-à-dire non spécifique (le peptide different de celui contre lequel on veut obtenir des anticorps monoclonaux restreints associé à la molécule de CMH étudiée ou le peptide contre lequel on souhaite produire des anticorps monoclonaux restreints, associé
a une molécule du CMH non spécifique).
~ a reaction positive ci-dessus est marquee par une densité optique (D.O) supérieure a au moins deux fois celle observée pour les puits qui contiennent tous les composants de la reaction excepté les anticorps restreints.
Les anticorps monoclonaux restreints de l'invention, ont l'avantage de présenter une sélectivité importante ce ~ui les rend particulièrement interessants dans leur application au diagnostic, au traitement et le cas écheant à la vaccination.
Les peptides reconnus par les anticorps de l'invention peuvent être caractéristiques d'agents pathogènes tels que des virus, des bacteries, des parasites, par exemple le plasmodium ou des champignons notamment des levures pathogènes.
7 2 ~
Il peut s'agir egalement des peptides representant des antigènes mineurs d'histo compatibilite, de peptides caractéristiques de dérèglements cellulaires de type tumoral ou cancereux ou encore de type auto-immum.
Selon un mode de realisation preféré de l'invention, les anticorps monoclonaux restreints sont caractérises en ce que les peptides reconnus présentent de 7 à 25, de préférence une dizaine d'acides amines.
Pour la présentation de certains antigènes par les molécules du CMH, la présence d'un peptide ayant une longueur en acides aminés voisine de ce gui est donné dans ce qui précède peut suffire a la réaction de fixation avec les molécules de CMH et à celle de reconnaissance par les anticorps de l'invention.
Pour la préparation et la determination des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention on peut également avoir recours à des antigenes constitues par un peptide associé à une forme solubilisée et/ou soluble de la molecule de CMH qui lui est spécifique pour une espece donnée. Dans le cas de l'utilisation de la forme solubilisee, celle ci est préparée par solubilisation avec un détergent ionique tel que le triton XlOO ou le NP40 ou avec un détergent non ionique tel que l'octyl -~D-glycopyranoside, la solubilisation étant suivie d'une chromatographie d'affinite. Pour preparer la molécule sous forme solubilisée on se réfèrera à la technique décrite par STALLCUP K et al (J. of Immunology, 1981, vol. 127, page 923).
Dans le cas de l'utilisation de la molecule soluble de CMH celle ci est obtenue depourvue de sa partie transmembranaire par genie génetique.
Cette molécule soluble peut être préparée par un hôte cellulaire modifié par insertion du gène codant WO9l/l2332 PCT/FR9l/00121 v~
pour la molecule de CMH que l'on souhaite expri~er, ce gène étant depourvu de la séquence codant pour la partie transmembranaire de la molécule. Compte te~u de la suppression de cette séquence, on lie la chaîne lourde et la chaîne légère de la molécule de CMH avec un polylinker de type GGGS. Le gène est incorpore dans l'hôte dans des conditions telles que ses elements de régulation sont reconnus par l'hôte cellulaire. Un hôte cellulaire approprié est par exemple une cellule d'insecte.
Des anticorps monoclonaux restreints particuliers sont caracterisés en ce que le peptide reconnu est spécifique d'un rétrovirus humain HIV et notamnent en ce qu'il s'agit des peptides de la protéine gag par exemple le peptide gag5 (GHQAAMEMLKE) ou le peptide gag p25 synthétisé par Neosystem (Strasbourg, référence SP89-158) (séquence 263-277), ou des peptides de la protéine interne pl4 (nucléoprotéine) notamment le peptide X16F décrit par Claverie JM et al dans Eur jour Imm 1988 vol 18 p 1547-1553.
D'autres anticorps monoclonaux restreints selon l'invention sont dirigés contre des peptides tels que les suivants :
.le peptide de 1'autoantigène de la protéine basique de myéline MPB 1 a 11 décrit par Wraith.D et al dans (Cell 1989 vol. 59 p 247-255), .le peptide de la sous-unité ~ du récepteur de l'acétylcholine décrit par Mozes et al (EMB0 journal 1989 vol 8 p 4049-4052~, .le peptide de la chaine ~ de l'insuline décrit par Gradehandt et al, (Immunological Reviews, (1988) vol.
106, p59 a 75), .le peptide de l'enveloppe du virus de l'hépatite B, Chisari et al (Cell 1989 vol 59 p 1145-1156).
Des anticorps selon l'invention peuvent aussi être caracterisés en ce que la molécule du CNH humain . , , ~ . :,.~ . . .: ~ .
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, WO ~1/12332 PCl~/FR91/00121 ,~. .~ l . ..~ " ,~
reconnue est de divers haplotypes (par exemple HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7, HLA-~12, HLA-B27, HLA-B37, HLA-CW3) de classe I comme de classe II (par exemple HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5).
Un anticorps monoclonal restreint particulier selon l'invention est l'anticorps qui reconnait un peptide de la proteine p25 (gag) de HIV, notamment le peptide gag5, en association avec une molécule de CMH
d'haplotype HLA-B27 ou HLA-All.
L'invention concerne aussi un procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints de l'invention. Un premier procédé adapté à la production de ces anticorps monoclonaux restreints est caracterise en ce que:
- on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec des cellules spléniques isogèniques recouvertes d'un peptide détermine, avec des cellules de myelome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyethylène glycol, les cellules spleniques etant en excès par rapport aux cellules myelomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ, - on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique ELISA, effectuée avec un réactif à base d'anticorps conjugué anti-Ig de souris couple à une enzyme par exemple l'urease, ou la phosphatase alcaline ou la peroxydase, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi selectionnés.
Une autre technique telle que la technique par la cytotoxicite peut être utilisee pour le criblage.
Entrent également dans le cadre de l'invention les hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux restreints ci-dessus. Ces hybridomes sont les produits , . . , : .
de fusion de cellules de myélomes et de cellules spléniques d'un animal prealablement immunise avec le peptide-antigène, dans des conditions telles que 1'antigène contre lequel sont formés les anticorps, est constitué par un complexe comportant le peptide ci-dessus associe ~ une molécule de CMH.
De préference les, hybridomes résultent de la fusion des cellules spléniques ci-dessus decrites avec un myelome de type HGPRT par exemple: X63-Ag8, NS-l ou SP2/O.
La réalisation des hybridomes est faite d'après le protocole de ~ohler et Milstein (Nature, 1974, 256:495- 497~.
. Les cellules lymphocytaires ou non, normales ou tumorales apportant la molécule de CMH sont de préférence d'haplotype H-2d, H-2b, H-2~, H-2q ou H-2s chez la souris, mais il pourra s'agir également de cellules exprimant des molécules de CMH humaines (ou d'une autre espece) chez des souris transgeniques (exprimant le même CMH humain) ou non transgeniques.
L'invention se rapporte aussi à des cellules lymphocytaires ou non, humaines ou animales, par exemple de souris, recouvertes d'un peptide ou d'un polypeptide de préférence immunogene, contre lequel on veut préparer des anticorps monoclonaux restreints.
Un second procédé pour la production des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention consiste a réaliser la fusion entre des cellules B du sang immortalisées avec le virus d'Epstein Barr et des lymphocytes B humains préalablement mis en contact avec des peptides contre lesquels on cherche a former des anticorps ~onoclonaux restreints.
Les cellules B prealablement mises au contact des peptides contre lesquels on cherche à former des anticorps monoclonaux, peuvent être prelevées dans le sang periphérique d'un donneur préalablement immunise i, . . ~ . , : , ................ ` .' ' :, . ` '` . ' ` .
`' ~091/12332 PCT/FR91/00121 ~ ~ S ~
avec le peptide, lorsqu'il n'est pas toxique pour ce donneur. Ces lymphocytes B peuvent aussi être obtenus par culture in vitro au contact des peptides, la recupération des cellules 3 recouvertes de peptides etant precedée d'un ou plusieurs cycles de stimulation.
Enfin, les anticorps restreints ou des molecules analogues telles que la partie Fab de ces anticorps, ou des analogues des récepteurs des cellules T ayant la capacité de reconnaitre le complexe CMH-peptide peuvent être obtenus dans E.coli ou d'autres micro -organismes, selon les techniques de Huse et al (Science, (1989), 246, 1275), Ward et al (Nature, (1989), 341, 544) Bird et al (Science, (1988), 242, 423); ou d'autres auteurs.
Conformément à ces techniques, on introduit à
l'aide de vecteurs appropries, les gènes amplifiés par la technique PCR, codant pour les anticorps monoclonaux restreints ou les gènes codant pour les recepteurs de cellules T spécifiques murins ou humains ou d'autres espèces, dans E.coli, dans des conditions permettant leur expression. Puis, on realise un criblage afin de déterminer celles des molécules exprimées qui presentent la spécificit~ requise pour la reconnaissance du complexe peptide-molécule du CMH.
Le criblage peut être effectué selon la méthode decrite précedemment.
La technique ci-dessus peut également être mise en oeuvre en introduisant des séquences de gènes codant pour les anticorps restreints ou les recepteurs de cellules T spécifiques, ou encore des mutants de ces séquences.
Les genes ou fragments de gènes codant pour les anticorps monoclonaux restreints sont obtenus par extraction de l'ADN des cellules immunes, dont la préparation est decrite ci-dessus.
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WO91~12332 PCT/FR91/00121 .., ''i',1i~i1 L'invention se rapporte donc à des anticorps ou a des analogues, produits dans E.coli ou dans d'autres micro-organismes, à des anticorps monoclonaux restreints humains ou dlautres espèces (par exemple obtenus chez le rat ou le hamster par des techniques analogues à celles décrites précedemment ou obtenus selon les méthodes de Borrebaeck et al, P.N.A.S.
(1988), vol. 85, p.3995-3999).
Les anticorps de l'invention présentent un grand intérêt pour différentes applications. Ils peuvent être utilisés par exemple pour des applications au diagnostic d'infections ou pour le diagnostic de déreglements cellulaires tels qu'ils se manifestent dans certains cancers ou maladies autoiNmunes.
L'invention se rapporte a cet égard a une composition pour le diagnostic de la présence de peptides associés a des molecules de CMH dans un échantillon biologique testé, caracterisee en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux restreints tels que décrits précédemment.
Cette composition de diagnostic peut être mise en oeuvre soit sur un échantillon biologique, soit dans un organisme vivant.
Selon cette derniere application, on aura recours aux techniques de diagnostic pratiquées en imagerie médicale.
Dans cette hypothese, 1'anticorps monoclonal restreint est marqué par une substance radioactive ou par une substance pouvant être rendue visible par les techniques de fluorochrome ou de LASER.
Pour le diagnostic d'une pathologie déterminée, dans laquelle interviennent des antigènes tels que décrits precédemment, il est nécessaire de prendre en consideration l'haplotype des molecules du CMH
presentes chez le patient chez lequel est realisee la detection.
: :: :- - ................... : - . , , : . ~, :.~. ', ' : ,: ' ' WO 91/12332 PCI/FR9ltO0121 2.,.~ 3 L'invention vise aussi un kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique d'une infection par un organisme pathogène ou pour le diagnostic dlun cancer, d'une maladie autoimmune ou d'un autre derèglement cellulaire, caractérise en ce qu'il comprend:
- des anticorps monoclonaux restreints selon l'invention, ayant la specificite recherchee compte tenu du diagnostic à effectuer, - des moyens pour révéler la présence d'un conjugué de -type complexe (antigene-molécule ou peptide-molecule ~ -du CMH) lié avec l'anticorps. ~ -L'echantillon biologique utilise est avantageusement un echantillon de serum ou tout autre fluide biologique. -~
Entre également dans le cadre de l'invention un test pour la détection in vitro d'une infection ou d'un déreglement cellulaire, comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact de l'échantillon biologique ~ -avec des anticorps selon l'invention, - détection de la présence d'un conjugué du type anticorps-complexe (antigéne-molécule ou peptide-molecule du CMH). ~-L'application au diagnostic, des anticorps de l'invention peut être utilisée pour détecter un virus tel que le virus HIV du SIDA, ou encore pour detecter des tumeurs ou des déreglements autoimmuns.
Selon un mode de réalisation de l'invention on peut aussi rendre les anticorps monoclonaux restreints cytotoxiques.
Les anticorps de l'invention peuvent alors entrer ~ titre de principe actif dans une composition pharmaceutique pour le traitement des infections ou des dérèglements ci-dessus par exemple par compétition notamment dans le cas ou ils ne sont pas cytotoxiques.
:, . . ~ . , ~. . .. .. : .. : :
~ ,i J ~ 3~; i 14 Dans ce cas, ils sont melangés avec un vehicule pharmaceutique acceptable.
Des substances capables de rendre les anticorps cytotoxiques sont des toxines, des antibiotiques, des isotopes radioactifs.
De tels anticorps peuvent être utilisés en immunothérapie.
L'invention vise aussi une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, a titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints conformes a l'invention. De tels anticorps formules dans une composition pharmaceutique pourraient être utilisés notamment comme agents competiteurs pour bloquer l'action de cellules T
spécifiques, particulierement dans des pathologies autoimmunes.
Entre egalement dans le cadre de l'invention l'application des anticorps monoclonaux restreints à
titre de vaccin, pour stimuler la production d'anticorps anti-idiotypiques notamment dans le cas des maladies autoimmunes.
Des compositions vaccinantes selon l'invention comprennent donc à titre de principe actif, des AcM
restreints ci-dessus décrits. Les anticorps anti-idiotypiques produits par l'injection des AcM
restreints reconnaissent et eliminent les cellules T
autoréactives.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.
EXEMPLES
ETABLISSENENT DES HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS
DE TYPE RESTREINT.
Immunisation Des souris de lignee BALB/c (H-2d~ sont immunisees par injection intra-péritonéale i.p. de .: - --. : .- - . -: . .;~
~091tl2332 PCT/FR91/00121 2 3 ~
cellules spléniques isogénigues couvertes de peptide.
Il s'agit en l'occurrence du peptide de la nucléoprotéine du virus grippal denommé NPl47-158R'.
Les cellules splenigues sont incubees au préalable avec le peptide à raison de 107 cellules pour lOO~g de peptide dans un volume de lml de milieu de culture (DMEM + 2% de sérum de veau foetal). L'incubation se fait dans une etuve à C02 (5%) pendant l heure. Les souris reçoivent 3 injections intra-péritonéales à
raison d'une injection par semaine. Un intervalle de 3 semaines sépare la 3ème de la 4ème injection qui précède le sacrifice et le prélèvement de la rate.
Trois jours séparent la 4ème injection du prelèvement de la rate. La 4ème injection se fait par deux voies:
0,5ml de la suspension est injectee par voie intra-péritonéale, 0,5ml par voie intra-veineuse.
Fusion cellulaire Les cellules spléniques sont obtenues à partir de la rate après dissociation en milieu DMEM I 5% de serum de veau foetal. Les globules rouges sont lyses au moyen du chlorure d'ammonium (NH4Cl) à 0,83% et les lymphocytes sont ensuite lavés trois fois en DMEM + 5%
de sérum de veau foetal.
Le partenaire de fusion est constitue par 3 myelomes HGPRT', à savoir X63-Ag8, NS-l et SP2/0.
Autrement dit, les lymphocytes sont fusionnés soit avec le myélome X63, NS-l ou SP2/0 séparément. La fusion se fait au moyen du polyéthyléne glycol (PEG
1500) de la firme MERCK, à raison de lO lymphocytes pour une cellule de myélome. Le protocole est base sur celui décrit par Xohler et Milstein (Nature, 1974, 256:495-497) rappelé ci-après: les lymphocytes et les cellules de myélome (X63, NS-l et SP2/0) sont mis ensemble dans la proportion indiquee en haut. Les trois préparations (lymphocytes plus X63 ou plus NS-l ou plus SP2/0) sont centrifugees pendant lO minutes à
.. , ., ,' , ~ ......................................... .
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WO91tl2332 2 ~ PCT/FR91/00121 250g et à 4 C. Les surnageants sont enlevés en laissant cependant un film de liquide au-dessus du culot cellulaire. Les tubes sont mis a 37-C dans un bain marie. On ajoute goutte a goutte lml d'une solution de polyethylène glycol 1500 (solution de 50%
de PEG 1500 dans RPMI à pH 7) sur le culot cellulaire.
L'operation devant durer 1 minute, est suivie par 1'addition de 2Oml de DMEM plus 10% de sérum de veau foetal. Le tout est laissé encore trois minutes dans le bain marie a 37-C puis les tubes sont centrifugés pendant 15 minutes a 250g et a +4-C. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont lavees une fois avec 20ml de DMEM +10% de sérum de veau foetal. Les cellules sont remises ensuite dans une solution de DNEM plus 10~ de sérum de veau foetal auquel est ajoute le milieu HAT (solution mère HAT 100X:
Hypoxanthine à 1,36mg/ml, Aminopterine à 0,018mg/ml et Thymidine à 0,76mg/ml). Les suspensions cellulaires sont distribuées dans les puits de plaques de culture en plastique (NUNCLON, 96 puits) à raison de 200 ~1 par puits et contenant 10.000 cellules. On ajoute ensuite 50.000 cellules spléniques normales, ou de pr~férence de cellules spleniques normales irradiées a 300 rad, dans chaque puits a titre de "cellules de remplissage". Les cellules sont incubees ainsi pendant 7 a 10 jours dans une étuve à CO2 (5~) et à 37 C.
CRIBLAGE
Au bout de 7 à 10 jours, le surnageant de chaque puits est préleve et soumis au criblage par la réaction immunoenzymatique "ELISA". Elle est effectuée d'abord au moyen du réactif à base d'anticorps conjugue anti-Ig de souris couple ~ l'urease puis confirmée ensuite par l'anticorps conjugué anti-lg de souris couplé à la phosphatase alcaline. Les cellules servant de cibles sont des cellules spleniques prealablement incubées avec le peptide NP 147-158R- (5 , ; ,. . . ~ . . . - . :
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WO91tl2332 PCT/FR91/00121 l7 2 ~ ., J~
à 50~g/ml pour 107 cellules) a 37 C pe~dant une ~ deux heures. Elles sont fixées sur plaques de polyvinyle (Dynatech) selon la technique décrite par Ternynck et Avrameas (Ternynck et Avrameas: Techniques immuno-enzymatiques- Les éditions INSERM, 1987) au moyen du poly-L-lysine.
- Les puits ayant donne une valeur en densité
optique (D.O) supérieure au moins de deux fois celle du témoin négatif (reaction des cellules cibles avec l'anticorps conjugué sans surnageant de culture) sont selectionnés. Les surnageants des mêmes puits sont testés aussi sur les cellules non couvertes de peptide et de même haplotype pour s'assurer que la réaction observee n'est pas due aux "autoanticorps". De même le test sur le peptide en question, fixe seul (sans cellules) directement sur la plaque, confirme ainsi que les surnageants sélectionnés réagissent seulement avec les cellules couvertes de peptide.
La sélection étant effectuée, les puits sont soumis a des clônages et sous-clônages pendant 3 à 4 fois. A chaque clônage et sous-clônage, les surnageants sont examinés de nouveau sur les mêmes critéres decrits en haut. En même temps, la réaction immunoenzymatique est appliquée pour déterminer l'isotype de l'hybridome. A ce stade est effectuée para}lelement la réaction en vue de dé~erminer la restriction, autrement dit, la réaction devant être observée seulement avec l'haplotype recherché, en l'occurrence H-2d.
EN CONCLUSION:
Trois hybridomes ont eté obtenus présentant les caractéristiques des anticorps de type dit restreint, en ce sens qu'ils reagissent seulement avec des cellules spléniques d'un haplotype précis (H-2d) couvertes de peptide (NP 147-158R-). Ces trois clônes WO 91/12332 PCl`t~R9ltO0121 sont denommés N6.6, S.2.2 et X5.3 d'isotype IgG2b,K, Ig~,K et IgG2b,K respectivement.
EFFETS IN VIVO D'UN ANTICORPS RESTREINT SPECIFIQUE DE
PEPTIDE SUR LA CROISSANCE TUMORALE.
L'expérience a pour but de tester la capacite d'un anticorps restreint anti-peptide, d'inhiber la croissance in vivo des cellules tumorales ayant éte mises en contact avec le peptide spécifique.
PROTOCOLE EXPERIMENTAL
. . _ .
Des souris DBA/2 (~-2d) sont reparties en 4 groupes comportant chacun quatre souris. Elles ont reçu, par injection sous-cutanee, une suspension de cellules du mastocytome P815 (il s'agit de cellules tumorales transplantables qui, une fois injectees aux hôtes syngéniques (souris DBA/2) provoquent le developpement d'une tumeur létale). -Dans le ler groupe, des cellules p815 seules sont injectées aux souris DBA/2, ce groupe sert de témoin de croissance des cellules P815 sur l'hôte syngenique.
Les souris du second groupe ont reçu des cellules P815 en mélange avec l'anticorps res*reint a raison de 5 ~g/106 cellules (il s'agit de l'anticorps X5.3, sous clone X.5.3.7.T). Ces souris servent de témoins ayant reçu des cellules et des anticorps seuls.
Les souris du 3eme groupe ont reçu des cellules P815 incubées pendant 1 heure à 37-C avec le peptide NPR- de la nucléoproteine du virus grippal à raison de 10 ~g/106 cellules. C'est le groupe témoin ayant reçu les cellules et le peptide seul.
Les souris du 4ème groupe ont reçu des cellules P815 incubées avec le peptide et mises ensuite en presence de 1'anticorps restreint X5.3.7.T dans les mêmes conditions et proportions que les groupes témoins 2 et 3.
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.
~O91/12332 PCT/FR91/00121 19 ~ n,~ 3 ~
Un même nombre de cellules P815 (lQ5 cellules/souris) est injecté à chaque souris qui est suivie individuellement quant au developpement d'une tumeur sous-cutanée. Les resultats sont exprimes d'une -part en diamètre moyen des tumeurs pour chaque groupe, en pourcentage de souris présentant une tumeur visible et enfin en pourcentaqe de tumeurs létales.
RESULTATS
1) Evolution des tumeurs sur l'~ôte s~nqénique iniecté avec les cellules P815 Le développement de la tumeur sur les souris DBA/2 injectées avec différentes preparations est représenté par la courbe des diamètres moyens des tumeurs de chaque groupe en fonction du temps (figure 1) ' .
En particulier on peut noter, au 24ème jour après l'injection des cellules :
- la présence de 4 tumeurs sur 4 souris dans chacun des trois groupes témoins (cellules P815 seules, cellules P815 + anticorps seuls, cellules P815 + peptide seul), avec un diamètre moyen de 7,5; 10,25 et 7,75 mm respectivement.
- la présence de deux tumeurs sur 4 souris dans le groupe expérimental (cellules P815 + peptide +
anticorps) avec un diamètre moyen de 4,5 mm.
2) Develo~Pement des tumeurs letales Le nombre de tumeurs letales pour chaque groupe en fin d'expérience est le suivant :
Groupe 1 (cellules P815 seules) : 3/4 Groupe 2 (cellules P815 + anticorps seuls) : 4/4 Groupe 3 (cellules P815 + peptide seul) : 4~4 Groupe 4 (cellules P815 + peptide + anticorps) :
2/4.
Pour 1'ensemble des témoins (groupe 1 + 2 + 3) on observe : 11 tumeurs letales sur 12, soit un WO 91/12332 ~ PCI~/FR91/00121 pourcentage de 92% comparé à 2 tumeurs sur 4 ou 50%
pour le groupe expérimental.
HYBRIDOMES SECRETANT DES ANTICORPS RESTREINTS ANTI-PEPTIDE DE L'ALBUMINE DE L'OEUF DE POULE OVA7c~ OU
I20X ASSOCIE A H-2 Kb.
Ce peptide OVA2s3.2n ou plus simplement I20R de 20 acides aminés dont la composition est la suivante IINFEXLTEWTSSNVMEERK est reconnu en association avec la molécule CMH de classe I (H-2 Xb) par les l,vmphocytes T cytotoxiques spécifiques (Carbone et Bevan, J. Exp. Med., 198g, 169:603; J. Exp. Med., 1990, 171:377).
En utilisant le même procéde que celui decrit pour le peptide du virus grippal NPR- un hybridome (9.3.2) a eté obtenu, qui reconnait en test ELISA et en test de cytotoxicité complément dependante, le peptide I20X en présence de lymphocytes exprimant H-2 X~. Les témoins constitués soit par des cellules exprimant H-2 X~ en 1'absence du peptide ou des preparations ou le peptide (I20K) est incubé avec des cellules portant un haplotype différent (H-2 ~) ne sont pas reconnus.
Les etudes relatives à ces anticorps monoclonaux restreints anti-peptide OVA253.2n reprennent les mêmes schémas expérimentaux gue ceux appliqués dans l'étude des anticorps restreints anti-peptide NPR'. De plus il est particulierement intéressant dans le cas de la molecule X~ de pouvoir étudier la reconnaissance du peptide en association avec les molécules ~ (K~) mutantes provenant des souris de la série C57Bl/6.
TECHNIQUES UTILISEES DANS L'ETUDE DES ANTICORPS
RESTREINTS, AUTRES QUE CELLES DECRITES PRECEDEMMENT
1) Cytotoxicite comPlément déPendante utilisant des cibles marquées au 51Cr ,.
. ~ '~ ~`' '' .
.. . .
La technique d~rivant de celle utilis~e par Cerottini et al dans 1'~tude de la cytolyse à
mediation cellulaire ou CMC a ete appliquée ~Cerottini et al, 1974, J. Exp. Ned., 140 : 703). Bri~vement les cellules cibles (cellules du CMH d'haplotype déterminé
+ peptide) sont marquées par le chrome (Cr) radioactif 51 sous forme de chromate de sodium (NA2s1cro~). On incube les cellules cibles (ou les cellules témoins sans peptide) en présence du monoclonal spécifique. Le pourcentage de lyse spécifique est déduit en mesurant le chrome radioactif libéré dans le surnageant. Dans le cas des expériences avec l'anticorps monoclonal restreint X5.3 la technique a été modifiée en ajoutant un anticorps secondaire, en l'occurence, l'anticorps de Lapin anti-Immunoglobuline de Souris. Ensuite est ajouté le complément de Lapin. L'anticorps secondaire ayant reconnu l'anticorps X5.3, active le complement qui permet la lyse. A titre d'exemple, dans notre cas, l'anticorps restreint dénomme X5.3, sous-clone X5.5.7/T lyse 30% de cibles specifiques (cellules P8l5-H-2d + peptide) et O~ quand les cellules P815 ne sont pas mises au contact prealable avec le peptide.
2) ImmunoPrécipit-ation après marauaae de surface ~ar l'iode radioactif 125 Des cellules cibles (cellules + peptide) ou témoins, (cellules sans peptide) sont marquee ~ l'iode radioactif 125 par la méthode utilisant l'enzyme lactoperoxydase (Marchalonis, J.J., Biochem. J., 1969, 113 : 291). Apr~s marquage, les cellules sont lysees par un détergent, le Triton X-l00 en présence d'inhibiteurs d'enzyme. Le lysat est incubé avec un anticorps non-relié (anticorps témoin) en presence des billes de sépharose-protéine A. Après centrifugation, le lysat est incube avec l'anticorps sp~cifique (anticorps restreint). Le complexe est adsorbe sur ~' ' ~ ' ' " . " , ' ~ f~ ~,' .J '~
billes de sépharose-proteine A, lavé, récupere et analysé en electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE~.
Les résultats ont montré que l'anticorps restreint donne une bande de précipitation, après autoradiographie, quand les cellules portant l'haplotype correspondant sont incubées avec le peptide. (En l'absence du peptide les resultats, pour cette expérience, sont extrèmement faibles mais ne semblent pas absolument négatifs).
3) Utilisation de la molécule H-2 soluble obtenu par aénie qénétique et vidée de son contenu PePtidique Une molecule H-2 soluble (dépourvue de la partie transmembranaire) obtenue par génie génetique a eté
produite et vidée de son peptide endogene. Elle est utilisée pour loger a l'intérieur le peptide de la nucléoprotéine du virus grippal. Cette molécule sert de cible pour l'anticorps restreint dans la technique ELISA ou radioimmuno-essai (RIA) utilisant la proteine A marquée à 1'iode 125 par exemple.
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Claims (17)
1/ Anticorps monoclonaux restreints caractérisés par leur capacité à reconnaître spécifiquement un complexe formé par un peptide caractéristique d'un antigène d'un agent pathogène ou un peptide caractéristique d'une dérégulation cellulaire et par une molécule du Complexe Najeur d'Histo-compatibilité (CMH) ayant la capacité de reconnaître et de fixer ce peptide, lesdits anticorps étant des anticorps monoclonaux restreints, dès lors qu'ils ne reconnaissent pas ledit peptide en association avec une molécule de CMH
d'haplotype non spécifique du peptide.
d'haplotype non spécifique du peptide.
2/ Anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus ou pratiquement dépourvus de réaction à
l'égard du peptide seul et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout la molécule du CMH seule.
l'égard du peptide seul et/ou en ce qu'ils reconnaissent faiblement ou pas du tout la molécule du CMH seule.
3/ Anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce que les peptides reconnus sont caractéristiques d'agents pathogènes des virus, des bactéries, des parasites par exemple le plasmodium, des champignons, notamment des levures pathogènes, ou des peptides représentant des antigènes mineurs d'histo-compatibilité, des antigènes spécifiques de tumeurs ou des antigènes spécifiques de dérèglements autoimmuns.
4/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que les peptides reconnus présentent de 7 à 25, de préférence une dizaine d'acides aminés.
5/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le peptide reconnu est spécifique d'un rétrovirus humain HIV et notamment en ce qu'il s'agit de peptides de la protéine gag, de la nucléoprotéine ou du peptide X16F.
6/ Anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que la molécule du CMH reconnue est de différents haplotypes de classe I comme de classe II.
7/ Procédé pour la préparation d'anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que:
- on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec des cellules spléniques isogèniques recouvertes d'un peptide déterminé, avec des cellules de myélome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyéthylène glycol, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ, - on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique ELISA effectuée avec un réactif à base d'anticorps conjugue anti-Ig de souris couplé à une enzyme par exemple l'uréase ou la phosphatase alcaline ou la peroxydase, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi sélectionnés.
- on fusionne des cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec des cellules spléniques isogèniques recouvertes d'un peptide déterminé, avec des cellules de myélome en présence d'un promoteur de fusion, par exemple le polyéthylène glycol, les cellules spléniques étant en excès par rapport aux cellules myélomateuses, par exemple dans une proportion de 10 pour 1 environ, - on réalise un criblage afin de sélectionner ceux des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux restreints, par exemple par la technique ELISA effectuée avec un réactif à base d'anticorps conjugue anti-Ig de souris couplé à une enzyme par exemple l'uréase ou la phosphatase alcaline ou la peroxydase, - on récupère et on clone les hybridomes ainsi sélectionnés.
8/ Hybridomes tels qu'obtenus par fusion de cellules de myélomes et de cellules spléniques d'un animal préalablement immunisé avec le peptide contre lequel on souhaite produire des anticorps monoclonaux restreints, dans des conditions telles que l'antigène contre lequel sont formés les anticorps, est constitue par un complexe comportant le peptide ci-dessus associé à une molécule de CMH qui le reconnait spécifiquement.
9/ Composition pour le diagnostic de la presence de peptides associés à des molécules de CMH, dans un échantillon biologique ou dans un organisme vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
10/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet de détecter une infection par un agent pathogène, notamment un virus.
11/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de tumeurs.
12/ Composition pour le diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de dérèglements autoimmuns.
13/ Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils sont couplés à des substances capables de les rendre cytotoxiques par exemple à une toxine, un antibiotique ou un isotope radioactif.
14/ Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints selon la revendication 13.
15/ Kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique d'une infection par un organisme pathogène ou pour le diagnostic d'un cancer, d'une maladie autoimmune ou d'un autre dérèglement cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend:
- des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ayant la spécificité recherchée compte tenu du diagnostic à
effectuer, - des moyens pour révéler la présence d'un conjugué de type complexe (antigène-molécule du CMH) lié avec l'anticorps.
- des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ayant la spécificité recherchée compte tenu du diagnostic à
effectuer, - des moyens pour révéler la présence d'un conjugué de type complexe (antigène-molécule du CMH) lié avec l'anticorps.
16/ Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la modulation de l'action de cellules T, notamment dans les pathologies autoimmunes.
17. Composition vaccinante caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, des anticorps monoclonaux restreints selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9001769 | 1990-02-14 | ||
| FR9001769A FR2658197B1 (fr) | 1990-02-14 | 1990-02-14 | Anticorps monoclonaux restreints reconnaissant un peptide associe a un antigene du complexe majeur d'histocompatibilite - applications au diagnostic et au traitement. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2051651A1 true CA2051651A1 (fr) | 1991-08-15 |
Family
ID=9393718
Family Applications (1)
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