FR2848573A1 - Compositions et methodes pour la detection et le traitement de pathologies neurodegeneratives - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la détection et le traitement de pathologies neurodégénératives. Elle décrit notamment l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, d'altérations moléculaires dans la voie de synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques. L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en oeuvre de ces stratégies.
Description
COMPOSITIONS ET METHODES POUR LA DETECTION ET LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES
NEURODEGENERATIVES
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la détection et le 5 traitement de pathologies neurodégénératives. Elle décrit notamment l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, 10 d'altérations moléculaires dans la voie de synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques.
L'invention concerne également des méthodes, outils, constructions et compositions adaptées à la mise en oeuvre de ces stratégies.
La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive, est caractérisée par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à l'orientation et au jugement. La nature des symptômes, souvent confondus avec les désagréments physiologiques liés à la vieillesse, leur sévérité ainsi que l'âge de leurs 20 apparitions, varient selon les individus. Ceci contribue à la difficulté d'établir un diagnostic aux stades précoces de la maladie.
L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de neurones de l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué dans 25 le raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont particulièrement affectés par cette déplétion.
Une autre anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de la maladie d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires de 30 protéines. Des agrégats neurofibrillaires intracellulaires de la protéine tau semblent bien corrélés avec la gravité de la démence. Des plaques séniles formées par agrégation intra et extracellulaire de peptide beta-amylode caractérisent des régions d'altérations de neurones et de cellules gliales.
Il est cependant remarquable de noter que ces zones d'agrégation ne correspondent pas aux sites de la déplétion en synapses caractéristique du déclin des fonctions cognitives.
Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes sont associés au développement de la maladie. L'APP (Amyloid Precursor Protein; précurseur du peptide beta amyloide), les présénilines 1 et 2 (PS1 et PS2) et 10 l'apolipoprotéine E(Apo E). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes aboutissent à une production accrue de peptide beta amylode, les mécanismes qui président aux pertes synaptiques et neuronales restent mal connus. Plusieurs hypothèses et mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent différents phénomènes: - le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide beta amyloide; - les phénomènes inflammatoires et la réponse immunitaire réactionnels; - les défauts d'hormones sexuelles; les défauts d'insuline; et - l'hypothyroidisme.
D'autres hypothèses soulignent le rôle des modifications des influx de calcium et de l'excitotoxicité. Toutefois, aucun élément ne permet de rentre compte de la vulnérabilité particulière des neurones cholinergiques.
Les traitements actuellement disponibles, basés sur l'utilisation d'inhibiteurs d'acétylcholinestérase, ne font qu'améliorer de façon transitoire les fonctions cognitives des patients et ne représentent pas une approche thérapeutique susceptible de ralentir la progression de la maladie d'Alzheimer et encore moins de la guérir.
Si de récentes observations soulignent la possibilité d'intervenir pharmacologiquement au niveau du métabolisme du cholestérol ou par des approches d'immunothérapie dirigée contre le peptide beta amyloide (ou peptide A13), il existe clairement un besoin de mieux comprendre les chemins de signalisation qui aboutissent à la mort neuronale, de façon à identifier d'autres cibles d'intérêt thérapeutique que les évidentes protéases qui participent à la maturation du peptide Ap.
En outre, la mise à disposition d'un test de diagnostic efficace, notamment précoce, permettrait aux patients de bénéficier, dès le début de la maladie, d'un traitement par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, dans des conditions plus efficaces qu'à l'heure actuelle.
La présente demande décrit maintenant l'identification de nouvelles voies métaboliques et de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans le développement de pathologies neurodégénératives, ainsi que des approches diagnostiques et thérapeutiques basées sur une modulation de ces voies ou de l'activité de ces cibles. L'invention décrit notamment la présence, chez des patients atteints, d'altérations moléculaires dans la voie de 15 synthèse des prostaglandines PGD2 et permet le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques efficaces et spécifiques.
De façon à identifier le répertoire des évènements d'épissage et liés également à toute autre modification qualitative des ARNm, la technique DATAS, brevetée, a été 20 appliquée à des ARNm de cerveaux contrôles et atteints de la maladie d'Alzheimer. Les deux groupes correspondent à des individus d'âges équivalents de façon à ne pas introduire de biais lié au vieillissement. Parmi les clones identifiés figure un fragment d'ARNm correspondant à la Prostaglandine D2 Synthase (" PGD2S "), recouvrant une partie de l'exon 5, l'exon 6 ainsi qu'une partie de l'exon 7. Ce fragment DATAS 25 correspond aux nucléotides 517 à 670 de la séquence de la banque Refseq répertoriée sous le numéro nm_000954. L'exon 6 porte le codon stop de la PGD2S, l'exon 7 étant non-codant. L'identification de ce fragment indique une dérégulation de l'expression de l'ARNm de 30 la PGD2S dans les cerveaux atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux cerveaux contrôles, qui aboutit à une délétion de l'extrémité C-terminale de la PGD2S.
La PGD2S est une protéine localisée dans l'appareil de Golgi et également sécrétée dans le liquide céphalorachidien à partir du plexus chorode. La PGD2S joue un rôle clef dans la synthèse des prostanodes. Elle intervient dans la production de la prostaglandine D2 (" PGD2 ") qui est la prostaglandine majeure produite dans le 5 système nerveux central, agissant comme un neuromodulateur et comme un médiateur des phénomènes inflammatoires. La PGD2 est un précurseur des prostaglandines J2.
Ces prostaglandines sont des ligands des récepteurs nucléaires PPAR gamma et sont impliquées dans la croissance des neurites et l'augmentation de l'activité de l'acétylcholinestérase. La PGD2 est formée par isomérisation de la PGH2 grâce à 10 l'action de la PGD2 synthase. Toute altération de la structure de la PGDS2 peut par conséquent aboutir à une altération de sa fonction et par conséquent à une altération de la viabilité et de la fonctionnalité des neurones et notamment des neurones cholinergiques, particulièrement vulnérable dans la maladie d'Alzheimer.
D'autre part, la prostaglandine D2 synthase est une molécule bifonctionnelle. En plus de ses propriétés catalytiques, la PGD2S possède la capacité de lier et donc de véhiculer dans le liquide céphalorachidien des molécules lipophiliques telles l'acide rétinoque. Il est remarquable de noter que la rétinaldéhyde déshydrogénase, enzyme intervenant dans la synthèse de l'acide rétinoque, est exprimée de façon majoritaire au niveau du plexus 20 choroide tout comme la PGD2S. Il est donc vraisemblable d'envisager la PGD2S comme un ligand de l'acide rétinoique capable de véhiculer cette molécule dans le liquide céphalorachidien et donc de réguler sa concentration locale. Les neurones qui répondent plus particulièrement à l'acide rétinoque au cours du développement et à l'âge adulte correspondent aux sites de plasticité synaptique importante. L'une des 25 caractéristiques les mieux corrélées avec le déclin cognitif au cours de la progression de la maladie d'Alzheimer est la perte de la plasticité synaptique. La présente invention permet de proposer que cette anomalie est consécutive à une dérégulation de l'expression de l'ARNm de la PGD2S qui a pour conséquence une anomalie de régulation du transport, du stockage ou du re-largage de l'acide rétinoque nécessaire 30 non seulement à la viabilité neuronale mais aussi à une plasticité neuronale correcte.
De plus, l'inhibition de l'activité de la PGD2S peut entraîner une augmentation de la concentration de PGH2, dont il a été montré qu'elle favorise l'agrégation du peptide beta -amylode. En outre, il existe une autre voie de conversion de la PGH2, conduisant à la synthèse de PGE2, grâce à l'action de la PGE2 synthase récemment clonée. La 5 PGE2 stimule la production par les astrocytes de cytokines proinflammatoires, l'IL6 et l'ILI, participant ainsi vraisemblablement au processus neurodégénératifs. De plus, la PGE2 bloque sélectivement la neurotransmission glycinergique qui est inhibitrice et donc la PGE2 favorise le phénomène d'excitotoxicité.
En outre, les hormones thyrodiennes et plus particulièrement la thyroxine qui est capable de protéger les neurones de l'hippocampe contre le stress induit dans des conditions ischémiques, sont capables de se lier à la PGD2S. L'importance des hormones thyrodiennes dans la maladie d'Alzheimer est attestée par le facteur de risque que représente l'hypothyrodisme et par l'association entre défaut thyrodien et 15 syndrome de Down. Il est à remarquer que la pertinence de l'association entre PGD2S, hormones thyrodiennes et maladie d'Alzheimer est renforcée par la présence d'éléments de réponse transcriptionnelle aux hormones thyrodiennes dans le promoteur du gène de la PGD2S. Ainsi donc un défaut d'hormones thyrodiennes diminue l'expression de la PGD2S et un défaut de PGD2S interfère avec le transport de celles-ci, 20 ces deux phénomènes pouvant concourir à l'altération des neurones et notamment des neurones cholinergiques.
L'identification, par les inventeurs, d'altérations structurales et/ou fonctionnelles affectant la protéine PGDS2 chez des patients permet donc de proposer de nouvelles 25 cibles et de nouvelles voies moléculaires pour le traitement ou le diagnostic de pathologies neurodégénératives, ainsi que pour le criblage de composés actifs.
La présente invention permet notamment de proposer la détection de toute modification de la protéine PGD2S, de son messager, gène, ou de leur expression, à des fins de 30 diagnostic de la maladie d'Alzheimer ou autres maladies neurodégénératives.
La présente invention fournit également les bases pour la recherche et l'utilisation thérapeutique, pour le traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, de composés activateurs de la PGD2S, notamment de composés permettant de compenser, au niveau des formes de l'enzyme non altérées, les effets liés à l'altération de la fonction observée chez les patients.
La présente invention fournit également les bases pour la recherche et l'utilisation thérapeutique, pour le traitement de maladies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, de composés permettant d'orienter préférentiellement la 10 conversion de la PGH2 vers la PGD2, et non pas vers la PGE2. Outre l'utilisation de composés permettant la stimulation de la PGD2S, il peut en effet être proposé d'utiliser des inhibiteurs de la PGE2 synthase afin compenser le défaut d'activité de PGD2S découvert par les inventeurs.
L'intérêt de ces stratégies thérapeutiques découlant des informations présentées dans la présente invention apparaît sur la figure 1. Ces stratégies thérapeutiques sont à placer notamment en regard des tentatives de traitement qui ont été réalisées à l'aide d'inhibiteur d'activités cyclooxygénases, et plus particulièrement des inhibiteurs de cox2. Il est permis d'anticiper que ces stratégies présenteront une faible efficacité. En 20 effet, les conséquences attendues de l'inhibition de la synthèse de PGH2 sont non seulement une inhibition de la production de PGE2 et donc de ses conséquences délétères pour le système nerveux central, mais aussi une inhibition des synthèses de PGD2 et PGJ2 et donc de leurs effets favorisant la viabilité et la fonctionnalité neuronale, voie métabolique identifiée par les inventeurs. 25 Dans ce contexte, sur la base des voies métaboliques caractérisées par les inventeurs, l'invention permet également de proposer l'utilisation combinée d'inhibiteurs de cyclooxygénases et d'agonistes de PPAR pour le traitement de maladies neurodégénératives. L'invention offre ainsi à présent des nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques plus spécifiques de ces pathologies, et permet également de concevoir des thérapies de combinaisons plus efficaces.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans une méthode de détection d'une prédisposition, de la présence, ou du stade d'évolution d'une maladie neurodégénérative chez un sujet, notamment de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la présence, dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, d'une altération dans le locus PGD2S. De préférence, l'altération est une forme 10 d'épissage dont la présence ou la quantité relative augmente ou diminue chez les patients atteints.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie 15 d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à augmenter l'activité de la PGD2S.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie 20 d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, 25 comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus, (ii) la synthèse d'un composé ainsi sélectionné ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci et (iii) le conditionnement dudit composé ou analogue en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'invention concerne également l'utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi qu'une méthode de traitement correspondante.
Un autre aspect de l'invention réside dans l'utilisation combinée d'un inhibiteur de 5 cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans une méthode de traitement correspondante.
D'autres éléments et aspects de l'invention sont notamment des protéines et acides 10 nucléiques correspondant, codant des formes nouvelles de PGD2S, des vecteurs et cellules les contenant, des sondes et amorces spécifiques, ainsi que d'autres constructions, compositions et kits utiles à la mise en oeuvre des méthodes ci-avant.
L'invention est particulièrement adaptée à la détection, au dépistage, au diagnostic, au 15 suivi ou au traitement, en phase précoce ou non, de la maladie d'Alzheimer chez l'homme.
DEFINITIONS
Maladie Neurodégénérative: Au sens de l'invention, on entend par maladie neurodégénérative, toute pathologie liée à une perte neuronale, telle que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la Chorée de Huntington. L'invention est tout particulièrement adaptée au diagnostic ou au traitement de la maladie d'Alzheimer.
Locus PGD2S: Dans le contexte de l'invention, le terme locus PGD2S désigne toute séquence ou tout produit PGD2S dans une cellule ou un organisme. Ce terme comprend notamment les 30 séquences nucléiques, codantes ou non, ainsi que les séquences protéiques, matures ou non. Le terme locus PGD2S inclut donc tout ou partie de l'ADN génomique, y compris ses régions codantes et/ou non-codantes (introns, séquences régulatrices, etc.), des ARN (messagers, pré-messagers, etc.) et des protéines (formes précurseurs, matures, solubles, sécrétées, etc.) de PGD2S, présentes dans un organisme, tissu ou cellule.
Le terme " gène PGD2S " désigne tout acide nucléique codant un polypeptide PGD2S. 5 Il peut s'agit d'ADN génomique (ADNg), complémentaire (ADNc), synthétique ou semi-synthétique, d'ARNm, d'ARN synthétique, etc. Il peut s'agir d'un acide nucléique recombinant ou de synthèse, produit par les techniques connues de l'homme du métier, telles que la synthèse artificielle, l'amplification, le clivage enzymatique, la ligation, la recombinaison, etc., à partir de sources biologiques, de séquences disponibles ou de 10 matériel commercial. Un gène PGD2S est typiquement sous forme double-brin, même si des formes différentes peuvent exister au sens de l'invention. La séquence de gènes PGD2S est disponible dans certaines banques de données, comme notamment RefSeq, n NM_000954 (voir également White et al., JBC 267(32) (1992) 23202-23208).
D'autres séquences de gènes PGD2S au sens de l'invention peuvent être isolées à partir 15 d'échantillons, de collections ou synthétisées. Il peut s'agir de séquences hybridant en condition de stringence élevée avec un acide nucléique codant la séquence SEQ ID NO: 1 présentée ci-après.
Le terme polypeptide PGD2S désigne plus particulièrement tout polypeptide codé par 20 un gène PGD2S tel que défini ci-avant. Un exemple spécifique est fourni ci-après (SEQ ID NO: 1), correspondant à la séquence référencée dans Genbank sous le numéro NP_000945.1. 1 MATHHTLWMG LALLGVLGDL QAAPEAQVSV QPNFQQDKFL GRWFSAGLAS 25 51 NSSWLREKKA ALSMCKSVVA PATDGGLNLT STFLRKNQCE TRTMLLQPAG 101 SLGSYSYRSP HWGSTYSVSV VETDYDQYAL LYSQGSKGPG EDFRMATLYS 151 RTQTPRAELK EKFTAFCKAQ GFTEDTIVFL PQTDKCMTEQ Le terme polypeptide PGD2S inclut également, au sens large, tout variant naturel 30 biologiquement actif de la séquence identifiée ci-dessus, pouvant résulter de polymorphismes, épissage, mutations, insertions, etc. Altération L'altération dans le locus PGD2S peut être de nature diverse, telle que notamment un(e) ou plusieurs mutations, insertions, délétions et/ou épissages dans le gène ou 'ARN codant PGD2S. Il s'agit avantageusement d'un épissage, par exemple de l'apparition d'une forme d'épissage de PGD2S ou de la modification du rapport entre différentes 5 formes d'épissage ou entre une forme non-épissée et des formes d'épissage. Dans ce contexte, l'invention décrit notamment l'apparition de formes alternatives de l'ARNm codant PGD2S chez des patients atteints de pathologie neurodégénérative, et notamment de formes altérées au niveau de l'exon 6. D'autres formes peuvent être envisagées et suivies dans le cadre de la présente demande. Un forme altérée de PGD2S désigne plus 10 spécifiquement un polypeptide dont la structure primaire est modifiée par rapport à la séquence présentée ci-dessus, cette modification pouvant résulter d'une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions ou insertions de un ou plusieurs résidus, ladite forme étant présente dans certains tissus pathologiques.
Utilisation combinée Le terme " utilisation combinée " indique que les différents (typiquement deux) principes actifs sont administrés au sujet de manière à exercer une action thérapeutique combinée. Toutefois, 1 'utilisation combinée n'implique pas nécessairement un 20 conditionnement unique ou une administration simultanée. Ainsi, les deux types d'agents peuvent être utilisés de manière séparée ou espacée dans le temps, pour produire une action thérapeutique combinée chez un patient. Dans ce cas, les principes actifs peuvent être conditionnés séparément, ou dans un même packaging mais dans des conteneurs séparés. En outre, les agents actifs peuvent être administrés selon des 25 protocoles, voies et dosages différents. Dans le cas d'une administration simultanée, celle-ci peut être réalisée en un même site ou en des sites et voies d'administration différents. En outre, s'il peut être envisagé un conditionnement sous forme de mélange, un conditionnement séparé reste généralement plus pratique. il
Traitement Dans le contexte de l'invention, le terme " traitement " désigne le traitement préventif, curatif ou palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, 5 amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents actifs.
Selon un aspect particulier, l'invention permet d'améliorer la viabilité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment des neurones 1 0 cholinergiques.
Selon un autre aspect particulier, l'invention permet d'améliorer la fonctionnalité neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment des neurones cholinergiques.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration de la fonction cognitive chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration de la plasticité 20 neuronale chez des sujets atteints de pathologie neurodégénérative, notamment de la plasticité synaptique.
Un autre aspect particulier de l'invention concerne l'amélioration du transport, du stockage et/ou du re-largage de l'acide rétinoque dans le liquide céphalorachidien chez 25 des sujets atteints de pathologie neurodégénérative.
OUTILS ET METHODES DE DIAGNOSTIC
La présente demande décrit à présent de nouveaux procédés de détection, dépistage ou de suivi de l'évolution (et/ou de l'efficacité d'un traitement) d'une pathologie neurodégénérative ou d'une prédisposition à une telle pathologie chez un sujet, basés sur une détermination de la présence d'une altération dans le locus PGD2S.
La détermination est réalisée typiquement dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, 5 tel que un échantillon de sang, urine, tissu, salive, etc. Il peut s'agir d'un fluide biologique, d'une biopsie, etc., typiquement de liquide céphalorachidien. L'échantillon comprend préférentiellement des acides nucléiques ou des protéines. Lorsque cela est souhaitable, l'échantillon peut être soumis à différents traitements, par exemple lyse, centrifugation, purification, enrichissement, etc., de manière à rendre accessible ou à 10 faciliter l'accès aux protéines et/ou acides nucléiques qu'il contient.
La détermination de la présence de l'altération dans le locus PGD2S peut être effectuée par différentes techniques, telles que le séquençage, l'hybridation sélective, l'amplification sélective et/ou la détection immunologique, etc. Des méthodes 15 utilisables pour déterminer la présence de protéines sont basées par exemple sur des réactions immunoenzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence ou la quantité (absolue ou relative) de gènes ou d'ARN sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA (" Transcriptional Mediated Amplification "), la 20 migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE (" denaturing gel gradient electrophoresis "), etc. La présente demande démontre, pour la première fois, une dérégulation du locus PGD2S dans les cerveaux atteints de maladie neurodégénérative, et fournit donc une 25 méthode fiable de détection ou diagnostic de ces pathologies, notamment dès les phases précoces, permettant ainsi d'optimiser le suivi thérapeutique des patients.
Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde nucléique spécifique du gène PGD2S, et la mise en évidence d'une 30 hybridation.
La sonde est plus particulièrement spécifique d'une forme altérée du gène PGD2S, par exemple d'une forme mutée, délétée ou épissée. La demande décrit la mise en évidence d'une dérégulation de l'expression de l'ARNm de PGD2S dans les cerveaux atteints, conduisant à la production de formes altérées de l'ARN, notamment de formes 5 comprenant une ou plusieurs délétions, en particulier une délétion dans la région codant la partie Cterminale de la PGD2S. Ainsi, un variant spécifique a été mis en évidence, dans lequel l'exon 6 notamment est délété. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, la sonde utilisée est spécifique d'une forme altérée de PGD2S dans laquelle tout ou partie de l'exon 6 est délétée. Dans un autre mode de réalisation, la sonde utilisée est 10 spécifique d'une forme altérée de PGD2S dans laquelle tout ou partie d'un exon est délétée. D'autres altérations sont des altérations portant sur la structure de 'ARN, notamment dans les régions 5'- et/ou 3'-non traduites.
Dans ce contexte, un objet particulier de l'invention réside également dans une sonde 15 nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété de tout ou partie d'un exon, notamment de l'exon 6. A titre d'exemple spécifique, une sonde de l'invention comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété des résidus 517 à 670 de la séquence codante 20 nm_000954.
Une sonde selon l'invention comprend typiquement de 10 à 2000 nucléotides, de préférence de 20 à 1000, plus préférentiellement de 30 à 800, et est généralement simple-brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide 25 spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un acide nucléique tel que défini ci-avant. L'oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Les oligonucléotides et/ou les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc. Pour la détection de formes d'épissages du gène PGD2S 30 ou de délétions, on utilise typiquement une sonde complémentaire d'un domaine épissé (ou délété), ou d'un domaine retenu, ou d'une région de jonction formée par un épissage (ou une délétion).
Ainsi, pour détecter la forme PGD2S délétée des résidus 517-670, il est possible d'utiliser une sonde complémentaire et spécifique de la région de l'ARNm formée par la jonction des nucléotides 516 et 671. Une telle région est spécifique de la forme épissée et permet sa détection.
Une autre méthode particulière pour déterminer la présence d'une altération dans le locus PGD2S comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec 10 une amorce nucléique ou une paire d'amorces nucléiques permettant l'amplification d'une portion au moins du gène PGD2S, et la mise en évidence d'un produit d'amplification. Préférentiellement, l'amorce ou la paire d'amorces utilisée permet l'amplification d'une portion du gène PGD2S spécifique d'une forme altérée, par exemple d'une portion comprenant un site de mutation,délétion ou d'épissage. Dans un 15 mode particulier de mise en oeuvre, l'amorce ou la paire d'amorces permet l'amplification de tout ou partie d'un exon, par exemple de l'exon 6, de l'ARNm de PGD2S, ou d'une région formée par la jonction entre deux domaines séparant un domaine épissé.
A cet égard, un objet particulier de la présente demande concerne également une paire d'amorces nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une amorce 5' et une amorce 3', chacune étant complémentaire et spécifique d'une région du gène PGD2S et permettant l'amplification d'une portion de l'acide nucléique spécifique d'une forme altérée de PGD2S, notamment d'une forme épissée, mutée ou délétée. Une amorce 25 selon l'invention est typiquement simple-brin, et avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 3 à 40 et encore plus préférentiellement de 3 à 35 bases. Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 3 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins d'une région bordant (i) une mutation, (ii) une insertion ou (iii) un exon du gène (et 30 notamment de l'ARN) PGD2S, ladite mutation, insertion étant présente et/ou ledit exon étant épissé, en tout ou en partie, dans les tissus pathologiques, notamment l'exon 6. Le terme " bordant " indique que la région est généralement distante de 300pb au plus de la région ciblée (e.g., de la mutation ou du début de l'exon ou de la séquence insérée), plus préférentiellement de 200, 150, 100 ou 50, au plus.
Une autre méthode particulière de détermination de la présence d'une altération du locus PGD2S comprend le séquençage de tout ou partie de 'ARN codant PGD2S obtenu à partir d'un échantillon provenant d'un sujet, et la mise en évidence d'une séquence altérée.
Pour les méthodes de l'invention, les acides nucléiques de l'échantillon peuvent être traités avant détection, par exemple par purification, amplification, clivage, sélection, etc. Une autre méthode particulière de détermination de la présence d'une altération du 15 locus PGD2S comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un ligand spécifique d'une protéine PGD2S altérée, notamment un anticorps, et la mise en évidence d'un complexe (e.g., antigène-anticorps).
Comme indiqué, l'invention montre la présence d'altérations du locus PGD2S chez les 20 patients, conduisant à l'expression de formes altérées de la protéine PGD2S. Il peut s'agir de formes mutées, délétées ou d'épissages particuliers, dont la présence ou la quantité relative est caractéristique de la pathologie. La présente invention inclut donc la détection de ces formes protéiques, au moyen de ligands spécifiques, comme indicateurs de l'état pathologique du sujet.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne tout anticorps capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un polypeptide PGD2S tel que défini ci-dessus, notamment à une forme altérée d'un polypeptide PGD2S. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps 30 présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées sont décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e.
g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection souscutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés. Les méthodes classiques de 10 production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou 15 F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles. L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection (non thérapeutique) d'un polypeptide tel que défini ci-avant ou d'un 20 fragment immunogène de ce dernier à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps. Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques de formes altérées de PGD2S, notamment de formes d'épissage, notamment délétées de tout ou partie de la région codée par un exon alternatif, notamment par l'exon 6.
L'invention concerne des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits cidessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.
Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues telles que des toxines, 30 des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Pour la mise en oeuvre des méthodes de détection, le ligand (e.g., anticorps) ou la sonde 5 utilisé peuvent être sous forme soluble ou immobilisée à un support. L'immobilisation sur un support est avantageuse, notamment pour la révélation de la formation du complexe. A cet égard, un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support 10 sur lequel un ou plusieurs acides nucléiques ou anticorps tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. Les acides nucléique ou anticorps sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la 15 molécule accessible pour une réaction d'hybridation ou immunologique, respectivement. Les acides nucléiques ou anticorps peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et déposés en plusieurs exemplaires.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en oeuvre d'un 20 procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ciavant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.
Les procédés et outils décrits ci-avant sont particulièrement adaptés à la détection et/ou au suivi de la maladie d'Alzheimer chez des sujets, y compris à des phases précoces, et peuvent ainsi permettre de proposer des protocoles thérapeutiques plus efficaces.
OUTILS ET METHODES DE SELECTION
Un autre objet de l'invention réside dans des procédés de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans les outils (e.g., vecteurs, cellules, etc.) utilisables à cet effet. Les procédés sont basés sur la sélection de composés ayant la capacité de moduler une voie métabolique identifiée dans l'invention, notamment l'activité de la PGD2S ou de la PGE2S. L'invention montre en effet que le développement de pathologies neurodégénératives est associé à une dérégulation de l'expression de la PGD2S, 10 conduisant à une dérégulation des voies de conversion de la PGH2. Des composés capables d'orienter la conversion de PGH2 en PGD2, ou de favoriser ou stimuler cette conversion, constituent des candidats pour la correction de ces dérégulations et donc pour le traitement des pathologies neurodégénératives.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à augmenter l'activité de la PGD2S. Le procédé est avantageusement réalisé in vitro ou ex vivo, en système cellulaire ou acellulaire. 20 Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S. Le procédé est avantageusement réalisé 25 in vitro ou ex vivo, en système cellulaire ou acellulaire.
Les procédés de sélection sont avantageusement réalisés ex vivo ou in vitro, en système cellulaire ou acellulaire. Ils peuvent également être réalisés (ou validés ultérieurement) par des essais chez des mammifères non-humains. Il peut s'agir de tests de liaison ou de 30 tests fonctionnels (mesure d'une expression, d'une activité, d'un phénotype, etc.). La détermination de l'activité du polypeptide cible peut comprendre une détermination de la synthèse (e.g., transcription, traduction, etc.), de la maturation, du transport ou de la fonction biologique du polypeptide.
Dans une première variante, les méthodes de l'invention comprennent la sélection des 5 composés se liant au polypeptide cible (PGD2S ou PGE2S) ou au gène ou à 'ARN correspondant, ou à un fragment de ceux-ci. La liaison au polypeptide, au gène ou à 'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. Elle peut être réalisée in vitro, par exemple en utilisant le polypeptide ou le gène immobilisé sur 10 un support. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne donc un procédé de sélection de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant l'incubation d'un composé test avec une molécule cible choisie parmi un polypeptide PGD2S ou PGE2S, un acide nucléique codant celui-ci et un fragment de ceux-ci, dans des conditions permettant l'interaction 15 entre ledit composé test et ladite molécule cible et, la détermination de la formation d'un complexe entre ledit composé test et ladite molécule cible. Les composés capables de former un tel complexe peuvent ensuite être testés pour d'autres propriétés biologiques, dans d'autres systèmes. Le fragment utilisé comporte avantageusement au moins 10 résidus consécutifs, de préférence au moins 20, provenant de la molécule cible 20 entière.
Dans une deuxième variante, les méthodes de l'invention comprennent la sélection des composés modulant l'expression du polypeptide cible (PGD2S ou PGE2S) ou de 'ARN correspondant. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN 25 ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur. Cette variante peut être réalisée en système acellulaire ou, préférentiellement, en système cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne donc un procédé de sélection de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer, comprenant l'incubation in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une (population de) 30 cellule(s) exprimant une molécule cible choisie parmi un polypeptide PGD2S ou PGE2S, un acide nucléique codant celui-ci et un fragment de ceux-ci, et la détermination de capacité du composé test à moduler l'expression de ladite molécule cible, notamment sa quantité dans la cellule. Les cellules utilisées dans cette variante peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes. Parmi les cellules procaryotes on peut citer notamment les bactéries telles que E. coli. Parmi les cellules eucaryotes, on peut mentionner les cellules de levure ou 5 les cellules de mammifères, d'insectes ou de plantes. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées. On peut citer les cellules COS, CHO, 3T3, HeLa, etc. On utilise typiquement une cellule exprimant naturellement la molécule cible, ou modifiée pour exprimer ladite molécule, notamment des cellules recombinantes. De telles cellules recombinantes peuvent être préparées par introduction d'un acide nucléique 10 recombinant exprimant le polypeptide, ou d'un vecteur comprenant celui-ci.
Pour la mise en oeuvre d'un test fonctionnel cellulaire, on incube typiquement une cellule exprimant un polypeptide cible avec un composé test et on mesure l'expression dudit polypeptide. Le niveau d'expression mesuré en présence du composé test est 15 avantageusement comparé à celui observé en l'absence du composé test. Les composés capables d'inhiber (e. g., de réduire) l'expression de PGE2S ou d'augmenter l'expression de PGD2S constituent des composés d'intérêt.
Les procédés de sélection peuvent être réalisés en différents formats, comme par 20 exemple en plaques multi-puits, en testant en parallèle de multiples composés candidats.
L'invention concerne également des polypeptides, acides nucléiques, vecteurs et cellules recombinantes utilisables pour la mise en oeuvre des méthodes décrites ci-avant.
En particulier, l'invention concerne tout variant d'épissage d'un polypeptide PGD2S, 25 notamment un variant comprenant une délétion de tout ou partie de la région codée par l'exon 6. Elle concerne aussi des variants de polypeptide PGD2S comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions ou délétions, caractéristiques de tissus pathologiques chez des patients atteints de maladie neurodégénérative.
L'invention concerne également tout acide nucléique codant un polypeptide tel que 30 défini ci-avant, ainsi que tout vecteur comprenant un tel acide nucléique. Le vecteur peut être un plasmide, cosmide, épisome, chromosome artificiel, virus, phage, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc. Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinantes comprenant un acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-avant. Les cellules peuvent être procaryotes ou eucaryotes.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus et (ii) le 10 conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. L'analogue fonctionnel est typiquement un composé dérivé du composé actif identifié, par modification chimique, notamment dans le but d'améliorer son activité ou sa pharmaco-cinétique, ou dans le but de réduire sa toxicité. L'analogue fonctionnel peut être une "pro-drogue" du 15 composé identifié. Des techniques de préparation d'analogues fonctionnels sont bien connues de l'homme du métier, par exemple la modélisation moléculaire, le couplage de groupes NO, etc. Le procédé peut à cet égard comprendre une étape intermédiaire de synthèse du composé sélectionné ou de l'analogue fonctionnel de celui-ci.
TRAITEMENT
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé agoniste de PGD2S ou antagoniste de PGE2S pour le traitement d'une pathologie neurodégénérative, ainsi 25 qu'une méthode de traitement correspondante.
L'invention concerne notamment l'utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi qu'une 30 méthode de traitement correspondante.
Le terme agoniste de PGD2S désigne tout composé stimulant ou mimant l'activité de PGD2S dans une cellule. Le terme antagoniste de PGE2S désigne tout composé diminuant l'activité de PGD2S dans une cellule.
Un autre aspect de l'invention réside dans l'utilisation combinée d'un inhibiteur de cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer, ainsi que dans une méthode de traitement correspondante.
L'inhibiteur de cyclooxygénase est préférentiellement un inhibiteur de Cox2, 10 notamment un inhibiteur spécifique de Cox2. A titre d'exemples spécifiques, on peut citer notamment les composés suivants: Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, dérivés 1,5-diarylpyrazole, etc. L'agoniste de PPAR est avantageusement un agoniste de PPAR gamma, choisi de préférence parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone. 15 Un autre aspect de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de cyclooxygénase, notamment de Cox-2, et un agoniste de PPAR, notamment de PPAR gamma, en vue d'une utilisation combinée pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de 20 la maladie d'Alzheimer.
Les composés peuvent être administrés par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intrapéritonéale, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Les 25 doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. I1 est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule 30 acceptable sur le plan pharmaceutique (ex., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.
EXEMPLES
Identification d'une altération de PGD2S La technique DATAS (WO99/46403) a été appliquée à des ARNm de cerveaux humains contrôles et atteints de la maladie d'Alzheimer. Les deux groupes correspondent à des individus d'âges équivalents de façon à ne pas introduire de biais 10 lié au vieillissement. Parmi les clones identifiés figure un fragment d'ARNm correspondant à la Prostaglandine D2 Synthase (" PGD2S >>), recouvrant une partie de l'exon 5, l'exon 6 ainsi qu'une partie de l'exon 7. Ce fragment DATAS correspond aux nucléotides 517 à 670 de la séquence de la banque Refseq répertoriée sous le numéro nm_000954. L'exon 6 porte le codon stop de la PGD2S, l'exon 7 étant non-codant. La 15 séquence de la PGD2S est fournie dans la séquence SEQ ID NO:1.
L'identification de ce fragment indique une dérégulation de l'expression de l'ARNm de la PGD2S dans les cerveaux atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux cerveaux contrôles, qui aboutit à une délétion de l'extrémité C-terminale de la PGD2S. 20 Compositions pour le traitement des maladies neurodégénératives Les composés actifs mis en évidence dans le cadre de la présente invention peuvent être mis en oeuvre pour le traitement de pathologies neurodégénératives. Ces composés sont 25 notamment choisis parmi des agonistes PGD2S, des antagonistes PGE2S, et des combinaisons de ceux-ci, éventuellement en association avec des inhibiteurs de cyclooxygénase et/ou des agonistes PPAR gamma. On peut citer comme composés spécifiques des anticorps anti-PGE2S (ou des fragments ou dérivés de ceux-ci), des antisens anti-PGE2S, des ARN inactivant PGE2S (siARN, ribozymes, etc.), des 30 molécules mimant ou stimulant la synthèse ou l'activité biologique de PGD2S, des inhibiteurs de Cox2 choisis parmi Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, et des dérivés 1,5-diarylpyrazole; des agonistes de PPAR gamma choisis parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone.
Ces composés peuvent être formulés de différentes manières, et notamment sous forme 5 solide, liquide, de gel, sirop, poudre, aérosol, soluté injectable, etc. Des compositions typiques comprennent un ou plusieurs véhicules ou excipients choisis parmi des solutés tampons, solavnts, liants, stabilisants, amulsifiant, etc. Des solutés tampons ou diluant sont notamment le dicalcium phosphate, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl methyl 10 cellulose (HPMC) (pour libération retard). Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment l'alginate, la carboxymethylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc. D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des 15 agents stabilisants peuvent être incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, guar gum et tragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose. Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels.
Claims (20)
1. Méthode de détection d'une prédisposition, de la présence, ou du stade d'évolution d'une maladie neurodégénérative chez un sujet, comprenant une étape de détermination 5 de la présence, dans un échantillon isolé à partir dudit sujet, d'une altération dans le locus PGD2S.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la maladie neurodégénérative est la maladie d'Alzheimer. 10
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'altération dans le locus PGD2S est une mutation, une insertion, une délétion et/ou un épissage dans le gène ou 'ARN codant PGD2S, ou dans la protéine correspondante.
4. Méthode selon la revendication 3, comprenant la détermination de la présence d'une forme d'épissage de PGD2S ou de la modification du rapport entre différentes formes d'épissage.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'altération est 20 détectée par séquençage, hybridation sélective et/ou amplification sélective.
6. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'un variant d'un polypeptide PGD2S, notamment d'un variant d'épissage comprenant une délétion de tout ou partie de la région codée par un exon epissé chez des patients atteints de maladie 25 neurodégénérative, en particulier de l'exon 6.
7. Acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 6.
8. Vecteur comprenant un acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 30 6.
9. Sonde nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence complémentaire et spécifique d'un acide nucléique codant un polypeptide PGD2S délété de tout ou partie d'un exon, notamment de l'exon 6.
10. Sonde selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend de 10 à 2000 nucléotides, de préférence de 20 à 1000, plus préférentiellement de 30 à 800, et en ce qu'elle est simple-brin.
11. Sonde selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle est complémentaire 10 d'un domaine épissé, ou d'un domaine retenu, ou d'une région de jonction formée par un épissage dans l'ARN de PGD2S.
12. Paire d'amorces nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend une amorce 5' et une amorce 3', chacune étant complémentaires et spécifique d'une acide région du gène 15 PGD2S et permettant l'amplification d'une portion de l'acide nucléique spécifique d'une forme altérée de PGD2S, notamment d'une forme épissée.
13. Paire d'amorces selon la revendication 12, caractérisée en ce que les amorces sont simple-brin, composées de 3 à 50 bases, de préférence complémentaires d'une partie au 20 moins d'une région bordant un exon du gène PGD2S qui est épissé, en tout ou en partie, dans les tissus pathologiques, notamment de l'exon 6.
14. Procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un 25 composé test à augmenter l'activité de la PGD2S in vitro ou ex vivo.
15. Procédé de sélection ou d'identification de composés actifs sur les pathologies neurodégénératives, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à diminuer l'activité de la PGE2S in vitro ou ex vivo. 30
16. Procédé de production d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon la revendication 14 ou 15 et (ii) le conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
17. Utilisation combinée d'un inhibiteur de PGE2S et d'un agoniste de PGD2S pour la 5 préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
18. Utilisation combinée d'un inhibiteur de cyclooxygénase et d'un agoniste de PPAR pour la préparation d'un médicament pour le traitement de pathologies 10 neurodégénératives, notamment de la maladie d'Alzheimer.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'inhibiteur de cyclooxygénase est un inhibiteur de Cox2, choisi de préférence parmi les composés suivants: Rofecoxib, Celecoxib, Raloxifene, Indoxole, et dérivés 1,5- diarylpyrazole. 15
20. Utilisation selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que l'agoniste de PPAR est un agoniste de PPAR gamma choisi de préférence parmi la troglitazone, la pioglitazone et la rosiglitazone.
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