WO2002000878A2 - Dynamine mitochondriale humaine msp1, ses isoformes msp1-x, et leur utilisation en therapeutique - Google Patents

Dynamine mitochondriale humaine msp1, ses isoformes msp1-x, et leur utilisation en therapeutique Download PDF

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WO2002000878A2
WO2002000878A2 PCT/FR2001/001999 FR0101999W WO0200878A2 WO 2002000878 A2 WO2002000878 A2 WO 2002000878A2 FR 0101999 W FR0101999 W FR 0101999W WO 0200878 A2 WO0200878 A2 WO 0200878A2
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polypeptide
msp1
mspl
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PCT/FR2001/001999
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Guy Lenaers
Bernard Ducommun
Christian Hamel
Cécile DELETTRE
Pascale Belenguer
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Universite Paul Sabatier
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4722—G-proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a new protein from the dynamin family, called MSP1, and its 7 isoforms MSPl-X. Also claimed are the DNAs encoding these proteins and their mutated forms, as well as the use of these proteins for research and the manufacture of active substances useful for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • dynamins and related proteins have been identified in recent years in eukaryotes. It seems established that these proteins have many representatives in all organisms, from yeast to humans, and that they are located at different cell sites where they fulfill very specific functions (van derBliek AM, 1999, Trends Cell Biol , 9, pp. 96-102). All are large GTPases (80 to 100 kDa), having in addition to the catalytic domain GTPase, a central domain characteristic of dynamins and one or two assembly domains (coiled-coil domains). Certain dynamins, such as Mspl / MGMl, are further distinguished by the presence of a strongly basic amino-terminal domain.
  • Dynamins can be classified into three groups, according to the functions that may have been assigned to them and / or according to their structural similarity.
  • first group family of conventional dynamins we find dynamins 1 and 2 of mammals, dynamin
  • Vpslp of budding yeast Nothwehr S.F. et al, 1995, J. Cell Biol, 129, pp. 35-46;
  • the second group includes the Dnmlp dynamins of budding yeast, DRP-1 from 'C. elegans and the Drpl of mammals (Imoto M. et al, 1998, J. Cell Sci., 111, pp 1341-49; Kamimoto T., 1998, J. Biol. Chem., 273, pp. 1044-51; Yoon Y. et al, 1998, J. Cell Biol, 140, pp. 779-93). These are cytoplasmic proteins whose functions are involved in vesicular traffic and in controlling the distribution of mitochondria.
  • the third group (family Mspl / MGMl) is formed only of the proteins MGM1 and Mspl which have been isolated in two divergent yeasts, respectively Saccharomyces cerevisiae (Jones B. and Fangman W., 1992, Genes and Dev., 6, pp. 380 -389) and Schi ⁇ osaccharomyces pombe (Pelloquin L. et al, 1998, Biochem. Biophys. Res. Cons., 251, pp. 720-726; Pelloquin L. et al, 1999, J. Cell Sci., 112, pp . 4151-61).
  • MGM1 and Mspl are mitochondrial dynamins essential for the maintenance of mitochondrial DNA and for the organization of the mitochondrial network.
  • the present invention relates to a new human mitochondrial dynamin called MSP1, orthologue to Mspl and MGM1 of yeasts, having several isoforms derived from alternative splicing of the coding gene, as well as the cDNA sequences derived from alternative splices coding for said splicing.
  • dynamin MSP1 and its isoforms Unexpectedly, it has been found that mutated forms of MSP1 are involved in human pathology of genetic origin, namely dominant optical atrophy.
  • Dominant optic atrophy rated OPA1 according to the Online Mendelian Inheritance in Man database (OMIM, entry 165500) is the most common non-syndromic hereditary optic neuropathy. It occurs in one in 50,000 individuals and in many cases leads to legal blindness (visual acuity less than 1/20). This progressive and irreversible disease is characterized by a loss of visual acuity from an early childhood, an acquired anomaly of the chromatic visual sense (dyschromatopsia) and a gap in perception in the visual field projecting both at the point of fixation and on the blind spot (centrocoecal scotoma) with maintenance of the peripheral visual field (Kjer P., 1959,
  • the present invention shows that DNA sequences corresponding to the MSP1 / OPA1 gene carry mutations which are the cause of dominant optical atrophy. These mutations are described as well as the corresponding proteins. In total, 14 mutations affecting the activity of the 8 isoforms of dynamin MSP1 were identified.
  • the subject of the present invention is a human protein belonging to the dynamin family and comprising several isoforms, the mutated forms of said protein as well as the nucleotide sequences encoding said protein, including its isoforms and its mutants.
  • the invention also relates to the vectors capable of expressing said protein and / or its isoforms and / or its mutated forms, in all types of host cells, as well as the cells transformed by said vectors and the methods using them.
  • the subject of the invention is methods of identifying biological or pharmacological compounds modulating the activity of the protein according to the invention, its isoforms and its mutants, and the use of said compounds for therapeutic purposes.
  • the subject of the present invention is a polypeptide whose amino acid sequence is chosen from SEQ ID No.1, a sequence homologous to said SEQ ID No.1, a biologically active fragment of said SEQ ID No.1 or its sequences homologs, said polypeptide being designated by MSP1.
  • the sequence SEQ ID No. 1 is the amino acid sequence of the dynamin MSP1 identified in humans. It is a ubiquitous protein with GTPase activity related to mitochondrial functioning and cell division.
  • homologous polypeptide means any polypeptide resulting from a genetic and / or chemical modification of the sequence SEQ ID No. 1, that is to say mutation, deletion, addition, substitution and / or chemical modification of at least minus one amino acid.
  • Said homologous polypeptides preferably have a sequence homology greater than 80%, with the complete sequence SEQ ID No. 1.
  • homologous polypeptides or the polypeptide fragments of the sequence SEQ ID No.1 according to the invention have biological properties identical or analogous to the biological properties of the polypeptide of sequence SEQ ID No.1.
  • MSPl of general designation MSPl-X.
  • the iso-formed polypeptides between them are the polypeptides which result from the transcription of a nucleic sequence carried by a single gene but whose coding sequences (exons) are retained and combined in a different way by the game of alternative splices of the transcribed sequence .
  • the MSPl-X isoform polypeptides according to the invention are also dynamins having a GTPase catalytic activity.
  • isoform polypeptides whose amino acid sequence is represented respectively by SE ⁇ ) ID N ° 3, SEQ ID N ° 4, SEQ ID N ° 5, SEQ ID N ° 6, SEQ ID N ° 7 , SEQ ID N ° 8, SEQ ID N ° 9. Also claimed are the homologous sequences of said SEQ ID Nos. 3 to 9, the biologically active fragments of said SEQ ID No. 3 to 9 and their homologous sequences.
  • the 7 isoform proteins described by the sequences SEQ ID Nos. 3 to 9 above are designated respectively MSP1-B, MSP1-C, MSP1-D, MSP1-E, MSP1-F MSP1-G, and
  • MSP1-H the 8th isoform MSP1-A being the dominant form, that is to say MSP1.
  • the 7 + 1 isoform MSPl-X dynamins are encoded from 8 mature mRNAs resulting from alternative splices of 3 exons of the MSP1 / OPA1 gene, namely exon 4, exon 4b and exon 5b. The detailed description of these splicing variants is presented in Example No. 4_
  • the present invention also relates to a polypeptide homologous to an MSP1 or MSP1-X polypeptide and distinguished by the fact that it carries one or more mutations inducing a modification, or even a total loss, of the biological activity of said MSP 1 or MSP 1 -X polypeptide.
  • the mutated forms of MSP 1 and MSP 1 -X are designated MSP 1 -m and
  • MSPl-X-m MSPl-X-m, respectively.
  • These mutated polypeptides may be responsible for disorders associated with mitochondrial dysfunction and cell division disorders. They are in particular involved in neurodegenerative diseases such as optic neuropathies and very particularly OPA1 dominant optic atrophy.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence comprising at least one sequence chosen from a) - SEQ ID Sf ° 2, a sequence homologous to said SEQ ID No 2, a fragment of said SEQ ID No 2, said sequences encoding for an MSP1 polypeptide according to the invention; b) - SEQ ID N ° 10, SEQ ID N ° l 1, SEQ ID N ° 12, SEQ ID N ° -13, SEQ ID N ° 14, SEQ
  • sequence SEQ ID No. 2 is the cDNA sequence (complementary DNA) comprising the coding phase, or reading phase, corresponding to the protein MSP1 identified in humans.
  • sequences SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16 are the cDNA sequences comprising respectively the coding phase corresponding to the MSPl-X proteins identified in humans.
  • the cDNA sequences represented by SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 10 to 16 above are therefore the image sequences of the isoform sequences of mRNA directly encoding the proteins MSP1 and MSPL.-X.
  • Said isoform sequences of mRNA result from the transcription of a DNA sequence originating from a single gene but whose coding sequences are retained and combined in a different manner by the game of alternative splices of the transcribed sequence.
  • homologous nucleotide sequence means any nucleotide sequence coding for a polypeptide homologous to MSPl or MSPl-X as defined above, that is to say a sequence resulting from a modification of the sequence SEQ ID No. 2 or sequences SEQ ID No. 10 to 16, in particular by mutation, deletion, addition or substitution of at least one nucleotide.
  • sequences deduced from the sequence SEQ ID No. 2 or from the sequences SEQ ID No. 10 to 16 are included, by degeneration of the genetic code.
  • Such a homologous sequence preferably has a homology greater than 70% with the sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 10 to 216, respectively.
  • the nucleotide sequence according to the invention comprises inter alia the homologous sequences of SEQ ID No. 2 carrying a mutation which affects the biological activity of the MSP 1 polypeptide and which codes for the amino acid sequence of an MSP 1 -m polypeptide according to the invention.
  • nucleotide sequence according to the invention comprises inter alia the sequences homologous to the sequences represented by SEQ ID Nos. 10 to 16, carrying a mutation which affects the biological activity of the MSPl-X polypeptide and which codes for the sequence d amino acids of an MSPl-Xm polypeptide according to the invention. Mutations MSPl -m and MSPl-Xm are described in example N ° 6.
  • MSP1 indifferently denotes the 8 isoform dynamins MSPl and MSPl-X according to the invention.
  • MSP 1 -m will denote either MSP 1 -m and MSP 1 -X-m.
  • nucleotide sequences according to the invention can be used for the production of a protein or a fragment of ', recombinant protein MSPl or MSPl -m according to the invention, according to the techniques of production of recombinant products known to man. of career.
  • An efficient system for producing a recombinant protein requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
  • the invention relates to the cloning and expression vectors containing a nucleotide sequence according to the invention, and the host cells transfected (or transformed) by these vectors.
  • the vector may include a promoter, and signals for initiating and terminating transcription and translation. It can include one or more selection markers as required. It can be integrated into the cell and possibly have specific signals specifying the secretion of the translated protein.
  • nucleotide sequences according to the invention can be inserted into autonomous replication vectors within the chosen host, or into vectors integrative of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be integrated into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation.
  • Such vectors of interest are, for example, the plasmids of the pBlueScript, pREP1, pCDNA or pRK171 families. These vectors can be used as such directly for the in vitro synthesis of the polypeptide according to the invention or introduced into a host cell.
  • the cell host can be chosen from prokaryotic or eukaryotic systems, including yeasts, bacteria, mammalian cells such as human HeLa cells. These transformed cells can be obtained by the transfection of a " nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then the culturing of said cells under conditions allowing replication and / or expression of the nucleotide sequence transfected.
  • These cells can be used in a method for producing a recombinant polypeptide according to the invention.
  • An embodiment of the present invention consists in a process for manufacturing said polypeptide, characterized in that the transfected cells are cultured under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide according to the invention, and that one recovers said recombinant polypeptide.
  • it is useful to be able to detect and ectopically produce a polypeptide according to the invention.
  • the association of the coding phase of the polypeptide according to the invention with the coding phase of a tag protein makes it possible to express in a suitable host a chimeric protein composed of the polypeptide according to the invention and of said tag protein.
  • a function of said tag protein can be its recognition by specific antibodies.
  • the presence of the tag protein is then a sign of the presence of the polypeptide of interest.
  • Such a label is called an antigenic label.
  • the subject of the present invention is therefore a method for detecting the MSP1 or MSP1 -m polypeptide comprising:
  • Such an antigenic label is a protein chosen so that the coding sequence is known and available, and at least one antibody specific and detectable for said protein. It can be for example the fluorescent green protein (Green Fluorescent Protein), the Myc epitope, the Haemagglutinin epitope.
  • the host cell can be any host cell according to the invention.
  • the antibody associated with the chimeric protein obtained by the method according to the invention can be detected by any means available to those skilled in the art.
  • a tag protein can be used, the function of which is to allow specific binding of the protein.
  • affinity label is then called an affinity label.
  • a subject of the present invention is therefore also a process for purifying the MSP 1 or MSP 1 -m polypeptide comprising:
  • An affinity tag is a protein chosen so that the coding sequence is known and available, and at least one support having a specific affinity with said protein. It can be, for example, Glutathione S-transferase, the maltose binding protein (Maltose Binding Protein), polymers of histidines.
  • the specific affinity support can for example consist of microbeads of a metal such as nickel fixing the histamine hexamers.
  • the subject of the invention is also the monoclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, obtained from a polypeptide according to the invention administered to an animal, and capable of specifically recognizing a polypeptide according to the invention.
  • the invention further relates to the use of these antibodies for the purification or the detection of an MSP1 or MSP1 -m polypeptide in a biological sample.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional hybrid culture method described by Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256, pp. 495-497).
  • the antibodies can be chimeric antibodies, or can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.
  • the antibodies according to the invention are particularly useful for detecting the presence of MSPl or MSPl -m.
  • the subject of the present invention is therefore a method of immunological detection of MSP1 or MSPl -m in a biological sample comprising the steps consisting in:
  • detectable antibody is meant either an antibody labeled with a detectable group, such as for example a radioactive, enzymatic, fluorogenic or fluorescent group, or an antibody to which another detectable antibody itself binds.
  • biological sample is meant any animal cell including human, normal or transformed, any normal or transformed microorganism, and in general any tissue comprising such cells.
  • the antibodies according to the invention can thus make it possible to evaluate the cellular localization, the level of expression or the activity of the proteins MSP1 and MSPl -m, which can be an important indication for the detection of dominant optical atrophy OP At 1.
  • the subject of the invention is also a method for detecting the GTPase activity of MSP1 or of MSP1 -m in a biological sample, comprising the steps consisting in:
  • GTP substrate guanosine triphosphate
  • the biological samples liable to be thus tested are in particular extracts from human blood cells, or other tissue extracts.
  • a biological sample can also consist of normal cells or cells transformed by a vector according to the invention, in which the GTPase activity due to MSPl or MSPl -m must be measured.
  • the measurement of GTPase activity on such cells in the presence of different biological or pharmacological compounds makes it possible to demonstrate the possible inhibitory or activating nature of said compounds.
  • the present invention also relates to a method for screening for compounds capable of modulating the activity of MSPl or MSPl-m, during which said compounds are brought into contact with said polypeptides MSPl or MSPl -m and the level of modification of the GTPase activity of these polypeptides.
  • modulation of activity is meant stimulation or inhibition to varying degrees including variations just noticeable by means available to those skilled in the art, up to significant variations which may go as far as the total disappearance of the activity.
  • the modulating compounds obtained are in principle good candidates as active ingredient of a medicament in association with an acceptable pharmaceutical carrier.
  • the subject of the invention is also a method for screening proteins capable of possessing pharmacological activity, consisting in testing the affinity and / or the action of said molecules on a polypeptide according to the invention.
  • Another object of the invention is a method of screening for molecules capable of possessing pharmacological activity, consisting in testing the affinity and / or the action of said molecules on a cell transformed according to the invention.
  • the MSP1 polypeptide according to the invention may be particularly useful for the manufacture of a medicament intended for treating disorders affecting the structure of the mitochondrial network.
  • a medicament can be used in the treatment of neurodegenerative diseases, in particular optic neuropathies and preferably OPAl.
  • the MSP1-m polypeptides according to the invention could also be used for the development of an anti-proliferative treatment useful for treating dysfunctions of cell division, such as cancer.
  • plasmid vector according to the invention carrying any coding sequence for MSPl or MSPl-m can be used for the development of a treatment for dominant optical atrophy by gene therapy.
  • Figure 5 Production of the protein MSP1 in Schizosaccharomyces pombe yeasts and assay of its GTPase activity in the presence or in the absence of compounds A and B tested for their possible activity.
  • the samples are as follows:
  • Fig ⁇ (A-1) on cells transfected with the plasmid pCDNA-MSPl-Ha-6his using anti-Haemagglutinin antibodies,
  • FIG. 6 (A-2) on cells transfected with the plasmid pCDNA-MSPl-Ha-6his using the anti-hsp60-LK2 antibody, specific for a mitochondrial protein,
  • Fig 6 (B-2) on non-transfected cells using the same LK2 antibodies as Fig 6 (A-2).
  • the 4 samples were prepared according to the same procedure.
  • the localization of MSP1 is visualized on the photographs A1 and Bl.
  • the mitochondrial network is revealed on photos A-2 and B-2.
  • a protein encoded by a 2880 bp segment was selected from the KIAA0567 cDNA fragment. It consists of 960 amino acids (SEQ ID N ° 1). The study of its primary structure shows that the protein has a very basic amino-terminal domain (acids amino acids 1 to 120), a first assembly domain (amino acids 121 to 259), a catalytic domain GTPase (amino acids 260 to 505), a central domain of dynamin type (amino acids 505 to 787), and a second domain assembly in the carboxy-terminal zone. These characteristic areas are also found in the yeast dynamins Mspl and MGM1.
  • the MSPl / OPAl gene has a size greater than 69kb and is composed of at least 29 exons with intron-exon links according to the AG-GT rule. It codes for a messenger RNA whose complete coding sequence is presented in the form of complementary DNA and described by SEQ ID No. 2.
  • the MSP1 / OPAl gene has been located by fluorescent in situ hybridization (FISH) using the methods conventional with complete cDNA as probe including the open reading frame of the MSP1 protein and the 3 'untranslated end. The results clearly show a unique double labeling in the 3q28-29 region ( Figure 2).
  • RNAs were extracted from 11 types of tissues or cells: leukocytes, retina, thyroid, kidney, lung, ovary, skeletal muscle, liver, heart, colon, fetal brain, by Stratagene (La Jolla, USA).
  • the leukocytes were isolated from 20 ml of blood with heparin additives.
  • Total RNA was extracted using the AGPC method in one step (Chomczynski P. and Sacchi N., 1987, Anal
  • the conditions for implementing the PCR are 94 ° C for 3 min, then 35 cycles of 94 ° C for 30 s, 66 ° C for 30 s and 72 ° C for 1 min, then 72 ° C for 10 min.
  • the 8 transcripts are expressed in the 11 types of tissues tested, with some variations in the level of expression.
  • the cDNA sequences corresponding to the 7 additional isoform mRNAs and the sequences of the 7 isoform MSP1-X polypeptides which are derived therefrom are represented by:
  • MSPl / OPAl a candidate gene for dominant OPA1 optical atrophy.
  • Several hereditary diseases are associated with this region of chromosome 3, however, no characteristic karyotypic anomaly has been described to date.
  • the sequencing of the MSP1 / OPAl gene from purified DNA was carried out on the blood cells of people with dominant optical atrophy. It made it possible to establish in an unexpected way, that the patients reached with OPAl carried a mutation of the MSPl / OPAl gene.
  • a first splicing mutation concerns the last nucleotide of intron 9, suppressing the site of intron excision (IVS9-1G> A). This mutation has the effect of not recognizing the start of exon 10 and of jumping directly to exon 11 without shifting the reading frame, which induces a deletion of 27 amino acids in the protein in the GTPase domain. .
  • a mutation corresponding to a 4 base pair deletion concerns the AGTT bases at position 2823 of the cDNA (c.2823delAGTT), which results in the replacement of the last 19 amino acids of the terminal carboxy part of the protein by 24 new amino acids with the following sequence:
  • EKFKKNLMLSLKLFIRRNKLKSYS NH2-COOH In exon 8 a 4 bp deletion was found: c.794delTTGA. It causes a change of 41 amino acids from codon 265 to codon 305 and a premature stop at codon 306, ie the loss of 68.23% of the protein on the C-terminal side including the major part of the GTPase domain.
  • a first mutation is located in exon 9 which is part of the catalytic domain
  • the base G, at position 899 of the cDNA is replaced by A (c.899G> A), which leads to the replacement of the glycine by glutamic acid at position 300 in the corresponding protein MSP1.
  • the glycine at position 300 corresponds to a conserved motif of the GTPase catalytic domain of dynamins.
  • Arg290Gln in exon 8 has been described by Alexander (Alexander C. et al, 2000, Nature Genêt, 26, pp. 211-215). The other two are Gln785Arg in exon 23 and Leu939Pro in exon 27.
  • the reading phase of MSP1 was obtained by purification of the total RNA (QIAGEN kit) taken from blood cells in healthy subjects.
  • a reverse transcriptase reaction was obtained by purification of the total RNA (QIAGEN kit) taken from blood cells in healthy subjects.
  • the 1-3 'MSP primer sequence is:
  • the sequence of the 1-5 'MSP primer is: 5' -CTCCCCTCGAG-CATATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCT-3 '
  • the DNA fragment obtained after amplification by PCR of MSP1 and the plasmid pBlueScript were digested with the restriction enzymes Xhol and BamHI (NEB), purified on agarose gel and then ligated for 12 hours.
  • the ligation products are transformed into E. coli DH5 (supE44 hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl).
  • the pBS-MSP1 clones thus obtained are analyzed by restriction profile of the purified plasmid DNA according to the MiniPrep protocol (Qiagen). For.
  • Buffer containing 50 mM Tris pH7.4, 250 mM NaCl, 50 mM sodium fluoride, 5 mM EDTA, O, l mM sodium orthovanadate, 1 mM difhiotreitol (DTT), 0.1% solution Triton XI 00, 1 microgr / ml of PMSF, 10 microgr / ml of leupeptin and 10 microgr / ml of soybean trypsin inhibitor. Then, the product of the transcription-translation reaction obtained is separated into two fractions: 1/5 of the reaction volume is kept to serve as a control, while the remaining 4 / 5ths are taken up and 5 microl of antibodies are added.
  • EXAMPLE 8 Production of MSP1 in the E. coli bacterium and purification on an affinity column.
  • This example concerns the protein MSP1, labeled Haemagglutinin (Ha) + 6 histidines, produced in the E. coli bacterium and purified on a nickel affinity column.
  • the sequence of the MSP primer 1-3 'bis is:
  • the primer sequence MSP1-PST1 is: 5 '-CAGCAATGGGATGCAGCTAT-3'
  • the amplified fragment was digested with the enzymes Pstl and BamHl (NEB) and subcloned into the plasmid pBS also digested with Pstl and BamHI. After verification of the sequence, a DNA fragment coding for 2 copies of the Haemagglutinin epitope associated with 6 copies of histidine (McGowan and Russel, 1993, EMBO Journal, vol 12, pp.
  • the cells are then recovered by centrifugation and lysed in the following buffer: 50 mM Na2HPO4 pH8, 10 mM Tris pH8, 250 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.1 mM NaVn ⁇ 4, 5 mM PMSF, 0.05% 2-mercaptoethanpl, 0.1% Tween 20, 10 mg / ml lysozyme, 1 mg / ml DNAse (Sigma), for 1 hour at 3 ° C.
  • the reaction mixture is then centrifuged at 15000 g for 5 minutes.
  • the supernatant is mixed with nickel beads (Ni-NTA,
  • the reading phase coding for the protein MSP1 was cloned from the plasmid pBS-
  • MSP1 as described in Example 6 in the vector pREP1 (K. Maundrell, J. Biol. Chem., 1990, 265, pp. 10857-64) between the NdeI and BamHI sites.
  • This vector contains the nmtl promoter inducible by the absence of thiamine.
  • the plasmid pREPl-MSP1 thus obtained is introduced into the wild strain T199 (leul-32, ura4-dl 8, h-) of the yeast Schizosaccharomyces pombe by electroporation, and the cells containing the plasmid are selected on medium without leucine: EMMA ( BIO101), uracyl 4 mg / ml, thiamine 20 microM. After liquid culture and induction of the nmtf promoter for 24 hours by
  • GTPase is measured by the following protocol: the immunoprecipitates are taken up in the medium following buffer: 20 mM Tris pH7.9, 4 mM MgC12, 50 microg / ml BSA, 1 mM DTT (Sigma), 50 microM GTP and added with 1 microCurie of GTP alpha 32P (Amersham) per sample. This mixture is incubated for 2 hours at 30 ° C then the reaction is stopped by adding 2 microl of 0.5M EDTA. The samples migrate 2 to 3 hours on a PEI plate (Sigma) immersed in 50 ml of 0.5M LiCl solution and 1M formic acid in a sealed migration tank.
  • buffer 20 mM Tris pH7.9, 4 mM MgC12, 50 microg / ml BSA, 1 mM DTT (Sigma), 50 microM GTP and added with 1 microCurie of GTP alpha 32P (Amersham) per sample. This mixture is incubated for 2 hours
  • This example relates to the protein MSP1 labeled Haemagglutinin (Ha) expressed ectopically in HeLa cells. From the plasmid pBS-MSP 1 -Ha-6his as described in Example 8, the fragment coding for MSPl-Ha-6his was introduced into the plasmid pCDNA between the Kpnl and BamHI sites.
  • Ha Haemagglutinin
  • the plasmid pCDNA-MSPl-Ha-6his was transfected into HeLa cells, according to the procedure described by the manufacturer (ExGen-500, Euromedex), and the cells incubated for 24 hours in DMEM medium (Dulbecco Mpdified Eagle Medium , Gibco- BRL) supplemented with glucose 4 mg / 1, sodium pyruvate 4 mM, glutamine 4 mM (Seromed), penicillin 100 U / ml (Seromed), streptomycin 100 microg / ml (Seromed) and fetal calf serum at 10 % (Eurobio).
  • DMEM medium Dulbecco Mpdified Eagle Medium , Gibco- BRL
  • the specific detection of the protein MSP1-Ha-6his was carried out using the primary anti-Ha 12CA5 mouse antibodies (Boehringer) and the secondary anti-mouse antibody Alexa 594 (Molecular Probes), by the immuno-protocol. following fluorescence: the cells were fixed in a 3.7% formaldehyde solution for 20 minutes at 4 ° C, permeabilized by a 100% methanol treatment at -20 ° C for 10 minutes, then treated for 5 minutes with Triton XI 00 to 0.25% in PBS buffer (Phosphate Buffer Saline).
  • the samples thus obtained are incubated for 2 hours in the presence of anti-Ha 12CA5 antibodies diluted to 1/700 in PBS buffer supplemented with 1% bovine serum albumin (BSA) at 37 ° C., then with the secondary antibody Alexa 594 diluted to l / 500th band of PBS buffer supplemented with BSA (Bovine Serum Albumin) at 1%.
  • BSA bovine serum albumin
  • the cells are observed under a fluorescence microscope (Leitz), the fluorescence corresponding specifically to the expression of the protein MSP1-Ha-6his ( Figure 6A-1).
  • this ectopically produced protein corresponds perfectly to that observed for non-transfected HeLa cells, using the antibody specific for the protein MSP1 (FIG. 6B-1) and to the localization obtained by using antibodies directed against proteins specific for human mitochondria other than MSP1, such as for example the anti-hsp60-LK2 antibody (Sigma). (See Figures 6A-2 and 6B-2).

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Abstract

La présente invention a pour objet une protéine humaine appartenant à la famille des dynamines, appelée MSP1, et ses 7 isoformes MSP1-X, dont les mutations sont en particulier responsables de l'atrophie optique dominante. La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques codant ladite protéine, ses isoformes et leurs formes mutées, les vecteurs capables d'exprimer ladite protéine et ses isoformes ou leurs formes mutées, dans tout type de cellules hôtes, ainsi que les cellules transformées par lesdits vecteurs et les procédés les utilisant. L'invention a enfin pour objet des procédés d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine et de ses isoformes selon l'invention et l'utilisation desdits composés pour la recherche et la fabrication de substances actives utiles en thérapie, en particulier pour la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante.

Description

DYNAMINE MITOCHONDRIALE HUMAINE MSP1,
SES ISOFORMES MSPl-X,
ET LEUR UTILISATION EN THÉRAPEUTIQUE
La présente invention a pour objet une nouvelle protéine de la famille des dynamines, appelée MSP1, et ses 7 isoformes MSPl-X. Sont également revendiqués les ADNs codant ces protéines et leurs formes mutées, ainsi que l'utilisation de ces protéines pour la recherche et la fabrication de substances actives, utiles pour le traitement de maladies neurodégénératives.
De nombreuses dynamines primaires et protéines apparentées ont été identifiées durant ces dernières années chez les eucaryotes. Il semble établi que ces protéines ont de nombreux représentants dans tous les organismes, de la levure à l'homme, et qu'elles sont localisées à différents sites cellulaires où elles remplissent des fonctions bien particulières (van derBliek A.M., 1999, Trends Cell Biol, 9, pp. 96-102). Toutes sont de grandes GTPases (80 à 100 kDa), possédant outre le domaine catalytique GTPase, un domaine central caractéristique des dynamines et un ou deux domaines d'assemblage (domaines coiled-coil). Certaines dynamines comme Mspl/MGMl, se distinguent en outre par la présence d'un domaine amino-terminal fortement basique.
On peut classer les dynamines en trois groupes, selon les fonctions qui ont pu leur être attribuées et/ou selon leur similitude structurale. Dans le premier groupe (famille des dynamines conventionnelles) on trouve les dynamines 1 et 2 des mammifères, la dynamine
Vpslp de la levure bourgeonnante (Nothwehr S.F. et al, 1995, J. Cell Biol, 129, pp. 35-46;
Rothman J.H. et al, 1990, Cell, 61, pp. 1063-74), la dynamine dyn-1 du nématode C. elegans (Clark S. G. et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 10438-43). Ces protéines sont décrites comme jouant un rôle dans la formation des vésicules et le transport.
Le second groupe (famille Dnml, Drpl) comprend les dynamines Dnmlp de la levure à bourgeons, DRP-1 de' C. elegans et la Drpl des mammifères (Imoto M. et al, 1998, J. Cell Sci., 111, pp. 1341-49; Kamimoto T., 1998, J. Biol. Chem., 273, pp. 1044-51; Yoon Y. et al, 1998, J. Cell Biol, 140, pp. 779-93). Ce sont des protéines cytoplasmiques dont les fonctions sont impliquées dans le trafic vésiculaire et dans le contrôle de la distribution des mitochondries.
Le troisième groupe (famille Mspl/MGMl) est formé uniquement des protéines MGM1 et Mspl qui ont été isolées dans deux levures divergentes, respectivement Saccharomyces cerevisiae (Jones B. and Fangman W., 1992, Gènes and Dev., 6, pp. 380-389) et Schi∑osaccharomyces pombe (Pelloquin L. et al, 1998, Biochem. Biophys. Res. Comun. 251, pp. 720-726; Pelloquin L. ét al, 1999, J. Cell Sci., 112, pp. 4151-61). MGM1 et Mspl sont des dynamines mitochondriales indispensables au maintien de l'ADN mitochondrial et à l'organisation du réseau mitochondrial.
Chez l'homme, seulement deux familles de dynamines ont été décrites. Celle des dynamines conventionnelles, DY 1 et DYN2 impliquées dans les processus d'endocytose, et celle de la famille Drpl impliquée dans la voie sécrétrice (Imoto M. et al, 1998, J. Cell Sci., 111, pp. 1341-49) et dans la maintenance du réseau mitochondrial (Smirnova E. et al, 1998, J. Cell Biol, 143, pp. 351-8).
La présente invention a pour objet une nouvelle dynamine mitochondriale humaine appelée MSP1, orthologue à Mspl et MGM1 des levures, présentant plusieurs isoformes issues de l'épissage alternatif du gène codant, ainsi que les séquences d'ADNc issues d'épissages alternatifs codant pour ladite dynamine MSP1 et ses isoformes. De manière inattendue, il a été trouvé que des formes mutées de MSP1 sont impliquées dans une pathologie humaine d'origine génétique, à savoir l'atrophie optique dominante.
L'atrophie optique dominante, notée OPA1 selon la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, entrée 165500) est la plus fréquente des neuropathies optiques héréditaires non syndromiques. Elle se manifeste chez un individu sur 50 000 et conduit dans de nombreux cas à la cécité légale (acuité visuelle inférieure à l/20ème). Cette maladie progressive et irréversible est caractérisée par une perte de l'acuité visuelle dès la jeune enfance, une anomalie du sens visuel chromatique (dyschromatopsie) acquise et une lacune de perception dans le champ visuel se projetant à la fois sur le point de fixation et sur la tâche aveugle (scotome centrocoecal) avec maintien du champ visuel périphérique (Kjer P., 1959,
Acta Ophthalmol. Scand., 37, suppl. 54, pp. 1-146). Malgré le fait que les études cytologiques ont mis en évidence chez tous les cas pathologiques la disparition des cellules ganglionnaires de la rétine, les variations phénotypiques sont importantes d'un malade à l'autre. Des études ont été menées pour décrire les manifestations physiologiques de la maladie et comprendre son développement (Brown J. et al, 1997, Arch. Ophthalmol, 115, pp. 95-99). Malheureusement, seuls les symptômes cliniques en sont connus et les mécanismes biochimiques et cellulaires de l'OPAl n'ont pu à ce jour être mis en évidence. En particulier rien n'est connu du gène ou de la protéine responsable de la dégénérescence cellulaire, ni de leur structure, ni de leur fonction, ou de leur mode d'action. Aucun traitement des symptômes de la maladie n'a pu être mis au point jusqu'à présent.
Une démarche pour élucider les mécanismes responsables de cette" maladie génétique et y porter remède est d'en rechercher les origines génétiques. Par analogie avec la Neuropathie Optique Héréditaire de Leber (LHON.) dont les symptômes sont comparables à ceux de l'OPAl, l'hypothèse d'une implication des mitochondries a été formulée. Des travaux ont montré que dans le cas de la pathologie LHON, des mutations particulières de l'ADN mitochondrial pouvaient provoquer la dégénérescence du nerf optique (Howell N, 1997, J. Bioenerg. Biomembr., 29, pp. 165-173). Dans le cas de l'OPAl, la région 3q28-q29 du chromosome 3 a été proposée pour porter le locus responsable de cette pathologie (Lunkes A. et al, 1995, Am. J. Hum. Genêt, 57, pp. 968-970).
Partant de cette hypothèse, l'équipe de U.E.A. Pesch a tenté de déterminer la structure d'un gène candidat pour l'OPAl (Pesch U.E.A. et al, 1999, American Journal of Human Genetics, 65-4, pp. A378 XP000993287). Le fragment d'ADNc KIAA0567, susceptible de coder de grosses protéines in vitro et supposé correspondre à des gènes de fonction inconnue de la région 3q28-q29 du chromosome 3, disponible sur la base de données DATA EMBL en ligne (Nagase T. et al., 1998, DNA res., 5, pp. 31-39) a été étudié. 16 liaisons introns/exons ont été identifiées, mais sans réussir à établir la séquence complète du gène. Ainsi la structure génique impliquée dans l'OPAl n'est pas décrite et aucune protéine ne lui est associée, ce qui rend impossible de prédire une quelconque activité fonctionnelle, et à plus forte raison une implication dans une pathologie déterminée.
En fin de compte, jusqu'à présent le gène impliqué dans l'atrophie optique dominante n'a pas été identifié. La présente invention montre que des séquences d'ADN correspondant au gène MSP1/OPA1 portent des mutations qui sont à l'origine de l'atrophie optique dominante. Ces mutations sont décrites ainsi que les protéines correspondantes. Au total, ce sont 14 mutations affectant l'activité des 8 isoformes de la dynamine MSP1 qui ont été identifiées.
Ainsi, aucune hypothèse de travail ne permettait jusqu'à présent d'incriminer une protéine particulière comme étant responsable de l'apparition des symptômes de l'OPAl . De même, aucune pathologie n'avait à ce jour été associée à un dysfonctionnement lié à une dynamine. De manière inattendue, la présente invention a su établir une relation directe entre une rétinopathie et la dynamine mitochondriale MSPl. Il devient de ce fait possible de disposer d'outils biochimiques. et génétiques utiles à la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante.
DESCRIPTION:
La présente invention a pour objet une protéine humaine appartenant à la famille des dynamines et comprenant plusieurs isoformes, les formes mutées de ladite protéine ainsi que les séquences nucléotidiques codant ladite protéine, y compris ses isoformes et ses mutants. L'invention concerne également les vecteurs capables d'exprimer ladite protéine et/ou ses isoformes et/ou ses formes mutées, dans tout type de cellules hôtes, ainsi que les cellules transformées par lesdits vecteurs et les procédés les utilisant. Enfin l'invention a pour objet des procédés d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine selon l'invention, de ses isoformes et de ses mutants, et l'utilisation desdits composés à des fins thérapeutiques.
La présente invention a pour objet un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N°l, une séquence homologue de ladite SEQ ID N°l, un fragment biologiquement actif de ladite SEQ ID N°l ou de ses séquences homologues, ledit polypeptide étant désigné par MSPl. La séquence SEQ ID N°l est la séquence d'acides aminés de la dynamine MSPl identifiée chez l'humain. C'est une protéine ubiquitaire dotée d'une activité GTPase en relation avec le fonctionnement mitochondrial et la division cellulaire.
Par polypeptide homologue, on entend tout polypeptide résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID N°l, c'est-à dire mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'au moins un acide aminé. Lesdits polypeptides homologues présentent préférentiellement une homologie de séquence supérieure à 80%, avec la séquence SEQ ID N°l complète.
Les polypeptides homologues ou les fragments polypeptidiques de la séquence SEQ ID N°l selon l'invention présentent des propriétés biologiques identiques ou analogues aux propriétés biologiques du polypeptide de séquence SEQ ID N°l .
Constituent aussi un objet de la présente invention les polypeptides isoformes du polypeptide MSPl, de désignation générale MSPl-X. Les polypeptides iso formes entre eux sont les polypeptides qui résultent de la transcription d'une séquence nucléique portée par un gène unique mais dont les séquences codantes (exons) sont retenues et combinées de manière différente par le jeu d'épissages alternatifs de la séquence transcrite. Les polypeptides isoformes MSPl-X selon l'invention sont également des dynamines ayant une activité catalytique GTPase.
En particulier, sont revendiqués les polypeptides isoformes dont la séquence d'acides aminés est représentée respectivement par SE< ) ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID N°8, SEQ ID N°9. Sont également revendiquées les séquences homologues desdites SEQ ID N°3 à 9, les fragments biologiquement actifs desdites SEQ ID N°3 à 9 et de leurs séquences homologues.
Les 7 protéines isoformes décrites par les séquences SEQ ID N°3 à 9 ci-dessus sont désignées respectivement MSP1-B, MSP1-C, MSP1-D, MSP1-E, MSP1-F MSP1-G, et
MSP1-H, le 8ème isoforme MSP1-A étant la forme dominante c'est-à-dire MSPl. Les 7+1 dynamines MSPl-X isoformes sont codées à partir de 8 ARNm matures résultant d'épissages alternatifs de 3 exons du gène MSP1/OPA1, à savoir l'exon 4, l'exon 4b et l'exon 5b. La description détaillée de ces variants d'épissage est présentée dans l'exemple N°4_
La présente invention a également pour objet un polypeptide homologue d'un polypeptide MSPl ou MSPl-X et s'en distinguant par le fait qu'il porte une ou plusieurs mutations induisant une modification, voire une perte totale, de l'activité biologique dudit polypeptide MSP 1 ou MSP 1 -X. Les formes mutées de MSP 1 et de MSP 1 -X sont désignées MSP 1 -m et
MSPl-X-m, respectivement. Ces polypeptides mutés peuvent être responsables de troubles associés au dysfonctionnement mitochondrial et aux troubles de la division cellulaire. Ils sont en particulier impliqués dans des maladies neurodégénératives telles que les neuropathies optiques et tout particulièrement l'atrophie optique dominante OPA1.
La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence choisie parmi a)- SEQ ID Sf°2, une séquence homologue de ladite SEQ ID N°2, un fragment de ladite SEQ ID N°2, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSPl selon l'invention; b)- SEQ ID N°10, SEQ ID N°l 1, SEQ ID N°12, SEQ ID N°-13, SEQ ID N°14, SEQ
ID N°15, SEQ ID N°16, une séquence homologue de l'une desdites SEQ ID N°10 à 16, un fragment de l'une desdites SEQ ID N°10 à 16, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSPl-X selon l'invention; et c)- les séquences complémentaires desdites séquences nucléotidiques.
La séquence SEQ ID N°2 est la séquence d'ADNc (ADN complémentaire) comprenant la phase codante, ou phase de lecture, correspondant à la protéine MSPl identifiée chez l'humain. Les séquences SEQ ID N°10, SEQ ID N°l l, SEQ ID N°12, SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16 sont les séquences d'ADNc comprenant respectivement la phase codante correspondant aux protéines MSPl-X identifiées chez l'humain.
Les séquences d'ADNc représentées par SEQ ID N°2 et SEQ ID N°10 à 16 ci-dessus sont donc les séquences images des séquences isoformes d'ARNm codant directement les protéines MSPl et MSPL.-X. Lesdites séquences isoformes d'ARNm résultent de la transcription d'une séquence d'ADN issue d'un gène unique mais dont les séquences codantes sont retenues et combinées de manière différente par le jeu d'épissages alternatifs de la séquence transcrite.
Par séquence nucléotidique "homologue", on entend toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide homologue de MSPl ou MSPl-X tel que défini précédemment, c'est-à- dire une séquence résultant d'une modification de la séquence SEQ ID N°2 ou des séquences SEQ ID N°10 à 16, notamment par mutation, délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide. Sont en particulier comprises les séquences déduites de la séquence SEQ ID N°2 ou des séquences SEQ ID N°10 à 16, par dégénérescence du code génétique. Une telle séquence homologue présente préférentiellement une homologie supérieure à 70% avec les séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°10 à 216, respectivement.
La séquence nucléotidique selon l'invention comprend entre autres les séquences homologues de SEQ ID N°2 portant une mutation qui affecte l'activité biologique du polypeptide MSP 1 et qui code pour la séquence d' acides aminés d'un polypeptide MSP 1 -m selon l'invention.
De manière analogue, la séquence nucléotidique selon l'invention comprend entre autres les séquences homologues des séquences représentées par SEQ ID N°10 à 16, portant une mutation qui affecte l'activité biologique du polypeptide MSPl-X et qui code pour la séquence d'acides aminés d'un polypeptide MSPl-X-m selon l'invention. Des mutations MSPl -m et MSPl-X-m sont décrites dans l'exemple N°6.
Dans la suite de la description, et sauf indication contraire, le terme "MSPl" désigne indifféremment les 8 dynamines isoformes MSPl et MSPl-X selon l'invention. De même, le terme "MSP 1 -m" désignera indifféremment MSP 1 -m et MSP 1 -X-m.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour la production d'une protéine ou d'un fragment de', protéine recombinante MSPl ou MSPl -m selon l'invention, selon les techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier.
Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'invention concerne les vecteurs de clonage et d'expression contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, et les cellules hôtes transfectées (ou transformées) par ces vecteurs.
Le vecteur peut comporter un promoteur, et des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription et de la traduction. Il peut comprendre un ou plusieurs marqueurs de sélection selon les besoins. Il peut être intégré dans la cellule et éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs de réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou dans des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être intégrés dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple Pélectroporation.
De tels vecteurs d'intérêt sont par exemple les plasmides des familles pBlueScript, pREPl, pCDNA ou pRK171. Ces vecteurs peuvent être utilisés tels quels directement pour la synthèse in vitro du polypeptide selon l'invention ou introduits dans une cellule hôte.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, dont les levures, les bactéries, les cellules de mammifères telles que les cellules HeLa humaines. Ces cellules transformées peuvent être obtenues par la transfection d'une" séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Un mode de réalisation de la présente invention consiste en un procédé de fabrication dudit polypeptide, caractérisé en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. En particulier, il est utile de pouvoir détecter et produire de manière ectopique un polypeptide selon l'invention.
L'association de la phase codante du polypeptide selon l'invention avec la phase codante d'une protéine étiquette permet d'exprimer dans un hôte adapté une protéine chimère composée du polypeptide selon l'invention et de ladite protéine étiquette. Une fonction de ladite protéine étiquette peut être sa reconnaissance par des anticorps spécifiques. La présence de la protéine étiquette est alors le signe de la présence du polypeptide d'intérêt. Une telle étiquette est qualifiée d'étiquette antigénique.
La présente invention a donc pour objet un procédé permettant de détecter le polypeptide MSPl ou MSPl -m consistant à:
- associer la phase codante du polypeptide MSPl ou MSPl -m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette antigénique dans une cellule hôte; - exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi;
- mettre en contact ledit hôte avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ladite étiquette;
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSPl ou MSPl -m.
Une telle étiquette antigénique est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un anticorps spécifique et détectable de ladite protéine. Elle peut être par exemple la protéine verte fluorescente (Green Fluorescent Protein), l'épitope Myc, l'épitope Haemagglutinine. La cellule hôte peut être n'importe quelle cellule hôte selon l'invention. L'anticorps associé à la protéine chimère obtenue par le procédé selon l'invention peut être détectée par tout moyen à la disposition de l'homme de l'art.
Il est également intéressant de produire la protéine d'intérêt pure et dans des quantités utilisables industriellement, c'est-à-dire de l'ordre du mg. Dans ce cas on peut utiliser une protéine étiquette dont la fonction est de permettre la fixation spécifique de la protéine chimère étiquette+polypeptide sur un support ayant une affinité spécifique de l'étiquette choisie. Une telle étiquette est alors qualifiée d'étiquette d'affinité.
La présente invention a donc aussi pour objet un procédé permettant de purifier le polypeptide MSP 1 ou MSP 1 -m consistant à:
- associer la phase codante du polypeptide MSPl ou MSPl -m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette choisi pour son affinité à un support,
- exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi, - obtenir un extrait par lyse de l'hôte,
- mettre en contact l'extrait avec le support choisi,
- récupérer le polypeptide selon l'invention par élution.
Une étiquette d'affinité est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un support ayant une affinité spécifique avec ladite protéine. Elle peut être par exemple, la Glutathion S-transférase, la protéine liante du maltose (Maltose Binding Protein), des polymères d'histidines. Le support d'affinité spécifique peut être par exemple constitué de microbilles d'un métal tel que le nickel fixant les hexamères d'histidine.
Les procédés utilisant une étiquette antigénique et une étiquette d'affinité peuvent bien entendu être combinés. Il suffit pour cela d'associer à la phase codante de la protéine d'intérêt la phase codante d'une étiquette antigénique et la phase codante d'une étiquette d'affinité. Les procédés seront mis en œuvre successivement, comme décrit précédemment pour détecter et/ou purifier la protéine d'intérêt.
L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, obtenus à partir d'un polypeptide selon l'invention administré à un animal, et capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention. L'invention a en outre pour objet l'utilisation de ces anticorps pour la purification ou la détection d'un polypeptide MSPl ou MSPl -m dans un échantillon biologique.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomès décrite par Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, pp. 495-497). Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, ou également se présenter sous la forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement utiles pour détecter la présence de MSPl ou de MSPl -m. La présente invention a donc pour objet un procédé de détection immunologique de MSPl ou MSPl -m dans un échantillon biologique comprenant les étapes consistant à :
- mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps selon l'invention, détectable;
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSPl ou MSPl -m.
Par "anticorps détectable", on entend soit un anticorps marqué par un groupement détectable, tel que par exemple un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, soit un anticorps auquel se lie un autre anticorps lui-même marqué de manière détectable. Par échantillon biologique on entend toute cellule animale y compris humaine, normale ou transformée, tout micro-organisme normal ou transformé, et de manière générale tout tissus comprenant de telles cellules.
Les anticorps selon l'invention peuvent ainsi permettre d'évaluer la localisation cellulaire, le niveau d'expression ou l'activité des protéines MSPl et MSPl -m, ce qui peut être une indication importante pour la détection de 1 ' atrophie optique dominante OP A 1.
L'invention a également pour objet un procédé de détection de l'activité GTPase de MSPl ou de MSPl -m dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à:
- mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps détectable selon l'invention - purifier le complexe anticorps-antigène,
- mettre ce complexe en présence de substrat GTP (guanosine triphosphate),
- doser le GDP (guanosine diphosphate) formé, indicateur de l'activité GTPase de MSPl ou MSPl -m.
Les échantillons biologiques susceptibles d'être ainsi testés sont notamment des extraits de cellules sanguines humaines, ou d'autres extraits tissulaires. Un échantillon biologique peut aussi être constitué de cellules normales ou transformées par un vecteur selon l'invention, dans lesquelles l'activité GTPase due à MSPl ou MSPl -m doit être mesurée. La mesure de l'activité GTPase sur de telles cellules en présence de différents composés biologiques ou pharmacologiques permet de mettre en évidence l'éventuel caractère inhibiteur ou activateur desdits composés.
La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés susceptibles de moduler l'activité de MSPl ou de MSPl-m, au cours duquel on met en contact lesdits composés avec lesdits polypeptides MSPl ou MSPl -m et l'on évalue le taux de modification de l'activité GTPase de ces polypeptides. Par "modulation" de l'activité, on entend stimulation ou inhibition à des degrés variés incluant les variations juste perceptibles par les moyens à la disposition de l'homme de l'art, jusqu'à des variations importantes pouvant aller jusqu'à la disparition totale de l'activité. On peut en particulier rechercher par ledit procédé des molécules ayant un effet stimulateur de l'activité de MSPl, ou des molécules ayant une action inhibitrice de l'activité de MSPl -m, ou inversement. Les composés modulateurs obtenus sont en principe de bons candidats en tant que principe actif d'un médicament en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé de criblage de protéines susceptibles de posséder une activité pharmacologiquè, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur un polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologiquè, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule transformée selon l'invention.
Le polypeptide MSPl selon l'invention peut être particulièrement utile pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles affectant la structure du réseau mitochondrial. Un tel médicament peut être employé dans le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier les neuropathies optiques et préférentiellement l'OPAl. Les polypeptides MSP1- m selon l'invention pourraient aussi servir à la mise au point d'un traitement anti-prolifératif utile pour soigner les dysfonctionnement de la division cellulaire, tels que le cancer.
Enfin, un vecteur plasmidique selon l'invention portant toute séquence codante pour MSPl ou MSPl-m peut être utilisé pour la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante par thérapie génique.
LISTE DES FIGURES
Figure 1:
Fig 1(A): Organisation et comparaison de la structure primaire de MSPl avec celle des protéines Mspl et MGM1 des levures Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces c OeCre -vUisi1UaeC..
Fig 1(B): Pourcentage d'identité entre les autres représentants de cette famille de dynamines. Figure 2:
Localisation chromosomique du gène MSPl/OPAl par hybridation fluorescence in situ
(FISH) montrant le double marquage unique de la région 3q28-29.
Figure 3:
Séparation sur gel SDS-PAGE et exposition sur film radiosensible.
- échantillon IVT: transcription et traduction in vitro de la protéine MSPl;
- échantillon P: immuno-précipitation de la protéine par des anticorps spécifiques.
Figure 4:
Production de la protéine MSPl étiquetée Ha-6his dans la bactérie E. coli (EX: extrait total) et purification sur colonne de nickel (EL: éluat de la colonne de nickel).
Figure 5: Production de la protéine MSPl dans les levures Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité GTPase en présence ou en l'absence de composés A et B testés pour leur activité éventuelle. Les échantillons sont les suivants:
- Tem: immuno-précipité de MSPl réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSPl dosé seul, . +A: immuno-précipité de MSPl réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSPl dosé en présence du produit A,
- +B: immuno-précipité de MSPl réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant MSPl dosé en présence du produit B,
- Çon: immuno-précipité réalisé sur une souche de S. pombe ne produisant pas MSPl .
Figure 6:
Localisation cellulaire de la protéine MSPl dans des cellules HeLa.
Fig β(A-l): sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his en utilisant des anticorps anti-Haemagglutinine,
Fig β(B-l): sur des cellules non transfectées en utilisant des anticorps spécifiques de MSPl,
Fig 6(A-2): sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his en utilisant l'anticorps anti-hsp60- LK2, spécifique d'une protéine mitochondriale,
Fig 6(B-2): sur des cellules non transfectées en utilisant les mêmes anticorps LK2 que Fig 6(A-2). Les 4 échantillons ont été préparés selon le même mode opératoire. La localisation de MSPl est visualisée sur les clichés A-l et B-l . Le réseau mitochondrial est révélé sur les clichés A- 2 et B-2.
EXEMPLES
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Ils montrent qu'il est possible de synthétiser une protéine selon l'invention in vitro, comme in vivo dans tous les organismes modèles classiques, et de purifier, doser ou localiser ladite protéine, ses isoformes, ou leurs mutants.
EXEMPLE 1:
Identification des séquences nucléotidiques et protéiques.
La recherche d'un orthologue humain des dynamines Mspl/MGMl a été réalisée dans la banque de données GENBANK. Nous avons sélectionné une séquence d'ADNc d'une longueur de 5 821 pb (fragment N° KIAA0567, code d'accès ABOI 1139, Nagase T. et al,
1998, DNA res., 5, pp. 31-39) dont le fragment compris entre le nucléotide 56 et 2935 code pour une protéine de 960 acides arninés ayant 19 % d'identité avec Mspl et 17 % d'identité avec MGM1. Ceci représente une homologie significative étant donné que le degré d'identité avec les autres dynamines est de l'ordre de 10 à 12 % seulement. Par ailleurs l'organisation de cette protéine est fortement analogue à celle de Mspl et MGM1, en particulier par la présence d'un domaine amino-terminal basique caractéristique des protéines importées dans les mitochondries. La séquence comprises entre +56 et 2935 a donc été identifiée comme codant pour la dynamine mitochondriale MSPl orthologue à Mspl et MGM1 des levures (Figure 1).
EXEMPLE 2:
Caractérisation du polypeptide MSPl.
Une protéine codée par un segment de 2880 pb a été sélectionnée dans le fragment d'ADNc KIAA0567. Elle est constituée de 960 acides aminés (SEQ ID N° 1). L'étude de sa structure primaire montre que la protéine comporte un domaine amino-terminal très basique (acides aminés 1 à 120), un premier domaine d'assemblage (acides aminés 121 à 259), un domaine catalytique GTPase (acides aminés 260 à 505), un domaine central de type dynamine (acides aminés 505 à 787), et un deuxième domaine d'assemblage dans la zone carboxy-terminale. Ces domaines caractéristiques se retrouvent également dans les dynamines de levures Mspl et MGM1. Les ressemblances dans la séquence et dans la structure entre le peptide humain décrit et les protéines de levures Mspl et MGM1 concourent à montrer que le fragment ABOI 1139 d'ADNc code pour l'orthologue humain de Mspl/MGMl des levures, qui sera appelée MSPl.
EXEMPLE 3:
Identification du gène MSPl/OPAl et localisation chromosomique.
Le gène MSPl/OPAl a une taille supérieure à 69kb et est composé d'au moins 29 exons avec des liaisons introns-exons suivant la règle AG-GT. Il code pour un ARN messager dont la séquence codante complète est présentée sous la forme de l'ADN complémentaire et décrite par SEQ ID N° 2. Le gène MSPl/OPAl a été localisé par hybridation fluorescente in situ (FISH) en utilisant les méthodes conventionnelles avec comme sonde l'ADNc complet incluant le cadre ouvert de lecture de la protéine MSPl et l'extrémité 3' non traduite. Les résultats montrent clairement un double marquage unique dans la région 3q28-29 (Figure 2).
EXEMPLE 4:
4.A) - Identification d'exons supplémentaires dans le gène MSPl/OPAl.
L'analyse de l'ARNm extrait des leucocytes humains et de différents tissus a permis de mettre en évidence l'existence de 8 produits codant pour huit formes différentes de MSPl, résultant de la transcription du gène MSPl/OPAl, qui se sont avérés être les produits obtenus par épissages alternatifs de l'exon 4 et de 2 nouveaux exons 4b et 5b. Il a été procédé de la manière suivante:
Des fragments d'ADNc obtenus a partir d'ARN humain ont été amplifiés par PCR inverse à l'aide d'amorces permettant d'amplifier les exons 3 à 9. Extraction:
Les ARN ont été extraits de 11 types de tissus ou cellules: leucocytes, rétine, thyroïde, rein, poumon, ovaire, muscle squelettique, foie, cœur, colon, cerveau fœtal, par Stratagène (La Jolla, USA).
Les leucocytes ont été isolés à partir de 20 ml de sang additivé d'héparine. L'ARN total a été extrait selon la méthode AGPC en une étape (Chomczynski P. et Sacchi N., 1987, Anal
Biochem., 162, pp. 156-159), et purifié sur billes de verre. La rétine de deux yeux humains a été prélevée et l'ARN a été extrait à l'aide du Kit RNeasy(R) (Qiagen, Courtabœuf, France) selon les indication du fabriquant.
Transcription inverse et amplification:
Un mélange de 2 microg de l'ARN total, 200 unités de transcriptase inverse SuperScript II(R) (Gibco-BRL, Carlsbad, USA) en solution tampon, et 150 ng d'oligonucléotides aléatoires (Proméga, Madison, USA). Une transcription inverse sans transcriptase inverse a été effectuée pour servir de témoin. La séquence codante du gène MSPl/OPAl comprise entre les exons 3 et 9 a été ensuite amplifiée à l'aide des amorces suivantes:
K5S 5'-GGATTGTGCCTGACATTGTG-3' K5AS 5'-CACTCAGAGTCACCTTAACTGG-3'
Les conditions de mise en œuvre de la PCR sont 94°C pendant 3 mn, puis 35 cycles de 94°C pendant 30 s, 66 °C pendant 30 s et 72°C pendant 1 mn, puis 72°C pendant 10 mn.
Tous les produits de la PCR ont été séparés par electrophorèse sur agarose GTC à 3% (NuSieve(R), FMC Bioproducts, USA) purifiés par le kit Gel Extraction Kit(R) (QIAGEN, Courtabœuf, France), clones dans le vecteur pTOPOII (INVITROGEN) et séquences
Dans tous les tissus testés, 8 produits de PCR ont été obtenus, incluant le fragment de 597 pb attendu et 7 fragments supplémentaires de 498 à 762 pb. Le séquençage des 8 fragments clones montre qu'ils résultent de la combinaison des alternatives absence/présence de trois exons, à savoir l'exon 4 et deux nouveaux exons appelés 4b et 5b codant respectivement des fragments de 18 et 37 acides aminés. Les séquences des nouveaux exons sont telles que le cadre de lecture n'est pas altéré et qu'elles possèdent les signaux consensus d'épissage conformément à la règle GT/AG. De même, la soustraction de l'exon 4 n'altère pas non plus le cadre de lecture. C'est donc par un mécanisme d'épissage alternatif de 3 exons que 8 ARNm codant sont obtenus. Aucun autre épissage alternatif n'a été rencontré ailleurs dans la ' séquence codante. 4.B) - Caractérisation des dynamines isoformes MSPl-X.
Les deux nouveaux exons 4b et 5b codant respectivement des portions de 18 et 37 acides aminés ne présentent pas d'ho ologie significative avec d'autres protéines connues. Cependant, l'analyse des structures secondaires potentielles suggère que la séquence d'acides aminés déduite de l'exon 5b pourrait participer aux relations protéine-protéine par le biais de structures coiled-coil.
Les 8 produits de transcription sont exprimés dans les 11 types de tissus testés, avec quelques variations dans le niveau d'expression.
Les séquences d'ADNc correspondant aux 7 ARNm isoformes supplémentaires et les séquences des 7 polypeptides isoformes MSPl-X qui en sont issus sont représentés par:
protéine épissage séquence polypeptidique séquence nucléotidique
MSP1-B 356 SEQ ID N°3 SEQ ID N°10
MSP1-C 344b56 SEQ ID N°4 SEQ ID °11
MSP1-D 34b56 SEQ ID N°5 SEQ ID N°12
MSP1-E 3455b6 SEQ ID N°6 SEQ ID N°13
MSP1-F 355b6 SEQ ID N°7 SEQ ID N°14
MSP1-G 34b55b6 SEQ ID N°8 SEQ ID N°15
MSPl -H 344b55b6 SEQ ID N°9 SEQ ID N°16
EXEMPLE 5:
Relation entre le gène MSPl/OPAl et la pathologie OPA1.
La concordance entre la localisation du locus OPA1 et la localisation chromosomique du gène MSPl/OPAl en 3q28-29 faisait de MSPl/OPAl un gène candidat pour l'atrophie optique dominante OPA1. A cette région du chromosome 3 sont associées plusieurs maladies héréditaires, néanmoins aucune anomalie caryotypique caractéristique n'avait 'été décrite à ce jour. Le séquençage du gène MSPl/OPAl à partir d'ADN purifié a été réalisé sur des cellules sanguines de personnes atteintes d'atrophie optique dominante. Il a permis d'établir de manière inattendue, que les malades atteints d'OPAl portaient une mutation du gène MSPl/OPAl.
EXEMPLE 6 Mutations de MSP1/OPA 1 j ouant un rôle dans la pathologie OP A 1..
Plusieurs types de mutations ont été identifiées chez 18 personnes souffrant de la pathologie OPA1: mutations d'épissage, délétions, insertions, mutations non-sens, mutations faux-sens.
Mutations d' épissage:
Une première mutation d'épissage. concerne le dernier nucléotide de l'intron 9, supprimanile site d'excision de l'intron (IVS9-1G>A). Cette mutation a pour effet de ne pas reconnaître le début de l'exon 10 et de sauter directement au niveau de l'exon 11 sans décalage du cadre de lecture, ce qui induit une délétion de 27 acides aminés dans la protéine dans le domaine GTPase.
Quatre autres nouvelles mutations des sites d'épissage affectant les séquences consensus de sites d'épissage ont été identifiées. L'une d'elles est un changement du premier nucléotide de l'intron 12 (IVS12+1G>T), qui est une partie de la séquence GT canonique. La deuxième mutation est un changement du 5ème nucléotide de l'intron 8 (IVS+5G>A). Les deux autres sont des substitutions du dernier nucléotide de Fexon en amont. L'une affecte l'exon 9 (c.984G>A) sans provoquer de modification de l'acide aminé codé (Lys328Lys) et l'autre se situe dans l'exon 26 (c.2707G>C) ce qui conduit à une substitution d'acide aminé conservée (Vall903Leu). Bien que ces deux dernières mutations ne doivent pas avoir d'effet pathogène, la guanine en position 1 appartenant à la séquence consensus du site d'épissage; un épissage inefficace avec un ARNm anormal est probable.
C'est pourquoi deux fragments ont été amplifiés par PCR inverse pour chacune de ces deux mutations. Pour la mutation c.984G>A, deux produits de transcription ont été obtenus. Le plus long ne portait pas de mutation, alors que le plus court était privé de l'exon 9. Pour la mutation c.2707G>C, deux produits de transcriptions ont été aussi obtenus, dont l'un n'avait pas de mutation et l'autre n'avait pas l'exon 26. L'absence de l'exon 9 conduit à la délétion de 38 acides aminés dans le domaine GTPase sans décalage du cadre de lecture. Le saut de l'exon 26 entraîne un décalage du cadre de lecture aboutissant à l'addition de trois nouveaux acides aminés après le codon 871 (NH2-LCD-COOH) suivi d'un stop prématuré au codon 875 avec perte des derniers acides aminés C-terminaux, soit 9,27% de la protéine. Délétions et insertions
Une mutation correspondant à une délétion de 4 paires de bases concerne les bases AGTT en position 2823 de l'ADNc (c.2823delAGTT), qui se traduit par le remplacement des 19 derniers acides aminés de la partie carboxy terminale de la protéine, par 24 nouveaux acides aminés dont la séquence est la suivante:
NH2-EKFKKNLMLSLKLFIRRNKLKSYS-COOH. Dans l'exon 8 une délétion de 4 pb a été trouvée: c.794delTTGA. Elle provoque un changement de 41 acides aminés du codon 265 au codon 305 et un stop prématuré au codon 306, soit la perte de 68,23% de la protéine du côté C-terminal incluant la majeure partie du domaine GTPase.
Une autre délétion a été trouvée. dans l'exon 21, notée c.2029delC. Le .cadre de lecture est décalé après le codon 676 par le remplacement de 8 acides aminés (NH2-YKKNFPAL- COOH-) avant un codon stop en position 685, correspondant à la perte de 29,58% de la partie C-terminal de la protéine. Deux nouvelles insertions ont été identifiées. L'une est située dans l'exon 26, c.2681insT, correspondant la substitution de 8 acides aminés des codons 894 à 901 (NH2-FKATTYKY- COOH) avant un codon stop en position 902 avec perte de 6,98% de la partie C-terminale de la protéine. L'autre est située dans l'exon 28, c.2853insT provoquant la substitution d'un acide aminé (Ile953His) suivi par un codon stop en position 954 ayec perte des 7 derniers acides aminés côté C-terminal.
Enfin, une mutation notée c.2708delTTAG a été trouvée dans l'exon 27 correspondant à une délétion de 4 paires de bases T, T, A et G en position 2708 de l'ADNc, qui se traduit par la substitution de la valine par la glycine en position 903, de l'arginine par Pasparagine en position 904 et par un codon stop anticipé au niveau du codon 905. On obtient alors une protéine tronquée de 56 acides aminés en C-terminal.
Mutations non-sens
Une première mutation est située dans l'exon 9 faisant partie du domaine catalytique
GTPase. La base G, en position 899 de l'ADNc est remplacée par A (c.899G>A), ce qui conduit au remplacement de la glycine par l'acide glutamique à la position 300 dans la protéine MSPl correspondante. La glycine en position 300 correspond à un motif conservé du domaine catalytique GTPase des dynamines.
Une nouvelle mutation non-sens a été détectée dans l'exon 21, notée Arg711Stop, du fait d'une transition C>T en position c.2131. Cette mutation conduit à la perte de 26,04% de la protéine en C-terminal.
La mutation c.l096C>T déjà décrite a également été retrouvée (Alexander C. et al, 2000, Nature Genêt., 26, pp. 211-215).
Mutations faux-sens
Trois mutations faux-sens ont été identifiées. L'une d'elles, Arg290Gln dans l'exon 8 a été décrite par Alexander (Alexander C. et al, 2000, Nature Genêt, 26, pp. 211-215). Les deux autres sont Gln785Arg dans l'exon 23 et Leu939Pro dans l'exon 27.
L'ensemble de ces mutations est de nature à affecter la fonction de MSPl /MSPl-X , du fait qu'elles affectent soit le site catalytique GTPase à proprement parler, soit le domaine d'assemblage carboxy-terminal.
EXEMPLE 7:
Production de la protéine MSPl in vitro et reconnaissance par des anticorps spécifiques.
a) Origine moléculaire de l'ADN correspondant à la phase de lecture de MSPl :
La phase de lecture de MSPl a été obtenue par purification de l'ARN total (kit QIAGEN) prélevé sur des cellules sanguines chez des sujets sains. Une réaction de transcriptase réverse
(New England Biolabs, NEB) a été réalisée en utilisant l'amorce MSP1-3'. La phase de lecture a été ensuite amplifiée par PCR en utilisant les amorces MSP 1-3' et MSP 1-5' décrites ci-après et la TAQ polymerase (NEB) dans des conditions standards d'amplification.
La séquence de l'amorce MSP 1-3' est:
5 ' -CCTGTCGGATCCTTATTTCTCCTGATGAAGAGCTTCAATGAAAGC-3 '
La séquence de l'amorce MSP 1-5' est: 5' -CTCCCCTCGAG-CATATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCT-3'
b) Construction du vecteur d'expression pBS-MSP 1
Le fragment d'ADN obtenu après amplification par PCR de MSPl et le plasmide pBlueScript (Stratagene Cloning System) ont été digérés par les enzymes de restriction Xhol et BamHl (NEB), purifiés sur gel d' agarose puis ligués 12 heures. Les produits de ligation sont transformés dans E. coli DH5 (supE44 hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl). Les clones pBS-MSPl ainsi obtenus sont analysés par profil de restriction de l'ADN plasmidique purifié selon le protocole de MiniPrep (Qiagen). Pour. confirmer l'absence de mutation liée à la réaction d'amplification, le fragment d'ADN correspondant à la phase de lecture de MSPl a été séquence dans son intégralité (MilGen). c) Production in vitro de la protéine MSPl et reconnaissance par les anticorps anti-MSPl . Une réaction de transcription couplée à la traduction a été réalisée en utilisant 1 microgr du clone pBS-MSPl, le kit TNT-T7 Quick Transcription-Translation Coupled (Proméga) et 5 microl de L-méthionine 35S (Amersham), le tout incubé à 30°C pendant une heure. Une réaction d'immuno-précipitation est ensuite réalisée dans du tampon de lyse LB (Lyse
Buffer) contenant 50 mM de Tris pH7.4, 250 mM de NaCl, 50 mM fluorure de sodium, 5 mM d'EDTA, O,l mM d'orthovanadate de sodium, 1 mM de difhiotréitol (DTT), 0.1% de solution Triton XI 00, 1 microgr/ml de'PMSF, 10 microgr/ml de leupeptine et 10 microgr/ml d'inhibiteur de la trypsine du soja. Puis, le produit de la réaction de transcription-traduction obtenu est séparé en deux fractions: l/5ème du volume réactionnel est conservé pour servir de témoin,, tandis que les 4/5èmes restant sont repris et sont additionnés de 5 microl d'anticorps anti-MSPl (Eurogentec) et incubés pendant deux heures à 4°C, puis incubés en présence de 20 microl .de protéine A-Sépharose (Pharmacia) durant une heure supplémentaire à 4°C. Après 3 lavages par du tampon LB, l'échantillon et le témoin sont séparés sur gel SDS-PAGE (PolyAcrylamine Gel Electrophorèse) puis exposés sur film radio-sensibles (Kodak) (Voir la figure 3).
EXEMPLE 8 Production de MSPl dans la bactérie E. coli et purification sur colonne d'affinité.
Cet exemple concerne la protéine MSPl étiquetée Haemagglutinine (Ha) + 6 histidines, produite dans la bactérie E. coli et purifiée sur colonne d'affinité au nickel.
A partir du plasmide précédent pBS-MSPl. une réaction d'amplification par PCR a été réalisée en utilisant les amorces suivantes: MSPl-3τjis et MSP1-PST1 :
La séquence de l'amorce MSP 1-3 'bis est:
5 ' -CCTGTCGGATCCTTAGCGGCCGCGCTCCTGATGAAGAGCTTC-3 ' La séquence de l'amorce MSP1-PST1 est: 5' -CAGCAATGGGATGCAGCTAT-3' Le fragment amplifié a été digéré par les enzymes Pstl et BamHl (NEB) et sous-cloné dans le plasmide pBS-MSPl digéré également par Pstl et BamHl. Après vérification de la séquence un fragment d'ADN codant pour 2 exemplaires de l'épitope Haemagglutinine associés à 6 exemplaires d'histidine (McGowan et Russel, 1993, EMBO Journal, vol 12, pp. 75-85) a été inséré en phase entre les sites Notl et BamHl à l'extrémité de la phase codante de MSPl, créant le plasmide pBS-MSPl-Ha-6his. Le fragment codant pour la protéine chimère MSPl-Ha+6his a été sous-cloné dans le vecteur pRKl 71 (Invitrogen) entre les sites Ndel et BamHl. Le plasmide résultant pRK171-MSPl-Ha-6his a été transformé dans la souche E. coli BL21DE3 (hsdS gal(lclts857 indlSam7 nin5 lacUV5-T7 genel)). Après pré-culture et culture jusqu'à une densité optique de 0,1 à 600 nm dans du milieu Luria Broth Ampicilline à 100 microgr/ml (Sigma), l'activité productrice bactérienne est induite par addition de 100 microM d'IPTG (Isopropylthio-beta-D-galactoside, Sigma) pendant 3 heures. Les cellules sont alors récupérées par centrifugation et lysées dans le tampon suivant: 50 mM Na2HPO4 pH8, 10 mM Tris pH8, 250 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,1 mM NaVnθ4, 5 mM PMSF, 0,05% 2-mercaptoethanpl, 0,1% Tween 20, 10 mg/ml lysozyme, 1 mg/ml DNAse (Sigma), pendant 1 heure à 3 °C. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé à 15000g pendant 5 minutes. Le surnageant est mélangé avec des billes de nickel (Ni-NTA,
Sigma) préconditionnées dans du chlorure de guanidium à pH5,5 puis pH8, et lavées 3 fois dans 50 mM Na2HPθ4 à pH8. Puis le mélange billes-surnageant est chargé dans un tube (ou colonne) et est incubé .1 heure à 4°C. Les billes sont lavées dans le tampon de départ (dépourvu de lysozyme et DNAse), puis dans 50 mM de solution Na2HPO4, pH6. Les billes sont éluées 3 fois par 250mM d'imidazole à pH7,2. On fait alors migrer sur gel SDS-
PAGE, d'une part une fraction de la solution chargée sur la colonne et contenant l'extrait total (EX) et d'autre part l'éluat contenant la protéine déplacée de l'étiquette par l'imidazole (EL). Le gel est fixé et coloré au Bleu de Commassie (Figure 4).
EXEMPLE 9:
Production de MSPl dans la levure Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité
GTPase.
La phase de lecture codant pour la protéine MSPl a été clonée à partir du plasmide pBS-
MSP1 tel que décrit à l'exemple 6 dans le vecteur pREPl (K. Maundrell, J. Biol. Chem., 1990, 265, pp. 10857-64) entre les sites Ndel et BamHl. Ce vecteur contient le promoteur nmtl inductible par l'absence de thiamine. Le plasmide pREPl-MSPl ainsi obtenu est introduit dans la souche sauvage T199 (leul-32, ura4-dl 8, h-) de la levure Schizosaccharomyces pombe par électroporation, et les cellules contenant le plasmide sont sélectionnées sur milieu sans leucine : EMMA (BIO101), uracyle 4 mg/ml, thiamine 20 microM. Après culture liquide et induction du promoteur nmtf pendant 24 heures par
* incubation dans un milieu EMMA + Uracyle à 4 mg/ml, mais sans thiamine, les cellules sont récoltées par centrifugation, puis lysées physiquement dans le tampon de lyse LB. Puis les protéines MSPl sont immunoprécipitées comme décrit dans l'exemple 6. Leur activité
GTPase est mesurée par le protocole suivant: les immunoprécipités sont repris dans le milieu tampon suivant: 20 mM Tris pH7,9, 4 mM MgC12, 50 microg/ml BSA, 1 mM DTT (Sigma), 50 microM GTP et additionnés de 1 microCurie de GTP alpha 32P (Amersham) par échantillon. Ce mélange est incubé 2 heures à 30°C puis la réaction est arrêtée par addition de 2 microl d'EDTA 0.5M. Les échantillons migrent 2 à 3 heures sur plaque de PEI (Sigma) immergée dans 50ml de solution de LiCl 0.5M et d'acide formique 1M dans une cuve de migration étanche. Après séchage de la plaque PEI, celle-ci est exposée dans un appareil Phosphor-Imager (Molecular Dynamics) et la radioactivité proportionnelle à l'activité GTPase de MSPl est comptée. L'effet de composés pharmacologiquement actifs est réalisée par l'addition dans le mélange réactionnel d'un composé candidat, noté ici A ou B, et mesure de l'activité GTPase résultante
(Figure 5).
EXEMPLE 10: Production et détection immunologique de la protéine MSPl étiquetée Haemagglutinine dans les cellules HeLa.
Cet exemple concerne la protéine MSPl étiquetée Haemagglutinine (Ha) exprimée ectopiquement dans les cellules HeLa. A partir du plasmide pBS-MSP 1 -Ha-6his tel que décrit dans l' exemple 8, le fragment codant pour MSPl-Ha-6his a été introduit dans le plasmide pCDNA entre les sites Kpnl et BamHl. Puis, le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his a été transfecté dans des cellules HeLa, selon le mode opératoire décrit par le fabriquant (ExGen-500, Euromedex), et les cellules incubées 24 heures dans un milieu DMEM (Dulbecco Mpdified Eagle Médium, Gibco- BRL) additionné de glucose 4 mg/1, pyruvate de sodium 4 mM, glutamine 4 mM (Seromed), pénicilline 100 U/ml (Seromed), streptomycine 100 microg/ml (Seromed) et sérum de veau fœtal à 10% (Eurobio). La détection spécifique de la protéine MSPl-Ha-6his a été réalisée en utilisant les anticorps primaires de souris anti-Ha 12CA5 (Boehringer) et l'anticorps secondaire anti-souris Alexa 594 (Molecular Probes), par le protocole d'immuno- fluorescence suivant: les cellules ont été fixées dans une solution à 3,7% de formaldéhyde pendant 20 minutes à 4°C, perméabilisées par un traitement au méthanol 100% à -20°C pendant 10 minutes, puis traitées 5 minutes au Triton XI 00 à 0,25% dans du tampon PBS (Phosphate Buffer Saline). Puis les échantillons ainsi obtenus sont incubés 2 heures en présence des anticorps anti-Ha 12CA5 dilués au l/700ème dans du tampon PBS additionné de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) à 37°C, puis avec l'anticorps secondaire Alexa 594 dilué au l/500ème bans du tampon PBS additionné de BSA (Albumine de Sérum Bovin) à 1%. Les cellules sont observées au microscope à fluorescence (Leitz), la fluorescence correspondant spécifiquement à l'expression de la protéine MSPl-Ha-6his (Figure 6A-1).
La localisation de cette protéine produite ectopiquement correspond parfaitement à celle observée pour des cellules HeLa non transfectées, en utilisant l'anticorps spécifique de la protéine MSPl (Figure 6B-1) et à la localisation obtenue en utilisant des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques des mitochondries humaines autres que MSPl, comme par exemple l'anticorps anti-hsp60-LK2 (Sigma). (Voir figures 6A-2 et 6B-2).
Les exemples décrits précédemment illustrent les moyens de produire la protéine MSPl in vitro comme in vivo. Ces protocoles décrivent aussi des méthodes de production et de purification de la protéine MSPl basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques ou de colonnes d'affinité, et du dosage de son activité. Ils sont applicables quelle que soit la nature des échantillons biologiques, et peuvent être répétées pour les mutants MSPl -m de la protéine MSPl, en utilisant les phases codantes correspondantes, ainsi que pour l' ensembles des isoformes MSPl-X et leurs mutants.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Polypeptide dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N°l, une séquence homologue de ladite SEQ ID N° 1 , un fragment biologiquement actif de ladite SEQ
ID N°l, et un fragment biologiquement actif des séquences homologues de ladite SEQ ID N° 1 , ledit polypeptide étant désigné par MSP 1.
2 - Polypeptide isoforme du polypeptide MSPl, dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID
N°8, SEQ ID N°9, une séquence homologue desdites SEQ ID_N°3 à 9, un fragment biologiquement actif desdites SEQ ID N°3 à 9 et un fragment biologiquement actif des séquences homologues desdites SEQ ID N°3 à 9, ledit polypeptide isoforme étant désigné par MSPl-X.
3 - Polypeptide dérivé d'un polypeptide MSPl ou MSPl-X , portant en outre une ou plusieurs mutations induisant une modification et /ou une perte de l'activité biologique dudit polypeptide.
4 - Séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence choisie parmi
SEQ ID N°2, une séquence homologue de ladite SEQ ID N°2, un fragment de ladite
SEQ ID N°2, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSPl selon la revendication 1 ;
SEQ ID N°10, SEQ ID N°l 1, SEQ ID N°12, SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID
N°15, SEQ ID N°16, une séquence homologue de l'une desdites SEQ ID N°10 à 16, un fragment de l'une desdites SEQ ID N°10 à 16, lesdites séquences codant pour un polypeptide MSPl-X selon la revendication 2; et la séquence complémentaire de ladite séquence nucléotidique.
5 - Vecteur de clonage et/ou d'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 a >, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique selon la revendication 4 fusionnée à un promoteur actif dans les cellules procaryotes ou eucaryotes, et éventuellement un ou des marqueurs de sélection.
6 - Cellule hôte, eucaryote ou procaryote, transformée par un vecteur selon la revendication 5.
7 - Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'on fait exprimer ledit polypeptide par une cellule selon la revendication 6.
8 - Procédé de préparation d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on produit ledit polypeptide in vitro à l'aide d'un vecteur d'expression selon la revendication 5.
9 - Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 consistant à:
- associer dans une cellule hô.te selon la revendication 6, la phase codante dudit polypeptide à la phase codante d'une étiquette antigénique; - exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans ladite cellule hôte,
- mettre en contact ladite cellule hôte avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ladite étiquette,
- détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence dudit polypeptide.
10 - Procédé de purification d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 consistant à: - associer dans une cellule hôte selon la revendication 6, la phase codante dudit polypeptide à la phase codante d'une étiquette choisie pour son affinité à un support,
- exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans ladite cellule hôte,
- obtenir un extrait par lyse de ladite cellule hôte,
- mettre en contact l'extrait avec le support choisi,
- récupérer ledit polypeptide par élution.
11 - Anticorps monoclonal ou ses fragments ou anticorps chimérique ou immunoconjugué, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 administré à un animal et est capable de reconnaître spécifiquement ledit polypeptide.
12 - Procédé de détection immunologique d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, consistant à :
- mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps détectable, selon la revendication 11,
- détecter la présence dudit anticorps indicatrice de la présence dudit polypeptide.
13 - Procédé de détection de l'activité GTPase d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps selon la revendication 11,
- purifier le complexe anticorps-antigène,
- mettre en contact le complexe avec le GTP,
- doser le GDP formé.
14 - Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder un effet modulateur de l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur ledit polypeptide.
15 - Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologiquè, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule selon la revendication 6.
16 - Utilisation d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3 pour le criblage de composés modulateurs de l'activité dudit polypeptide, utiles pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles associés à un dysfonctionnement mitochondrial, ou à ceux de la division cellulaire.
17 - Utilisation selon la revendication 16 dans laquelle lesdits troubles sont choisis parmi les maladies neurodégénératives, en particulier les neuropathies optiques et de préférence l'OPAl .
18 - Utilisation d'un vecteur selon la revendication 5 pour la préparation d'une composition destinée à être utilisée en thérapie génique.
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