FR2755446A1 - Lignees cellulaires stables exprimant la proteine cftr ou un mutant de cette proteine, outil de selection de molecules ayant un effet sur le transport intracellulaire de ces proteines - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un acide nucléique recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend: - une séquence de nucléotides codant (séquence codante) pour la protéine CFTR normale, - une séquence épitope localisée à l'extrémité 3' de la susdite séquence codante, - une séquence promoteur fort capable de contrôler l'expression des susdites séquence codante et séquence épitope, lorsqu'elles sont intégrées dans une cellule déterminée.
Description
LIGNEES CELLULAIRES STABLES EXPRIMANT LA PROTEINE CFTR
OU UN MUTANT DE CETTE PROTEINE. OUTIL DE SELECTION DE
MOLECULES AYANT UN EFFET SUR LE TRANSPORT
INTRACELLULAIRE DE CES PROTEINES.
OU UN MUTANT DE CETTE PROTEINE. OUTIL DE SELECTION DE
MOLECULES AYANT UN EFFET SUR LE TRANSPORT
INTRACELLULAIRE DE CES PROTEINES.
L'invention a pour objet des lignées cellulaires stables exprimant la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductant Regulator), ainsi que des mutants de cette protéine. La demande concerne également l'utilisation de ces lignées en tant qu'outils de criblage pour déterminer l'effet de molécules choisies sur le transport intracellulaire de ces protéines.
La mucoviscidose (ou cystic fibrosis (CF)) est une maladie génétique autosomique récessive fréquente au sein de certaines populations, qui se caractérise spécifiquement par une altération fonctionnelle des glandes exocrines de l'organisme humain, résultant de mutations du gène cftr qui conduit à des modifications de la fonction du canal chlore CFTR.
Le gène cftr a été cloné et séquencé et sa caractérisation a été rapportée dans les publications suivantes : Kerem BS, et al., Science 1989, 245:1073-80 Riordan JR, et al., Science, 1989, 245: 1066-73 et
Rommens JM. et al., Science 1989, 245 : 1059-64. A cette occasion, la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) a été identifiée et décrite (Riordan J.R. et al précitée).
Rommens JM. et al., Science 1989, 245 : 1059-64. A cette occasion, la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) a été identifiée et décrite (Riordan J.R. et al précitée).
La mucoviscidose se traduit par une insuffisance globale des sécrétions exocrines, notamment au niveau du pancréas et des poumons et correspond cliniquement à l'observation de sécrétions trop visqueuses, les troubles en résultant pouvant conduire au décès du patient.
A la suite de la mise en évidence du rôle du gène codant pour la protéine CFTR dans le développement de la maladie, différentes voies ont fait l'objet de recherches, afin de proposer des moyens thérapeutiques pour traiter les patients concernés.
Parmi les mutations du gène cftr observées chez les patients, l'une d'entre elles se traduit par l'expression d'une protéine CFTR mutée appelée CFTR(AF508). Cette mutation du gène se traduit par la délétion du résidu phénylalanine en position 508 de la protéine CFTR. Elle est la plus fréquente des 400 mutations observées jusqu'à ce jour au niveau du gène cftr, puisqu'elle représente 70 % des mutations répertoriées chez les malades.
Cette mutation affecte la maturation et le transport intracellulaire de la protéine CFTR(AF508).
Dans le cadre de la présente demande de brevet, les inventeurs se sont intéressés à des moyens utilisables pour le criblage de molécules, connues ou nouvelles, afin d'identifier parmi celles-ci, des agents susceptibles d'intervenir dans la restauration du transit intracellulaire de la protéine CFTR mutée présente chez les patients atteints de mucoviscidose.
A cet égard, les inventeurs ont particulièrement observé le comportement de la protéine CFTR mutée (AF508), étant entendu cependant que l'enseignement découlant des observations faites est également applicable dans le cadre de l'invention à d'autres protéines
CFTR mutées, dont le phénotype est analogue à celui de la protéine
CFTR(AF508), correspondant à un phénotype de rétention dans le réticulum endoplasmique.
CFTR mutées, dont le phénotype est analogue à celui de la protéine
CFTR(AF508), correspondant à un phénotype de rétention dans le réticulum endoplasmique.
L'invention a pour objet des constructions d'acide nucléique, et en particulier d'ADN ou d'ADNc comprenant une séquence de nucléotides codant pour la protéine CFTR normale ou une séquence de nucléotides codant pour un variant muté et notamment pour la protéine CFTR(AF508).
L'invention a également pour objet des cellules transformées et des lignées cellulaires recombinantes stables comprenant ces constructions.
Une première construction utilisable pour exprimer dans des conditions contrôlées la protéine CFTR ou un mutant de cette protéine, en particulier un mutant (AF508), est un acide nucléique recombinant comprenant:
- une séquence de nucléotides codant (séquence codante) pour la protéine CFTR normale,
- une séquence épitope localisée à l'extrémité 3' de la susdite séquence codante et,
- une séquence promoteur fort, capable de contrôler l'expression des susdites séquence codante et séquence épitope, lorsqu'elles sont intégrées dans une cellule déterminée.
- une séquence de nucléotides codant (séquence codante) pour la protéine CFTR normale,
- une séquence épitope localisée à l'extrémité 3' de la susdite séquence codante et,
- une séquence promoteur fort, capable de contrôler l'expression des susdites séquence codante et séquence épitope, lorsqu'elles sont intégrées dans une cellule déterminée.
La séquence codante décrite ci-dessus est avantageusement une séquence d'ADNc, dérivable du gène cftr. Cette séquence d'ADNc a été publiée (Riordan J.R. et al précitée) et peut être obtenue par tout moyen en soi connu.
Alternativement, la séquence de nucléotides codante définie cidessus, capable d'exprimer la protéine CFTR normale, est remplacée par une séquence de nucléotides codant pour la protéine CFTR mutée (AF508) (séquence codante mutée). Cette séquence est de préférence une séquence d'ADNc.
On peut avantageusement ajouter à la construction d'acide nucléique recombinant, un marqueur de sélection, et en particulier un gène de résistance à un antibiotique, par exemple un gène de résistance à la néomyci ne.
La séquence épitope ou étiquette (tag) utilisée dans le cadre de la construction ci-dessus décrite est choisie de façon à être reconnue de façon spécifique par un anticorps monoclonal de haute affinité. Cette séquence épitope est localisée dans l'acide nucléique recombinant, de façon à ne pas altérer la fonctionnalité de la protéine CFTR normale ou mutée exprimée, lorsque l'acide nucléique recombinant est placé dans une cellule déterminée. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence épitope est ajoutée à l'extrémité 3' de la séquence codant pour la protéine CFTR normale ou mutée.
Avantageusement, on aura recours à une séquence épitope telle que la séquence codant pour la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) (Kreis T.E., EMBO J., 1986, 5, 931-941).
Le promoteur mis en oeuvre dans la construction d'acide nucléique recombinant est avantageusement un promoteur fort et par exemple un promoteur viral, notamment le promoteur du cytomégalovirus (CMV). II peut s'agir également d'autres promoteurs viraux ou de promoteurs spécifiques d'un tissu donné tel que le promoteur de la villine humaine (Robine et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 11426-11434).
L'invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et d'expression comprenant un acide nucléique recombinant tel qu'il a été défini précédemment. Ce vecteur peut être un plasmide et notamment le plasmide pCFTag ou le plasmide pCFTagAF508. II peut également s'agir d'un vecteur viral.
L'invention a également pour objet des cellules recombinantes, notamment des cellules eucaryotes, choisies parmi les cellules polarisées n'exprimant pas le gène cftr de façon endogéne, lesdites cellules contenant en outre un acide nucléique recombinant selon l'invention ou un vecteur tel que défini précédemment.
Ces cellules sont transformées par toute technique en soi connue de transformation cellulaire et peuvent être notamment transfectées, par exemple par lipofection.
De préférence, les cellules recombinantes sont des cellules dérivées de cellules épithéliales.
Une lignée cellulaire particulièrement intéressante dans le cadre de la réalisation de l'invention est la lignée cellulaire stable et homogène LLC.A6.5 déposée à la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes à Paris (C.N.C.M.) sous le n" 1-1779 le 4 Novembre 1996. Cette lignée cellulaire est capable d'exprimer un acide nucléique recombinant selon l'invention sous la forme d'une protéine CFTR mutée (AF508).
Microorganismes à Paris (C.N.C.M.) sous le n" 1-1779 le 4 Novembre 1996. Cette lignée cellulaire est capable d'exprimer un acide nucléique recombinant selon l'invention sous la forme d'une protéine CFTR mutée (AF508).
Une autre lignée cellulaire, utilisable notamment comme témoin est la lignée LLC.CFt6.1 déposée à la CNCM sous le n" 1-1780 le 4 Novembre 1996, capable d'exprimer la protéine CFTR normale.
Selon une variante de réalisation de l'invention, les lignées cellulaires sont obtenues par transformation des cellules choisies avec un acide nucléique recombinant selon l'invention, ce dernier étant toutefois dépourvu de la séquence épitope dite tag .
La lignée cellulaire épithéliale LLC.A6.5 est utilisable dans le cadre de l'invention, comme moyen pour la recherche d'agents pharmacologiquement actifs capables de restaurer le transport intracellulaire de la protéine CFTR mutée AF508 vers la membrane apicale des cellules. La lignée LLC.CFt6.1 peut être utilisée comme témoin dans le cadre d'un tel procédé de criblage.
Pour ce faire, on aura recours à un procédé pour déterminer l'effet d'une molécule donnée sur le transport de la protéine CFTR mutée (au508) à la membrane des cellules l'exprimant, comprenant:
- la mise en contact d'une molécule choisie avec la lignée cellulaire LLC.A6.5 (CNCM n" 1-1779) dans des conditions permettant l'interaction entre ia molécule testée et les protéines exprimées par la cellule,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée (AF508) à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée LLCPK1.
- la mise en contact d'une molécule choisie avec la lignée cellulaire LLC.A6.5 (CNCM n" 1-1779) dans des conditions permettant l'interaction entre ia molécule testée et les protéines exprimées par la cellule,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée (AF508) à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée LLCPK1.
La mise en oeuvre de ce procédé peut permettre d'étudier les modifications de l'interaction entre la protéine CFTR mutée et une molécule chaperon telle que la calnexine, qui empêche le transport de cette protéine CFTR mutée à la membrane apicale des cellules.
En particulier, on sélectionnera dans ce cadre, des molécules capables d'interagir avec la fonction de rétention exercée par la protéine chaperon, en particulier la calnexine, sur les protéines exprimées et retenues dans le reticulum endoplasmique des cellules.
Dans le cadre de la présente invention, une protéine dérivée de la calnexine est également utilisée, dans laquelle le signal de rétention a été délété ou rendu non fonctionnel. Les inventeurs ont montré que la protéine ainsi tronquée n'est plus susceptible de retenir au niveau du reticulum endoplasmique, des protéines qui le seraient par la calnexine normale, en particulier la protéine CFTR(AF508).
La présente demande a également pour objet une lignée cellulaire dérivée des cellules recombinantes précédemment définies, la dite lignée exprimant en outre une protéine dérivée d'une protéine chaperon, en particulier la calnexine, tronquée de son signal de rétention dans le réticulum endoplasmique. Ces lignées peuvent être obtenues par transformation des lignées LLCPKî, LLC.A6.5 ou LLC.CFt6.1 à l'aide de l'ADNc codant pour la calnexine mutée. A cet égard, la publication de
Rajagopalan S. et al (Science, 1994, 263, 387-390) décrit des constructions plasmidiques appropriées.
Rajagopalan S. et al (Science, 1994, 263, 387-390) décrit des constructions plasmidiques appropriées.
De préférence, la calnexine tronquée est surexprimée par rapport à la calnexine normale endogène. Une lignée ainsi établie constitue un moyen pour l'étude de la restauration du transport de la protéine CFTR mutée (AF508), à la membrane cellulaire.
L'invention concerne également des lignées cellulaires LLC.A6.5 ou
LLC.CFt6.1, transformées avec une séquence d'ADN codant pour la calnexine normale. On utilise notamment pour ce faire, la séquence d'ADNc de la calnexine humaine, par exemple dans les constructions décrites par Rajagopalan et al.
LLC.CFt6.1, transformées avec une séquence d'ADN codant pour la calnexine normale. On utilise notamment pour ce faire, la séquence d'ADNc de la calnexine humaine, par exemple dans les constructions décrites par Rajagopalan et al.
La présente demande a donc également pour objet un procédé pour déterminer l'effet d'une molécule donnée sur l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR mutée (AF508), comprenant:
- la mise en contact d'une molécule choisie avec une lignée cellulaire LLC.A6.5 exprimant la protéine calnexine,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée (AF508), à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée.
- la mise en contact d'une molécule choisie avec une lignée cellulaire LLC.A6.5 exprimant la protéine calnexine,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée (AF508), à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée.
Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de détection de l'effet d'une molécule choisie sur l'interaction entre la calnexine humaine, de préférence obtenue sous forme recombinante, et la protéine CFTR mutée (AF508), ledit procédé consistant à
- placer dans des conditions d'interaction, la calnexine et la protéine
CFTR (au508),
- mettre en contact les susdites protéines avec une molécule choisie susceptible de réagir avec ces protéines et en particulier susceptible de modifier l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR (AF508),
- observer, le cas échéant mesurer l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR (AF508).
- placer dans des conditions d'interaction, la calnexine et la protéine
CFTR (au508),
- mettre en contact les susdites protéines avec une molécule choisie susceptible de réagir avec ces protéines et en particulier susceptible de modifier l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR (AF508),
- observer, le cas échéant mesurer l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR (AF508).
Des tests utilisables à cet égard comprennent les techniques mises en oeuvre dans le test Biacor (Pharmacia), la technique de réalisation de double hybride, ou la technique de phage display .
D'autres propriétés caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent.
Fiaure 1: carte de restriction du plasmide pCFTag comprenant l'ADNc codant pour la protéine CFTR, la séquence épitope de la protéine
G du virus VSV, sous le contrôle du promoteur du CMV le gène de résistance à l'ampicilline et le gène marqueur de résistance à la néomycine.
G du virus VSV, sous le contrôle du promoteur du CMV le gène de résistance à l'ampicilline et le gène marqueur de résistance à la néomycine.
Figure 2: carte de restriction du plasmide pCFTagåF508 comprenant l'ADNc codant pour la protéine CFTR(AF508), la séquence épitope de la protéine G du virus VSV, sous le contrôle du promoteur du
CMV le gène de résistance à l'ampicilline et le gène marqueur de résistance à la néomycine.
CMV le gène de résistance à l'ampicilline et le gène marqueur de résistance à la néomycine.
Figure 3: utilisation de la séquence nucléotidique terminale de VSV
G dans les constructions.
G dans les constructions.
Dévelopnement d'outils immunologigues et Pharmacoloaiques Pour l'étude de l'expression et du transport intracellulaire de la protéine CFTR normale ou mutée (au508).
L'étude ex vivo et in vivo de l'expression et de l'adressage de la protéine CFTR normale ou mutée (au508) était jusqu'à présent limitée du fait de la faible spécificité des anticorps existants. Dans le but de développer un outil immunologique pour ce type d'étude, les inventeurs ont utilisé des ADNc codant pour la protéine CFTR normale (Riordan J.R. et al., Science 1989, 245:1066-1080) ou pour la protéine mutée Au508 (Morgenstern J.P. et al., Nucleic Acids Rs., 1990, 18: 3587-3596). Ces
ADNc ont été modifiés génétiquement par l'addition d'une séquence épitope constituée par la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (Kreis T.E., EMBO J., 1986, 5: 931-941), en 3' des séquences d'ADNc.
ADNc ont été modifiés génétiquement par l'addition d'une séquence épitope constituée par la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (Kreis T.E., EMBO J., 1986, 5: 931-941), en 3' des séquences d'ADNc.
Cette séquence épitope (étiquette ou tag) code pour un antigène reconnu de façon spécifique par un anticorps monoclonal P5D4 de haute affinité (Kreis T.E., EMBO J., 1986, 5: 931-941). Des clones stables de cellules épithéliales différenciées LLCPK1 (ATCC n" CL1) transfectées avec ces constructions sous le contrôle du promoteur viral fort du cytomégalo-virus (CMV) ont été obtenus. Les lignées cellulaires exprimant la protéine
CFTR(AF508) marquée sont utilisées pour rechercher des agents pharmacologiques capables de restaurer le transport apical du CFTR(åF508).
CFTR(AF508) marquée sont utilisées pour rechercher des agents pharmacologiques capables de restaurer le transport apical du CFTR(åF508).
A. Matériel et méthodes 1. Construction des plasmides pCMV/CFtag:
L'ADNc du gène cftr normal a été inséré dans le vecteur pCB6 (Algrain M. et al., J. Cell. Biol., 1993, 120, 129-139) en aval du promoteur du cytomégalo-virus (CMV). Ce vecteur comporte un gène de résistance à l'ampicilline, et le gène de résistance à la néomycine qui sert de marqueur de sélection. La séquence codant pour l'antigène de la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (étiquette), a été insérée en phase avec le cadre ouvert de lecture du ADNc du gène cffr, à l'extrémité 3' de celui-ci.
L'ADNc du gène cftr normal a été inséré dans le vecteur pCB6 (Algrain M. et al., J. Cell. Biol., 1993, 120, 129-139) en aval du promoteur du cytomégalo-virus (CMV). Ce vecteur comporte un gène de résistance à l'ampicilline, et le gène de résistance à la néomycine qui sert de marqueur de sélection. La séquence codant pour l'antigène de la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (étiquette), a été insérée en phase avec le cadre ouvert de lecture du ADNc du gène cffr, à l'extrémité 3' de celui-ci.
p CMWCF( F508) tag:
Ce plasmide a été construit selon le même principe que le vecteur pCMV/CFtag. La seule différence est que le ADNc inséré en aval du promoteur viral fort CMV était celui codant pour le CFTR(AF508).
Ce plasmide a été construit selon le même principe que le vecteur pCMV/CFtag. La seule différence est que le ADNc inséré en aval du promoteur viral fort CMV était celui codant pour le CFTR(AF508).
Aprm8.2kb:
Le ADNc codant pour la calnexine humaine normale a été inséré dans le vecteur Aprm8 (Rajagopolan S. et al, Science, 1994, 263, 387-390) en aval du promoteur du cytomégalo-virus (CMV). Le vecteur Aprm8 comporte le gène de résistance à l'ampicilline. Le fragment de 2kb codant pour la calnexine humaine a été coupé à chaque extrémité par l'enzyme de restriction Spel, et inséré dans le site Hbaî du polylinker du vecteur
Aprm8.
Le ADNc codant pour la calnexine humaine normale a été inséré dans le vecteur Aprm8 (Rajagopolan S. et al, Science, 1994, 263, 387-390) en aval du promoteur du cytomégalo-virus (CMV). Le vecteur Aprm8 comporte le gène de résistance à l'ampicilline. Le fragment de 2kb codant pour la calnexine humaine a été coupé à chaque extrémité par l'enzyme de restriction Spel, et inséré dans le site Hbaî du polylinker du vecteur
Aprm8.
Aprm8.CT:
Ce plasmide a été construit selon le même principe que le vecteur
Aprm8.2kb. La seule différence était que l'ADNc inséré en aval du promoteur viral fort CMV est celui codant pour la calnexine humaine délétée de sa queue cytoplasmique. Cet ADNc a été obtenu par PCR, puis coupé à chaque extrémité par l'enzyme de restriction EcoRI, et inséré dans le site EcoRI du polylinker du vecteur Aprm8.
Ce plasmide a été construit selon le même principe que le vecteur
Aprm8.2kb. La seule différence était que l'ADNc inséré en aval du promoteur viral fort CMV est celui codant pour la calnexine humaine délétée de sa queue cytoplasmique. Cet ADNc a été obtenu par PCR, puis coupé à chaque extrémité par l'enzyme de restriction EcoRI, et inséré dans le site EcoRI du polylinker du vecteur Aprm8.
2. Culture cellulaire
La lignée de cellules épithéliales LLCPK1 dérivées de tubules de rein de porc est cultivée en milieu DMEM (Dulbecco's minimum essential medium) supplémenté avec: 10% de sérum de veau foetal (Biological
Industries, testé pour mycoplasmes et virus, lot ne085712), du glucose 25 mM et de la L-glutamine 2mM. Elles sont maintenues à 37"C, en atmosphère humide en présence de 10% de CO2 (Pinto et al., 1982-1983).
La lignée de cellules épithéliales LLCPK1 dérivées de tubules de rein de porc est cultivée en milieu DMEM (Dulbecco's minimum essential medium) supplémenté avec: 10% de sérum de veau foetal (Biological
Industries, testé pour mycoplasmes et virus, lot ne085712), du glucose 25 mM et de la L-glutamine 2mM. Elles sont maintenues à 37"C, en atmosphère humide en présence de 10% de CO2 (Pinto et al., 1982-1983).
3. Transfections des cellules LLCPK1
Les cellules ont été transfectées avec la lipofectine (BRL) qui induit la formation de complexes lipides-ADN (Felgner et al., 1987). La transfection est effectuée sur des cellules en phase de croissance exponentielle qui ont été répliquées la veille à une densité d'environ 105 cellules par boîte de culture de 3 cm de diamètre. Le milieu de culture a été changé 2h avant la transfection. Les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de culture DMEM sans SVF. La lipofectine a été chauffée 2 mn à 40"C, puis incubée avec les plasmides (10,ut de lipofectine pour Spg de plasmide) dans de l'eau stérile pendant 15 mn à température ambiante. Les micelles ainsi formées ont été diluées dans du milieu DMEM sans SVF et mises en présence des cellules qui étaient maintenues à 37"C. Des cellules contrôles ont été incubées avec la même quantité de micelles de lopfectine sans plasmide. Le milieu de culture standard a été rétabli 6 h après.
Les cellules ont été transfectées avec la lipofectine (BRL) qui induit la formation de complexes lipides-ADN (Felgner et al., 1987). La transfection est effectuée sur des cellules en phase de croissance exponentielle qui ont été répliquées la veille à une densité d'environ 105 cellules par boîte de culture de 3 cm de diamètre. Le milieu de culture a été changé 2h avant la transfection. Les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu de culture DMEM sans SVF. La lipofectine a été chauffée 2 mn à 40"C, puis incubée avec les plasmides (10,ut de lipofectine pour Spg de plasmide) dans de l'eau stérile pendant 15 mn à température ambiante. Les micelles ainsi formées ont été diluées dans du milieu DMEM sans SVF et mises en présence des cellules qui étaient maintenues à 37"C. Des cellules contrôles ont été incubées avec la même quantité de micelles de lopfectine sans plasmide. Le milieu de culture standard a été rétabli 6 h après.
4. Etablissement des lignées stables de cellules LLCPK1
Après transfection par les plasmides pCMV/CFtag ou pCMV/CF(AF508)tag, la culture cellulaire a été poursuivie jusqu'à la préconfluence, puis repiquée à basse densité. Le G418 (Gibco BRL) a alors été ajouté à la concentration de 2 mg/ml. Cette concentration léthale minimum a été auparavant établie en cultivant des cellules non transfectées en présence de concentrations croissantes de G41 8. Les clones résistants ont été isolés par trypsination au moyen d'anneaux, puis cultivés chacun séparément, en gardant la pression de sélection par le
G 418 à 1 mg/ml.
Après transfection par les plasmides pCMV/CFtag ou pCMV/CF(AF508)tag, la culture cellulaire a été poursuivie jusqu'à la préconfluence, puis repiquée à basse densité. Le G418 (Gibco BRL) a alors été ajouté à la concentration de 2 mg/ml. Cette concentration léthale minimum a été auparavant établie en cultivant des cellules non transfectées en présence de concentrations croissantes de G41 8. Les clones résistants ont été isolés par trypsination au moyen d'anneaux, puis cultivés chacun séparément, en gardant la pression de sélection par le
G 418 à 1 mg/ml.
Un clone établi après transfection par le plasmide pCMV/CF(AF508)tag a été co-transfecté avec le plasmide PHA58, contenant le gène de résistance à l'hygromycine, et le plasmide Aprm8.2kb ou Aprm8.CT selon les conditions décrites précédemment. Des lignées stables ont été établies; la sélection des clones résistants a été obtenue dans du milieu de culture cellulaire contenant 2 mg/ml de G418, et 0.4 mg/ml d'hygromycine B (Boehringer Mannheim).
5. Test utilisant le fluoronhore 6-methoxv-N-3 sulfopropyl guinolinium (SPQ)
La fonction de canal anionique de la protéine CFTR étiquetée a été évaluée par un test basé sur la mesure de l'intensité de fluorescence du composé SPQ sensible à la concentration anionique du milieu (D. Rich et al. Nature 347: 358-363; 1990, Rommens et al, Proc. Acad. Sci. USA 88: 7500-7504; 1991).
La fonction de canal anionique de la protéine CFTR étiquetée a été évaluée par un test basé sur la mesure de l'intensité de fluorescence du composé SPQ sensible à la concentration anionique du milieu (D. Rich et al. Nature 347: 358-363; 1990, Rommens et al, Proc. Acad. Sci. USA 88: 7500-7504; 1991).
Le protocole expérimental est le suivant:
Le fluorophore 6-methoxy-N-3 - sulfopropyl quinolinium (SPQ) est chargé dans les cellules par un choc hypo-osmotique. Après une courte période de récupération des cellules, la conductance basale en anion est mesurée en exposant les cellules à une solution iodée, puis une solution de NO3, puis à nouveau la solution iodée. L'iode est utilisé plutôt que le chlore dans le test SPQ parce que l'extinction de fluorescence est plus sensible à l'addition d'iode qu'à celle du chlore (llsley and Verkman
Biochemistry 26: 1215-1219, 1987). Toutes les solutions sont additionnées de bumétanide 10 pM, qui est un inhibiteur de co-transporteur Na/KlCI.
Le fluorophore 6-methoxy-N-3 - sulfopropyl quinolinium (SPQ) est chargé dans les cellules par un choc hypo-osmotique. Après une courte période de récupération des cellules, la conductance basale en anion est mesurée en exposant les cellules à une solution iodée, puis une solution de NO3, puis à nouveau la solution iodée. L'iode est utilisé plutôt que le chlore dans le test SPQ parce que l'extinction de fluorescence est plus sensible à l'addition d'iode qu'à celle du chlore (llsley and Verkman
Biochemistry 26: 1215-1219, 1987). Toutes les solutions sont additionnées de bumétanide 10 pM, qui est un inhibiteur de co-transporteur Na/KlCI.
L'activité de canal anionique du CFTR a été testée par l'adjonction à la solution de NO3, du CPTAMPc 500 pM, de la forskolin 10 pM, et de
I'IBMX (iso-butyl-methyl-xanthine) 100 pM.
I'IBMX (iso-butyl-methyl-xanthine) 100 pM.
B. Etablissement de clones cellulaires stables exprimant la protéine CFTR normale ou mutée. étiquetée.
Les cellules LLCPK1 (ATCC n" Cl 101), dérivées de tubule proximal de rein de porc, ne présentent pas d'activité liée à un canal chlore dépendante de l'AMPc. C'est une des raisons de leur choix pour l'établissement de clones stables exprimant la protéine CFTR étiquetée.
Les constructions ont été réalisées avec l'ADNc codant pour la protéine
CFTR normale ou CFTR mutée (AF508), placé sous le contrôle du promoteur viral fort CMV. Les plasmides utilisés contiennent le gène de résistance à la néomycine, utilisé comme marqueur de sélection. Les cellules ont été transfectées par lipofection. Après 3 semaines de sélection en présence de G418, les clones ont été isolés par la technique des anneaux delonage.
CFTR normale ou CFTR mutée (AF508), placé sous le contrôle du promoteur viral fort CMV. Les plasmides utilisés contiennent le gène de résistance à la néomycine, utilisé comme marqueur de sélection. Les cellules ont été transfectées par lipofection. Après 3 semaines de sélection en présence de G418, les clones ont été isolés par la technique des anneaux delonage.
2 clones transfectés avec le plasmide comportant I'ADNc sauvage, et 3 clones transfectés avec le plasmide comportant l'ADNc (AF508), présentant 30 à 40% de cellules positives en immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal P5D4, spécifique de l'étiquette ont été sélectionnés.
Pour chaque construction, un des clones obtenus a été sous-cloné par dilution limite ; 9 sous-clones exprimant le CFTR sauvage étiqueté et 1 sous-clone exprimant le CFTR (AF508) étiqueté de façon homogène (plus de 90% de cellules positives) ont ainsi été obtenus. Ces clones ont gardé les caractéristiques des cellules épithéliales polarisées : ils poussent en monocouche, ont un aspect pavimenteux en microscopie à contraste de phase, et forment des dômes. L'expression des transgènes a été vérifiée par northern-blot et par immunoprécipitation de la protéine à l'aide de l'anticorps P5D4. La fonctionnalité du CFTR est étudiée par des tests utilisant le fluorophore SPQ, sensible aux flux de chlore (Rich DP. et al,
Nature, 347:358-363, 1990 et Rommens JM. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 88: 7500-7504,1991).
Nature, 347:358-363, 1990 et Rommens JM. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 88: 7500-7504,1991).
La distribution intracellulaire du CFTR est celle attendue : la protéine est localisée à la membrane apicale dans les clones transfectés avec la forme sauvage. La forme mutée (AF508) est exprimée dans le reticulum endoplasmique où elle est colocalisée avec la calnexine.
Ceci suggère que la protéine chaperon, calnexine, interagit avec la protéine CFTR (AF508) au niveau du reticulum endoplasmique. Cette interaction fait intervenir des chaines N-glycosylées immatures de la protéine CFTR, et serait responsable de la rétention de la protéine CFTR (AF508) dans le reticulum endoplasmique.
B. Recherche d'agents Pharmacoloaiques capables de restaurer le franspon apical de la protéine CFTR (AF508).
La mutation AF508 du gène cftr est de loin la plus fréquente chez les malades atteints de mucoviscidose, puisqu'elle représente environ 68% des mutations répertoriées. La protéine mutée est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE), ce qui empêche sa maturation, en particulier l'adjonction de certains sucres, et son adressage à la membrane apicale (revue dans Férec et al., Médecine/Sciences, 1994, 10, 631-639).
La fonctionnalité de la protéine CFTR (AF508) (canal chlore régulé par la phosphorylation) a été démontrée (Li et al., Nat. Genet., 1993, 3, 311-316).
II a aussi été montré qu'après deux jours d'incubation à 23"C, la protéine mutée est en partie localisée au pôle apical (Denning et al., Nature, 1992, 358, 761-764). Cependant, de telles conditions ne sont pas envisageables en thérapeutique clinique, il paraît donc intéressant de caractériser des agents pharmacologiques susceptibles de corriger ou de restaurer le transport de la protéine CFTR (AF508) du réticulum endoplasmique vers la surface cellulaire. De telles molécules si elles s'avèrent utilisables en clinique, seraient une alternative à la thérapie génique.
II a été montré que des protéines chaperones, en particulier la calnexine, interagissent avec la protéine CFTR (du508) imparfaitement glycosylée (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90,9480-9484), et pourraient être en partie ou totalement responsables de sa rétention au niveau du RE (revue dans Puchelle, Médecine/Sciences, 1994,10, 627629). La calnexine est une protéine chaperon impliquée dans le repliement des protéines en cours de maturation dans le Ré IN a été montré qu'elle co-immunoprécipite avec la protéine CFTR immature (Pind et al., J. Biol.
Chem. 1994, 269,12784-12788).
Deux stratégies différentes pour tenter de déplacer l'interaction calnexine/protéine CFTR (AF508) ont été envisagées.
1. Utilisation d'oligosaccharides compétiteurs de l'interaction calnexine/protéine CFTR immature.
L'interaction de la calnexine avec certaines protéines nouvellement synthétisées telles que l'hémaglutinine du virus inluenza et la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire est empêchée par les inhibiteurs des Nglycosylations (tunicamycine) et des glycosidases I et Il (catanospermine et 1 -deoxynojirimycine) (Hammond et al., 1994). Ceci montre le rôle des Nglycosylations dans les interactions calnexine/protéine nouvellement synthétisée. De telles molécules n'étant pas utilisables en thérapie à cause de leur toxicité, il a paru intéressant de tenter d'empêcher l'interaction entre les deux protéines en déplaçant les chaines N-glycosylées de la glycoprotéine CFTR(AF508) du site d'interaction avec la calnexine ; ceci en faisant compétition avec un carbohydrate de synthèse. La séquence glycosidique qui interagit avec la calnexine, est en effet un glucose directement relié à un mannose.
2. Utilisation d'une calnexine modifiée dominante négative .
La calnexine est une protéine trans-membranaire localisée dans le
RE. Elle possède un court domaine cytoplasmique, et un grand domaine intraluminal par lequel elle interagit avec les protéines immatures en cours de glycosylation. La surexpression d'une forme mutée de la calnexine au niveau du signal de rétention dans le RE, permettrait à la protéine CFTR mutée d'être adressée à la membrane plasmique. Cette forme mutée de la calnexine en interagissant avec la protéine immature, permettrait l'adressage jusqu'à la membrane plasmique du complexe formé entre la calnexine mutée et la protéine CFTR mutée complexe qui ne serait donc plus retenu au niveau du RE. Lorsqu'elle est surexprimée, cette protéine calnexine mutée agit donc comme un dominant négatif en déplaçant l'interaction de la calnexine endogène avec la protéine CFTR immature.
RE. Elle possède un court domaine cytoplasmique, et un grand domaine intraluminal par lequel elle interagit avec les protéines immatures en cours de glycosylation. La surexpression d'une forme mutée de la calnexine au niveau du signal de rétention dans le RE, permettrait à la protéine CFTR mutée d'être adressée à la membrane plasmique. Cette forme mutée de la calnexine en interagissant avec la protéine immature, permettrait l'adressage jusqu'à la membrane plasmique du complexe formé entre la calnexine mutée et la protéine CFTR mutée complexe qui ne serait donc plus retenu au niveau du RE. Lorsqu'elle est surexprimée, cette protéine calnexine mutée agit donc comme un dominant négatif en déplaçant l'interaction de la calnexine endogène avec la protéine CFTR immature.
L'effet de ce dominant négatif sur l'adressage de la protéine CFTR (AF508) étiquetée dans les clones de cellules LLCPK1 obtenus est en cours d'évaluation. Des expériences de transfections transitoires de la calnexine mutée sont réalisées, et des lignées stables doubles transfectantes (pour le CFTR (AF508) et pour la calnexine mutée) sont sélectionnées. Pour cela, un deuxième marqueur de sélection (Hygromycine R) est utilisé.
Claims (16)
1. Acide nucléique recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une séquence de nucléotides codant (séquence codante) pour la protéine CFTR normale,
- une séquence épitope localisée à l'extrémité 3' de la susdite séquence codante,
- une séquence promoteur fort capable de contrôler l'expression des susdites séquence codante et séquence épitope, lorsqu'elles sont intégrées dans une cellule déterminée.
2. Acide nucléique recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides codant pour la protéine CFTR normale est remplacée par une séquence de nucléotides codant pour la protéine CFTR mutée (séquence codante mutée).
3. Acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un marqueur de sélection.
4. Acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence épitope est reconnue de façon spécifique par un anticorps monoclonal.
5. Acide nucléique recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence épitope est la séquence codant pour la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV).
6. Acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le promoteur fort est un promoteur viral.
7. Acide nucléique recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus.
8. Acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le promoteur est spécifique d'un tissu, par exemple est constitué par le promoteur de la villine humaine.
9. Vecteur recombinant de clonage et d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Vecteur recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit des plasmides représentés aux figures 1 et 2.
11. Cellule recombinante eucaryote choisie parmi les cellules polarisées n'exprimant pas le gène cftr de façon endogène, caractérisée en ce qu'elle contient un acide nucléique recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 9 ou 10.
12. Cellule recombinante selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule épithéliale.
13. Lignée cellulaire stable de cellules recombinantes selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'une des lignées LLC.CFt6.1 ou LLC.A6.5 déposées à la CNCM sous les numéros I1780 et 1-1779.
14. Lignée cellulaire selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre une protéine calnexine tronquée, dépourvue de son signal de rétention.
15. Procédé pour déterminer l'effet d'une molécule donnée sur le transport de la protéine CFTR mutée AF508 à la membrane des cellules l'exprimant, comprenant:
- la mise en contact d'une molécule choisie avec la lignée cellulaire
LLC.A6.5 (CNCM n" 1-1779) dans des conditions d'interaction appropriées,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée AF508 à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée LLC.A6.5.
16. Procédé pour déterminer l'effet d'une molécule donnée sur l'interaction entre la calnexine et la protéine CFTR mutée AF508, comprenant:
- la mise en contact d'une molécule choisie avec une lignée cellulaire selon la revendication 14,
- la détection de la présence de la protéine CFTR mutée AF508, à la membrane cellulaire apicale des cellules de la lignée.
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