FR2810673A1 - Dynamine mitochondriale humaine msp1 et son utilisation en therapeutique - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet une protéine humaine appartenant à la famille des dynamines, appelée MSP1, les formes mutées de ladite protéine, en particulier celles responsables de l'atrophie optique dominante, ainsi que les séquences nucléotidiques codant ladite protéine et ses formes mutées. L'invention concerne également les vecteurs capables d'exprimer ladite protéine et/ ou ses formes mutées dans tout type de cellules hôtes, ainsi que les cellules transformées par lesdits vecteurs et les procédés les utilisant. L'invention a enfin pour objet des procédés d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine selon l'invention et de ses mutants et l'utilisation desdits composés pour la recherche et la fabrication de substances actives utiles en thérapie, en particulier pour la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante.
Description
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DYNAMINE MITOCHONDRIALE HUMAINE MSP1
ET SON UTILISATION EN THÉRAPEUTIQUE La présente invention a pour objet une nouvelle protéine de la famille des dynamines, appelée MSP1, et ses formes mutées, les ADNs natifs et mutés codant ces protéines, et l'utilisation de ces protéines pour la recherche et la fabrication de substances actives utiles en thérapie.
ET SON UTILISATION EN THÉRAPEUTIQUE La présente invention a pour objet une nouvelle protéine de la famille des dynamines, appelée MSP1, et ses formes mutées, les ADNs natifs et mutés codant ces protéines, et l'utilisation de ces protéines pour la recherche et la fabrication de substances actives utiles en thérapie.
De nombreuses dynamines primaires et protéines apparentées ont été identifiées durant ces dernières années chez les eucaryotes. Il semble établi que ces protéines ont de nombreux représentants dans tous les organismes, de la levure à l'homme, et qu'elles sont localisées à différents sites cellulaires où elles remplissent des fonctions bien particulières (van der Bliek A. M., 1999, Trends Cell Biol., 9, pp. 96-102).
Toutes sont de grandes GTPases (80 à 100 kDa), possédant outre le domaine catalytique GTPase, un domaine central caractéristique des dynamines et un ou deux domaines d'assemblage (domaines coiled-coil). Certaines dynamines comme Mspl/MGM1, se distinguent en outre par la présence d'un domaine amino-terminal fortement basique.
On peut classer les dynamines en trois groupes, selon les fonctions qui ont pu leur être attribuées et/ou selon leur similitude structurale.
Dans le premier groupe (famille des dynamines conventionnelles) on trouve les dynamines 1 et 2 des mammifères, la dynamine Vpslp de la levure bourgeonnante (Nothwehr S.F.et al., 1995, J. Cell. Biol., 129, pp. 35-46 ; J.H. et al., 1990, Cell, 61, pp. 1063-74), la dynamine dyn-1du nématode C. elegans (Clark S. G. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 10438-43). Ces protéines sont décrites comme jouant un rôle dans la formation des vésicules et le transport.
Le second groupe (famille Dnml, Drpl) comprend les dynamines Dnmlp de la levure à bourgeons, DRP-1 de C. elegans et la Drp1des mammifères (Imoto M. et al., 1998, J.
Cell Sci., 111, pp. 1341-49; Kamimoto T., 1998, J. Biol. Chem., 273, pp. 1044-51; Yoon Y. et al., 1998, J. Cell Biol., 140, pp. 779-93). Ce sont des protéines cytoplasmiques dont les fonctions sont impliquées dans le trafic vésiculaire et dans le contrôle de la distribution des mitochondries.
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Le troisième groupe (famille Mspl/MGM1) est formé uniquement des protéines MGM1 et Mspl qui ont été isolées dans deux levures divergentes, respectivement Saccharomyces cerevisiae (Jones B. and Fangman W., 1992, Genes and Dev., 6, pp. 380-389) et Schizosaccharomyces pombe (Pelloquin L. et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comun. 251, pp. 720-726 ; L. et al., 1999, J. Cell Sci., 112, pp. 4151-61). MGM1 et Msplsont des dynamines mitochondriales indispensables au maintien de l'ADN mitochondrial et à l'organisation du réseau mitochondrial.
Chez l'homme, seulement deux familles de dynamines ont été décrites. Celle des dynamines conventionnelles, DYN1 et DYN2 impliquées dans les processus d'endocytose, et celle de la famille Drpl impliquée dans la voie sécrétrice (Imoto M. et al., 1998, J. Cell Sci., 111, pp. 1341-49) et dans la maintenance du réseau mitochondrial (Smirnova E. et al.,1998, J. Cell Biol., 143, pp. 351-8).
La présente invention a pour objet une nouvelle dynamine mitochondriale humaine appelée MSP1, orthologue à Mspl et MGM1 des levures, ainsi que la séquence d'ADN codant pour ladite dynamine appelée MSP1/OPA1.
De manière inattendue, il a été trouvé que des formes mutées de MSP1 sont impliquées dans une pathologie humaine d'origine génétique, à savoir l'atrophie optique dominante.
L'atrophie optique dominante, notée OPA1 selon la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, entrée 165500) est la plus fréquente des neuropathies optiques héréditaires non-syndromiques. Elle se manifeste chez un individu sur 50 000 et conduit dans de nombreux cas à la cécité légale (acuité visuelle inférieure à 1/20ème).
Cette maladie progressive et irréversible est caractérisée par une perte de l'acuité visuelle dès la jeune enfance, une anomalie du sens visuel chromatique (dyschromatopsie) acquise et une lacune de perception dans le champ visuel se projetant à la fois sur le point de fixation et sur la tâche aveugle (scotome centrocoecal) avec maintien du champ visuel périphérique (Kjer P., 1959, Acta Ophthalmol. Scand., 37, suppl.54, pp. 1-146). Malgré le fait que les études cytologiques ont mis en évidence chez tous les cas pathologiques la disparition des cellules ganglionnaires de la rétine, les variations phénotypiques sont importantes d'un malade à l'autre. Des études ont été menées pour décrire les manifestations physiologiques de la maladie et comprendre son développement (Brown J . et al., 1997, Arch. Ophthalmol., 115, pp. 95-99). Malheureusement, seuls les symptômes cliniques en sont connus et les mécanismes biochimiques et cellulaires de l'OPAl n'ont pu à ce jour être mis en évidence. En particulier rien n'est connu du gène ou de la protéine responsable de la dégénérescence cellulaire, ni de leur structure, ni de leur fonction, ou de leur mode d'action. Aucun traitement des symptômes de la maladie n'a pu être mis au point jusqu'à présent.
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Une démarche pour élucider les mécanismes responsables de cette maladie génétique et y porter remède est d'en rechercher les origines génétiques. Par analogie avec la Neuropathie Optique Héréditaire de Leber (LHON) dont les symptômes sont comparables à ceux de l'OPAl, l'hypothèse d'une implication des mitochondries a été formulée. Des travaux ont montré que dans le cas de la pathologie LHON, des mutations particulières de l'ADN mitochondrial pouvaient provoquer la dégénérescence du nerf optique (Howell N., 1997, J. Bioenerg. Biomembr., 29, pp. 165-173). Dans le cas de l'OPAl, la région 3q28-q29 du chromosome 3 a été proposée pour porter le locus responsable de cette pathologie (Lunkes A.et al., 1995, Am. J. Hum. Genet., 57, pp. 968-970), En fin de compte, jusqu'à présent le gène impliqué dans l'atrophie optique dominante n'a pas été identifié. La présente invention montre que des séquences d'ADN correspondant au gène MSP1 portent des mutations qui sont à l'origine de l'atrophie optique dominante. Ces mutations sont décrites ainsi que les protéines correspondantes, formes mutées de la dynamine MSP1.
Ainsi, aucune hypothèse de travail ne permettait jusqu'à présent d'incriminer la protéine particulière responsable de l'apparition des symptômes de l'OPAl. De même, aucune pathologie n'avait à ce jour été associée à un dysfonctionnement lié à une dynamine. De manière inattendue, la présente invention a su établir une relation directe entre une rétinopathie et la dynamine mitochondriale MSP 1. Il devient de ce fait possible de disposer d'outils biochimiques et génétiques utiles à la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante.
DESCRIPTION : La présente invention a pour objet une protéine humaine appartenant à la famille des dynamines, les formes mutées de ladite protéine ainsi que les séquences nucléotidiques codant ladite protéine et ses formes mutées. L'invention concerne également les vecteurs capables d'exprimer ladite protéine et/ou ses formes mutées dans tout type de cellules hôtes, ainsi que les cellules transformées par lesdits vecteurs et les procédés les utilisant.
Enfin l'invention a pour objet des procédés d'identification de composés biologiques ou pharmacologiques modulant l'activité de la protéine selon l'invention et de ses mutants et l'utilisation desdits composés à des fins thérapeutiques.
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La présente invention a pour objet un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N 1, ou une séquence homologue de ladite SEQ ID N 1, ou un fragment biologiquement actif de ladite SEQ ID N 1, ou de ses séquences homologues, ledit polypeptide étant désigné par MSP1.
La séquence SEQ ID N 1, est la séquence d'acides aminés de MSP1 identifiée chez l'humain.
Par polypeptide homologue, on entend tout polypeptide résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID N 1, c'est-à-dire mutation, délétion, addition, substitution et/ou modification chimique d'au moins un acide aminé.
Lesdits polypeptides homologues présentent préférentiellement une homologie de séquence supérieure à 80%, avec la séquence SEQ ID N 1, complète.
Lesdits polypeptides homologues ou les fragments polypeptidiques de la séquence SEQ ID N 1, présentent des propriétés biologiques identiques ou analogues aux propriétés biologiques du polypeptide de séquence SEQ ID N 1, La présente invention a également pour objet un polypeptide homologue du polypeptide MSP1 et s'en distinguant par le fait qu'il porte une ou plusieurs mutations induisant une modification de l'activité biologique du polypeptide MSP1. En particulier ces polypeptides mutés peuvent être par exemple MSPl-ml représenté par SEQ ID N 3, ou MSPl-m2 représenté par SEQ ID N 4, ou MSPl-m3 représenté par SEQ ID N 5, ou encore MSPl-m4 représenté par SEQ ID N 6. Les formes mutées de MSP1 sont désignées ensemble MSP1-m.
La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N 2 ou une séquence homologue de ladite SEQ ID N 2, ou un fragment de ladite SEQ ID N 2 et codant pour un polypeptide selon l'invention ou la séquence complémentaire desdites séquences nucléotidiques.
La séquence SEQ ID N 2 est la séquence d'ADNc (ADN complémentaire) comprenant la phase codante, ou phase de lecture, de la protéine MSP1 identifiée chez l'humain.
Par séquence nucléotidique "homologue", on entend toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide homologue de MSP1 tel que défini précédemment, c'est-à-dire une séquence résultant d'une modification de la séquence SEQ ID N 2, notamment par mutation, délétion, addition ou substitution d'au moins un nucléotide. Sont en particulier comprises les séquences déduites de la séquence SEQ ID N 2 par dégénérescence du code génétique.
Une telle séquence homologue présente préférentiellement une homologie supérieure à 70%, avec la séquence SEQ ID N 2.
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La séquence nucléotidique selon l'invention comprend entre autres les séquences homologues de SEQ ID N 2 portant une mutation qui affecte l'activité biologique du polypeptide MSP1 et codant pour la séquence d'acides aminés d'un polypeptide MSPl-m selon l'invention. En particulier une telle séquence peut être SEQ ID N 7 codant le polypeptide MSPl-ml, ou SEQ ID N 8 codant le polypeptide MSP1-m2, ou SEQ ID N 9 codant le polypeptide MSPl-m3, ou SEQ ID N 10 codant le polypeptide MSPl-m4.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour la production d'une protéine ou d'un fragment de protéine recombinante MSP1 ou MSPl-m selon l'invention, selon les techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier.
Un système efficace de production d'une protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'invention concerne les vecteurs de clônage et d'expression contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, et les cellules hôtes transfectées (ou transformées) par ces vecteurs.
Le vecteur peut comporter un promoteur, et des signaux d'initiation et de terminaison de la transcription et de la traduction. Il peut comprendre un ou plusieurs marqueurs de sélection selon les besoins. Il peut être intégré dans la cellule et éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs de réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou dans des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être intégrés dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple l'électroporation.
De tels vecteurs d'intérêt sont par exemple les plasmides des familles pBlueScript, pREP1, pCDNA ou pRK171.
Ces vecteurs peuvent être utilisés tels quels directement pour la synthèse in vitro du polypeptide selon l'invention ou introduits dans une cellule hôte.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, dont les levures, les bactéries, les cellules de mammifères telles que les cellules Hela humaines.
Ces cellules transformées peuvent être obtenues par la transfection d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
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Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Un mode de réalisation de la présente invention consiste en un procédé de fabrication dudit polypeptide, caractérisé en ce que l'on cultive les cellules transfectées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. En particulier, il est utile de pouvoir détecter et produire de manière ectopique un polypeptide selon l'invention.
L'association de la phase codante du polypeptide selon l'invention avec la phase codante d'une protéine étiquette permet d'exprimer dans un hôte adapté une protéine chimère composée du polypeptide selon l'invention et de ladite protéine étiquette.
Une fonction de ladite protéine étiquette peut être sa reconnaissance par des anticorps spécifiques. La présence de la protéine étiquette est alors le signe de la présence du polypeptide d'intérêt. Une telle étiquette est qualifiée d'étiquette antigénique.
La présente invention a donc pour objet un procédé permettant de détecter le polypeptide MSP1 ou MSPl-m consistant à: - associer la phase codante du polypeptide MSP1 ou MSPl-m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette antigénique dans une cellule hôte; - exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi; - mettre en contact ledit hôte avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ladite étiquette; - détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSP1 ou MSP1-m.
Une telle étiquette antigénique est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un anticorps spécifique et détectable de ladite protéine. Elle peut être par exemple la protéine verte fluorescente (Green Fluoresccent Protein), l'épitope Myc, l'épitope Haemagglutinine. La cellule hôte peut être n'importe quelle cellule hôte selon l'invention. L'anticorps associé à la protéine chimère obtenue par le procédé selon l'invention peut être détectée par tout moyen à la dispostion de l'homme de l' art.
Il est également intéressant de produire la protéine d'intérêt pure et dans des quantités utilisables industriellement, c'est-à-dire de l'ordre du mg. Dans ce cas on peut utiliser une protéine étiquette dont la fonction est de permettre la fixation spécifique de la protéine chimère étiquette+polypeptide sur un support ayant une affinité spécifique de l'étiquette choisie. Une telle étiquette est alors qualifiée d'étiquette d'affinité.
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La présente invention a donc aussi pour objet un procédé permettant de purifier le polypeptide MSP1 ou MSPl-m consistant à: - associer la phase codante du polypeptide MSP1 ou MSPl-m selon l'invention à la phase codante d'une étiquette choisi pour son affinité à un support, - exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans l'hôte choisi, - obtenir un extrait par lyse de l'hôte, - mettre en contact l'extrait avec le support choisi, - récupérer le polypeptide selon l'invention par élution.
Une étiquette d'affinité est une protéine choisie de telle sorte que soient connus et disponibles la séquence codante, et au moins un support ayant une affinité spécifique avec ladite protéine. Elle peut être par exemple, la Glutation S-transférase, la protéine liante du maltose (Maltose Binding Protein), des polymères d'histidines. Le support d'affinité spécifique peut être par exemple constitué de microbilles d'un métal tel que le nickel fixant les héxamères d'histidine.
Les procédés utilisant une étiquette antigénique et une étiquette d'affinité peuvent bien entendu être combinés. Il suffit pour cela d'associer à la phase codante de la protéine d'intérêt la phase codante d'une étiquette antigénique suivie de la phase codante d'une étiquette d'affinité. Les procédés seront mis en oeuvre successivement, comme décrit précédemment pour détecter et/ou purifier la protéine d'intérêt.
L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, obtenus à partir d'un polypeptide selon l'invention administré à un animal, et capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention. L'invention a en outre pour objet l'utilisation de ces anticorps pour la purification ou la détection d'un polypeptide MSP1ou MSPl-m dans un échantillon biologique.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, pp. 495-497).
Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, ou également se présenter sous la forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement utiles pour détecter la présence de MSP1ou de MSPl-m.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection immunologique de MSP1 ou MSPl-m dans un échantillon biologique comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps selon l'invention, détectable; - détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence du polypeptide MSP1 ou MSPl-m.
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Par "anticorps détectable", on entend soit un anticorps marqué par un groupement détectable, tel que par exemple un groupement radioactif, enzymatique, fluorogène ou fluorescent, soit un anticorps auquel se lie un autre anticorps lui-même marqué de manière détectable.
Par échantillon biologique on entend toute cellule animale y compris humaine, normale ou transformée, tout micro-organisme normal ou transformé, et de manière générale tout tissus comprenant de telles cellules.
Les anticorps selon l'invention peuvent ainsi permettre d'évaluer la localisation cellulaire, le niveau d'expression ou l'activité des protéines MSP1 et MSPl-m, ce qui peut être une indication importante pour la détection de l'atrophie optique dominante OPA1.
L'invention a également pour objet un procédé de détection de l'activité GTPase de MSP1 ou de MSPl-m dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à: - mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps détectable selon l'invention - purifier le complexe anticorps-antigène, - mettre ce complexe en présence de substrat GTP (guanosine triphosphate), - doser le GDP (guanosine diphosphate) formé, indicateur de l'activité GTPase de MSP1 ou MSPl-m.
Les échantillons biologiques susceptibles d'être ainsi testés sont notamment des extraits de cellules sanguines humaines, ou d'autres extraits tissulaires. Un échantillon biologique peut aussi être constitué de cellules normales ou transformées par un vecteur selon l'invention, dans lesquelles l'activité GTPase due à MSP1 ou MSPl-m doit être mesurée. La mesure de l'activité GTPase sur de telles cellules en présence de différents composés biologiques ou pharmacologiques permet de mettre en évidence l'éventuel caractère inhibiteur ou activateur desdits composés.
La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés susceptibles de moduler l'activité de MSP1 ou de MSPl-m, au cours duquel on met en contact lesdits composés avec lesdits polypeptides MSP1 ou MSPl-m et l'on évalue le taux de modification de l'activité GTPase de ces polypeptides. Par "modulation" de l'activité, on entend stimulation ou inhibition à des degrés variés incluant les variations juste perceptibles par les moyens à la disposition de l'homme de l'art, jusqu'à des variations importantes pouvant aller jusqu'à la disparition totale de l'activité. On peut en particulier rechercher par ledit procédé des molécules ayant un effet stimulateur de l'activité de MSP1, ou des molécules ayant une action inhibitrice de l'activité de MSPl-m, ou inversement. Les composés modulateurs obtenus sont en principe de bons candidats en tant que principe actif d'un médicament en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
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L'invention a par ailleurs pour objet un procédé de criblage de protéines susceptibles de posséder une activité pharmacologique, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur un polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologique, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule transformée selon l'invention.
Le polypeptide MSP1 selon l'invention peut être particulièrement utile pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles affectant la structure du réseau mitochondrial. Un tel médicament peut être employé dans le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier les neuropathies optiques et préférentiellement l'OPAl. Les polypeptides MSP1-m selon l'invention pourraient aussi servir à la mise au point d'un traitement anti-prolifératif utile pour soigner les dysfonctionnement de la division cellulaire, tels que le cancer.
Enfin, un vecteur plasmidique selon l'invention portant toute séquence codante pour MSP1 ou MSPl-m peut être utilisé pour la mise au point d'un traitement de l'atrophie optique dominante par thérapie génique.
Liste des figures: Figure 1: Fig 1(A): Organisation et comparaison de la structure primaire de MSP1 avec celle des protéines Mspl et MGM1 des levures Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae.
Fig 1(B): Pourcentage d'identité entre les autres représentants de cette famille de dynamines.
Figure 2: Localisation chromosomique du gène MSP1/OPA1 par hybridation fluorescence in situ (FISH) montrant le double marquage unique de la région 3q28-29.
Figure 3: Séparation sur gel SDS-PAGE et exposition sur film radiosensible.
- échantillon IVT: transcription et traduction in vitro de la protéine MSP1; - échantillon P: immuno-précipitation de la protéine par des anticorps spécifiques.
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Figure 4: Production de la protéine MSP1 étiquetée Ha-6his dans la bactérie E. coli (EX: extrait total) et purification sur colonne de nickel (EL: éluat de la colonne de nickel).
Figure 5: Production de la protéine MSP1 dans les levures Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité GTPase en présence ou en l'absence de composés A et B testés pour leur activité éventuelle. Les échantillons sont les suivants: - Tem: immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant
MSP1 dosé seul, - +A: immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant
MSP1 dosé en présence du produit A, - +B : de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant
MSP1 dosé en présence du produit B, - Con : réalisé sur une souche de S. pombe ne produisant pas MSP1.
MSP1 dosé seul, - +A: immuno-précipité de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant
MSP1 dosé en présence du produit A, - +B : de MSP1 réalisé sur une souche de S. pombe surproduisant
MSP1 dosé en présence du produit B, - Con : réalisé sur une souche de S. pombe ne produisant pas MSP1.
Figure 6: Localisation cellulaire de la protéine MSP1 dans des cellules HeLa.
Fig 6(A-1): sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSP1-Ha-6his en utilisant des anticorps anti-Haemagglutinine, Fig 6(B-1): sur des cellules non transfectées en utilisant des anticorps spécifiques de MSP1, Fig 6(A-2): sur des cellules transfectées par le plasmide pCDNA-MSPl-Ha-6his en utilisant l'anticorps anti-hsp60- LK2, spécifique d'une protéine mitochondriale, Fig 6(B-2): sur des cellules non transfectées en utilisant les mêmes anticorps LK2 que Fig 6(A-2).
Les 4 échantillons ont été préparés selon le même mode opératoire. La localisation de MSP1 est visualisée sur les clichés A-1 et B-l. Le réseau mitochondrial est révélé sur les clichés A-2 et B-2.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. Ils montrent qu'il est possible de synthétiser la protéine selon l'invention in vitro, comme in vivo dans tous les organismes modèles classiques, et de purifier, doser ou localiser ladite protéine ou ses mutants.
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EXEMPLE 1: Identification des séquences nucléotidiques et protéiques.
La recherche d'un orthologue humain des dynamines Mspl/MGM1 a été réalisée dans la banque de données GENBANK. Une séquence d'ADNc d'une longueur de 5 821 pb (code d'accès AB011139, Nagase T. et al., 1998, DNA res., 5, pp. 31-39) code pour une protéine ayant 19 % d'identité avec Mspl et 17 % d'identité avec MGM1. Ceci représente une homologie significative étant donné que le degré d'identité avec les autres dynamines est de l'ordre de 10 à 12 % seulement. Par ailleurs l'organisation de cette protéine est fortement analogue à celle de Msplet MGM1, en particulier par la présence d'un domaine amino-terminal basique caractéristique des protéines importées dans les mitochondries. Ce clone a donc été retenu comme codant pour la dynamine mitochondriale MSP1 orthologue à Msplet MGM1 des levures (Figure 1).
EXEMPLE 2: Caractérisation du polypeptide MSP1.
La protéine codée par le fragment d'ADNc de 2880 pb ainsi choisi est constituée de 960 acides aminés (SEQ ID N 1). L'étude de sa structure primaire montre que la protéine comporte un domaine amino-terminal très basique (acides aminés 1 à 120), un premier domaine d'assemblage (acides aminés 121 à 259), un domaine catalytique GTPase (acides aminés 260 à 505), un domaine central de type dynamine (acides aminés 505 à 787), et un deuxième domaine d'assemblage dans la zone carboxy-terminale. Ces domaines caractéristiques se retrouvent également dans les dynamines de levures Mspl et MGM1.
Les ressemblances dans la séquence et dans la structure entre le peptide humain décrit et les protéines de levures Mspl et MGM1 concourent à montrer que le fragment ABOI 1 139 d'ADNc code pour l'orthologue humain de Mspl/MGMl des levures, qui sera appelée MSP1.
EXEMPLE 3: Caractérisation du gène MSP1/OPA1 et localisation chromosomique.
Le gène MSP1/OPA1 a une taille supérieure à 69kb et est composé de 29 exons avec des liaisons introns-exons suivant la règle AG-GT. Il code pour un ARN messager dont la séquence codante complète est présentée sous la forme de l'ADN complémentaire et décrite par SEQ ID N 2. Le gène MSP1/OPA1 a été localisé par hybridation fluorescente in situ (FISH) en utilisant les méthodes conventionnelles avec comme sonde l'ADNc complet incluant le cadre ouvert de lecture de la protéine MSP1 et l'extrémité 3' non
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traduite. Les résultats montrent clairement un double marquage unique dans la région 3q28-29. (Figure 2) EXEMPLE 4: Relation entre le gène MSPIIOPAI et la pathologie OPA1.
La concordance entre la localisation du locus OPA1 et la localisation chromosomique du gène MSP1/OPA1 en 3q28-29 faisait, de MSP1 un gène candidat pour l'atrophie optique dominante OPA1. A cette région du chromosome 3 sont associées plusieurs maladies héréditaires, néanmoins aucune anomalie caryotypique caractéristique n'avait été décrite à ce jour. Le séquençage du gène MSP1/OPA1 à partir d'ADN purifié a été réalisé sur des cellules sanguines de personnes atteintes d'atrophie optique dominante. Il a permis d'établir de manière inattendue, que les malades atteints d'OPAl portaient une mutation du gène MSP1OPA1.
EXEMPLE 5 Séquences d'ADNc MSP1 mutantes impliquées dans la pathologie OPA1.
Plusieurs mutations ont été identifiées: La première mutation, notée ml, est située dans l'exon 9 faisant partie du domaine catalytique GTPase. C'est une mutation non-sens où la base G, en position 899 du cDNA est remplacée par A (c.899G>A), (SEQ ID No 7) ce qui conduit au remplacement de la glycine par l'acide glutamique à la position 300 dans la protéine MSP1 correspondante (SEQ ID No 3).
La deuxième mutation, notée m2, concerne le dernier nucléotide de l' i ntron 9, supprimant le site d'excision de l'intron (IVS9-1G>A). Cette mutation a pour effet de ne pas reconnaître le début de l'exon 10 et de sauter directement au niveau de l'exon 11 sans décalage du cadre de lecture (SEQ ID No8), ce qui induit une délétion de 27 acides aminés dans la protéine (SEQ ID No4).
La troisième mutation, notée m3 a été trouvée dans l'exon 27. C'est une délétion de 4 paires de bases T, T, A et G en position 2708 de l'ADNc, notée c.2708delTTAG (SEQ ID No 9), qui se traduit par la substitution de la valine par la glycine en position 903, de l'arginine par l'asparagine en position 904 et par un codon stop anticipé au niveau du codon 905 (SEQ ID No 5).
Enfin la quatrième mutation, notée m4, est également une délétion de 4 paires de bases. Il s'agit des bases AGTT en position 2823 de l'ADNc (c.2823delAGTT) (SEQ ID No 10),
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qui se traduit par le remplacement des 19 derniers acides aminés de la partie carboxy terminale de la protéine, par 24 nouveaux acides aminés: dont la séquence est la suivante :NH2- EKFKKNLMLSLKLFIRRNKLKSYS-COOH (SEQ ID No 6).
L'ensemble de ces mutations est de nature à affecter la fonction de MSP1. La glycine en position 300 correspond à un motif conservé du domaine catalytique GTPase des dynamines. La mutation IVS9-1G>A aboutit à la délétion de 27 acides aminés dans le domaine GTPase. La mutation c.2708delTTAG code pour une protéine tronquée de 56 acides aminés en C-terminal. Enfin la protéine issue du gène portant la délétion c2823delTTAG voit ses 19 derniers acides aminés substitués. En résumé, deux mutations touchent le site catalytique GTPase à proprement parler et deux mutations affectent le domaine d'assemblage carboxy-terminal.
EXEMPLE 6: Production de la protéine MSP1 in vitro et reconnaissance par des anticorps spécifiques. a) Origine moléculaire de l'ADN correspondant à la phase de lecture de MSP1: La phase de lecture de MSP1 a été obtenue par purification de l'ARN total (kit QIAGEN) prélevé sur des cellules sanguines chez des sujets sains. Une réaction de transcriptase réverse (New England Biolabs, NEB) a été réalisée en utilisant l'amorce MSP1-3'. La phase de lecture a été ensuite amplifiée par PCR en utilisant les amorces MSPl-3' et MSP1-5' décrites ci-après et la TAQ polymerase (NEB) dans des conditions standards d'amplification.
La séquence de l'amorce MSP1-3' est : 5'-CCTGTCGGATCCTTATTTCTCCTGATGAAGAGCTTCAATGAAAGC-3' La séquence de l'amorce MSP1-5' est : 5' -CTCCCCTCGAG-CATATGTGGCGACTACGTCGGGCCGCTGTGGCCT-3' b) Construction du vecteur d'expression pBS-MSPl Le fragment d'ADN obtenu après amplification par PCR de MSP1 et le plasmide pBlueScript (Stratagene Cloning System) ont été digérés par les enzymes de restriction Xhol et BamHl (NEB), purifiés sur gel d'agarose puis ligués 12 heures. Les produits de ligation sont transformés dans E. coli DH5 (supE44 hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relA1). Les clones pBS-MSP1 ainsi obtenus sont analysés par profil de restriction de l'ADN plasmidique purifié selon le protocole de MiniPrep (Qiagen). Pour confirmer l'absence de mutation liée à la réaction d'amplification, le fragment d'ADN correspondant à la phase de lecture de MSP1 a été séquence dans son intégralité (MilGen). c) Production in vitro de la protéine MSP1 et reconnaissance par les anticorps anti-MSP1.
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Une réaction de transcription couplée à la traduction a été réalisée en utilisant 1 microgr du clone pBS-MSP1, le kit TNT-T7 Quick Transcription-Translation Coupled (Promega) et 5 microl de L-méthionine 35S (Amersham), le tout incubé à 30 C pendant une heure. Une réaction d'immuno-précipitation est ensuite réalisée dans du tampon de lyse LB (Lyse Buffer) contenant 50mM de Tris pH7. 4, 250mM de NaCl, 50mM fluorure de sodium, 5mMd'EDTA, 0,1 mM d'orthovanadate de sodium, 1mM de dithiotréitol (DTT), 0.1 % de solution Triton X100, 1 microgr/ml de PMSF, 10 microgr/ml de leupeptine et 10 microgr/ml d'inhibiteur de la trypsine du soja. Puis, le produit de la réaction de transcription-traduction obtenu est séparé en deux fractions: 1/5ème du volume réactionnel est conservé pour servir de témoin, tandis que les 4/5èmes restant sont repris et sont additionnés de 5 microl d'anticorps anti-MSP1 (Eurogentec) et incubés pendant deux heures à 4 C, puis incubés en présence de 20 microl de protéine A-Sépharose (Pharmacia) durant une heure supplémentaire à 4 C. Après 3 lavages par du tampon LB, l'échantillon et le témoin sont séparés sur gel SDS-PAGE (PolyAcrylamine Gel Electrophorèse) puis exposés sur film radio-sensibles (Kodak) (Voir la figure 3).
EXEMPLE 7 Production de MSP1 dans la bactérie E. coli et purification sur colonne d'affinité.
Cet exemple concerne la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine (Ha) + 6 histidines, produite dans la bactérie E. coli et purifiée sur colonne d'affinité au nickel.
A partir du plasmide précédent pBS-MSP1 une réaction d'amplification par PCR a été réalisée en utilisant les amorces suivantes: MSPl-3'bis et MSP1-PST 1 La séquence de l'amorce MSPl-3'bis est : 5'-CCTGTCGGATCCTTAGCGGCCGCGCTCCTGATGAAGAGCTTC-3' La séquence de l'amorce MSP1-PST1 est : 5'-CAGCAATGGGATGCAGCTAT-3' Le fragment amplifié a été digéré par les enzymes Pst1et BamHl (NEB) et sous-cloné dans le plasmide pBS-MSP1 digéré également par Pstl et BamHl. Après vérification de la séquence un fragment d'ADN codant pour 2 exemplaires de l'épitope Haemagglutinine associés à 6 exemplaires d'histidine (McGowan et Russel, 1993, EMBO Journal, vol. 12, pp. 75-85) a été inséré en phase entre les sites Notl et BamHl à l'extrémité de la phase codante de MSP1, créant le plasmide pBS-MSPl-Ha-6his. Le fragment codant pour la protéine chimère MSPl-Ha+6his a été sous-cloné dans le vecteur pRK171 (Invitrogen) entre les sites Ndel et BamHl. Le plasmide résultant pRK171-MSPl-Ha-6his a été transformé dans la souche E. coli BL21DE3 (hsdS gal(lclts857 ind 1 Sam7 nin5 lacUV5T7 genel)). Après pré-culture et culture jusqu'à une densité optique de 0,1à 600nm dans du milieu Luria Broth Ampicilline à 100microgr./ml (Sigma), l'activité productrice
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bactérienne est induite par addition de 100microM d'IPTG (Isopropylthio-beta-Dgalactoside, Sigma) pendant 3 heures. Les cellules sont alors récupérées par centrifugation et lysées dans le tampon suivant: 50mM Na2HP04 pH8, lOmM Tris pH8, 250mM NaCl, 50mM NaF, O,lmM NaVn04, 5mM PMSF, 0,05% 2-mercaptoethanol, 0,1% Tween 20, lOmg/ml lysozyme, Img/ml DNAse (Sigma), pendant 1 heure à 37 C. Le mélange réactionnel est ensuite centrifugé à 15 000g pendant 5 minutes. Le surnageant est mélangé avec des billes de nickel (Ni-NTA, Sigma) préconditionnées dans du chlorure de guanidium à pH5,5 puis pH8, et lavées 3 fois dans 50mM Na2HP04 à pH8. Puis le mélange billes-surnageant est chargé dans un tube (ou colonne) et est incubé 1 heure à 4 C. Les billes sont lavées dans le tampon de départ (dépourvu de lysozyme et DNAse), puis dans 50mM de solution Na2HP04, pH6. Les billes sont éluées 3 fois par 250mM d'imidazole à pH 7,2. On fait alors migrer sur gel SDS-PAGE, d'une part une fraction de la solution chargée sur la colonne et contenant l'extrait total (EX) et d'autre part l'éluat contenant la protéine déplacée de l'étiquette par l'imidazole (EL). Le gel est fixé et coloré au Bleu de Commassie (Figure 4).
EXEMPLE 8: Production de MSP1 dans la levure Schizosaccharomyces pombe et dosage de son activité GTPase.
La phase de lecture codant pour la protéine MSP1 a été clonée à partir du plasmide pBSMSP1 tel que décrit à l'exemple 6 dans le vecteur pREP1 (K. Maundrell, J. Biol. Chem., 1990,265, pp. 10857-64) entre les sites Ndel et BamHl. Ce vecteur contient le promoteur nmtl inductible par l'absence de thiamine. Le plasmide pREPl-MSPl ainsi obtenu est introduit dans la souche sauvage T199 (leul-32, ura4-d18, h-) de la levure Schizosaccharomyces pombe par electroporation, et les cellules contenant le plasmide sont sélectionnées sur milieu sans leucine : EMMA (BI0101), uracyle 4mg/ml, thiamine 20microM. Après culture liquide et induction du promoteur nmtl pendant 24 heures par incubation dans un milieu EMMA + Uracyle à 4mg/ml, mais sans thiamine, les cellules sont récoltées par centrifugation, puis lysées physiquement dans le tampon de lyse LB. Puis les protéines MSP1 sont immunoprécipitées comme décrit dans l'exemple 6. Leur activité GTPase est mesurée par le protocole suivant : lesimmunoprécipités sont repris dans le milieu tampon suivant: 20mM Tris pH7,9,4mM MgCl2, 50 microg/ml BSA, lmM DIT (Sigma), 50 microM GTP et additionnés de 1 microCurie de GTP alpha 32P (Amersham) par échantillon. Ce mélange est incubé 2 heures à 30 C puis la réaction est arrêtée par addition de 2 microl d'EDTA 0. 5M. Les échantillons migrent 2 à 3 heures sur plaque de PEI (Sigma) immergée dans 50ml de solution de LiCl 0. 5M et d'acide formique 1M dans une cuve de migration étanche. Après séchage de la plaque PEI, celle-ci est
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exposée dans un appareil Phosphor-Imager (Molecular Dynamics) et la radioactivité proportionnelle à l'activité GTPase de MSP1 est comptée.
L'effet de composés pharmacologiquement actifs est réalisée par l'addition dans le mélange réactionnel d'un composé candidat, noté ici A ou B, et mesure de l'activité GTPase résultante (Figure 5).
EXEMPLE 9: Production et détection immunologique de la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine dans les cellules HeLa.
Cet exemple concerne la protéine MSP1 étiquetée Haemagglutinine (Ha) exprimée ectopiquement dans les cellules HeLa.
A partir du plasmide pBS-MSPl-Ha~6his tel que décrit dans l'exemple 7, le fragment codant pour MSPl-Ha-6his a été introduit dans le plasmide pCDNA entre les sites Kpnl et BamHl. Puis, le plasmide pCDNA-MSP1-Ha-6his a été transfecté dans des cellules HeLa, selon le mode opératoire décrit par le fabriquant (ExGen-500, Euromedex), et les cellules incubées 24 heures dans un milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco-BRL) additionné de glucose 4mg/l, pyruvate de sodium 4mM, glutamine 4mM (Seromed), péniciline 100 U/ml (Seromed), streptomycine 100microg/ml (Seromed) et serum de veau fétal à 10% (Eurobio). La détection spécifique de la protéine MSPl-Ha- 6his a été réalisée en utilisant les anticorps primaires de souris anti-Ha 12CA5 (Boehringer) et l'anticorps secondaire anti-souris Alexa 594 (Molecular Probes), par le protocole d'immuno-fluorescence suivant : les cellules ont été fixées dans une solution à 3,7% de formaldéhyde pendant 20 minutes à 4 C, perméabilisées par un traitement au méthanol 100% à -20 C pendant 10 minutes, puis traitées 5 minutes au Triton XI 00 à 0,25% dans du tampon PBS (Phosphate Buffer Saline). Puis les échantillons ainsi obtenus sont incubés 2 heures en présence des anticorps anti-Ha 12CA5 dilués au 1/700ème dans du tampon PBS additionné de 1% d'albumine de serum bovin (BSA) à 37 C, puis avec l'anticorps secondaire Alexa 594 dilué au l/500ème bans du tampon PBS additionné de BSA (Albumine de Sérum Bovin) à 1%. Les cellules sont observées au microscope à fluorescence (Leitz), la fluorescence correspondant spécifiquement à l'expression de la protéine MSPl-Ha-6his (Figure 6A-1).
La localisation de cette protéine produite ectopiquement correspond parfaitement à celle observée pour des cellules HeLa non transfectées, en utilisant l'anticorps spécifique de la protéine MSP1(Figure 6B-1) et à la localisation obtenue en utilisant des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques des mitochondries humaines autres que MSP1, comme par exemple l'anticorps anti-hsp60-LK2 (Sigma). (Voir figures 6A-2 et 6B-2).
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Les exemples décrits précédemment illustrent les moyens de produire la protéine MSP 1 in vitro comme in vivo. Ces protocoles décrivent aussi des méthodes de production et de purification de la protéine MSP basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques ou de colonnes d'affinité, et du dosage de son activité. Ils sont applicables quelle que soit la nature des échantillons biologiques, et peuvent être répétées pour les mutants MSP1-m de la protéine MSP1, en utilisant les phases codantes correspondantes.
Origine des phases codantes des mutants MSP1-m: Les phases codantes des quatre formes mutées MSP1-m ont été obtenues à partir de l'ARN total prélevé sur des cellules sanguines de personnes atteintes d' OPA 1. Les protocoles d'amplification et de clonage comme précédemment décrits (Exemple 6a) ont été suivis en utilisant les amorces MSPl-3'ter et MSP 1-5'.
La séquence de l'amorce MSPl-3'ter est la suivante: 5'-AGATGGATCCAGAGCTGATTATGAGTACGA-3'
Claims (18)
- REVENDICATIONS 1 - Polypeptide dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi SEQ ID N 1, ou une séquence homologue de ladite SEQ ID N 1, ou un fragment biologiquement actif de ladite SEQ ID N 1 ou de ses séquences homologues, ledit polypeptide étant désigné par MSP1.
- 2 - Polypeptide selon la revendication N 1 caractérisé en ce qu'il porte une ou plusieurs mutations induisant une modification de l'activité biologique du polypeptide selon la revendication N 1, ledit polypeptide muté étant désigné par MSP1-m.
- 3 - Polypeptide selon la revendication N 2, caractérisé en ce que lesdites mutations sont portées par un polypeptide choisi parmi MSP1-ml, MSPl-m2, MSPl-m3, MSPl-m4, tels que décrits respectivement par SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6.
- 4 - Séquence nucléotidique comprenant au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N 2 ou une séquence homologue de ladite SEQ ID N 2 ou un fragment de ladite SEQ ID N 2, et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, ou la séquence complémentaire de ladite séquence nucléotidique.
- 5 - Vecteur de clonage et/ou d'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence nucléotidique selon la revendication 4 fusionnée à un promoteur actifdans les cellules procaryotes ou eucaryotes, et éventuellement un ou des marqueurs de sélection.
- 6 - Cellule hôte, eucaryote ou procaryote, transformée par un vecteur selon la revendication N 5.
- 7 - Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'on fait exprimer ledit polypeptide par une cellule selon la revendication N 6.
- 8 - Procédé de préparation d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on produit ledit polypeptide in vitro à l'aide d'un vecteur d'expression selon la revendication N 5.
- 9 - Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 consistant à:associer dans une cellule hôte selon la revendication 6, la phase codante dudit polypeptide à la phase codante d'une étiquette antigénique;<Desc/Clms Page number 19>- exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans ladite cellule hôte, - mettre en contact ladite cellule hôte avec un anticorps reconnaissant spécifiquement ladite étiquette, - détecter la présence dudit anticorps, indicatrice de la présence dudit polypeptide.
- 10 - Procédé de purification d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 consistant à : - associer dans une cellule hôte selon la revendication 6, la phase codante dudit polypeptide à la phase codante d'une étiquette choisie pour son affinité à un support, - exprimer la protéine chimère codée par ladite association de phases codantes dans ladite cellule hôte, - obtenir un extrait par lyse de ladite cellule hôte, - mettre en contact l'extrait avec le support choisi, - reccupérer ledit polypeptide par élution.
- 11 - Anticorps monoclonal ou ses fragments ou anticorps chimérique ou immunoconjugué, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3 administré à un animal et est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon une des revendications 1 à 3.
- 12 - Procédé de détection immunologique d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, consistant à : - mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps détectable, selon la revendication 11 - détecter la présence dudit anticorps indicatrice de la présence dudit polypeptide.
- 13 - Procédé de détection de l'activité GTPase d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon avec un anticorps selon la revendication 11, - purifier le complexe anticorps-antigène, - mettre en contact le compexe avec le GTP, - doser le GDP formé.
- 14 - Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder un effet modulateur de l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur ledit polypeptide.
- 15 - Procédé de criblage de molécules susceptibles de posséder une activité pharmacologique, consistant à tester l'affinité et/ou l'action desdites molécules sur une cellule selon la revendication N 6.<Desc/Clms Page number 20>
- 16 - Utilisation d'un polypeptide selon une des revendications 1 à 3 pour le criblage de composés modulateurs de l'activité dudit polypeptide, utiles pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les troubles associés à un dysfonctionnement mitochondrial, ou à ceux de la division cellulaire.
- 17 - Utilisation selon la revendication N 16 dans laquelle lesdits troubles sont choisis parmi les maladies neurodégénératives, en particulier les neuropathies optiques et préférentiellement l'OPAl.
- 18- Utilisation d'un vecteur selon la revendication N 5 pour la préparation d'une composition destinée à être utilisée en thérapie génique.
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