FR2844713A1 - Nouvelle cible de l'angiogenese et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle protéine impliquée dans les mécanismes de perméabilité vasculaire, d'adhésion cellulaire et d'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage. Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en oeuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine des cancers, de l'angiogenèse, des maladies inflammatoires ou des altérations tissulaires.

Description

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NOUVELLE CIBLE DE L'ANGIOGENESE ET UTILISATIONS

La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle 5 protéine impliquée dans les mécanismes de perméabilité vasculaire, d'adhésion cellulaire et d'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage. Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en oeuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est 10 particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine

des cancers, de l'angiogenèse, des maladies inflammatoires ou des altérations tissulaires.

L'adhésion cellulaire est un processus complexe particulièrement important pour maintenir l'intégrité tissulaire et la compartimentalisation au sein de l'organisme. 15 L'adhésion d'un type cellulaire à un autre au sein d'un tissu donné entraîne la formation de jonctions intercellulaires, connues sous le nom de jonction serrées (" tight jonctions "), jonctions adhérentes, jonctions gap et desmosomes. La formation de ces jonctions assure la cohésion des épithéliums et des endothéliums et est responsable de l'existence de barrières imperméables qui empêchent la libre diffusion de cellules et 20 d'autres substances biologiques d'un compartiment tissulaire vers un autre. Par exemple, un composé présent dans le sang doit tout d'abord traverser la barrière constituée par les cellules endothéliales composant le vaisseau sanguin. Cette barrière rend difficile le ciblage de médicaments vers un tissu donné. Les cellules endothéliales rendent les capillaires sanguins très imperméables aux médicaments et la barrière hémato25 encéphalique complique particulièrement l'administration de molécules au système nerveux central. De plus, de nombreuses tumeurs solides développent des barrières internes qui limitent la délivrance de composés anti-tumoraux ou d'anticorps aux cellules ciblées. De nombreuses pathologies présentent des anomalies de l'adhésion cellulaire. L'adhésion cellulaire est également impliquée dans les phénomènes de rejets de greffes, et il est aussi bien établi que l'ischémie tissulaire perturbe le transport normal d'eau et de solutés à travers la microvasculature, et que ceci résulte en différentes formes d'oedèmes tissulaires. Dans ces circonstances, la perte soudaine de la fonction de barrière de l'endothélium constitue une cause majeure de pathologie tissulaire et de perte de la

fonction d'un organe donné.

Lors de pathologies à composantes prolifératives, les cellules qui se multiplient voient également une réorganisation de leurs jonctions entre elles. Ainsi, au cours du développement de vascularites et lors de la néovascularisation tumorale, une prolifération des cellules endothéliales s'accompagne d'un relâchement de l'endothélium 10 vasculaire. Ce relâchement est lié à une modification de la nature des interactions entre

cellules endothéliales. De façon analogue, lors de la prolifération tumorale, les cellules épithéliales transformées ne constituent plus d'épithéliums réguliers mais ne sont plus affectées par le phénomène d'inhibition de contact. Les cellules tumorales capables de former des métastases peuvent se détacher de leurs voisines et donc relâcher leurs 15 interactions avec celles-ci.

Une modification des liaisons intercellulaires survient également lors de l'angiogénèse, et de nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogenèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, 20 les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatode,

le psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée.

La présente invention décrit à présent l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans les phénomènes d'angiogenèse, d'adhésion cellulaire et de réponse à l'hypoxie. Une 25 approche originale a permis d'identifier un ADNc correspondant à une nouvelle protéine

qui présente une homologie de structure et fonctionnelle avec la famille des claudins.

Cette nouvelle protéine fournit de nouvelles bases pour des approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées aux phénomènes d'angiogenèse et, plus

généralement, à des processus prolifératifs.

Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits de cellules HMEC-1 (" Human dermal Microvascular Endothelial Cell ") en culture, exposées ou non à l'hypoxie (par traitement avec la desferoxiamine (DFO) pendant 16 heures). Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS décrite dans le brevet no W099/46403. Cette analyse a permis la construction, par le demandeur, d'un répertoire des altérations 5 d'épissage dans les cellules HMEC-1 exposées à l'hypoxie. Ce répertoire qui contient plus de 1100 séquences distinctes, implique des acteurs clefs du phénomène de réponse à l'hypoxie tels que les enzymes de la glycolyse (phosphofructokinase, pyruvate kinase ou lactate deshydrogénase) ou le transporteur de glucose GLUT-1. Des séquences dérivées d'ARNs codant pour des protéines impliquées dans la réponse au stress, et notamment 10 ORP150, qui est directement impliqué dans la réponse au stress hypoxique et dans la stabilisation du facteur VEGF, font également partie de ce répertoire, soulignant

l'implication de cette réponse dans la réponse à l'hypoxie.

La réalisation de DATAS sur des ARN de cellules HMEC-1 traitées ou non par le DFO 15 a permis d'isoler un fragment d'ADNc dérivé de l'ARNm d'un gène hypothétique. Ce gène, répertorié dans GenBank sous la référence NM_024600, est purement hypothétique. Ainsi, aucune démonstration de l'expression physiologique de cette séquence n'a été rapportée antérieurement. De même, la séquence de la protéine putative codée (protéine FLJ20898) a été déduite de la séquence de l'ADNc, mais cette protéine 20 n'a jamais été identifiée dans des échantillons biologiques, ni isolée ou caractérisée. Par ailleurs, aucune fonction biologique et aucune application industrielle n'ont été

attribuées à cette séquence putative dans l'art antérieur.

La présente demande décrit pour la première fois l'identification d'ARNm et d'une 25 protéine FLJ dans des conditions physio-pathologiques. La présente demande démontre que cette séquence est exprimée et possède des propriétés biologiques importantes dans la régulation de l'adhésion cellulaire et de la perméabilité para-cellulaires. La présente demande fournit ainsi une nouvelle protéine caractérisée fonctionnellement et expose, pour la première fois, ses applications industrielles. 30 La séquence en acides aminés de cette nouvelle protéine, désignée FLJ, est représentée ci-après (SEQ ID NO:2). La séquence codante est représentée dans la séquence SEQ ID NO:1. Protéine FLJ (SEQ ID NO:2)

MTVQRLVAAAVLVALVSLILNNVAAFTSNWVCQTLEDGRRRSVGLWRSCWLVDRT RGGPSPGARAGQVDAHDCEALGWGSEAAGFQESRGTVKLQFDMMRACNLVATAAL TAGQLTFLLGLVGLPLLSPDAPCWEEAMAAAFQLASFVLVIGLVTFYRIGPYTNL 10 SWSCYLNIGACLLATLAAAMLIWNILHKREDCMAPRVIVISRSLTARFRRGLDND

YVESPC

Une analyse bioinformatique réalisée à l'aide d'outils connus de l'homme de l'art n'a pas 15 révélé d'homologie significative entre la protéine FLJ de l'invention et d'autres protéines connues. Elle a toutefois permis de mettre en évidence une faible homologie

entre la protéine FLJ et certains domaines des protéines de la famille des claudins.

Une seconde analyse bioinformatique, réalisée grâce au serveur Pfam, a permis d'émettre 20 l'hypothèse selon laquelle la protéine FLJ faisait partie de la famille des claudins. Ces

protéines sont impliquées dans la formation de jonction intercellulaire de type serrée (" tight junction "). Le logiciel utilisé compare la séquence protéique à étudier avec une séquence consensus représentative d'un domaine protéique donné. Cette séquence consensus est générée à partir d'un alignement d'un grand nombre de séquences 25 protéiques du domaine considéré.

L'analyse de séquences a permis de mettre en évidence la présence d'un site de liaison au domaine de type PDZ, très conservé dans les claudins, ainsi qu'une topologie identique à celle des claudins. Ces particularités structurales ont renforcé l'hypothèse 30 selon laquelle cette nouvelle protéine était un nouveau membre de la famille des claudins. La distribution tissulaire de ce nouveau gène a ensuite été analysée par la technique du Northern blot, et a permis de mettre en évidence une expression marquée dans le coeur, les poumons et le rein (Figure 1). Ce profil d'expression est celui qui est classiquement

observé pour des gènes fortement exprimés dans l'endothélium.

Par ailleurs, en utilisant les techniques des puces à ADN et de la PCR quantitative en temps réel, une forte sur-expression de l'ARNm de la protéine FLJ a été mise en évidence dans différentes lignées cellulaires exposées à un traitement hypoxique, confirmant l'implication de cette protéine dans la perméabilité vasculaire. 10 Afin de poursuivre l'analyse biologique fonctionnelle, un ADNc correspondant à la phase ouverte de lecture de la proteine FLJ a été isolé par RT-PCR. La séquence du fragment amplifié est fournie dans la séquence SEQ ID NO:1. Cette séquence a ensuite été clonée en phase avec la séquence de la protéine EGFP, et des expériences de 15 transfection puis d'imagerie en fluorescence ont permis d'établir que la protéine FLJ était

adressée à la membrane plasmique des cellules transfectées.

Plusieurs clones stables de cellules MDCK transfectées avec la protéine de fusion FLJEGFP ont ensuite été isolés. Les résultats obtenus montrent que le signal de fluorescence 20 d à l'expression de la protéine de fusion est fortement concentré à la jonction entre plusieurs cellules (Figure 2). Ceci constitue une forte indication que la protéine FLJ est bien un membre de la famille des claudins. En effet, le type d'image obtenu dans cette expérience est très similaire à celui observé avec d'autres claudins (Claudin-1, Claudin-2

et Claudin-4) (Figure 3).

Un clone MDCK transfecté de manière stable avec la protéine de fusion FLJEGFP a ensuite été utilisé dans un test de mesure de la perméabilité paracellulaire. Dans ce type de test, une monocouche des cellules étudiées est constituée afin de séparer deux compartiments de milieu de culture. L'un de ces compartiments contient un traceur 30 fluorescent, du dextran couplé au FITC (" Fluorescein IsoThioCyanate "). Une mesure

du passage de ce traceur d'un compartiment à l'autre permet de mesurer la perméabilité de la monocouche cellulaire et donc des jonctions entre les cellules qui la constituent.

Les résultats obtenus montrent que le coefficient de perméabilité mesuré à partir du clone protéine de fusion FLJ-EGFP est trois fois plus élevé que celui mesuré avec un clone transfecté avec la protéine EGFP seulement (Figure 4). Ce résultat indique que la sur-expression de la protéine FLJ induit un relâchement des liaisons entre cellules, ce qui 5 est compatible avec une interférence de la protéine FLJ avec les " tight junctions " entre cellules.

Un tel relâchement des liaisons intercellulaires survient entre les cellules endothéliales lors de la formation des vaisseaux sanguins et entre les cellules épithéliales lors de la 10 prolifération tumorale. L'expression de l'ARNm de FLJ a donc été étudiée dans des échantillons de tumeurs. Des expériences de QPCR ont permis de mettre en évidence, de manière inattendue, une sur-expression de l'ARNm codant pour FLJ dans des échantillons de tumeurs de la prostate par rapport au tissu sain (Figure 5). Cette surexpression souligne une fois encore la corrélation entre la présence de la protéine FLJ et 15 l'intégrité tissulaire, l'adhésion cellulaire et l'angiogénèse. Ceci est également conforté par les conditions d'hypoxie dans lesquelles la protéine FLJ a été mise en évidence, l'hypoxie étant caractérisée notamment par une augmentation significative de la

perméabilité vasculaire in vivo.

Ces résultats démontrent donc l'identification et l'isolement d'une nouvelle protéine 1) exprimée dans l'endothélium, 2) sur-exprimée en conditions hypoxiques in vitro (cellules en culture) et in vivo (cancer de la prostate) et 3) dont l'expression augmente la perméabilité vasculaire dans un modèle de mesure de flux paracellulaire. Cette protéine constitue donc une nouvelle cible particulièrement attrayante pour la mise au point de 25 procédés de diagnostics et/ou thérapeutiques utiles dans les domaines du cancer, des pathologies à composantes angiogéniques ou impliquant une perturbation de l'intégrité

ou de l'adhésion tissulaire.

La présente demande concerne donc l'utilisation de cette protéine comme cible pour le 30 développement de nouvelles molécules ou de méthodes de diagnostic. Elle concerne

également des composés régulateurs de la protéine FLJ et leur utilisation thérapeutique.

Elle concerne également des méthodes et compositions pour le criblage de composés

actifs. Elle est particulièrement adaptée au diagnotic, suivi ou traitement de cancers.

Un premier objet de l'invention concerne une protéine FLJ sous forme isolée ou purifiée, ainsi que des variants et fragments de celle-ci. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une protéine FLJ

sous forme isolée ou purifiée, ou des variants ou fragments de celle-ci.

Un autre objet de l'invention concerne un vecteur comprenant un acide nucléique codant la protéine FLJ, ainsi que toute cellule recombinante exprimant une protéine FLJ. Une telle cellule recombinante comprend typiquement un vecteur tel que défini ci-avant ou

un acide nucléique codant une protéine FLJ, et exprime une protéine FLJ.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers, notamment pour

inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ 20 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse, à réguler la perméabilité vasculaire ou para- cellulaire ou à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.

Un autre objet de l'invention concerne un composé antagoniste ou inhibiteur de la 25 protéine FLJ, notamment un anticorps, un antisens, un ligand cytotoxique.

L'invention concerne également un procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la 30 quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FLJ, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN

messager correspondant.

Elle concerne encore des procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène FLJ, à moduler son expression ou à moduler son activité.

PRODUITS ET DEFINITIONS

Protéine FLJ Dans le contexte de l'invention, le terme protéine FLJ désigne tout polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO: 2, un variant de la séquence SEQ ID NO: 2, ou

un fragment de celles-ci.

Le terme " variant " désigne en particulier tous les variants naturels de la séquence SEQ ID NO: 2, résultant par exemple de polymorphisme(s), épissage(s), mutations(s), etc. De tels variants naturels peuvent donc comprendre une ou plusieurs mutations ou substitutions, une délétion d'un ou plusieurs résidus, etc. par rapport à la séquence SEQ ID NO: 2. Le terme variant désigne également les polypeptides FLJ ayant pour origine 20 une autre espèce, par exemple de rongeurs, bovins, etc. Avantageusement, le terme

protéine FLJ désigne un polypeptide d'origine humaine.

Le terme " variant " inclut également tout variant synthétique d'une protéine FLJ, et notamment tout polypeptide comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, 25 substitutions et/ou additions d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à la séquence SEQ ID NO 2. De préférence, il s'agit de polypeptides reconnus par un anticorps

polyclonal produit à partir de la protéine FLJ de séquence SEQ ID NO 2.

Des variants préférés comportent avantageusement au moins 75% d'identité avec la 30 séquence primaire SEQ ID NO: 2, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 85%. Encore plus préférentiellement, les variants préférés comportent au moins 90% d'identité avec la séquence primaire SEQ ID NO: 2, de préférence au moins 95%, 96%, 97% ou 98%. Le degré d'identité peut être déterminé par différentes méthodes et au moyen de logiciels connus de l'homme du métier, comme

par exemple selon la méthode CLUSTAL.

Des variants particuliers possèdent une mutation ou une substitution affectant 5 acides aminés au plus de la séquence SEQ ID NO 2. Typiquement, les variants selon l'invention sont des polypeptides conservant au moins une propriété immunologique, biologique ou pharmacologique de la protéine FLJ de 10 séquence SEQ ID NO:2. Les propriétés biologiques sont notamment la modulation de l'adhésion cellulaire, de la perméabilité paracellulaire ou de la contraction de jonctions inter-cellulaires. Les propriétés immunologiques sont par exemple la capacité de

produire des anticorps reconnaissant la protéine de SEQ ID NO: 2.

Comme indiqué, le terme protéine FLJ inclut également des polypeptides comprenant des fragments de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un variant de celle-ci. Il s'agit plus

particulièrement des polypeptides comprenant une partie de la séquence SEQ ID NO:2.

Les polypeptides fragments de l'invention contiennent de préférence moins de 200 20 acides aminés, plus préférentiellement moins de 180 acides aminés, encore plus préférentiellement moins de 150 acides aminés, par exemple moins de 120 acides aminés. Ils comportent avantageusement au moins 5 résidus consécutifs de la séquence de la protéine FLJ. Avantageusement, les polypeptides fragments contiennent au moins une région ou un domaine fonctionnel de la protéine FLJ de séquence SEQ ID NO:2, 25 comme par exemple un domaine d'adressage membranaire, un domaine transmembranaire, un site de liaison au domaine de type PDZ, un épitope, une structure secondaire (boucle, feuillet, etc.), un site consensus, etc. L'analyse de la protéine FLJ montre qu'elle comporte des domaines fonctionnels 30 localisés aux positions suivantes: - domaines transmembranaires: résidus 14-31, 101-123, 139-162 et 169-190; - site putatif de phosphorylation par PKC: résidus 210-212; - site putatif de phosphorylation sur tyrosine: résidus 214-221

- site d'interaction avec les protéines à domaines PDZ: résidus 217-226.

Des polypeptides préférés de l'invention comprennent moins de 200 acides aminés de la 5 séquence SEQ ID NO 2, plus préférentiellement moins de 150, encore plus préférentiellement moins de 100, et comportent au moins les résidus 14-31, 101-123,

139-162, 169-190, 210-212, 214-221 ou 217-226 de la séquence SEQ ID NO 2.

D'autres polypeptides préférés de l'invention comprennent moins de 200 acides aminés 10 de la séquence SEQ ID NO 2 et comportent au moins un domaine antigénique spécifique

de la séquence SEQ ID NO 2.

Un autre polypeptide particulier est caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de la séquence SEQ ID NO:2 et en ce qu'il comporte au moins un domaine immunogène de 15 la protéine FLJ humaine. La présente demande propose en effet la production de polypeptides fragments de FLJ comportant de préférence une portion immunogène de FLJ, qui sont utilisables pour la production d'anticorps, de tests de dosages, etc. Ces polypeptides peuvent être élaborés en utilisant des algorithmes permettant d'évaluer l'hydrophilicité ou l'antigénicité d'un polypeptide. Au sens de l'invention, le terme 20 "fragment " ou " portion " immunogène désigne toute portion du polypeptide

comprenant un épitope, de préférence un épitope T ou B. Un tel fragment comprend donc avantageusement au moins 7 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO:2, plus préférentiellement au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO:2, encore plus préférentiellement au moins 15 acides aminés consécutifs de 25 la séquence SEQ ID NO:2.

Des fragments particuliers au sens de l'invention conservent une ou plusieurs propriétés de FLJ telles que mentionnées ci-avant. De tels variants ou fragments biologiquement actifs sont utilisables pour mimer l'action de FLJ ou pour produire des anticorps 30 correspondants.

il D'autres fragments particuliers au sens de l'invention sont des polypeptides capables d'antagoniser l'activité de FLJ. De tels fragments sont utilisables pour inhiber l'action

de FLJ.

Les polypeptides ou protéines FLJ de l'invention peuvent comprendre des résidus hétérologues ajoutés à la séquence d'acides amines indiquée. Ainsi, un objet de l'invention réside dans un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID

NO:2, ou d'un variant de celle-ci, et une partie hétérologue.

La partie hétérologue peut correspondre à des acides aminés, lipides, sucres, etc. Il peut

également s'agir de groupe(s) chimique(s), enzymatique(s), radioactif(s), etc. La partie hétérologue peut en particulier constituer un marqueur, un agent de ciblage, un agent stabilisateur, un agent améliorant l'immunogénicité ou facilitant la production, un agent protecteur, un agent facilitant la pénétration du polypeptide dans les cellules, une toxine, 15 ou composé actif, un anticorps, etc..

Les protéines FLJ de l'invention peuvent se présenter sous forme soluble, purifiée ou complexée avec une molécule porteuse telle que KLH ou la sérum-albumine, ou toute autre molécule inerte (par exemple synthétique), telle qu'une bille par exemple. Les 20 polypeptides selon l'invention sont préférentiellement dépourvus de contamination par des protéines naturellement présentes dans leur environnement naturel. Dans un mode de mise en oeuvre particulier, les polypeptides sont couplés à une molécule porteuse notamment pour la fabrication d'anticorps. Le couplage peut être réalisé selon des techniques conventionnelles. Les polypeptides peuvent également être conjugués ou 25 fusionnés à toute autre molécule polypeptidique ou peptidique telle que par exemple un

peptide, polypeptide ou une protéine biologiquement active.

Les protéines FLJ de l'invention peuvent être fabriquées par toute technique connue en soi de l'homme du métier, notamment par toute technique chimique, biologique, 30 génétique, enzymatique, etc., seule ou en combinaison(s). Des méthodes préférées comprennent l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, d'un acide nucléique correspondant ou la synthèse artificielle selon des techniques conventionnelles telles que

la synthèse en phase solide.

Les protéines FLJ selon l'invention peuvent être utilisées dans des tests de sélection ou 5 de criblage, dans des méthodes de dosage, pour réguler l'activité de FLJ in vitro ou in vivo, pour la production de médicaments ou vaccins, pour le ciblage de molécules, pour la production d'anticorps anti-FLJ, notamment d'anticorps thérapeutiques, etc. Gène FLJ Au sens de l'invention, on entend par " gène FLJ " tout acide nucléique codant une protéine FLJ telle que définie ci-avant. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, d'origine naturelle ou synthétique. Il peut notamment s'agir d'ADN génomique, complémentaire, chimérique, artificiel, d'ARNm, etc. Le gène FLJ peut être sous forme simple-brin ou 15 double-brin. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme de l'art à partir

de la séquence SEQ ID NO: 1 et des informations contenues dans la présente demande.

Un gène FLJ particulier comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID NO:1 ou d'une séquence complémentaire, ou d'une séquence différente en raison de la dégénérescence du code génétique, ou d'une séquence hybridant avec celles-ci dans des conditions de 20 stringence élevée et codant une protéine FLJ.

Le gène FLJ de l'invention peut être incorporé dans un vecteur de clonage ou d'expression, dans le génome d'une cellule, etc. Des exemples de vecteurs utilisables pour cloner un gène FLJ de l'invention sont notamment des plasmides, cosmides, épisomes, chromosomes artificiels, virus, phages, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc. De tels vecteurs constituent des objets particuliers de l'invention. 30 Le gène ou vecteur peut être introduit dans une cellule hôte, afin de produire une protéine FLJ. Des exemples de cellules utilisables sont notamment des cellules de mammifères, de levure, de plante, d'insecte ou de bactérie. On peut citer des cellules primaires ou des lignées établies de cellules de mammifère. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. 5 Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple. De telles cellules recombinantes

constituent des objets particuliers de l'invention.

Sonde Nucléique Un objet particulier de l'invention concerne une sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un gène FLJ ou d'un ARN correspondant, typiquement par hybridation sélective à partir d'un échantillon. Généralement, la sonde comprend la séquence d'un gène FLJ tel que défini ci-avant ou une partie de celle-ci. Une sonde de 15 l'invention comprend typiquement de 10 à 1000 nucléotides, de préférence de 20 à 800, plus préférentiellement de 50 à 600, et est généralement simple-brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un gène FLJ ou de l'ARN correspondant. L'oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Un autre exemple 20 de sonde nucléique de l'invention comprend la séquence SEQ ID NO:1 ou la partie codante de celle-ci. Les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc. Les sondes peuvent être sous forme libre ou immobilisée sur un support (colonne,

bille, lame, membrane, etc.).

A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins un acide nucléique comprenant tout ou une partie spécifique de la séquence SEQ ID NO: 1, immobilisé sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, 30 polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. L'acide nucléique est préférentiellement immobilisé par une extrémité, dans des conditionslaissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation. Des techniques d'immobilisation de matériels (tels que acides nucléiques, polypeptides, anticorps, etc.) sur des supports ont été décrites dans la littérature, et notamment dans les demandes ou brevets n0 EP619

321, W091/08307, US4,925,785 et GB2,197,720.

Amorce Spécifique Un autre objet de l'invention concerne une amorce nucléique, permettant l'amplification (sélective) d'un gène FLJ ou d'une partie (spécifique) de celui-ci. Une amorce selon l'invention est avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 5 à 40 et 10 encore plus préférentiellement de 6 à 35 bases. Elle est typiquement simple-brin. Une amorce particulière est complémentaire d'une région au moins du gène FLJ ou de 'ARN correspondant. Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique 15 simple- brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de

la séquence SEQ ID NO: 1 ou de son brin complémentaire.

L'invention concerne également une paire d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisée en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec 20 une région d'un gène FLJ et permettent l'amplification d'au moins une portion de celuici. Les amorces peuvent être complémentaires d'une partie de la région codante du gène

FLJ, ou des régions régulatrices (promoteur, terminateur, etc.).

Antisens On entend par acide nucléique anti-sens tout acide nucléique capable d'inhiber la

transcription du gène FLJ ou la traduction du messager correspondant.

L'acide nucléique anti-sens peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène FLJ, 30 d'un fragment de celle-ci, du messager de la FLJ, ou d'une séquence complémentaire à

celles-ci. L'antisens peut notamment comprendre une région complémentaire d'une partie de la séquence SEQ ID NO:1 et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine.

L'antisens est préférentiellement complémentaire d'une portion au moins de la région codante de la séquence SEQ ID NO:1. La complémentarité de l'antisens est préférentiellement parfaite, même si certains mésappariements peuvent être tolérés.

L'antisens peut être un ADN, un ARN, un ribozyme, un ARNi, etc. Il peut être simple5 brin ou double-brin. Sa longueur peut varier entre quelques bases et plusieurs centaines de bases, par exemple jusqu'à la longueur complète de la séquence SEQ ID NO:1 ou de l'ARNm de FLJ. Il peut également s'agir d'un ARN codé par un gène antisens.

S'agissant d'un oligonucléotide antisens, il comprend typiquement moins de 100 bases, par exemple de l'ordre de 10 à 50 bases. Cet oligonucléotide peut être modifié pour 10 améliorer sa stabilité, sa résistance aux nucléases, sa pénétration cellulaire, etc. De tels antisens représentent des objets particuliers de l'invention, ainsi que des compositions pharmaceutiques les comprenant, en association avec tout véhicule ou excipient acceptable sur la plan pharmaceutique. 15 Anticorps Un autre objet de l'invention concerne tout anticorps spécifique d'une protéine ou d'un polypeptide FLJ, c'est-à-dire capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un 20 tel polypeptide ou protéine. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, poly-fonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant 25 l'immunisation d'un animal non-humain avec une protéine FLJ ou un fragment de celleci comportant un épitope, et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées). Diverses méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées ont

été décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, par exemple par injection sous-

cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont

collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés.

Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent 5 l'immunisation d'un animal non-humain avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les

clones individuels.

Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase

selon les techniques conventionnelles.

L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant 15 l'injection d'une protéine FLJ telle que définie ci-avant (ou d'un fragment immunogène de celle-ci) à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules

productrices d'anticorps.

Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques de la protéine FLJ, c'est-à-dire 20 ayant une affinité supérieure pour la protéine FLJ que pour d'autres antigènes, même si

une liaison non-spécifique ou moins affine ne peut être exclue.

L'invention concerne également des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps. 25 Les anticorps de l'invention peuvent être couplés à des fragments hétérologues tels que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents 30 fluorescents, des particules magnétiques, etc. Les toxines peuvent être choisies parmi la toxine dipthérique, botulique, la ricine, etc. Les anticorps de l'invention peuvent également être immobilisés sur un support, tel qu'une bille, colonne, gel, puce, etc. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins un anticorps spécifique d'une protéine FLJ immobilisé sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, 5 comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. L'anticorps est préférentiellement immobilisé par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction immunologique.

METHODES DE DETECTION/DIAGNOSTIC

La présente demande décrit de nouveaux procédés de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la 15 quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FLJ, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN

messager correspondant.

La détermination peut être réalisée par différentes techniques, telles que séquençage, 20 hybridation et/ou amplification sélectives. Des méthodes utilisables pour déterminer la présence de protéines (ou domaines protéiques) sont basées par exemple sur des réactions immunoenzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence ou l'expression de gènes ou d'ARN sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de 25 PCE ou TMA (" Transcriptional Mediated Amplification "), la migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE (" denaturing gel gradient electrophoresis "), etc. Dans le cas o une étape d'amplification est réalisée, celle-ci met préférentiellement en oeuvre une amorce ou une paire d'amorces telle que définie ci-avant. 30 Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'acides nucléiques complémentaires et spécifiques du gène FLJ pour la détection de cancers, la caractérisation de cancers ou pour le suivi de la progression de cancers, notamment de la formation de métastases. Cette détection peut s'effectuer grâce à des puces à ADN ou par mise en oeuvre d'une PCR à partir de biopsie ou de fluides biologiques tels que du sang (le sérum notamment), des urines, du fluide séminal, etc.

L'invention réside également dans la mise au point et l'utilisation de tests immunologiques contenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-dessus ou fragments de ces derniers. Ces tests permettent de détecter et/ou mesurer la présence et/ou la quantité de protéine FLJ dans un échantillon biologique, cette quantité étant 10 corrélée à un processus pathologique.

Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde nucléique telle que définie ci-avant, et la mise en évidence d'une hybridation. Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce ou une paire d'amorces telles que définies ci-avant, et la

mise en évidence d'un produit d'amplification.

Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un anticorps tel que défini ciavant, et la mise en évidence d'un

complexe antigène-anticorps.

Plusieurs tests peuvent réalisés en parallèle, à partir de plusieurs échantillons et/ou en 25 utilisant plusieurs sondes, amorces et/ou anticorps.

Comme indiqué ci-avant, la protéine FLJ est impliquée dans les mécanismes d'adhésion cellulaire, de perméabilité para-cellulaire, d'interaction entre cellules et d'angiogénèse.

La surexpression de cette protéine induit un relâchement des liaisons intercellulaires et 30 est observée dans des tissus pathologiques, notamment les tissus cancéreux. La détection ou le dosage de cette protéine (ou de formes altérées) dans un échantillon d'un sujet constitue donc un indicateur de la présence de telles événements pathologiques et de la

sévérité de ces pathologies.

Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci-avant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.

CRIBLAGE DE COMPOSES ACTIFS

La protéine FLJ selon l'invention représente une cible thérapeutique particulièrement 15 intéressante pour le traitement des cancers, de l'angiogénèse, des maladies tissulaires ou

pour la régulation de l'adhésion cellulaire ou de la perméabilité paracellulaire.

L'invention permet donc la mise au point de procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, basés sur une détermination de la capacité de composés tests à interagir avec FLJ, à moduler son 20 expression ou à moduler son activité.

A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une protéine 25 FLJ telle que définie ciavant, et la sélection ou l'identification des composés se liant à ladite protéine. Dans ce procédé, la protéine FLJ (ou tout fragment de celle-ci) peut être

utilisée sous forme soluble ou immobilisée à un support (colonne, bille, plaque, etc.).

Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, 30 d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant une protéine FLJ telle que définie ci-avant, et la sélection ou l'identification

de composés modulant l'expression ou l'activité de ladite protéine.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, 5 d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un gène FLJ ou un ARN correspondant, et la sélection ou l'identification de composés se liant au dit gène ou ARN. Dans ce procédé, il est possible d'utiliser des portions du gène ou de l'ARN. Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un acide nucléique comprenant la séquence du promoteur du gène FLJ, et la sélection ou 15 l'identification de composés se liant au dit promoteur. Dans une variante particulière, on utilise une construction génétique comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle du promoteur, et l'effet du composé est déterminé par mesure de l'expression du gène rapporteur (ou de variation dans le niveau d'expression, par rapport à une situation contrôle).

La liaison à la protéine FLJ, au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur. Les cellules utilisées 25 peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes.

Ces cellules peuvent être des cellules de mammifères, des bactéries, des cellules de levure, de plante, d'insecte, etc. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des 30 fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer

notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple.

Le procédé de sélection peut être mis en oeuvre dans tout support approprié, comme par exemple une plaque, un tube, une flasque, etc., typiquement dans un support multirécipients, comme des plaques multipuits.

Le procédé peut être mis en oeuvre pour sélectionner ou identifier un activateur ou un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de la protéine FLJ. Pour l'obtention de

composés anti-cancéreux, on sélectionne des inhibiteurs de FLJ.

A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne des méthodes de sélection, d'identification, ou de caractérisation de composés anticancéreux, comprenant la mise en contact d'un ou de plusieurs composés tests avec une protéine FLJ, un gène FLJ ou une cellule exprimant une protéine FLJ, et la sélection des composés inhibant l'expression ou l'activité de FLJ ou se liant à celle-ci. 15

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES

La présente demande décrit l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans la 20 réalisation de jonctions inter-cellulaires. Cette protéine, lorsqu'elle est surexprimée, induit un relâchement des jonctions inter-cellulaires, et peut donc réguler la perméabilité para- cellulaire. En outre, cette protéine se trouve surexprimée dans des cellules tumorales, ce qui confirme son rôle dans le relâchement de l'épithélium et son implication dans la formation de métastases. Cette protéine représente donc une cible 25 particulièrement intéressante pour des interventions thérapeutiques visant à réguler l'adhésion ou la perméabilité cellulaire, notamment dans des pathologies liées à l'angiogénèse, la perméabilité épithéliale ou à une prolifération cellulaire incontrôlée ou pathologique. Une application thérapeutique particulièrement bénéfique réside dans le traitement des pathologies liées à une prolifération cellulaire incontrôlée ou pathologique, notamment

les cancers.

Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur de la

protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers. En effet, il est établi que langiogenèse est non seulement essentielle à la croissance d'une tumeur mais est aussi impliquée dans la progression du stade bénin au stade du cancer invasif, et dans la progression de métastases dormantes 10 vers des lésions métastatiques. La possibilité de réguler négativement l'angiogénèse et de renforcer l'adhésion cellulaire permet de réduire la progression métastasique des cancers. L'invention est utilisable pour la traitement de différents types de cancers, notamment de 15 tumeurs solides, comme par exemple les cancers du sein, du poumon, de la prostate, du colon, de l'utérus, tête-et-cou, du cerveau (e.g., glioblastome), de la peau, du foie, de la vessie, etc. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ

pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse.

L'angiogenèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de la vasculature préexistante, a lieu principalement au cours du développement embryonaire. 25 Ce processus est également hautement régulé au stade adulte durant les processus de cicatrisation, d'ovulation et de menstruation. De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogenèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatode, le psoriasis, ainsi que les 30 pathologies liées à une cicatrisation retardée. L'invention permet donc de contrôler la

l'apparition, la progression ou le développement de ces pathologies chez des patients.

Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite

rhumatode, du psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée.

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ

pour la préparation d'un médicament destiné à favoriser la cicatrisation.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ 10 pour la préparation d'un médicament destiné à réguler l'adhésion cellulaire. La régulation de l'adhésion cellulaire est importante dans les greffes d'organes ou de tissus et dans le contrôle de pathologies tissulaires et de la perte de fonction d'organes, notamment liées à une ischémie tissulaire, des oedèmes, etc. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la perméabilité vasculaire ou para-cellulaire. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ 20 pour la préparation d'un médicament destiné à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer l'inflammation. L'angiogenèse 25 et l'inflammation sont deux processus étroitement liés et de nombreuses pathologies inflammatoires comportent une composante angiogénique. Un contrôle de l'angiogenèse

peut donc résulter en un bénéfice dans certaines pathologies inflammatoires.

Un autre objet de l'invention concerne des méthodes de traitement des pathologies 30 mentionnées ci-dessus, comprenant l'administration à un patient d'une quantité efficace

d'un inhibiteur de la protéine FLJ.

Dans le contexte de l'invention, le terme " traitement " désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements 5 (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.

Au sens de l'invention, le terme " inhibiteur " de la protéine FLJ désigne tout composé, traitement ou composition capable d'inhiber l'expression de la protéine FLJ ou son 10 activité. Il peut s'agir notamment d'un composé, traitement ou composition inhibant la

transcription du gène, la maturation des ARNs, la traduction de l'ARNm, la modification post-traductionnelle de la protéine, sa translocation vers la membrane, etc. Il peut également s'agir d'un composé, traitement ou composition inhibant l'activité de la protéine FLJ, par exemple en inhibant son interaction avec d'autres constituants 15 cellulaires, notamment avec d'autres constituants des jonctions serrées.

Le terme " inhiber " inclut toute réduction de l'expression ou de l'activité de la protéine FLJ, même si celle-ci n'est pas totale. On préfère néanmoins des inhibiteurs capables de réduire in vitro de 20% au moins l'expression ou l'activité de la protéine FLJ, plus 20 préférentiellement de 30% au moins. En outre, des inhibiteurs particulièrement préférés

sont des inhibiteurs sélectifs, c'est-à-dire qui agissent principalement sur la protéine FLJ et, dans une moindre mesure ou de manière essentiellement indirecte, sur d'autres cibles ou mécanismes. La sélectivité peut être déterminée en testant l'effet des inhibiteurs sur d'autres protéines cellulaires, notamment sur d'autres protéines impliquées dans la 25 formation de jonctions serrées.

Dans un premier mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique antisens capable d'inhiber la transcription du gène FLJ ou la traduction du messager correspondant. Il s'agit tout particulièrement d'un oligonucléotide antisens ou d'un gène 30 codant un ARN antisens.

Dans un autre mode de réalisation, le composé est un peptide comprenant une région de la protéine FLJ et capable d'antagoniser son activité. Le peptide comprend avantageusement 5 résidus consécutifs au moins de la protéine FLJ, plus généralement entre 10 et 100. Le peptide comprend typiquement le site de liaison au domaine PDZ de la protéine FLJ, localisé au niveau des résidus 217 à 226.

Selon un autre mode de réalisation, l'inhibiteur est un anticorps spécifique de la protéine FLJ, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, tels que définis ci-avant. De tels anticorps, fragments et dérivés constituent des objets particuliers de la présente 10 demande.

L'anticorps peut également être couplé à un fragment hétérologue, tel qu'une toxine, un médicament ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. A cet égard, dans une 15 variante particulière de mise en oeuvre, le composé inhibiteur est un ligand cytotoxique spécifique de FLJ. De tels ligands cytotoxiques sont particulièrement adaptés pour le traitement de cancers. Des ligands cytotoxiques spécifiques sont typiquement des molécules comportant une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité vis-à-vis de FLJ. La région conférant la cytotoxicité peut être toute molécule 20 toxique pour une cellule, soit par elle-même, soit de manière conditionnelle ou indirecte

(c'est-à-dire en rendant la cellule sensible à un agent chimique ou au système immunitaire du patient, par exemple). La région conférant la spécificité vis-à-vis de FLJ est typiquement un anticorps ou fragment d'anticorps tel que défini ci-avant. Il peut cependant s'agir également de ligands spécifiques de FLJ, notamment d'une partie d'un 25 récepteur ou partenaire cellulaire de FLJ.

Selon un autre mode de réalisation, le composé inhibiteur est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi30 synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de la protéine FLJ. Un tel inhibiteur est préférentiellement obtenu ou issu d'une méthode de sélection telle que

définie ci-avant.

Pour la mise en oeuvre des méthodes thérapeutiques définies ci-avant, l'inhibiteur peut être utilisé à différentes doses et selon différents protocoles. En outre, il peut être utilisé seul ou, de préférence, combiné à d'autres agents actifs. L'administration peut être 5 réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-tumotale, intra- dermique, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra- musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés 10 nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Pour

des anticorps thérapeutiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (ex., tampons, solutions saline, isotonique, en présence 15 d'agents stabilisants, etc.).

L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. Les résultats présentés dans cette demande illustrent l'implication de la protéine FLJ dans les mécanismes de perméabilité paracellulaire et sa dérégulation dans des tissus 20 pathologiques, et démontrent l'intérêt d'approches thérapeutiques basées sur la

régulation de cette protéine.

MATERIELS ET METHODES UTILISES

Toute la partie de biologie moléculaire (clonage, constructions plasmidiques, tranfections, établissement de clones stables, immunofluorescence,...) a été réalisé en

utilisant des protocoles classiques connus de l'homme de l'art.

Le test de mesure de perméabilité paracellulaire a été réalisé de la manière suivante. A JO, environ 105 cellules MDCK transfectées stablement ont été ensemencées à 30 confluence dans des inserts Becton Dickinson Transwell 8 jam semi-perméables définissant une partie basale et une partie apicale (chambre de Boyden). A J+5, du dextran-FITC 3 kDa a été déposé à une concentration de 0.5 mg/ml dans la partie apicale. Une prélèvement dans la partie basale est effectué au cours du temps et l'intensité de fluorescence est mesurée au fluorimètre. Les différentEs cinétiques ont été tracées et un coefficient de perméabilité a été calculé. Les différents résultats sont

soutenus par les tests statistiques ANOVA et Wilcoxon à 5%.

Les séquences protéiques et nucléiques sont fournies dans la liste de séquence annexée.

LEGENDE DES FIGURES ET RESULTATS OBTENUS

Figure 1: Analyse par Northern Blot de la distribution tissulaire de l'ARNmessager de la protéine FLJ. Ce messager est principalement exprimé dans le poumon, le rein et le coeur. Figure 2: Analyse par microscopie à fluorescence de la localisation cellulaire de la 15 protéine FLJ. La phase ouverte de lecture de FLJ a été clonée en phase avec la protéine EGFP. Des cellules HMEC-1 ont été transfectées avec cette construction plasmidique et des clones stables ont été sélectionnés. Cette image montre une concentration du signal fluorescent à la jonction entre plusieurs cellules, ce type d'image est observé également après transfection stable avec d'autres membres de la famille des claudins. 20 Figure 3: Partie gauche: analyse par microscopie à fluorescence de la localisation cellulaire de la protéine FLJ. La phase ouverte de lecture de FLJ a été clonée en phase avec la protéine EGFP. Des cellules MDCK ont été transfectées avec cette construction plasmidique et des clones stables ont été sélectionnés. Cette image montre une 25 concentration du signal fluorescent à la jonction entre plusieurs cellules, ce type d'image est observé également après transfection stable avec la claudin 1 (partie droite de la figure). Figure 4: Mesure du passage d'une molécule de dextran marquée au FITC au travers 30 d'une monocouche de cellules MDCK transfectées stablement soit avec la protéine FLJ fusionnée avec l'EGFP (FLJ-EGFP), soit avec l'EGFP seule (EGFP). On observe une plus forte perméabilité pour le clone transfecté avec la protéine de fusion FLJ-EGFP. Un coefficient de perméabilité a été calculé en normalisant les résultats par la surface

occupée par la monocouche de cellules (partie droite de la figure).

Figure 5: Analyse de l'expression de l'ARN messager de FLJ par PCR quantitative en 5 temps réel (QPCR). Des biopsies de la partie tumorale (tumor) d'une part et de tissus péritumoraux (normal) d'autre part ont été isolées chez le même patient atteint de cancer de la prostate. Les ARN extraits à partir de ces biopsies ont été rétrotranscrits et utilisés dans des expériences de QPCR. Les résultats ont été normalisés par l'expression de la beta-tubuline. On observe une expression 3.5, 8.2 et 1. 9 fois plus forte dans la partie 10 tumorale par rapport à la partie normale chez les patients A, B et C, respectivement.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament

destiné au traitement des cancers.

2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à

inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.

3. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament 10 destiné à inhiber l'angiogénèse.

4. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatode, du psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une 15 cicatrisation retardée.

5. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament

destiné à réguler la perméabilité vasculaire ou para-cellulaire.

6. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FLJ pour la préparation d'un médicament

destiné à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.

7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que

l'inhibiteur de la protéine FLJ est un acide nucléique antisens. 25

8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que

l'inhibiteur de la protéine FLJ est un anticorps spécifique de la protéine FLJ.

9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que 30 l'inhibiteur de la protéine FLJ est un ligand cytotoxique spécifique de la protéine FLJ.

10. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est spécifique de la protéine FLJ.

11. Acide nucléique antisens, caractérisé en ce qu'il inhibe la transcription du gène FLJ

ou la traduction de l'ARNm correspondant.

12. Ligand cytotoxique spécifique de la protéine FLJ, caractérisé en ce qu'il comprend une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité pour la protéine FLJ.

13. Protéine FLJ comprenant la séquence SEQ ID NO: 2. 10

14. Sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un gène FLJ ou d'un ARN correspondant par hybridation sélective et en ce qu'elle comprend la

séquence SEQ ID NO:1 ou une partie de celle-ci.

15. Amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de

son brin complémentaire.

16. Procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez 20 un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FLJ, de son expression, de

formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.

17. Procédé de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène FLJ, à moduler son expression ou à moduler

son activité.

18. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un acide nucléique codant une

protéine FLJ.

2844713 31

19. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon la revendication 18 ou un acide nucléique codant une protéine FLJ, et en ce qu'elle

exprime une protéine FLJ.