FR2837838A1 - Nouvelle cible moleculaire de la neurotoxicite - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la détection, la caractérisation et/ ou le traitement de pathologies neurodégénératives, notamment de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également des méthodes pour l'identification ou le screening de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles pour la mise en oeuvre des méthodes ci-dessus. L'invention décrit notamment le rôle des histones déactétylases, et notamment l'histone déacétylase 2, dans ces pathologies et son utilisation comme cible thérapeutique, diagnostique ou expérimentale.

Description

médicament est destiné au traitement de patients HLA-A*0201.

Nouvelle Cible Moléculaire de la Neurotoxicité La présente invention concerne le domaine de la blologie, de la génétique et de la médecine. Elle concerne notamment de nouvelles méthodes pour la s détection, la caractérisation eVou le traitement de pathologies

neurodégénératives, notamment de la sclérose latérale amyotrophique.

L'i nvention concerne également d es méthod es pour l' identificatio n ou le screening de composés actifs dans ces pathologies. L'invention concerne également les composés, gènes, cellules, plasmides ou compositions utiles o pour la mise en _uvre des méthodes ci-dessus. L'invention découle notamment de l'identification du rôle des enzymes impliquées dans la phosphorylation de facteurs nucléaires, parmi lesquelles il convient de souligner les histones, dans ces pathologies et décrit leur utilisation comme cibles ou marqueurs

thérapeutiques, diagnostiques ou expérimentaux de ces désordres.

De nombreuses pathologies neurodégénératives ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité. C'est le cas de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques

et de la chorée de Huntington.

La sclérose amyotrophique latérale (SAL ou ALS pour Amyotrophic Lateral Sclerosis) est une maladie neurodégénérative associée à différents types d'inclusions tels les corps de Lewis et caractérisée par une apoptose des motoneurones spinaux et corticaux dont l'issue fetale est parfois associée à une s démence frontale. Des formes sporadiques, sans aucune mutation décrite, coexistent avec des formes familiales (FALS) associées à des mutations dans le gène SOD1 codant pour la superoxide dismutase. La majorité des cas est sporadique, les formes familiales (FALS) étant très rares. Il est vraisemblable qu'une longue période asymptomatique précède l'apparition des symptômes so cliniques qui sont variés et dont la classification est complexe. Les futurs développements thérapeutiques substitueront aux traitements de la symptomatologie des stratégies basées sur les causes moléculaires de la pathologie. Au niveau cellulaire, ces symptômes sont associés à une mort des motoneurones corticaux et des motoneurones spinaux. Cette mort neuronale a été reliée à différents phénomènes qui constituent la base de plusieurs pathologies neurodégénératives. C'est le cas de l'excitotoxicité liée au s glutamate, du stress oxydatif, d'une certaine auto immunité dirigée contre des marqueurs neuronaux (les canaux calciques dans le cas de l'ALS) ainsi que d'anomalies du cytosquelette. Si ces phénomènes sont décrits, la ou les causes de ces maladies, dont l'ALS, sont obscures. Même si les FALS sont lices à des mutations dans le gène SOD1 qui code pour la superoxide dismutase, les o mécanismes qui engagent les neurones vers la mort cellulaire dont au moins

une composante est l'apoptose, sont inconnus.

L'identification des évènements moléculaires impliqués dans les différents phénomènes impliqués dans la mort cellulaire permettra de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'étude de ces évènements est difficilement réalisable à partir de biopsies humaines. Ces biopsies proviennent évidemment d'échantillons post-mortem dont la qualité est difficilement contrôlable et ne représentent que des états pathologiques représentatifs des

phases tardives de la maladie.

Les modèles animaux donnent accès à des échantillons blologiques qui permettent d'analyser différentes étapes du développement d'une pathologie et de comparer ces étapes à des témoins sains. A cet égard, des souris transgéniques qui expriment le gène humain SOD1 portant l'une des mutations qui prévaut dans les FALS (mutation G93A) sont disponibles auprès de Jackson Laboratory, sous condition de prise d'une licence d'utilisation auprès de la NorthWestern University. Ce modèle reproduit en 120 jours l'issue fatale de la

maladie avec des symptômes comparables à ceux de la maladie humaine.

L'apparition des symptômes d'ALS liés à la mutation G93A dans SOD1 n'est o pas la conséquence d'une réduction de l'activité superoxyde dismutase mais d'un gain de fonction qui augmente la capacité de l'enzyme à générer des radicaux libres. Malgré ces informations, les évènements moléculaires qui président aux différentes étapes de l'ALS sont mal connus. La complexité de ces évènements moléculaires reflète l'évolution de la pathologie: Dans le modèle transgénique étudié, aucune dérégulation neuronale ou manifestation clinique n'a été rapportée à 30 jours. 60 jours correspondent à un stode qui précède de peu les premiers symptô mes, ma is q u i est d éjà caractérisé au niveau cérébral par des changements dans la physiologie cellulaire tels qu'une altération du métabolisme mitochondrial, un stress et une mort neuronale associés à un phénomène d'excitotoxicité. A 90 jours, 50% des motoneurones corticaux et spinaux sont morts et un processus actif d'apoptose neuronale est o engagé parallèlement à une activation astrocytaire. Le phénomène d 'excitotoxicité n 'est pl us observé à ce stad e. La mort ne u rona le y est associée à l'activation de caspases qui ne semblent pas impliquces dans les phases

précoces de la pathologie.

A côté de ce modèle animal, il est également possible d'étudier le phénomène s d'excitotoxicité sur des modèles cellulaires. Les neurones granulaires du cervelet représentent un modèle avantageux pour l'étude de la mort neuronale expérimentale. En effet, les cultures de ces neurones présentent un enrichissement en neurones par rapport aux cellules gliales, ce qui permet

d'étudier de façon préférentielle les évènements propres à la mort neuronale.

o Pour reproduire certains aspects de l'excitotoxicité, plusieurs approches sont envisageables. Les neurones peuvent être traités par du glutamate qui va stimuler l'ensemble des récepteurs à cet acide aminé excitateur, les récepteurs métabotropiques et les récepteurs ionotropiques. Des traitements à l'aide de NMDA ou de keinate peuvent également être appliqués de façon à stimuler s leurs récepteurs ionotropiques respectifs. L'une des conséquences de la stimulation de ces récepteurs ionotropiques est un effflux de potassium lors de l'ouverture de ces canaux. Cet effflux de potassium participe de façon directe au phénomène d'excitotoxicité puisque augmenter la concentration extracellulaire

de potassium permet de réduire cette mort cellulaire.

Réciproquement, placer des cultures de neurones en présence de faibles

concentrations de potassium conduit à leur mort.

Par conséquent placer des cultures de neurones en présence de faibles concentrations de potassium permet d'étudier l'une des composantes de l'excitotoxicité. Identifier les différents évènements moléculaires spécifiques de ce phénomène doit permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques aussi bien que de

nouveaux marqueurs diagnostiques.

La présente invention d écrit à présent l' identification d 'événements génétiq ues impliqués dans les phénomènes d'excitotoxicité et de mort neuronale. La o présente invention fournit ainsi de nouvelles approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées à ces phénomènes, ainsi que de

nouvelles cibles pour l'identification de composés actifs.

Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à s partir d'ARN extraits de neurones granulaires de cervelet de rat mis en culture selon les techniques connues de l'homme de métier. Avantageusement, des ARN extraits de neurones viables cultivés en présence de 25.uM de potassium ont été comparés à des ARN extraits de neurones placés en conditions de toxicité par abaissement de la concentration de potassium à 5'uM. Cette analyse o a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS

(décrite dans la demande n WO99/46403).

Cette analyse a permis l'identification d'un fragment d'ADNc dérivé de l'ARNm d'une histone déacétylase, démontrant l'implication de cette enzyme dans le développement des processus d'excitotoxicité et de mort neuronale. Plus particulièrement, la présente demande démontre l'existence d'une modification

de l'épissage de l'histone déacétylase au cours de phénomènes d'excitotoxicité.

Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence une altération de la séquence codante de cette enzyme dans les cerveaux engagés dans le phénomène d'excitotoxicité lors de 1'apparition des symptômes de 1'ALS. Cette altération suggère une augmentation de l'activité de l'enzyme correspondante et

donc une hypo-acétylation des histones et autres cibles nucléaires.

Le niveau d'acétylation de ces cibles régule l'activité transcriptionnelle et l'épissage des pré-mRNA. Le niveau d'acétylation des histones et autres facteurs nucléaires est régulé par la balance qui existe entre deux activités s enzymatiques: I'activité histone acétyltransférase et l'activité histone déacétylase. Il a été montré dans le cas de maladies lices à des agrégations de protéines modifiées par adjonctions de répétition de glutamine (la huntingtin dans la o chorée de Huntington, le récepteur aux androgènes dans le cas de certaines atrophies musculaires spinales ou bulbaires) que les histones acétyltransférases sont séquestrées dans les agrégats protéiques. De manière surprenante, I'invention démontre l'existence d'un mécanisme moléculaire de dérégulation génétique conduisant à une excitotoxicité par baisse de l'acétylation des histones et autres facteurs nucléaires impliqués dans la régulation de

l'expression génétique.

La présente invention fournit ainsi une nouvelle cible moléculaire pour le développement d'approches thérapeutiques et diagnostiques de pathologies o liées à l'excitotoxicité. Ces stratégies sont basées sur une modulation de l'activité d'acétylation des histones, plus particulièrement sur une augmentation du niveau d'acétylation des histones. Cette modulation peut être exercoe de différentes manières, préférentiellement par l'utilisation d'inhibiteurs d'histones déacétylases. Ces stratégies thérapeutiques permettent d'améliorer la viabilité neuronale lors des phénomènes d'excitotoxicité impliqués dans différentes pathologies du système nerveux, notamment la maladie d'Alzheimer, la sclérose

en plaque et la Sclérose Amyotrophique Latérale (SLA).

Un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur d'histone so déactétylase pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives, notamment en phase précoce, plus préférentiellement pour réduire l'excitotoxicité neuronale associée aux maladies

neurodégénératives, notamment en phase précoce.

Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement d'une s pathologie associée à un stress neuronal, notamment à une excitotoxicité,

comprenant l'administration à un sujet d'un inhibiteur d'histone déacétylase.

Au sens de l'invention, on entend plus préférentiellement par pathologie associée à une excitotoxicité, des maladies neurogénérétaives choisies parmi o l'ALS, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaque et l'ischémie cérébrale. L'invention est également applicable au traitement de l'excitotoxicité neuronale survenant dans d'autres pathologies, notamment en

phase précoce.

Dans le contexte de l'invention, le terme " traitement " désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie, amélioration de la viabilité de neurones placés en conditions d'excitotoxicité, etc.). Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison o avec d'autres agents ou traitements, notamment adressant les événements tardifs de la pathologie, tels que des inhibiteurs de caspases ou autres

composés actifs.

Le terme " inhibiteur " désigne tout composé ou traitement capable d'inhiber ou s de réduire l'expression ou l'activité d'une histone déactétylase. L'inhibiteur est préférentiellement sélectif, c'est-à-dire actif essentiellement sur une histone déactétylase, sans action substantielle directe sur une autre enzyme. A titre particulier, I'inhibiteur d'histone désctétylase est essentiellement dépourvu

d'effet inhibiteur direct sur une histone acétyltransférase.

Différentes histones déacétylases ont été identifiées, clonées et caractérisées.

On peut citer notamment l'histone déacétylase-1 (HDAC1), I'histone déacétylase-2 (HDAC2) et l'histone déacétylase-3 (HDAC3), notamment humaines. Les séquences nuclélques codant ces enzymes et les séquences en acides aminés correspondantes sont décrites dans l'art antérieur, par exemple dans les banques de données Genbank sous les références NM_004964 s (hHDAC1); NM_001527 (hHDAC2); NM_003883 (hHDAC3); AF006603 (mHDAc2). Ces séquences sont également accessibles d'autres sources publiques. Il est entendu que l'invention s'adresse également aux variants

naturels eVou homologues de ces séquences spécifiques.

o Dans le cadre de la présente invention, on utilise préférentiellement un inhibiteur d'histone déacétylase humaine, notamment d'hHDCA1, hHDCA2 eVou

hHDCA3, plus préférentiellement un composé inhibiteur.

Le composé utilisé peut être tout composé capable d'inhiber l'expression de I'histone déacétylase, c'est-à-dire en particulier tout composé inhibant la transcription du gène, la maturation des ARNs, la traduction de l'ARN, la modification post-traductionnelle de la protéine, la liaison de la protéine sur une ci ble molécu la ire, etc. o Le composé peut être de nature et d'origine variées, telles que notamment d'origine naturelle (par exemple d'origine végétale, bactérienne, virale, animale ou eucaryote) ou synthétique (notamment une molécule organique ou inorganique, synthétique ou semi-synthétique). Il peut s'agir par exemple d'un acide nucléique, un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), un lipide, un composé chimique, etc. Dans une première variante de réalisation, I'inhibiteur est un acide nucléique anti-sens, capable d'inhiber la transcription du gène de l'histone déacétylase ou la traduction du messager correspondant. L'acide nucléique anti-sens peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène de l'histone déacétylase, du messager de l'histone déacétylase, ou d'une séquence complémentaire à celles-ci. L'antisens peut être un ADN, un ARN, un ribozyme, etc. ll peut être simple-brin ou double-brin. Il peut également s'agir d'un ARN codé par un gène antisens. Dans le cadre de l'utilisation d'un acide nuclélque antisens comprenant une partie de la séquence du gène ou du messager considéré, on utilise prétérentiellement une partie comprenant au moins 10 bases consécutives de la séquence, plus préférentiellement au moins 15, afin s'assurer une spécificité d'hybridation. S'agissant d'un oligonucléotide antisens, il comprend typiquement moins de 100 bases, par exemple de l'ordre de 10 à 50 bases. Cet oligonucléotide peut être modifié pour améliorer sa stabilité, sa résistance aux nucléases, sa pénétration cellulaire, etc. Une complémentarité o parfaite entre la séquence de l'antisens et celle du gène ou messager cible n'est

pas indispensable, mais elle est généralement préférce.

Selon une autre variante de réalisation, le composé inhibiteur est un polypeptide. Il peut s'agir par exemple d'un peptide comprenant une région de la s séquence d'une histone déacétylase, et capable d'antagoniser son activité. Un peptide comprend avantageusement de 5 à 50 acides aminés consécutifs de la séquence primaire de la déacétylase considérée, typiquement de 7 à 40. Le polypeptide peut également être un anticorps anti-histone déacétylase, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, par exemple un fragment Fab, une région o CDR, ou, plus préférentiellement, un anticorps simple-chane (e.g., ScFv). Les anticorps simple-chane sont particulièrement avantageux dans la mesure o ils peuvent agir de manière spécifique et intracellulaire pour moduler l'activité d'une protéine cible. De tels anticorps ou fragments ou dérivés peuvent être produits par des techniques conventionnelles. comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière

à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).

Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces varices sont décrites dans l'art antérieur. Typiquement, I'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés. Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnces avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à 1'aide d'une protéase selon

les techniques conventionnelles.

o Selon une autre variante de réalisation, le composé est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, capable de moduler l'expression ou l'activité de l'histone déacétylase. De tels composés peuvent être produits et/ou sélectionnés selon différents tests décrits ci-après. A titre d'exemple préféré, on peut citer de s manière non limitative la trichostatin A. Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé inhibiteur d'une histone déacétylase humaine, notamment d'un inhibiteur sélectif, pour la

préparation d'une composition destinée à réduire l'excitotoxicité neuronale.

Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé inhibiteur de l'histone déacétylase 2 humaine, notamment d'un inhibiteur sélectif, pour la préparation d'une composition destinée à réduire l'excitotoxicité neuronale,

notamment pour le traitement de l'ALS.

Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur d'une histone déacétylase humaine, notamment d'un inhibiteur sélectif, pour la préparation d'une composition destinée au traitement de l'ALS, notamment pour

réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce de l'ALS.

Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de la trichostatin A pour la préparation d'une composition destinée à réduire l'excitotoxicité neuronale eVou pour la préparation d'une composition destinée au traitement de l'ALS. Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de la trichostatin s A pour la préparation d'une composition destinée à inhiber l'activité de l'histone

déacétylase 2 chez les patients atteints d'ALS.

L'invention concerne également des méthodes de traitement de l'ALS comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé o inhibiteur de l'expression ou de l'activité d'une histone déacétylase, notamment

de l'histone déacétylase 2, de préférence humaines.

De préférence, I'invention est utilisée pour le traitement en phase précoce des

maladies neurodégénératives.

L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du

métier, de préférence par injection, typiquement par voie intrapéritonéale, intra-

cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Ces doses injectées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg o à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nuclélques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (e.g., tampons,

s solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).

L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.

L'invention montre notamment l'existence d'événements d'épissage qui so affectent la région codante de l'histone déacétylase 2 (mHDA2, référence Genbank: AF006603), plus particulièrement une région recouvrant les nucléotides 2934 à 3243. Cet épissage détecté préférentiellement dans les conditions de viabilité neuronale (25,uM de potassium) inactive l'enzyme et aboutit à une augmentation de l'acétylation des histones et autres acteurs de l'expression génétique dans les neurones viables. Réciproquement, il est mis en évidence qu'une diminution de l'acétylation des mémes acteurs nucléaires est associée à la mort neuronale en présence de 5,uM de potassium. La présente invention ouvre donc une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur l'utilisation d'inhibiteurs d'histone déacétylase afin de restaurer la viabilité neuronale lors d'efflux de potassium et notamment lors des phénomènes d'excitotoxicité et plus particulièrement lors de pathologies comme l'ALS. La présente invention o propose, pour la première fois, I'histone déacétylase 2 comme cible thérapeutique pour le traitement des événements moléculaires associés à l'excitotoxicité. Selon d es modes de mise en _uvre particul iers, I' i nvention peut étre utilisée pour inhiber ou réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce des maladies neurodégénératives. Elle est applicable notamment au traitement de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en

plaques, ou de l'ischémie cérébrale.

La présente invention fou rn it éga lement u ne no uvel le ci b le pou r l' id entificatio n, la validation, la sélection ou l'optimisation de composés actifs. L'invention o permet en effet de sélectionner des composés ayant des propriétés thérapeutiques ou blologiques avantageuses, sur la base de leur capacité à moduler l'expression ou l'activité d'histone déacétylase. Ces tests peuvent étre réalisés en système cellulaire, animal, ou acellulaire (e.g., sur des protéines, polypeptides ou acides nuclélques isolés, ou sur des système d'expression in vitro), et étre basés sur la mesure d'une interaction (e.g., tests de liaison,

déplacement, compétition, etc.) ou d'une fonction (activité, transcription, etc.).

Un autre objet particulier de l'invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les so pathologies associées à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une histone déacétylase ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé à inhiber l'expression ou l'activité de

cette protéine.

Les méthodes peuvent être mises en _uvre avec différentes populations s cellulaires, telles que des cellules primaires ou des lignées de cellules d'origine mammifère (humaine, murine, etc.). On utilise avantageusement des cellules qui n'expriment pas naturellement l'histone déacétylase considérée, transfectées avec un acide nuclélque codant l'enzyme souhaitée. De cette manière, la sélectivité de la méthode est augmentée. On peut également utiliser des cellules o eucaryotes inférieures (levure, etc.) ou des cellules procaryotes. On peut

également utiliser des animaux non-humains transgéniques.

L'effet inhibiteur peut être mesuré de différentes façons, comme notamment par dosage des ARN, dosage de la protéine, mesure d'une activité, etc. Les sondages peuvent être effectués par toute technique immuno-enzymatique classique (RIA, ELISA, EiA, etc.) ou par des techniques d'hybridation avec des sondes marquces, sur puce, amplification avec des amorces spécifiques, etc. Les méthodes de sélection peuvent également être réalisoes en système o acellulaire, par mesure de la capacité de composés tests à lier l'histone déacétylase ou un variant ou fragment de celle-ci. A cet égard, un autre objet particulier de l'invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les pathologies associées à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact d'un

composé test avec une histone déacétylase ou un variant ou fragment de celle-

ci, et la détermination de la capacité du composé test à lier ladite histone déacétylase, fragment ou variant. L'histone déacétylase, fragment ou variant peut être utilisée sous forme isolée et purifiée, soluble ou attachée à un support (e.g., bille, colonne, etc.), ou incorporé à une membrane ou une vésicule. La so liaison du composé test et de l'histone peut être déterminée par toute technique connue, notamment par déplacement d'un ligand de référence marqué, par migration sur gel, électrophorèse, etc. Le terme " variant " inclut des polypeptides comprenant une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions eVou additions d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présentant substantiellement la même spécificité antigénique OU activité, et notamment conservant la capacité à déacétyler une histone. Des exemples typiques de dérivés incluent des variations de séquence dues au polymorphisme de l'histone déacétylase, à l'épissage, etc. Des dérivés particulièrement préférés comprennent au plus 5 résidus d'acides aminés distincts de ceux présents dans la séquence sauvage. Le terme " fragment " o désigne tout polypeptide comprenant de 5 à 100 résidus consécutifs de la séquence en acides aminés de l'histone déacétylase, de préférence de 10 à

100. Les fragments comportent avantageusement un site actif de l'enzyme.

Les composés tests peuvent être de nature et d'origine varices, telles que des composés naturels ou synthétiques, des lipides, des acides nucléiques, des polypeptides, des molécules chimiques, etc. Il peut s'agir de composés isolés ou sous forme de mélange, de banques combinatoires, etc. Dans les méthodes de l'invention, il est possible de tester en parallèle plusieurs composés tests, par exemple dans des dispositifs adaptés tels que plaque multipuits, boite, etc. Un autre objet de l'invention concerne tout variant d'épissage d'une histone déacétylase ainsi que tout acide nucléique codant un tel polypeptide, les vecteu rs le co ntena nt, cell u les recombinantes, et util isatio ns. Les vecteu rs peuvent être des plasmides, phages, cosmides, virus, chromosomes artificiels, etc. Des vecteurs préférés sont par exemple des vecteurs plasmidiques, comme ceux dérivés de plasmides commerciaux (pUC, pcDNA, pBR, etc.). De tels vecteurs comportent avantageusement un gène de sélection eVou une origine de réplication eVou un promoteur transcriptionnel. D'autres vecteurs particuliers sont par exemples des virus ou des phages, notamment des virus recombinants so défectifs pour la réplication, tels que des virusdérivés de rétrovirus, adénovirus, MV, herpès-virus, baculovirus, etc. Les vecteurs peuvent être utilisés dans tout hôte compétent, comme par exemple des cellules procaryotes ou eucaryotes. Il peut s'agit de bactéries (par exemple E. coli), levures (par exemple Saccharomyces ou Kluyveromyces), cellules végétales, cellules d'insectes, cellules de memmifères, notamment humaines, etc. Il peut s'agir de lignées, cellules primaires, cultures mixtes, etc. La présente invention est également utilisable pour le diagnostic de situations d 'excititoxicité, nota mment en phases p récoces. El le est notam ment uti l isab le pour détecter la présence, la prédisposition ou le développement d'une situation d'excitotoxicité chez un sujet, notamment d'une pathologie associée à une telle o situation, telle que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, I'ALS ou l'ischémie cérébrale. Elle est particulièrement adaptée à la

détection à un stade précoce de la sclérose en plaques ou de l'ALS.

Un autre aspect de la présente demande concerne donc des méthodes et outils pour détecter la présence d'une histone déacétylase (ou d'un variant d'épissage ou autre altération génétique) dans des échantillons blologiques, ou pour la

doser ou déterminer ses quantités relatives.

Un objet particulier de l'invention concerne une méthode de détection d'une o situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la mesure in vitro ou ex vivo de l'expression d'une (ou de plusieurs) histones déacétylases, notamment de l'histone déacétylase 2, dans un échantillon

provenant du sujet.

Un autre objet particulier concerne une méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la détection de la présence (ou de l'absence) d'une forme motée d'une (ou de plusieurs) histones déacétylases, notamment de l'histone déacétylase 2, ou de 1'ARN

correspondant, dans un échantillon provenant du sujet.

Des outils adaptés à la mesure ou à la détection d'une protéine, d'un ARN ou d'une expression comprennent notamment des sondes ou amorces nuclélques, des anticorps ou autres ligands spécifiques, des kits, supports, puces, etc. Les méthodes de détection peuvent inclure les méthodes d'hybridation, de PCR, de chromatographie, d'immunologie, etc. Ces méthodes sont particulièrement adaptées à la détection, la caractérisation, le suivi de la progression ou de s l'effficacité d'un traitement de pathologies telles que mentionnées ci-avant, ou à

la détermination d'une prédisposition.

La méthode peut être mise en _uvre à partir de différents échantillons blologiques, tels que sang, plasma, urine, sérum, salive, biopsies ou cultures o cellulaires, etc. Il s'agit de préférence d'un échantillon comprenant des cellules nerveuses ou musculaires. Selon la technique utilisée, I'échantillon peut être traité préalablement, par exemple pour rendre les acides nuclélques accessibles à une réaction d'hybridation eVou d'amplification, eVou pour rendre les protéines

accessibles à une réaction immunologique ou enzymatique.

Dans un mode particulier de mise en _uvre, on mesure l'expression, on détecte ou on dose, dans l'échantillon, la présence ou la quantité d'ARNm codant une histone déacétylase. Plusieurs histones déacétylases peuvent être détectées ou

dosées en parallèle.

Cette mesure, détection ou ce dosage peuvent être effectués par hybridation de l'échantillon avec une sonde nucléique spécifique de l'ARN considéré, notamment une sonde comprenant tout ou partie d'une séquence de l'ARN messager de l'histone déacétylase ou d'une séquence complémentaire ou s dérivée. Dans un mode particulier, la sonde est simple-brin eVou est marquée, pour faciliter la détection du produit d'hybridation. Le marquage peut être radioactif, fluorescent, luminescent, etc. La sonde peut être immobilisée sur un support. so Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée du gène ou de l'ARN messager d'une histone déacétylase pour la mise en _uvre d'une méthode de diagnostic, de détection, de dépistage ou de caractérisation d'une situation de stress neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité, notamment d'une méthode de diagnostic, de détection, de dépistage ou de caractérisation de pathologies neurodégénératives ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'excitotoxicité ou de stress neuronal, notamment d'une séquence

spécifique, complémentaire ou dérivée de cette séquence.

Comme indiqué ci-avant, la présente demande démontre l'existence d'une forme non épissée dans certains tissus engagés dans des processus de o neurotoxicité, et l'invention permet une détection ou un dosage relatif de la forme épissée et de la forme non épissée dans l'échantillon. L'apparition, la présence ou l'augmentation de l'espèce non-épissée est corrélée au développement de la situation d'excitotoxicité. Dans une variante particulière, la méthode de l'invention prévoit donc une analyse de la présence de la forme

épissée et/ou de la forme non épissée de 1'ARN codant l'histone déacétylase.

Cette détection peut être réalisoe par exemple en utilisant une sonde nucléique spécifique de la séquence résultant de la jonction entre les régions non délétées (i.e., non-épissées) de l'ARN. L'évolution de rapport entre la forme épissée et la forme non épissée peut être suivie, comme un indicateur de la progression de la

o pathologie (ou de l'efficacité d'un traitement.

La mesure, détection ou le dosage peuvent également être effectués par amplification sélective des acides nuclélques de l'échantillon avec une amorce nuclélque (ou un couple d'amorces) spécifique de l'ARN considéré. Dans un mode particulier, I'amorce (ou l'une des amorces du couple) est spécifique de la

séquence résultant de la jonction entre les régions non délétées (i.e., non-

épissées) de l'ARN. L'amplification peut être effectuée par exemple par PCR. Le

produit d'amplification peut être détecté ou dosé par toute technique connue.

Une telle amorce (ou couple d'amorce) constitue un autre objet de la présente

demande.

Dans un autre mode particulier de mise en _uvre, on détecte ou on dose, dans l'échantillon, la présence ou la quantité d'histone déacétylase. Cette détection peut être réalisée en utilisant un anticorps spécifique, ou tout autre ligand spécifique. Un autre objet de l'invention concerne un (produit comprenant un) support sur lequel un ou plusieurs acides nuclélques (y compris un vecteur, une sonde, une amorce, un oligonucléotide, un antisens), polypeptides (y compris un anticorps) ou cellules tels que définis ci-avant sont immobilisés. Le support peut être o solide, plan ou non, répulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, etc., ou tout autre matériau compatible. Les polypeptides ou acides nucléiques sont préférentiellement immobilisés par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'interaction avec un ligand spécifique, tel qu'un anticorps ou une sonde. Les polypeptides ou acides nuclélques peuvent être arrangés de manière précise sur le support, et

déposés en plusieurs exemplaires.

L'invention est également utilisable pour la caractérisation de tissu et de la situation ischémique. Cette utilisation est également basée sur la détection ou le

dosage d'une histone déacétylase ou d'une forme altérée dans le tissu.

D'autres aspects et avantages de la présente invention appara^'tront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

EXEMPLES

Exemple 1: Identification de l'histone déacétviase 2 comme cible moléculaire de l'excitotoxicité L'analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN poly adénylés ( poly A+) extraits d 'échantil lo ns d e cerveaux d 'an i ma ux co rrespo nd a nt aux différents stades, sans isolement préalable des neurones afin de prendre en compte un maximum d'évènements d'épissages alternatifs liés au développement de la pathologie. Les ARN poly A+ sont préparés selon des techniques connues de l'homme de métier. Il peut s'agir en particulier d'un traitement au moyen d'agents chaotropiques tels que le thiocyanate de guanidium suivi d'une extraction des ARN totaux au moyen de solvants (phénol, chloroforme par exemple). De telles o méthodes sont bien connues de l'homme du métier (voir Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), et peuvent être aisément pratiquées en utilisant des kits disponibles dans le commerce. A partir de ces ARN totaux, les ARN poly A+ sont préparés selon des méthodes classiques

con nues d e l' hom me de métie r et pro posées par d es kits co m merciaux.

s Ces ARN poly A+ servent de matrice à des réactions de transcription inverse à l'aide de reverse transcriptase. Avantageusement sont utilisées des reverse transcriptases dépourvues d'activité RNase H qui permettent d'obtenir des premiers brins d'ADN complémentaire de tailles supérieures à ceux obtenus avec des reverse transcriptases classiq u es. De tel les prépa rations d e reverse

o transcriptases sans activité RNase H sont disponibles commercialement.

Pour chaque point de la cinétique de développement de la pathologie (30 jours, jours et 90 jours) les ARN poly A+ ainsi que les ADNc simple brins sont préparés à partir des animaux transpéniques (T) et des animaux contrôles

syngéniques (C).

Conformément à la technique DATAS, pour chaque point de la cinétique sont réa l isées des hybridatio n s d 'ARN m (C) avec d es ADNc (T) et des hybrid ations

réciproques d'ARNm (T) avec des ADNc (C).

Ces hétéroduplex ARNm/ADNc sont ensuite purifiés selon les protocoles de la

technique DATAS.

so Les séquences d'ARN non appariées avec un ADN complémentaire sont libérées de ces hétéroduplex sous l'action de la RNase H. cette enzyme dégradant les séquences d'ARN appariées. Ces séquences non appariées représentent les différences qualitatives qui existent entre des ARN par ailleurs homologues entre eux. Ces différences qualitatives peuvent être localisées n'importe o sur la séquence des ARN, aussi bien en 5', 3' ou à 1'intérieur de la séquence et notamment dans la séquence codante. Selon leur localisation, ces s séquences peuvent être non seulement des modifications d'épissage mais

également des conséquences de translocations ou de délétions.

Les séquences d'ARN représentant les différences qualitatives sont ensuite clonées selon les techniques connues de l'homme de métier et notamment

celles décrites dans le brevet de la technique DATAS.

o Ces séquences sont regroupées au sein de banques de cDNA qui constituent des banques qualitatives différentielles. Une de ces banques contient les exons et les introns spécifiques de la situation saine; les autres banques contiennent

les évènements d'épissage caractéristiques des conditions pathologiques.

L'expression différentielle des clones a été vérifiée par hybridation avec des s sondes obtenues par reverse-transcription à partir d'ARN messagers extraits des différentes situations étudiées. Les clones hybridant de façon différentielle ont été retenus pour analyse ultérieure. Les séquences identifiées par DATAS correspondent à des introns eVou à des exons exprimées de façon différentielle par épissage entre les situations pathologiques et la situation saine. Ces o évènements d'épissage peuvent être spécifiques d'une étape donnée du

développement de la pathologie ou caractéristiques de l'état sain.

La comparaison de ces séquences avec les banques de données permet de classifier les informations obtenues et de proposer une sélection raisonnce des

s séquences selon leur intérêt diagnostique ou thérapeutique.

Les résultats obtenus montrent l'existence d'événements d'épissage qui affectent la région codante de l'histone déacétylase 2 (mHDA2, référence Genbank: AF006603), plus particulièrement une région recouvrant les so nucléotides 2934 à 3243. Cet épissage détecté préférentiellement dans les conditions de viabilité neuronale (25,uM de potassium) inactive l'enzyme et aboutit à une augmentation de l'acétylation des histones et autres acteurs de I'expression génétique dans les neurones viables. Réciproquement, il est mis en évidence qu'une diminution de l'acétylation des mêmes acteurs nucléaires est

associée à la mort neuronale en présence de 5M de potassium.

Exemple 2: Inhibition de l'excitotoxicité par des inhibiteurs de d'histone acétvitransférase Pour cet exemple, des neurones granulaires du cervelet de rat sont mis en culture selon les techniques connues de l'homme de métier. L'excitotoxicité est induite sur ces cellules par deux types de traitement: I'administration conjointe de 100,uM de NMDA (NMethyl-D-apartic acid) et de 10,uM de sérine d'une part, I'administration de 50M de kainate d'autre part. Dans les conditions expérimentales retenues, 30 à 40% de toxicité est observée et mesurée par des

tests MTT connus de l'homme de l'art.

Une inhibition de l'excitotoxicité peut être mise en évidence en présence d'inhibiteurs d'histone déacétylase, notamment de trichostatin A. La présente invention docomente donc l'implication de l'histone déacétylase 2 dans les mécanismes d'excitotoxicité, notamment dans un modèle d'ALS, et aussi la capacité d'inhiteurs de cette enzyme à préserver la viabilité neuronale lors de

stress liés à l'excitotoxicité.

D'autres aspects et applications de l'invention résident dans: I'utilisation de tout fragment d'acide nuclélque y compris des ARN antisens dans le but d'inhiber l'expression de l'histone déacétylase 2 chez les patients atteints de telles pathologies, -I'utilisation de tout composé chimique, la trichostatin A, ou de toute composition pharmaceutique la contenant, dans le but d'inhiber l'activité de l'histone

so déacétylase 2 chez les patients atteints de telles pathologies.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Méthode de détection d'une situation d'excitotoxicité ou de stress neuronal chez un sujet, comprenant la mesure in vitro de l'expression d'une histone s déacétylase, notamment de l'histone déacétylase 2, dans un échantillon provenant du sujet ou la détection de la présence d'une forme mutée d'une histone déacétylase, notamment de l'histone déacétylase 2, ou de l'ARN

correspondant, dans un échantillon provenant du sujet.

o

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure de l'expression est effectuée par hybridation de l'échantillon avec une sonde

nuclélque spécifique de l'ARN de l'histone déacétylase considérée.

3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la sonde nucléique s comprend tout ou partie d'une séquence de l'ARN messager de l'histone

déacétylase ou d'une séquence complémentaire ou dérivée de celle-ci.

4. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mesure de l'expression est effectuée par amplification sélective des acides nucléiques de I'échantillon avec une amorce nucléique (ou un couple d'amorces) spécifique de

l'ARN considéré.

5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que

l'échantillon comprend des cellules nerveuses ou musculaires.

6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, pour le diagnostic ou la

détection de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose

en plaques, de l'ALS ou de l'ischémie cérébrale.

o

7. Méthode selon la revendication 6, pour la détection à un stade précoce de la

sclérose en plaques.

8. Utilisation d'un acide nucléique comprenant tout ou partie d'une séquence dérivée du gène ou de l'ARN messager de l'histone déacétylase 2 pour la mise en _uvre d'une méthode de diagnostic ou de détection d'une situation de stress

neuronal et plus particulièrement la situation d'excitotoxicité.

9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'acide nucléique comprend tout ou partie de l'histone déacétylase 2, ou de la séquence résultant de la jonction entre les régions non délétées, ou une séquence complémentaire

de celles-ci.

10. Utilisation d'un composé inKibiteur d'histone déacétylase pour la préparation d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives

associées à une excitotoxicité.

s

11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le composé est acide nocléique anti-sens, capable d'inhiber la transcription du gène de l'histone

déacétylase ou la traduction du messager correspondant.

12. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le composé est

un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique.

13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisoe en ce que le composé est

la trichostatinA.

14. Utilisation selon l'une des revendications 10 à 13, pour inhiber ou réduire

l'excitotoxicité neuronale en phase précoce des maladies neurodépénératives.

15. Utilisation selon l'une des revendications 10 à 14, pour le traitement de la

maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, de la sclérose en plaques ou

de l'ischémie cérébrale.

16. Utilisation selon l'une des revendications 10 à 14, pour le traitement de

l'ALS, notamment pour réduire l'excitotoxicité neuronale en phase précoce de l'ALS.

17. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les pathologies associces à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule exprimant une histone déacétylase ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci, et la détermination de la capacité du composé à inhiber l'expression ou

o l'activité de cette protéine.

18. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés actifs, notamment sur les pathologies associces à l'excitotoxicité ou au stress neuronal, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une histone s déacétylase ou un variant ou fragment de celle-ci, et la détermination de la