WO2004056991A2 - Nouvelle cible moleculaire de l'angiogenese et utilisations - Google Patents

Nouvelle cible moleculaire de l'angiogenese et utilisations Download PDF

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WO2004056991A2
WO2004056991A2 PCT/FR2003/003776 FR0303776W WO2004056991A2 WO 2004056991 A2 WO2004056991 A2 WO 2004056991A2 FR 0303776 W FR0303776 W FR 0303776W WO 2004056991 A2 WO2004056991 A2 WO 2004056991A2
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nucleic acid
inhibitor
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Fabien Schweighoffer
Silvère Petit
Emmanuel Valentin
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Exonhit Therapeutics
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present application relates to the field of biology and health. It relates more particularly to the identification and functional characterization of a new protein involved in the mechanisms of angiogenesis, as well as the use of this protein as a therapeutic, diagnostic or screening target. It also relates to tools which can be used for the implementation of therapeutic, diagnostic or screening methods, such as in particular probes, antibodies, vectors, recombinant cells, etc.
  • the invention is particularly useful for the preparation of pharmaceutical compounds in the field of cancers, angiogenesis and hypoxia.
  • Angiogenesis is a complex process by which new blood vessels are formed, typically from the preexisting vasculature. Angiogenesis takes place mainly during embryonic development, but also plays an essential role in the adult stage in certain highly regulated physiological processes, such as in particular during the healing, ovulation and menstruation processes.
  • angiogenesis is not only essential for the growth of a tumor, but is also involved in the progression from the benign stage to the stage of invasive cancer, and in the progression of dormant metastases towards metastatic lesions.
  • angiogenesis is a complex process, which involves various events such as the degradation of the extracellular matrix, the proliferation and migration of endothelial cells, the synthesis of a new extracellular matrix, the recruitment of pericytes, tubule formation and anastomosis of new vessels.
  • elastin is a protein of the extracellular matrix which is secreted in a soluble form (tropoelastin) then aggregates to form the insoluble fibers of elastin. These fibers are present among others in the skin, the pulmonary alveoli and the vasculature. It is the special mechanical properties of elastin fibers that give elasticity to a number of vessels. Elastin is expressed mainly during embryonic development and postnatal growth, then its expression is very greatly reduced in the adult stage.
  • Severe vascular pathologies hyper proliferative neointima
  • Severe vascular pathologies are associated with a defect in the elastin fibers.
  • Poor incorporation of tropoelastin into elastin fibers as well as degradation of elastin fibers by proteases can lead to the hyper proliferation of smooth muscle vascular cells, which is observed in these pathologies.
  • elastin fibers act as reservoirs for many growth factors present in serum.
  • the serious defects in elastogenesis observed in supra-valvular aortic stenosis or in Williams-Beuren disease, lead to greater exposure of vascular cells to these growth factors. This hypothesis has recently been confirmed by a mouse model in which the gene coding for elastin has been invalidated. Mice homozygous for the mutation develop a hyper proliferation of the intima, in particular in the aorta.
  • Tropoelastin or peptides from the breakdown of elastin fibers, can interact with membrane receptors (S-gal / EBP and Galectin-3) found in many cell types. The binding of these ligands to EBP has potent mitogenic effects. Thus, a failure to incorporate tropoelastin into existing fibers also leads to cellular hyper proliferation.
  • RNA extracted from HMEC-1 cells (“Human dermal Microvascular Endothelial
  • RNAs coding for proteins involved in the stress response and in particular ORP150, which is directly involved in the response to hypoxic stress and in the stabilization of the VEGF factor, are also part of this repertoire, underlining the implication. of this response in response to hypoxia.
  • RNAs from HMEC-1 cells treated or not with DFO made it possible to isolate two cDNA fragments derived from the mRNA of the gene coding for the protein FKBP65 (GenBank under the reference NM_021939).
  • the protein FKBP65 belongs to the family of peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, involved in the folding of proteins.
  • FKBP65 is an enzyme located in the endoplasmic reticulum, which can intervene in the maturation of tropoelastin.
  • the FKBP65 protein is mainly expressed during development, and its expression is not detectable in the adult stage.
  • this enzyme can intervene in the maturation of certain members of the collagen family (I and III), a predominant component of the extracellular matrix.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the present application demonstrates for the first time that this sequence is expressed and has important biological properties in the regulation of hypoxia and angiogenesis. It shows in particular a deregulation of the expression of this protein in response to hypoxic stress and to VEGF treatment.
  • the present application thus provides a new molecular target for angiogenesis and the response to hypoxia, and allows the development of new therapeutic and diagnostic strategies for pathologies involving these mechanisms, as well as new approaches for research, selection, optimization or production of active compounds on these pathologies.
  • the results provided in the present application also demonstrate the anti-angiogenic properties of compounds that inhibit the protein FKBP65.
  • the present application therefore relates to the use of this protein as a target for the development of new molecules or of diagnostic methods. It also relates to regulatory compounds of the FKBP65 protein and their therapeutic use. It also relates to methods and compositions for screening for active compounds.
  • a first subject of the invention relates to variants of the FKBP65 protein (typically in isolated or purified form), as well as specific fragments thereof.
  • nucleic acids encoding variants of the FKBP65 protein (typically in isolated or purified form), as well as specific fragments thereof.
  • the nucleic acids can be DNA or RNA, for example.
  • compositions comprising a variant of the protein FKBP65 (typically in isolated or purified form), or a specific fragment thereof, or a nucleic acid encoding such a variant or fragment.
  • Another subject of the invention relates to a vector comprising a nucleic acid as defined above, as well as any recombinant cell comprising such a vector or nucleic acid, and / or expressing a variant of FKBP65.
  • Another subject of the invention resides in the use of an inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers, in particular for inhibiting the growth of tumors or the formation of metastases in patients suffering from cancers.
  • Another object of the invention lies in the use of an inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis. Another object of the invention lies in the use of a protein inhibitor
  • FKBP65 for the preparation of a medicament intended for the treatment of retinopathies linked to diabetes, macular degeneration, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, or pathologies linked to delayed scarring.
  • Another subject of the invention resides in a method of treatment of a pathology as defined above in a subject, in particular of a pathology having a component linked to angiogenesis, comprising the administration to a subject suffering from 'an effective amount of an inhibitor of the protein FKBP65.
  • Another subject of the invention relates to compounds inhibiting the FKBP65 protein, in particular an antibody, an inhibiting nucleic acid or a cytotoxic ligand, as well as compositions containing them.
  • the invention also relates to a method for detecting a pathology or a predisposition to a pathology in a subject, or for monitoring the evolution or the stage of advancement of a pathology, comprising determining the presence, the quantity (relative or absolute) or distribution, in a sample of said subject, of the protein FKBP65, of its expression, of altered forms thereof or of the corresponding gene or messenger RNA.
  • It also relates to methods of selection, screening, characterization, optimization or production of active compounds, comprising a step of determining the capacity of a test compound to interact with the protein or the FKBP65 gene, to modulate its expression or to modulate its activity.
  • the invention is particularly suitable for the development of medicaments or methods for the diagnosis or screening of diseases having a component linked to angiogenesis, as indicated above.
  • protein FKBP65 designates any polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 2 (wild isoform), a variant of the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof.
  • variant designates in particular all the natural variants of the sequence SEQ ID NO: 2, resulting for example from polymorphism (s), splicing (s), mutations (s), etc. Such natural variants can therefore comprise one or more mutations or substitutions, a deletion of one or more residues, etc. compared to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • present invention now describes the identification of new isoforms of the human FKBP65 protein, resulting from qualitative alterations in RNA, in particular splicing.
  • the applicants have highlighted three new isoforms of splicing, the characteristics of which are summarized below:
  • Isoform 2 presence of a first alternative exon denoted 6B, located between exon 6 and exon 7.
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 4.
  • the additional region resulting from the presence of the alternative exon 6B corresponds to residues 356 to 417 inclusive.
  • the corresponding coding sequence is represented on the SEQ ID NO: 4.
  • Isoform 3 presence of a second alternative exon denoted 7B, located between exon 7 and exon 8.
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 6.
  • the additional region resulting from the presence of the alternative exon 6B corresponds to residues 420 to 438 inclusive.
  • the corresponding coding sequence is represented on the SEQ ID NO: 6.
  • Isoform 4 presence of exon 6B in the absence of exon 7 (mutually alternative exons).
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 8.
  • the additional region resulting from the presence of the alternative exon 6B corresponds to residues 355 to 431 inclusive (residues 417 to 431 correspond to a newly created sequence) .
  • the corresponding coding sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • specific fragment or part designates a fragment characteristic of the variants considered, typically a fragment carrying at least one genetic alteration characteristic of the variants considered. Such specific fragments are therefore distinguished from the wild-type sequence by the presence of their own structural characteristic (eg, mutation, new junction, intron retention, sequence deletion, stop codon, new sequence resulting from a shift in the reading frame, etc.) resulting from an alteration event highlighted by the applicants.
  • This specific structural characteristic is also designated by the expression "target sequence”.
  • Specific fragments according to the invention therefore comprise at least one target sequence as defined above.
  • Preferred fragments comprise at least 5 consecutive nucleotides of the sequence considered, preferably at least 8, more preferably at least 12. Fragments can comprise up to 50, 75 or 100 nucleotides, or even more.
  • a particular object of the invention resides in particular in a polypeptide comprising residues 356 to 417 of the sequence SEQ ID NO: 4 or residues 420 to 438 of the sequence SEQ ID NO: 6 or residues 355 to 431 or 417 to 431 of the sequence SEQ ID NO: 8, a fragment thereof comprising at least 5 consecutive residues, preferably at least 8, more preferably at least 12.
  • variant also designates the FKBP65 polypeptides originating from another species, for example rodents, cattle, etc.
  • FKBP65 protein designates a polypeptide of human origin.
  • variant also includes any synthetic variant of an FKBP65 protein, and in particular any polypeptide comprising one or more mutations, deletions, substitutions and / or additions of one or more amino acids relative to the sequence SEQ ID NO 2, 4, 6 or 8.
  • polypeptides recognized by a polyclonal antibody produced from the FKBP65 protein of sequence SEQ ID NO 2, 4, 6 or 8.
  • Preferred synthetic variants advantageously comprise at least 75% identity with the primary sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, preferably at least 80%, more preferably at least 85%. Even more preferably, the preferred synthetic variants have at least 90% identity with the primary sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, preferably at least 95%, 96%, 97% or 98%.
  • the degree of identity can be determined by different methods and by means of software known to those skilled in the art, such as for example according to the CLUSTAL method.
  • the variants according to the invention are polypeptides retaining at least one immunological, biological or pharmacological property of the FKBP65 protein of sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8.
  • the biological properties are in particular the modulation of angiogenesis or elastin production.
  • the immunological properties are for example the capacity to produce antibodies recognizing the protein of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8.
  • protein FKBP65 also includes polypeptides comprising fragments of the sequence SEQ ID NO: 2 or a variant thereof. They are more particularly the polypeptides comprising a part of the sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8.
  • the fragment polypeptides of the invention preferably contain less than 200 amino acids, more preferably less than 180 amino acids, even more preferably less than 150 amino acids, for example less than 120 amino acids. They advantageously comprise at least 5 consecutive residues of the sequence of the protein FKBP65.
  • the fragment polypeptides contain at least one region or a functional domain of the FKBP65 protein of sequence SEQ ID NO: 2, such as for example an FKBP domain, a retention domain in the endoplasmic reticulum, an EF domain, an epitope, a secondary structure (loop, sheet, etc.), a consensus site, etc.
  • the signal peptide is located at the level of residues 1-26, the EF domain at the level of residues 501-529 and / or 546-574, the retention signal in the reticulum at the level residues 579-582 and the FKBP domain at residues 53-147, 165-259, 277-371 and / or 390-483.
  • Preferred fragments of the invention comprise less than 200 amino acids of the sequence SEQ ID NO 2, 4, 6 or 8 and comprise at least one specific antigenic or immunogenic domain thereof.
  • the present application indeed proposes the production of polypeptides fragments of FKBP65 preferably comprising an immunogenic portion of FKBP65, which can be used for the production of antibodies, assay tests, etc. These polypeptides can be developed using algorithms for assessing the hydrophilicity or antigenicity of a polypeptide.
  • the term "fragment” or "portion” immunogen designates any portion of the polypeptide comprising an epitope, preferably a T or B epitope.
  • Such a fragment therefore advantageously comprises at least 7 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, more preferably at least 10 consecutive amino acids of the sequence considered, even more preferably at least 15 consecutive amino acids.
  • fragments within the meaning of the invention retain one or more properties of FKBP65 as mentioned above.
  • Such biologically active variants or fragments can be used to mimic the action of FKBP65 or to produce corresponding antibodies.
  • fragments within the meaning of the invention are polypeptides capable of antagonizing the activity of FKBP65. Such fragments can be used to inhibit the action of FKBP65. Such fragments can for example comprise the FKBP domain or a functional part thereof, and act as a competitor for the active protein.
  • the FKBP65 polypeptides or proteins of the invention may include heterologous residues added to the indicated amino acid sequence. So an object of the invention resides in a polypeptide comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, or of a variant thereof, and a heterologous part.
  • the heterologous part can correspond to amino acids, lipids, sugars, etc. It can also be a chemical, an enzymatic, a radioactive group, etc.
  • the heterologous part can in particular constitute a marker, a targeting agent, a stabilizing agent, an agent improving immunogenicity or facilitating production, a protective agent, an agent facilitating the penetration of the polypeptide into cells, a toxin, or compound. active, antibody, etc.
  • the FKBP65 proteins of the invention can be in soluble, purified or complexed form with a carrier molecule such as KLH or serum albumin, or any other inert molecule (for example synthetic), such as a bead for example.
  • a carrier molecule such as KLH or serum albumin, or any other inert molecule (for example synthetic), such as a bead for example.
  • the polypeptides according to the invention are preferably devoid of contamination by proteins naturally present in their natural environment.
  • the polypeptides are coupled to a carrier molecule in particular for the manufacture of antibodies. The coupling can be carried out according to conventional techniques.
  • the polypeptides can also be conjugated or fused to any other polypeptide or peptide molecule such as for example a peptide, polypeptide or a biologically active protein.
  • the FKBP65 proteins of the invention can be manufactured by any technique known per se to those skilled in the art, in particular by any chemical, biological, genetic, enzymatic technique, etc., alone or in combination (s).
  • Preferred methods include expression, in an appropriate cellular host, of a corresponding nucleic acid or artificial synthesis according to conventional techniques such as solid phase synthesis.
  • the FKBP65 proteins according to the invention can be used in selection or screening tests, in assay methods, to regulate the activity of FKBP65 in vitro or in vivo, for the production of drugs or vaccines, for the targeting of molecules, for the production of anti-FKBP65 antibodies, in particular therapeutic antibodies, etc.
  • Gene FKBP65 can be used in selection or screening tests, in assay methods, to regulate the activity of FKBP65 in vitro or in vivo, for the production of drugs or vaccines, for the targeting of molecules, for the production of anti-FKBP65 antibodies, in particular therapeutic antibodies, etc.
  • FKBP65 gene is intended to mean any nucleic acid encoding an FKBP65 protein as defined above. It can be DNA or RNA, of natural or synthetic origin. It can in particular be genomic, complementary, chimeric, artificial DNA, mRNA, etc.
  • the FKBP65 gene can be in single-stranded or double-stranded form. It can be obtained by any technique known to those skilled in the art from the sequence SEQ ID NO: 1 and the information contained in the present application.
  • a particular FKBP65 gene comprises all or part of the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 or of a complementary sequence, or of a different sequence due to the degeneration of the genetic code, or of a hybridizing sequence with these under conditions of high stringency and encoding an FKBP65 protein.
  • the FKBP65 gene of the invention can be incorporated into a cloning or expression vector, into the genome of a cell, etc.
  • vectors which can be used to clone an FKBP65 gene of the invention are in particular plasmids, cosmids, episomes, artificial chromosomes, viruses, phages, etc. Mention may be made of various commercial plasmids such as pUC, pcDNA, pBR, etc.
  • viral vectors mention may be made of retroviruses, adenoviruses, AAVs, herpesviruses, etc. Such vectors constitute particular objects of the invention.
  • the gene or vector can be introduced into a host cell to produce an FKBP65 protein.
  • usable cells are in particular mammalian, yeast, plant, insect or bacteria cells. Mention may be made of primary cells or established lines of mammalian cells. Examples of mammalian cells include hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc.
  • mammalian cells include hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc.
  • E. Coli Saccharomyces and Kluyveromyces
  • Such recombinant cells constitute particular objects of the invention.
  • the term “inhibitor of the protein FKBP65” or “inhibitor of FKBP65” designates any molecule, composition, condition or treatment making it possible to reduce the expression or the biological activity of the protein FKBP65 in a cell , a tissue or an organism. It may especially be a compound, treatment or composition inhibiting the transcription of an FKBP65 gene, the maturation of RNAs, the translation of mRNA, the post-translational modification of the protein, its translocation to the reticulum, etc. It can also be a compound, treatment or composition inhibiting the activity of the protein FKBP65, for example by inhibiting its interaction with other cellular constituents, or its activity on tropoelastin or on the maturation of collagen.
  • Inhibitor compounds can be diverse in nature, such as inhibitory nucleic acids, antibodies, peptides, synthetic molecules, etc.
  • inhibitor includes any reduction in the expression or activity of the FKBP65 protein, even if it is not total.
  • inhibitors are preferred which are capable of reducing in vitro by at least 20% the expression or activity of the protein FKBP65, more preferably by at least 30%.
  • particularly preferred inhibitors are selective inhibitors, that is to say which act mainly on the protein FKBP65 and, to a lesser extent or essentially indirectly, on other targets or mechanisms. Selectivity can be determined by testing the effect of inhibitors on other cellular proteins.
  • a selective inhibitor advantageously designates an inhibitor of the FKBP65 protein as defined above, essentially devoid of direct activity (in particular essentially devoid of binding capacity) on the FKBP 12 protein and / or of other members of the family of FKBP.
  • a particular object of the invention relates to a nucleic probe characterized in that it allows the detection of an FKBP65 gene or of a corresponding RNA, typically by selective hybridization from a sample.
  • the probe comprises the sequence of a FKBP65 gene as defined above or a part of it.
  • a probe of the invention typically comprises from 10 to 1000 nucleotides, preferably from 20 to 800, more preferably from 50 to 600, and is generally single-stranded.
  • a particular example of a probe is represented by an oligonucleotide specific and complementary to a region at least of a FKBP65 gene or of corresponding TARN. The oligonucleotide is typically single-stranded, and generally has 10 to 100 bases.
  • Another example of a nucleic acid probe of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 or a coding part thereof.
  • a particular probe according to the invention is a probe specific for a sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 and capable of distinguishing between the different isoforms of FKBP65. It is typically a specific probe and complementary to the specific exons of each of these isoforms or to new junction regions created by the presence or absence of alternative exons.
  • a particular probe according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and the exon 6, on the one hand, or exon 7, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 6B corresponds to residues 356 to 417 of the sequence SEQ ID NO: 4.
  • a particular probe according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 7B, or of a junction region between this alternative exon 7B and the exon 7 , on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 7B corresponds to residues 420 to 438 of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • This sequence, as well as that of the flanking residues and the corresponding nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 5) can be used to construct specific probes according to the invention.
  • a particular probe according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and the exon 6 , on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 6B corresponds to residues 355 to 431 of the sequence SEQ ID NO: 8.
  • This sequence (or fragments thereof, for example between residues 417 and 431), as well that that of the flanking residues and the corresponding nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 7) can be used to construct specific probes according to the invention.
  • the nucleic acid probes according to the invention can be labeled, for example by means of radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent markers, etc.
  • the probes can be in free form or immobilized on a support (column, ball, slide, membrane, etc.).
  • a particular object of the invention relates to a product comprising at least one probe as defined above, immobilized on a support.
  • the support can be solid, flat or not, regular or not, such as for example nylon, glass, plastic, metal, fiber, ceramic, silica, polymer, etc., or any other compatible material.
  • the probe is preferably immobilized by one end, under conditions leaving the molecule accessible for a hybridization reaction.
  • Techniques for immobilizing materials such as nucleic acids, polypeptides, antibodies, etc.
  • a primer according to the invention is advantageously composed of 3 to 50 bases, preferably from 5 to 40 and even more preferably from 6 to 35 bases. It is typically single-stranded.
  • a particular primer is complementary to at least one region of the FKBP65 gene or of the corresponding RNA.
  • a preferred embodiment resides in a primer consisting of a single-stranded nucleic acid comprising from 6 to 50 nucleotides complementary to at least part of the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 or to their complementary strand .
  • Another preferred embodiment resides in a primer consisting of a single-stranded nucleic acid comprising from 6 to 50 nucleotides complementary to a region bordering the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 and allowing the amplification of 'at least part of this sequence.
  • the term "bordering" indicates that the region is preferably located less than 300 bp from the sequence considered, more preferably less than 200 bp, even more preferably less than 150 bp.
  • the primer can thus be complementary and specific to a region bordering an FKBP65 gene in a genome, or bordering a coding sequence in a genome or RNA.
  • a particular primer according to the invention is a primer specific for a sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 and capable of distinguishing between the different isoforms of FKBP65. It is typically a specific and complementary primer (or allowing specific amplification) of all or part of a specific exon of each of these isoforms or of new junction regions created by the presence or absence of alternative exons.
  • a particular primer according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and the exon 6, on the one hand, or exon 7, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 6B corresponds to residues 356 to 417 of the sequence SEQ ID NO: 4.
  • This sequence, as well as that of the flanking residues and the corresponding nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) can be used to construct specific primers according to the invention.
  • a particular primer according to the invention comprises a specific sequence of a codon at least of the alternative exon 7B, or of a junction region between this alternative exon 7B and exon 7 , on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 7B corresponds to residues 420 to 438 of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • a particular primer according to the invention comprises a specific sequence of a codon at least of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and exon 6 , on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • the amino acid sequence of the alternative exon 6B corresponds to residues 355 to 431 of the sequence SEQ ID NO: 8.
  • This sequence (or fragments thereof, for example between residues 417 and 431), as well that that of the flanking residues and the corresponding nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 7) can be used to construct specific primers according to the invention.
  • the invention also relates to a pair of primers comprising a sense sequence and a reverse sequence, characterized in that the primers of said pair hybridize with a region of an FKBP65 gene and allow the amplification of at least one portion. of it.
  • the primers can be complementary to part of the coding region of the FKBP65 gene, or to regulatory regions (promoter, terminator, etc.).
  • inhibiting nucleic acid is understood to mean any nucleic acid capable of inhibiting the transcription of the FKBP65 gene or the translation of the corresponding messenger.
  • the inhibitory nucleic acid can act according to various mechanisms and can comprise all or part of the sequence of the FKBP65 gene, of a fragment thereof, of the messenger of FKBP65, or of a sequence complementary to these.
  • the inhibitory nucleic acid may in particular comprise a region complementary to a part of the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 and inhibit (or reduce) its translation into protein.
  • the inhibiting nucleic acid is preferably complementary to at least a portion of the coding region of the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.
  • the complementarity of the inhibiting nucleic acid is preferably perfect, even if certain mismatches may be tolerated.
  • the inhibitory nucleic acid can be DNA, RNA, or modified forms thereof, for example PNA.
  • RNAi can be an antisense nucleic acid, a ribozyme, an RNAi, etc. It can be single-stranded or double-stranded. Its length can vary between a few bases and several hundred bases, for example up to the full length of the sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 or of the mRNA of FKBP65. It can also be an RNA coded by an antisense gene. As it is an inhibitory oligonucleotide (eg, antisense, RNAi, etc.), it typically comprises less than 100 bases, for example of the order of 10 to 50 bases. This oligonucleotide can be modified to improve its stability, its resistance to nucleases, its cell penetration, etc.
  • inhibitory oligonucleotide eg, antisense, RNAi, etc.
  • the inhibitory nucleic acids are capable of inhibiting the transcription and / or the translation of all the isoforms of sequence SEQ ID NO: 1, 3, 5 and 7. Such inhibitory nucleic acids are therefore directed against regions specific for FKBP65 common to these isoforms, preferably in the 5'-terminal region.
  • a particular inhibitory nucleic acid according to the invention comprises a sequence specific for at least one codon of an exon situated upstream (that is to say) 5 'from exon 6B, chosen by example among exons 1, 2, 3, 4, 5 and 6.
  • Another particular inhibitory nucleic acid according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of exon 7.
  • acids nucleic acid inhibitors complementary to at least one codon of exons 6 or 7 make it possible to effectively inhibit FKBP65 activity in cells.
  • inhibitory nucleic acids within the meaning of the invention are specific for an isoform of the protein FKBP65 of sequence SEQ ID NO: 3, 5 or 7.
  • inhibitory nucleic acids within the meaning of the invention are inhibitory nucleic acids specific for junction regions created at the mRNA level by specific alternative splicing of each of the identified isoforms. Such inhibitory nucleic acids make it possible to discriminate between these different forms and to specifically modulate the activity of one of the forms only.
  • a particular inhibitory nucleic acid according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and exon 6, on the one hand, or exon 7, on the other hand, as defined above.
  • a particular inhibitory nucleic acid according to the invention comprises a specific sequence of at least one codon of the alternative exon 7B, or of a junction region between this alternative exon 7B and the exon 7, on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • a particular inhibitory nucleic acid according to the invention comprises a specific sequence of a codon at least of the alternative exon 6B, or of a junction region between this alternative exon 6B and the exon 6, on the one hand, or exon 8, on the other hand.
  • the inhibitory nucleic acids specific for FKBP65 represent particular objects of the invention, as well as pharmaceutical compositions comprising them, in association with any pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • RNA interference is a powerful mechanism for disabling gene expression. Briefly, it relies on the use of double-stranded RNA molecules, typically 21 nucleotides in length, called siRNA, which cause the induction of an endogenous mechanism called RNA interference. This causes the specific degradation of mRNA molecules homologous in sequence to siRNA. This original system is now widely recognized and used as a molecular biology tool due to its efficiency and specificity of action. Different molecules of siRNA directed against FKBP65 have been synthesized by the inventors and their effects tested on cells. The results obtained in the examples demonstrate the antiproliferative effect of such selective inhibitors of FKBP65 according to the present invention.
  • a particular object of the invention resides in an inhibiting RNA, of the interfering type, comprising a double-stranded region of 21 nucleotides in length, the double-stranded region being complementary to a region of the FKBP65 gene or RNA.
  • the inhibitory RNA comprises a unique sequence comprising two regions of 21 complementary to nucleotides separated by a region capable of forming a loop.
  • the inhibitory RNA is designated shRNA.
  • Another particular subject of the invention relates to a DNA coding for an inhibitory RNA as defined above, as well as any vector comprising such a DNA (e.g., plasmid, viral vector, etc.).
  • the double-stranded region of the inhibitory RNAs is complementary to part of an FKBP65 exon chosen from the exons
  • the double-stranded region of the inhibitory RNAs is formed by the hybridization of the oligonucleotides of sequence SEQ ID NO: 9 and 10 on the one hand, 11 and 12 on the other hand.
  • Another subject of the invention relates to any antibody specific for an FKBP65 protein or polypeptide, that is to say capable of binding, preferably selectively, to such a polypeptide or protein.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal. It can also be fragments and derivatives of antibodies having substantially the same antigenic specificity, in particular antibody fragments (eg, Fab, Fab'2, CDRs), humanized, polyfunctional, single-stranded antibodies ( ScFv), etc.
  • Antibodies can be produced using conventional methods, including immunizing a non-human animal with an FKBP65 protein or a fragment thereof comprising an epitope, and recovering its serum (polyclonal) or spleen cells (so as to produce hybridomas by fusion with appropriate cell lines).
  • the antigen is combined with an adjuvant (eg, Freund's adjuvant) and administered to an animal, for example by subcutaneous injection. Repeated injections can be given. Blood samples are collected and immunoglobulin or serum are separated.
  • an adjuvant eg, Freund's adjuvant
  • monoclonal antibodies Conventional methods of producing monoclonal antibodies include immunizing a non-human animal with an antigen, followed by the recovery of spleen cells which are then fused with immortalized cells, such as myeloma cells.
  • the resulting hybridomas produce monoclonal antibodies and can be selected by limiting dilutions so as to isolate the individual clones.
  • the Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced by digestion using a protease according to conventional techniques.
  • the invention also relates to a method for the production of antibodies, comprising the injection of an FKBP65 protein as defined above (or of a fragment immunogen thereof) to a non-human animal and the recovery of antibodies or antibody-producing cells.
  • the preferred antibodies are antibodies specific for the FKBP65 protein, that is to say having a higher affinity for the FKBP65 protein than for other antigens, even if a non-specific or less affine bond cannot be excluded.
  • the antibodies are capable of recognizing all the isoforms of sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6 and 8. Such antibodies are therefore directed against specific epitopes of FKBP65 common to these isoforms, preferably in the N region -terminal.
  • antibodies within the meaning of the invention are specific for an isoform of the protein FKBP65 of sequence SEQ ID NO: 4, 6 or 8.
  • preferred antibodies within the meaning of the invention are antibodies specific for (or generated by immunization with a polypeptide comprising) the following sequence:
  • the invention also relates to hybridomas producing the monoclonal antibodies described above and their use for producing said antibodies.
  • the antibodies of the invention can be coupled to heterologous fragments such as toxins, markers, drugs or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the markers can be chosen from radio-markers, enzymes, agents fluorescent, magnetic particles, etc.
  • the toxins can be chosen from diphtheria, botulinum toxin, ricin, etc.
  • the antibodies of the invention can also be immobilized on a support, such as a ball, column, gel, chip, etc.
  • a particular object of the invention relates to a product comprising at least one antibody specific for an FKBP65 protein immobilized on a support.
  • the support can be solid, flat or not, regular or not, such as for example nylon, glass, plastic, metal, fiber, ceramic, silica, polymer, etc., or any other compatible material.
  • the antibody is preferably immobilized by one end, under conditions leaving the molecule accessible for an immunological reaction.
  • the present application describes the identification of a new protein involved in angiogenesis.
  • This protein is overexpressed under conditions of hypoxia, in response to VEGF and under conditions of ischemia.
  • This protein is therefore involved in the regulation of angiogenesis and represents a particularly interesting target for therapeutic interventions in various pathologies, such as in particular cancers or retinopathies.
  • FKBP65 inhibitors can lead to the formation of immature blood vessels by inhibiting the secretion of elastin during angiogenesis.
  • inhibitors of FKBP65 can lead to a decrease in the secretion of tropoelatin and of the proteolysis fragments of elastin, which act as factors inducing proliferation in these cancers. They can also reduce the irrigation of tumors and therefore reduce their growth.
  • a first particularly beneficial therapeutic application lies in the treatment of pathologies linked to uncontrolled or pathological cell proliferation, in particular cancers.
  • An object of the invention lies more particularly in the use of a selective inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers.
  • Another particular object of the invention lies in the use of a selective inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to inhibit tumor growth and / or the formation of metastases in patients suffering from cancers.
  • angiogenesis is not only essential for the growth of a tumor but is also involved in the progression from the benign stage to the stage of invasive cancer, and in the progression from dormant metastases to metastatic lesions.
  • the ability to negatively regulate angiogenesis helps reduce the metastatic progression of cancers.
  • the invention can be used for the treatment of different types of cancer, in particular solid tumors, such as for example breast, lung, prostate, colon, uterus, head and neck, brain (eg, glioblastoma), skin, liver, bladder, etc.
  • solid tumors such as for example breast, lung, prostate, colon, uterus, head and neck, brain (eg, glioblastoma), skin, liver, bladder, etc.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis.
  • pathologies have been described as having a component or a stage linked to the phenomenon of angiogenesis. Mention may be made, among others, of numerous cancers, retinopathies (in particular retinopathies linked to diabetes and macular degeneration), atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed scarring.
  • the invention therefore makes it possible to control the appearance, progression or development of these pathologies in patients.
  • a particular object of the invention therefore lies in the use of a (selective) inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended for the treatment of retinopathies linked to diabetes, macular degeneration, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed healing.
  • Another object of the invention resides in the use of an inhibitor (selective) of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to promote wound healing.
  • Another subject of the invention relates to the use of a (selective) inhibitor of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to treat ischemia.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor (selective) of the protein FKBP65 for the preparation of a medicament intended to preserve or restore tissue integrity.
  • Another subject of the invention relates to methods of treatment of the pathologies mentioned above, comprising the administration to a patient of an effective amount of an inhibitor (selective) of the protein FKBP65.
  • treatment designates preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down the progression of the disease ), etc.
  • the treatment can also be carried out in combination with other agents or treatments (chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, etc.).
  • the treatments and medicaments of the invention are very particularly intended for humans.
  • the inhibitor compound can be of a varied nature.
  • the compound is an inhibitory nucleic acid capable of inhibiting the transcription of the FKBP65 gene or the translation of the corresponding messenger. It is very particularly an antisense oligonucleotide, a gene coding for an antisense RNA, a ribozyme or an interfering RNA.
  • the inhibitor is an interfering RNA specific for the FKBP65 gene or mRNA.
  • the present application describes several RNAi sequences specific for the FKBP65 mRNA and their properties. organic.
  • the invention also relates to any composition comprising such an interfering RNA, or comprising a DNA encoding such an interfering RNA.
  • the compound is a peptide comprising a region of the FKBP65 protein and capable of antagonizing its activity.
  • the peptide advantageously comprises at least 5 consecutive residues of the protein FKBP65, more generally between 10 and 100.
  • the peptide typically comprises the FKBP site of the protein FKBP65.
  • the inhibitor is an antibody specific for the FKBP65 protein, or a fragment or derivative of such an antibody, as defined above, in particular an intracellular antibody (e.g., of the ScFv type).
  • the antibody can also be coupled to a heterologous fragment, such as a toxin, a drug or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the inhibitor compound is a cytotoxic ligand specific for FKBP65.
  • cytotoxic ligands are particularly suitable for the treatment of cancers.
  • Specific cytotoxic ligands are typically molecules comprising a region conferring cytotoxicity and a region conferring specificity with respect to FKBP65.
  • the region conferring cytotoxicity may be any molecule toxic to a cell, either by itself, or conditionally or indirectly (i.e. by making the cell sensitive to a chemical agent or to the patient's immune system, for example).
  • the region conferring specificity with respect to FKBP65 is typically an antibody or antibody fragment as defined above. However, they may also be specific ligands for FKBP65, in particular part of a FKBP65 receptor or cellular partner.
  • the inhibitor compound is a chemical compound, of natural or synthetic origin, in particular an organic or inorganic molecule, of vegetable, bacterial, viral, animal, eukaryotic, synthetic or semi-synthetic origin, capable of modulate the expression or activity of the FKBP65 protein.
  • an inhibitor can be obtained or derived from a selection method, as defined below.
  • the present application shows that Ascomycin, ascomycete fermentation product, of formula C43H69NO12, is capable of inhibiting angiogenesis. Even if this compound is not a selective inhibitor of FKBP65, these results validate the interest and the biological relevance of the target of the invention for the development of drugs which can be used in the treatment of the pathologies described above.
  • a particular object of the invention also lies in the use of FK506 or a derivative thereof for the treatment of pathologies associated with angiogenesis, in particular retinopathies linked to diabetes, macular degeneration, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed healing.
  • FK506 or a derivative thereof for the treatment of pathologies associated with angiogenesis, in particular retinopathies linked to diabetes, macular degeneration, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed healing.
  • a specific example of a compound derived from ascomycin is the compound FK506, which has an ethyl group in position 21 in place of an allyl.
  • a selective chemical inhibitor of FKBP65 is used as defined above. Such a selective inhibitor can in particular be produced by the methods described below.
  • the inhibitor can be used at different doses and according to different protocols. In addition, it can be used alone or, preferably, combined with other active agents.
  • the administration can be carried out by any method known to a person skilled in the art, preferably by injection, typically by intraperitoneal, intra-tumotal, sub-dermal, intra-cerebral, intravenous, intra-arterial or infra route. -muscular.
  • the doses administered can be adjusted by those skilled in the art. Typically, from 0.01 mg to 100 mg / kg approximately are injected, for inhibiting compounds of a chemical nature.
  • nucleic compounds the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose.
  • therapeutic antibodies the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose. It is understood that repeated injections can be carried out, possibly in combination with other active agents.
  • the inhibitor compounds can be formulated in the presence of any pharmaceutically acceptable vehicle (for example buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • vehicle or excipient acceptable on the plan pharmaceutical can be chosen from buffer solutions, solvents, binders, stabilizers, emulsifiers, etc.
  • Buffer or diluent solutions include calcium phosphate, calcium sulfate, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, sodium chloride, starch, powdered sugar and hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (for delayed release).
  • Binders are for example starch, gelatin and filling solutes such as sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc.
  • Natural or synthetic gums can also be used, such as in particular Palginate, carboxymethylcellulose, methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, etc.
  • Other excipients are for example cellulose and magnesium stearate.
  • Stabilizing agents can be incorporated into the formulations, such as for example polysaccharides (acacia, agar, alginic acid, guar gum and tragacanth, chitin or its derivatives and cellulose ethers.
  • Solvents or solutes are for example the Ringer solution, l , distilled water, phosphate buffers, phosphate salt solutions, and other conventional fluids.
  • the invention can be used in mammals, in particular in humans.
  • the results presented in this application illustrate the involvement of the protein FKBP65 in the mechanisms of angiogenesis and demonstrate the advantage of therapeutic approaches based on the selective regulation of this protein.
  • the present application describes new methods for detecting a pathology or a predisposition to a pathology in a subject, or for monitoring the evolution or the stage of advancement of a pathology, comprising determining the presence, the quantity (relative or absolute) or distribution, in a sample of said subject, of the protein FKBP65, of its expression, of altered forms thereof or of the corresponding gene or messenger RNA.
  • the determination can be carried out by various techniques, such as sequencing, hybridization and / or selective amplification.
  • Methods that can be used to determine the presence of proteins (or protein domains) are based, for example, on immunoenzymatic reactions, such as ELISA, RIA, EIA, etc.
  • Techniques usable to determine the presence or the expression of genes or RNA are for example PCR, RT-PCR, chain ligation reaction (LCR), the technique of PCE or TMA (“Transcriptional Mediated Amplification”), gel migration, electrophoresis, in particular DGGE (“denaturing gel gradient electrophoresis”), etc.
  • the latter preferably uses a primer or a pair of primers as defined above.
  • a particular object of the invention relates to the use of nucleic acids complementary and specific to the FKBP65 gene for the detection of cancers, the characterization of cancers or for monitoring the progression of cancers, in particular the formation of metastases.
  • This detection can be carried out using DNA chips or by carrying out a PCR using biopsy or biological fluids such as blood (notably serum), urine, seminal fluid, etc.
  • the invention also resides in the development and use of immunoassays containing one or more antibodies as described above or fragments thereof. These tests make it possible to detect and / or measure the presence and / or the quantity of protein FKBP65 in a biological sample, this quantity being correlated with a pathological process.
  • a particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with a nucleic probe as defined above, and demonstrating hybridization.
  • Another particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with a primer or a pair of primers as defined above, and demonstrating an amplification product.
  • Another particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with an antibody as defined above, and demonstrating an antigen-antibody complex.
  • Several tests can be carried out in parallel, using several samples and / or using several probes, primers and / or antibodies.
  • the protein FKBP65 is involved in the mechanisms of angiogenesis.
  • the overexpression of this protein is observed in response to hypoxic stress.
  • the detection or determination of this protein (or of altered forms) in a sample of a subject therefore constitutes an indicator of the presence of such pathological events and of the severity of these pathologies.
  • Another object of the invention resides in a kit which can be used for implementing a method as defined above comprising i. a pair of primers or a probe or an antibody as defined above, and ii. the reagents necessary for amplification or for a hybridization or immunological reaction.
  • the protein FKBP65 according to the invention represents a particularly interesting therapeutic target for the treatment of cancers, angiogenesis, and associated diseases (in particular retinopathies and atherosclerosis).
  • the invention therefore allows the development of methods of selection, screening, characterization, optimization or production of active compounds, based on a determination of the ability of test compounds to interact with FKBP65, to modulate its expression or to modulate its activity.
  • a particular object of the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising bringing into contact in vitro or ex vivo a test compound with an FKBP65 protein as defined above, and the selection or identification of the compounds binding to said protein.
  • the FKBP65 protein (or any fragment thereof) can be used in soluble form or immobilized on a support (column, bead, plate, etc.).
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with a cell expressing an FKBP65 protein as defined above, and the selection or identification of compounds modulating the expression or the activity of said protein.
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with a FKBP65 gene or a corresponding RNA, and the selection or identification of compounds which bind to said gene or RNA. In this process, it is possible to use portions of the gene or RNA.
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with a nucleic acid comprising the sequence of the promoter of the FKBP65 gene, and the selection or identification of compounds which bind to said promoter.
  • a genetic construction comprising a reporter gene placed under the control of the promoter, and the effect of the compound is determined by measuring the expression of the reporter gene (or of variation in the level of expression, by relative to a control situation).
  • the binding to the protein FKBP65, to the gene or to the corresponding RNA can be measured by various techniques, such as the displacement of a labeled ligand, migration on gel, electrophoresis, etc.
  • the modulation of expression can be determined by assaying the RNAs or proteins, or by means of a reporter system.
  • the cells used can be any compatible cell, in particular eukaryotic or prokaryotic cells. These cells can be mammalian cells, bacteria, yeast, plant, insect cells, etc. They can be primary cultures or established lines. As an example, we can cite mammals of hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc. Among the bacteria or yeast cells, mention may in particular be made of E. Coli, Saccharomyces and Kluyveromyces, for example.
  • the selection process can be carried out in any suitable support, such as for example a plate, a tube, a flange, etc., typically in a multi-container support, such as multi-well plates.
  • the method can be implemented to select or identify an activator or, preferably, an inhibitor of the expression or activity of the protein FKBP65.
  • FKBP65 inhibitors are selected.
  • a particular object of the invention relates to methods of selection, identification, or characterization of anti-cancer compounds, comprising bringing one or more test compounds into contact with an FKBP65 protein, a gene FKBP65 or a cell expressing an FKBP65 protein, and the selection of compounds that inhibit or bind to the expression or activity of FKBP65.
  • the method allows the selection, identification, characterization, optimization or production of compounds that are selective inhibitors of FKBP65.
  • an additional step of determining the selectivity of the selected compounds can be carried out, for example by determining the activity of the compound on another biological target.
  • the methods of the invention comprise an additional step of evaluating the ability of the test compound to modulate the activity of FKBP 12 (that is to say in particular to bind to this protein, to its gene or mRNA, to modulate the expression of the gene or mRNA, etc.) and / or other members of the FKBP family.
  • the compounds essentially devoid of direct effect on this (or these) protein (s) are selected as selective compounds.
  • the specificity of the compounds can also be determined by determining the activity of the compounds on other biological targets, including receptors with a different endogenous ligand.
  • the invention also relates to a method for producing a medicament for the treatment of cancers or diseases linked to angiogenesis, in particular retinopathies, comprising (i) the selection of active compounds according to the above methods and (ii) conditioning said compound or a functional analog thereof in the presence of a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the functional analog is typically a compound derived from the active compound identified, by chemical modification, in particular with the aim of improving its activity or its pharmacokinetics, or with the aim of reducing its toxicity.
  • the functional analog may be a "pro-drug" of the identified compound.
  • Techniques for preparing functional analogs are well known to those skilled in the art, for example molecular modeling, coupling of NO groups, etc. The method can in this regard comprise an intermediate step of synthesis of the selected compound or of the functional analog thereof.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle or excipient may be chosen from buffer solutions, solvents, binders, stabilizers, emulsifiers, etc., as defined above.
  • the entire molecular biology part (cloning, plasmid constructs, transfections, establishment of stable clones, immunofluorescence, etc.) was carried out using conventional protocols known to those skilled in the art.
  • the protein and nucleic acid sequences are provided in the annexed sequence list.
  • FIGURES Figure 1 Representation of the FKBP65 gene and new isoforms.
  • Figure 2 Northern blot analysis of the expression of the transcript coding for FKBP65 in response to hypoxic stress.
  • Figure 3 Western blot analysis of the expression of the protein FKBP65 in response to VEGF.
  • Figure 4 Analysis by immunofluorescence of the cellular localization of FKBP65.
  • FIG. 5 Effects of FK506 and CAI on the tubulogenesis of HMEC-1 in vitro.
  • Fig. 5a in the absence of compound (control);
  • Fig. 5b in the presence of 60 ⁇ M of FK506;
  • Fig. 5c in the presence of 100 ⁇ M of CAL
  • Figure 6 Measurement of tubule length and number of connections after cell culture in the presence of an FKBP65 inhibitor.
  • Figure 7 Western blot analysis of the expression of the protein FKBP65 in HMEC-1 cells after transient fransfection of different amounts of siRNA molecules specific for FKBP65.
  • Figure 8 Analysis of the viability of HMEC-1 cells after transient fransfection of different quantities of siRNA molecules specific for FKBP65 and EGFP (negative control).
  • Fig. 8a in the presence of siRNA molecules specific for FKBP65
  • Fig. 8b in the presence of EGFP-specific siRNA molecules (negative control).
  • Isoform 2 presence of a first alternative exon denoted 6B, located between exon 6 and exon 7.
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 4.
  • the corresponding coding sequence is represented on the SEQ ID NO: 3.
  • Isoform 3 presence of a second alternative exon noted 7B, located between exon 7 and exon 8.
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 6.
  • the sequence corresponding coding is shown on SEQ ID NO: 5.
  • Isoform 4 presence of exon 6B in the absence of exon 7 (mutually alternative exons).
  • the amino acid sequence of this isoform is presented in SEQ ID NO: 8.
  • the corresponding coding sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the mRNA encoding the FKBP65 protein is differentially expressed during hypoxic stress. This strong expression was demonstrated by DNA microarray and Northern Blot techniques. By macroarray, an over-expression of a factor 2.3 of the mRNA coding for FKBP65 is observed in HMEC-1 cells subjected to hypoxic stress (3% O 2 , 16 h). In addition, this result was confirmed by Northern Blot where a strong overexpression of the transcript coding for FKBP65 is observed ( Figure 2).
  • Angiogenesis involves various events such as the degradation of the extracellular matrix, the proliferation and migration of endothelial cells, the synthesis of a new extracellular matrix, the formation of tubules and the anastomosis of new vessels.
  • various in vivo tests have been developed, such as the CAM test (ChorioAllantoicMembrane assay) and the aortic ring test.
  • endothelial cells In addition to these tests, means have been set up to study the proliferation, migration and invasiveness of endothelial cells in vitro.
  • the formation of tubules by endothelial cells, or tubulogenesis can thus be studied through an in vitro test which is widely recognized as well reflecting the late stages of angiogenesis which require migration, attachment as well as differentiation tubular structures of endothelial cells.
  • endothelial cells are cultured on a layer of Matrigel which reconstitutes the basement membrane and form capillary structures within a few hours. Consequently, this system, by allowing the morphogenesis of endothelial cells to be followed on a layer of extracellular matrix, represents a rapid and powerful tool for screening anti-angiogenic agents.
  • tubulogenesis was studied using HMEC-1 cells which constitute a line of human endothelial cells of microvasculature immortalized by the large T antigen of SV40.
  • the HMEC-1 cells are seeded in a 96-well plate, the bottoms of which are covered with matrigel, and incubated at 37 ° C. for 6 to 8 hours.
  • the formation of tubules is visualized, after labeling with calcein, by image analysis allowing quantification using the commercially available software TCS AngioSys TM.
  • TCS AngioSys TM Several parameters relating to the formation of the tubules can be determined, such as the length of the tubules and the number of connections.
  • An anti-angiogenic compound known to those skilled in the art, CAI (carboxyamidotriazol) was used as a positive control for the inhibition of tubulogenesis.
  • the HMEC-1 line is cultured in MCDB-131 medium (Sigma) supplemented with
  • the cells are cultured at a confluence of between 70 and 80%.
  • the bottom of the 96 wells of a microtiter plate is covered with Matrigel (Matrigel® Basement Membrane Matrix; Becton Dickinson).
  • the Matrigel® matrix polymerizes in 30 minutes at room temperature and then 5 minutes at 37 ° C, in the presence of 5% CO 2 .
  • a suspension of HMEC-1 at 2-4.10 5 cells / ml of culture medium is prepared by trypsination. Each well is seeded with 2.10 4 cells.
  • the test compound or the positive control (CAI) are diluted in the culture medium (final volume of 150 ⁇ l per well) at different concentrations and added to the cells at the time of seeding on the matrix.
  • the cells are incubated for 6 to 8 hours at 37 ° C, in the presence of 5% CO 2 .
  • the cell culture medium is diluted with 200 ⁇ l PBS and then removed.
  • the cells are then labeled using 150 ⁇ l of a 1.25 ⁇ g / ml solution of Calcein AM (acetoxymethyl) prepared in PBS.
  • the plate is then incubated for 15 minutes at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 .
  • the medium is then diluted with 250 ⁇ l of PBS and then removed.
  • Image analysis is carried out using fluorescent microscope shots and use of the free image analysis software GIMP.
  • FIG. 6a shows the capacity of HMEC-1 cells to form tubules in 7 hours in the absence of FK506 or of the positive control CAL
  • FIGS. 5b and 5c illustrate the capacities of FK506 (60 ⁇ M) and of CAI (100 ⁇ M) to inhibit the formation of microtubules.
  • the FK506 appears at least as effective as the CAI, regardless of the lengths of the tubules or the number of connections, ( Figure 6a and 6b).
  • RNA interference has recently been described as being a powerful tool for invalidating the expression of genes and thus studying the function of proteins encoded by these genes.
  • siRNA double-stranded RNA molecules
  • RNA interference causes the induction of an endogenous mechanism called RNA interference.
  • This causes the specific degradation of mRNA molecules homologous in sequence to siRNA.
  • This original system is now widely recognized and used as a molecular biology tool due to its efficiency and specificity of action.
  • a first step of validating the RNA interference mechanism was carried out in order to verify its functionality in HMEC-1 cells.
  • siRNA molecules directed against lamin A / C were transfected in HMEC-1 cells at increasing doses and the evolution of the expression of the lamin A / C protein. was then followed by western blot. It has thus been validated the functionality and efficiency of the RNA interference mechanism in HMEC-1 cells (data not shown).
  • a second validation step was carried out to verify the functionality of the siRNA molecules chosen to invalidate the expression of FKBP65.
  • siRNA molecules directed against FKBP65 were synthesized chemically and then transfected in HMEC-1 cells at increasing doses and the evolution of the expression of the protein FKBP65 was followed by western blot.
  • SiRNA 1 sequence (duplex): 5 'CGC CGG AGA AUU ACC AUC CUU 3' SEQ 9
  • Exons 6 and 7 are common to the wild form of FKBP65 and to the different isoforms of FKBP65.
  • the invalidation of the expression of the FKBP65 gene by these RNAs therefore relates both to the invalidation of the expression of the wild form and the invalidation of the expression of the various isoforms.
  • HMEC-1 cells were transfected with different molecules of siRNA directed against FKBP65 and on the other hand against EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) not present in HMEC-1 cells and which serves as negative control.
  • the HMEC-1 cells were transfected with increasing doses of siRNA (0-500-2000 ng) using the Oligofectamine TM kit (Invifrogen).
  • a cell viability test of the MTT type (Microculture Tefrazolium assay) described by Carmichael et al. with some modifications.
  • FIG. 8b clearly shows that the cell viability of HMEC-1 cells is not affected by the infection of siRNA molecules directed against EGFP and regardless of the quantity of molecules transfected.
  • FIG. 8a illustrates the capacity of the siRNA molecules directed against FKBP65 to strongly inhibit the proliferation of HMEC-1 cells and this all the more so as an increasing quantity of siRNA molecules is transfected.

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Abstract

La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle protéine impliquée dans les mécanismes de l'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage. Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en oeuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine des cancers, de l'angiogenèse, des maladies inflammatoires ou des altérations tissulaires.

Description

NOUVELLE CIBLE MOLECULAIRE DE L'ANGIOGENESE ET UTILISATIONS
La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle protéine impliquée dans les mécanismes d'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage. Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en œuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine des cancers, de l'angiogénèse et de l'hypoxie.
L'angiogénèse, est un processus complexe par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés, typiquement à partir de la vasculature préexistante. L'angiogénèse a lieu principalement au cours du développement embryonnaire, mais joue également un rôle essentiel au stade adulte dans certains processus physiologiques hautement régulés, tels que notamment durant les processus de cicatrisation, d'ovulation et de menstruation.
De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogénèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, des troubles ophtalmologiques de type rétinopathies (notamment les rétinopathies diabétiques et la dégénérescence maculaire), l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ou les pathologies liées à une cicatrisation retardée. Dans le cas des cancers, il est établi que l'angiogénèse est non seulement essentielle à la croissance d'une tumeur, mais est aussi impliquée dans la progression du stade bénin au stade du cancer invasif, et dans la progression de métastases dormantes vers des lésions métastatiques.
Comme indiqué ci-avant, l'angiogénèse est un processus complexe, qui implique différents événements tels que la dégradation de la matrice extracellulaire, la prolifération et la migration des cellules endothéliales, la synthèse d'une nouvelle matrice extracellulaire, le recrutement de péricytes, la formation de tubules et l'anastomose de nouveaux vaisseaux. Au niveau moléculaire, l'élastine est une protéine de la matrice extracellulaire qui est sécrétée sous une forme soluble (tropoélastine) puis s'agrège pour former les fibres insolubles d'élastine. Ces fibres sont présentes entre autre au niveau de la peau, des alvéoles pulmonaires et de la vasculature. Ce sont les propriétés mécaniques particulières des fibres d'élastine qui confèrent à un certain nombre de vaisseaux leur élasticité. L'élastine est exprimée principalement au cours du développement embryonnaire et de la croissance postnatale puis son expression est très fortement réduite au stade adulte.
De sévères pathologies vasculaires (neointima hyper proliférative) sont associées à un défaut des fibres d'élastine. Une mauvaise incorporation de la tropoélastine dans les fibres d'élastine ainsi que la dégradation des fibres d'élastine par des protéases peuvent conduire à l'hyper prolifération des cellules vasculaires musculaires lisses, qui est observée dans ces pathologies. En effet, les fibres d'élastine agissent comme des réservoirs pour de nombreux facteurs de croissance présents dans le sérum. Les graves défauts dans l'élastogénèse, observés dans la sténose supra valvulaire aortique ou dans la maladie de Williams-Beuren, conduisent à une exposition plus grande des cellules vasculaires à ces facteurs de croissance. Cette hypothèse a été récemment confortée par un modèle murin dans lequel le gène codant pour l'élastine a été invalidé. Les souris homozygotes pour la mutation développent une hyper prolifération de l'intima, en particulier au niveau de l'aorte.
La tropoélastine, ou des peptides issus de la dégradation des fibres d'élastine, peuvent interagir avec des récepteurs membranaires (S-gal/EBP et Galectin-3) présents dans de nombreux types cellulaires. La liaison de ces ligands à EBP entraîne de puissants effets mitogéniques. Ainsi, un défaut d'incorporation de la tropoélastine dans les fibres existantes conduit également à une hyper prolifération cellulaire.
Enfin, certaines cellules cancéreuses, notamment dans le cancer du sein et de la vessie, synthétisent de l'élastine et interagissent spécifiquement avec celle-ci. L'expression des récepteurs de l'élastine est étroitement associée avec le potentiel métastatique et invasif de différentes lignées cancéreuses. La présente invention décrit à présent l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans les phénomènes d'angiogénèse et de réponse à l'hypoxie. Une approche originale a permis d'identifier un ADNc correspondant à une portion de la protéine FKBP65, ainsi que des formes modifiées de cette protéine, dans des conditions d'hypoxie. Cette protéine fournit ainsi de nouvelles bases pour des approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées aux phénomènes d'angiogénèse et, plus généralement, à des processus prolifératifs.
Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits de cellules HMEC-1 (« Human dermal Microvascular Endothelial
Cell ») en culture, exposées ou non à l'hypoxie (par traitement avec la desferoxiamine
(DFO) pendant 16 heures). Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS décrite dans le brevet n° WO99/46403. Cette analyse a permis la construction, par le demandeur, d'un répertoire des altérations d'épissage dans les cellules HMEC-1 exposées à l'hypoxie. Ce répertoire qui contient plus de 1100 séquences distinctes, implique des acteurs clefs du phénomène de réponse à l'hypoxie tels que les enzymes de la glycolyse (phosphofîuctokinase, pyruvate kinase ou lactate deshydrogénase) ou le transporteur de glucose GLUT-1. Des séquences dérivées d'ARNs codant pour des protéines impliquées dans la réponse au stress, et notamment ORP150, qui est directement impliqué dans la réponse au stress hypoxique et dans la stabilisation du facteur VEGF, font également partie de ce répertoire, soulignant l'implication de cette réponse dans la réponse à l'hypoxie.
La réalisation de DATAS sur des ARN de cellules HMEC-1 traitées ou non par le DFO a permis d'isoler deux fragments d'ADNc dérivés de l'ARNm du gène codant pour la protéine FKBP65 (GenBank sous la référence NM_021939). La protéine FKBP65 appartient à la famille des peptidyl-prolyl cis-trans isomérases, impliquées dans le repliement des protéines. La FKBP65 est un enzyme localisée dans le réticulum endoplasmique, pouvant intervenir dans la maturation de la tropoélastine. La protéine FKBP65 est principalement exprimée au cours du développement, et son expression n'est pas détectable au stade adulte. Il a été également démontré que cet enzyme peut intervenir dans la maturation de certains membres de la famille des collagènes (I et III), composante prédominante de la matrice extracellulaire. Suite à un traitement au PDGF (platelet-derived growth factor), il a été montré que l'expression de FKBP65 est fortement stimulée et est co-régulée à celle des collagènes.
La présente demande démontre pour la première fois que cette séquence est exprimée et possède des propriétés biologiques importantes dans la régulation de l'hypoxie et de l'angiogénèse. Elle montre notamment une dérégulation de l'expression de cette protéine en réponse au stress hypoxique et à un traitement au VEGF.
En utilisant des techniques des puces à ADN et de Northern Blot, une forte sur- expression de l'ARNm de la protéine FKBP65 a été mise en évidence dans des cellules exposées à un traitement hypoxique.
En outre, une sur-expression de la protéine FKBP65 a également été mise en évidence dans des cellules traitées par le facteur de croissance des cellules endothéliales (VEGF), confirmant encore l'implication de cette protéine dans les mécanismes de l'angiogénèse.
D'autre part, des expériences d'invalidation d'expression transitoire du gène FKBP65 (par la technique d'ARN interférence) couplée à un test de viabilité des cellules endothéliales HMEC-1 ont permis de montrer que FKBP65 joue un rôle essentiel au cours de la prolifération des cellules endothéliales. Cette donnée a été confirmée de manière indépendante par l'impossibilité d'isoler des clones stables d'HMEC-1 exprimant de manière constitutive le siRNA (small interfering RNA) invalidant l'expression de FKBP65.
La présente demande fournit ainsi une nouvelle cible moléculaire de l'angiogénèse et de la réponse à l'hypoxie, et permet le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques de pathologies impliquant ces mécanismes, ainsi que de nouvelles approches pour la recherche, la sélection, l'optimisation ou la production de composés actifs sur ces pathologies. A cet égard,les résultats fournis dans la présente demande démontrent également les propriétés anti-angiogéniques de composés inhibiteurs de la protéine FKBP65. La présente demande concerne donc l'utilisation de cette protéine comme cible pour le développement de nouvelles molécules ou de méthodes de diagnostic. Elle concerne également des composés régulateurs de la protéine FKBP65 et leur utilisation thérapeutique. Elle concerne également des méthodes et compositions pour le criblage de composés actifs. Elle est particulièrement adaptée au diagnostic, suivi ou traitement de cancers, de rétinopathies liées au diabète, de la dégénérescence maculaire, de l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ou de pathologies liées à une cicatrisation retardée.
Un premier objet de l'invention concerne des variants de la protéine FKBP65 (typiquement sous forme isolée ou purifiée), ainsi que des fragments spécifiques de ceux-ci.
Un autre objet de l'invention concerne des acides nucléiques codant des variants de la protéine FKBP65 (typiquement sous forme isolée ou purifiée), ainsi que des fragments spécifiques de ceux-ci. Les acides nucléiques peuvent être de l'ADN ou de l'ARN, par exemple.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un variant de la protéine FKBP65 (typiquement sous forme isolée ou purifiée), ou un fragment spécifique de celui-ci, ou un acide nucléique codant un tel variant ou fragment.
Un autre objet de l'invention concerne un vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, ainsi que toute cellule recombinante comprenant un tel vecteur ou acide nucléique, et/ou exprimant un variant de FKBP65.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers, notamment pour inhiber la croissance des tumeurs ou la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine
FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de rétinopathies liées au diabète, de la dégénérescence maculaire, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatoïde, du psoriasis, ou de pathologies liées à une cicatrisation retardée.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement d'une pathologie telle que définie ci-avant chez un sujet, notamment d'une pathologie ayant une composante liée à l'angiogénèse, comprenant l'administration à un sujet atteint d'une quantité efficace d'un inhibiteur de la protéine FKBP65.
Un autre objet de l'invention concerne des composés inhibiteurs de la protéine FKBP65, notamment un anticorps, un acide nucléique inhibiteur ou un ligand cytotoxique, ainsi que des compositions les contenant.
L'invention concerne également un procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FKBP65, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
Elle concerne encore des procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène FKBP65, à moduler son expression ou à moduler son activité.
L'invention est particulièrement adaptée au développement de médicaments ou de procédés de diagnostic ou dépistage de maladies ayant une composante liée à l'angiogénèse, comme indiqué ci-avant. PRODUITS ET DEFINITIONS
Protéine FKBP65
Dans le contexte de l'invention, le terme protéine FKBP65 désigne tout polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO : 2 (isoforme sauvage), un variant de la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celles-ci.
Le terme « variant » désigne en particulier tous les variants naturels de la séquence SEQ ID NO : 2, résultant par exemple de polymorphisme(s), épissage(s), mutations(s), etc. De tels variants naturels peuvent donc comprendre une ou plusieurs mutations ou substitutions, une délétion d'un ou plusieurs résidus, etc. par rapport à la séquence SEQ ID NO : 2. Dans ce contexte, la présente invention décrit à présent l'identification de nouveaux isoformes de la protéine FKBP65 humaine, résultant d'altérations qualitatives au niveau des ARN, notamment d'épissages. Ainsi, les demandeurs ont mis en évidence trois nouvelles isoformes d'épissage, dont les caractéristiques sont résumées ci-après :
Isoforme 2 : présence d'un premier exon alternatif noté 6B, situé entre l'exon 6 et l'exon 7. La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 4. La région additionnelle résultant de la présence de l'exon alternatif 6B correspond aux résidus 356 à 417 inclus. La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ
ID NO : 3.
Isoforme 3 : présence d'un second exon alternatif noté 7B, situé entre l'exon 7 et l'exon 8. La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 6. La région additionnelle résultant de la présence de l'exon alternatif 6B correspond aux résidus 420 à 438 inclus. La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ
ID NO : 5.
Isoforme 4: présence de l'exon 6B en l'absence de l'exon 7 (exons mutuellement alternatifs). La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 8. La région additionnelle résultant de la présence de l'exon alternatif 6B correspond aux résidus 355 à 431 inclus (les résidus 417 à 431 correspondent à une séquence nouvellement créée). La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ ID NO : 7. Ces isoformes représentent des objets particuliers de l'invention. Ainsi, un aspect de l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 4, 6 et 8, ou un fragment spécifique de ces séquences.
Le terme fragment ou partie « spécifique » désigne un fragment caractéristique des variants considérés, typiquement un fragment portant au moins une altération génétique caractéristique des variants considérés. De tels fragments spécifiques se distinguent donc de la séquence sauvage par la présence d'une caractéristique structurale propre (e.g., mutation, nouvelle jonction, rétention d'intron, délétion d'une séquence, codon stop, nouvelle séquence résultant d'un décalage du cadre de lecture, etc.) résultant d'un événement d'altération mis en évidence par les demandeurs. Cette caractéristique structurale propre est également désignée par l'expression « séquence cible ». Des fragments spécifiques selon l'invention comprennent donc au moins une séquence cible telle que définie ci-avant. Des fragments préférés comportent au moins 5 nucléotides consécutifs de la séquence considérée, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 12. Des fragments peuvent comprendre jusqu'à 50, 75 ou 100 nucléotides, voire plus.
Un objet particulier de l'invention réside notamment dans un polypeptide comprenant les résidus 356 à 417 de la séquence SEQ ID NO : 4 ou les résidus 420 à 438 de la séquence SEQ ID NO : 6 ou les résidus 355 à 431 ou 417 à 431 de la séquence SEQ ID NO : 8, un un fragment de ceux-ci comprenant au moins 5 résidus consécutifs, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 12.
Le terme variant désigne également les polypeptides FKBP65 ayant pour origine une autre espèce, par exemple de rongeurs, bovins, etc. Avantageusement, le terme protéine FKBP65 désigne un polypeptide d'origine humaine.
Le terme « variant » inclut également tout variant synthétique d'une protéine FKBP65, et notamment tout polypeptide comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions et/ou additions d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à la séquence SEQ ID NO 2, 4, 6 ou 8. De préférence, il s'agit de polypeptides reconnus par un anticorps polyclonal produit à partir de la protéine FKBP65 de séquence SEQ ID NO 2, 4, 6 ou 8.
Des variants synthétiques préférés comportent avantageusement au moins 75% d'identité avec la séquence primaire SEQ ID NO : 2, 4, 6 ou 8, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 85%. Encore plus préférentiellement, les variants synthétiques préférés comportent au moins 90% d'identité avec la séquence primaire SEQ ID NO : 2, 4, 6 ou 8, de préférence au moins 95%, 96%, 97% ou 98%. Le degré d'identité peut être déterminé par différentes méthodes et au moyen de logiciels connus de l'homme du métier, comme par exemple selon la méthode CLUSTAL.
Des variants particuliers possèdent une mutation ou une substitution affectant 5 acides aminés au plus de la séquence SEQ ID NO 2, 4, 6 ou 8.
Typiquement, les variants selon l'invention sont des polypeptides conservant au moins une propriété immunologique, biologique ou pharmacologique de la protéine FKBP65 de séquence SEQ ID NO :2, 4, 6 ou 8. Les propriétés biologiques sont notamment la modulation de l'angiogénèse ou de la production d'élastine. Les propriétés immunologiques sont par exemple la capacité de produire des anticorps reconnaissant la protéine de SEQ ID NO : 2, 4, 6 ou 8.
Comme indiqué, le terme protéine FKBP65 inclut également des polypeptides comprenant des fragments de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant de celle-ci. Il s'agit plus particulièrement des polypeptides comprenant une partie de la séquence SEQ ID NO :2, 4, 6 ou 8.
Les polypeptides fragments de l'invention contiennent de préférence moins de 200 acides aminés, plus préférentiellement moins de 180 acides aminés, encore plus préférentiellement moins de 150 acides aminés, par exemple moins de 120 acides aminés. Ils comportent avantageusement au moins 5 résidus consécutifs de la séquence de la protéine FKBP65. Avantageusement, les polypeptides fragments contiennent au moins une région ou un domaine fonctionnel de la protéine FKBP65de séquence SEQ ID NO :2, comme par exemple un domaine FKBP, un domaine de rétention dans le réticulum endoplasmique, un domaine EF, un épitope, une structure secondaire (boucle, feuillet, etc.), un site consensus, etc. Par rapport à la séquence SEQ ID NO :2, le peptide signal est localisé au niveau des résidus 1-26, le domaine EF au niveau des résidus 501- 529 et/ou 546-574, le signal de rétention dans le réticulum au niveau des résidus 579- 582 et le domaine FKBP au niveau des résidus 53-147, 165-259, 277-371 et/ou 390-483.
Des fragments préférés de l'invention comprennent moins de 200 acides aminés de la séquence SEQ ID NO 2, 4, 6 ou 8 et comportent au moins un domaine antigénique ou immunogène spécifique de celle-ci. La présente demande propose en effet la production de polypeptides fragments de FKBP65 comportant de préférence une portion immunogène de FKBP65, qui sont utilisables pour la production d'anticorps, de tests de dosages, etc. Ces polypeptides peuvent être élaborés en utilisant des algorithmes permettant d'évaluer l'hydrophilicité ou Pantigénicité d'un polypeptide. Au sens de l'invention, le terme "fragment » ou « portion » immunogène désigne toute portion du polypeptide comprenant un épitope, de préférence un épitope T ou B. Un tel fragment comprend donc avantageusement au moins 7 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO :2, 4, 6 ou 8, plus préférentiellement au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence considérée, encore plus préférentiellement au moins 15 acides aminés consécutifs.
Des fragments particuliers au sens de l'invention conservent une ou plusieurs propriétés de FKBP65 telles que mentionnées ci-avant. De tels variants ou fragments biologiquement actifs sont utilisables pour mimer l'action de FKBP65 ou pour produire des anticorps correspondants.
D'autres fragments particuliers au sens de l'invention sont des polypeptides capables d'antagoniser l'activité de FKBP65. De tels fragments sont utilisables pour inhiber l'action de FKBP65. De tels fragments peuvent comprendre par exemple le domaine FKBP ou une partie fonctionnelle de celui-ci, et agir comme compétiteur de la protéine active.
Les polypeptides ou protéines FKBP65 de l'invention peuvent comprendre des résidus hétérologues ajoutés à la séquence d'acides aminés indiquée. Ainsi, un objet de l'invention réside dans un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :2, 4, 6 ou 8, ou d'un variant de celles-ci, et une partie hétérologue.
La partie hétérologue peut correspondre à des acides aminés, lipides, sucres, etc. Il peut également s'agir de groupe(s) chimique(s), enzymatique(s), radioactif(s), etc. La partie hétérologue peut en particulier constituer un marqueur, un agent de ciblage, un agent stabilisateur, un agent améliorant l'immunogénicité ou facilitant la production, un agent protecteur, un agent facilitant la pénétration du polypeptide dans les cellules, une toxine, ou composé actif, un anticorps, etc..
Les protéines FKBP65 de l'invention peuvent se présenter sous forme soluble, purifiée ou complexée avec une molécule porteuse telle que KLH ou la sérum-albumine, ou toute autre molécule inerte (par exemple synthétique), telle qu'une bille par exemple. Les polypeptides selon l'invention sont préférentiellement dépourvus de contamination par des protéines naturellement présentes dans leur environnement naturel. Dans un mode de mise en œuvre particulier, les polypeptides sont couplés à une molécule porteuse notamment pour la fabrication d'anticorps. Le couplage peut être réalisé selon des techniques conventionnelles. Les polypeptides peuvent également être conjugués ou fusionnés à toute autre molécule polypeptidique ou peptidique telle que par exemple un peptide, polypeptide ou une protéine biologiquement active.
Les protéines FKBP65 de l'invention peuvent être fabriquées par toute technique connue en soi de l'homme du métier, notamment par toute technique chimique, biologique, génétique, enzymatique, etc., seule ou en combinaison(s). Des méthodes préférées comprennent l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, d'un acide nucléique correspondant ou la synthèse artificielle selon des techniques conventionnelles telles que la synthèse en phase solide.
Les protéines FKBP65 selon l'invention peuvent être utilisées dans des tests de sélection ou de criblage, dans des méthodes de dosage, pour réguler l'activité de FKBP65 in vitro ou in vivo, pour la production de médicaments ou vaccins, pour le ciblage de molécules, pour la production d'anticorps anti-FKBP65, notamment d'anticorps thérapeutiques, etc. Gène FKBP65
Au sens de l'invention, on entend par « gène FKBP65 » tout acide nucléique codant une protéine FKBP65 telle que définie ci-avant. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, d'origine naturelle ou synthétique. Il peut notamment s'agir d'ADN génomique, complémentaire, chimérique, artificiel, d'ARNm, etc. Le gène FKBP65 peut être sous forme simple-brin ou double-brin. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme de l'art à partir de la séquence SEQ ID NO : 1 et des informations contenues dans la présente demande. Un gène FKBP65 particulier comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 ou d'une séquence complémentaire, ou d'une séquence différente en raison de la dégénérescence du code génétique, ou d'une séquence hybridant avec celles-ci dans des conditions de stringence élevée et codant une protéine FKBP65.
Le gène FKBP65 de l'invention peut être incorporé dans un vecteur de clonage ou d'expression, dans le génome d'une cellule, etc.
Des exemples de vecteurs utilisables pour cloner un gène FKBP65 de l'invention sont notamment des plasmides, cosmides, épisomes, chromosomes artificiels, virus, phages, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc. De tels vecteurs constituent des objets particuliers de l'invention.
Le gène ou vecteur peut être introduit dans une cellule hôte, afin de produire une protéine FKBP65. Des exemples de cellules utilisables sont notamment des cellules de mammifères, de levure, de plante, d'insecte ou de bactérie. On peut citer des cellules primaires ou des lignées établies de cellules de mammifère. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple. De telles cellules recombinantes constituent des objets particuliers de l'invention. Inhibiteur de la protéine FKBP65
Dans le contexte de la présente demande, le terme « inhibiteur de la protéine FKBP65 » ou « inhibiteur de FKBP65 » désigne toute molécule, composition, condition ou traitement permettant de réduire l'expression ou l'activité biologique de la protéine FKBP65 dans une cellule, un tissu ou un organisme. Il peut s'agir notamment d'un composé, traitement ou composition inhibant la transcription d'un gène FKBP65, la maturation des ARNs, la traduction de l'ARNm, la modification post-traductionnelle de la protéine, sa translocation vers le réticulum, etc. Il peut également s'agir d'un composé, traitement ou composition inhibant l'activité de la protéine FKBP65, par exemple en inhibant son interaction avec d'autres constituants cellulaires, ou son activité sur la tropoélastine ou sur la maturation du collagène.
Des composés inhibiteurs peuvent être de nature diverse, comme par exemple des acides nucléiques inhibiteurs, anticorps, peptides, molécules synthétiques, etc.
Le terme « inhiber » inclut toute réduction de l'expression ou de l'activité de la protéine FKBP65, même si celle-ci n'est pas totale. On préfère néanmoins des inhibiteurs capables de réduire in vitro de 20% au moins l'expression ou l'activité de la protéine FKBP65, plus préférentiellement de 30% au moins. En outre, des inhibiteurs particulièrement préférés sont des inhibiteurs sélectifs, c'est-à-dire qui agissent principalement sur la protéine FKBP65 et, dans une moindre mesure ou de manière essentiellement indirecte, sur d'autres cibles ou mécanismes. La sélectivité peut être déterminée en testant l'effet des inhibiteurs sur d'autres protéines cellulaires. Un inhibiteur sélectif désigne avantageusement un inhibiteur de la protéine FKBP65 tel que défini ci-dessus, essentiellement dépourvu d'activité directe (notamment essentiellement dépourvu de la capacité de liaison) sur la protéine FKBP 12 et/ou d'autres membres de la famille des FKBP.
Sonde Nucléique
Un objet particulier de l'invention concerne une sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un gène FKBP65 ou d'un ARN correspondant, typiquement par hybridation sélective à partir d'un échantillon. Généralement, la sonde comprend la séquence d'un gène FKBP65 tel que défini ci-avant ou une partie de celle- ci. Une sonde de l'invention comprend typiquement de 10 à 1000 nucléotides, de préférence de 20 à 800, plus préférentiellement de 50 à 600, et est généralement simple- brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un gène FKBP65 ou de TARN correspondant. L' oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Un autre exemple de sonde nucléique de l'invention comprend la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 ou une partie codante de celles-ci.
Une sonde particulière selon l'invention est une sonde spécifique d'une séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 et capable de distinguer entre les différentes isoformes de FKBP65. Il s'agit typiquement d'une sonde spécifique et complémentaire des exons spécifiques de chacune de ces isoformes ou de régions de jonctions nouvelles créées par la présence ou l'absence d'exons alternatifs. Ainsi, dans le cas de l'isoforme 2, une sonde particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 7, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 6B alternatif correspond aux résidus 356 à 417 de la séquence SEQ ID NO: 4. Cette séquence, ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 3) peut être utilisée pour construire des sondes spécifiques selon l'invention. Dans le cas de l'isoforme 3, une sonde particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 7B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 7B et l'exon 7, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 7B alternatif correspond aux résidus 420 à 438 de la séquence SEQ ID NO: 6. Cette séquence, ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 5) peut être utilisée pour construire des sondes spécifiques selon l'invention. Dans le cas de l'isoforme 4, une sonde particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 6B alternatif correspond aux résidus 355 à 431 de la séquence SEQ ID NO: 8. Cette séquence (ou des fragments de celle-ci, par exemple entre les résidus 417 et 431), ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 7) peut être utilisée pour construire des sondes spécifiques selon l'invention.
Les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc. Les sondes peuvent être sous forme libre ou immobilisée sur un support (colonne, bille, lame, membrane, etc.).
A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins une sonde telle que définie ci-avant, immobilisée sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. La sonde est préférentiellement immobilisée par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation. Des techniques d'immobilisation de matériels (tels que acides nucléiques, polypeptides, anticorps, etc.) sur des supports ont été décrites dans la littérature, et notamment dans les demandes ou brevets n° EP619 321, WO91/08307, US4,925,785 et GB2,197,720.
Amorce Spécifique
Un autre objet de l'invention concerne une amorce nucléique, permettant l'amplification (sélective) d'un gène FKBP65 ou d'une partie (spécifique) de celui-ci. Une amorce selon l'invention est avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 5 à 40 et encore plus préférentiellement de 6 à 35 bases. Elle est typiquement simple-brin. Une amorce particulière est complémentaire d'une région au moins du gène FKBP65 ou de l'ARN correspondant.
Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de la séquence SEQ ID NO : 1, 3, 5 ou 7 ou de leur brin complémentaire. Un autre mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une région bordant la séquence SEQ ID NO : 1, 3, 5 ou 7 et permettant l'amplification d'une partie au moins de cette séquence. Le terme « bordant » indique que la région est située préférentiellement à moins de 300 pb de la séquence considérée, plus préférentiellement à moins de 200pb, encore plus préférentiellement à moins de 150pb. L'amorce peut ainsi être complémentaire et spécifique d'une région bordant un gène FKBP65 dans un génome, ou bordant une séquence codante dans un génome ou un ARN.
Une amorce particulière selon l'invention est une amorce spécifique d'une séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 et capable de distinguer entre les différentes isoformes de FKBP65. Il s'agit typiquement d'une amorce spécifique et complémentaire (ou permettant l'amplification spécifique) de tout ou partie d'un exon spécifique de chacune de ces isoformes ou de régions de jonctions nouvelles créées par la présence ou l'absence d'exons alternatifs. Ainsi, dans le cas de l'isoforme 2, une amorce particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 7, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 6B alternatif correspond aux résidus 356 à 417 de la séquence SEQ ID NO: 4. Cette séquence, ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 3) peut être utilisée pour construire des amorces spécifiques selon l'invention. Dans le cas de l'isoforme 3, une amorce particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 7B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 7B et l'exon 7, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 7B alternatif correspond aux résidus 420 à 438 de la séquence SEQ ID NO: 6. Cette séquence, ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 5) peut être utilisée pour construire des amorces spécifiques selon l'invention. Dans le cas de l'isoforme 4, une amorce particulière selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. La séquence en acides aminés de l'exon 6B alternatif correspond aux résidus 355 à 431 de la séquence SEQ ID NO: 8. Cette séquence (ou des fragments de celle-ci, par exemple entre les résidus 417 et 431), ainsi que celle des résidus flanquants et la séquence correspondante en acides nucléiques (SEQ ID NO: 7) peut être utilisée pour construire des amorces spécifiques selon l'invention.
L'invention concerne également une paire d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisée en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un gène FKBP65 et permettent l'amplification d'au moins une portion de celui-ci. Les amorces peuvent être complémentaires d'une partie de la région codante du gène FKBP65, ou des régions régulatrices (promoteur, terminateur, etc.).
Antisens
On entend par acide nucléique inhibiteur tout acide nucléique capable d'inhiber la transcription du gène FKBP65 ou la traduction du messager correspondant.
L'acide nucléique inhibiteur peut agir selon différents mécanismes et peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène FKBP65, d'un fragment de celle-ci, du messager de la FKBP65, ou d'une séquence complémentaire à celles-ci. L'acide nucléique inhibiteur peut notamment comprendre une région complémentaire d'une partie de la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine. L'acide nucléique inhibiteur est préférentiellement complémentaire d'une portion au moins de la région codante de la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7. La complémentarité de l'acide nucléique inhibiteur est préférentiellement parfaite, même si certains mésappariements peuvent être tolérés. L'acide nucléique inhibiteur peut être un ADN, un ARN, ou des formes modifiées de ceux-ci, par exemple un PNA. Il peut s'agit d'un acide nucléique anti-sens, un ribozyme, un ARNi, etc. Il peut être simple-brin ou double-brin. Sa longueur peut varier entre quelques bases et plusieurs centaines de bases, par exemple jusqu'à la longueur complète de la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7 ou de l'ARNm de FKBP65. Il peut également s'agir d'un ARN codé par un gène antisens. S 'agissant d'un oligonucléotide inhibiteur (e.g., antisens, RNAi, etc.), il comprend typiquement moins de 100 bases, par exemple de l'ordre de 10 à 50 bases. Cet oligonucléotide peut être modifié pour améliorer sa stabilité, sa résistance aux nucléases, sa pénétration cellulaire, etc. Dans une première variante, les acides nucléiques inhibiteurs sont capables d'inhiber la transcription et/ou la traduction de toutes les isoformes de séquence SEQ ID NO : 1, 3, 5 et 7. De tels acides nucléiques inhibiteurs sont donc dirigés contre des régions spécifiques de FKBP65 communes à ces isoformes, préférentiellement dans la région 5'- terminale. Ainsi par exemple, un acide nucléique inhibiteur particulier selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins d'un exon situé en amont (c'est- à-dire) en 5' de l'exon 6B, choisi par exemple parmi les exons 1, 2, 3, 4, 5 et 6. Un autre acide nucléique inhibiteur particulier selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon 7. Comme illustré dans les exemples, des acides nucléiques inhibiteurs complémentaires d'un codon au moins des exons 6 ou 7 permettent d'inhiber efficacement l'activité FKBP65 dans des cellules.
D'autres acides nucléiques inhibiteurs particuliers au sens de l'invention sont spécifiques d'une isoforme de la protéine FKBP65 de séquence SEQ ID NO : 3, 5 ou 7. En particulier, des acides nucléiques inhibiteurs au sens de l'invention sont des acides nucléiques inhibiteurs spécifiques de régions de jonctions créées au niveau des ARNm par les épissages alternatifs spécifiques de chacune des isoformes identifiées. De tels acides nucléiques inhibiteurs permettent de discriminer entre ces différentes formes et de moduler spécifiquement l'activité de l'une des formes seulement. Ainsi, dans le cas de l'isoforme 2, un acide nucléique inhibiteur particulier selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 7, d'autre part, tels que définis précédemment. Dans le cas de l'isoforme 3, un acide nucléique inhibiteur particulier selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 7B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 7B et l'exon 7, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. Dans le cas de l'isoforme 4, un acide nucléique inhibiteur particulier selon l'invention comprend une séquence spécifique d'un codon au moins de l'exon alternatif 6B, ou d'une région de jonction entre cet exon alternatif 6B et l'exon 6, d'une part, ou l'exon 8, d'autre part. Les acides nucléiques inhibiteurs spécifiques de FKBP65 représentent des objets particuliers de l'invention, ainsi que des compositions pharmaceutiques les comprenant, en association avec tout véhicule ou excipient acceptable sur la plan pharmaceutique.
Plus particulièrement, un objet particulier de l'invention réside dans un ARNi spécifique de la protéine FKBP65. Il s'agit plus particulièrement d'un siARN ou d'un shARN, ou d'un ADN (ou autre type d'acides nucléiques) codant pour un tel ARNi. L'ARN interférence est un mécanisme puissant d'invalidation de l'expression de gènes. Brièvement, elle repose sur l'utilisation de molécules ARN double brins, typiquement de 21 nucléotides en longueur, appelées siRNA, qui provoquent l'induction d'un mécanisme endogène appelé ARN interférence. Ceci provoque la dégradation spécifique des molécules des ARNm homologues en séquence aux siRNA. Ce système original est maintenant largement reconnu et utilisé comme outil de biologie moléculaire du fait de son efficacité et de sa spécificité d'action. Différentes molécules de siRNA dirigées contre FKBP65 ont été synthétisées par les inventeurs et leurs effets testés sur des cellules. Les résultats obtenus dans les exemples démontrent l'effet anti-prolifératif de tels inhibiteurs sélectifs de FKBP65 selon la présente invention.
Un objet particulier de l'invention réside dans un ARN inhibiteur, de type interférant, comprenant une région double brin de 21 nucléotides de longueur, la région double brin étant complémentaire d'une région du gène ou de l'ARN FKBP65. Dans un mode de réalisation particulier, l'ARN inhibiteur comprend un séquence unique comportant deux régions de 21 complémentaires de nucléotides séparées par une région capable de former une boucle. Dans ce mode de réalisation, l'ARN inhibiteur est désigne shRNA. Un autre objet particulier de l'invention concerne un ADN codant pour un ARN inhibiteur tel que défini ci-avant, ainsi que tout vecteur comprenant un tel ADN (e.g., plasmide, vecteur viral, etc.). Dans un mode particulier de mise en œuvre, la région double brin des ARN inhibiteurs est complémentaire d'une partie d'un exon de FKBP65 choisi parmi les exons
1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7. Dans un mode spécifique, la région double brin des ARN inhibiteurs est formée par l'hybridation des oligonucléotides de séquence SEQ ID NO: 9 et 10 d'une part, 11 et 12 d'autre part. Anticorps
Un autre objet de l'invention concerne tout anticorps spécifique d'une protéine ou d'un polypeptide FKBP65, c'est-à-dire capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un tel polypeptide ou protéine. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, poly-fonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal non-humain avec une protéine FKBP65 ou un fragment de celle-ci comportant un épitope, et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Diverses méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées ont été décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, par exemple par injection sous- cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés.
Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal non-humain avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels.
Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles.
L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection d'une protéine FKBP65 telle que définie ci-avant (ou d'un fragment immunogène de celle-ci) à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques de la protéine FKBP65, c'est-à-dire ayant une affinité supérieure pour la protéine FKBP65 que pour d'autres antigènes, même si une liaison non-spécifique ou moins affine ne peut être exclue.
Dans une première variante, les anticorps sont capables de reconnaître toutes les isoformes de séquence SEQ ID NO : 2, 4, 6 et 8. De tels anticorps sont donc dirigés contre des épitopes spécifiques de FKBP65 communs à ces isoformes, préférentiellement dans la région N-terminale.
D'autres anticorps particuliers au sens de l'invention sont spécifiques d'une isoforme de la protéine FKBP65 de séquence SEQ ID NO : 4, 6 ou 8. En particulier, des anticorps préférés au sens de l'invention sont des anticorps spécifiques de (ou générés par immunisation avec un polypeptide comprenant) la séquence suivante :
- résidus 356 à 417 de la séquence SEQ ID NO : 4, ou
- résidus 420 à 438 de la séquence SEQ ID NO : 6, ou
- résidus 355 à 431 ou 417 à 431 de la séquence SEQ ID NO : 8, ou - un fragment de ceux-ci comprenant au moins 5 résidus consécutifs, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 12.
De tels anticorps permettent de discriminer entre ces différentes formes et d'analyser leur régulation dans des échantillons et de moduler spécifiquement l'activité de l'une des formes seulement.
L'invention concerne également des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.
Les anticorps de l'invention peuvent être couplés à des fragments hétérologues tels que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Les toxines peuvent être choisies parmi la toxine dipthérique, botulique, la ricine, etc.
Les anticorps de l'invention peuvent également être immobilisés sur un support, tel qu'une bille, colonne, gel, puce, etc. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins un anticorps spécifique d'une protéine FKBP65 immobilisé sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. L'anticorps est préférentiellement immobilisé par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction immunologique.
APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
La présente demande décrit l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans l'angiogénèse. Cette protéine est sur-exprimée en condition d'hypoxie, en réponse au VEGF et en conditions d'ischémie. Cette protéine est donc impliquée dans la régulation de l'angiogénèse et représente une cible particulièrement intéressante pour des interventions thérapeutiques dans différentes pathologies, comme notamment les cancers ou les rétinopathies.
En effet, des inhibiteurs de FKBP65 peuvent conduire à la formation de vaisseaux sanguins immatures en inhibant la sécrétion d'élastine au cours de l'angiogénèse. Dans le cas plus particulier des cancers, des inhibiteurs de FKBP65 peuvent conduire à une diminution de la sécrétion de la tropoélatine et des fragments de protéolyse de l'élastine, qui agissent comme des facteurs induisant la prolifération dans ces cancers. Ils peuvent également réduire l'irrigation des tumeurs et donc réduire leur croissance.
Une première application thérapeutique particulièrement bénéfique réside dans le traitement des pathologies liées à une prolifération cellulaire incontrôlée ou pathologique, notamment les cancers. Un objet de l'invention réside plus particulièrement dans l'utilisation d'un inhibiteur sélectif de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur sélectif de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance tumorale et/ou la formation de métastases chez les patients atteints de cancers. En effet, il est établi que l'angiogénèse est non seulement essentielle à la croissance d'une tumeur mais est aussi impliquée dans la progression du stade bénin au stade du cancer invasif, et dans la progression de métastases dormantes vers des lésions métastatiques. La possibilité de réguler négativement l'angiogénèse permet de réduire la progression métastasique des cancers.
L'invention est utilisable pour la traitement de différents types de cancers, notamment de tumeurs solides, comme par exemple les cancers du sein, du poumon, de la prostate, du colon, de l'utérus, tête-et-cou, du cerveau (e.g., glioblastome), de la peau, du foie, de la vessie, etc.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse.
De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogénèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, les rétinopathies (notamment les rétinopathies liées au diabète et la dégénérescence maculaire), l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée. L'invention permet donc de contrôler la l'apparition, la progression ou le développement de ces pathologies chez des patients.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur (sélectif) de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de la dégénérescence maculaire, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatoïde, du psoriasis, ainsi que de pathologies liées à une cicatrisation retardée. Un autre objet .de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur (sélectif) de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à favoriser la cicatrisation.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur (sélectif) de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à traiter l'ischémie.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur (sélectif) de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.
Un autre objet de l'invention concerne des méthodes de traitement des pathologies mentionnées ci-dessus, comprenant l'administration à un patient d'une quantité efficace d'un inhibiteur (sélectif) de la protéine FKBP65.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.
Le composé inhibiteur peut être de nature variée.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique inhibiteur capable d'inhiber la transcription du gène FKBP65 ou la traduction du messager correspondant. Il s'agit tout particulièrement d'un oligonucléotide antisens, d'un gène codant un ARN antisens, d'un ribozyme ou d'un ARN interférant.
Dans une variante particulière de réalisation, l'inhibiteur est un ARN interférant spécifique du gène ou de l'ARNm de FKBP65. A cet égard, la présente demande décrit plusieurs séquences ARNi spécifiques de l'ARNm de FKBP65 et leurs propriétés biologiques. L'invention concerne également toute composition comprenant un tel ARN interférant, ou comprenant un ADN codant un tel ARN interférant.
Dans un autre mode de réalisation, le composé est un peptide comprenant une région de la protéine FKBP65 et capable d'antagoniser son activité. Le peptide comprend avantageusement 5 résidus consécutifs au moins de la protéine FKBP65, plus généralement entre 10 et 100. Le peptide comprend typiquement le site FKBP de la protéine FKBP65.
Selon un autre mode de réalisation, l'inhibiteur est un anticorps spécifique de la protéine FKBP65, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, tels que définis ci-avant, notamment un anticorps intracellulaire (e.g., de type ScFv).
L'anticorps peut également être couplé à un fragment hétérologue, tel qu'une toxine, un médicament ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. A cet égard, dans une variante particulière de mise en œuvre, le composé inhibiteur est un ligand cytotoxique spécifique de FKBP65. De tels ligands cytotoxiques sont particulièrement adaptés pour le traitement de cancers. Des ligands cytotoxiques spécifiques sont typiquement des molécules comportant une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité vis-à-vis de FKBP65. La région conférant la cytotoxicité peut être toute molécule toxique pour une cellule, soit par elle-même, soit de manière conditionnelle ou indirecte (c'est-à-dire en rendant la cellule sensible à un agent chimique ou au système immunitaire du patient, par exemple). La région conférant la spécificité vis-à-vis de FKBP65 est typiquement un anticorps ou fragment d'anticorps tel que défini ci-avant. Il peut cependant s'agir également de ligands spécifiques de FKBP65, notamment d'une partie d'un récepteur ou partenaire cellulaire de FKBP65.
Selon un autre mode de réalisation, le composé inhibiteur est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi- synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de la protéine FKBP65. Un tel inhibiteur peut être obtenu ou issu d'une méthode de sélection, telle que définie ci-après. Dans ce contexte, la présente demande montre que l'Ascomycin, produit de fermentation ascomycete, de formule C43H69NO12, est capable d'inhiber l'angiogénèse. Même si ce composé n'est pas un inhibiteur sélectif de FKBP65, ces résultats valident l'intérêt et la pertinence biologique de la cible de l'invention pour le développement de médicaments utilisables dans le traitement des pathologies décrites ci-avant.
Un objet particulier de l'invention réside également dans l'utilisation du FK506 ou un dérivé de celui-ci pour le traitement de pathologies associées à l'angiogénèse, notamment les rétinopathies liées au diabète, la dégénérescence maculaire, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée. Un exemple spécifique de composé dérivé d'ascomycin est le composé FK506, qui possède un groupement ethyle en position 21 à la place d'un allyle. Dans un mode de mise en œuvre préféré, on utilise un inhibiteur chimique sélectif de FKBP65 tel que défini précédemment. Un tel inhibiteur sélectif peut notamment être produit par les méthodes décrites ci-après.
Pour la mise en œuvre des méthodes thérapeutiques définies ci-avant, l'inhibiteur peut être utilisé à différentes doses et selon différents protocoles. En outre, il peut être utilisé seul ou, de préférence, combiné à d'autres agents actifs. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-tumotale, infra-dermique, intra-cérébrale, intra-veineuse, intra-artérielle ou infra-musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Pour des anticorps thérapeutiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs.
Les composés inhibiteurs peuvent être formulés en présence de tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (par exemple tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.). Le véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique peut être choisi parmi des solutés tampons, solvants, liants, stabilisants, émulsifïants, etc. Des solutés tampons ou diluant sont notamment le phosphate de calcium, sulfate de calcium, lactose, cellulose, kaolin, mannitol, chlorure de sodium, amidon, sucre en poudre et hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC) (pour libération retard). Des liants sont par exemple l'amidon, la gélatine et des solutés de remplissage comme le sucrose, glucose, dextrose, lactose, etc. Des gommes naturelles ou synthétiques peuvent aussi être utilisées, comme notamment Palginate, la carboxymethylcellulose, la méthylcellulose, la polyvinyl pyrrolidone, etc. D'autres excipients sont par exemple la cellulose et du stéarate de magnésium. Des agents stabilisants peuvent être incorporés aux formulations, comme par exemple des polysaccharides (acacia, agar, acide alginique, gomme guar et tragacanth, la chitine ou ses dérivés et des éthers de cellulose. Des solvants ou solutés sont par exemple la solution Ringer, l'eau, l'eau distillée, des tampons phosphates, des solutions salines phosphatées, et autres fluides conventionnels.
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. Les résultats présentés dans cette demande illustrent l'implication de la protéine FKBP65 dans les mécanismes d'angiogénèse et démontrent l'intérêt d'approches thérapeutiques basées sur la régulation sélective de cette protéine.
METHODES DE DETECTION/DIAGNOSTIC
La présente demande décrit de nouveaux procédés de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FKBP65, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
La détermination peut être réalisée par différentes techniques, telles que séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives. Des méthodes utilisables pour déterminer la présence de protéines (ou domaines protéiques) sont basées par exemple sur des réactions immuno-enzymatiques, telles que ELISA, RIA, EIA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence ou l'expression de gènes ou d'ARN sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA (« Transcriptional Mediated Amplification »), la migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE (« denaturing gel gradient electrophoresis »), etc.
Dans le cas où une étape d'amplification est réalisée, celle-ci met préférentiellement en oeuvre une amorce ou une paire d'amorces telle que définie ci-avant.
Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'acides nucléiques complémentaires et spécifiques du gène FKBP65 pour la détection de cancers, la caractérisation de cancers ou pour le suivi de la progression de cancers, notamment de la formation de métastases. Cette détection peut s'effectuer grâce à des puces à ADN ou par mise en œuvre d'une PCR à partir de biopsie ou de fluides biologiques tels que du sang (le sérum notamment), des urines, du fluide séminal, etc.
L'invention réside également dans la mise au point et l'utilisation de tests immunologiques contenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-dessus ou fragments de ces derniers. Ces tests permettent de détecter et/ou mesurer la présence et/ou la quantité de protéine FKBP65 dans un échantillon biologique, cette quantité étant corrélée à un processus pathologique.
Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde nucléique telle que définie ci-avant, et la mise en évidence d'une hybridation.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce ou une paire d'amorces telles que définies ci-avant, et la mise en évidence d'un produit d'amplification.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un anticorps tel que défini ci-avant, et la mise en évidence d'un complexe antigène-anticorps. Plusieurs tests peuvent réalisés en parallèle, à partir de plusieurs échantillons et/ou en utilisant plusieurs sondes, amorces et/ou anticorps.
Comme indiqué ci-avant, la protéine FKBP65 est impliquée dans les mécanismes d'angiogénèse. La surexpression de cette protéine est observée en réponse au stress hypoxique. La détection ou le dosage de cette protéine (ou de formes altérées) dans un échantillon d'un sujet constitue donc un indicateur de la présence de telles événements pathologiques et de la sévérité de ces pathologies.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en œuvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci-avant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique.
CRIBLAGE DE COMPOSES ACTIFS
La protéine FKBP65 selon l'invention représente une cible thérapeutique particulièrement intéressante pour le traitement des cancers, de l'angiogénèse, et des maladies associées (notamment des rétinopathies et de l'athérosclérose). L'invention permet donc la mise au point de procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, basés sur une détermination de la capacité de composés tests à interagir avec FKBP65, à moduler son expression ou à moduler son activité.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une protéine FKBP65 telle que définie ci-avant, et la sélection ou l'identification des composés se liant à ladite protéine. Dans ce procédé, la protéine FKBP65 (ou tout fragment de celle- ci) peut être utilisée sous forme soluble ou immobilisée à un support (colonne, bille, plaque, etc.). Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant une protéine FKBP65 telle que définie ci-avant, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité de ladite protéine.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un gène FKBP65 ou un ARN correspondant, et la sélection ou l'identification de composés se liant au dit gène ou ARN. Dans ce procédé, il est possible d'utiliser des portions du gène ou de l'ARN.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un acide nucléique comprenant la séquence du promoteur du gène FKBP65, et la sélection ou l'identification de composés se liant au dit promoteur. Dans une variante particulière, on utilise une construction génétique comprenant un gène rapporteur placé sous le confrôle du promoteur, et l'effet du composé est déterminé par mesure de l'expression du gène rapporteur (ou de variation dans le niveau d'expression, par rapport à une situation contrôle).
La liaison à la protéine FKBP65, au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur.
Les cellules utilisées peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes. Ces cellules peuvent être des cellules de mammifères, des bactéries, des cellules de levure, de plante, d'insecte, etc. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple.
Le procédé de sélection peut être mis en œuvre dans tout support approprié, comme par exemple une plaque, un tube, une flasque, etc., typiquement dans un support multi- récipients, comme des plaques multi-puits.
Le procédé peut être mis en œuvre pour sélectionner ou identifier un activateur ou, de préférence, un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de la protéine FKBP65. Pour l'obtention de composés anti-cancéreux ou anti-angiogéniques, on sélectionne des inhibiteurs de FKBP65.
A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne des méthodes de sélection, d'identification, ou de caractérisation de composés anti-cancéreux, comprenant la mise en contact d'un ou de plusieurs composés tests avec une protéine FKBP65, un gène FKBP65 ou une cellule exprimant une protéine FKBP65, et la sélection des composés inhibant l'expression ou l'activité de FKBP65 ou se liant à celle-ci.
Dans une variante préférée de mise en œuvre, le procédé permet la sélection, l'identification, la caractérisation, l'optimisation ou la production de composés inhibiteurs sélectifs de FKBP65. Dans ce but, une étape supplémentaire de détermination de la sélectivité des composés sélectionnés peut être réalisée, par exemple par détermination de l'activité du composé sur une autre cible biologique. Dans un mode de mise en œuvre préféré, les méthodes de l'invention comprennent une étape supplémentaire d'évaluation de la capacité du composé test à moduler l'activité de FKBP 12 (c'est-à-dire notamment à se lier à cette protéine, à son gène ou ARNm, à moduler l'expression du gène ou ARNm, etc.) et/ou d'autres membres de la famille des FKBP. Les composés essentiellement dépourvus d'effet direct sur cette (ou ces) protéine(s) sont sélectionnés comme des composés sélectifs. La détermination de la spécificité des composés peut également être réalisée par détermination de l'activité des composés sur d'autres cibles biologiques, notamment des récepteurs ayant un ligand endogène différent.
L'invention porte également sur un procédé de production d'un médicament pour le traitement de cancers ou maladies liées à l'angiogénèse, notamment les rétinopathies, comprenant (i) la sélection de composés actifs selon les procédés ci-dessus et (ii) le conditionnement dudit composé ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. L'analogue fonctionnel est typiquement un composé dérivé du composé actif identifié, par modification chimique, notamment dans le but d'améliorer son activité ou sa pharmaco-cinétique, ou dans le but de réduire sa toxicité. L'analogue fonctionnel peut être une « pro-drogue » du composé identifié. Des techniques de préparation d'analogues fonctionnels sont bien connues de l'homme du métier, par exemple la modélisation moléculaire, le couplage de groupes NO, etc. Le procédé peut à cet égard comprendre une étape intermédiaire de synthèse du composé sélectionné ou de l'analogue fonctionnel de celui-ci.
Le véhicule ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique peut êfre choisi parmi des solutés tampons, solvants, liants, stabilisants, émulsifiants, etc., tels que définis ci- avant.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
MATERIELS ET METHODES UTILISES
Toute la partie de biologie moléculaire (clonage, constructions plasmidiques, transfections, établissement de clones stables, immunofluorescence, ...) a été réalisée en utilisant des protocoles classiques connus de l'homme de l'art.
Les séquences protéiques et nucléiques sont fournies dans la liste de séquence annexée.
LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Représentation du gène FKBP65 et des nouvelles isoformes.
Figure 2 : Analyse par Northern Blot de l'expression du transcrit codant pour FKBP65 en réponse au sress hypoxique.
Figure 3 : Analyse par Western Blot de l'expression de la protéine FKBP65 en réponse au VEGF.
Figure 4 : Analyse par immunofluorescence de la localisation cellulaire de FKBP65.
Figure 5 : Effets du FK506 et du CAI sur la tubulogenèse des HMEC-1 in vitro. Fig. 5a, en l'absence de composé (confrôle) ; Fig. 5b, en présence de 60 μM de FK506 ; Fig. 5c, en présence de 100 μM de CAL
Figure 6 : Mesure de la longueur des tubules et du nombre de branchements après culture de cellules en présence d'un inhibiteur de FKBP65.
Figure 7 : Analyse par Western Blot de l'expression de la protéine FKBP65 dans les cellules HMEC-1 après fransfection transitoire de différentes quantités de molécules siRNA spécifiques de FKBP65.
Figure 8 : Analyse de la viabilité des cellules HMEC-1 après fransfection transitoire de différentes quantités de molécules siRNA spécifiques de FKBP65 et de EGFP (confrôle négatif). Fig. 8a, en présence de molécules siRNA spécifiques de FKBP65 ; Fig. 8b, en présence de molécules siRNA spécifiques de l'EGFP (contrôle négatif).
EXEMPLES
1. Mise en évidence d'une dérégulation et de nouvelles isoformes de FKBP65 en réponse à l'hypoxie Une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits de cellules HMEC-1 («Human dermal Microvascular Endothelial Cell ») en culture, exposées ou non à l'hypoxie (par fraitement avec la desferoxiamine (DFO) pendant 16 heures). Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS décrite dans le brevet n° WO99/46403. Cette analyse a permis d'isoler deux fragments d'ADNc dérivés de l'ARNm du gène codant pour la protéine FKBP65 (GenBank sous la référence NM 021939). Des expériences de RT-PCR complétées par une analyse bioinformatique détaillée ont permis de mettre en évidence au moins 3 nouvelles isoformes d'épissage différentes de FKBP65, dont les caractéristiques sont résumées ci- après (Figure 1) :
Isoforme 2 : présence d'un premier exon alternatif noté 6B, situé entre l'exon 6 et l'exon 7. La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 4. La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ ID NO : 3. Isoforme 3 : présence d'un second exon alternatif noté 7B, situé entre l'exon 7 et l'exon 8. La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 6. La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ ID NO : 5.
Isoforme 4: présence de l'exon 6B en l'absence de l'exon 7 (exons mutuellement alternatifs). La séquence en acides aminés de cette isoforme est présentée en SEQ ID NO : 8. La séquence codante correspondante est représentée sur le SEQ ID NO : 7.
2. Mise en évidence d'une expression différentielle de FKBP65 en réponse à l'hypoxie
L'ARNm codant pour la protéine FKBP65 est exprimé de manière différentielle au cours du stress hypoxique. Cette forte sur expression a été mise en évidence par les techniques des puces à ADN, et du Northern Blot. On observe par macroarray une sur-expression d'un facteur 2.3 de l'ARNm codant pour FKBP65 dans les cellules HMEC-1 soumises à un sfress hypoxique (3% O2, 16 h). De plus, ce résultat a été confirmé par Northern Blot où l'on observe une forte sur-expression du transcrit codant pour FKBP65 (Figure 2).
3. Mise en évidence d'une sur-expression de FKBP65 en réponse au VEGF Nous avons caractérisé l'expression de la protéine FKBP65 par western Blot dans la lignée HMEC-1 après un traitement par le facteur de croissance des cellules endothéliales VEGF. On observe une sur-expression de la protéine FKBP65 suite au traitement VEGF (Figure 3).
4. Localisation cellulaire de la protéine FKBP65
Nous avons localisé la protéine FKBP65 dans la lignée HMEC-1 par immunofluorescence. Le signal se retrouve concentré dans la région péri nucléaire, ce qui confirme le fait que FKBP65 est une protéine du réticulum endoplasmique (Figure 4).
5. Action anti-angiogénique d'inhibiteurs de FKBP65
L'angiogénèse implique différents événements tels que la dégradation de la matrice extracellulaire, la prolifération et la migration des cellules endothéliales, la synthèse d'une nouvelle matrice extracellulaire, la formation de tubules et l'anastomose de nouveaux vaisseaux. Afin d'étudier ces phénomènes, différents tests in vivo ont été développés, tels le test CAM (chick ChorioAllantoicMembrane assay) et les test de l'anneau aortique.
A côté de ces tests ont été mis en place des moyens d'étudier in vitro la prolifération, la migration et l'invasivité des cellules endothéliales. La formation de tubules par des cellules endothéliales, ou tubulogenèse, peut ainsi êfre étudiée au travers d'un test in vitro qui est largement reconnu comme reflétant bien les stades tardifs de l'angiogénèse qui nécessitent la migration, l'attachement ainsi que la différenciation structures tubulaires des cellules endothéliales. Dans ce test, des cellules endothéliales sont cultivées sur une couche de Matrigel qui reconstitue la membrane basale et forment en quelques heures des structures de capillaires. Par conséquent, ce système, en permettant de suivre la morphogénèse des cellules endothéliales sur une couche de matrice extracellulaire, représente un outil rapide et puissant pour cribler des agents anti- angiogéniques. Dans le cadre de la présente invention, la tubulogenèse a été étudiée en utilisant des cellules HMEC-1 qui constituent une lignée de cellules endothéliales humaines de microvasculature immortalisées par l'antigène grand T de SV40. Les cellules HMEC-1 sont ensemencées dans une plaque à 96 puits dont les fonds sont recouverts par du matrigel, et incubées à 37°C pendant 6 à 8 heures. La formation de tubules est visualisée, après marquage à l'aide de la calcéine, par analyse d'image permettant la quantification grâce au logiciel disponible commercialement TCS AngioSys ™ . Plusieurs paramètres relatifs à la formation des tubules peuvent être déterminés, tels la longueur des tubules et le nombre de branchements. Un composé anti-angiogénique connu de l'homme de métier, le CAI (carboxy- amidotriazol), a été utilisé comme témoin positif d'inhibition de la tubulogenèse.
5.1. Procédure expérimentale de la tubulogenèse
5.1.1. Culture cellulaire
La lignée HMEC-1 est cultivée dans du milieu MCDB-131 (Sigma) supplémenté avec
15% de sérum de veau fœtal, 10 ng/ml EGF (« Epidermal Growth Factor ») humain recombinant (Invifrogen) et 1 μg/ml d'hydrocortisone.
Les cellules sont cultivées à une confluence comprise entre 70 et 80%.
5.1.2. Formation des tubules
Le fond des 96 puits d'une plaque de microtitration est recouvert de Matrigel (Matrigel® Basement Membrane Matrix; Becton Dickinson). La matrice de Matrigel® polymérise en 30 mn à température ambiante puis 5 mn at 37°C, en présence de 5% de CO2. Une suspension de HMEC-1 à 2-4.105 cellules/ml de milieu de culture est préparée par trypsination. Chaque puits est ensemencé par 2.104 cellules. Le composé test ou le contrôle positif (CAI) sont dilués dans le milieu de culture (volume final de 150 μl par puits) à différentes concentrations et additionnés aux cellules au moment de l'ensemencement sur la matrice. Les cellules sont incubées 6 à 8 heures à 37°C, en présence de 5% de CO2.
5.1.3. Marquage à la Calcéïne Après les 6 à 8 heures d'incubation, le milieu de culture cellulaire est dilué à l'aide de 200 μl PBS puis retiré. Les cellules sont ensuite marquées à l'aide de 150μl d'une solution à 1,25 μg/ml de Calcéine AM (acetoxyméthyle) préparée dans du PBS. La plaque est ensuite incubée 15 minutes at 37°C en présence de 5% de CO2. Le milieu est ensuite dilué à l'aide de 250 μl de PBS puis retiré.
L'analyse d'image est réalisée à l'aide de prises de vue au microscope à fluorescence et utilisation du logiciel d'analyse d'images disponible gratuitement GIMP.
5.1.4. Mesure de la formation de tubules Les images sont analysées grâce au logiciel AngioSys qui permet de quantifier la surface et la longueur des tubules ainsi que le nombre de leurs jonctions, paramètres qui sont représentatifs de la formation ou la destruction des tubules.
5.2. Impact d'un inhibiteur de FKBP65 sur la tubulogenèse
L'impact du composé FK506 (Calbiochem), ou Tacrolimus, sur la tubulogenèse a été déterminé selon la procédure détaillée plus haut. Ce composé est capable de se lier aux protéines FKBP (FK506 Binding Proteins) et d'en inhiber l'activité. La figure 6a montre la capacité des cellules HMEC-1 à former des tubules en 7 heures en l'absence de FK506 ou du contrôle positif CAL
Les figures 5b et 5c illustrent les capacités du FK506 (60μM) et du CAI (lOOμM) à inhiber la formation de microtubules.
Après analyse par le logiciel AngioSys, le FK506 apparaît au moins aussi efficace que le CAI, que soient considérés les longueurs des tubules ou le nombre de branchements, (figure 6a et 6b).
Ces résultats indiquent un fort potentiel anti-angiogénique du FK506 et démontrent les propriétés anti-angiogéniques d'inhibiteurs de la protéine FKBP65.
6. Mise en évidence de l'importance de FKBP65 pour la prolifération des cellules endothéliales. L'angiogénèse implique différents événements tels que la dégradation de la matrice extracellulaire, la prolifération et la migration des cellules endothéliales. Afin d'étudier le rôle fonctionnel et l'implication de FKBP65 dans une des étapes de l'angiogénèse qu'est la prolifération des cellules endothéliales, un test a été mis en place afin d'invalider l'expression du gène FKBP65 et de suivre in vitro l'ef et de cette invalidation sur la viabilité cellulaire.
Le phénomène d'ARN interférence a été récemment décrit comme pouvant être un outil puissant pour invalider l'expression de gènes et ainsi étudier la fonction de protéines codées par ces gènes. Brièvement, l'incorporation dans les cellules de molécules ARN double brins, de 21 nucléotides en longueur et appelées siRNA, provoque l'induction d'un mécanisme endogène appelé ARN interférence. Ceci provoque la dégradation spécifique des molécules des ARNm homologues en séquence aux siRNA. Ce système original est maintenant largement reconnu et utilisé comme outil de biologie moléculaire du fait de son efficacité et de sa spécificité d'action. Dans le cadre de la présente invention, une première étape de validation du mécanisme d'ARN interférence a été réalisée afin de vérifier sa fonctionnalité dans les cellules HMEC-1. Pour cela, des molécules siRNA commerciales dirigées contre la lamin A/C (protéine de l'enveloppe nucléaire) ont été fransfectées dans les cellules HMEC-1 à des doses croissantes et l'évolution de l'expression de la protéine lamin A/C a ensuite été suivie par western blot. Il a ainsi été validé la fonctionnalité et l'efficacité du mécanisme d'ARN interférence dans les cellules HMEC-1 (données non montrées). Une seconde étape de validation a été réalisée afin de vérifier la fonctionnalité des molécules de siRNA choisies pour invalider l'expression de FKBP65. Pour cela, différentes molécules de siRNA dirigées contre FKBP65 ont été synthétisées par voie chimique puis fransfectées dans les cellules HMEC-1 à des doses croissantes et l'évolution de l'expression de la protéine FKBP65 a été suivie par western blot. Plusieurs séquences particulières de siRNA ont ainsi été retenues comme invalidant efficacement et durablement l'expression de FKBP65 (Figure 7). Sont indiquées ci- dessous les séquences et les régions ciblées des deux siRNA ayant expérimentalement démontré une efficacité d'invalidation de l'expression du gène FKBP65 supérieure à 50%.
Séquence siRNA 1 (duplex) :5' CGC CGG AGA AUU ACC AUC CUU 3' SEQ 9
3' UUGCG GCC UCU UAA UGG UAG G 5' SEQ 10 Région ciblée de FKBP65 : exon 6
Séquence siRNA 2 (duplex) :5' CUG UUC UUU GCU GGA CGG CUU 3' SEQ 11
3' UUGAC AAG AAA CGA CCU GCC G 5' SEQ 12
Région ciblée de FKBP65 : exon 7 Les exons 6 et 7 sont communs à la forme sauvage de FKBP65 et aux différentes isoformes de FKBP65. L'invalidation de l'expression du gène FKBP65 par ces ARN concerne donc à la fois l'invalidation de l'expression de la forme sauvage et l'invalidation de l'expression des différentes isoformes.
La spécificité de l'invalidation de l'expression de FKBP65 a été démontré par l'efficacité d'action de deux molécules siRNA dirigées contre des parties différentes du transcrit de gène FKBP65.
Après avoir démontré la capacité à invalider spécifiquement et efficacement l'expression de FKBP65 dans les cellules HMEC-1 par le biais de la technologie du siRNA, les cellules HMEC-1 ont été fransfectées avec différentes molécules de siRNA dirigées contre d'une part FKBP65 et d'autre part contre l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) non présente dans les cellules HMEC-1 et qui sert de confrôle négatif. Les cellules HMEC-1 ont été fransfectées avec des doses croissantes de siRNA (0-500-2000 ng) en utilisant le kit Oligofectamine™ (Invifrogen). Six jours après fransfection est réalisé un test de viabilité cellulaire de type MTT (Microculture Tefrazolium assay) décrit par Carmichael et al. avec quelques modifications.
La figure 8b montre clairement que la viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 n'est pas affectée par la fransfection de molécules de siRNA dirigées contre l'EGFP et quelque soit la quantité de molécules transfectées. La figure 8a illusfre la capacité des molécules de siRNA dirigées contre FKBP65 à inhiber fortement la prolifération des cellules HMEC-1 et ce d'autant plus qu'une quantité croissante de molécules siRNA est fransfectée.
Ce résultat est corrélé à notre incapacité à isoler des clones stables d'HMEC-1 exprimant de manière constitutive, grâce au système plasmidique pSuppressor (hngenex), le siRNA invalidant l'expression de FKBP65. Ces résultats indiquent que FKBP65 jouerait un rôle essentiel au cours de la prolifération des cellules endothéliales et des phénomènes d'angiogénèse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un inhibiteur sélectif de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au fraitement des cancers.
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance tumorale ou la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.
3. Utilisation d'un inhibiteur sélectif de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse.
4. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine FKBP65 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de la dégénérescence maculaire, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatoïde, du psoriasis, ainsi que de pathologies liées à une cicatrisation retardée.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine FKBP65 est un acide nucléique inhibiteur spécifique de FKBP65.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine FKBP65 est un anticorps spécifique de la protéine FKBP65.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine FKBP65 est un ligand cytotoxique spécifique de la protéine FKBP65.
8. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine FKBP65 est un ARNsi spécifique de l'ARNm de FKBP65.
9. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il comprend les résidus 356 à 417 de la séquence SEQ ID NO : 4 ou les résidus 420 à 438 de la séquence SEQ ID NO : 6 ou les résidus 355 à 431 ou 417 à 431 de la séquence SEQ ID NO : 8, ou un fragment de ceux-ci comprenant au moins 5 résidus consécutifs, de préférence au moins 8, plus préférentiellement au moins 12.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 4, 6 ou 8.
11. Acide nucléique codant un polypeptide selon la revendication 9 ou 10.
12. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est spécifique d'un polypeptide selon la revendication 9 ou 10.
13. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est spécifique d'une protéine comprenant la séquence SEQ ID NO : 4, 6 ou 8.
14. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 9 ou 10 pour la production d'un anticorps dirigé contre la protéine FKBP65.
15. Procédé de production d'un anticorps, comprenant l'immunisation d'un animal non- humain avec un polypeptide selon la revendication 9 ou 10 et la récupération des anticorps ou cellules productrices d'anticorps.
16. Anticorps selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps polyclonal, monoclonal ou d'un dérivé de ceux ci conservant la même spécificité antigénique, choisi de préférence parmi un fragment Fab, ScFv, CDR, un anticorps humanisé ou recombinant.
17. Acide nucléique inhibiteur, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence complémentaire et spécifique du gène ou de l'ARNm FKBP65 et en ce qu'il inhibe la transcription du gène FKBP65 ou la traduction de l'ARNm correspondant.
18. Acide nucléique selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend une région ARN double-brin spécifique de l'ARNm de FKBP65.
19. Molécule d'ADN codant un acide nucléique selon la revendication 18.
20. Ligand cytotoxique spécifique de la protéine FKBP65, caractérisé en ce qu'il comprend une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité pour la protéine FKBP65.
21. Sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un gène FKBP65 ou d'un ARN correspondant par hybridation sélective et en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID NO :1, 3, 5 ou 7, ou une partie de celles-ci.
22. Amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de la séquence SEQ ID NO : 1, 3, 5 ou 7 ou de leur brin complémentaire ou de régions bordant celles-ci.
23. Procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine FKBP65, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
24. Procédé de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène FKBP65, à moduler son expression ou à moduler son activité.
25. Procédé de production d'un médicament, comprenant une étape de sélection, criblage ou optimisation d'un composé actif selon la revendication 24, et une étape de formulation dudit composé actif ou d'un analogue fonctionnel de celui-ci en présence d'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
26. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 11.
27. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon la revendication 26 ou un acide nucléique selon la revendication 11.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005092923A2 (fr) * 2004-03-18 2005-10-06 THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICEOffice of the Technology Transfer, NIH 6011 Executive Boulevard Cytonectine, gene de la cytonectine et inhibiteurs de la cytonectine et ligand de liaison, leur utilisation dans le diagnostic et le traitement de maladies
WO2006076854A1 (fr) * 2005-01-19 2006-07-27 Institute Of Basic Medical Sciences, Chinese Academy Of Medical Sciences Medicament combine pour les tumeurs malignes et application de celui-ci

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH686761A5 (de) * 1993-05-27 1996-06-28 Sandoz Ag Galenische Formulierungen.
US5989860A (en) * 1997-12-12 1999-11-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human isomerase homologs
WO1999035160A1 (fr) * 1998-01-09 1999-07-15 Human Genome Sciences, Inc. Proteines de liaisons fk506 humaines
AU1181900A (en) * 1998-11-17 2000-06-05 Protegene Inc. Human proteins having hydrophobic domains and dnas encoding these proteins
WO2001073024A1 (fr) * 2000-03-31 2001-10-04 Helix Research Institute Agent induisant l'expression du facteur neurotrophique
US6687428B2 (en) * 2000-09-21 2004-02-03 Tera Op (Usa) Inc. Optical switch

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COSS M C ET AL: "MOLECULAR CLONING, DNA SEQUENCE ANALYSIS, AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL 65-KDA FK506-BINDING PROTEIN (FKBP65)" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 270, no. 49, 8 décembre 1995 (1995-12-08), pages 2933-2941, XP002917765 ISSN: 0021-9258 *
DATABASE EMBL [en ligne] 12 février 2001 (2001-02-12) GENOSCOPE: "3 prime end of clone CS0DK003YI01 of library LTI_NFL006_PL2 from placenta of male Homo sapiens (human)" Database accession no. AL578100 XP002286120 *
DATABASE EMBL [en ligne] 29 septembre 2000 (2000-09-29) SUGANO S ET AL: "Homo sapiens CDNA, FLJ22221 fis, clone HRC01651" Database accession no. AK025874 XP002286119 *
DATABASE UNIPROT [en ligne] 1 mars 2001 (2001-03-01) WATANABE ET AL: "Hypothetical protein FLJ22221" Database accession no. Q9H6J3 XP002286118 *
DAVIS E C ET AL: "IDENTIFICATION OF TROPOELASTIN AS A LIGAND FOR THE 65-KD FK 506-BINDING PROTEIN, FKBP65, IN THE SECRETORY PATHWAY" THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US, vol. 140, no. 2, 26 janvier 1998 (1998-01-26), pages 295-303, XP000978504 ISSN: 0021-9525 *
PATTERSON CHARLES E ET AL: "Genomic organization of mouse and human 65 kDa FK506-binding protein genes and evolution of the FKBP multigene family" GENOMICS, vol. 79, no. 6, juin 2002 (2002-06), pages 881-889, XP002286117 ISSN: 0888-7543 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005092923A2 (fr) * 2004-03-18 2005-10-06 THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICEOffice of the Technology Transfer, NIH 6011 Executive Boulevard Cytonectine, gene de la cytonectine et inhibiteurs de la cytonectine et ligand de liaison, leur utilisation dans le diagnostic et le traitement de maladies
WO2005092923A3 (fr) * 2004-03-18 2005-11-17 Us Secretary Dept Of Health An Cytonectine, gene de la cytonectine et inhibiteurs de la cytonectine et ligand de liaison, leur utilisation dans le diagnostic et le traitement de maladies
WO2006076854A1 (fr) * 2005-01-19 2006-07-27 Institute Of Basic Medical Sciences, Chinese Academy Of Medical Sciences Medicament combine pour les tumeurs malignes et application de celui-ci

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