CN107921149B - 非酒精性脂肪肝调控因子14-3-3蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非酒精性脂肪肝调控因子14‑3‑3蛋白。根据本发明，作为14‑3‑3蛋白的两种亚型的14‑3‑3β和14‑3‑3γ是调控PPARγ2的转录活性的不同的调控因子。14‑3‑3β通过与PPARγ2结合来提高PPARγ2的转录活性，相反，14‑3‑3γ起到降低PPARγ2的转录活性的作用。因此，作为PPARγ2调控因子的14‑3‑3β和14‑3‑3γ是在脂质代谢中起重要作用的蛋白质，并且可以用作预防或治疗脂肪肝的靶标。

Description

非酒精性脂肪肝调控因子14-3-3蛋白
技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪肝调控因子14-3-3蛋白。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是引起肝脏炎症和损伤的一种代表性的肝脏疾病。当加重时，NAFLD发展成具有诸如肝硬化和纤维化等症状的非酒精性脂肪性肝炎(NAS)。根据最近的报道，已经得知，作为转录因子的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ2在脂肪肝患者的肝脏中被过表达和激活。此外，PPARγ2的激活诱导干预肝脏脂质代谢的多种靶蛋白的表达。这种干预转录因子的活性的所谓的14-3-3蛋白存在七种亚型(isoforms)(α/β、ε、ε、γ、η/ζ、δ/δ和ζ)。已知14-3-3蛋白与转录因子的磷酸化位点结合并调控转录因子的活性，并且也参与对代谢相关转录因子的调控。因此，本发明的发明人调研了14-3-3蛋白在脂肪肝的发病和调节中的作用，结果证实了调控因子14-3-3β和14-3-3γ是在脂质代谢中发挥重要作用的蛋白质，可以作为治疗非酒精性脂肪肝的靶标，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明提供了14-3-3β和14-3-3γ用于预防非酒精性脂肪肝或开发治疗性药物的用途。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述技术问题，并且从下文的描述中，其他未提及的技术问题对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，该药物组合物包含针对14-3-3β基因的抑制剂，其中所述抑制剂包括针对14-3-3β基因的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或miRNA或者包含其的载体。
本发明还提供用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，其包含14-3-3γ基因或14-3-3γ蛋白。
本发明还提供用于诊断非酒精性脂肪肝的组合物，所述组合物包含用于从疑似患有脂肪肝的患者的样本中测量14-3-3β基因和/或14-3-3γ基因的mRNA水平或蛋白质水平的探针。
本发明还提供筛选用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物的方法，所述方法包括：使包含14-3-3β基因或14-3-3β蛋白或者14-3-3γ基因或14-3-3γ蛋白的细胞在体外与候选材料接触；以及测量候选材料对所述基因或所述蛋白的表达量引起的变化。
本发明还提供筛选用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物的方法，所述方法包括：使14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白以及PPARγ2蛋白一起与候选材料接触；以及测量候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2蛋白的结合引起的变化。
有益效果
根据本发明，作为14-3-3蛋白的两种亚型的14-3-3β和14-3-3γ是调控PPARγ2的转录活性的不同的调控因子。14-3-3β通过与PPARγ2结合来提高PPARγ2的转录活性，相反，14-3-3γ起到降低PPARγ2的转录活性的作用。因此，作为PPARγ2调控因子的14-3-3β和14-3-3γ是在脂质代谢中起重要作用的蛋白质，并且可以用作预防或治疗非酒精性脂肪肝的靶标。
附图说明
图1A示出了在使14-3-3蛋白亚型过表达的情况下验证PPARγ2的转录活性的结果。
图1B示出了验证取决于14-3-3β的表达量变化的PPARγ2的转录活性变化的结果。
图1C示出了验证取决于14-3-3γ的表达量变化的PPARγ2的转录活性变化的结果。
图1D示出了验证取决于对14-3-3β表达的抑制的PPARγ2的转录活性的结果。
图1E示出了验证取决于对14-3-3γ表达的抑制的PPARγ2的转录活性的结果。
图2示出了验证取决于吡格列酮(PPARγ2配体)处理的与PPARγ2之间的结合力的结果，其中该结合力取决于利用作为PPARγ2配体的吡格列酮进行的处理，图2A示出了验证PPARγ2和14-3-3β之间的结合力的结果，并且图2B示出了验证PPARγ2和14-3-3γ之间的结合力的结果。
图3A示出了验证PPARγ2的结构域位置和其缺失突变体的结果。
图3B示出了通过GST(谷胱甘肽s-转移酶)-pull down assay(下拉实验)来验证PPARγ2的缺失突变体与14-3-3β之间的结合的结果。
图3C示出了通过GST-pull down assay来验证PPARγ2的缺失突变体与14-3-3γ之间的结合的结果。
图4A示出了验证PPARγ2的S112A突变体和S273A突变体与14-3-3β之间的结合的结果。
图4B示出了验证PPARγ2的S112A突变体和S273A突变体与14-3-3γ之间的结合的结果。
图4C示出了验证取决于PPARγ2的S273A突变体与14-3-3β之间的结合来验证PPARγ2的转录活性的结果。
图4D示出了验证取决于PPARγ2的S273A突变体与14-3-3γ之间的结合来验证PPARγ2的转录活性的结果。
图5示出了验证取决于14-3-3γ过表达或14-3-3β过表达的与PPARγ2之间的结合的结果，其中图5A示出了验证取决于14-3-3γ过表达的14-3-3β与PPARγ2之间的结合的结果，并且图5B示出了验证取决于14-3-3β过表达的14-3-3γ与PPARγ2之间的结合的结果。
图6A示出了验证取决于油酸处理的PPARγ2、14-3-3β和14-3-3γ在HepG2细胞中的表达的结果。
图6B示出了验证取决于油酸处理的PPARγ2、14-3-3β和14-3-3γ在原代小鼠肝细胞中的表达的结果。
图6C示出了验证取决于油酸处理的靶基因在HepG2细胞中的表达的结果。
图6D示出了验证取决于油酸处理的靶基因在原代小鼠肝细胞中的表达的结果。
图7A示出了验证在HepG2细胞中取决于14-3-3β表达和14-3-3γ表达的靶基因表达的结果。
图7B示出了验证在原代小鼠肝细胞中取决于14-3-3β表达和14-3-3γ表达的靶基因的表达的结果。
图7C示出了通过染色质免疫沉淀法(ChIP实验)验证取决于14-3-3β表达和14-3-3γ表达的与FAT/CD3启动子之间的结合的结果。
图7D示出了验证取决于14-3-3β表达和14-3-3γ表达的SREBP-1c蛋白表达的结果。
图8示出了验证取决于油酸处理的与PPARγ2之间的结合的结果，以及验证取决于14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达的PAR-RXR复合物形成与否的结果，其中图8A示出了取决于油酸处理的PPARγ2与14-3-3β之间的结合的结果；图8B示出了取决于油酸处理的PPARγ2与14-3-3γ之间的结合的结果；并且图8C示出了取决于14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达的PPAR-RXR复合物形成与否的结果。
图9示出了验证在原代小鼠肝细胞和HepG2细胞中取决于油酸处理、14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达或者对其表达的抑制的脂肪积累变化的结果，其中图9A示出了验证取决于油酸处理的脂肪积累变化的结果；图9B示出了验证取决于14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达的脂肪积累变化的结果；并且图9C示出了验证取决于对14-3-3β表达和14-3-3γ表达的抑制的脂肪积累变化的结果。
图10示出了验证在原代小鼠肝细胞和HepG2细胞中取决于14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达或者对其表达的抑制的甘油三酯积累变化的结果，其中图10A示出了验证取决于14-3-3β过表达和14-3-3γ过表达的甘油三酯积累变化的结果；并且图10B示出了验证取决于对14-3-3β表达和14-3-3γ表达的抑制的甘油三酯积累变化的结果。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明的要素。
本发明的发明人发现，作为14-3-3蛋白的两种亚型的14-3-3β和14-3-3γ是调控PPARγ2的转录活性的不同的调控因子。14-3-3β通过与PPARγ2结合来提高PPARγ2的转录活性，相反，14-3-3γ起到降低PPARγ2的转录活性的作用。由于PPARγ2在NAFLD中起重要作用，因此通过14-3-3β和14-3-3γ在肝细胞中的过表达来研究14-3-3β和14-3-3γ如何影响脂肪积累。结果是，当14-3-3β过表达时，干预脂质代谢的PPARγ2靶基因的表达增加，脂肪积累得到增强，相反，当14-3-3γ过表达时，PPARγ2的靶基因的表达和脂肪积累受到抑制。也就是说，证实了作为PPARγ2调控因子的14-3-3β和14-3-3γ是在脂质代谢中起重要作用的蛋白质，并且可以用作治疗NAFLD的靶蛋白。
因此，本发明提供了14-3-3β和14-3-3γ用于制备预防或治疗脂肪肝的药物组合物的用途。
更具体地，本发明提供用于预防或治疗脂肪肝的药物组合物，所述组合物包含针对14-3-3β基因的抑制剂；该抑制剂用于制备预防或治疗脂肪肝的药物的用途；以及预防或治疗脂肪肝的方法，其包括给受试者给药该抑制剂。
在本发明中，14-3-3β用作参与脂质代谢的PPARγ2的转录活性进行调控的靶标，14-3-3β被解释为指14-3-3β基因或指14-3-3β蛋白。因此，针对14-3-3β的抑制剂被解释为既包含针对14-3-3β基因的抑制剂，还包含针对14-3-3β蛋白的抑制剂。
14-3-3β蛋白、14-3-3β基因和类似物被解释为包括具有与14-3-3β蛋白、14-3-3β基因或类似物基本上相同的活性的变体或其片段。
在一个实施方式中，针对14-3-3β基因的抑制剂可以是通过抑制该基因的表达来抑制14-3-3β蛋白表达以阻断与PPARγ2进行结合的抑制剂。14-3-3β基因可以是编码14-3-3β的DNA或由其转录的mRNA。因此，针对14-3-3β基因的抑制剂可以是通过与基因自身结合来干扰转录或者通过与转录的mRNA结合来干扰mRNA的翻译的抑制剂。
在一个实施方式中，针对14-3-3β基因的抑制剂可以是针对14-3-3β基因的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或miRNA或者包含其的载体。这种反义寡核苷酸、siRNA、shRNA或miRNA或者这种包含其的载体可以采用本领域中已知的方法来构建。本文中使用时，术语“载体”是指包括被插入到编码多肽的基因组中的外源DNA的基因构建体。与本发明相关的载体是将抑制基因的核酸序列插入到基因组中而得的载体，并且载体可以是例如DNA载体、质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、酵母载体或病毒载体。
在一个实施方式中，针对14-3-3β蛋白的抑制剂可以是通过与14-3-3β蛋白的结合来阻断14-3-3β蛋白与PPARγ2之间的结合的抑制剂。例如，这种抑制剂可以是与14-3-3β蛋白结合的肽或化合物，或类似物。可以通过下文所描述的筛选方法(例如蛋白质结构分析等)来选择这种抑制剂，并且可以使用本领域中已知的方法来设计这种抑制剂。在一个实施方式中，抑制剂可以是针对14-3-3β蛋白的多克隆或单克隆抗体。这种多克隆或单克隆抗体可以使用本领域中已知的抗体生产方法来生产。
当14-3-3γ过表达时，PPARγ2的靶基因的表达和脂肪积累被抑制，因此14-3-3γ基因或14-3-3γ蛋白本身可以被用作用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物的活性成分。
因此，本发明提供用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，其包含14-3-3γ基因。
作为药物组合物的活性成分所包含的基因可以以基因本身的形式或者包含相应基因的载体的形式被包含于药物组合物中。上文中已经提供了载体的定义，并且这种载体的类型和构建方法是本领域中公知的。
本发明还提供用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，其包含14-3-3γ蛋白。
本发明的用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物可以包含天然或重组的14-3-3γ，或者具有与天然或重组的14-3-3γ基本上相同的生物活性的14-3-3γ蛋白。具有基本上相同的生物活性的14-3-3γ蛋白包括天然/重组的14-3-3γ、其功能等同物以及其功能性衍生物。
本文中使用时，术语“功能等同物”是指具有天然蛋白质的氨基酸被部分或完全取代或者部分氨基酸缺失或被添加而得的氨基酸序列的变体，其中该变体具有与天然的14-3-3γ基本上相同的生物活性。
本文中使用时，术语“功能性衍生物”是指被修饰以提高或降低14-3-3γ蛋白质的物理性质或化学性质的蛋白质，其中该蛋白质具有与天然14-3-3γ基本上相同的生物活性。
本发明的14-3-3γ蛋白质的来源不受特别限制，但是14-3-3γ蛋白质可以优选地是来自脊椎动物(优选地人、小鼠、大鼠等)的蛋白质。
根据一个实施方式，可以使用本领域中已知的基因工程方法从已知的序列生产本发明中使用的14-3-3γ。
当通过基因工程方法使用天然的14-3-3γ来生产蛋白质时，使用哺乳动物细胞生产的蛋白质被认为在蛋白质的活性或溶解度方面比使用大肠杆菌(E.coli)或昆虫细胞生产的蛋白质更类似于天然的14-3-3γ。
可以使用一般的柱色谱法或类似方法来分离重组14-3-3γ蛋白。此外，可以通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等来识别蛋白质纯化程度。
除了活性成分外，本发明的药物组合物还可以使用药学上合适的和生物学上可接受的添加剂来制备，并且添加剂可以是增溶剂，如赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、助流剂、增味剂等。
出于给药药物组合物的目的，本发明的药物组合物可以优选地通过除活性成分之外还包含一种或多种药学上可接受的载体来配制。
用于配制成液体溶液的组合物的药学上可接受的载体可以适用于消毒和身体，并且可以是盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或两种或更多种这些成分的混合物。必要时可添加其它的一般添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，可以通过进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，将组合物配制成如水溶液、悬浮液、乳剂等可注射制剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂的形式。此外，组合物可以使用本领域已知的适当方法根据疾病或成分而使用在Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton PA中公开的方法来优选地配制。
本发明的药物组合物的药物制剂形式可以是颗粒剂、粉剂、包衣片剂、片剂、胶囊剂、栓剂、糖浆剂、汁液剂、悬浮剂、乳剂、滴剂、可注射液和活性化合物的缓释型制剂，或类似形式。
本发明的药物组合物可以经由静脉内、动脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、经皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内或皮内途径使用一般方法来给药。
本发明药物组合物的活性成分的有效量指的是达到预防或治疗疾病的效果或诱导骨生长的效果所需的量。因此，有效量可以根据多种因素进行调整，包括：疾病的类型；疾病的严重程度；组合物中包含的活性成分和其他成分的类型和含量；制剂的类型；患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食；给药时间；给药途径；组合物的排泄速率；治疗时期；以及同时使用的药物。例如，在成年人的情况下，本发明的抑制剂可以以0.1ng/kg至10g/kg的化合物的剂量，以0.1ng/kg至10μg/kg的多肽、蛋白质或抗体的剂量，或以0.01ng/kg至10g/kg的反义寡核苷酸、siRNA、shRNAi或miRNA的剂量一天一次或数次地给药。
本文中使用时，术语“受试者”包括人、猩猩、黑猩猩、小鼠、大鼠、狗、牛、鸡、猪、山羊、绵羊等，但是本发明不限于上述示例。
此外，本发明涉及通过从疑似患有非酒精性脂肪肝的患者的样本中测量14-3-3β基因和/或14-3-3γ基因的mRNA水平或蛋白质水平来提供关于非酒精性脂肪肝的发病可能性的信息的方法。
具体而言，本发明提供用于诊断非酒精性脂肪肝的组合物，其包含用于从疑似患有非酒精性脂肪肝的患者的样本中测量14-3-3β基因的mRNA水平或蛋白质水平的探针。
本发明还提供用于诊断非酒精性脂肪肝的组合物，其包含用于从疑似患有非酒精性脂肪肝的患者的样本中测量14-3-3γ基因的mRNA水平或蛋白质水平的探针。
在一个实施方式中，用于测量基因的mRNA水平或蛋白质水平的探针可以是针对mRNA的核酸探针或引物。
核酸探针是指天然或修饰的单体或链(linkages)型线性寡聚物，其包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸且可以与靶核苷酸序列特异性杂交，并且是天然存在的或人工合成的。根据本发明的探针可以是单链形式，优选是寡脱氧核糖核苷酸。本发明的探针可以包括天然dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)或者核苷酸类似物或衍生物。此外，本发明的探针还可以包含核糖核苷酸。例如，本发明的探针可以包含：具有骨架修饰的核苷酸，例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、氨基磷酸酯DNA、酰胺连接的DNA、MMI连接的DNA、2'-O-甲基RNA、α-DNA和甲基膦酸酯DNA；具有糖修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基RNA、2'-氟RNA、2'-氨基RNA、2'-O-烷基DNA、2'-O-烯丙基DNA、2'-O-炔基DNA、己糖DNA、吡喃糖基RNA和脱水己糖醇DNA；具有碱基修饰的核苷酸，例如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟、溴、氯、碘、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、乙炔基、丙炔基、炔基、噻唑基、咪唑基或吡啶基)、具有C-7取代基的7-脱氮嘌呤(取代基包括氟、溴、氯、碘、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、炔基、烯基、噻唑基、咪唑基或吡啶基)、肌苷和二氨基嘌呤。
“引物”是指在合适的条件下(即四种不同的三磷酸核苷和聚合酶)在合适的温度和合适的缓冲液中能够引发模板引导的DNA合成的单链寡核苷酸。引物的适当长度的可以根据各种因素而变化，例如温度和其使用目的。另外，引物的序列不需要与模板的一部分序列完全互补，而只需要在能够通过与模板杂交而使引物发挥其固有功能的范围内充分互补。因此，本发明的引物不需要具有与作为模板的基因的核苷酸序列完全互补的序列，而只需要在能够通过与基因的序列杂交而使引物发挥其功能的范围内充分互补。另外，根据本发明的引物优选用于基因扩增。扩增是指扩增核酸分子的反应，这种基因扩增在本领域中是公知的，包括例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)等等。
在一个实施方式中，用于测量蛋白质水平的探针可以是针对该蛋白质的抗体。
作为抗体，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或其片段。
抗体的片段的示例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体等。
当用木瓜蛋白酶消化抗体时，产生两个相同的抗原结合片段，即分别具有单个抗原结合位点的“Fab”片段和其余部分“Fc”片段。当用胃蛋白酶处理抗体时，产生具有两个抗原结合位点并仍然能够与抗原交联的F(ab')片段。Fv是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成且通过紧密的非共价键结合。
多克隆抗体生产方法在本领域中是已知的。多克隆抗体可以通过将免疫剂注射到哺乳动物中一次或多次，或者当需要时与佐剂组合来产生。通常，通过皮下注射或腹膜内注射将免疫剂和/或佐剂注射到哺乳动物中数次。免疫剂可以是本发明的蛋白质或其融合蛋白质。将免疫剂与已知具有免疫原性的蛋白质一起注射到待免疫的哺乳动物中可能是有效的。
根据本发明的单克隆抗体可以使用文献(Kohler等，Nature，256:495(1975))中描述的杂交瘤方法或使用重组DNA方法(例如参见美国专利号4,816,576)来生产。另外，例如，可以使用文献(Clackson等，Nature，352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991))中所描述的技术从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。
特别地，本发明的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分具有与衍生自特定物种的抗体或属于特异性抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源的序列，而其余的链与衍生自另一物种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体或其片段是相同或同源的，只要它们表现出期望的活性即可。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab'，F(ab')2或抗体的其他抗原结合序列)。在大多数情况下，人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被非人物种(例如具有所需的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR残基(供体抗体)取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被相应的非人残基取代。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体或引入的CDR或框架区序列中未发现的残基。通常，人源化抗体基本上包括一个或更多个、通常两个或更多个可变结构域，并且本文中全部或基本上全部CDR对应于非人免疫球蛋白的区域，并且全部或基本上全部FR对应于人免疫球蛋白序列的区域。另外，人源化抗体包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白区域的一部分。
本发明的用于诊断非酒精性脂肪肝的组合物可以以试剂盒形式包含。
试剂盒可以包含能够测量14-3-3β基因或14-3-3γ基因的表达水平或者其蛋白质的量的引物、探针或抗体，并且其定义与上文中所描述的相同。
当应用于PCR扩增过程时，试剂盒可以任选地包含PCR扩增所需的试剂，例如缓冲液、DNA聚合酶(例如，从水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermis flavus)、海滨热球菌(Thermococcus literalis)或强烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)获得的热稳定的DNA聚合酶)、DNA聚合酶辅助因子和dNTPs。当应用于免疫测定时，本发明的试剂盒可以任选地包含二抗和标记底物。此外，根据本发明的试剂盒可以被构建为分开的多个包含试剂组分的隔室或包装。
此外，本发明的用于诊断非酒精性脂肪肝的组合物可以以微阵列的形式包含。
在本发明的微阵列中，能够测定14-3-3β或14-3-3γ蛋白或编码其的基因的表达水平的引物、探针或抗体被用作可杂交的阵列元件，并且固定在基材上。优选的基材可以包括合适的刚性或半刚性支撑体，例如膜、过滤器、芯片、载玻片、晶片、纤维、磁珠或非磁性珠、凝胶、管、板、聚合物、微粒和毛细管。可杂交的阵列元件被排列并固定在基材上，并且这样的固定可以通过化学结合方法或共价结合方法(例如使用UV)来进行。例如，可杂交的阵列元件可以结合到被修饰以包含环氧化合物或醛基的玻璃表面，或者可以通过UV结合到聚赖氨酸涂覆的表面。另外，可杂交的阵列元件可以通过连接头(例如，乙二醇低聚物和二胺)与基材结合。
同时，当应用于本发明的微阵列的样本是核酸时，核酸可以被标记并且与微阵列上的阵列元件杂交。杂交条件可以改变，杂交程度的检测和分析可以根据标记而采用各种方式进行。
本发明还提供了通过测量14-3-3β基因或14-3-3γ基因的表达水平或其表达蛋白质水平来提供诊断非酒精性脂肪肝所需信息的方法。更具体地，该方法可以包括：(a)从疑似患有非酒精性脂肪肝的患者的生物样本中测量14-3-3β基因或14-3-3γ基因的表达水平或其表达蛋白质的量；以及(b)从正常对照组样本中测量基因的表达水平或其表达蛋白质的量，并将测量结果与方法(a)的结果进行比较。
测量基因的表达水平或其蛋白质的量的方法可以使用已知技术进行，包括从生物样本中分离mRNA或蛋白质的已知方法。
生物样本是指从活体收集的样本，其中根据非酒精性脂肪肝的发生或进展程度，所述样本具有与正常对照组不同的基因表达水平或不同的其蛋白质水平，并且样本可以包括但不限于例如组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿液等。
基因表达水平的测量优选为mRNA水平的测量，测量mRNA水平的方法可以是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时逆转录聚合酶链式反应、RNA酶保护分析、northern印迹、DNA芯片等，但不限于此。
其蛋白质水平的测定可以使用抗体进行，并且在这种情况下，生物样本中的蛋白质及对其具有特异性的抗体形成结合物质，即抗原-抗体复合物，并且可以通过检测标记(detection label)的信号大小来定量测定所形成的抗原-抗体复合物的量。这样的检测标记可以选自酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于上述实施例。用于测量蛋白质水平的分析方法可以是但不限于蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组织染色法、免疫沉淀测定法、补体结合测定法、荧光激活细胞分选法(FACS)、蛋白质芯片等。
因此，在本发明中，通过上文列出的检测方法，可以识别对照组的mRNA的表达量和蛋白质的量以及疑似患有非酒精性脂肪肝的患者的mRNA的表达量和蛋白质的量，并且通过比较患者和对照组的表达量的程度，可以诊断非酒精性脂肪肝的发病与否、进展阶段等等。
另外，根据本发明，通过提供用于诊断非酒精性脂肪肝的信息的方法，当根据本发明的14-3-3β基因的表达水平或其表达蛋白质的量与正常对照组样本相比增加时，可以确定非酒精性脂肪肝被诱发或者发病可能性高。相反，当14-3-3γ基因的表达水平或其表达蛋白质的量与正常对照组样本相比降低时，可以确定非酒精性脂肪肝被诱发或发病可能性高。
本发明还提供筛选用于预防或治疗脂肪肝的药物的方法，其包括：使包含14-3-3β基因或14-3-3γ基因或其蛋白质的细胞在体外与候选材料接触；并且测量候选材料对所述基因或所述蛋白质的表达量引起的变化。
例如，当候选材料下调14-3-3β基因或其蛋白质的表达时，候选材料可以被确定为用于预防或治疗脂肪肝的药物。相反，当候选材料上调14-3-3γ基因或其蛋白质的表达时，候选材料可以被确定为用于预防或治疗脂肪肝的药物。
本发明还提供筛选用于预防或治疗脂肪肝的药物的方法，其包括：使14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白以及PPARγ2蛋白一起与候选材料接触；并且测量候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2的结合引起的变化。
在一个实施方式中，测量候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2的结合引起的变化可以通过测量对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2的Ser273残基之间的结合引起的变化来进行。
根据一般选择方法，候选材料可以是加速或抑制14-3-3β和/或14-3-3γ基因碱基序列转录和翻译成mRNA和蛋白质的物质，或者是推定具有作为增强或抑制14-3-3β和/或14-3-3γ的功能或活性的药物的潜力或者是随机选择的个体核酸、蛋白质、肽、其他提取物或天然物质、化合物等等。
随后，可以在用候选材料处理的细胞中测量基因的表达量、蛋白质的量或蛋白质的活性，并且作为测量的结果，当基因的表达量、或者蛋白质的量或蛋白质的活性提高或降低时，候选材料可以被确定为能够预防或治疗脂肪肝的物质。
基因的表达量、蛋白质的量或蛋白质的活性的测量可以使用本领域中已知的各种方法进行，并且其测量方法的示例包括但不限于逆转录酶-聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应、western印迹、Northern印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散和免疫沉淀测定。
通过本发明的筛选方法获得的抑制/增强14-3-3β基因和/或14-3-3γ基因表达的候选材料或者展现出抑制/增强其蛋白质功能的候选材料可能是用于预防或治疗脂肪肝的药物的候选材料。
这种用于预防或治疗脂肪肝的药物的候选材料在随后的开发治疗剂的过程中起着主导化合物的作用，并且可以对主导化合物的结构进行修饰和优化，以表现出促进或抑制14-3-3β基因和/或14-3-3γ基因或由其表达的蛋白质的功能，因此可以开发新的脂肪肝治疗剂。
在下文中，将参考以下实施例来详细描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并不意图限制本发明的范围。
<实验材料>
从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、培养基199(M199)、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和Opti-MEM。
从Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)购买si-14-3-3β和si-14-3-3γsiRNA、抗PPARγ、抗GFP(绿色荧光蛋白)、抗GST、抗Flag、抗p-Cdk5(Tyr15)、抗Cdk5和抗HA、抗SREBP-1c抗体和Roscovitine，并从Rockland Immunochemicals Inc.(Limerick，PA，USA)购买抗p-PPARγ2(Ser273)抗体。
从Lugen Sci.(Seoul，South Korea)购买E-fection plus试剂。
从Promega Co.(Madison，WI，USA)购买萤光素酶分析系统。
从Sigma(St.Louis，MO，USA)购买吡格列酮和油酸。
从Cayman Chemical(Ann Arbor，MI，USA)购买甘油三酯分析系统。
<实施例1>验证调控PPARγ2的转录活性的14-3-3β和14-3-3γ
PPARγ2的转录活性在肝病相关的蛋白质的表达中起着至关重要的作用。因此，使用由PPARγ2调控的aP2启动子来测量PPARγ2的转录活性，并研究了7种类型的14-3-3蛋白的作用。
为此，将HEK-293T细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在12孔板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行aP2启动子构建体(0.5μg)和14-3-3蛋白亚型(α、β、γ、δ、ε、δ、ε、ζ)(0.5μg)或者si-14-3-3β和si-14-3-3γsiRNA(5nM和10nM，Santa Cruz)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用10μM的吡格列酮(Pio，Santa Cruz)处理24小时，将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，使用80μl/孔的报告基因裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟，以收集上清液，并测量荧光素酶活性。使用Luminometer 20/20n(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)作为仪器。为了标准化，将pSV40-β-半乳糖苷酶共转染至细胞。对于收集的上清液，测量β-半乳糖苷酶的活性并修正荧光素酶活性，并利用所得的数值制图。此时，使用β-半乳糖苷酶分析系统(Promega，Madison，WI)，并使用DU530分光光度计(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)进行分析。
通过测定aP2启动子的活性，确认了14-3-3β提高PPARγ2的转录活性，14-3-3γ降低PPARγ2的转录活性。然而，其他5种亚型没有呈现变化(参见图1A)。
为了准确地验证14-3-3β和14-3-3γ是否干预PPARγ2的转录活性，以不同浓度使14-3-3β和14-3-3γ过表达。通过测量发现，14-3-3β以浓度依赖性方式提高PPARγ2的转录活性(参见图1B)。而14-3-3γ以浓度依赖性方式降低PPARγ2的转录活性(参见图1C)。
相反，当使用si-14-3-3β抑制14-3-3β的表达时，PPARγ2的转录活性降低(参见图1D)，并且当14-3-3γ的表达被抑制时，PPARγ2的转录活性增加(参见图1E)。
因此，根据本实验结果，确定14-3-3β参与提高PPARγ2的转录活性，14-3-3γ参与抑制PPARγ2和14-3-3的转录活性，14-3-3β和14-3-3γ是以相反方式调控的基因。
<实施例2>验证14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的结合
从转录活性实验结果可以看出，14-3-3β和14-3-3γ调控PPARγ2的转录活性，因此推测14-3-3β和14-3-3γ可以与PPARγ2结合。
因此，通过GST-下拉实验来研究14-3-3β和14-3-3γ是否与PPARγ2结合。
为此，将HEK-293T细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行Myc-PPARγ2DNA(4μg)和mGST-14-3-3β(4μg)或mGST-14-3-3γ(4μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用10μM的吡格列酮(Pio，Santa Cruz)处理24小时，将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，使用500μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1％NonidetP-40，5％甘油，25mM tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟，以提取蛋白质。随后，使1000μg的该蛋白质与20μl的谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)反应6个小时，然后将这些珠用1ml的冰冷PBS洗涤5次，将这些珠在100℃下煮沸10分钟，然后进行10％SDS-PAGE凝胶分离和western印迹。GST抗体(Santa Cruz)与Myc抗体(自我生产)的比例是1:3000。使用West Pico ECL(Thermo scientific，Rockford，IL)检测每种蛋白质并在暗室中进行识别。
结果，当用PPARγ2配体吡格列酮进行处理时，PPARγ2和14-3-3β之间的结合变得更强(参见图2A)。与14-3-3β相反，PPARγ2与14-3-3γ之间的结合减少(参见图2B)。从这些结果可以确定，当激活PPARγ2时，PPARγ2与14-3-3β的结合增加，并且其与14-3-3γ的结合降低，因此通过调控这两种蛋白质对PPARγ2转录活性的影响，来调控靶基因的表达。
<实施例3>验证14-3-3β和14-3-3γ结合到PPARγ2的结构域
据报告，PPARγ2蛋白质由激活功能域1(AF-1，氨基酸1-138)、DNA-结合域(DBD，氨基酸139-203)、铰链区(氨基酸204-310)和激活功能域2(AF-2，氨基酸311-505)组成(参见图3A)。因此，进行GST-下拉实验，以验证PPARγ2的哪一结构域部分与14-3-3β和14-3-3γ结合。
将HEK-293T细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行Flag-PPARγ2(1-505)DNA(4μg)、Flag-PPARγ2(1-310)DNA(4μg)、Flag-PPARγ2(139-505)DNA(4μg)和mGST-14-3-3β(4μg)或mGST-14-3-3γ(4μg)的转染。对于Flag-PPARγ2(1-310)DNA和Flag-PPARγ2(139-505)DNA，用限制酶XhoI和ApaI将通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的DNA片段克隆到pCMV-3Tag-1载体中。DNA与E-fectionplus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。将相应的细胞用冰冷PBS洗涤并用500μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％Nonidet P-40，5％甘油，25mMtris-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟以提取蛋白质。随后，使1000μg的蛋白质与20μl的谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)反应6个小时，然后将这些珠用1ml的冰冷PBS洗涤5次，将这些珠在100℃下煮沸10分钟，然后进行10％SDS-PAGE凝胶分离和western印迹。GST抗体(Santa Cruz)与Flag抗体(Santa Cruz)的比例是1:3000。使用West Pico ECL(Thermoscientific，Rockford，IL)检测每种蛋白质，并在暗室中进行识别。
通过验证PPARγ2基因的野生型和两种缺失突变体与14-3-3β或14-3-3γ之间的结合发现，每个14-3-3β(参见图3B)和14-3-3γ(参见图3C)均与PPARγ2缺失突变体(1-310)和PPARγ2缺失突变体(139-505)结合。这些结果表明在14-3-3β或14-3-3γ与PPARγ2的DBD或铰链区之间存在结合。
<实施例4>验证与14-3-3β和14-3-3γ结合的PPARγ2残基
已知14-3-3蛋白与靶蛋白的磷酸化残基结合。已知，与PPARγ2的活性有关的磷酸化残基是丝氨酸112和丝氨酸273。因此，生产具有未磷酸化的丝氨酸112和丝氨酸273的PPARγ2突变体(PPARγ2S112A和S273A)，并通过GST-下拉实验验证其与14-3-3蛋白的结合。
将HEK-293T细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行Flag-PPARγ2(WT)DNA(4μg)、Flag-PPARγ2(S112A)DNA(4μg)、Flag-PPARγ2(S273A)DNA(4μg)和mGST(微粒体谷胱甘肽s-转移酶)-14-3-3β(4μg)或mGST-14-3-3γ(4μg)的转染。对于Flag-PPARγ2(S112A)DNA和Flag-PPARγ2(S273A)DNA，将通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的DNA片段克隆到Flag标记的载体中。DNA与E-fectionplus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。将相应的细胞用冰冷PBS洗涤并用500μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％Nonidet P-40，5％甘油，25mMtris-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟，以提取蛋白质。随后，使1000μg的蛋白质与20μl的谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)反应6个小时，然后将这些珠用1ml的冰冷PBS洗涤5次，将这些珠在100℃下煮沸10分钟，然后进行10％SDS-PAGE凝胶分离和western印迹。GST抗体(Santa Cruz)与Flag抗体(Santa Cruz)的比例是1:3000。使用West Pico ECL(Thermoscientific，Rockford，IL)检测每种蛋白质，并在暗室中进行识别。
此外，将HEK-293T细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在12孔板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行aP2启动子构建体(0.5μg)、Flag-PPARγ2(S112A)DNA(0.5μg)或Flag-PPARγ2(S273A)DNA(0.5μg)和mGST-14-3-3βDNA(0.5μg)或mGST-14-3-3γDNA(0.5μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，使用80μl/孔的报告裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟，以收集上清液，并测定荧光素酶活性。使用Luminometer 20/20n(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)作为仪器。为了标准化，将pSV40-β-半乳糖苷酶共转染至细胞。对于收集的上清液，测量β-半乳糖苷酶的活性并修正荧光素酶活性，并利用所得的数值制图。此时，使用β-半乳糖苷酶分析系统(Promega，Madison，WI)，并使用DU530分光光度计(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)进行分析。
结果是，在PPARγ2S273A突变体中，与14-3-3β的结合和与14-3-3γ的结合均受到抑制(参见图4A和4B)。此外，在PPARγ2S273A突变体的情况下，随着14-3-3β的过表达而提高的PPARγ2的转录活性没有变化(参见图4C)。此外，在PPARγ2S273A突变体的情况下，当14-3-3γ过表达时降低的PPARγ2的转录活性没有变化(参见图4D)。从而，验证了14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的丝氨酸273残基结合，从而调控PPARγ2的转录活性。
<实施例5>验证14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的竞争性结合
从之前的实验结果，验证了14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的磷酸化丝氨酸273残基结合，并且确定这两种蛋白质会竞争性结合同一残基。因此，进行GST-下拉实验来验证14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的竞争性结合。
将HEK-293T细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行mGST-PPARγ2DNA(4μg)、GFP-14-3-3βDNA(4μg)或GFP-14-3-3γDNA(4μg)以及HA-14-3-3βDNA(2和4μg)或HA-14-3-3γDNA(2和4μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用10μM的吡格列酮(Pio，Santa Cruz)处理24小时，将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，且用500μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％Nonidet P-40，5％甘油，25mM tris-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，并且对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟，以提取蛋白质。随后，使1000μg的蛋白质与20μl的谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)反应6个小时，然后将这些珠用1ml的冰冷PBS洗涤5次，将这些珠在100℃下煮沸10分钟，然后在10％SDS-PAGE凝胶上进行分离。通过western印迹使用多种抗体(GST，GFP，HA(血凝素):Santa Cruz)中的每一种对蛋白质进行识别，并且所有抗体均以1:3000的比例使用。
结果，随着14-3-3γ的表达量提高，14-3-3β与PPARγ2之间的结合降低(参见图5A)，并且随着14-3-3β的表达量提高，14-3-3γ与PPARγ2之间的结合降低(参见图5B)。这表明14-3-3β和14-3-3γ竞争性地与PPARγ2的磷酸化丝氨酸273残基结合。
<实施例6>通过油酸提高PPARγ2的表达并由此调节PPARγ2靶基因的表达
已知，在肥胖小鼠的肝脏中，PPARγ2的表达和活性提高，并且其靶基因的表达提高。为了在体外实验中形成这种肥胖环境，通过用油酸(OA)处理，来检查14-3-3β和14-3-3γ以及PPARγ2的mRNA表达量，油酸(OA)是一种脂肪酸。
将HepG2细胞和原代小鼠肝细胞分别以每孔4×105细胞的浓度接种在6孔板中，然后用200μM的油酸(OA)处理72小时。为了进行mRNA提取，将相应的细胞用1ml/孔的TRIzol(Invitrogen)裂解，向其中加入200μl的氯仿并充分混合，将所得到的细胞在室温下保持5分钟，然后在12000×g和4℃下进行离心15分钟，将所得到的上清液与500μl的异丙醇混合，然后置于冰上10分钟，对所得到的上清液在12000×g和4℃下进行离心15分钟，以除去上清液，然后使用经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的三重蒸水使沉淀物溶解。使用SuperscriptFirst Strand cDNA合成试剂盒(Bioneer，Daejeon，South Korea)来由2μg的mRNA合成cDNA，并通过聚合酶链反应(PCR)使用对人的PPARγ2、14-3-3β、14-3-3γ、SREBP-1c、SCD-1、ACC、FABP、FAT/CD36和β-肌动蛋白具有特异性的引物将合成的cDNA作为模板进行扩增，并通过实时PCR使用对小鼠的PPARγ2、14-3-3β、14-3-3γ、SREBP-1c、FAT/CD36和GAPDH具有特异性的引物进行扩增。使用β-肌动蛋白和GAPDH作为对照组，以观察各个细胞的mRNA是否以相同的量进行比较。
PPARγ2的mRNA表达以油酸浓度依赖性方式提高。然而，14-3-3β和14-3-3γ的mRNA表达量没有变化(参见图6A和6B)。此外，作为PPARγ2靶基因的脂质代谢相关基因的mRNA表达也以油酸浓度依赖性的方式提高(参见图6C和6D)。本实验的结果为，油酸提高PPARγ2及其靶基因的表达，并且不影响14-3-3β和14-3-3γ的表达。从结果可以确定，在调控转录活性的方面，14-3-3β和14-3-3γ与激活的PPARγ2的磷酸化残基之间的结合比14-3-3β和14-3-3γ的表达更重要。
<实施例7>14-3-3β和14-3-3γ在油酸对PPARγ2的靶基因表达的调控中起到的作用
将HepG2细胞以每孔4×105个细胞的浓度接种到6孔板中，然后使用E-fectionplus试剂(Lugen)进行GFP-14-3-3βDNA(4μg)或GFP-14-3-3γDNA(4μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，将细胞用200μM的油酸(OA)处理72个小时，并且为了mRNA提取，将相应的细胞用1ml/孔的TRIzol(Invitrogen)裂解，向其中加入200μl的氯仿并充分混合，将所得到的细胞保持在室温下5分钟，然后在12000×g和4℃下进行离心15分钟，将所得到的上清液与500μl的异丙醇混合，然后置于冰上10分钟，并对所得到的上清液在12000×g和4℃下进行离心15分钟，以去除上清液，然后使用经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的三重蒸水使沉淀物溶解。使用SuperscriptFirst Strand cDNA合成试剂盒(Bioneer，Daejeon，South Korea)来由2μg的mRNA合成cDNA，并通过聚合酶链反应(PCR)使用对人的PPARγ2(序列号1和2)、14-3-3β(序列号3和4)、14-3-3γ(序列号5和6)、SREBP-1c、FAT/CD36和β-肌动蛋白具有特异性的引物将合成的cDNA作为模板进行扩增，并通过实时PCR使用对小鼠的PPARγ2、SREBP-1c、FAT/CD36和GAPDH具有特异性的引物进行扩增。使用β-肌动蛋白和GAPDH作为对照组，以观察各个细胞的mRNA是否以相同的量进行比较。
此外，为了染色质免疫沉淀(ChIP)测定，将HepG2细胞以每孔4×106个细胞的浓度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行Flag-PPARγ2DNA(4μg)、mGST-14-3-3βDNA(4μg)或mGST-14-3-3γDNA(4μg)、以及si-14-3-3β(20μM，Santa Cruz)或si-14-3-3γ(20μM，Santa Cruz)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。将相应的细胞用0.75％甲醛在室温下处理15分钟，向其中加入甘氨酸，并将所得到的细胞刮到冰冷PBS中，并在1000×g和4℃下进行离心3分钟，以除去上清液，将沉淀物用400μl的FA裂解缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，2mM EDTApH8.0，1％Triton-X100，0.1％NaDeoxycholate)溶解，然后在如下条件下使用超声波破碎仪在高压下反复破碎两次，每次10分钟：破碎30秒，静置30秒。使用抗Flag抗体(SantaCruz)对DNA-蛋白质复合物进行免疫沉淀，然后通过PCR使用FAT/CD36启动子特异性引物进行扩增。
此外，将HepG2细胞以每孔5×105个细胞的浓度接种在6孔板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行HA-14-3-3βDNA(1μg)或HA-14-3-3γDNA(1μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用200μM的油酸(OA)处理72个小时，将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，并用80μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％Nonidet P-40，5％甘油，25mM tris-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟以提取蛋白质，并且将30μg的蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上进行分离，通过western印迹使用每种抗体(HA，SREBP-1c:Santa Cruz)进行识别，并且所有抗体均以1:3000的比例使用。
通过14-3-3β的过表达，由油酸提高的固醇调控因子结合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸转位酶(FAT)/CD36的mRNA表达被进一步提高。然而，当14-3-3γ过表达时，SREBP-1c和FAT/CD36的mRNA表达降低(参见图7A和7B)。
此外，使用已知为在FAT/CD36启动子中存在的PPARγ2的结合位点的PPAR应答元件(PPRE)通过ChIP试验来评估PPARγ2的结合以及取决于14-3-3β和14-3-3γ的表达的结合强度。结果，PPARγ2与FAT/CD36启动子的结合在14-3-3β的过表达期间增加，并在14-3-3γ的过表达期间被抑制(参见图7C，上侧)。
然而，可以看出，当14-3-3β的表达被抑制时，PPARγ2与14-3-3β之间的结合强度差，并且当14-3-3γ的表达被抑制时，二者之间的结合强度增加(参见图7C，下侧)。
这些结果表明，14-3-3β使得与启动子区域结合以调节CD36基因表达的PPARγ2被提高，而14-3-3γ使其降低。
为了验证对PPARγ2靶基因的mRNA表达的这种调控是否与在其蛋白质的表达中相同，通过western印迹检查SREBP-1c蛋白的表达量。实验结果证实了，SREBP-1c蛋白的表达由于14-3-3β的过表达而提高，并且由于14-3-3γ的过表达而降低(参见图7D)。
因此，从以上实验结果可以确认，脂肪酸的刺激使得PPARγ2的表达和活性提高，并且14-3-3β和14-3-3γ以相反的方式调控所提高的PPARγ2的转录活性。
<实施例8>取决于对PPARγ2的激活的PPARγ2与14-3-3β和14-3-3γ之间的结合
将HEK-293T细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在100mm板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行mGST-PPARγ2DNA(4μg)和HA-14-3-3βDNA(4μg)或HA-14-3-3γDNA(4μg)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用200μM的油酸(OA)处理72个小时，将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，并且用500μl/孔的裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％Nonidet P-40，5％甘油，25mMtris-HCl，pH7.5，加入蛋白酶抑制剂)裂解，对经裂解的细胞在10000×g和4℃下进行离心10分钟以提取蛋白质，使1000μg的蛋白质与20μl的谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)反应6个小时，将这些珠用1ml的冰冷PBS洗涤5次，将所得到的珠在100℃下煮沸10分钟，并将蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上进行分离，并通过western印迹使用每种抗体(GST，HA:Santa Cruz)进行识别，并且所有抗体均以1:3000的比例使用。
当利用油酸处理时，PPARγ2与14-3-3β之间的结合提高(参见图8A)，但是PPARγ2与14-3-3γ之间的结合降低(参见图8B)。根据迄今已知的报道，已知PPAR-RXR复合物在代谢调节和代谢相关的基因表达中发挥重要作用。因此，通过观察14-3-3β和14-3-3γ的过表达是否影响PPAR-RXR复合物的形成，证实其不影响PPAR-RXR复合物的形成(参见图8C)。即，由于油酸而活性增加的PPARγ2与14-3-3β的结合提高并且与14-3-3γ之间的结合降低，并且不干预PPARγ2-RXRα复合物的形成。
<实施例9>14-3-3β和14-3-3γ在由油酸处理引起的油酸肝细胞脂质积累中起到的作用
将HepG2细胞和原代小鼠肝细胞分别以每孔4×105个细胞的浓度接种在6孔板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行GFP-14-3-3βDNA(1μg)或GFP-14-3-3γDNA(1μg)以及si-14-3-3β(10μM，Santa Cruz)或si-14-3-3γ(10μM，Santa Cruz)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，用200μM的油酸(OA)处理72个小时，用冰冷PBS洗涤，并用4％多聚甲醛将相应的细胞固定，然后用0.35％Oil Red-O溶液在室温下染色6个小时。将经染色的细胞用1ml的异丙醇清洗，并使用DU530分光光度计(Beckman Instruments，Palo Alto，CA)以550nm波长进行分析。
由于油酸的浓度依赖性处理，脂质积累在原代小鼠肝细胞和HepG2细胞中提高(参见图9A)。14-3-3β的过表达提高由油酸引起的脂质积累，并且14-3-3γ的过表达降低脂质积累(参见图9B)。此外，当14-3-3β的表达经由si-14-3-3β受到抑制时，脂质积累降低，并且当14-3-3γ表达受到抑制时，脂质积累提高(参见图9C)。
这些实验结果表明，已经由油酸提高的PPARγ2的活性被14-3-3β进一步提高，导致脂质积累提高，并且14-3-3γ降低PPARγ2的活性，导致脂质积累降低。
<实施例10>14-3-3β和14-3-3γ在甘油三酯积累中起到的作用
甘油三酯(中性脂肪)是一种脂肪酸，并用作脂肪含量的指标。通过测量甘油三酯的量进行生物化学脂质测试。
将HepG2细胞和原代小鼠肝细胞分别以每孔4×105个细胞的密度接种在6孔板中，然后使用E-fection plus试剂(Lugen)进行GFP-14-3-3βDNA(1μg)或GFP-14-3-3γDNA(1μg)以及si-14-3-3β(10μM，Santa Cruz)或si-14-3-3γ(10μM，Santa Cruz)的转染。DNA与E-fection plus试剂的比例是1:2，并且根据制造商的使用说明进行此方法。转染后，将细胞用200μM的油酸(OA)处理72个小时，使用甘油三酸酯比色试验试剂盒(Cayman Chemical)测定甘油三酯的量。将相应的细胞用冰冷PBS洗涤，然后使用标准的稀释试验试剂刮擦，使用超声波破碎仪重复破碎过程20次，以破碎细胞，并且经破碎的细胞与酶缓冲溶液反应15分钟，随后使用ELISA读取器(Bio-Rad Laboratories，Inc)在550nm波长处进行测量。
与脂质积累结果一样，当用油酸处理原代小鼠肝细胞时甘油三酯积累提高，由于14-3-3β的过表达，甘油三酯积累被进一步提高，并且14-3-3γ的过表达降低甘油三酯积累(参见图10A)。此外，抑制14-3-3β表达会降低甘油三酯积累，并且抑制14-3-3γ表达会提高甘油三酯积累(参见图10B)。
综合考虑上述结果，可以确定14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的同一残基结合，并以相反的方式调节PPARγ2的活性，并竞争性地对其进行调控。在基础条件下，维持基础代谢，此时14-3-3β和14-3-3γ与PPARγ2的S273残基的结合处于平衡，并且在高度浓缩的脂肪酸条件下，14-3-3β与PPARγ2的S273残基的结合提高，导致脂质积累提高，因此预期发展为非酒精性脂肪肝。因此，预计能够通过调控14-3-3β和14-3-3γ的表达量以调控PPARγ2的活性来预防或治疗非酒精性脂肪肝。
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
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tgcatgtgct ccttgctgat 20

Claims (3)

1.一种筛选用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物的方法，所述方法包括：
使14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白以及PPARγ2蛋白一起与候选材料接触；以及
测量所述候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2蛋白的结合引起的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2蛋白的结合引起的变化包括测量对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2的Ser273残基的结合引起的变化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中作为测量所述候选材料对14-3-3β蛋白和/或14-3-3γ蛋白与PPARγ2蛋白的结合引起的变化的结果，当所述候选材料降低14-3-3β蛋白与PPARγ2蛋白的结合或者提高14-3-3γ蛋白与PPARγ2蛋白的结合时，所述候选材料被确定为用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物。
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