KR101863710B1 - 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 진단방법 - Google Patents

비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물, 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트, 비알코올성 지방간 질환 진단을 위한 정보제공방법, 비알코올성 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 및 진단방법{Composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease and a method for diagnosing non-alcoholic fatty liver using the same}
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
지방간은 간 내 지방침착으로 인한 무게가 간 내 무게의 5% 이상으로 이루어진 경우로 정의된다. 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic disease)은 그 중 지방간의 원인이 알코올에 기인되지 않은 경우를 말하며 간 내 단순 지방침착(simple steatosis)부터 지방간염, 간경변에 이르는 일련의 과정을 모두 포함하는 용어이다.
세계적으로 비알코올성 지방간 질환의 유병률은 다양하게 보고되고 있는데 서구에서는 특별한 간질환의 원인이 없는 정상 성인의 20~30% 정도에서 비알코올성 지방간 질환이 있는 것으로 알려지고 있다. 우리나라에서의 역학연구결과는 그리 많지 않은 편으로 연구자에 따라 다양한 결과를 보고하였는데 우리나라 성인에서의 비알코올성 지방간 질환의 유병률은 약 16~50%로 보고하였다. 일반적으로 비알코올성 지방간 질환은 비만인 경우에 더 유병률이 증가하는 것으로 알려져 있는데, 이는 비만으로 인한 인슐린저항성이 간 내 지방침착을 일으키는 중요한 원인으로 지목되는 이유 중 하나가 된다.
비알코올성 지방간 질환의 원인으로는 인슐린저항성으로 인한 간 내 지방침착, 과도한 영양섭취, 유전적 원인 등이 지목되고 있다. 인슐린저항성은 대사증후군의 원인으로 여겨지는데 실제도 대사증후군이나 제2형 당뇨병 환자에서 비알코올성 지방간 질환의 유병률이 상대적으로 높게 나타나고 인슐린저항성은 비알코올성 지방간 질환질환 환자의 대부분에서 관찰된다.
한편, 생물체에서 일어나는 수많은 신진대사는 유비퀴틴화(Ubiquitination)와 탈유비퀴틴화(deubiquitination)에 의해 조절된다. 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub)은 76개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 모든 진핵 세포에 존재하여 단백질의 선택적인 분해 및 세포 분열의 조절 등 수많은 세포 내의 기능에 관여한다. 유비퀴틴화란, 유비퀴틴 활성화 효소(E1), 유비퀴틴 결합 효소(E2) 및 유비퀴틴 접합 효소(E3)에 의해 유비퀴틴과 기질 단백질의 공유 결합이 순차적으로 일어나는 것이다. 유비퀴틴화에 의한 기질 단백질 변형은 단백질의 인산화/탈인산화에 의한 변형에서와 같이 가역적으로 일어날 수 있는데, 기질 단백질로부터 유비퀴틴을 제거하는 것을 탈유비퀴틴화라고 하며, 이 반응을 활성화시키는 효소 군을 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinase, DUB)라 한다.
사람에는 약 100개의 탈유비퀴틴화 효소가 존재하는 것으로 보고되고 있는데, 탈유비퀴틴화 효소는 크게 UCH(Ub C-terminal hydrolase), USP(Ub-specific processing protease), Otubain(OTU-domain Ub-aldehyde-binding protein), MJD(Machado-Joseph disease) 및 JAMM(Jab1/Pad1/MPN domain metallo-enzyme) family의 5개 그룹으로 나눌 수 있으며, 이 중 USP가 가장 큰 그룹을 형성한다. USP의 경우, 주로 350개의 아미노산으로 구성된 활성-도메인을 가지고 있으며 단백질 분해 효소(Cysteine protease)들이다. 이들 USP 활성 도메인의 아미노산 보전 정도는 전반적으로 그리 높지 않은 편이지만, 활성 시스테인(Cysteine)과 히스티딘(Histidine) 잔기를 둘러싼 부위, 즉 시스테인 박스(Cysteine box)＆ 히스티딘 박스(Histidine box) 는 잘 보존되어있다. USP의 경우 이런 활성-도메인 외에 아직 그 기능이 밝혀지지 않은 도메인들을 다수 포함하고 있는데, 아마도 기질 인식, 세포 내 위치조절 및 단백질-단백질 상호작용 등에 관여하는 것으로 여겨진다.
대한민국 등록특허 제10-0794706호에서는 지방 전구세포를 인슐린으로 처리하였을 때 특정한 탈유비퀴틴화 효소를 코딩하는 유전자의 발현량이 유의성 있게 감소하므로, 상기 유전자의 발현량을 측정함으로써, 비만 또는 당뇨병을 진단할 수 있다는 사실을 밝힌 바 있다.
그러나, 고지방 식이를 섭취시킨 마우스의 간조직에서 탈유비퀴틴화 효소 USP15를 코딩하는 유전자의 발현량과 비알코올성 지방간 질환의 상호연관성에 대해 보고된 연구는 지금껏 없었다.
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 상기 USP15 유전자의 발현 수준 측정을 통하여, 비알코올성 지방간 질환의 진단 및 치료물질의 스크리닝 등이 가능하여, 상기 USP15 유전자의 발현을 억제하거나 USP15 유전자에 대한 길항제를 이용하여 비알코올성 지방간 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 마우스 조직별 USP15 mRNA 발현 정도를 확인한 것이다.
도 2는 (a) 정상식이를 섭취한 마우스 및 고지방식이를 섭취한 마우스 간 조직에서의 USP 발현 양상 및 (b) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 3은 정상 환자와 비교하여 (a) 건강한 비만자 및 (b) 비알코올성 지방간 환자의 USP15 발현량을 비교한 것이다.
도 4는 간암 세포주에 올레산 처리한 후, USP15 발현량을 확인한 것이다.
도 5는 간 세포주에 올레산 처리한 후, (a) 지방축적량 (b) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 6은 USP15 과발현된 간암 세포주에 올레산을 처리한 후, (a) 지방축적량 (b) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 7은 USP15의 발현이 억제된 간암 세포주에 올레산을 처리한 후, (a) 지방축적량 (b) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 8는 USP15의 발현이 억제된 간 세포주에 올레산을 처리한 후, (a) 지방축적량 (b) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 9는 mouse HA-USP15이 과발현된 간 세포주 및 mouse HA-L749R이 과발현된 간 세포주에 올레산을 처리한 후, 지방축적량을 확인한 것이다.
도 10은 (a) USP15 과발현 정도에 따른 FABP4 (b) PPARγ의 발현 양상 및 (c) USP15와 FABP4 및 PPARγ 단백질 간의 상호결합 여부를 확인한 것이다.
본 발명자들은 고지방 식이를 섭취시킨 마우스의 간조직에서 탈유비퀴틴화 효소 USP15를 코딩하는 유전자의 발현량과 비알코올성 지방간 질환의 상호연관성에 대해 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 "USP15"는 탈유비퀴틴화 효소인 USP(ubiquitin specific protease) 패밀리 중의 하나인 단백질로 상기 USP 패밀리 단백질들이 가지고 있는 시스테인(Cys)과 히스티딘(His) 박스를 가지고 있으며, 모든 조직에 고루 분포하고 있어 세포 내의 다양한 기질의 탈유비퀴틴화를 유도함으로써, 세포 내 기능을 조절한다. 본 발명의 일실시예에서는 USP15를 과발현하는 간암 세포를 형질주입(transfection) 시킨 후, 올레산을 처리하여 세포 내 지방축적량 및 비알코올성 지방간에 관여하는 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, UPS15 유전자가 과발현된 경우, 지방축적량이 증가하였고, 상기 USP15 유전자의 발현이 증가함으로써, 비알코올성 지방간에 관여하는 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), FABP4(Fatty acid binding protein 4) 또는 Perilipin mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 USP15 유전자는 비알코올성 지방간에서 양성조절(positive regulation) 인자임을 알 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 항체일 수 있다. 이때, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 조성물은 USP15 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 비알코올성 지방간 질환을 진단할 수 있고, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
비알코올성 지방간 질환 진단용 키트
본 발명은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트를 제공한다. USP15 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, USP15 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서 상기 USP15 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
비알코올성 지방간 질환의 진단을 위한 정보제공방법
본 발명은 (a) 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 USP15 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
먼저, 본 발명에 따른 정보제공방법은 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계[(a) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 진단하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 통하여 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence)인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 생물학적 시료는 간 유래 조직, 세포, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 정보제공방법은 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계[(b) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료의 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계는 상기 시료 내 USP15 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군에 비해 높은 것을 확인하는 단계이다.
이후, 본 발명에 따른 정보제공방법은 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 mRNA 또는 단백질 발현 수준보다 높은 경우, 비알코올성 지방간 질환으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 정상 대조군에서의 USP15 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비알코올성 지방간 질환 의심 환자에서의 USP15 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 비교함으로써, 비알코올성 지방간 질환의 실제 환자 여부를 진단할 수 있고, 나아가서는 비알코올성 지방간 질환의 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 정보제공방법에 의하면, 비알코올성 지방간 질환을 정확하게 진달할 수 있고, 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있는바, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점이 있다.
비알코올성 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법
본 발명은 (a) 비알코올성 지방간 질환 환자의 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 시료에 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 낮은 경우, 상기 후보물질을 비알코올성 지방간 질환의 치료용 물질로 판단하는 단계;를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 USP15 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
먼저, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 비알코올성 지방간 질환 환자의 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계[(a) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 비알코올성 지방간 질환 치료제로서 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 펩타이드, 단백질, 항체, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있으며, USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현을 저해하는 화합물인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 상기 시료에 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계[(b) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 비알코올성 지방간 질환의 치료 또는 예방의 후보물질을 간 세포 또는 조직 또는 기타 생물학적 시료에 처리하여, USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준 및 USP15 발현 관련 신호전달 단백질의 발현 및 인산화 수준을 측정함으로써, 비알코올성 지방간 질환 치료 또는 예방 물질을 선별할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 낮은 경우, 상기 후보물질을 비알코올성 지방간 질환의 치료용 물질로 판단하는 단계[(c) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 후보물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여, USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 및 USP15 발현 관련 신호전달 단백질의 발현 및 인산화를 저해하는 물질을 비알코올성 지방간 질환 치료 또는 예방 물질로서 결정하며, 상기 물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물, 또는 상기 언급된 후보물질로서, 단백질-핵산, 펩타이드, 항체, 기타 추출물 또는 천연물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 USP15 유전자의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 물질은 USP15 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA일 수 있으며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 이때, 상기 siRNA는 서열번호 3 및 4로 표시되는 siRNA 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 siRNA일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다. 또한 상기 항체는 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 따른 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질로는 서열번호 3 및 4로 표시되는 siRNA 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 siRNA일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), FABP4(Fatty acid binding protein 4) 또는 Perilipin의 mRNA 발현을 억제할 수 있다. 구체적으로, "PPAR(peroxisome proliferator activated receptor)"은 주로 지방대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(adipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는데, 퍼옥시좀(peroxisome)의 수를 증가시킬 수 있는 화합물인 퍼옥시좀 증식제(peroxisome proliferator)를 리간드로 하는 핵 내 수용체를 말하며, PPARα, PPARδ, PPARγ의 동형체(isoform)가 알려져 있다. 상기 PPAR 동형체 중, PPARγ는 지방세포, 면역세포, 부신(adrenal gland), 비장(spleen) 및 소장에서 주로 발현되며, 지방산에 의해 활성화되는 전사인자로 지방세포 분화와 기능에서 중요한 조절인자이다. "FABP4(Fatty acid binding protein 4)"는 지방산, 에이코사노이드 및 레티노이드와 같은 다른 친지성 물질의 운반 단백질로서, 세포내막(intercellular membrane)과 세포외막(extracellular membrane) 간의 지방산 운반에 관여한다. "Perilipin"은 PPARγ의 수준 유전자로, 세포 내 트리글리세라이드 지질 방울의 표면을 감싸고, 트리글리세라이드 지질 방울에 리파아제의 접근을 제한하여 지방분해를 조절한다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 유효성분으로 사용되는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 항체 이외에, 비알코올성 지방간 질환 치료 활성을 나타내는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), FABP4(Fatty acid binding protein 4) 또는 Perilipin의 mRNA 발현을 억제함으로써, 간 내 지방 축적 억제 활성이 뛰어난바, 비알코올성 지방간 질환에 대한 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 준비예 ]
5주령 수컷 마우스(C57B6/N)를 오리엔트 바이오에서 구입하여 고형사료로 1주일 간 적응기간을 거쳤다. 실험동물은 2개 군으로 분류하여 군별로 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 사육 기간 동안 사료와 물을 자유로이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22 ± 1℃, 습도는 60 ± 5%로 유지하고 매일 광주기와 암주기가 12시간이 되도록 조절하였다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 마우스 조직별 USP15의 기저 발현 정도 확인
준비예의 마우스에 정상식이를 8주 동안 공급한 후, 희생(sacrifice)시켰다. 그 후, 상기 마우스로부터 얻은 여러 장기조직을 TRIzolTM 시약을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 DEPC가 처리된 물로 녹였으며 UV 260nm에서 그 농도를 측정하였다. 이로부터 얻은 RNA를 SuperscriptTM I (Invitrogen社, 미국)를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 최초 cDNA를 합성하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대사관련 장기인 Liver, BAT, gWAT, iWAT에서 USP15 발현이 다른 장기에 비하여 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 고지방 식이를 섭취한 마우스 간 조직에서의 USP15 발현 확인
준비예의 마우스에 지방이 60% 포함된 고지방식이 사료를 8주 동안 공급한 후, 희생(sacrifice)시켰다. 그 후, 상기 마우스로부터 얻은 간 조직을 RIPA buffer (Biosaesang 社)를 이용하여 단백질을 분리하고, OD 660nm 값에서 정량 하였다.
정량된 단백질을 RIPA buffer, 및 5X SDS와 섞은 후 100℃에서 5분 동안 끓여서 샘플을 제작하였다. 제작된 샘플은 SDS PAGE 후 웨스턴 블럿을 통해서 1차 항체(B-actin, USP15, USP1, USP10, USP11, FABP4, PPARg, Perilipin) 및 2차 항체 (mouse, rabbit 2ND)를 붙인 후, 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 고지방식이(60% High fat diet)를 시킨 C57B6/N 마우스의 간 조직에서의 USP15 발현이 정상식이(Normal fat diet, Normal chow diet)를 시킨 경우에 비해 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 FABP4, Perilipin과 같이 지방산이 간세포 및 간조직으로 유입 시 증가하는 인자들의 발현이 정상식이를 시킨 마우스에 비하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 비만으로 인해 비알콜성 지방간이 될 경우, 간조직에서의 USP15 발현이 증가한다고 볼 수 있다.
실시예 3. 건강한 비만자 및 비알코올성 지방간 임상 환자 간 조직에서의 USP15 발현 확인
데이터는 오픈 소스인 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ 의 임상 환자 Micro array data 결과를 분석 및 prism 프로그램을 이용한 통계처리를 통하여 얻었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 정상환자에 비해서 건강한 비만과 지방간을 지닌 환자에서 USP15의 발현이 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 간암 및 간 세포주에 올레산 처리 및 RNA 분리
4-1) 간암 세포주
사람의 간암세포인 HepG2 세포주를 MEM 배지에 10% FBS 및 1% antibiotics을 첨가하여, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 이후, 0, 100, 200 μM의 올레산을 배양 배지에 첨가한 배양액으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 구체적으로, 상기 HepG2 세포를 6 웰 플레이트에 분주한 후, 올레산을 처리하였다. 이후, 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 후 10% 포르말린 2㎖을 첨가하여 10분 동안 실온에서 방치하였다. 이후, 멸균된 증류수로 세척하였다. 세포 염색을 위하여, Oil Red O 가루를 Isopropanol에 녹여 수용액을 만들었다. 상기 ORO 수용액을 포르말린으로 고정된 AML12 세포에 첨가한 후 약 2시간 정도 실온에 방치하여 염색시키고 완벽히 건조하였다. 이후, 염색된 6 웰 플레이트에 100% Isopropanol을 첨가하여 녹이고, OD 500 값에서 그 수치를 측정한 후 excel을 이용해서 데이터화 하였다.
올레산을 처리한 간암 세포주와 올레산을 처리하지 않은 간암 세포주의 총 세포내 RNA는 TRIzolTM 시약(Invitrogen社, 미국)을 이용하여 분리하였다. 분리된 RNA는 DEPC가 처리된 물로 녹였으며, UV 260nm에서 그 농도를 측정하였다. 1000ng의 RNA를 SuperscriptTM I (Invitrogen社, 미국)를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 최초 cDNA를 합성하였다. 이러한 cDNA를 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 주형가닥으로 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 지방산의 일종인 올레산을 처리함으로써, 세포 내 지방축적량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비알코올성 지방간 관여 인자인 PPARγ, FABP4, 및 perilipin의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 비알코올성 지방간으로 인해 간 세포 내에 지방축적량이 증가할수록 USP15의 발현이 증가할 수 있다.
4-2) 간 세포주
마우스 간세포인 AML12를 사용하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 지방산의 일종인 올레산을 처리함으로써, 세포 내 지방축적량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 비알코올성 지방간 관여 인자인 PPARγ, FABP4, 및 perilipin의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 비알코올성 지방간으로 인해 간 세포 내에 지방축적량이 증가할수록 USP15의 발현이 증가할 수 있다.
실시예 5. USP15 과발현에 따른 지방축적량 및 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상 확인
5-1) 지방축적량 확인
HepG2 세포에 Flag-USP15 발현 벡터를 형질주입시킨 후, 올레산을 각각 0, 100 및 200μM 처리하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 세포 내 지방축적량을 확인하였다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, USP15가 발현되지 않은 대조군과 비교하여, USP15가 과발현된 세포에서 지방축적량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP15는 비알코올성 지방간에서 양성조절(positive regulation) 인자임을 알 수 있다.
5-2) 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상 확인
실시예 5-1의 간암 세포주의 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 실시하였다. 구체적으로, 조직과 세포에서 비알콜성 지방간 관여인자는 바이오세상으로부터 구입한 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리 한 후 OD 660nm에서 정량하였다. 정량된 단백질을 RIPA buffer, 그리고 5X SDS 와 섞은 후 100℃에서 5분 동안 가열하여 샘플을 제작하였다. 제작된 샘플은 SDS PAGE 후 웨스턴 블럿을 통해서 1차항체(FABP4, PPARg, Perilipin)와 2차항체 (mouse, rabbit 2ND 항체)를 이용하여 단백질 발현을 확인 하였다.
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, USP15의 발현이 증가하는 것과 유사하게 비알코올성 지방간에 관여하는 PPARγ, FABP4, perilipin 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP15는 비알코올성 지방간에 관여하는 인자들 중 일부를 조절할 수 있다.
실시예 6. USP15 유전자에 특이적인 프라이머 세트 제작 및 역전사 중합효소 연쇄반응
6-1) 프라이머 세트 제작
모든 탈유비퀴틴화 효소의 유전자들은 길이에 상관없이 UCH라고 하는 부위를 공통적으로 가지고 있어, 해당 부위를 제외하고 USP15 유전자에 특이적인 부위에서 PCR 생성물 길이가 약 230bp 이하가 되도록 프라이머 세트를 제작하였으며, 하기 표 1에 나타냈다.
서열번호 1 서열번호 2
USP15 F_5'-cccaggtgcatccaattt-3' R_5'-ttgctcaaacactgaatggct-3'
6-2) 역전사 중합효소 연쇄반응
실시예 4에 따라 분리된 mRNA 및 실시예 6-1)에서 제작한 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응 조건은 핫 스타트를 위해 94℃에서 5분간 진행하였고 이후 94℃에서 15초, 58℃에서 15초, 72℃에서 25초로 30 사이클을 진행하였다. 이후, 72℃에서 7분간 연장과정을 거쳤다. 증폭된 중합효소 연쇄반응 생성물은 0.8% 아가로즈 젤에서 분리하였고, 에티디움 브라마이드(ethidium bromide)로 염색하였다.
실시예 7. USP15 siRNA에 의한 단백질의 발현 억제
7-1) 간암 세포주
USP15의 siRNA를 제작한 후, 간암세포주인 HepG2 세포에 주입하여 siRNA에 의한 단백질 발현 억제 효과를 확인하였다.
간암세포주인 HepG2 세포를 6 웰 플레이트에 8ⅹ104 cell의 수로 심고 하루 동안 배양한 후, 하기 표 2의 siRNA와 이에 대한 대조군 siRNA USP15를 viafwct시약을 이용하여 형질감염(transfection)하였다. 형질감염 후 1일 후에, 웨스턴블랏팅을 통하여 USP15의 발현 억제를 확인하였다.
서열번호 3 서열번호 4
siUSP15 F_5'CAGACUGUGGAACAAGUAUAUCUC 3' R_5'CAGACUGUGGAACAAGUAUAUCUC 3'
7-2) 간 세포주
마우스 간세포주인 AML12 세포에 대하여 하기 표 3의 siRNA를 사용하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
서열번호 5 서열번호 6
siUSP15 F_5'CCCGUCAUAUACUGCUUAUAACUC 3' R_5'GAGUUAUAAGCAGUAUAUGACGGG 3'
실시예 8. USP15 발현 억제에 따른 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상 확인
8-1) 간암 세포주
실시예 7-1의 간암 세포에서 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상을 실시예 4-2와 동일한 방법으로 세포 염색을 실시하고, 실시예 5-2와 동일한 방법으로 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 지방방울(lipid droplet)의 염색 정도가 대조군과 비교하여 감소한 것을 확인할 수 있었고, 세포 내 지방 축적량 또한 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, USP15의 발현이 감소하는 것과 유사하게 비알코올성 지방간 관여 인자인 FABP4, perilipin 및 PPARγ의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP15는 비알코올성 지방간에 관여하는 인자들 중 일부를 조절할 수 있다.
8-2) 간 세포주
실시예 7-1의 간 세포주를 사용하였다는 점을 제외하고 상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 8a에 나타난 바와 같이, 지방방울(lipid droplet)의 염색 정도가 대조군과 비교하여 감소한 것을 확인할 수 있었고, 세포 내 지방 축적량 또한 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8b에 나타난 바와 같이, USP15의 발현이 감소하는 것과 유사하게 비알코올성 지방간 관여 인자인 FABP4, perilipin 및 PPARγ의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, USP15는 비알코올성 지방간에 관여하는 인자들 중 일부를 조절할 수 있다.
실시예 9. USP15 과발현에 따른 지방축적량 확인
AML12 세포에 mouse HA-USP15 발현 벡터를 형질전환시킨 후, 올레산을 각각 200, 400 및 600μM 처리하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 세포 내 지방축적량을 확인하였다. 양성대조군으로는 mutant vector인 mouse HA-L749R 발현 벡터를 사용하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 음성대조군 세포와 비교하여 mouse HA-USP15 발현 벡터를 형질전환시킨 세포에서 지방축적량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 양성대조군 세포의 경우, 음성대조군 세포와 지방축적량이 유사한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 비알콜성 지방간에서 USP15가 양성 조절(positive regulation) 인자임을 재 확인할 수 있다.
실시예 10. USP15 과발현에 따른 비알코올성 지방간 관여 인자의 발현 양상 확인 및 단백질간 상호결합
10-1) FABP4 발현 양상 확인
USP15의 과발현 정도에 따른 FABP4의 발현변화를 확인하기 위해서 HEK293(Human embryonic kidney 293) 세포에 HA-FABP4 발현 벡터는 2㎍으로 동일하게, Flag-USP15 발현벡터는 각각 0.5, 1, 2㎍을 형질전환시켰다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에서 USP15의 과발현 되는 정도가 증가할 수록 FABP4의 발현되는 정도가 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, USP15와 FABP4 발현에 상호연관성이 있음을 알 수 있다.
10-2) PPARγ 발현 양상 확인
HA-PPARγ 발현 벡터를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 10-1)과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 10b에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에서 USP15의 과발현 되는 정도가 증가할 수록 PPARγ의 발현되는 정도가 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, USP15와 FABP4 발현에 상호연관성이 있음을 알 수 있다.
10-3) USP15 및 비알코올성 지방간 관여 인자 단백질 간의 상호결합
상기 실시예 10-1 및 10-2에서 형질전환된 HEK293 세포에 대하여 면역침강(Immunoprecipitation) 실험을 실시하였다.
그 결과, 도 10c에 나타난 바와 같이, FABP4 및 PPARγ 이 각각 USP15 단백질과 상호 결합을 한다는 것을 생화학 분자생물학적인 방법을 통해 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation. Yonsei University <120> Composition for diagnosing non-alcoholic fatty liver disease and a method for diagnosing non-alcoholic fatty liver using the same <130> 1062282 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of USP15 <400> 1 cccaggtgca tccaattt 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of USP15 <400> 2 ttgctcaaac actgaatggc t 21 <210> 3 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of siUSP15(HepG2) <400> 3 cagacugugg aacaaguaua ucuc 24 <210> 4 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of siUSP15(HepG2) <400> 4 cagacugugg aacaaguaua ucuc 24 <210> 5 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of siUSP15(AML12) <400> 5 cccgucauau acugcuuaua acuc 24 <210> 6 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of siUSP15(AML12) <400> 6 gaguuauaag caguauauga cggg 24

Claims (12)

  1. USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 항체인 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환 진단용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비알코올성 지방간 질환 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, RP-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 정량적 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환 진단용 키트.
  6. (a) 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서,
    (c) 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 mRNA 또는 단백질 발현 수준보다 높은 경우, 비알코올성 지방간 질환으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는
    비알코올성 지방간 질환의 진단을 위한 정보제공방법.
  8. (a) 비알코올성 지방간 질환 환자의 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 시료에 USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 낮은 경우, 상기 후보물질을 비알코올성 지방간 질환의 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 비알코올성 지방간 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  9. USP15 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 물질은 USP15 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 물질은 USP15 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), FABP4(Fatty acid binding protein 4) 또는 Perilipin의 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는
    비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020189970A1 (ko) * 2019-03-15 2020-09-24 한국생명공학연구원 Tcf7l2를 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20210061742A (ko) * 2019-11-20 2021-05-28 숙명여자대학교산학협력단 만성간질환의 예후 예측용 바이오마커 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150137473A (ko) * 2014-05-29 2015-12-09 한국과학기술연구원 USP15의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
US20170072071A1 (en) * 2012-05-28 2017-03-16 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Inflammation-enabling polypeptides and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170072071A1 (en) * 2012-05-28 2017-03-16 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Inflammation-enabling polypeptides and uses thereof
KR20150137473A (ko) * 2014-05-29 2015-12-09 한국과학기술연구원 USP15의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
International Journal of Molecular Sciences, 18:483 (2017.02.24.) *
Journal of Virology, 84(10):5404-5414 (2010) *
Scientific Reports, 7:42800 (2017.02.20.) *
Toxicological Sciences, 82:318-332 (2004) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020189970A1 (ko) * 2019-03-15 2020-09-24 한국생명공학연구원 Tcf7l2를 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20210061742A (ko) * 2019-11-20 2021-05-28 숙명여자대학교산학협력단 만성간질환의 예후 예측용 바이오마커 조성물
KR102341336B1 (ko) 2019-11-20 2021-12-21 숙명여자대학교산학협력단 만성간질환의 예후 예측용 바이오마커 조성물

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