KR101883936B1 - 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 - Google Patents

림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 이용한 위암 초기에서 림프절 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법{Marker for predicting lymph node metastasis and method for predicting lymph node metastasis using the same}
APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 초기 위암에서의 림프절 전이 예측용 조성물 및 키트, 이를 이용한 초기 위암에서의 림프절 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다.
위암은 전 세계에서 다섯 번째로 흔한 암인 동시에 암으로 인한 사망률로는 두 번째 주요 원인이다 (Int J Cancer 2015; 136: E359-386). 국소 림프절전이는 위암에서 가장 중요한 예후 인자 중 하나로 알려져 있고, 림프절 절제 범위 또한 위암의 치료에 있어 매우 중요하다 (J Clin Oncol 2012; 30: 3834-3840, Ann Surg 2012; 255: 50-58, Br J Surg 1995; 82: 346-351). 최근에 본 연구팀의 후향적 임상 연구에서는 점막 위암에서도 림프절전이 치료가 중요함을 재평가한 바 있다 (Oh SY et al., Ann Surg 2016).
한편, 보통 TNM 병기(TNM staging system)에서 종양 침습 깊이가 깊을수록 국소 림프절 전이가 자주 나타난다 (Edge S et al., New York, NY: Springer 2009). 그러나 드물게는 T 병기와 N 병기가 상반되는 (T 병기가 높고 림프절전이가 없는 경우 또는 T 병기가 낮지만 림프절전이가 높은 경우) 위암이 발생하기도 하며 이러한 경우 림프절전이에 대한 독립적인 바이오마커를 찾는데 좋은 타겟이 될 수 있다. 본 연구팀의 이전 연구에서는 DNA 마이크로어레이 (DNA microarray) 기법을 통해 이러한 위암에서 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 과발현이 림프절 전이가 높은 진행위암과 관련이 있음을 보고하였으나 적은 샘플 숫자와 분석 깊이의 한계로 결과 검증에는 어려움이 있었다 (Cancer Res Treat 2015; 47: 718-726).
최근 차세대 염기서열 분석법 (Next-generation sequencing; NGS) 이 발달함에 따라 암 유전체 연구에서 희귀 변이들의 분자적 특성을 분석하는 것이 가능해졌다 (Nat Rev Genet 2013; 14: 681-691). 그러므로 본 연구는 NGS 기법을 이용하여 T 병기가 높고 림프절전이가 없는 위암과 T 병기가 낮지만 림프절전이가 극도로 높은 위암을 분석함으로써 림프절전이를 위한 독립적인 분자 바이오마커들을 찾고자 한다.
일 양상은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법을 제공한다.
일 양상은 APOBEC3A(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A), FCGR3B(Fc fragment of IgG, low affinity IIIb, receptor), SERPINB5(serpin family B member 5), NMU(neuromedin-U) 및 PADI2(Protein-arginine deiminase type-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 단백질은 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있으며, 인간 유래의 PADI2는 GenBank Accession No. NM_007365.2의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 또는 이 중 PADI2로 발현되는 코돈만을 갖는 것으로서 서열번호 2의 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 이를 포함하는 mRNA로부터 NP_031391.2의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 또는 2의 mRNA와 서열번호 14의 단백질이 일부 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 PADI2의 mRNA 또는 PADI2 단백질로 간주될 수 있다. APOBEC3A는 서열번호 3(NM_145699.3), 서열번호 3에서 171 내지 770번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 4(NM_001270406.1) 및 서열번호 4에서 171 내지 716번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, FCGR3B는 서열번호 5(NM_001244753.1), 서열번호 5에서 261 내지 1070번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 6(NM_000570.4), 서열번호 6에서 123번 내지 824번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 7(NM_001271035.1), 서열번호 7에서 261번 내지 1067번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 8(NM_001271036.1), 서열번호 8에서 286번 내지 936번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 9(NM_001271037.1) 및 서열번호 9에서 286번 내지 678번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, SERPINB5는 서열번호 10(NM_002639.4) 또는 서열번호 10에서 143번 내지 1270번의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 NMU는 서열번호 11(NM_006681.3), 서열번호 11에서 107번 내지 631번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 12(NM_001292045.1), 서열번호 12에서 107번 내지 583번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 13(NM_001292046.1), 및 서열번호 13에서 107번 내지 556번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 포함하는 mRNA로부터 번역된 것일 수 있으며, 이를 포함하는 mRNA로부터 번역되는 APOBEC3A는 NP_663745.1(서열번호 15), FCGR3B는 NP_001231682.1(서열번호 16), NP_000561.3(서열번호 17), NP_001257964.1(서열번호 18), NP_001257965.1(서열번호 19), 및 NP_001257966.1(서열번호 20) 중 어느 하나, SERPINB5는 NP_002630.2(서열번호 21), 및 NMU는 NP_006672.1(서열번호 22), NP_001278974.1(서열번호 23), 및 NP_001278975.1(서열번호 24) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다. 또한 상기 각각의 단백질의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 그 단백질 또는 그 단백질의 mRNA로 간주될 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 13과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 13의 서열에서 1개 이상의 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드 또는 7개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 각각은 서열번호 14 내지 24와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 각각은 상기 서열번호 14 내지 24의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 서열을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 전이성 위암 진단용 조성물은 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 하나 이상의 조합으로 포함하는 것일 수 있다.
용어 '전이성'은 암이 발생한 장기 또는 위치에서 다른 장기 또는 다른 위치로 퍼지는 것을 의미하며, 주로 직접적으로 연결되지 않은 부위(또는 장기)로 옮겨가는 현상을 의미한다. 일부 암 세포는 림프관 또는 혈관 벽을 통과하여 다른 장기로 옮겨 갈 수 있는데, 이러한 프로세스 등을 통해 림프절로 전이되면 '림프절 전이'라 한다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측하기 위한 것일 수 있고, 상기 전이는 구체적으로 림프절 전이를 의미하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암 중 초기 위암에서 전이성 위암 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측하기 위한 것일 수 있다. 전이성 암은 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 평가할 수 있다. TNM 병기에서 T는 원(original) 조직에서의 종양 크기, N은 근처의 연관된 림프절, M은 원거리 전이를 의미하는 것으로서, T는 Tx(측정 불가), Tis(in situ 암종(carcinoma)), T0(종양 신호 없음), 및 크기에 따라 T1 내지 T4로 분류되고, N은 Nx(측정 불가), N0(종양 내 국소적 림프절 없음), N1(국소 림프절 전이가 존재하는 것으로서, 가까운 림프절 또는 소수의 국소 림프절에 전이), N2(N1 및 N3 사이의 림프절 전이 정도), 및 N3(원거리 림프절 전이 또는 다수의 국소 림프절 전이)로 분류되고, M은 M0(원거리 전이 없음) 및 M1(원거리 장기에 전이)으로 분류될 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 조성물은 상기 초기 위암 중에서도 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측할 수 있다. 또한 상기 초기 위암은 N 병기 중 N0 내지 N2, N0 내지 N1, 또는 N1 내지 N2에 해당하는 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측할 수 있고, 바람직하게는 상기 N 병기는 N0 내지 N1이다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 조직 시료 또는 세포 시료로부터 세포핵을 단리하는 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단리된 세포핵 중에 검출 대상이 되는 PADI2 단백질은 절단된-PADI2(서열정보 BC009701.1)의 폴리뉴클레오티드로부터 번역된 폴리펩티드로서, 서열번호 14의 서열 중 1 내지 437번의 아미노산 서열을 포함하는 것으로서 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25 또는 서열번호 25에서 65번 내지 1378번의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 PADI2 단백질을 바이오마커로 하여 전이성 위암을 진단하는데 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정함으로써 그 정확성을 더 증진시킬 수 있다. 이에 따라 일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암 진단용 조성물은, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 물질은 상기 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 전이성 위암 진단 바이오마커인 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 각각에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 단백질을 얻고, 얻어진 상기 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2의 발현량을 측정할 수 있는 물질은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 조합일 수 있다.
APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 서열에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 당해 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA 등의 뉴클레오티드과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 방사성 원소 등으로 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현양)을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 전이성 위암의 바이오마커인 PADI2 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 전이성 위암 진단 및 전이 가능성을 예측할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 마커 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 mRNA의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 단백질의 발현량의 측정을 통해 전이성 위암인지 여부 및 림프절 전이 가능성을 예측할 수 있다. PCR 조건, 및 프라이머 세트의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 나타내며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체 및 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체를 포함할 수 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 포스포르아미디트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 또는 그 유전자의 mRNA 발현량은 전이성 위암, 특히 초기 위암에서 림프절 전이 위험성이 큰 경우 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 전이성 위암 조성물은 위암 환자의 위암 세포에서 (또는 정상 세포와 함께 비교되어) APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량 또는 유전자 (mRNA 등) 발현량을 측정하여 전이성 위암인지 여부 진단 및 림프절로의 전이 가능성을 예측할 수 있다.
다른 양상은 본 발명의 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2의 발현량, 및 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정할 수 있는 상기 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트를 제공한다.
상기 전이성 위암 진단용 키트는 전이성 위암 진단 마커인 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질의 발현량을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현량을 측정함으로써 전이성 위암인지 여부를 진단 및 림프절로 전이 가능성을 예측할 수 있다. 상기 전이성 위암 진단용 키트는 앞서 설명한 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량을 측정할 수 있는 물질, 즉 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 또는 단백질, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질을 코딩하는 각각의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량을 측정하는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
일 구체예에서 따르면, 본 발명의 전이성 위암 진단용 키트는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명의 전이성 위암 진단용 키트는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는 전이성 위암 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 전이성 위암 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질을 코딩하는 각각의 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.
또한 본 발명의 키트는 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β에 대해서도 상기 기재된 바와 같으며, 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약 또는 상기 시약을 담은 용기를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 각각의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스(mouse), 쥐(rat), 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 개체로부터 분리된 시료는 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직일 수 있다. 또한 상기 시료는 상기 조직들로부터 유래된 세포 또는 주변 세포 외액을 포함하는 것일 수 있다.
용어 "병변 조직"이란 암의 징후를 보이는 조직을 의미한다. 정상 조직은 이러한 암의 징후를 보이지 않는 부분의 조직을 의미하는 것으로서, 본 발명에서 위(stomach)로부터 유래된 조직일 수 있고, 보다 구체적으로 위점막조직일 수 있다. 일 구체예에서 상기 정상 조직 및 병변 조직은 같은 개체로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 측정된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량을 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2의 표준 발현량과 각각 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 표준 발현량은 불특정 다수의 정상 조직에서의 특정 단백질의 평균적인 발현량을 의미하는 것으로서, 예를 들어 TCGA 빅데이터와 같은 것으로부터 수득된 값의 평균을 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직 각각으로부터 측정된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량을 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 이 경우 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량에 있어 정상 상태에서의 발현량에 대한 개인차를 극복할 수 있는 장점이 있을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 상기 시료로부터 세포핵을 단리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 도 8C를 참조하면 세포 중 세포질 뿐만 아니라 세포핵에도 PADI2 발현량이 높으며, 상기 PADI2 중에서도 절단된-PADI2가 세포핵에서 높게 발현하고 세포 침습(invasion)에 크게 관여함을 알 수 있다(도 9D). 따라서 세포핵을 단리하는 단계를 더 포함하는 진단 방법을 이용하는 경우 세포핵에서의 PADI2 발현량을 측정함으로써 전이성 위암의 진단 및 전이 가능성 예측에서 정확도를 더 높일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 비교된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량이 현저하게 높은 경우, 상기 개체의 위암은 전이될 확률이 높을 것으로 진단하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 전이성 위암 조직에서의 PADI2 발현량은 표준 발현량에 비해 3배 내지 10배 이상일 수 있고, 정상 조직의 PADI2 발현량에 비해 동일한 개체로부터 수득된 위암 조직의 PADI2 발현량이 3배 내지 10배 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 초기 위암에 걸린 개체를 대상으로 하는 것일 수 있다. 상기 초기 위암은 TNM 단계 시스템 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것일 수 있고, N 병기로서 N0 내지 N2, N0 내지 N1, 또는 N1 내지 N2에 해당하는 경우를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 N병기는 N0 내지 N1 일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 개체로부터 분리된 시료로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 즉, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 진단 방법에서 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량 측정은, 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하여 단백질의 발현양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 mRNA의 발현량은 상기 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물에 의하여 위암 초기에 림프절 전이 가능성을 예측하고 전이를 미리 예방 조치할 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트에 의하여, 신속하고 편리하게 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법에 의하여, 위암 초기에 림프절 전이 가능성을 예측하고 전이를 미리 예방 조치할 수 있다.
도 1은 위암의 각 병기별로 분류된 환자의 정상 조직과 암 조직에서 추출된 RNA를 이용하여 T1/2N3-T(tumor)에서 2배 이상 증가하는 유전자를 분리하여 Heatmap을 나타낸 것이다. (붉은색이 진할수록 fold change가 높음)
도 2는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자(1031, 1101, 211, 220, 및 241)에 비해 T1/2N3인 환자(0107, 0160, 0399, 0486, 및 1027)에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자(APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다. (N: 정상 조직, T: 암 조직)
도 3은 26쌍의 정상 조직 및 위암 조직에서 TNM 병기에 따른 mRNA 발현량 측정하여 나타낸 것으로서, 도 3A는 전체 26명 환자의 정상 조직 및 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3B는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3C는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3D는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직 대비 위암 조직에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이다.
도 4는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자에 비해 T1/2N3인 환자에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자에 대해 정상 조직 및 위암 조직에서의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 다양한 암종에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 위암에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 패밀리의 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TNM 병기 기준 각 병기에 따른 PADI2 발현량을 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이고, 도 8B는 전장-PADI2(full-length form) 및 절단된-PADI2(truncated form)를 도식화한 것이고, 도 8C는 선별된 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이고, 도 8D는 SNU0638에서의 세포질 및 핵에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이다.
도 9A는 SNU-638에서 siPADI2에 의한 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9B는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9C는 PADI2 활성 억제제 처리에 따른 세포 생존률 변화를 나타낸 것이고, 도 9D는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 침습 정도를 나타낸 것이다.
도 10A는 PADI2가 과발현하는 SNU-638, 및 전장 및 절단된-PADI2를 과발현하는 AGS 안정 세포에서 PADI2에 의한 염증 시토킨 발현을 측정한 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 10B는 AGS 안정 세포에서의 전장-PADI2 및 절단된-PADI2의 과발현 처리에 의한 PADI2, 도 10C는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 시료를 제공한 환자의 정보를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 림프절 전이를 예측할 수 있는 바이오마커로서 PADI2의 발굴
1-1. 환자 조직 시료의 수집 및 병기의 분류
위암 초기에 림프절 전이를 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 각 병기에 따라 환자를 분류하고, 상기 환자로부터 조직 시료를 수득하였다.
시료를 얻기 위해 구체적으로, 서울대학교병원에서 원발성 위선암으로 위절제술을 받은 환자에서 위절제 직후 신선한 상태의 위암 조직 및 같은 환자의 정상 위점막조직을 일부 취득하여 즉시 액체질소통에 넣어 냉동시키고, 이후 80℃ 조직저장소에 장기 보관하였다. 상기 각 시료들은 서울대학교병원위암연구소에 IRB 승인을 받아 동의서와 함께 조직저장소자료(IRB No. H-0806-072-248)로 보관하였다.
시료를 선별하기 위해 후향적 문헌 리뷰에 대한 IRB의 승인을 받은 임상데이터베이스자료(IRB No:H-0603-072-170)와 상기 조직저장소 자료를 비교대조하여, 조직저장소에 저장된 모든 조직의 임상병리 결과를 후향적으로 리뷰하면서 AJCC/UICC 제7판 TNM병기 분류 정의상 T 병기가 4기인 진행성 위암 중 림프절 전이 없는 환자군과 T병기가 1기 또는 2기이면서 림프절 전이를 의미하는 N병기가 3기인 환자군을 선별하였다. 그 후 해당 환자군의 위암 조직과 정상 위점막조직의 신선 동결조직 (fresh frozen tissue)를 해동하여 실험을 진행하였다.
따라서 각 병기는 구체적으로, 악성 종양을 분류할 수 있는 TNM 병기(TNM staging system)에 따라, T병기와 N병기로 구분하면, 총 26명의 환자 중 T병기가 높으면서 림프절 전이가 없는 환자군(T4N0, n=21), T병기가 낮으면서 림프절 전이가 높은 환자군(T1N3과 T2N3, n=5)으로 하였다. 분석을 위한 조직 시료는 상기 총 26명의 환자로부터 정상 조직(N) 및 종양 조직(T) 각각을 분리한 후 조직 내 각 후보 바이오마커의 발현량 비교 분석을 수행하였다. 각 환자의 정보는 도 11에 나타낸 바와 같다.
1-2. 후보 바이오마커의 발현량 분석을 위한 라이브러리 생성
환자로부터 수집된 조직으로부터 전체 RNA를 추출한 다음 RNA 2㎍으로부터 oligo(dT)를 이용하여 mRNA를 분리하였다. 100bp Paired-end sequencing을 위해 라이브러리 제작을 진행하였으며, 상기 환자 시료를 혼합한 후 Illumina사의 TruSeq RNA Sample Prep Kit을 이용하여 최종 라이브러리를 생성하였다.
구체적으로, 상기 분리된 mRNA를 단편화(fragmentation)시키고 무작위 6량체 프라이밍(random hexamer priming)을 통해 단일-가닥 cDNA로 합성하였다. 이를 주형으로 하여 2차 가닥을 합성하고 이중-가닥 cDNA를 합성하였다. Blunt-end를 만들기 위해 End Repair를 하고, Adapter를 붙이기 위해 A-tailing 및 Adapter ligation 하였다. 그 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 cDNA 라이브러리를 증폭시켰다. 2100 BioAnalyzer를 이용하여 최종 생성물의 농도와 사이즈를 확인하였다. 생성된 라이브러리는 KAPA library quantification kit를 이용하여 최종 정량한 후 Hiseq2500을 이용하여 서열을 해독하였다.
1-3. 후보 바이오마커의 발현량 분석
해독된 서열에서 낮은 품질의 서열을 제거하기 위해 필터링을 수행하였다. 구체적으로, 서열 정보 중 N으로 나타난 염기의 비율이 전체 서열의 10% 이상 포함되어 있거나, Q20 미만의 염기가 40%이상인 리드가 제거되었으며, 평균 품질이 Q20 이하인 리드 역시 제거하였다. 필터링 전 과정은 내부에서 제작된 프로그램에 의해서 수행되었다. 필터링된 서열은 STAR v2.4.0b (Dobin et al, 2013)를 이용하여 해당 종(species) 참조 유전체 서열 (hg19)에 정렬하였다.
발현량 측정은 Cufflinks v2.1.1 (Trapnell C. et al, 2010)를 이용하여 계산하였으며, 계산된 발현값을 FPKM (fragments read per kilobase of exon per million fragments mapped)으로 표현하였다. 유전자 정보 데이터베이스로 ensemble 72를 사용하였으며, non-coding 유전자 영역은 -mask 옵션을 이용하여 발현량 측정에서 제외하였다. 발현량 측정의 정확성을 높이기 위하여 multi-read-correction 과 frag-bias-correct 옵션을 추가로 사용하였으며, 다른 옵션은 기본값을 사용하였다.
림프절 위암의 전이에 관련된 유전자를 확인하고자 Cufflinks를 통해 얻어진 전체 52 샘플들의 발현값을 이용하였다. 환자들의 정상조직과 비전이성 위암 종양조직(T4N0-T)의 전체 발현값에 비해 림프절 전이군인 T1/2N3-T에서 2배 이상, P value < 0.01로 유의성 있는 유전자를 선택하였으며 선택된 유전자는 Clustvis (Tauno M., 2015)를 이용하여 heatmap으로 나타내었다.
도 1은 선택된 78개의 유전자들을 Clustvis를 이용하여 heatmap으로 나타낸 것이다 (T4N0-N: T병기 4이면서 림프절 전이(N병기)가 없는 샘플의 정상조직, T4N0-T: T병기 4이면서 림프절 전이가 없는 샘플의 종양조직, T1/2N3-N: T병기 1또는 2이면서 N병기 3으로 림프절 전이가 있는 샘플의 정상조직, 및 T1/2N3-T: T병기 1또는 2이면서 N병기 3으로 림프절 전이가 있는 샘플의 종양조직). 상기 heatmap에서 적색에 가까울수록 높은 발현량, 청색에 가까울수록 상대적으로 낮은 발현량을 나타내는데, 적색이 진할수록 fold change가 높다. 분석 결과 PADI2가 비전이성 위암 종양조직(T4N0-T)의 전체 발현값에 비해 림프절 전이군인 T1/2N3-T에서 2배 이상 발현하는 것으로 보였으며, heatmap 중 화살표가 PADI2를 나타낸다.
도 2는 상기 선택된 유전자들 중 위암의 초기 암인 T1/2기 임에도 림파선 전이가 나타난 환자 (N3) (0107, 0160, 0399, 0486, 및 1027로 나타냄)와 4기 위암 (T4)임에도 림파선 전이가 나타나지 않은 환자 (N0) (1031, 1101, 211, 220, 및 241로 나타냄)에서 유의성이 있는 5개의 유전자를 선정하여 발현값을 나타낸 것이다. APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2를 선정하여 정상 조직(N) 및 암 조직(T)을 비교한 결과, 선정된 유전자 모두 T1/2N3에서 거의 일관되게 높게 발현하였으며, 그 중 PADI2가 가장 유의하면서도 현저한 차이를 보이며 암 조직에서 높게 발현하는 것으로 나타났다.
또한 도 4를 참조하면, TNM 병기 T4N0인 환자에 비해 T1/2N3인 환자에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자에 대해 정상 조직 및 위암 조직에서의 발현량을 비교해본 결과에서 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 모두 T1/2N3인 환자에서 T4N0인 환자에 비해 과발현하였으며, 특히 각 병기 내 정상 조직 및 위암 조직을 비교한 경우 T1/2N3인 환자에서 현저한 차이를 보이는 것을 알 수 있다.
실시예 2: 림프절 전이 바이오마커로서 PADI2의 mRNA 분석
2-1. mRNA 추출 및 cDNA 합성
PADI2가 림프절 전이 바이오마커로서 역할 할 수 있는지 알아보기 위해 26쌍의 정상 점막 조직 및 위암 조직에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다. 먼저 각 조직으로부터 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
구체적으로, 총 RNA를 추출하기 위해 액체질소에 동결 보관된 26쌍의 정상 점막 조직 및 위암 조직을 약 2mm3 취하여 막자사발로 분쇄한 후, Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1mL을 넣고 조직이 완전히 녹을 때까지 혼합하였다. 클로로포름 (Chloroform) 200㎕를 첨가하여 원심분리 후 상층액을 이소프로판 (Isopropan) 500㎕와 혼합하였고, 다시 원심분리하여 침전된 RNA 펠렛(pellet)을 확인하였다. 75% 에탄올(Ethanol) 1mL로 펠렛을 씻어준 뒤 다시 원심분리하여 RNA 펠렛을 건조시키고 RNase가 없는 증류수를 첨가하였다. RNA의 품질을 측정하기 위해 전기영동과 분광광도계 (Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 흡광도 측정하였다. cDNA 합성에는 500ng의 RNA를 이용하였고 TOP script cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
2-2. 실시간 중합효소연쇄반응 (RT- PCR )
PADI2 유전자의 발현을 분석하기 위해 StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 통해 상대정량법을 이용한 실시간 정량적 중합효소연쇄반응 (Quantitative real-time PCR)을 수행하였다. 이 반응은 10㎕의 2X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Monza, Italy), 각 프라이머 2.5pmole/㎕ 및 1㎕의 cDNA를 첨가하여 총 20㎕로 반응시켰다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성시킨 후 95℃에서 15초, 60℃ 15초, 및 72℃ 1분을 1회 반복으로 하여 40회 반복 시행하였다. 산출된 Ct값 (Threshold cycle)을 이용하여 유전자 발현을 정량화하였고, 각 샘플에서의 PADI2 발현은 GAPDH 발현 값으로 보정하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
Gene Forward primer (5'→3') Reverse primer (5'→3')
GAPDH TCTCAGGCCTGGTCTCCAT AAGATGGGAGTCAGGGGAAT
PADI2 CATTTCCTGGTATGACAACGA CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 PADI2 mRNA가 정상 점막 조직에 비해 위암 조직에서 유의하게 발현이 높았다 (p = 0.047, 도 3A). T 병기 및 N 병기를 보다 세부적으로 구분하여 환자를 두 군 (T4N0; n=21 및 T1/2N3; n=5)으로 분류하였다. 정상 점막 조직에서의 PADI2 발현은 두 군에서 차이를 보이지 않았지만 (p = 0.981, 도 3B), 위암 조직에서의 PADI2 발현은 T4N0 군에 비해 T1/2N3 군에서 통계적으로 유의하게 높은 발현(약 5배의 차이)을 보였다 (p < 0.001, 도 3C). 또한, 각 환자에서 정상 점막 조직에서의 PADI2 발현에 대해 위암 조직에서의 PADI2 발현을 비율로 계산했을 때도 마찬가지로 두 군 간에 유의한 차이(약 4배 내지 5배의 차이)를 보였다 (p = 0.022, 그림 3D). 따라서 PADI2의 mRNA 발현량으로 측정된 값이 PADI2의 과발현의 지표로서 이용될 수 있으며, 림프절 전이가 높은 조기 위암에서 PADI2가 바이오마커로 기능할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 빅 데이터 분석에 의한 림프절 전이 바이오마커로서 PADI2의 평가
3-1. The Cancer Genome Atlas ( TCGA ) 빅데이터 분석
PADI2가 림프절 전이 바이오마커로서 역할 할 수 있는지 알아보기 위해 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 빅데이터 분석을 수행하였다. TCGA는 인간 게놈 프로젝트의 가장 중요한 연구로서, 미국 국립보건원 (National Institutes of Health) 주도로 대규모 암 환자의 유전체를 분석하여 빅데이터 형태로 전세계 연구자들에게 공개한 연구이다. TCGA 홈페이지 (https://cancergenome.nih.gov) 및 UCSC Cancer Browser 홈페이지 (https://genome-cancer.ucsc.edu)에는 10,000명 이상의 환자들의 임상정보와 함께, 유전자 돌연변이, 메틸레이션 프로파일 (methylation profile), 유전자 발현정보에 대해서 기초 데이터 (raw data)부터 정돈된 데이터 (processed data)까지 모든 자료를 다운로드 받을 수 있다. 본 발명자들은 RNA 발현이 공개된 모든 데이터를 다운로드 받았으며, 총 31개의 암종(도 5 하단 참조)에서 8,981개의 암조직 및 686개의 정상조직에서의 RNA 발현 자료를 분석하였다. 그 중 위암의 경우 401개의 암조직 및 35개의 정상조직을 분석하였다. 해당 조직의 암 병기 정보는 같이 공개되어 있는 임상정보 자료를 참고하였다. 두 군 간의 유전자 발현 정도의 차이는 Wilcoxon rank sum법을 이용하여 분석하였고, 여러 군에서 유전자 발현 정도의 차이는 ANOVA법으로 분석 후 Tukey법을 이용하여 각 군 간의 차이를 분석하였다. P value가 0.05보다 작을 경우 통계적으로 의미가 있는 것으로 간주하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 갑상선암(THCA; thyroid carcinoma), 담관암(CHOL; cholangiocarcinoma), 식도암(ESCA; esophageal carcinoma), 자궁경부암(CESC; cervical cancer), 및 위암(STAD; stomach adenocarcinoma)에서 이러한 현상이 확인되었으나, 위암에서 특히 PADI2의 발현이 정상 조직에 비해 암 조직에서 현저하게 높게 나타나는 것으로 확인되었다 (P < 0.001). 또한, PADI2 유전자와 같은 패밀리인 PADI1, PADI3, 및 PADI4의 발현을 위암 조직 및 위 정상조직과 비교한 결과 (도 6), PADI1 및 PADI3는 암 조직에서 정상조직보다 유의하게 발현이 증가하는 것으로 보였으나, PADI4의 경우는 반대로 암 조직에서 오히려 발현이 감소하였다.
상기 TCGA 데이터베이스에서 확인된 PADI2 발현의 증가 여부가 위암의 병기에 따라 차이가 있는지 확인하기 위하여, 임상정보와 연관지어 분석을 수행하였다 (도 7). 그 결과 T 병기에 따라서 PADI2의 발현이 차이가 있음을 확인하였다 (P < 0.001). 그 중에서도 특히 T1 과 T2 사이에서의 차이가 가장 유의하게 나타났다 (P = 0.007). N 병기에 따라서도 PADI2의 발현이 차이가 있었으나 (P < 0.001), 그 차이는 주로 정상 조직과 N1 병기 환자의 암 조직 (P = 0.036), 및 정상 조직과 N2 병기 환자의 암 조직 (P = 0.011)간에 나타났으며, 그 외에는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서, 위암에서 PADI2의 과발현 여부를 측정함으로써 위암 초기, 적어도 TNM 병기로 구분하는 경우 T1 내지 T2 병기의 환자에서 림프절 전이 여부를 예측할 수 있으며, PADI2가 림프절 전이 단계 중에서도 초기 (적어도, N0 내지 N1)에 림프절 전이 바이오마커로서 기능함으로써 림프절 전이 여부를 예측하는데 훌륭한 바이오마커로서 기능할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. PADI2 발현 위치 측정
4-1. 세포주 및 세포 배양
PADI2 발현 위치 분석을 위한 세포를 선별하기 위해, 실시예 1-3에서와 같이 유전자 데이터 베이스 상에서 분석하여 PADI2가 과발현하는 SNU-638, 및 PADI2가 거의 발현되지 않는 SNU-719 및 AGS를 선발하였다 (도 8A 참조)
추가 실험을 위해, 인간 위암세포 SNU-638 및 SNU-719는 Korean Cell Lline Bank (Seoul, Korea)로부터 구입하였고, AGS는 American Type Culture Collection (ATCC) (Virginia, USA)로부터 구입하였다. 모든 위암세포는 10% fetal bovine serum (FBS, WelGENE) 및 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI1640 배지 (WelGENE)에 5% CO2 습윤배양기로 37℃에서 배양하였다.
4-2. 시약 및 항체
PADI2항체는 Proteintech (12110-1-AP)에서 구입하였고 α-tubulin (b-7) 그리고 Lamin B (c-20)의 항체는 Santa Cruz Technology에서 구입하였다. β-actin 항체는 Sigma-aldrich (A2228)에서 구입하였다.
4-3. 세포핵 및 세포질의 분획, 및 웨스턴 블롯
세포로부터 세포핵 및 세포질을 분획하기 위해 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 뒤 M-PERTM Mammalian Protein Extract Reagent (ThermoFisher Scienctific, 78501)에 Phosphatase 와 protease 억제제를 첨가한 완충액으로 세포를 파쇄한다. 세포 파쇄액을 13,000 rpm/min으로, 4℃에서 20분간 원심분리하여 정화하였다. 그 상등액을 회수하여 BCA 단백질 정량 레포트 방법으로 전체 단백질의 농도를 측정하였다. 동량의 세포 단백질을 95℃에서 5분간 가열하고 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 그 막들을 0.05% (v/v) Tween 20 및 5% (w/v) 탈지분유를 함유한 Tris-버퍼 식염수로 1시간 블로킹한 후 적당한 항체들로 배양한 후, 1차 항체를 첨가하고 냉실에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체 결합을 Horseradish peroxidase-부착된 염소 항-마우스 또는 항-래빗 면역글로빈 G 2차 항체(Merck Millipore)를 사용하여, Chemiluminscent Substrate (GE, Visual Protein Biotechnology Corporation, LF08-500)로 시각화시켰다.
그 결과, 도 8C에 나타난 바와 같이 PADI2가 두 사이즈로 측정됨으로써 전장 형태(full-length form)와 절단된 형태(truncated form)가 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8D에 나타낸 바와 같이 세포질에서는 전장 형태가, 핵 내에서는 절단된 형태가 주로 존재하는 것으로 보였다.
실시예 5. PADI2에 의한 세포 생존 평가 및 세포 침습 평가
5-1. 안정 세포주 (stable cell line) 제조
human PADI2 유전자 cDNA를 SNU-638 세포주의 cDNA로부터 PCR를 이용하여 증폭시킨 뒤 pFLAG-CMV-6c vector의 EcoRI과 SalI 제한 효소 부위에 도입하여 Flag-cPADI2(전장-형태)와 Flag-nPADI2(절단된-형태)로 발현 플라스미드를 제작하였다.
PADI2 유전자의 과잉발현을 유도하기 위하여 Lpcx vector의 XhoI과 ClaI 제한 효소 부위에 상기 Flag-cPADI2(전장-형태)와 Flag-nPADI2(절단된-형태)를 도입하여 레트로바이러스 플라스미드를 제작하였다.
상기 플라스미드에서 PADI2는 도 8B에 도시한 바와 같이 도메인에 따라 뉴클레오티드 서열 정보 NM_007365.2 (전장-PADI2) 및 절단된-PADI2(BC009701.1)에 따라, 전장-PADI2 (서열번호 14의 아미노산 서열 중 1 내지 625번)및 절단된-PADI2 (서열번호 14의 아미노산 서열 중 1 내지 437번)으로 하여 각각 LPCX-전장-PADI2(cPADI2) 및 LPCX-절단된-PADI2(nPADI2) 플라스미드로 제작하였다.
사용된 프라이머는 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같다.
Flag-cPADI2 Flag-nPADI2
Forward Primer AAAGAATTCATGCTGCGCGAGCGGACCGT AAAGAATTCATGCTGCGCGAGCGGACCGT
Reverse Primer AAAGTCGACTCAGGGCACCATGTGCCACC GATCGTCGACTGACAGAGGAAAGCTGCTCCCGAT
Lpcx-flag-cPADI2 Lpcx-flag-nPADI2
Forward Primer GATCCTCGAGATGGACTACAAAGACGATGACGAC GATCCTCGAGATGGACTACAAAGACGATGACGAC
Reverse Primer GATCATCGATCTAGGGCACCATGTGCCACCACTT GATCATCGATCTACAGAGGAAAGCTGCTCCCGAT
바이러스 생산 숙주 세포로는 GP2-293 세포주를 사용하였다. 형질주입 24시간 전에 GP2-293 세포주를 100-mm 배양 접시에 접종하였다. 10㎍ DNA와 5㎍ VSV-G를 Polyethylenimine (PEI)를 이용하여 형질주입시켰다. 형질주입한 후 48시간 후에 세포 배양물로부터 virus soup을 수거하여 0.45-㎛ 필터를 사용하여 정제하였다. 정제한 바이러스의 3-3.5ml를 8mg/ml polybrene과 함께 AGS (1x105 cells/100-mm culture dish)에 처리하였고, 이를 8시간 간격으로 세 번 반복하였다. 상기 바이러스를 감염시킨 후, 새로운 배지로 갈아준 뒤 24시간 후에 2 ㎍/ml puromycin으로 감염된 세포를 선택하였다.
도 8E 및 8F와 같이 AGS 안정 세포를 실시예 4-3과 같이 세포 전체, 세포질 및 세포 핵에서의 PADI2 발현량을 측정해본 결과, 실시예 4에서의 결과와 일치하여, 전장-PADI2는 세포질, 절단된-PADI2는 세포핵에서 주로 발현되는 것을 나타났다.
반면 상기 안정 세포를 배양하며 6일간 이틀마다 카운팅한 결과, 도 9B와 같이 절단된-PADI2가 과발현되는 경우 세포 증식 속도가 현저하게 증가하는 것으로 보였다.
5-2. siRNA를 이용한 PADI2 발현 억제시 세포 증식 속도 평가
실시예 4-1에 따른 SNU-638 세포를 준비하고, siRNA를 이용하여 PADI2의 발현을 억제한 후 세포 증식 속도를 평가하였다.
구체적으로, SNU-638 세포를 배양 접시의 60 내지 80% 밀도가 되도록 접종하였다. 다음날, Opti-MEM medium (Gibco, 31985070)에 siRNA 형질주입 시약과 siRNA(를 1:3 비율로 넣고 5분간 인큐베이션 하였다. 상기 혼합물을 세포 배지에 넣고 1 내지 3일 정도 37℃에서 인큐베이션 하였다. PADI2 siRNA는 Thermo Fisher Scientific (4392420)에서 구입하였고 이의 형질주입 시약은 invitrogen (13778-075)에서 구입하였다.
그 결과, 실시예 5-1의 결과와 일치하여 도 9A와 같이 PADI2 발현을 억제하는 경우 대조군에 비하여 세포 증식 속도가 감소함을 알 수 있다.
5-3. PADI2 활성 억제시 세포 생존률 평가
실시예 4-1에 따라 PADI2를 과발현하는 SNU-638 및 PADI2를 거의 발현하지 않는 SNU-719를 준비한 후, PAD 저해제인 Cl-amidine은 Merck Millipore (506282-10MGCN)로부터 구입하여 세포에 도 9C에 표시된 농도대로 처리하였다.
구체적으로, PADI2 저해제인 Cl-amidine에 의한 세포 독성을 측정하기 위해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 탈수소 효소작용에 의하여 보라색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 측정함으로써 세포 생존율을 분석할 수 있는 MTT 분석을 수행하였다. SNU-638 (high PADI2) 세포주 및 SNU-719 (low PADI2) 세포주 각각을 96well plate에 2 X 105 cell로 접종하여 인큐베이션하고, Cl-amidine을 각각 정해진 농도(도 9C에 나타낸)로 처리 후 96시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 상기 세포 배양물에 1/10의 MTT용액을 첨가하여 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 상기 세포 배양물로부터 배양액을 조심스럽게 제거하고 각 well에 200㎕ DMSO를 첨가하여 30분 동안 인큐베이션한 후, microplate reader에서 540nm 파장을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9C와 같이, PADI2를 과발현하는 SNU-638 및 PADI2를 거의 발현하지 않는 SNU-719의 경우, 모두 Cl-amidine 처리에 의해 세포 생존률이 감소하였다. 그러나, 실시예 5-1 및 5-2의 결과와 일치하여, PADI2를 과발현하는 SNU-638이 그렇지 않은 SNU-719보다 PADI2 저해제에 민감하게 반응하여 세포 생존률이 감소하는 것으로 나타났다.
5-4. 세포 침습 분석
세포 침습 분석을 위해 BioCoat Matrigel invasion chamber (Corning, 354578)을 이용하였다. 실시예 5-1의 PADI2 과발현 안정 세포를 FBS 세럼이 없는 배지에 24시간 배양한 뒤 상기 세포를 Traswell의 위쪽 부분에 1×105 cell로 넣어준다. Transwell 아래쪽 부분은 세럼(serum)이 존재하는 배지를 넣고, 세포가 존재하는 위쪽 부분은 세럼이 없는 배지 조건으로 세포를 배양하였다. 24시간 후 chamber 안에 남아있는 세포들을 면봉으로 닦아 주었다. Trasnwell 아래 부분으로 이동한 세포를 염색하기 위해서 먼저 70% 에탄알로 10분간 고정시킨 후, 에탄알을 제거하고 말린 뒤 0.05% crystal violet을 이용하여 이동한 세포를 염색시켰다. 그 후, 이동한 세포의 수를 현미경으로 관찰한 후 무작위로 4부분의 사진 이미지를 수득하여 이동한 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 9D와 같이 침습이 PADI2를 과발현하는 경우 세포 침습률이 대조군에 비해 급격히 증가하는데, 특히 절단된-PADI2를 과발현한 경우 침습률이 현저하게 증가함을 알 수 있다.
따라서, 위암 세포에서 PADI2가 과발현하는 경우 세포 증식률이 증가하고, 세포 침습이 증가하므로 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측하는데, PADI2가 훌륭한 마커가 될 수 있음을 알 수 있다.
특히, 세포핵에서의 PADI2 과발현 또는 절단된-PADI2의 과발현 여부는 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측하는 정확도를 더 높일 수 있는 마커가 될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. 전이성 위암 바이오마커로서 PADI2 측정시 보조인자 발굴
6-1. 세포주 및 siRNA 처리
실시예 5-1의 AGS 안정 세포 및 실시예 5-2의 siRNA를 처리한 SNU-638을 준비하였다.
6-2. RNA의 추출 및 qRT - PCR (quantitative Reverse Transcriptase PCR )
실시예 6-1의 세포로부터 제조자의 지침에 따라 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 easy-BLUE total RNA extreactio kit (promega, 17061)를 사용하여 추출하였다. 2㎍의 추출한 RNA를 올리고 dT 프라이머, 연전사효소 (promega, M1705) 및 효소의 버퍼를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 cDNA를 주형으로 이용하여 보고자하는 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co., Daejon, S. Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 밴드를 분석하여 타겟 유전자의 발현량 변화를 측정하였다. 상기 qRT-PCR에 사용된 프라이머 쌍은 표 4와 같다.
Target gene Forward Primer Reverse Primer
PADI2 TGAGAGCCTCGTGCAAGAGAACC CGTGAGCCCCAACTCCTTCTTG
IL-6 GTAGCCGCCCCACACAGA CATGTCTCCTTTCTCAGGGCTG
IL- 1β AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT
TNF -α TCTTCTCGAACCCCGAGTGA CCTCTGATGGCACCACCAG
18S CCCAACTTCTTAGAGGGACA TAGTCAAGTTCGACCGTCTT
qRT-PCR 결과는 도 10A에 나타낸 바와 같다. PADI2 과발현에 따라서 염증 시토킨인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량이 증가하였다.
6-3. PADI2 과발현에 따른 염증 시토킨의 mRNA 발현량 측정
PADI2가 과발현함에 따라 염증 시토킨의 발현량을 mRNA 수준에서 평가하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)은 ViiATM7 Real-time PCR systems (Applied Biosystems) 상에서 SYBR Premix Ex Taq II(TAKARA, RR820A)를 사용하여 수행하였다. 앞서 제조된 cDNA를 1/5로 희석한 뒤, 타겟 유전자 특이적 프라이머 쌍과 2x SYBR premix와 함께 혼합하여 인큐베이션 시켰다. 이때 다양한 유전자의 mRNA 수준은 3배수로 측정하고, GAPDH RNA로 보정하였다. 본 실시예의 RT-PCR에 사용된 프라이머 쌍은 표 5와 같다.
Target gene Forward Primer Reverse Primer
cPADI2 ATGGAGAGGCCATCATGTTC TGTCAGTCCCAGCTCCTTCT
nPADI2 ACTCTCCCCGAGATGGAAAC GAATAATTCCCCCAGCCACT
IL-6 CTCTGGGAAATCGTGGAAAT CCAGTTTGGTAGCATCCATC
IL- 1β GGACAAGCTGAGGAAGATGC TCTTTCAACACGCAGGACAG
TNF -α TGCTTGTTCCTCAGCCTCTT TGAGGTACAGGCCCTCTGAT
GAPDH CCATCTTCCAGGAGCGAGAT GTGTCAGGTACGGTAGTGAC
RT-PCR 결과는 도 10B 및 도 10C에 나타낸 바와 같다. 전장-PADI2 및 절단된-PADI2의 과발현에 따라 상기 실시예 6-2에서와 같이 염증 시토킨인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 림프절 전이성 위암을 예측하기 위한 바이오마커로서 PADI2를 측정시 그 보조 인자로서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6가 좋은 후보가 될 수 있음을 알 수 있다.
<110> AICT (ADVANCED INSTITUTES OF CONVERGENCE TECHNOLOGY) <120> Marker for predicting lymph node metastasis and method for predicting lymph node metastasis using same <130> PN116685 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcaggctgct ggagaaggcg cacctgctgc aggtgctccc ggccgccccg gaccagcgag 60 cgcgggcact gcggcgggga ggatgctgcg cgagcggacc gtgcggctgc agtacgggag 120 ccgcgtggag gcggtgtacg tgctgggcac ctacctctgg accgatgtct acagcgcggc 180 cccagccggg gcccaaacct tcagcctgaa gcactcggaa cacgtgtggg tggaggtggt 240 gcgtgatggg gaggctgagg aggtggccac caatggcaag cagcgctggc ttctctcgcc 300 cagcaccacc ctgcgggtca ccatgagcca ggcgagcacc gaggccagca gtgacaaggt 360 caccgtcaac tactatgacg aggaagggag cattcccatc gaccaggcgg ggctcttcct 420 cacagccatt gagatctccc tggatgtgga cgcagaccgg gatggtgtgg tggagaagaa 480 caacccaaag aaggcatcct ggacctgggg ccccgagggc cagggggcca tcctgctggt 540 gaactgtgac cgagagacac cctggttgcc caaggaggac tgccgtgatg agaaggtcta 600 cagcaaggaa gatctcaagg acatgtccca gatgatcctg cggaccaaag gccccgaccg 660 cctccccgcc ggatacgaga tagttctgta catttccatg tcagactcag acaaagtggg 720 cgtgttctac gtggagaacc cgttcttcgg ccaacgctat atccacatcc tgggccggcg 780 gaagctctac catgtggtca agtacacggg tggctccgcg gagctgctgt tcttcgtgga 840 aggcctctgt ttccccgacg agggcttctc aggcctggtc tccatccatg tcagcctgct 900 ggagtacatg gcccaggaca ttcccctgac tcccatcttc acggacaccg tgatattccg 960 gattgctccg tggatcatga cccccaacat cctgcctccc gtgtcggtgt ttgtgtgctg 1020 catgaaggat aattacctgt tcctgaaaga ggtgaagaac cttgtggaga aaaccaactg 1080 tgagctgaag gtctgcttcc agtacctaaa ccgaggcgat cgctggatcc aggatgaaat 1140 tgagtttggc tacatcgagg ccccccataa aggcttcccc gtggtgctgg actctccccg 1200 agatggaaac ctaaaggact tccctgtgaa ggagctcctg ggcccagatt ttggctacgt 1260 gacccgggag cccctctttg agtctgtcac cagccttgac tcatttggaa acctggaggt 1320 cagtccccca gtgaccgtga acggcaagac atacccgctt ggccgcatcc tcatcgggag 1380 cagctttcct ctgtctggtg gtcggaggat gaccaaggtg gtgcgtgact tcctgaaggc 1440 ccagcaggtg caggcgcccg tggagctcta ctcagactgg ctgactgtgg gccacgtgga 1500 tgagttcatg tcctttgtcc ccatccccgg cacaaagaaa ttcctgctac tcatggccag 1560 cacctcggcc tgctacaagc tcttccgaga gaagcagaag gacggccatg gagaggccat 1620 catgttcaaa ggcttgggtg ggatgagcag caagcgaatc accatcaaca agattctgtc 1680 caacgagagc cttgtgcagg agaacctgta cttccagcgc tgcctagact ggaaccgtga 1740 catcctcaag aaggagctgg gactgacaga gcaggacatc attgacctgc ccgctctgtt 1800 caagatggac gaggaccacc gtgccagagc cttcttccca aacatggtga acatgatcgt 1860 gctggacaag gacctgggca tccccaagcc attcgggcca caggttgagg aggaatgctg 1920 cctggagatg cacgtgcgtg gcctcctgga gcccctgggc ctcgaatgca ccttcatcga 1980 cgacatttct gcctaccaca aatttctggg ggaagtccac tgtggcacca acgtccgcag 2040 gaagcccttc accttcaagt ggtggcacat ggtgccctga cctgccaggg gccctggcgt 2100 ttgcctcctt cgcttagttc tccagaccct ccctcacacg cccagagcct tctgctgaca 2160 tggactggac agccccgctg ggagaccttt gggacgtggg gtggaatttg gggtatctgt 2220 gccttgccct ccctgagagg ggcctcagtg tcctctgaag ccatccccag tgagcctcga 2280 ctctgtccct gctgaaaata gctgggccag tgtctctgta gccctgacat aaggaacaga 2340 acacaacaaa acacagcaaa ccatgtgccc aaactgctcc ccaaagaatt ttgagtctct 2400 aatctgacac tgaatgaggg gagaagggaa ggagattctg ggattgccag ttcttccagc 2460 agccatgctc tgaaaatcaa ggtagaatcc atggaaaggg accccaggac cccgggaccc 2520 tagacgtatc ttgaactgcc atcgtcattt caaatacatc tccctcaggg tttccaggtg 2580 gccaccccca attattcatt ccttaccaac ctctcaaatc ctcttggctt tctctctgca 2640 gtgtggacac tgttggctag tcctccccac tccctgaggg tccagtaagt tagcttagaa 2700 ccttcctgga aacatttcat ctgagcaggt ttccccacgt gtgggatgct ccttttgcct 2760 catctgtctc agggatgcag gctcccccgc atgcatgggg atttctcccc agaccagcat 2820 acttgtgacc tgagagttca atgcgtaaag atgcccctgg tcagccatat ccatcttctc 2880 ttgcctggtc cttgattctc tggccgctcc ctgaccttcc tccttccact gccttgactt 2940 tcttcctttt tattcctggt gccatctgtc caggcagcta gacaagaact tgttcgccag 3000 cagccagatt caggccttcc caggggcata ataagtgacc agcccctcct ctccggacat 3060 cagatccaac acataaggac cctggcctac cctccagccc aacagccagt tctgggtcag 3120 ctgccaactt aggggtggtt tgattatccc attgaaattc accagtgcct ttgccaaaga 3180 ccctctcatt tggacatacc cagattcatt ccctggctcc aactgaaaag actcagtttc 3240 aatcgttaaa agttccttta gggccagaag aataaatgaa ttataatccc attttgaaga 3300 accgatttat aaccaatgaa aaggttataa tgtaatttat attcttggag gaacaagatt 3360 ttcatttggg attatttcct tcaaccattc aacaaacatt tgttgtatgc cactaagcgc 3420 caggcacggc gttgggctct gcaaacacag tggttagtag cagtctggac ctggtcccta 3480 ctggcatgga acccatcact ccccaacatg caaagcccac atttaaaggc cagcctctgc 3540 cccttcagtg atgcgctctt tagaaatgcc agtccactat attcagaaat ccgcagggca 3600 caaaacttcc agcaagtcac tgttgtggtg aaatgggcag tgggggtggg gggtcttctt 3660 taaacaggcc cccttcccat ctacctagcc agtacccatc caatgagtcc ccagagcctc 3720 cagaagctgt tgtctcctct ctggggacag cagctcctgc ctttggaggc caaagcccca 3780 gatctctcca gccccagagc tgaaaacacc aagtgcctat ttgagggtgt ctgtctggag 3840 acttagagtt tgtcatgtgt gtgtgtgtgt ttggttaatg tgggtttatg ggttttcttt 3900 cttttttttc tttttttttt tagtctacat tagggggaag tgagcgcctc ccatgtgcag 3960 acagtgtgtc tttatagatt tttctaaggc tttccccaat 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ccgcatcctc atcgggagca gctttcctct gtctggtggt 1320 cggaggatga ccaaggtggt gcgtgacttc ctgaaggccc agcaggtgca ggcgcccgtg 1380 gagctctact cagactggct gactgtgggc cacgtggatg agttcatgtc ctttgtcccc 1440 atccccggca caaagaaatt cctgctactc atggccagca cctcggcctg ctacaagctc 1500 ttccgagaga agcagaagga cggccatgga gaggccatca tgttcaaagg cttgggtggg 1560 atgagcagca agcgaatcac catcaacaag attctgtcca acgagagcct tgtgcaggag 1620 aacctgtact tccagcgctg cctagactgg aaccgtgaca tcctcaagaa ggagctggga 1680 ctgacagagc aggacatcat tgacctgccc gctctgttca agatggacga ggaccaccgt 1740 gccagagcct tcttcccaaa catggtgaac atgatcgtgc tggacaagga cctgggcatc 1800 cccaagccat tcgggccaca ggttgaggag gaatgctgcc tggagatgca cgtgcgtggc 1860 ctcctggagc ccctgggcct cgaatgcacc ttcatcgacg acatttctgc ctaccacaaa 1920 tttctggggg aagtccactg tggcaccaac gtccgcagga agcccttcac cttcaagtgg 1980 tggcacatgg tgccctga 1998 <210> 3 <211> 1444 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggagaagggg tggggcaggg tatcgctgac tcagcagctt ccaggttgct ctgatgatat 60 attaaggctc ctgaatccta agagaatgtt ggtgaagatc ttaacaccac gccttgagca 120 agtcgcaaga gcgggaggac acagaccagg aaccgagaag ggacaagcac atggaagcca 180 gcccagcatc cgggcccaga cacttgatgg atccacacat attcacttcc aactttaaca 240 atggcattgg aaggcataag acctacctgt gctacgaagt ggagcgcctg gacaatggca 300 cctcggtcaa gatggaccag cacaggggct ttctacacaa ccaggctaag aatcttctct 360 gtggctttta cggccgccat gcggagctgc gcttcttgga cctggttcct tctttgcagt 420 tggacccggc ccagatctac agggtcactt ggttcatctc ctggagcccc tgcttctcct 480 ggggctgtgc cggggaagtg cgtgcgttcc ttcaggagaa cacacacgtg agactgcgta 540 tcttcgctgc ccgcatctat gattacgacc ccctatataa ggaggcactg caaatgctgc 600 gggatgctgg ggcccaagtc tccatcatga cctacgatga atttaagcac tgctgggaca 660 cctttgtgga ccaccaggga tgtcccttcc agccctggga tggactagat gagcacagcc 720 aagccctgag tgggaggctg cgggccattc tccagaatca gggaaactga aggatgggcc 780 tcagtctcta aggaaggcag agacctgggt tgagcagcag aataaaagat cttcttccaa 840 gaaatgcaaa cagaccgttc accaccatct ccagctgctc acagacgcca gcaaagcagt 900 atgctcccga tcaagtagat 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ggggctttct acacaaccag gctaagaatc 300 ttctctgtgg cttttacggc cgccatgcgg agctgcgctt cttggacctg gttccttctt 360 tgcagttgga cccggcccag atctacaggg tcacttggtt catctcctgg agcccctgct 420 tctcctgggg ctgtgccggg gaagtgcgtg cgttccttca ggagaacaca cacgtgagac 480 tgcgtatctt cgctgcccgc atctatgatt acgaccccct atataaggag gcactgcaaa 540 tgctgcggga tgctggggcc caagtctcca tcatgaccta cgatgaattt aagcactgct 600 gggacacctt tgtggaccac cagggatgtc ccttccagcc ctgggatgga ctagatgagc 660 acagccaagc cctgagtggg aggctgcggg ccattctcca gaatcaggga aactgaagga 720 tgggcctcag tctctaagga aggcagagac ctgggttgag cagcagaata aaagatcttc 780 ttccaagaaa tgcaaacaga ccgttcacca ccatctccag ctgctcacag acgccagcaa 840 agcagtatgc tcccgatcaa gtagattttt aaaaaatcag agtgggccgg gcgcggtggc 900 tcacgcctgt aatcccagca ctttggaggc caaggcgggt ggatcacgag gtcaggagat 960 cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaacc ctgtctctac taaaaataca aaaaattagc 1020 caggcgtggt ggcgggcgcc tgtagtccca gctactctgg aggctgaggc aggagagtag 1080 cgtgaacccg ggaggcagag cttgcggtga gccgagattg cgctactgca ctccagcctg 1140 ggcgacagta ccagactcca tctcaaaaaa aaaaaaacca gactgaatta attttaactg 1200 aaaatttctc ttatgttcca agtacacaat agtaagatta tgctcaatat tctcagaata 1260 attttcaatg tattaatgaa atgaaatgat aatttggctt catatctaga ctaacacaaa 1320 attaagaatc ttccataatt gcttttgctc agtaactgtg tcatgaattg caagagtttc 1380 cacaaacact 1390 <210> 5 <211> 2394 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 attcttggtg ctgggtggat ctaaatccag gagatggggg caagcatcct gggaaagctg 60 agggcacact ctggcagatt ctgtgtgtgt cctcagatgc tcagccgcag acctttggga 120 gagtaaaggg ggcacaccca cccaccttgc ctccaggctc tttccttcct attcctgttc 180 tatggtgggg ctccattgcg agacttcaga ttgagaaatc agatgaagtt tcaagaaaag 240 gaaactggca ggtgacagag atgggtggag ggactgggga aaggctgttt actccctcct 300 gtctagtcgg cttggtccct ttagggctcc ggatatcttt ggtgacttgt ccactccagt 360 gtggcatcat gtggcagctg ctcctcccaa ctgctctgct acttctagtt tcagctggca 420 tgcggactga agatctccca aaggctgtgg tgttcctgga gcctcaatgg tacagcgtgc 480 ttgagaagga cagtgtgact ctgaagtgcc agggagccta ctcccctgag gacaattcca 540 cacagtggtt tcacaatgag aacctcatct caagccaggc ctcgagctac ttcattgacg 600 ctgccacagt caacgacagt ggagagtaca ggtgccagac aaacctctcc accctcagtg 660 acccggtgca gctagaagtc catatcggct ggctgttgct ccaggcccct cggtgggtgt 720 tcaaggagga agaccctatt cacctgaggt gtcacagctg gaagaacact gctctgcata 780 aggtcacata tttacagaat ggcaaagaca ggaagtattt tcatcataat tctgacttcc 840 acattccaaa agccacactc aaagatagcg gctcctactt ctgcaggggg cttgttggga 900 gtaaaaatgt gtcttcagag actgtgaaca tcaccatcac tcaaggtttg gcagtgtcaa 960 ccatctcatc attctctcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc 1020 tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacatttga agctcaacaa 1080 gagactggaa ggaccataaa cttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa tgacccccat 1140 cccatggggg taataagagc agtggcagca gcatctctga acatttctct ggatttgcaa 1200 ccccatcatc ctcaggcctc tctacaagca gcaggaaaca tagaactcag agccagatcc 1260 tttatccaac tctcgatttt tccttggtct ccagtggaag ggaaaagccc atgatcttca 1320 agcagggaag ccccagtgag tagctgcatt cctagaaatt gaagtttcag agctacacaa 1380 acactttttc tgtcccaacc attccctcac agcaaagcaa caatacaggc tagggatggt 1440 aatcctttaa acatacaaaa attgctcgta ttataaatta cccagtttag agggaaaaaa 1500 agaaaataat tattcctaaa caaatggata agtagaatta atggttgagg caggacccta 1560 cagagtgtgg gaactgctgg ggatctagag aattcagtgg gaccaatgaa agcatggctg 1620 agaaatagca gggtagtcca ggatagtcta agggaggtgt tcccatctga gcccagagat 1680 aagggtgtct tcctagaaca ttagccgtag tggaattaac aggaaatcat gagggtgacg 1740 tagaattgag tcttccaggg gactctatca gaactggacc atttccaagt atataacgat 1800 gagtcctcta atgctaggag tagaaaatgg tcctaggaag gggactgagg attggggtgg 1860 gggtggggtg gaaaagaaag tacagaacaa accctgtgtc actgtctcaa gttaagctaa 1920 gtgaacagaa ctatctcagc atcagaatga gaaagcctga gaagaaagaa ccaaccagaa 1980 gcacacagga aggaaagcgc aggaggtgaa aatgctttct tggccggggt agtaagaatt 2040 agaggttaat gcagggactg taaaaccacc ttttctgctt caatgtctag ttcctgtata 2100 gctttgttca ttgcatttat taaacaaatg ttgtataacc aatactaaat gtactactga 2160 gcttcactga gttacgctgt gaaactttca aatccttctt catgtcagtt ccaatgaggt 2220 ggggatggag aagacaattg ttgcttatga aagaaagctt tagctgtctc tgttttgtaa 2280 gctttcagtg caacatttct tggttccaat aaagcatttt acaagatctt gcatgctact 2340 cttagataga agatggcaaa accatggtaa taaaatatga atgataaaaa aaaa 2394 <210> 6 <211> 2148 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aggctgacag accagcccag atccagtggc ccggaggggc ctgagctaaa tccgcaggac 60 ctgggtaaca cgaggaaggg ctccggatat ctttggtgac ttgtccactc cagtgtggca 120 tcatgtggca gctgctcctc ccaactgctc tgctacttct agtttcagct ggcatgcgga 180 ctgaagatct cccaaaggct gtggtgttcc tggagcctca atggtacagc gtgcttgaga 240 aggacagtgt gactctgaag tgccagggag cctactcccc tgaggacaat tccacacagt 300 ggtttcacaa tgagaacctc atctcaagcc aggcctcgag ctacttcatt gacgctgcca 360 cagtcaacga cagtggagag tacaggtgcc agacaaacct ctccaccctc agtgacccgg 420 tgcagctaga agtccatatc ggctggctgt tgctccaggc ccctcggtgg gtgttcaagg 480 aggaagaccc tattcacctg aggtgtcaca gctggaagaa cactgctctg cataaggtca 540 catatttaca gaatggcaaa gacaggaagt attttcatca taattctgac ttccacattc 600 caaaagccac actcaaagat agcggctcct 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tcatgagggt gacgtagaat 1500 tgagtcttcc aggggactct atcagaactg gaccatttcc aagtatataa cgatgagtcc 1560 tctaatgcta ggagtagaaa atggtcctag gaaggggact gaggattggg gtgggggtgg 1620 ggtggaaaag aaagtacaga acaaaccctg tgtcactgtc tcaagttaag ctaagtgaac 1680 agaactatct cagcatcaga atgagaaagc ctgagaagaa agaaccaacc agaagcacac 1740 aggaaggaaa gcgcaggagg tgaaaatgct ttcttggccg gggtagtaag aattagaggt 1800 taatgcaggg actgtaaaac caccttttct gcttcaatgt ctagttcctg tatagctttg 1860 ttcattgcat ttattaaaca aatgttgtat aaccaatact aaatgtacta ctgagcttca 1920 ctgagttacg ctgtgaaact ttcaaatcct tcttcatgtc agttccaatg aggtggggat 1980 ggagaagaca attgttgctt atgaaagaaa gctttagctg tctctgtttt gtaagctttc 2040 agtgcaacat ttcttggttc caataaagca ttttacaaga tcttgcatgc tactcttaga 2100 tagaagatgg caaaaccatg gtaataaaat atgaatgata aaaaaaaa 2148 <210> 7 <211> 2391 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 attcttggtg ctgggtggat ctaaatccag gagatggggg caagcatcct gggaaagctg 60 agggcacact ctggcagatt ctgtgtgtgt cctcagatgc tcagccgcag acctttggga 120 gagtaaaggg 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<213> Homo sapiens <400> 14 Met Leu Arg Glu Arg Thr Val Arg Leu Gln Tyr Gly Ser Arg Val Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Val Leu Gly Thr Tyr Leu Trp Thr Asp Val Tyr Ser Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Gly Ala Gln Thr Phe Ser Leu Lys His Ser Glu His Val 35 40 45 Trp Val Glu Val Val Arg Asp Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Asn 50 55 60 Gly Lys Gln Arg Trp Leu Leu Ser Pro Ser Thr Thr Leu Arg Val Thr 65 70 75 80 Met Ser Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ser Ser Asp Lys Val Thr Val Asn 85 90 95 Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Ser Ile Pro Ile Asp Gln Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Leu Thr Ala Ile Glu Ile Ser Leu Asp Val Asp Ala Asp Arg Asp Gly 115 120 125 Val Val Glu Lys Asn Asn Pro Lys Lys Ala Ser Trp Thr Trp Gly Pro 130 135 140 Glu Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Glu Thr Pro 145 150 155 160 Trp Leu Pro Lys Glu Asp Cys Arg Asp Glu Lys Val Tyr Ser Lys Glu 165 170 175 Asp Leu Lys Asp Met Ser Gln Met Ile Leu Arg Thr Lys Gly Pro Asp 180 185 190 Arg Leu Pro Ala Gly Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Ile Ser Met Ser Asp 195 200 205 Ser Asp Lys Val Gly Val Phe Tyr Val Glu Asn Pro Phe Phe Gly Gln 210 215 220 Arg Tyr Ile His Ile Leu Gly Arg Arg Lys Leu Tyr His Val Val Lys 225 230 235 240 Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Glu Leu Leu Phe Phe Val Glu Gly Leu Cys 245 250 255 Phe Pro Asp Glu Gly Phe Ser Gly Leu Val Ser Ile His Val Ser Leu 260 265 270 Leu Glu Tyr Met Ala Gln Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ile Phe Thr Asp 275 280 285 Thr Val Ile Phe Arg Ile Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Ile Leu 290 295 300 Pro Pro Val Ser Val Phe Val Cys Cys Met Lys Asp Asn Tyr Leu Phe 305 310 315 320 Leu Lys Glu Val Lys Asn Leu Val Glu Lys Thr Asn Cys Glu Leu Lys 325 330 335 Val Cys Phe Gln Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu 340 345 350 Ile Glu Phe Gly Tyr Ile Glu Ala Pro His Lys Gly Phe Pro Val Val 355 360 365 Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu 370 375 380 Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu 385 390 395 400 Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro 405 410 415 Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly 420 425 430 Ser Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gly Arg Arg Met Thr Lys Val Val Arg 435 440 445 Asp Phe Leu Lys Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Tyr Ser 450 455 460 Asp Trp Leu Thr Val Gly His Val Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Pro 465 470 475 480 Ile Pro Gly Thr Lys Lys Phe Leu Leu Leu Met Ala Ser Thr Ser Ala 485 490 495 Cys Tyr Lys Leu Phe Arg Glu Lys Gln Lys Asp Gly His Gly Glu Ala 500 505 510 Ile Met Phe Lys Gly Leu Gly Gly Met Ser Ser Lys Arg Ile Thr Ile 515 520 525 Asn Lys Ile Leu Ser Asn Glu Ser Leu Val Gln Glu Asn Leu Tyr Phe 530 535 540 Gln Arg Cys Leu Asp Trp Asn Arg Asp Ile Leu Lys Lys Glu Leu Gly 545 550 555 560 Leu Thr Glu Gln Asp Ile Ile Asp Leu Pro Ala Leu Phe Lys Met Asp 565 570 575 Glu Asp His Arg Ala Arg Ala Phe Phe Pro Asn Met Val Asn Met Ile 580 585 590 Val Leu Asp Lys Asp Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Gln Val 595 600 605 Glu Glu Glu Cys Cys Leu Glu Met His Val Arg Gly Leu Leu Glu Pro 610 615 620 Leu Gly Leu Glu Cys Thr Phe Ile Asp Asp Ile Ser Ala Tyr His Lys 625 630 635 640 Phe Leu Gly Glu Val His Cys Gly Thr Asn Val Arg Arg Lys Pro Phe 645 650 655 Thr Phe Lys Trp Trp His Met Val Pro 660 665 <210> 15 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His 1 5 10 15 Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr 20 25 30 Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met 35 40 45 Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys 50 55 60 Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro 65 70 75 80 Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile 85 90 95 Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala 100 105 110 Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg 115 120 125 Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg 130 135 140 Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His 145 150 155 160 Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp 165 170 175 Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala 180 185 190 Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn 195 <210> 16 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gly Gly Gly Thr Gly Glu Arg Leu Phe Thr Pro Ser Cys Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Pro Leu Gly Leu Arg Ile Ser Leu Val Thr Cys Pro Leu 20 25 30 Gln Cys Gly Ile Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu 35 40 45 Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val 50 55 60 Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr 65 70 75 80 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp 85 90 95 Phe His Asn Glu Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile 100 105 110 Asp Ala Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn 115 120 125 Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp 130 135 140 Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile 145 150 155 160 His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr 165 170 175 Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp 180 185 190 Phe His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys 195 200 205 Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile 210 215 220 Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro 225 230 235 240 Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala 245 250 255 Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 260 265 <210> 17 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230 <210> 18 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Gly Gly Gly Thr Gly Glu Arg Leu Phe Thr Pro Ser Cys Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Pro Leu Gly Leu Arg Ile Ser Leu Val Thr Cys Pro Leu 20 25 30 Gln Cys Gly Ile Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu 35 40 45 Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe 50 55 60 Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu 65 70 75 80 Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe 85 90 95 His Asn Glu Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp 100 105 110 Ala Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu 115 120 125 Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu 130 135 140 Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His 145 150 155 160 Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr 165 170 175 Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe 180 185 190 His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg 195 200 205 Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr 210 215 220 Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro 225 230 235 240 Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val 245 250 255 Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 260 265 <210> 19 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln 1 5 10 15 Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly 20 25 30 Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Asn 35 40 45 Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val 50 55 60 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser 65 70 75 80 Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala 85 90 95 Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His 100 105 110 Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly 115 120 125 Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly 145 150 155 160 Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly 165 170 175 Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val 180 185 190 Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu 195 200 205 Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 210 215 <210> 20 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln 1 5 10 15 Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly 20 25 30 Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Asn 35 40 45 Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val 50 55 60 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser 65 70 75 80 Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met 100 105 110 Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr 115 120 125 Asn Ile 130 <210> 21 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Asp Ala Leu Gln Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ala Val Asp Leu Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Cys Glu Lys Glu Pro Leu Gly Asn Val Leu Phe Ser Pro 20 25 30 Ile Cys Leu Ser Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gln Val Gly Ala Lys Gly 35 40 45 Asp Thr Ala Asn Glu Ile Gly Gln Val Leu His Phe Glu Asn Val Lys 50 55 60 Asp Val Pro Phe Gly Phe Gln Thr Val Thr Ser Asp Val Asn Lys Leu 65 70 75 80 Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Tyr Val Asp Lys 85 90 95 Ser Leu Asn Leu Ser Thr Glu Phe Ile Ser Ser Thr Lys Arg Pro Tyr 100 105 110 Ala Lys Glu Leu Glu Thr Val Asp Phe Lys Asp Lys Leu Glu Glu Thr 115 120 125 Lys Gly Gln Ile Asn Asn Ser Ile Lys Asp Leu Thr Asp Gly His Phe 130 135 140 Glu Asn Ile Leu Ala Asp Asn Ser Val Asn Asp Gln Thr Lys Ile Leu 145 150 155 160 Val Val Asn Ala Ala Tyr Phe Val Gly Lys Trp Met Lys Lys Phe Ser 165 170 175 Glu Ser Glu Thr Lys Glu Cys Pro Phe Arg Val Asn Lys Thr Asp Thr 180 185 190 Lys Pro Val Gln Met Met Asn Met Glu Ala Thr Phe Cys Met Gly Asn 195 200 205 Ile Asp Ser Ile Asn Cys Lys Ile Ile Glu Leu Pro Phe Gln Asn Lys 210 215 220 His Leu Ser Met Phe Ile Leu Leu Pro Lys Asp Val Glu Asp Glu Ser 225 230 235 240 Thr Gly Leu Glu Lys Ile Glu Lys Gln Leu Asn Ser Glu Ser Leu Ser 245 250 255 Gln Trp Thr Asn Pro Ser Thr Met Ala Asn Ala Lys Val Lys Leu Ser 260 265 270 Ile Pro Lys Phe Lys Val Glu Lys Met Ile Asp Pro Lys Ala Cys Leu 275 280 285 Glu Asn Leu Gly Leu Lys His Ile Phe Ser Glu Asp Thr Ser Asp Phe 290 295 300 Ser Gly Met Ser Glu Thr Lys Gly Val Ala Leu Ser Asn Val Ile His 305 310 315 320 Lys Val Cys Leu Glu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Asp Ser Ile Glu Val 325 330 335 Pro Gly Ala Arg Ile Leu Gln His Lys Asp Glu Leu Asn Ala Asp His 340 345 350 Pro Phe Ile Tyr Ile Ile Arg His Asn Lys Thr Arg Asn Ile Ile Phe 355 360 365 Phe Gly Lys Phe Cys Ser Pro 370 375 <210> 22 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ile Asp Asp Thr Cys Ser Ser 50 55 60 Phe Leu Ser Ile Asp Ser Gln Pro Gln Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp 85 90 95 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln 100 105 110 Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Ser Ser Val Val His Pro Leu Leu 115 120 125 Gln Leu Val Pro His Leu His Glu Arg Arg Met Lys Arg Phe Arg Val 130 135 140 Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg Ser Ala Gly Phe Ile 165 170 <210> 23 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu 50 55 60 Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln 85 90 95 Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Ser Ser Val Val His Pro Leu Leu 100 105 110 Gln Leu Val Pro His Leu His Glu Arg Arg Met Lys Arg Phe Arg Val 115 120 125 Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe 130 135 140 Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg Ser Ala Gly Phe Ile 145 150 155 <210> 24 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys 20 25 30 Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro 35 40 45 Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ile Asp Asp Thr Cys Ser Ser 50 55 60 Phe Leu Ser Ile Asp Ser Gln Pro Gln Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp 85 90 95 Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln 100 105 110 Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala 115 120 125 Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg 130 135 140 Ser Ala Gly Phe Ile 145 <210> 25 <211> 1626 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 cgcacctgct gcaggtgctc ccggccgccc cggaccagcg agcgcgggca ctgcggcggg 60 gaggatgctg cgcgagcgga ccgtgcggct gcagtacggg agccgcgtgg aggcggtgta 120 cgtgctgggc acctacctct ggaccgatgt ctacagcgcg gccccagccg gggcccaaac 180 cttcagcctg aagcactcgg aacacgtgtg ggtggaggtg gtgcgtgatg gggaggctga 240 ggaggtggcc accaatggca agcagcgctg gcttctctcg cccagcacca ccctgcgggt 300 caccatgagc caggcgagca ccgaggccag cagtgacaag gtcaccgtca actactatga 360 cgaggaaggg agcattccca tcgaccaggc ggggctcttc ctcacagcca ttgagatctc 420 cctggatgtg gacgcagacc gggatggtgt ggtggagaag aacaacccaa agaaggcatc 480 ctggacctgg ggccccgagg gccagggggc catcctgctg gtgaactgtg accgagagac 540 accctggttg cccaaggagg actgccgtga tgagaaggtc tacagcaagg aagatctcaa 600 ggacatgtcc cagatgatcc tgcggaccaa aggccccgac cgcctccccg ccggatacga 660 gatagttctg tacatttcca tgtcagactc agacaaagtg ggcgtgttct acgtggagaa 720 cccgttcttc ggccaacgct atatccacat cctgggccgg cggaagctct accatgtggt 780 caagtacacg ggtggctccg cggagctgct gttcttcgtg gaaggcctct gtttccccga 840 cgagggcttc tcaggcctgg tctccatcca tgtcagcctg ctggagtaca tggcccagga 900 cattcccctg actcccatct tcacggacac cgtgatattc cggattgctc cgtggatcat 960 gacccccaac atcctgcctc ccgtgtcggt gtttgtgtgc tgcatgaagg ataattacct 1020 gttcctgaaa gaggtgaaga accttgtgga gaaaaccaac tgtgagctga aggtctgctt 1080 ccagtaccta aaccgaggcg atcgctggat ccaggatgaa attgagtttg gctacatcga 1140 ggccccccat aaaggcttcc ccgtggtgct ggactctccc cgagatggaa acctaaagga 1200 cttccctgtg aaggagctcc tgggcccaga ttttggctac gtgacccggg agcccctctt 1260 tgagtctgtc accagccttg actcatttgg aaacctggag gtcagtcccc cagtgaccgt 1320 gaatggcaag acatacccgc ttggccgcat cctcatcggg agcagctttc ctctgtaaga 1380 gaagccaggc tggggctagg ggctgtggga gtggggaagt cactgtttct cttttggggt 1440 ggcctgggtt gctcacacat ggagcaagtg gctgggggaa ttattccctc ccacgacttc 1500 ctgttaagag gccgacactc ttggaaagaa aatcaagcta gcctttatat ctttgtgtga 1560 tttaggatct aatatataac taaataaaca actcttttcc ccaagtgaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaa 1626 <210> 26 <211> 437 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Leu Arg Glu Arg Thr Val Arg Leu Gln Tyr Gly Ser Arg Val Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Val Leu Gly Thr Tyr Leu Trp Thr Asp Val Tyr Ser Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Gly Ala Gln Thr Phe Ser Leu Lys His Ser Glu His Val 35 40 45 Trp Val Glu Val Val Arg Asp Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Asn 50 55 60 Gly Lys Gln Arg Trp Leu Leu Ser Pro Ser Thr Thr Leu Arg Val Thr 65 70 75 80 Met Ser Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ser Ser Asp Lys Val Thr Val Asn 85 90 95 Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Ser Ile Pro Ile Asp Gln Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Leu Thr Ala Ile Glu Ile Ser Leu Asp Val Asp Ala Asp Arg Asp Gly 115 120 125 Val Val Glu Lys Asn Asn Pro Lys Lys Ala Ser Trp Thr Trp Gly Pro 130 135 140 Glu Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Glu Thr Pro 145 150 155 160 Trp Leu Pro Lys Glu Asp Cys Arg Asp Glu Lys Val Tyr Ser Lys Glu 165 170 175 Asp Leu Lys Asp Met Ser Gln Met Ile Leu Arg Thr Lys Gly Pro Asp 180 185 190 Arg Leu Pro Ala Gly Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Ile Ser Met Ser Asp 195 200 205 Ser Asp Lys Val Gly Val Phe Tyr Val Glu Asn Pro Phe Phe Gly Gln 210 215 220 Arg Tyr Ile His Ile Leu Gly Arg Arg Lys Leu Tyr His Val Val Lys 225 230 235 240 Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Glu Leu Leu Phe Phe Val Glu Gly Leu Cys 245 250 255 Phe Pro Asp Glu Gly Phe Ser Gly Leu Val Ser Ile His Val Ser Leu 260 265 270 Leu Glu Tyr Met Ala Gln Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ile Phe Thr Asp 275 280 285 Thr Val Ile Phe Arg Ile Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Ile Leu 290 295 300 Pro Pro Val Ser Val Phe Val Cys Cys Met Lys Asp Asn Tyr Leu Phe 305 310 315 320 Leu Lys Glu Val Lys Asn Leu Val Glu Lys Thr Asn Cys Glu Leu Lys 325 330 335 Val Cys Phe Gln Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu 340 345 350 Ile Glu Phe Gly Tyr Ile Glu Ala Pro His Lys Gly Phe Pro Val Val 355 360 365 Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu 370 375 380 Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu 385 390 395 400 Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro 405 410 415 Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly 420 425 430 Ser Ser Phe Pro Leu 435

Claims (21)

  1. PADI2 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 위암은 초기 위암인 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 초기 위암은 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 PADI2 단백질은 서열번호 14의 서열을 포함하는 것이고, 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것이고,
    상기 APOBEC3A 단백질은 서열번호 15의 서열을 포함하는 것이고, 상기 APOBEC3A 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3, 서열번호 3에서 171 내지 770번의 서열, 서열번호 4 및 서열번호 4에서 171 내지 716번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고,
    상기 FCGR3B 단백질은 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 FCGR3B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 5, 서열번호 5에서 261 내지 1070번의 서열, 서열번호 6, 서열번호 6에서 123번 내지 824번의 서열, 서열번호 7, 서열번호 7에서 261번 내지 1067번의 서열, 서열번호 8, 서열번호 8에서 286번 내지 936번의 서열, 서열번호 9 및 서열번호 9에서 286번 내지 678번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고,
    상기 SERPINB5 단백질은 서열번호 21의 서열을 포함하는 것이고, 상기 SERPINB5 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 10 또는 서열번호 10에서 143번 내지 1270번의 서열을 포함하는 것이고,
    상기 NMU 단백질은 서열번호 22 내지 24 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 NMU 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11, 서열번호 11에서 107번 내지 631번의 서열, 서열번호 12, 서열번호 12에서 107번 내지 583번의 서열, 서열번호 13 및 서열번호 13에서 107번 내지 556번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약을 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단리된 세포핵에 포함된 PADI2 단백질은 서열번호 14의 서열 중 1 내지 437번의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 단리된 세포핵에 포함된 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 25 또는 서열번호 25에서 65번 내지 1378번의 서열을 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
  9. 청구항 1의 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트.
  10. 전이성 위암 진단의 정보를 제공하기 위하여,
    개체로부터 분리된 시료에 PADI2 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 복합체로부터 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 측정된 PADI2 유전자의 발현량을 PADI2 유전자의 표준 발현량과 각각 비교하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 시료는 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직인 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직 각각으로부터 측정된 PADI2 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 시료에서 상기 시료로부터 세포 핵을 단리시키는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, PADI2 유전자 발현량의 경우, 비교된 PADI2의 발현량이 3배 이상 높은 경우, 상기 개체의 위암은 전이될 확률이 높을 것으로 결정하는 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  16. 청구항 10에 있어서, 상기 개체는 초기 위암에 걸린 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 초기 위암은 TNM 단계 시스템 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  18. 청구항 10에 있어서, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 복합체로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  19. 청구항 10에 있어서, 상기 발현량 측정은 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  20. 청구항 10에 있어서, 상기 발현량 측정은 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
  21. 청구항 10에 있어서, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
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