KR102158009B1 - 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 마커로서의 14-3-3γ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 마커로서의 14-3-3γ의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 마커로서의 14-3-3γ의 용도{Use of 14-3-3 gamma as attention deficit/hyperactivity disorder(ADHD) diagnostic marker}

본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 마커로서의 14-3-3γ의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물에 관한 것이다.

주의력 결핍/과잉행동장애(ADHD, Attention Deficit/Hyperactivity Disorder)는 지속적 주의력, 집중력과 더불어 업무완성 능력이 떨어질 뿐 아니라, 과활성과 충동성 등의 증상을 특징으로 한다. 학령기 어린이의 경우 약 10%정도로 추정되고 있으며, 학업성취도나 학교생활, 특히 교우관계에 부적절한 적응을 보인다. 성인의 경우에도, 초조함과 성급함등 인간관계유지의 어려움 등 직업적으로나 사회생활에 부적응을 보인다.

주의력 결핍/과잉행동장애의 원인들로는 저체중출생, 두부손상, 뇌감염, 철분결핍, 폐색성 수면 무호흡, 납중독, 마약 및 담배의 노출(부모에 의한)등이 관여하는 것으로 알려지고 있으며, 유전적인 소인도 기인한다.

과민함과 과대행동 등의 증상을 보이는 정신질환의 발병기전에 대한 연구지식과 이해가 아직 불명확한 상황이며, 따라서 현재 임상적으로 사용되는 증상완화제나 치료제들의 작용기전들이 정확치 않다.

주의력 결핍/과잉행동장애 환자의 뇌조직은 전전두엽 피질 (prefrontal cortex), 후두정피질 (posterior parietal cortex)의 두께가 얇아보인다는 뇌 형태 구조적 연구와 더불어, 전전두엽 피질에서 줄무늬체 (striatum), 시상(thalamus), 소뇌(cerebellum)로 연결되는 뇌 회로의 기능적 이상이 중요한 것으로 알려지고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0047985호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 14-3-3γ의 감소가 ADHD 의 발병과 연관이 있음을 확인함에 따라, 14-3-3γ를 ADHD 진단을 위한 마커로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, ADHD 치료제를 스크리닝할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 14-3-3γ의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 주의력 결핍/과잉행동장애 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및 b) 시료 내 14-3-3γ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ의 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 14-3-3γ의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 14-3-3γ mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 14-3-3γ의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 방법은

(a) 피검체의 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 14-3-3γ 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 14-3-3γ 발현 수준이 감소한 피검체를 주의력 결핍/과잉행동장애에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 14-3-3γ 발현 수준 측정은 14-3-3γ 단백질 또는 14-3-3γ 코딩 유전자 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 수준 측정은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 사우던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한 본 발명은 a) 주의력 결핍/과잉행동장애 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및 b) 시료 내 14-3-3γ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애를 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물, 주의력 결핍/과잉행동장애 진단 방법 및 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명으로 주의력 결핍/과잉행동장애의 진단이 가능할 것으로 기대되며, 본 발명의 마커인 14-3-3γ의 발현 및 활성을 조절하여 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 14-3-3γ KO 마우스의 표적 부위의 서열을 분석한 도이다.
도 1a는 14-3-3γ KO 마우스에 대한 유전자 - 트랩 전략의 게놈 일러스트이다. pU-21W 트랩 벡터의 구성은 다음과 같다: EN2- 인트론, 1.2kb의 마우스 En2 인트론 1; EN2-SA, 마우스 En2 엑손 2의 스플라이스 수용체; β-geo, β-galactosidase; pA1, SV40 폴리아데닐화 시그널; pA2, 마우스 PGK 유전자 폴리아데닐화 시그널; FRT, FLP 재조합 효소 표적 서열.
도 1b는 트랜스제닉 영역 및 예측된 단백질 서열의 RT-PCR로부터의 mRNA 서열의 정렬을 나타낸다.
도 1c는 WT가 14-3-3γ 9 개의 α 헬리컬 도메인을 갖고, 트랜스제닉 마우스의 돌연변이 14-3-3γ가 3 개의 N 말단 도메인(A ~ C)만을 갖는다는 것을 보여주는 지도이다.
도 2는 14-3-3γ KO 마우스를 확인한 도이다.
도 2a는 14-3-3γ KO 마우스의 게놈 일러스트를 나타낸다. 트랩 벡터 pU-21W를 ywhag의 엑손 2에 삽입 하였다. 엑손 2 (흑색 및 청색 화살표) 및 트랩 벡터용 프라이머 (적색 화살표)용으로 설계된 2 개의 PCR 프라이머를 유전자형 결정에 사용하였다.
도 2b는 14-3-3γ WT, 이형 접합체(heterozygote) 및 동형 접합체(homozygote) KO 마우스로부터 제조된 게놈 DNA의 유전자형 분석 결과이다.
도 2c 왼쪽은 특정 14-3-3γ 항체를 사용하여 14-3-3γ WT, 이형 접합체 및 동형 접합체 KO 마우스로부터 P0에서 제조된 뇌 균질물의 웨스턴 블랏 결과이다. 도 2c 오른쪽은 뇌의 14-3-3γ 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2d는 14-3-3γ Het 및 WT 마우스의 β-gal 염색 결과이다(눈금 막대 : 1 mm).
도 3은 14-3-3γ Het 마우스의 무게 및 크기를 확인하였다.
도 3a는 14-3-3γ Het 번식 쌍에서 태어난 P21에서 새끼의 생존율을 보여주는 요약 막대 그래프이다.
도 3b는 P21에서 태어난 14-3-3γ Het 번식 쌍에서 태어난 새끼의 체중을 보여주는 요약 막대 그래프이다.
도 3c는 P21에서 14-3-3γ WT 및 Het 마우스의 사진 이미지이다.
도 3d 왼쪽은 특정 14-3-3γ 항체를 사용하여 14-3-3γ WT 및 Het 성인 쥐로부터 제조된 뇌 균질물의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3d 오른쪽은 14-3-3γ의 발현 수준을 보여주는 요약 막대 그래프이다.
도 3e는 행동 실험에 사용된 14-3-3γ WT 및 Het 마우스의 체중을 보여주는 요약 그래프이다.
도 4a는 중심 구역에서 이동한 거리로 정량화된 오픈 필드 테스트(OFT)에서의 운동 활동 결과이다.
도 4b는 OFT에서의 운동 활동 결과이다. 총 이동 거리로 정량화되었다.
도 4c는 OFT의 평균 이동 속도이다.
도 4d는 가속화된 로타로드 테스트에서의 대기 시간 측정 결과이다(n = 8 마우스/genotype, * p <0.05, n.s. 통계적으로 유의하지 않음).
도 5는 14-3-3γ Het 마우스가 사회적 결함 없이 우울증 같은 행동을 확인하였다.
도 5a는 FST에서 움직이지 않는 시간을 측정한 결과이다.
도 5b는 3CT 결과이다(n = 8 마우스/genotype, * p <0.05, ** p <0.01).
도 6은 14-3-3γ Het 마우스에서 급성 스트레스에 대한 반응을 확인한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 OFT에서의 스트레스 반응을 확인한 것으로, 총 이동 거리 (A) 및 평균 속도 (B)를 측정한 결과이다.
도 6c 및 도 6d는 LDB 테스트에서의 스트레스에 대한 반응으로, 라이트 존에서의 총 이동 거리(C) 및 이동 수(D)를 측정한 결과이다
도 6e 및 도 6f는 EPM 테스트에서의 스트레스에 대한 반응으로, 열린 팔에서의 시간 및 열린 팔에서의 총 이동 거리를 측정한 결과이다(n = 8 마우스/genotype, * p <0.05, ** p <0.01).

본 발명은 14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 명세서에서, “14-3-3γ(YWHAG)”는 14-3-3 단백질 family로, 14-3-3 단백질들은 진핵생물에서 어디에서나 발현되는 보존된 세포내 조절 분자들의 집단이다. 14-3-3 단백질들은 키나아제, 포스파타아제 및 막투과 수용체들을 포함하는 여러 기능적으로 다양한 시그널링 단백질들과 결합하는 능력을 가진다. 포유류들에서 발현될 것으로 알려진 14-3-3 단백질들의 7개 뚜렷한 유전적으로 암호화된 아이소형들이 있고, 각각의 아이소형은 242-255개 아미노산을 포함한다. 7개 14-3-3 단백질 아이소형들은 14-3-3 α/β(알파/베타), 14-3-3 δ/ξ(델타/제타), 14-3-3ε(입실론), 14-3-3γ(감마), 14-3-3η(에타), 14-3-3τ/θ(타우/쎄타) 및 14-3-3σ(시그마/스트라핀)로 지정된다.

본 발명자들은, 14-3-3γ 단백질이 주의력 결핍/과잉행동장애 모델에서 비 모델에 비해 뇌 조직에서 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 14-3-3γ의 아미노산 서열을 서열번호 1에, 유전자의 염기서열을 서열번호 2에 나타내었다.

본 명세서에서, “주의력 결핍/과잉행동장애”(ADHD, Attention Deficit/Hyperactivity Disorder)는 과잉행동, 주의력 결핍 및 충동 행동성을 핵심 증상으로 하는 대표적 뇌발달 장애 질환으로 소아부터 성인까지 지속적인 치료가 요구되는 질환이다. ADHD 환자는 핵심 증상에 수반하는 학습장애, 품행장애, 우울증, 수면장애 등의 정신과적 장애를 동반한다.

본 발명에서, “발현(expression)”은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.

본 발명에서, “진단”이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 진단은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 주의력 결핍/과잉행동장애의 진행 또는 발병을 예측/확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 주의력 결핍/과잉행동장애의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

본 발명의 진단용 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.

상기 14-3-3γ의 mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 상기 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지 (Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 14-3-3γ mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

한편, 본 발명에서 상기 14-3-3γ의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 14-3-3γ에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 14-3-3γ 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.

본 발명에서 용어 ‘앱타머’는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질(본 발명에서는 14-3-3γ 단백질)에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 14-3-3γ 단백질 특이적인 항체를 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 14-3-3γ 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.

본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한, 본 발명은 14-3-3γ의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단용 키트에는 14-3-3γ 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 14-3-3γ mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

분석을 위해 사용되는 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 소변 및 뇌척수액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 주의력 결핍/과잉행동장애 특이적 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변으로부터 측정될 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.

또한, 본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 (a) 피검체의 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 14-3-3γ 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 14-3-3γ 발현 수준이 감소한 피검체를 주의력 결핍/과잉행동장애에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘분석’은 바람직하게 ‘측정’을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.

상기 시료는 주의력 결핍/과잉행동장애의 발병 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료(체액 시료)를 사용하는 것일 수 있으며, 일례로 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 소변 및 뇌척수액을 사용하는 것일 수 있다. 본 발명은 주의력 결핍/과잉행동장애가 발생된 직접적 뇌 병변조직 외의 체액시료(일례로, 혈장)를 통해 진단이 가능하여, 진단의 효용성, 신속성, 편이성 및 안전성 등이 증가된다는 점에서 기술적 의의가 크다. 본 발명 에서 상기 시료는 가장 바람직하게는 조직, 특히 뇌 조직일 수 있다.

상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 사우던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상술한 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체 시료의 14-3-3γ 발현 수준(유전자 또는 단백질 수준을 모두 포함)을, 동일한 방법으로 측정한 정상인 시료의 14-3-3γ 발현 수준과 비교한다. 이때 상기 시료는 피검체와 정상인 간에 동일한 종류 또는 동일한 방법에 의해 수득된 시료인 것이 바람직하다. 14-3-3γ의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 감소한 피검체를 주의력 결핍/과잉행동장애에 걸린 것으로 판정한다.

또한, 본 발명은 a) 주의력 결핍/과잉행동장애 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및

b) 시료 내 14-3-3γ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서 14-3-3γ mRNA 또는 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 14-3-3γ mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 증가시키는 물질은 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제로서 선택할 수 있다.

즉, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료 후보 물질의 부존재 하에 인간을 제외한 포유동물로부터 수득한 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 또한 주의력 결핍/과잉행동장애 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 주의력 결핍/과잉행동장애 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 증가시키는 물질을 주의력 결핍/과잉행동장애 치료제로 선택할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험동물

14-3-3γ 유전자인 YWHAG를 제거한 유전자변형 마우스의 동결난자를 일본 구마모토 대학으로부터 구입하여 대리모 대리모 마우스의 자궁에 주입함으로써 14-3-3γ KO 마우스를 제작하였다. 14-3-3γ KO 마우스의 전체 염색체 유전자 서열분석을 통해 14-3-3γ 유전자의 exon2 내부에 LacZ-Neo gene cassette이 삽입되어 있음을 확인하였다 (도 1a 참조). 14-3-3γKO 마우스의 변형된 유전체로부터 만들어지는 14-3-3γKO 의 mRNA를 분석하여 Exon1, Exon2 앞부분, gene trap에 사용된 pU-21W 염기서열을 확인하였다 (도 1b 참조). 변형된 14-3-3γKO 의 mRNA로부터 만들어지는 단백질을 예측한 결과, 14-3-3γ 단백질의 A와 B helical domain을 가지고 있으며 C helical domain의 끝 부분에서 절단되는 14-3-3γ돌연변이 단백질이 만들어지는 것으로 예측되었다 (도 1c).

실시예 2. 유전형( Genotyping ) 분석

ywhag KO (-/+ 및 -/-) 마우스를 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 유전자형을 결정하고, littermate ywhag (+/+) 마우스를 대조군으로 사용 하였다. 다음의 프라이머를 사용하였다: ywhag 공통 포워드 프라이머 - 5'-TCATCAGCAGCATCGAGCAG-3'(서열번호 3); ywhag WT 리버스 프라이머 - 5'-ATGGCGTCGTCGAAGGC-3'(서열번호 4); 및 ywhag KO 리버스 프라이머 - 5'-AGGGGTCTCTTTGTCAGGGT-3'(서열번호 5).

PCR 프로토콜은 95℃ (10분), 이어서 95℃ (30초) 35주기, 58℃ (30초) 72℃ (30초) 및 72℃ (5분)로 진행되었다. PCR 산물은 TAE 완충액에서 1% 아가로즈 겔 전기영동을 사용하여 검사하였다.

이렇게 만들어진 heterozygote 14-3-3γ KO 마우스 암수쌍으로부터 막 태어난 (P0) 마우스의 꼬리조직을 녹여 PCR 실험을 통해 유전형 (genotyping)을 분석하여 wild type (WT), heterozygote (Het) (+/-), homozygote (-/-) KO 마우스들이 태어남을 확인하였다(도 2a 및 2b 참조).

실시예 3. 웨스턴블롯팅(Western blotting)

수득된 전체 뇌 조직을 프로테아제 저해제 칵테일(Roche)을 함유하는 RIPA 완충액을 사용하여 용해시키고 항 14-3-3γ 항체 (sc-398423, 1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology) 및 마우스 항 - 액틴 (1 : 2000, Sigma Aldrich)을 사용하여 웨스턴블롯을 수행하였다.

신호는 적절한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 결합 2차 항체(1 : 3000, Jackson ImmunoResearch)로 프로빙한 후 향상된 화학 발광제(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 사용하여 검출하였다. 각 실험은 3 개의 독립적인 그룹의 샘플로 수행되었다.

P0 마우스들의 뇌를 파쇄하여 단백질을 추출한 후, 14-3-3γ 단백질 특이적 항체를 이용한 Western bloting 실험을 수행하여, homozygote KO에서는 14-3-3γ 단백질이 만들어지지 않고, heterozygote KO에서는 14-3-3γ 단백질의 발현양이 현저히 감소함을 확인하였다 (도 2c 및 2d).

LacZ 유전자 삽입을 통한 KO 제작기법임으로 adult heterozygote KO 마우스의 뇌절편조직에서 beta-gal 염색을 통해 LacZ 유전자발현을 확인함과 동시에, 14-3-3γ 유전자가 발현하는 뇌조직 위를 간접적으로 확인하였다 (도 2d).

하지만, 이 14-3-3γ homozygote KO 마우스은 엄마 젓을 떼고 혼자 살아갈 수 있는 3주령이 되는 시점까지는 살아남지 못하고 (도 3a), 3주령에서 몸무게도 WT 대조군에 비해 유의미하게 가볍고(도 3b), 몸크기도 작았다 (도 3c). 5주령 마우스의 뇌 조직에서 추출한 단백질 혼합물에서 14-3-3γ 단백질 양을 비교해보면, 여전히 heterozygote KO에서 14-3-3γ 단백질의 발현양이 감소해있음을 western blotting 기법으로 확인하였다 (도 3d). 이후의 행동실험결과에 14-3-3γ유전자 결손외의 다른 영향들을 최소화하기 위하여, 14-3-3γ heterozygote는 가능한 WT 대조군과의 조합에서 몸 크기 차이가 비슷한 수컷 마우스들을 사용하였다. 행동실험동안 측정한 몸무게 비교 결과 나이가 들어가면서도 그 차이를 유지하는 것으로 보인다(도 3e).

실시예 4. 행동실험

동물들은 테스트 전에 일주일 동안 행동 실험 룸에 적응하였다. 10주령 마우스를 이용하여 행동 검사를 시작했다. 모든 행동 분석(n = 유전자형 당 8 개)에 대해 한 코호트(cohort)의 마우스를 사용했다. 행동 테스트의 순서는 스트레스가 적은 것(예 : 오픈 필드 테스트)에서 좀 더 스트레스가 많은 테스트(예 : 강제 수영 테스트)로 진행되며 2 ~ 3 일 간격으로 분석하였다.

실시예 4-1. 오픈필드 테스트

오픈필드 테스트(open field test, OFT)에서 오픈 필드 장치는 바닥에서 2.5m 높이에 매달려있는 전구를 사용하여 30cm 높이의 벽으로 된 사각형 무대 (40 × 40cm)로 구성되었다. 마우스의 오픈 필드 행동을 기록하고 ANY-미로 시스템(Stoelting, Wood Dale, IL)을 사용하여 분석하였다. 동물을 오픈된 피드에 10 분 동안 노출시켰다. 피험자 사이에서 상자를 70 % 에탄올로 완전히 세척하고 마우스를 시험하기 전에 에탄올을 완전히 증발시켰다.

실시예 4-2. EPM 테스트(Elevated Plus Maze test)

EPM 검사 장치는 두 개의 열린 팔과 + 기호 방향으로 배열된 두 개의 닫힌 팔로 구성된다. 팔은 바닥에서 50cm 높이로 올려졌고, 5cm 너비의 팔은 가운데에서 30cm 돌출되어 있다. 시험 시작시 각 피험자는 닫힌 팔을 향한 EPM의 중앙에 위치시켰다. 마우스는 5분 동안 미로를 탐험하고 열린 팔 및 닫힌 팔 모두에서 탐험 활동을 기록하고 ANY 미로 시스템(Stoelting, Wood Dale, IL)을 사용하여 분석하였다. 피험자 사이에서 상자를 70 % 에탄올로 완전히 세척하고 마우스를 시험하기 전에 에탄올을 완전히 증발시켰다.

실시예 4-3. 명암 박스 테스트(Light and dark box test)

명암박스 테스트 장치는 2개의 챔버(밝은 색 및 어두운 색)(34 × 24 × 24 cm)가 서로 결합되어 구성되었다. 마우스가 챔버 사이를 이동하는 데 사용할 수 있는 두 개의 챔버 사이에 구멍 (8 × 8cm)이있다. 챔버는 흰색과 검은 색 불투명 한 플렉시 유리로 만들어졌다. 검은 챔버는 검은 뚜껑(어두운 상자)으로 덮여 있었고 하얀 챔버는 투명한 뚜껑으로 덮여 ~450 럭스(라이트 박스)까지 주위의 실내 조명을 사용하여 조명되었다. 검사 도중 두 개의 챔버를 연결하는 구멍에서 멀어지는 방향으로 라이트 박스의 중앙에 피험자(마우스)를 놓고 5분 동안 두 챔버를 자유롭게 탐색 할 수 있게 하였다. 피험자 사이에서 상자를 70 % 에탄올로 완전히 세척하고 마우스를 시험하기 전에 에탄올을 완전히 증발시켰다. ANY-maze 시스템을 사용하여 모든 세션을 기록하고 분석했다.(Stoelting, Wood Dale, IL).

실시예 4-4. 사회적 상호작용 테스트(Social interaction test)

마우스는 2 개의 동일한 크기의 말단 영역 (각각 31.5 × 25.5 cm)과 그 사이의 중립 섹션 (10.5 × 25.5 cm)을 포함하는 3 개의 챔버로 분할된 플렉시유리 (Plexiglas) 케이지에서 시험하였다. 요법 단계 동안, 최종 영역에는 빈 "보유 세포"(직경 10.16 cm 및 높이 13.97 cm)가 포함된다. 각 마우스를 상자 중앙에 놓고 5 분 동안 전체 상자를 탐색할 수 있게 하였다. 다른 성체 수컷 (C57BL / 6 WT 마우스)을 홀딩 셀(무작위로 선택된 면) 아래에 놓고 빈 셀을 반대편에 놓은 상태에서 대상을 케이지로 되돌려 놓았다. 시험 단계에서 피험자는 센터에 배치되어 5 분 동안 전체 상자를 조사할 수 있었다. ANY-maze 시스템은 각면에 들어가는 입구 수와 새로운 마우스를 조사하는 데 소비 한 시간을 기록하여 점수를 매겼다. 조사는 시험 마우스의 코가 새로운 마우스를 바를 통과하거나 1cm 이내에 스니핑(sniffing)하는 것으로 정의되었다. 피험자 사이에서 상자를 70 % 에탄올로 완전히 세척하고 마우스를 시험하기 전에 에탄올을 완전히 증발시켰다.

실시예 4-5. 로타로드 테스트(Rotarod test)

로타로드 테스트는 각 그룹에서 동물의 기본 이동성을 평가하기 위해 수행되었다. 동물이 적어도 60 초 동안 4 rpm으로 회전하는 막대 위에 머무를 수 있으면 로타로드 테스트를 받게 된다. 마우스를 300초에 걸쳐 4 내지 40 rpm의 가속 속도로 회전하는 로드 상에 위치시켰다. 동물이 막대에서 떨어지기 전의 시간은 최대 300초의 컷오프로 기록되었다. 마우스를 최소 5 분 간격으로 8 회 연속 시험했다. 지난 4 번의 실험에서 얻은 데이터는 평균 대기 시간으로 나타났다. 각 마우스는 원래 케이지로 돌아가고 다음 테스트 전에 5 분 동안 그대로 있었다. 쥐가 5 분 이상 막대에 남아 있다면, 300 초로 기록된다. 피험자 사이에서 장치를 70 % 에탄올로 완전히 세척하고 마우스를 시험하기 전에 에탄올을 완전히 증발시켰다.

실시예 4-6. 급성 스트레스(restraint stress)

마우스는 행동 테스트 및 생리학적 표현형을 유도하기 위해 각 행동 테스트 전에 구속 스트레스를 받았다. 호흡하기 위해 코를 노출시켜 개방된 끝이 있는 50 ml 원추형 관을 사용하여 각 마우스를 구속하였다. 이러한 급성 스트레스를 1 시간 동안 가했고 각 마우스는 스트레스를 억제한 직후에 우리로 되돌려졌다.

실시예 4-7. 통계 분석

모든 통계 분석은 Windows 용 GraphPad Prism 버전 5.00을 사용하여 수행되었다. 수치 데이터는 평균 ± 평균 표준 오차 (SEM)로 나타냈다. 그래프의 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 데이터의 통계적 유의성은 unpaired 또는 paired Student 's t-test를 사용하여 유의 수준을 별표로 표시하여 평가했다(* p <0.05, ** p <0.01, 또는 *** p <0.001).

실시예. 4-8. 행동 시험 결과

기본적인 운동능력을 확인하기 위한 오픈 필드 테스트에서 14-3-3γ Het KO 마우스는 WT 대조군에 비해 더 먼 거리를 움직인 것으로 보이며 (도 4a and 4b), 평균 움직이는 속도가 큰 것을 확인할 수 있었다 (도 4c). 이런 움직임의 차이가 14-3-3γ Het KO 근육강도나 균형 조절능력 등에 의한 차이가 아님을 Rotarod test를 통해 확인하였다 (도 4d). 이상의 행동실험결과는 14-3-3γ Het KO 마우스가 과도하게 활동적 (hyperactive) 임을 보여준다.

오픈 필드 테스트 결과는 Het KO 마우스에서 14-3-3γ 단백질의 감소가 과도한 활동성과 관련되어 있음을 보여주었기에, 14-3-3γ Het KO 마우스가 감정관련 행동 (mood-related behaviors)에 영향을 주는지를 확인하기 위하여 forced swim test와 3-mber social interaction test를 수행하였다. 그 결과, 14-3-3γ Het KO 마우스는 forced swim test에서 WT 대조군 마우스에 비해 보다 긴 움직이지 않는 시간을 보임으로서 우울증적 증상을 보임을 확인하였다 (도 5a).

그러나, 3 chamber test(3CT) 를 통해서 14-3-3γ Het KO 마우스는 다른 쥐들과의 사회적 관계형성에는 이상이 없는 것을 확인하였다 (도 4b).

과도한 흥분과 우울증 증상은 몇몇 신경정신병을 가진 환자에서 자주 관찰된다. 이런 환자들은 종종 단기 스트레스에 대한 적절한 반응성이 결여되어 있기에, 구속 스트레스를 14-3-3γ Het KO에 가한 후, open field test (OFT), light and dark box (LDB) test , elevated plus maze (EPM) test를 수행하였다.

오픈 필드 테스트 실험에서 WT 마우스 대조군은 단기 스트레스에 의해 유의미한 변화를 보이지 않는 반면에 14-3-3γ Het KO 마우스의 과도한 활동성 (총 이동거리 및 평균속도)이 단기 스트레스에 의해 현격하게 감소함을 확인하였다 (도 6a 및 6b). LDB test에서는 단기 스트레스에 의해 14-3-3γ Het KO 마우스가 불이 켜진 지역에서 이동한 총거리와 불이 켜진 지역으로 드나든 횟수가 WT 마우스 대조군에 비해 현격히 증가함을 확인하였다 (도 6c 및 6d). EPM test에서도 14-3-3γ Het KO 마우스군이 WT 마우스 대조군에 비해, 단기 스트레스 하에서 오픈된 끝 지역에서 머문 시간이 증가할 뿐 아니라, 오픈된 지역에서의 총 이동거리가 현격히 증가함을 확인하였다 (도 6e 및 6f)

종합하면, 14-3-3γ의 감소가 ADHD 의 발병과 연관이 있음을 확인함에 따라, 14-3-3γ를 ADHD 진단을 위한 마커로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, ADHD 치료제를 스크리닝할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Korea University Research and Business Foundation KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION OF SEJONG UNIVERSITY <120> Use of 14-3-3 gamma as attention deficit/hyperactivity disorder(ADHD) diagnostic marker <130> MP19-112 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma <400> 1 Met Val Asp Arg Glu Gln Leu Val Gln Lys Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Asn Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Ala Val 85 90 95 Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala 130 135 140 Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala His Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu His Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys His Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Asp 225 230 235 240 Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn 245 <210> 2 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma <400> 2 atggtggacc gcgagcaact ggtgcagaaa gcccggctgg ccgagcaggc ggagcgctac 60 gacgacatgg ccgcggccat gaagaacgtg acagagctga atgagccact gtcgaatgag 120 gaacgaaacc ttctgtctgt ggcctacaag aacgttgtgg gggcacgccg ctcttcctgg 180 agggtcatca gtagcattga gcagaagaca tctgcagacg gcaatgagaa gaagattgag 240 atggtccgtg cgtaccggga gaagatagag aaggagttgg aggctgtgtg ccaggatgtg 300 ctgagcctgc tggataacta cctgatcaag aattgcagcg agacccagta cgagagcaaa 360 gtgttctacc tgaagatgaa aggggactac taccgctacc tggctgaagt ggccaccgga 420 gagaaaaggg cgacggtggt ggagtcctcc gagaaggcct acagcgaagc ccacgagatc 480 agcaaagagc acatgcagcc cacccacccc atccgattag gcctggctct taactactcc 540 gtcttctact atgagatcca gaacgcccca gagcaagcgt gccacttggc caagaccgcg 600 ttcgacgacg ccatcgccga gcttgacacc ctcaacgagg actcctacaa ggactccacg 660 ctcatcatgc agctcctccg cgacaacctc acgctctgga cgagcgacca gcaggacgac 720 gatggcggcg aaggcaacaa ttaa 744 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma forward primer <400> 3 tcatcagcag catcgagcag 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma WT reverse primer <400> 4 atggcgtcgt cgaaggc 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma KO reverse primer <400> 5 aggggtctct ttgtcagggt 20

Claims (13)

14-3-3γ 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 주의력 결핍/과잉행동장애 발병 예측용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 14-3-3γ의 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 14-3-3γ의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.

제1항에 있어서,
상기 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.

14-3-3γ의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 주의력 결핍/과잉행동장애 발병 예측용 키트.

주의력 결핍/과잉행동장애 발병 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 정성 또는 정량 분석하는 방법.

제7항에 있어서, 상기 방법은
(a) 피검체의 시료로부터 14-3-3γ 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 14-3-3γ 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 14-3-3γ 발현 수준이 감소한 피검체를 주의력 결핍/과잉행동장애에 걸릴 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

제7항에 있어서,
상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.

제7항에 있어서,
상기 14-3-3γ 발현 수준은 14-3-3γ 단백질 또는 14-3-3γ 코딩 유전자 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 방법.

제8항에 있어서,
상기 측정은 14-3-3γ 단백질 발현 수준을 측정하는 것으로,
웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정된 것을 특징으로 하는 방법.

제8항에 있어서,
상기 측정은 14-3-3γ 코딩 유전자 발현 수준을 측정하는 것으로,
PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 사우던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정된 것 특징으로 하는 방법.

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