CN108753790A - 与bavm相关的基因标志物及其突变 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与BAVM相关的基因标志物及其突变，所述基因标志物为PITPNM3。本发明首次发现了位于PITPNM3上的新突变c.274C>T，通过斑马鱼实验进一步证明了PITPNM3与BAVM的发生发展相关，提示PITPNM3可用于BAVM的临床诊断。

Description

与BAVM相关的基因标志物及其突变
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及与BAVM相关的基因标志物及其突变，所述基因为PITPNM3。
背景技术
脑动静脉畸形(brain arteriovenous malformations,BAVM)是青少年自发性脑出血的主要病因，占总出血性卒中的2％(Horton JC.Arteriovenous malformations ofthe brain.N Engl J Med,2007；357(17):1774-1775.)。其结构包括异常血管迂曲缠绕而成的畸形血管团、终末供血动脉及引流静脉。BAVM的主要临床表现还有癫痫和局灶性神经功能障碍，病死率则与脑出血有关。BAVM自发性脑出血经常反复发作，并且随着出血次数的增多，症状和体征可逐步加重，乃至威胁生命。据统计，由BAVM引起的死亡率约为10％-15％，永久性重残率约为20％-30％。
而随着我国医疗事业总体水平的不断提高，DSA和MRI等先进的影像学诊断技术已逐步得到普及，客观上极大地促进了临床上BAVM病例的有效检出，尤其是一些无症状患者。
在治疗方面，虽然大部分BAVM可以通过手术切除、介入栓塞或立体定向放疗得到治愈，但是根据Spetzler和史玉泉分级法，畸形血管团直径>3cm，病灶位于功能区，或具有深部引流静脉的高分级BAVM仍然具有巨大的治疗风险，手术后神经功能障碍的发生率很高，栓塞及放射治疗的效果不理想。目前业已发现BAVM病灶可呈现动态变化的趋势：病灶体积可逐步增大，供血动脉和引流静脉会出现形态和数量上的变化，出现伴发的动脉瘤等等(Arteriovenous malformations of the brain in adults.NJ Med[J],1999,340(23):1812-1818.)。此类BAVM若能早期发现，其病理分级可能较低，易于治疗；同时由于绝大部分BAVM患者平时无症状，只有在出血之后才得以被发现，或在寻找癫痫或长期顽固性头痛的病因的过程中被偶然发现，这种隐匿特性，构成了对生命健康的潜在威胁。上述两点均对BAVM的早期发现、早期治疗提出了现实的要求。由于目前临床上用于确诊BAVM的脑血管造影或核磁共振的费用较高，难以用于BAVM病例的大规模筛检，寻找一种简便、价廉的BAVM早期诊断工具，同时可为人群罹患BAVM的概率提供风险评估，是广大医学研究人员努力的方向。因此，探究其病因学机制以求达到一级预防和控制出血等严重并发症引起的病理生理改变成为BAVM研究的热点。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与BAVM相关的基因及其突变体，从而为BAVM的诊断提供新的手段。
本发明的目的之二在于提供一种BAVM模型及其构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种PITPNM3的核苷酸序列，与SEQ ID NO.1相比，所述核苷酸在274位上存在突变，所述突变为c.274C>T。
进一步，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二方面提供了一种突变的PITPNM3蛋白，所述蛋白由本发明第一方面所述的核苷酸序列编码，该蛋白的氨基酸序列在第92位上由Arg变为Ter，即终止密码子。
本发明的第三方面提供了一种检测BAVM的试剂盒，所述试剂盒包括PITPNM3的检测试剂。
进一步，所述试剂选自：
检测PITPNM3表达水平的试剂；或
检测PITPNM3基因第274位核苷酸位点的试剂；或
检测PITPNM3蛋白第92位氨基酸位点的试剂。
进一步，所述试剂包括进一步，特异性识别PITPNM3基因的探针，或特异性扩增PITPNM3基因的引物，或特异性结合PITPNM3蛋白的抗体或配体。
本发明的第四方面提供了一种检测PITPNM3基因突变体的试剂盒，所述试剂盒包括与本发明第一面所述的核苷酸序列互补的核酸探针或扩增本发明第一面所述的核苷酸序列的引物。
本发明的第五方面提供了一种BAVM模型的构建方法，向培养体系施用PITPNM3抑制剂，其中所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
进一步，所述培养体系为动物体系，优选的，所述动物为斑马鱼。
进一步，所述PITPNM3抑制剂为反义寡核苷酸。
优选的，所述反义寡核苷酸为吗啉反义寡核苷酸。
更为优选的，所述吗啉反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述斑马鱼胚胎为单细胞期至二细胞期的胚胎。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的核苷酸在制备诊断BAVM的产品中的应用；
b.本发明第二方面所述的蛋白在制备诊断BAVM的产品中的应用；
c.PITPNM3在制备诊断BAVM的产品中的应用；
d.本发明第四方面所述的试剂盒在制备诊断BAVM的产品中的应用；
e.使用本发明第五方面所述方法构建的BAVM模型在筛选治疗BAVM的候选药物中的应用；
f.PITPNM3在制备治疗BAVM的药物中的应用。
进一步，c中所述的产品包括检测PITPNM3的试剂，所述试剂是检测PITPNM3表达水平的试剂；或是检测其突变位点和突变体的试剂；
e中，若施用待筛选物质后，培养体系的BAVM的症状缓解，则该待筛选物质是治疗BAVM的候选药物。
f中所述的药物包括PITPNM3的促进剂，优选的，所述促进剂为含有PITPNM3 mRNA的表达载体。
本发明的有益效果和优点：
本发明首次发现了PITPNM3的突变与BAVM相关，通过检测PITPNM3的特定位点是否发生突变可以判断患者是否患有BAVM。
本发明首次发现了PITPNM3的表达水平与BAVM相关，通过检测PITPNM3的表达水平可以判断患者是否患有BAVM。
本发明提供了一种构建BAVM模型的方法，为临床上BAVM的研究以及药物的筛选提供了新的手段。
附图说明
图1是携带PITPNM3突变的患者的Sanger测序验证以及临床影像学诊断；其中，图Asanger测序图，图B临床影像学诊断图。
图2是斑马鱼脑血管的共聚焦显微镜荧光图。
图3是斑马鱼突变体的BAVM样表型模式图。
图4是斑马鱼突变体的生长和RT-PCR验证图；其中图A是生长图，图B是吗啉反义寡核苷酸的作用位点和上下游引物的结合位点图；图C是突变体的RT-PCR验证图。
图5是斑马鱼BAVM表型数量统计图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，利用全外显子组测序，通过核心家系与散发病例以及健康人群的对比研究，从病因学和基因学角度对BAVM的出血风险、发展转归进行预测，有助于实现早期精准、个体化治疗。同时，为复杂多基因脑血管先天性疾病的病因学研究提供了新方法和经验。
在本发明中，术语“外显子”一词是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法对基因及其编码的蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。
检测PITPNM3表达水平的方法包括(但不限于)：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、原位杂交(ISH)、微阵列、Southern或Northern印迹、夹心ELISA、放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。如本文所用，“检测基因的表达水平”指确定生物样品中标记基因的mRNA存在及其表达水平以便预测BAVM的过程并且通过测量mRNA的量可实现。用于此目的分析方法是但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR(competitiveRT-PCR)、实时RT-PCR(Real-timeRTPCR)、RNA酶保护测定法(RPA；RNaseprotectionassay)、northern印迹法(northernblotting)、DNA微阵列芯片等。
检测基因突变或蛋白突变的方法包括(但不限于)：PCR-SSCP法、异源双链分析法、变性梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶链反应、等位基因特异性扩增法、直接测序法。
在本发明中，任何合适的测定平台均可用于确定样品中mRNA的存在。例如，测定可以呈试纸条(dipstick)、膜(membrane)、芯片(chip)、盘(disk)、测试条(test strip)、滤器(filter)、微球(microsphere)、载片(slide)、多孔板(multiwell plate)或光纤(opticalfiber)的形式。测定系统可以具有其上附着有与mRNA对应的核酸的固相支持物。所述固相支持物可包含例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物(precipitate)、凝胶、聚合物、薄片(sheet)、球、多糖、毛细管、胶片(film)、板或载片。所述测定组件可以制备后包装在一起作为用于检测mRNA的试剂盒。
通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNAISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
作为一种可选择的实施方式，本发明的试剂盒包括用于扩增PITPNM3的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。
作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。
在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。
根据本发明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一种。
免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法；这种方法测量沉淀物的量，在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。
在颗粒免疫测定中，多种抗体与该颗粒连接，且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。
在免疫比浊法(immunonephelometry)中，抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成，所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是，这些复合物将散射入射光，这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。
放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线，通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较，RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因，在常规临床实验室实践中，RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。
酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度，且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体，其一对于靶抗原是特异性的，而另一与酶偶联，酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。
荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定，所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此，FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。
化学发光免疫测定使用化学发光标记，当其被化学能激发时产生光；使用光检测器测量发射。
因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。
术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。
DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤：
提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段，并且所述核酸片段具有平末端；
在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。
对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。
在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
术语“外显子捕获”，“芯片杂交”可互换使用，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。
DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。
在本发明中，PITPNM3的抑制剂是指任何可降低PITPNM3蛋白的活性、降低PITPNM3基因或蛋白的稳定性、下调PITPNM3蛋白的表达、减少PITPNM3蛋白有效作用时间、或抑制PITPNM3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调PITPNM3蛋白或其编码基因的表达。
其中核酸抑制物选自：以PITPNM3或其转录本为靶序列、且能够抑制PITPNM3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与PITPNM3蛋白特异性结合的物质，如能够抑制PITPNM3蛋白活性的抗体或配体。
作为本发明的一种选择方式，所述的PITPNM3的抑制剂是一种特异性与PITPNM3结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PITPNM3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
作为本发明的一种可选择的实施方式，所述PITPNM3的抑制剂是一种PITPNM3特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
作为本发明的一种可选方式，所述的PITPNM3的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
作为本发明的一种优选的实施方式，所述PITPNM3的抑制剂为一种反义寡核苷酸，反义寡核苷酸是指与体内某RNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响转录或翻译过程的RNA或DNA片段。更为优选的，所述的抑制剂为吗啉反义寡核苷酸，吗啉反义寡核苷酸(morpholinooligomers，即MO)因其核苷酸骨架上的吗啉环而得名，吗啉环取代了RNA中的核糖核苷酸环或者DNA中的脱氧核糖核苷酸环。吗啉反义寡核苷酸是一种新型反义寡核苷酸，能抑制细胞内mRNA的剪接过程，从而抑制基因的表达；同时具有良好的稳定性、溶解度和细胞渗透性。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选与BAVM相关的基因
1、样品收集
收集了2015年11月至2016年11月期间在北京天坛医院被确诊为BAVM的患者123名(患者及其生物学父母血液被留取，患者+生物学父母＝核心家系)。脑动静脉畸形(BAVM)的诊断通过数字减影血管造影(DSA)、磁共振成像/血管摄影或计算机断层摄影证实，所有的父母都进行了体格检查以排除严重的血管问题。
排除标准为：(1)已知的遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagictelangiectasis，HHT)、毛细血管性畸形-AVM(Capillary malformation-arteriovenousmalformation syndrome，CM-AVM)、Sturge-Weber综合征或其他孟德尔遗传血管疾病；或(2)不完整的临床数据。
经排除之后，符合标准的有100名，患者及其临床表型正常的生物学父母均进行了WES。
本研究经北京天坛医院伦理委员会批准。患者或其父母签署知情同意。斑马鱼实验经北京大学动物保护和应用委员会(IACUC)批准。
2、全外显子测序及突变注释
1)提取DNA
使用Axygen的血基因组DNA提取试剂盒提取患者及父母外周血全基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计进行DNA定量检测。
2)构建DNA文库
采用超声打断仪(Covaris s2，Massachusetts，USA)将基因组DNA随机打断成主带200-300bp的片段，取500ng提纯的DNA片段进行末端修复并连接上标记性接头，构建DNA测序文库。按照illumina标准建库方法进行3步酶促反应：通过末端修复，加“A”和连接Illumina测序接头(通过PCR反应，将一个8bp的barcode连接至DNA片段上)，形成样本文库。
3)外显子捕获
使用SureSelect Human All Exon V6+UTR r2core design(91Mb,Agilent)完成外显子捕获，具体操作参见使用说明。
4)测序及分析
使用Illumina HiSeq 4000平台进行测序，使用Genome Analysis Toolkit 3.4.0以及HaplotypeCaller检测SNP位点和插入缺失标记，采用PUMCH进行注释，新发突变、复合杂合突变和隐形遗传突变运用Gemini(version 0.19.1)来计算。利用生物信息学预测工具预测候选变异的保守性和致病性。所有变异均对比公用数据库1000Genomes Project(http://www.internationalgenome.org/),Exome variant server,NHLBI GO ExomeSequencing Project(ESP)(http://evs.gs.washington.edu/EVS/),和ExomeAggregation Consortium(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org/)，筛选致病性的变异。
3、结果
结果显示，与参考转录本(NM_031220.3)相比，患者的PITPNM3基因出现了突变c.274C>T(p.Arg92Ter)。
实施例2 使用sanger测序对突变位点进行验证
1、将从患者和父母获得的基因组DNA，并使用Axygen-AP-GX-50套件试剂盒进行纯化，在ABI3730测序仪上进行Sanger测序。
2、结果
结果如图1所示，测序结果显示，患者中的PITPNM3第274位的核苷酸由C变成了T。
实施例3 斑马鱼验证
1、斑马鱼品系
利用Tg(kdrl.4:mCherry)pku6转基因斑马鱼进行实验其体内mCherry红色荧光的表达是由kdrl.4(一种内皮细胞特异性基因)调控。斑马鱼和胚胎按照标准进行培育。为了避免真菌感染，胚胎在0.5g/L亚甲基蓝中进行孵化。1-苯基2-硫脲(0.003％)被用来抑制色素生成。
2、体外转录和胚胎注射
为了体内验证针对斑马鱼同源的PITPNM3的设计了反义吗啉反义寡核苷酸，MO1(针对外显子5-内含子5的剪切区)，MO2(针对AUG位点)，具体序列如下：
MO1：5'-AAAGTCGCTTACTTACTTTGACACA-3'(SEQ ID NO.3)
MO2：5'-CCCTCTGGTCTCTTTAGCCATCCTG-3'(SEQ ID NO.4)
对照MO：5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(SEQ ID NO.5)
将基因敲低试剂Morpholino 5ng注射入斑马鱼胚胎单细胞期至二细胞期的细胞。
3、荧光观察
将48h的斑马鱼使用镊子剥去卵膜，使用Tricane麻醉。将胚胎在低熔点胶中固定，使用共聚焦显微镜进行拍照，由两位研究者使用盲法评估斑马鱼脑血管表型。
4、RNA提取
使用Trizol法提取24h胚胎的总RNA，将组织或细胞匀浆后，加入1.5ml离心管。加入0.2倍相同体积的氯仿，振荡混匀30s。室温离心15000g 3min。将上清液转移到另一干净离心管中。在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均30s。室温离心15000g5min，RNA沉淀将在离心底的侧面形成，小心吸弃上清液。清洗：在含RNA沉淀的离心管中加入1ml 75％乙醇,振荡器上振荡混均30s。室温15000g离心1min。小心吸弃上清液。重复清洗步骤。将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。
5、逆转录
将RNA产物使用OneScript Reverse Transcriptase kit试剂盒进行逆转录，将逆转录产物进行PCR扩增。引物序列如下：
PITPNM3的引物序列如下：
正向引物：5’-ATGGGACACATCGACCAAACA-3’(SEQ ID NO.6)
反向引物：5’-TTGCGACGGCATCTTGGTAG-3’(SEQ ID NO.7)
PCR反应条件：94℃2min，(94℃30s，60℃30s，72℃1.5min)×25～30个循环
6、统计分析
所有的实验进行至少三次重复，利用SPSS 15.0软件进行统计分析。有统计学意义的定义为P<0.05。利用t检验分析斑马鱼表型比例数据。
7、结果
斑马鱼脑血管的免疫荧光分析显示一系列BAVM特征：(1)异常的后循环连接血管节段(posterior connecting segments，PCS)延伸并与靠近基底交通动脉(basalcommunicating artery，BCA)的原始后脑通道(the primordial hidbrain channel，PHBC)融合，形成了半月形畸形表现；(2)BCA和PCS扩张；(3)大脑前动脉的发育不良(图2)。
进一步验证PITPNM3基因及其突变的功能，PITPNM3突变体(PITPNM3敲低的斑马鱼)的头部、心周出现了不同程度的水肿(图4A)，而RT-PCR图，可见被截断了约218bp的PITPNM3转录本(图4C)。
对BAVM表型的斑马鱼进行数量统计，发现PITPNM3敲除组相比对照组，BAVM的斑马鱼数量显著增加(图5)，说明PITPNM3与BAVM的发生发展相关。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京市神经外科研究所
中国医学科学院北京协和医院
<120> 与BAVM相关的基因标志物及其突变
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2925
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggccaagg cgggccgtgc aggtggtcct cccccgggcg gcggtgcccc ctggcacctt 60
cgaaatgtcc tcagtgactc tgtggagagc tcagatgatg aattctttga tgccagagag 120
gagatggctg aagggaagaa tgccatcctc attgggatga gccagtggaa ctccaatgac 180
ctcgtggagc agatcgagac catggggaaa ctggacgagc atcaaggaga agggaccgcg 240
ccgtgcacat ccagcatcct ccaggagaag cagcgagaac tgtaccgggt ttccttgaga 300
agacagaggt tcccagccca gggaagcatc gagatccacg aagacagcga ggaaggctgc 360
ccgcagcgct cctgcaagac acatgtcctc ctgctggtcc tgcatggggg aaacatcctg 420
gacacgggtg ccggggaccc gtcctgcaag gcagccgaca tccacacctt cagctccgtg 480
ctggagaagg tcacacgagc ccatttccct gctgccctgg gccacatcct catcaagttc 540
gtcccctgtc ctgccatctg ctctgaggct ttctcgcttg tctctcacct gaacccctac 600
agccacgatg agggctgcct cagcagcagc caggaccacg tccctctggc cgcccttccc 660
ctgttggcca tctcctcccc gcagtaccag gatgctgtcg ccaccgtcat cgagcgagcc 720
aaccaggtct acagagagtt cctgaagtcc tctgatggga ttggcttcag tgggcaggtg 780
tgtctcatcg gggactgtgt ggggggcctc ctggccttcg atgccatctg ctacagtgcg 840
gggccctcag gggacagccc tgccagcagc agccggaagg ggagcatcag cagcacccag 900
gacaccccag tcgcggtgga ggaagattgc agcctggcca gcagcaagcg tctcagcaaa 960
agcaacattg acatctccag tgggttggag gatgaggagc ccaagaggcc gttgccgcgg 1020
aaacagagcg actcctccac ctatgactgc gaggccatca cccagcacca tgccttcctc 1080
tcaagcatcc actccagcgt gctaaaggat gagtctgaga ccccggcggc tggggggccg 1140
cagctccctg aggtcagcct gggccgcttt gacttcgatg tgtccgactt cttcctcttc 1200
ggctcgccac tgggcctggt cctggccatg cggaggacgg tgctgcctgg gctggacggc 1260
ttccaggtgc gtcctgcctg cagccaggtc tacagcttct tccattgcgc agacccctct 1320
gcctcacggc tcgagccact gctggagccc aagttccacc tggtgccgcc tgtcagcgtg 1380
cctcgctacc agaggttccc actgggcgat gggcagtccc tcctcctcgc tgatgcccta 1440
cacacccaca gccccctctt cctggagggc agctcccggg acagcccgcc acttctggat 1500
gcccctgcct cgccccctca ggcctcgagg ttccagcgcc caggacggag gatgagcgag 1560
gggagctccc acagcgagag ctcggagtcc tcggacagca tggcacccgt gggtgcctcc 1620
cgcatcacag ccaagtggtg gggaagcaag aggatcgact atgccctgta ctgccctgat 1680
gtcctcacgg ccttccccac cgtggccctg ccccacctct tccacgccag ttactgggag 1740
tccacagacg tggtggcctt catcctgaga caggtaatgc gctatgagag cgtgaacatc 1800
aaggaaagcg cccgcctgga ccctgcagca ctgagtcctg ccaacccccg ggagaagtgg 1860
cttcgtaagc ggactcaggt caagctgagg aatgtcacgg ctaatcaccg ggccaatgat 1920
gtgattgctg ctgaagatgg cccccaggtc ctggtggggc ggttcatgta cgggcccctc 1980
gacatggtgg ctctgactgg agagaaggtg gacatcctag taatggcaga gccatcctca 2040
ggccgctggg tacacctgga cacagagatc accaacagca gtggtcgcat cacatacaat 2100
gtgccgcggc cccggcgcct gggggttggt gtctatcctg tgaagatggt cgtcaggggc 2160
gaccagacct gtgccatgag ctacctcacg gtgttgccca ggggcatgga gtgtgtagtg 2220
ttcagcattg atgggtcctt cgcggccagc gtgtctatca tgggaagcga ccccaaggtc 2280
cggccgggtg cagtggatgt tgtccggcac tggcaggact tgggctacat gatcctttac 2340
atcacgggac ggccggacat gcagaagcag cgggtggtgt cgtggctgtc ccagcacaac 2400
ttcccacagg gcatgatctt cttctccgat gggctggtgc atgacccgct gcggcagaag 2460
gccatcttcc tgcgcaacct catgcaggag tgcttcatca aaatcagtgc ggcctatggc 2520
tccacgaagg acatctctgt ctacagcgtg ctgggcctgc ctgcctccca gatcttcatt 2580
gtgggccggc ccaccaagaa gtaccaaacc cagtgccagt tcctgagcga gggctacgcc 2640
gcacacctgg ccgcgctgga ggccagccac cgctcacgcc caaagaagaa caactcgcgc 2700
atgatcctgc gcaagggcag cttcgggctg cacgcgcagc cagagttcct gcggaagcgc 2760
aaccacctgc gcagaaccat gtcagtgcag cagcccgacc cgcccgccgc caaccccaag 2820
cccgagcggg cccagagcca gcccgagtcg gacaaagacc acgagcggcc gctgccggcg 2880
ctcagctggg cgcgtgggcc ccccaagttc gagtcggtgc cctga 2925
<210> 2
<211> 2925
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggccaagg cgggccgtgc aggtggtcct cccccgggcg gcggtgcccc ctggcacctt 60
cgaaatgtcc tcagtgactc tgtggagagc tcagatgatg aattctttga tgccagagag 120
gagatggctg aagggaagaa tgccatcctc attgggatga gccagtggaa ctccaatgac 180
ctcgtggagc agatcgagac catggggaaa ctggacgagc atcaaggaga agggaccgcg 240
ccgtgcacat ccagcatcct ccaggagaag cagtgagaac tgtaccgggt ttccttgaga 300
agacagaggt tcccagccca gggaagcatc gagatccacg aagacagcga ggaaggctgc 360
ccgcagcgct cctgcaagac acatgtcctc ctgctggtcc tgcatggggg aaacatcctg 420
gacacgggtg ccggggaccc gtcctgcaag gcagccgaca tccacacctt cagctccgtg 480
ctggagaagg tcacacgagc ccatttccct gctgccctgg gccacatcct catcaagttc 540
gtcccctgtc ctgccatctg ctctgaggct ttctcgcttg tctctcacct gaacccctac 600
agccacgatg agggctgcct cagcagcagc caggaccacg tccctctggc cgcccttccc 660
ctgttggcca tctcctcccc gcagtaccag gatgctgtcg ccaccgtcat cgagcgagcc 720
aaccaggtct acagagagtt cctgaagtcc tctgatggga ttggcttcag tgggcaggtg 780
tgtctcatcg gggactgtgt ggggggcctc ctggccttcg atgccatctg ctacagtgcg 840
gggccctcag gggacagccc tgccagcagc agccggaagg ggagcatcag cagcacccag 900
gacaccccag tcgcggtgga ggaagattgc agcctggcca gcagcaagcg tctcagcaaa 960
agcaacattg acatctccag tgggttggag gatgaggagc ccaagaggcc gttgccgcgg 1020
aaacagagcg actcctccac ctatgactgc gaggccatca cccagcacca tgccttcctc 1080
tcaagcatcc actccagcgt gctaaaggat gagtctgaga ccccggcggc tggggggccg 1140
cagctccctg aggtcagcct gggccgcttt gacttcgatg tgtccgactt cttcctcttc 1200
ggctcgccac tgggcctggt cctggccatg cggaggacgg tgctgcctgg gctggacggc 1260
ttccaggtgc gtcctgcctg cagccaggtc tacagcttct tccattgcgc agacccctct 1320
gcctcacggc tcgagccact gctggagccc aagttccacc tggtgccgcc tgtcagcgtg 1380
cctcgctacc agaggttccc actgggcgat gggcagtccc tcctcctcgc tgatgcccta 1440
cacacccaca gccccctctt cctggagggc agctcccggg acagcccgcc acttctggat 1500
gcccctgcct cgccccctca ggcctcgagg ttccagcgcc caggacggag gatgagcgag 1560
gggagctccc acagcgagag ctcggagtcc tcggacagca tggcacccgt gggtgcctcc 1620
cgcatcacag ccaagtggtg gggaagcaag aggatcgact atgccctgta ctgccctgat 1680
gtcctcacgg ccttccccac cgtggccctg ccccacctct tccacgccag ttactgggag 1740
tccacagacg tggtggcctt catcctgaga caggtaatgc gctatgagag cgtgaacatc 1800
aaggaaagcg cccgcctgga ccctgcagca ctgagtcctg ccaacccccg ggagaagtgg 1860
cttcgtaagc ggactcaggt caagctgagg aatgtcacgg ctaatcaccg ggccaatgat 1920
gtgattgctg ctgaagatgg cccccaggtc ctggtggggc ggttcatgta cgggcccctc 1980
gacatggtgg ctctgactgg agagaaggtg gacatcctag taatggcaga gccatcctca 2040
ggccgctggg tacacctgga cacagagatc accaacagca gtggtcgcat cacatacaat 2100
gtgccgcggc cccggcgcct gggggttggt gtctatcctg tgaagatggt cgtcaggggc 2160
gaccagacct gtgccatgag ctacctcacg gtgttgccca ggggcatgga gtgtgtagtg 2220
ttcagcattg atgggtcctt cgcggccagc gtgtctatca tgggaagcga ccccaaggtc 2280
cggccgggtg cagtggatgt tgtccggcac tggcaggact tgggctacat gatcctttac 2340
atcacgggac ggccggacat gcagaagcag cgggtggtgt cgtggctgtc ccagcacaac 2400
ttcccacagg gcatgatctt cttctccgat gggctggtgc atgacccgct gcggcagaag 2460
gccatcttcc tgcgcaacct catgcaggag tgcttcatca aaatcagtgc ggcctatggc 2520
tccacgaagg acatctctgt ctacagcgtg ctgggcctgc ctgcctccca gatcttcatt 2580
gtgggccggc ccaccaagaa gtaccaaacc cagtgccagt tcctgagcga gggctacgcc 2640
gcacacctgg ccgcgctgga ggccagccac cgctcacgcc caaagaagaa caactcgcgc 2700
atgatcctgc gcaagggcag cttcgggctg cacgcgcagc cagagttcct gcggaagcgc 2760
aaccacctgc gcagaaccat gtcagtgcag cagcccgacc cgcccgccgc caaccccaag 2820
cccgagcggg cccagagcca gcccgagtcg gacaaagacc acgagcggcc gctgccggcg 2880
ctcagctggg cgcgtgggcc ccccaagttc gagtcggtgc cctga 2925
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaagtcgctt acttactttg acaca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctctggtc tctttagcca tcctg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctcttacct cagttacaat ttata 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgggacaca tcgaccaaac a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgcgacggc atcttggtag 20

Claims (10)

1.一种PITPNM3的核苷酸，其特征在于，与SEQ ID NO.1相比，所述核苷酸在274位上存在突变，所述突变为c.274C>T。
2.一种突变的PITPNM3蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1所述的核苷酸序列编码。
3.一种检测BAVM的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PITPNM3的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂选自：
检测PITPNM3表达水平的试剂；或
检测PITPNM3基因第274位核苷酸位点的试剂；或
检测PITPNM3蛋白第92位氨基酸位点的试剂。
5.一种检测PITPNM3基因突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与权利要求1所述的核苷酸序列互补的核酸探针或扩增权利要求1所述的核苷酸序列的引物。
6.一种BAVM模型的构建方法，其特征在于，向培养体系施用PITPNM3抑制剂。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述培养体系为动物培养体系，优选的，所述动物为斑马鱼。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述PITPNM3抑制剂为反义寡核苷酸。
9.根据权利要求8所述的构建方法，所述反义寡核苷酸为吗啉反义寡核苷酸，更为优选的，所述吗啉反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.3所示。
10.如下任一项所述的应用：
a.权利要求1所述的核苷酸在制备诊断BAVM的产品中的应用；
b.权利要求2所述的蛋白在制备诊断BAVM的产品中的应用；
c.PITPNM3在制备诊断BAVM的产品中的应用；
d.权利要求5所述的试剂盒在制备诊断BAVM的产品中的应用；
e.使用权利要求6-9任一项所述方法构建的BAVM模型在筛选治疗BAVM的候选药物中的应用；
f.PITPNM3在制备治疗BAVM的药物中的应用。
CN201810598796.3A 2018-06-12 2018-06-12 与bavm相关的基因标志物及其突变 Active CN108753790B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115295074A (zh) * 2022-10-08 2022-11-04 南京世和基因生物技术股份有限公司 基因标志物在恶性肺结节筛查中的应用、筛查模型的构建方法和检测装置

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