WO2004003198A1 - アレルギー性疾患の検査方法、および治療のための薬剤 - Google Patents

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protein
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Ryoichi Hashida
Shinji Kagaya
Yoshihiro Yayoi
Yuji Sugita
Hirohisa Saito
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Genox Research, Inc.
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Definitions

  • the present invention provides a method for testing an allergic disease using the expression of a NOR-1 gene associated with an allergic disease as an index, and a method for screening a therapeutic drug candidate for an allergic disease.
  • the present invention relates to a drug for treating allergic diseases.
  • Allergic diseases such as atopic dermatitis are considered to be multifactorial diseases. These diseases are caused by the interaction of the expression of many different genes, and the expression of these individual genes is affected by several environmental factors. Therefore, it is very difficult to elucidate the specific genes that cause specific diseases.
  • allergic diseases are thought to be related to the expression of mutated or defective genes, or overexpression or decreased expression of specific genes. Understanding the role of gene expression in disease requires an understanding of how genes are involved in efforts and how external stimuli, such as drugs, alter gene expression There is.
  • DD Differen-Chanole display
  • the differential display method was first developed in 1992 by Liang and Pardee (Science, 1992, 257: 967-971). By using this method, dozens of samples or more can be screened at a time and expressed in those samples. It is possible to detect a gene whose expression has changed. Using such methods to examine genes that have been mutated or whose expression changes with time and environment is expected to provide important information for elucidating pathogenic genes. These genes include those whose expression is affected by environmental factors.
  • the leukocyte histamine release test and the lymphocyte blastogenesis test are methods for observing the immune system's response to allergens at low temperatures. These methods are complicated in operation.
  • a method of using the immune response observed when a patient is actually brought into contact with an allergen to diagnose allergens is also known. Prick's tests, scratch tests, patch tests, intradermal reactions, or provocation tests are included in this type of test. While these tests can directly diagnose a patient's allergic reaction, it can be described as a highly invasive test that actually exposes the subject to allergens.
  • test methods have been attempted to prove the involvement of allergic reactions regardless of the allergen.
  • a high serum IgE level may indicate that the patient has an allergic reaction.
  • the serum IgE value is information corresponding to the total amount of allergen-specific IgE. IgE regardless of the type of allergen Determining the total dose is easy, but IgE may be low in patients with diseases such as non-atopic bronchitis.
  • Eosinophil counts and ECP levels are diagnostic parameters associated with delayed or allergic inflammatory responses following type I allergy. Eosinophil numbers are said to reflect the development of allergic symptoms. ECP (eosinophil cationic protein), a protein contained in eosinophil granules, is also strongly activated with asthma attacks. These diagnostic items certainly reflect allergic symptoms. However, the range that can be actually used as a diagnostic index is limited.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to identify a gene associated with an allergic disease. Furthermore, the present invention provides a method for testing an allergic disease using the expression of the gene as an index, a method for screening a candidate compound for a therapeutic drug for an allergic disease, and a drug for treating an allergic disease. The purpose is to do.
  • the present inventors have prepared from a plurality of human blood based on the procedure of the “Fluorescent DD (DD) method” already established (T. Ito et al., 1994, FEBS Lett. 351: 231-236).
  • DD system capable of analyzing RNA samples of leukocyte cells has been developed (Japanese Patent Application No. 11-12048) 9). Using this system, we attempted to identify genes whose expression levels differed specifically for allergic diseases.
  • the present inventors compared some parameters related to allergic symptoms in patients with atopic dermatitis, which is a typical allergic disease, between the exacerbation period and the remission period of skin inflammatory symptoms. did. As a result, a decrease in eosinophils during remission was observed in some patients. In general, eosinophils are regarded as a representative clinical index of atopic dermatitis, and the present inventors have paid attention to this finding. And, if it is possible to isolate genes whose expression levels change in eosinophils between the exacerbation period and remission period of the same patient, it is possible to isolate genes directly involved in atopic dermatitis I thought it would be.
  • eosinophils were collected during the exacerbation period and remission period of atopic dermatitis, and the above system was used to screen for genes whose expression levels change in eosinophils.
  • the sequence “2250-01” showing a significantly higher expression level was successfully isolated in patients in whom eosinophil reduction was observed during remission.
  • NOR-1 nuclear orphan receptor
  • the NOR-1 receptor is an orphan receptor, and no in vivo ligand-activator has been found so far.
  • the present inventors have developed a high-throughput system for searching for a ligand, and have succeeded in obtaining a compound which is considered to have a transcription activation activity of NOR-1 by using this system.
  • the compound is a prostaglandin (PGA derivative) having a pentenone structure in the mouth, and it was considered that it may be an in vivo ligand of the NOR-1 receptor.
  • a PGA derivative is a ligand active substance of NOR-1.
  • the present inventors simulated the binding position of the PGA derivative to the NOR-1 ligand binding region using a pharmacophore model, and found that the PGA derivative matched the binding pocket based on the structure-activity relationship information in the reporter system of the PGA derivative.
  • Compounds other than derivatives were selected from the database. These compounds are expected to function as ligands for the NOR-1 receptor.
  • Compounds that induce the expression of the NOR-1 gene or compounds that bind to the N0R-1 receptor and promote transcriptional activity are expected to have a therapeutic effect on allergic diseases.
  • the present invention relates to a method for detecting an allergic disease using as an index the expression of the N0R-1 gene, which is highly expressed during an allergic disease, particularly during a remission period accompanied by a decrease in eosinophils, and a method for treating an allergic disease. More specifically, the present invention relates to a method for screening a drug candidate compound, and a drug for treating an allergic disease.
  • a reagent for testing an allergic disease comprising a polynucleotide encoding a NOR-1 receptor protein or an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a complementary strand thereof and having a length of at least 15 bases;
  • a polynucleotide encoding a NOR-1 receptor protein (b) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding a NOR-1 receptor protein, wherein the polynucleotide is expressed in eosinophils along with a decrease in eosinophils during the remission of atopic dermatitis.
  • a method for detecting the effect of a candidate compound on the expression level of a polynucleotide encoding a NOR-1 receptor protein comprising the following steps (1) and (2): (1) Contacting a candidate compound with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which the transcription regulatory region of the gene encoding the NOR-1 receptor protein is functionally linked to a reporter gene Process, and
  • (10) a method according to (9), comprising detecting the effect of the candidate conjugate on the activity, and selecting a compound that increases the activity compared to a control, the NOR-1 receptor A method for screening a compound that increases the expression level of a gene encoding a protein,
  • a method of screening a candidate compound for a therapeutic drug for an allergic disease comprising the following steps (1) to (4):
  • a therapeutic agent for allergic diseases comprising as an active ingredient a compound obtainable by the screening method according to any of (10) to (12);
  • a therapeutic drug for an allergic disease comprising as an active ingredient prostagnadin having a pentenone structure which can be obtained by the screening method according to any one of (10) to (12);
  • Prostaglandins having a cyclopentenone structure include prostaglandin A 2 , prostaglandin A or 16,16-dimethyl prostaglandin A 2 , 15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 , Selected from the group consisting of 16-phenoxytetranor prostaglandin A 2 , 17-phenyl trinor prostaglandin A 2 , 15-dexoxy-delta 12,14-prostaglandin J 2 , and 8-isoprostaglandin; (16) The drug for treating an allergic disease according to (16),
  • an allergotic disease model animal comprising a transgenic non-human vertebrate having reduced expression intensity of the polynucleotide according to (a) or (b) below in eosinophil cells,
  • the transgenic animal is a knockout animal The model animal described in [20],
  • a cell is contacted with a conjugate or a prostaglandin having a cyclopentenone structure obtainable by the screening method according to any one of [10;] to [12].
  • the cell is an eosinophil cell, (22) or the method of inducing apoptosis according to (23),
  • an apoptosis inducer comprising a compound obtainable by the screening method according to any one of [10] to [: 12] or a prostaglandin having a pentenone structure.
  • Prostaglandin having a cyclopentenone structure is: Prostaglandin A 2 , prostaglandin, 16,16-dimethyl prostaglandin A 2 , 15 (R) ⁇ 15-methyl prostaglandin A 2 , 16-phenoxytetranor prostaglandin A 2 , 17-phenyl trinor prostaglandin A 2 , 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J 2 , and 8-iso An apoptosis-inducing agent according to (27), which is selected from the group consisting of prostaglandins.
  • the present inventors have studied the NOR-1 (MINOR) gene (sometimes simply referred to as "N0R-1") in the comparison between the exacerbation period and the remission period in patients with atopic dermatitis. In addition, it was found that the expression level was increased in eosinophils of patients in remission with a decrease in eosinophils. Therefore, the subject can be tested for an allergic disease by indicating the expression level of the NOR-1 gene.
  • NOR-1 MINOR
  • the present invention provides a method for testing allergic monogenic disease, which comprises measuring the expression level of the N0R-1 gene.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention comprises the following steps.
  • NOR-1 (MINOR) receptor is a nucleus constituting three subfamilies with various names as shown in Table 1. It is an r-type of inner orphan receptor, and is mainly called NOR-1 across species. table 1
  • NOR-1 (MINOR) receptor proteins Information on the amino acid sequence of these NOR-1 (MINOR) receptor proteins or the nucleotide sequence of the gene encoding the protein is known to those skilled in the art. It can be easily obtained from a gene database or the like. Specifically, the nucleotide sequence of the gene encoding the human N0R-1 receptor protein (NOR-1 gene) is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the NOR-1 receptor protein is shown in SEQ ID NO: 2. .
  • an allergic disease is a general term for diseases associated with allergic reactions. More specifically, it can be defined as identifying an allergen, demonstrating a deep link between exposure to the allergen and the development of the lesion, and demonstrating an immunological mechanism for the lesion.
  • the immunological mechanism means that white blood cells show an immune response by stimulation of allergen. Examples of allergens include mite antigens and pollen antigens.
  • allergic diseases can include bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, hay fever, or insect allergy.
  • Allergic diathesis is a genetic factor transmitted from a parent with an allergic disease to a child.
  • a familial allergic disease is also called atopic disease, and the genetic factors that cause it are predisposed to atopy.
  • Atopic dermatitis is a generic name given to atopic diseases, especially those accompanied by dermatological symptoms.
  • the test for an allergic disease in the present invention includes the following tests. For example, a test to determine whether the subject is affected by an allergic disease, a test to determine whether the subject is susceptible to an allergic disease, or a determination of whether allergic symptoms are improving And the like for inspection.
  • the N0R-1 gene of the present invention showed an increased expression level in eosinophils of atopic dermatitis patients in remission, particularly with a decrease in eosinophils. Since eosinophils are a representative clinical marker for atopic dermatitis, clinical markers associated with their reduction are useful for determining the therapeutic effect. More specifically, increased expression of the NOR-1 gene indicates that allergic disease is being improved with eosinophil depletion.
  • the severity of atopic dermatitis correlates with the number of eosinophils, and aggressive reduction of eosinophil counts may lead to treatment.
  • This gene which is specifically induced by eosinophils as the number decreases, and finding a method or substance that can be actively induced from outside the cell, a new treatment for atopic dermatitis can be achieved. It may lead to a method and a diagnostic method to evaluate it.
  • the expression level of the NOR-1 gene includes transcription of the gene into mRNA and translation into a protein. Therefore, the method for detecting an allergic disease according to the present invention is performed based on the comparison of the expression intensity of mRNA corresponding to the gene or the expression level of a protein encoded by the gene.
  • the measurement of the expression level of the NOR-1 gene in the method for testing an allergic disease of the present invention can be carried out by those skilled in the art according to a known gene analysis method. Specifically, for example, a hybridization technique using a nucleic acid that hybridizes to the NOR-1 gene as a probe or a gene amplification technique using a DNA that hybridizes to the gene of the present invention as a primer can be used.
  • the probe or primer used as the reagent for testing an allergic disease of the present invention includes a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof.
  • complementary strand refers to one strand of a double-stranded DNA consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • phase-like is not limited to a case where the sequence is completely complementary in at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably Should have a homology of 95% or more on the base sequence.
  • the homology of the nucleotide sequences can be determined by anoregorhythm such as BLASTN.
  • Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting and isolating the polynucleotide encoding the protein of the present invention, and as a primer for amplifying the polynucleotide of the present invention.
  • primer When used, it usually has a chain length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 35 bp.
  • a DNA having at least a part or the entire sequence of the polynucleotide of the present invention and a chain length of at least 15 bp is used.
  • the 3'-side region needs to be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence tag or the like can be added to the 5'-side.
  • the “polynucleotide” in the present invention can be DNA or RNA. These polynucleotides may be synthetic (isolated) or natural.
  • the probe DNA used for hybridization is usually labeled. As the labeling method, for example, the following methods can be shown.
  • the term oligonucleotide means a polynucleotide having a relatively low degree of polymerization. Oligonucleotides are included in polynucleotides.
  • Testing for allergic diseases using hybridization technology includes, for example, Northern hybridization, dot plotting, and DNA microarray. It can be performed using the method used. Furthermore, gene amplification techniques such as the RT-PCR method can be used. In the RT-PCR method, more quantitative analysis can be performed on the expression of the gene of the present invention by using the PCR amplification method in the gene amplification process.
  • probes that are labeled with different fluorescent dyes that cancel each other's fluorescence on both ends are used to hybridize to the detection target (DNA or RNA reverse transcript).
  • the detection target DNA or RNA reverse transcript.
  • the two fluorescent dyes separate and the fluorescence is detected. This fluorescence is detected in real time.
  • the number of copies of the target in the target sample is determined by the number of linear cycles of the PCR amplification by simultaneously measuring the standard sample whose copy number is known for the target (Holland, PM et al., 1991). Natl. Acad. Sci.
  • PCR amplification monitor method for example, ABI PRISM7700 (PE Biosystems) can be used.
  • the method for detecting an allergic disease of the present invention can also be performed by detecting a protein encoded by the NOR-1 gene.
  • a detection method for example, a Western plotting method using an antibody that binds to a protein encoded by the gene, an immunoprecipitation method, an ELISA method, and the like can be used.
  • Antibodies that bind to the NOR-1 protein used for this detection can be obtained using techniques well known to those skilled in the art.
  • the antibody used in the present invention can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40).
  • a polyclonal antibody against the protein of the present invention is obtained by removing the blood of a mammal sensitized with the antigen and subjecting the blood to a known method. More serum is separated. Serum containing a polyclonal antibody can be used as the polyclonal antibody. Alternatively, if necessary, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from the serum.
  • immune cells are removed from a mammal sensitized with the above antigen, and are fused with myeloma cells.
  • the hybridoma thus obtained can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture and used as a monoclonal antibody.
  • these antibodies may be appropriately labeled and used. Further, without labeling the antibody, a substance that specifically binds to the antibody, for example, protein A or protein G can be labeled and detected indirectly. As a specific detection method, for example, an ELISA method can be mentioned.
  • the protein or its partial peptide used for the antigen is, for example, a NOR-1 gene or a part thereof is incorporated into an expression vector, and this is introduced into an appropriate host cell to prepare a transformant, and the transformant is transformed.
  • the recombinant protein can be obtained by culturing the body to express the recombinant protein, and purifying the expressed recombinant protein from the culture body or the culture supernatant.
  • an oligonucleotide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence encoded by the NOR-1 gene can be chemically synthesized and used as an immunogen.
  • eosinophil cells of a subject are preferably used as a sample.
  • Eosinophil cells can be prepared from peripheral blood by a known method. That is, for example, heparin-collected blood is fractionated by centrifugation to separate white blood cells. Next, granulocytes can be separated from leukocytes by centrifugation with Ficoll, etc., and eosinophils can be further separated by depletion of neutrophils using the CD16 antibody. If the separated eosinophils are destroyed to form a lysate, it can be used as a sample for immunological measurement of the protein.
  • a sample for measuring mRNA corresponding to the gene can be obtained. can do.
  • eosinophil lysate and mRNA it is convenient to use a commercially available kit.
  • the expression level of the gene to be used as an index in the present invention may be measured for whole blood or peripheral blood leukocyte populations without separating eosinophils.
  • a change in the expression level of the gene in the cell can be obtained by correcting the measured value.
  • a gene to be used as an index in the present invention based on a measured value of the expression level of a gene (housekeeping gene) which is specifically expressed in eosinophils and whose expression level does not largely fluctuate regardless of the state of the cell The expression level measurement can be corrected.
  • the protein to be detected is a secretory protein
  • the amount of the target protein contained in a body fluid sample such as blood or serum of the subject is measured to determine the gene encoding the protein. Comparison of expression levels is possible.
  • the present invention also relates to an animal model for allergic diseases comprising a transgenic non-human animal in which the expression level of the polynucleotide described in the following (a) or (b) is reduced in eosinophil cells.
  • the expression level decrease includes a knockout state in which the function of a gene has been substantially lost.
  • the state in which the function of a gene is substantially lost means the expression of the gene or the activity of the protein encoded by this gene. A state in which sex cannot be found.
  • the expression level of the gene can be confirmed, for example, by quantitative PCR as described in Examples. In addition, the fact that the activity of the protein as a translation product is not substantially found can be confirmed by comparison with a normal state.
  • transgenic animals include, for example, animals that have been unable to express the original protein activity by introducing mutations in the coding region of the gene and artificially causing amino acid sequence mutations or termination codons. And so on. Mutations in the amino acid sequence can indicate substitutions, deletions, insertions, or additions.
  • the expression itself of the gene of the present invention can be regulated by mutating the transcription regulatory region of the gene.
  • transgenic animals for specific genes are known. That is, a method in which a gene and an egg are mixed and treated with calcium phosphate, or a method in which a gene is directly introduced into a nucleus of a pronuclear stage egg with a micropipette under a phase contrast microscope (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191).
  • Transgenic animals can be obtained by methods using embryonic stem cells (ES cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • a method of introducing a gene into a retrovirus vector and infecting an egg, and a sperm vector method of introducing a gene into an egg via sperm have been developed.
  • the sperm vector method is a genetic recombination method in which a foreign gene is introduced into sperm cells by attaching a foreign gene to sperm or by electroporation or the like, and then fertilizing the egg to introduce the foreign gene ( M. Lavitranoet et al. Cell, 57, 717, 1989).
  • transgenic animal of the present invention can be prepared using any vertebrate other than human. Specifically, transgenic animals have been created in which vertebrates such as mice, rats, porch egrets, miniature pigs, goats, sheep, and porcupines have had their gene introduction and expression levels altered.
  • the expression of homologue in a non-human animal species of the human NOR-1 gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is suppressed.
  • Knockout animals are included. By observing the phenotype of a knockout animal, the function of the knocked out gene can be specifically known.
  • the expression of the NOR-1 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was elevated in eosinophils during remission with reduction of eosinophils in atopic dermatitis in humans. Therefore, an animal in which the homolog is knocked out is useful as a model animal for allergic diseases. For example, if the knockout animal according to the present invention develops dermatitis or shows a change in a measurement value related to any allergic disease, a screening system that searches for a compound that has an action to restore it can be constructed. .
  • Methods for producing knockout animals are known. For example, a method for producing a knockout animal by performing homologous recombination using an embryonic stem cell in a mouse and selecting an embryonic stem cell in which one allele is modified / disrupted is selected. For example, a fertilized egg is injected with embryonic stem cells whose genes have been manipulated to obtain a chimeric animal in which cells derived from embryonic stem cells and cells derived from embryos are mixed. When this chimeric animal (a chimera is a single individual formed from somatic cells based on two or more fertilized eggs) is bred to a normal mouse, all of one allele is altered and destroyed. Terozygotes can be made. Furthermore, homozygotes can be prepared by crossing heterozygotes. The transgenic animal according to the present invention includes both these heterozygotes and homozygotes.
  • the recombination is a recombination that occurs between two genes that have the same or very similar nucleotide sequences in the genetic recombination mechanism.
  • PCR can be used to select cells that have undergone homologous recombination.
  • a PCR reaction was performed using a part of the inserted gene and a part of the region expected to be inserted as primers, and it was found that homologous recombination had occurred in the cells in which the amplification product was formed.
  • neomycin resistance gene is linked to the introduced gene, and the cells are selected by neomycin resistance after introduction. Can be easily selected using known methods and their modifications.
  • the present inventors have succeeded in establishing a transgenic (TG) mouse in which the expression of the human NOR-1 gene is actually induced by the actin promoter, as shown in Examples described later.
  • TG transgenic
  • the above-mentioned TG mouse can be shown.
  • the transgenic animal according to the present invention can be used for screening of drugs for treating or preventing allergic diseases, which will be described later, as well as for elucidating the mechanism of allergic diseases and for further improving the safety of screened compounds. Useful for testing.
  • the expression level of the N0R-1 gene is increased in eosinophils of atopic dermatitis patients in remission with eosinophil depletion. Therefore, animals in which the expression level of the NOR-1 gene or a gene functionally equivalent to this gene in eosinophil cells has been artificially reduced should be used as model animals for allergic diseases. Can be.
  • the decrease in the expression level in eosinophils includes a decrease in the expression level of the gene in the whole leukocyte population. That is, the expression level of the gene is decreased not only by eosinophils but also by the expression level of the gene in the whole leukocyte population.
  • the functionally equivalent gene usually means any of the genes described in the above (a) or (b). More specifically, the gene functionally equivalent in the present invention includes a gene that hybridizes under stringent conditions to a gene encoding NOR-1. Generally, the following conditions can be shown as stringent conditions in the present invention. For example, hybridization is carried out at 4 ⁇ SSC at 65 ° C., and washing is performed at 65 ° C. for 1 hour using 0.1 ⁇ SSC. The temperature conditions for hybridization and washing, which greatly affect the stringency, can be adjusted according to the melting temperature (Tm). Tm occupies the hybridizing base pair.
  • Tm melting temperature
  • model animal in the present invention for example, the above-described transgenic animal or the like can be used.
  • the present invention provides a method for detecting the effect of a candidate compound on the expression level of the polynucleotide of the present invention.
  • the expression level of the NOR-1 gene is significantly increased in eosinophils of atopic dermatitis patients in remission with a decrease in eosinophils. Therefore, a therapeutic agent for an allergic disease can be obtained by selecting a compound capable of increasing the expression level based on a method for detecting the effect on the expression level of these genes.
  • the compound that increases the expression level of a gene is a compound that has an action of inducing any of the steps of gene transcription, translation, and protein activity expression.
  • the present invention further provides a method for detecting the activity (transcription activating ability) of the NOR-1 gene product protein in addition to the expression level of the NOR-1 gene, and further comprises providing a method for detecting the NOR-1 gene product protein.
  • the method for detecting the effect of the candidate compound on the expression level of the polynucleotide of the present invention can be performed in vivo or in vitro.
  • the test animal includes, for example, an allergic disease model animal, or an allergic monogenic disease comprising a transgenic non-human animal in which expression of the gene described in (a) or (b) in eosinophil cells is suppressed. Model animals can be used.
  • the detection of the effect on the expression level in iniw according to the present invention can be performed, for example, according to the following steps. (1) Step of administering a candidate compound to a test animal (2) a step of measuring the expression level of the polynucleotide according to (a) or (b) in eosinophil cells of a test animal
  • a transgenic animal having reduced expression of the NOR-1 gene by expressing antisense of the N0R-1 gene can be used.
  • Such a transgenic animal can be created, for example, as follows. That is, first, a full-length sequence or a partial sequence of the sequence of the N0R-1 gene is incorporated in a reverse direction downstream of an appropriate promoter sequence to construct an antisense RNA expression vector. By introducing this expression vector into the nucleus, a transgenic animal expressing the antisense of the NOR-1 gene and having reduced expression of the NOR-1 gene can be obtained.
  • a promoter whose transcription is regulated by a substance such as an appropriate drug is used as a motor used in the expression vector, the expression level of the NOR-1 gene in transgenic animals can be adjusted by administering the substance. can do.
  • the N0R- By administering a drug candidate compound to the model animal in which the expression of the N0R-1 gene has been reduced in this way and monitoring the action of the compound on the expression of the NOR-1 gene in eosinophils of the model animal, the N0R- The effect of the drug candidate compound on the expression level of one gene can be detected.
  • drugs that are involved in various forms in the expression of the NOR-1 gene can be selected.
  • drug candidate compounds having the following action points can be found.
  • a candidate compound is brought into contact with cells expressing the gene described in the above (a) or (b), and the expression level of the gene is detected.
  • cells for use in step (1) can be obtained by inserting these polynucleotides into an appropriate expression vector and introducing the vector into an appropriate host cell.
  • Usable vectors and host cells may be any as long as they can express the gene of the present invention. Examples of host cells in the host-vector system include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, and the like, and available vectors can be appropriately selected.
  • Examples of a method for introducing a vector into a host include a biological method, a physical method, and a chemical method.
  • Biological methods include, for example, a method using a virus vector, a method using a specific receptor, a cell fusion method (HVJ (Sendai virus), polyethylene glycol (PEG), an electric cell fusion method, micronuclear fusion). Law
  • Examples of the 'physical method' include a method using a microinjection method, an electoral-portion method, and a method using a gene particle gun.
  • Chemical methods include calcium phosphate precipitation, liposome method, DEAE dextran method, protoplast method, erythrocyte ghost method, erythrocyte membrane ghost method, and microcapsule method.
  • leishocyte leukocytes can also be used as the cells expressing the polynucleotide described in the above (a) or (b).
  • leishocyte leukocytes can also be used.
  • established leukocyte cells include leukocyte-derived established cells such as Eol, YY-1, HL-60, TF-1, and AML14.3D10.
  • leukocyte cell lines cell lines derived from eosinophils are: It is suitable for the detection method of the present invention.
  • Examples of cell lines derived from eosinophils include Eo1, YY-1, AML14.3D10 and the like.
  • Eol (Eol-1: Saito H et al, Establishment and character ization of a new human eosinophilic leukemia cell line. Blood 66, 1233 1240, 1985) can be obtained from Hayashibara Institute. Similarly, YY-1 (Ogata N et al, The activat ion od the JAK2 / STAT5 pathway is commonly involved in signaling through the human IL-5 receptor. Int. Arch.Allergy Immunol., Suppl 1, 24-27, 199 7 ) Is provided by Site Signal Laboratory.
  • AML14.3D10 (Baumann MA et al, The AML14 and AML14.3D10 cell lines: a long-overdue model for the st udy of eosinophils and more.Stem cells, 16, 16-24, 1998) Commercially available from Paul CC at Research Service, VA Medical Center Dayton.
  • HL-60 clone 15 which is an undifferentiated leukocyte cell line, can differentiate into eosinophils and become an eosinophil cell line when cultured for about one week in the presence of butyric acid. Wear. Eosinophils can be distinguished morphologically by the presence of eosinophil granules in polymorphonuclear nuclei. Morphological observation is performed by Giemsa staining or Diff Quick staining. In general, a human leukocyte cell line containing eosinophils can be established by closing immortalized cells from a leukemia patient sample.
  • eosinophil cell line by a known method, if necessary.
  • a candidate conjugate is added to the established leukocyte cells. Thereafter, the expression level of the polynucleotide described in the above (a) or (b) in the leukemia leukocyte cells is measured, and a compound that increases the expression level of the gene is selected.
  • Transformed cells in which the expression of the polynucleotide described in the above (a) or (b) is regulated can be used as the cells for the detection method in the present invention.
  • Such transformed cells include, for example, antisense Examples include cells transformed with an expression vector.
  • Transformed cells using the antisense expression vector can be obtained according to the same principle as in the preparation of the transgenic animal. Using the obtained transformed cells, the effect of the candidate compound on the expression level of the gene can also be detected.
  • the expression levels of the polynucleotides described in the above (a) or (b) can be compared by detecting not only the expression levels of the proteins encoded by these genes but also the corresponding mRNAs. You can also.
  • the above-described mRNA sample preparation step is performed instead of the protein sample preparation step. Detection of mRNA or protein can be performed by a known method as described above.
  • a transcriptional regulatory region of the NOR-1 gene can be obtained, and a reporter atssay system can be constructed.
  • the reporter-assay system refers to an assay system that screens for a transcriptional regulatory factor acting on the transcriptional regulatory region, using the expression level of a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region as an index downstream of the transcriptional regulatory region. .
  • transcription control region examples include a promoter, an enhancer, and a CMT box, a TATA box, etc. which are usually found in a promoter region.
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase gene transfer gene, luciferase (lucif erase) gene, growth hormone gene, etc.
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase gene transfer gene, luciferase (lucif erase) gene, growth hormone gene, etc.
  • Those skilled in the art can obtain the transcription regulatory region of the NOR-1 gene by a general method, for example, the following method.
  • a human genomic DNA library such as a BAC library, a YAC library, etc. by a method using PCR or hybridization, and the sequence of the cDNA is obtained.
  • a genomic DNA clone containing The transcription regulatory region of the NOR-1 gene is estimated based on the obtained genome DNA sequence, and the transcription regulatory region is obtained. Place the resulting transcriptional regulatory region upstream of the reporter gene Crawling to construct a reporter construct.
  • the resulting reporter construct is introduced into a cultured cell line to obtain a transformant for screening.
  • the action of the candidate conjugate on the transcription regulatory region can be evaluated.
  • screening of a compound that changes the expression level of the polynucleotide can be performed.
  • the present invention relates to a method for screening a compound that changes the expression level of the polynucleotide described in the above (a) or (b), comprising the following steps.
  • the present invention detects the effect of a candidate compound on the expression level of the polynucleotide in in >> o and / or ⁇ 'iro, and selects a compound that increases the expression level compared to a control.
  • the present invention relates to a method for screening a compound acting on a transcription regulatory region by a reporter assay utilizing the transcription regulatory region of the NOR-1 gene.
  • a compound that induces the expression of NOR-1 gene can be obtained by selecting a compound that increases the expression of the reporter transgene compared to the target, based on the results of the reporter assay according to the present invention.
  • the present invention relates to a method for screening an agonist or an antagonist that binds to a ligand domain.
  • the NOR-1 (MINOR) receptor protein found by the present inventors as a protein associated with an allergic disease is an orphan receptor, and no in vivo ligand active substance has been found so far.
  • the ligand active substance of NOR-1 protein is thought to directly activate NOR-1 in eosinophil cells and promote apoptosis. Therefore, the ligand active substance of NOR-1 receptor is allergic It is expected to be a therapeutic drug for diseases. Usually, by searching for a compound that can bind to a receptor protein, it is possible to obtain a ligand for the receptor.
  • the present invention provides a method for screening a candidate compound for a therapeutic drug for an allergic disease, which comprises selecting a compound capable of binding to the NOR-1 protein.
  • the test compound is brought into contact with the NOR-1 receptor protein, then the binding activity between the NOR-1 receptor protein and the test compound is measured, and the compound that binds to the NOR-1 receptor protein is determined. select. In addition to simply binding, the transcriptional activity of NOR-1 is measured, and agonists and antagonists are selected.
  • the NOR-1 receptor protein in the present method also includes its partial peptide.
  • the measurement of the binding activity between the NOR-1 receptor protein and the test compound in the above method can be carried out by those skilled in the art using a known method.
  • the screening method of the present invention can be performed by a West Western blotting method. Specifically, a cDNA library using a phage vector (Agtll, ZAPII, etc.) was prepared from tissues or cells that are expected to express a protein (test protein) that binds to the NOR-1 protein. This is expressed on LB-agarose, and the expressed protein is immobilized on the filter. Next, NOR-1 protein is biotin-labeled or purified as a fusion protein with GST protein, which is reacted with the above filter, and plaques expressing the test protein are detected using a streptavidin-anti-GST antibody or the like. By performing the above, the binding activity can be evaluated.
  • a cDNA library using a phage vector Agtll, ZAPII, etc.
  • Another embodiment of the method for screening a candidate compound for a therapeutic drug for allergic diseases of the present invention includes the following steps.
  • DNA capable of expressing a fusion protein of a N0R-1 receptor protein or a ligand domain of the protein and a transcriptional regulatory protein Providing a cell into which DNA having a structure in which a reporter gene is functionally linked downstream of a DNA sequence to which the protein binds is introduced.
  • the term “functionally bound” in the above method means that when the N0R-1 receptor protein or a ligand binding region of the protein binds to a ligand of the receptor protein or a ligand-like compound, It refers to the state in which the reporter gene is linked so that it can be expressed.
  • GAL4 protein can be suitably used as the “transcription regulatory region-binding protein” in the above method.
  • the “DNA sequence capable of binding to a transcription regulatory region binding protein” includes, for example, a GAL4-binding DNA region.
  • the above-mentioned screening method of the present invention can be performed in high throughput.
  • the NOR-1 protein or its partial peptide is usually expressed in yeast cells by fusing it with the GAL4 DNA binding IB region and binding to the N0R-1 protein or its partial peptide.
  • a cDNA library was prepared that could be expressed in a form fused with the VP16 or GAL4 transcriptional activation region, and introduced into the yeast cells described above. (When a protein that binds to the NOR-1 protein or a partial peptide containing its ligand-binding domain is expressed in yeast cells, the reporter gene is activated by the binding of both, and a positive clone can be confirmed.) .
  • the protein encoded by the cDNA can be obtained by introducing the isolated cDNA into Escherichia coli for expression. This makes it possible to prepare a protein or its gene that binds to the NOR-1 protein or its partial peptide.
  • reporter genes used in the two hybrid systems include, for example, HIS3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, Norenfuefuse, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) jfcfe gene and the like. However, it is not limited to these. Screening by the two-hybrid method can also be performed using a mammalian cell or the like in addition to yeast.
  • the present inventors have applied a two-hybrid system using mammalian cells to construct a high-snoreput system capable of screening for a ligand that increases the transcriptional activation function of the N0R-1 protein. .
  • This system is an improvement of the conventional two-hybrid system in mammals, and the outline of this system is shown in FIG. 3 (for details, see Examples below).
  • the screening method of the present invention can be preferably performed using the high-throughput system developed by the above-mentioned investigators.
  • NOR-1 is different from other subfamilies (biS) in that not only the ligand-binding domain but also the AF1 domain near the N-terminus (Fig. 4) is important for transcriptional activity.
  • the N0R-1 protein that forms a fusion protein with GAL4 in the above method is preferably not only a ligand domain but also a full-length protein.
  • NOR-1 is induced to be expressed in a state in which leukocytes such as atopic dermatitis peripheral blood are hyperactive, and as a result, it is highly possible that apoptosis is induced in cells.
  • Ligands present in vivo may be present in places where nuclear receptors are highly expressed.
  • the present inventors carried out screening according to the above-mentioned method using a low-molecular-weight fat-soluble mediator, which is expected to be produced under such conditions, as a ligand-complement test compound.
  • the present inventors have proposed that, among the lipophilic mediators, ligand actives [[4 substances, prostaglandin A 2 (prostaglandin A 2 ), prostaglandin (prostaglandin), 16, 16-dimethinole prostaglandin A 2] (16, 16-dimethyl prostaglandin A 2 ), 15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 (15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 ), 16-phenoxytetranor prostaglandin A 2 (16-phenoxy tetranor prostaglandin A 2 ), 17- phenylene Honoré Rinonore ⁇ b Sutaguranjin A 2 (17- phenyl trinor prostaglandin A 2), 15- Dokishi - Anoreta 12, 14 prostaglandin J 2 (15 deoxy-deltal2 Prostaglandin J 2 ), 8-iso prostaglandin (8-iso prostaglandin), etc. were successfully obtained.
  • These compounds are prostaglandins having
  • Screening for a compound that binds to the N0R-1 protein can also be carried out using ab initia mouth chromatography.
  • the NOR-1 protein is immobilized on a carrier of an affinity column, and a test sample that is expected to express a protein that binds to the N0R-1 protein is applied here.
  • the test sample include a cell extract and a cell lysate.
  • the column can be washed and the protein bound to the NOR-1 protein can be prepared.
  • the obtained protein can be obtained by, for example, analyzing the amino acid sequence of the protein, synthesizing oligo DNA based on the amino acid sequence, and screening the cDNA library using the DNA as a DNA to obtain a DNA encoding the protein. Can be obtained.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring the bound compound.
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between the NOR-1 protein and the test compound in real time as a surface plasmon resonance signal (for example, BIAcore, manufactured by Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the NOR-1 protein and the test compound by using a pyrosensor such as BIAcore.
  • Isolation of compounds that bind to the NOR-1 protein can be routinely performed by those skilled in the art. Methods other than the above include, for example, a method in which a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library is allowed to act on immobilized N0R-1 protein, and a molecule that binds to the protein of the present invention is screened. Can be shown.
  • kits can also include candidate compounds and instructions used as positive and negative controls.
  • the kit for detecting the effect of the candidate conjugate on the expression level of the NOR-1 gene and the transcriptional activation mechanism according to the present invention modifies the expression level of the NOR-1 gene and the transcriptional activation mechanism It can be used as a compound screening kit.
  • the candidate test compound used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a compound prepared by an existing chemical method such as a steroid derivative, a compound prepared by combinatorial chemistry, Animal 'plant group Examples include a mixture containing a plurality of compounds such as a tissue extract or a microorganism culture, a purified protein, an expression product of a gene library, and a library of synthetic peptides.
  • a low-molecular-weight fat-soluble mediator as the test candidate compound.
  • the compound selected by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic drug for allergic diseases.
  • the expression of the NOR-1 gene is increased in eosinophils along with the decrease in eosinophils during the period of remission of atopic dermatitis. Therefore, compounds that can enhance the expression or function of this gene can be expected to have the effect of suppressing the symptoms of atopic dermatitis. Further, the compound selected by the screening method of the present invention is expected to be a therapeutic drug for allergic diseases having a completely new mechanism of activation of NOR-1 and accompanying induction of eosinophil apoptosis. You.
  • the present invention provides a therapeutic agent for an allergic disease containing, as an active ingredient, a compound obtainable by the screening method of the present invention.
  • the above-mentioned compounds also include conjugates in which a part of the structure of the compound which can be isolated by using the screening method of the present invention is converted by addition, deletion and Z or substitution.
  • the present inventors have proposed a cyclopentenone structure as a compound (NOR-1 ligand active substance) that enhances the transcriptional activation ability of NOR-1 among the lipophilic '14 mediators. Prostaglandin was found.
  • a therapeutic agent for allergic disease of the present invention for example, a therapeutic agent for allergic disease containing, as an active ingredient, a prostaglandin having a cyclopentenone structure obtainable by the screening method of the present invention is preferably mentioned.
  • the prostaglandin include prostaglandin A 2 (prostaglandin A 2 ), prostaglandin A (s) 16,16-dimethyl prostaglandin A 2 (16,16-dimethyl prostaglandin A 2 ), 15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 (15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 ), 16-phenoxytetranole prostaglandin A.
  • Examples include 8-iso prostaglandin A and the like.
  • the substance having a ligand activity of the NOR-1 receptor of the present invention is considered to induce eosinophil apoptosis and have an antiallergic effect. Therefore, the present invention provides an apoptosis inducer containing a ligand of the NOR-1 receptor as an active ingredient, and a therapeutic drug for an allergic disease containing a ligand of the NOR-1 receptor as an active ingredient.
  • the apoptosis inducer of the present invention is preferably an eosinophil apoptosis inducer.
  • Examples of the ligand for the NOR-1 receptor include the above-mentioned prostaglandins having a pentenone structure, and the compounds described in Tables 14 to 58 described later.
  • Other compounds that affect the transcription of N0R-1 include, for example, the literature "Abayratna Wa nsa KS, Harris Jl, Yan G, Ordentlich P, Muscat GE, The AF-1 domain of NO R-1 / NR4A3 mediates trans-act Compounds described in ivation, coactivator recruitment, and action by the purine anti-metabolite 6-Mercaptopurine; J Biol Chem. 2003 April 22 [E-publication ahead of print] J.
  • those skilled in the art can easily develop a synthetic ligand for N0R-1 (MINOR) by inferring from a docking study with the three-dimensional structure of N0R-1.
  • a “docking study” is usually a 3D query based on the tertiary structure of a receptor, a compound that will be sold to the ligand-binding domain from a three-dimensional database of several hundred thousand compounds, and a conformation. Means to search on a computer.
  • the docking study is performed, for example, according to the following procedures (1) to (4).
  • references related to 3D Pharamocophore search include, for example, Pharmacophore Perception, Development, ana Use in Drug Design (Iul Biotechnology Series, 2) -US-ISBN: 0963681761 (Hardcover) Guner, Osman F. (Edt) / Publisher: Intl Univ Line Published 1999/12.
  • a drug containing such a synthetic ligand as an active ingredient is also included in the therapeutic agent for an allergic disease of the present invention.
  • the present inventors have found for the first time that the expression of the NOR-1 receptor of the present invention is specifically induced in eosinophils, and have therefore searched for low-molecular ligands of the receptor. More specifically, the pharmacophore model simulates the binding position of the PGA derivative to the NOR-1 ligand binding region, and, based on the structure-activity relationship information in the PGA derivative reporter system, Compounds were selected from the database. Accordingly, the ligands of the NOR-1 receptor of the present invention include the compounds selected as described above. More specifically, the compounds listed in Tables 14 to 58 can be shown. These compounds are believed to be more useful than agonist antibodies to the receptors of the present invention.
  • the present inventors have also found that eosinophil CD30 ligand stimulation increases the expression of the NOR-1 gene.
  • the present invention relates to an agent for inducing the expression of the NOR-1 gene, which comprises a ligand for the eosinophil CD30 receptor.
  • the expression inducer is expected to be a therapeutic drug for allergic diseases by controlling the expression of the downstream gene of Norl in eosinophils to induce eosinophil apoptosis.
  • the remedy for allergic diseases of the present invention can also be produced by mixing with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like.
  • the key of the present invention The therapeutic agent for allergic disease can be administered orally or parenterally for the purpose of ameliorating allergic symptoms.
  • dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, and suspensions can be selected.
  • Parenteral preparations include, for example, injections, suppositories, liniments and the like. Examples of the injection include a subcutaneous, a preparation, an intramuscular injection, an intraperitoneal injection, and the like.
  • the dosage varies depending on the age, sex, weight and condition of the patient, therapeutic effect, administration method, processing time, or the type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition, but is usually once per adult.
  • the present inventors have found that apoptosis is induced in cells by enhancing the expression of the NOR-1 receptor protein. Therefore, it is possible to induce apoptosis by activating NOR-1 protein in cells. Therefore, the present invention provides a method for inducing cell apoptosis, which comprises activating a NOR-1 receptor protein in a cell. The above method also includes a method of inducing cell apoptosis by activating the expression of the NOR-1 gene.
  • apoptosis is induced by contacting a cell with a compound obtainable by the screening method of the present invention or a prostadalandin having a pentenone structure.
  • the cells in the above method of the present invention are preferably eosinophil cells. It is known that peripheral blood eosinophil counts decrease during remission in the treatment of atopic dermatitis. Therefore, by eosinophils specifically leading to cell death using the method of the present invention, It is possible to treat sexual diseases. That is, the present method is useful as a method for treating allergic diseases.
  • the compounds obtainable by the screening method of the present invention or the prostaglandins having a pen-mouthed pentenone structure are considered to have an effect of inducing apoptosis. Also provided is an apoptosis inducing agent.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level (copy / ng RNA) of 2250-01 in atopic dermatitis patients (patient Nos. 1 to 7) corrected by S-actin during the exacerbation period and the remission period.
  • FIG. 2 is a graph showing the expression level of the NOR-1 gene measured at the 0RF site only in patients whose eosinophil count decreases from the bad period to the remission period.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a ligand search system for the NOR-1 receptor constructed by the present inventors. And the full length gene of ret inoic acid X receptor (RXR) a in Y. These are transfected into NIH3T3 cells, and the induced luciferase activity is measured.
  • RXR ret inoic acid X receptor
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the structure of the NOR-1 receptor protein.
  • FIG. 5 is a diagram showing the NOR-1 transcriptional activation effect of prostaglandin A 2 and rostagland in A, when the system of FIG. 3 is used.
  • Figure 6 shows that the pharmacophore model simulates the binding position of the PGA derivative to the NOR-1 ligand binding region, using 15 (10 -15 -methyl-g-staglandin A 2 (15 (R)- 15_Methyl- Prostaglandin A. It is a figure of in gamma mode 1).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the transcriptional activity reduction of Prostaglandin A 2 by LBD deletion mutants of NOR-1.
  • ALBD is a deletion mutant.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a state in which PGA1 and PGA2 are coupled to the LBD of NOR-1 using the via core S51. GST was used as a control. 13, 14-dihydro-15-keto-PGA2 was used as a negative control.
  • FIG. 9 is a graph showing the result of NOR-1 expression induction when peripheral blood eosinophils were stimulated with apoptosis by an anti-CD30 antibody or an anti-Fas antibody. The beta-actin correction value and the GAPDH correction value are shown.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of inducing apoptosis when an eosinophil-specific cell line, AML14.3D10, is treated with an anti-CD30 antibody and an anti-Fas antibody.
  • FIG. 11 is a graph showing the induction of expression of NOR-1 when AML14.3D10, an eosinophil-specific cell line, was treated with an anti-CD30 antibody or an anti-Fas antibody.
  • FIG. 12 is a diagram showing the working hypothesis of treatment of allergic disease by eosinophil cell death by the nuclear receptor Nur subfamily containing Norl.
  • FIG. 13 is a photograph of a N0R-1 transgenic mouse and a wild-type mouse.
  • the characteristics of the transgenic mice include a decrease in body weight by half, thymus atrophy, and spleen atrophy.
  • Table 2 shows the profiles of the seven patients with atopic dermatitis from which blood was collected. Allergen non-specific (Total IgE), mite and cedar-specific IgE were measured by the EIA method. That is, the test serum was reacted with the cap to which the anti-human IgE antibody had been bound, and the allergen non-specific IgE antibody or the mite or cedar-specific IgE antibody in the serum was bound. Next, -D-galactosidase-labeled anti-human IgE antibody and a substrate solution (4-methylpenbergeryl-) S-D-D-galactopyranoside were added and reacted to generate a fluorescent substance.
  • Total IgE Total IgE
  • mite and cedar-specific IgE were measured by the EIA method. That is, the test serum was reacted with the cap to which the anti-human IgE antibody had been bound, and the allergen non-specific IgE antibody or the mite or cedar-specific
  • the reaction was stopped by adding a reaction stop solution, and the antibody concentration was determined from the fluorescence intensity of standard IgE measured at the same time.
  • LDH was measured by the UV method (Wroblewski-La Due method), and the rate of decrease in NADH due to the reaction between pyruvate and NADH was calculated from the decrease in absorbance.
  • the LDH value was measured using an L-type ⁇ LDH (Wako Pure Chemical Industries) and a Model 7170 automatic analyzer (Hitachi).
  • the eosinophil count was measured by microscopy and an automatic blood cell analyzer SE-9000 (RF / DC impedance method, manufactured by Sysmex) using 2 ml of EDTA-added blood sample.
  • T-lgE 6100 7100 2600 2100
  • Eosinophils (%) Zero 11: 7 :; ⁇ :; W: 1 8.6 12.1 13.4 Eosinophils
  • Non-steroid face Non-steroid face: Non-steroid face: Non-steroid face: Locoid Locoid
  • a 3% dextran solution was added to whole blood collected from the patient, and left at room temperature for 30 minutes to sediment erythrocytes.
  • the upper leukocyte fraction was collected, placed on a Vikol solution (Ficoll-Paque PLUS; Amersham Pharmacia Biotech), and centrifuged at 1500 rpm for 30 minutes at room temperature.
  • the granulocyte fraction collected in the lower layer was reacted with CD16 antibody magnetic beads at 4 ° C for 30 minutes, and the cells eluted without trapping by separation using MACS were used as eosinophils in the experiment.
  • RNA was isolated from this solution according to the protocol attached to Isogen.
  • a black-mouthed form was added, and the mixture was centrifuged with stirring to collect an aqueous layer.
  • isopropanol was added, and the mixture was centrifuged with stirring to collect the total RNA in the precipitate.
  • the collected total RNA was added with DNase (Nippon Gene; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), reacted at 37 ° C for 15 minutes, extracted with phenol-look form, and recovered with ethanol precipitation.
  • DD analysis was performed according to the method described in the literature (T. Ito et al., 1994, FEBS Lett. 351: 231-236).
  • cDNA was prepared using 0.2 // g of total RNA for each of the three anchor primers.
  • cDNA was prepared using 0.4 g of RNA for each of the three anchor primers. All cDNAs were diluted to a final concentration of 0.4 ng / l RNA and used for experiments.
  • DD-PCR reaction was performed using cDNA equivalent to 1 ng RNA per reaction. Table 3 shows the composition of the reaction solution. Table 3 shows the composition of the reaction solution. Table 3
  • the PCR reaction conditions were as follows: ⁇ 95 ° C for 3 minutes, 40 ° C for 5 minutes, 72 ° C for 5 minutes '' for one cycle, followed by ⁇ 94 ° C for 15 seconds, 40 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 1 minute '' after 30 cycles The temperature was raised to 72 ° C for 5 minutes and then continuously to 4 ° C.
  • the primer pairs used were arbitrary primers AG 1 to 110 and AG 111 to GT15A (SEQ ID NO: 3), GT15C (SEQ ID NO: 4), and GT15G (SEQ ID NO: 5) as anchor primers, respectively.
  • 199 and AG 200-287 were combined and a total of 287 sets of reactions were performed.
  • an oligomer composed of 10 nucleotides having a GC content of 50% was designed, synthesized, and used.
  • the primer and TaqMan probe used for the measurement with ABI 7700 were designed by Primer Express (PE Biosystems) from the sequence information obtained by the differential display method.
  • the 5 'end of the Taq Man probe is labeled with FAM (6-carboxy-fluorescein) and the 3' end is labeled with TAMRA (6-carboxy-N, N, N, N, -tetramethylrhodamine)
  • Reaction composition of ABI-PRISM 7700 (reaction amount per 1 ⁇ ) Sterile distilled water 25.66 ( ⁇ )
  • TAMRA 6-carboxy— N, N, ', N, -tetramethylr odamine
  • E Eosinophils
  • N Neutrophils
  • the monocyte fraction collected in the intermediate layer by Ficoll centrifugation is fractionated by MACS CD3 antibody magnetic beads as an eluted fraction (a mixture of monocyte and B cell) (T cell fraction). Separated. Next, the eluted fraction was applied to MACS CD14 antibody magnetic beads.
  • the eluted fraction (B cell fraction) and the trapped fraction (moocyte fraction) were divided into purified T cells, purified B cells, and purified monocytes.
  • Eosinophils are solubilized using Isogen, neutrophils, T cells, B cells, and monocytes using RNeasy (Qiagen), extracted with total RNA, and treated with DNase (as described above) for gene expression analysis. Provided. The used primers and probes are the same as above. The average expression level in these blood cells (AVERAGE: copy / ng (correction value)) was as follows. Eosinophil (E): 960
  • the base sequence analysis of 2250-01 was proceeded by the 5, RACE method. Furthermore, cloning by plaque hybridization was performed using a phage cDNA library prepared from peripheral blood eosinophil RNA using the SMART cDNA Library Construction kit (CL0NTECH). A plasmid containing the sequence of 2250-01 was amplified into type II using primers 2250-01F and 2250-01R designed within the sequence of 2250-01, and the purified 259 bp PCR product was used as a probe. As a result, a clone having an insert of about 2 kb containing the sequence of 2250-01 was obtained. The determined base sequence of 2087 bp is shown in SEQ ID NO: 15. Genome database analysis revealed that this sequence is the intron portion of the nuclear orphan receptor called NOR-1 (MINOR).
  • NOR-1 NOR-1
  • Primerl (5 '): TGGGTGCCCTGGTAGAACT (SEQ ID NO: 16)
  • TaqMan probe AGGAAGATCTGCACCCTGGGCCTC (SEQ ID NO: 18)
  • peripheral blood eosinophils Genetic enhancement of peripheral blood eosinophils that suggests such an apoptotic character during remission by treatment of atopic dermatitis corresponds well with a decrease in the number of peripheral blood eosinophils Thus, induction of the expression of this gene is likely to correlate with the therapeutic effect.
  • NOR-1 NOR-1
  • NOR-1 (MINOR) is a nuclear receptor that is structurally a nuclear receptor, and its ligand-activator in vivo is unknown. If they are found, they can directly activate NOR-1 (MIN0R) in eosinophil cells and promote apoptosis. Therefore, it was considered that the ligand active substance was highly possible as an anti-allergic drug4, and a high-throughput system for ligand Starry Jung was constructed.
  • the Mammalian Two Hybrid system was slightly modified to insert the ligand-binding region sequence of N0R-1 (MINOR) or the full-length gene (Fig. 4) into pBIND as shown in Fig. 3.
  • MINOR ligand-binding region sequence of OR-1
  • Fig. 4 full-length gene
  • a protein in which the DNA binding region of OR-1 and GAL4 was fused in frame was expressed.
  • NOR-1 unlike other subfamilies (and iS), it is presumed that the AF 1 region near the N-terminus is important for transcriptional activity, and the ligand binding region is also used in the Mammalian Hybrid system. Not only that, it was necessary to insert the full-length gene.
  • NOR-1 (MINOR) is induced to be expressed in a state in which leukocytes such as atopic dermatitis peripheral blood are hyperactive, and as a result, apoptosis is likely to be induced in cells.
  • Ligands present in vivo may be present at locations where nuclear receptors are highly expressed. Therefore, a low molecular fat-soluble mediator, which is expected to be produced under such conditions, was added to the Atsushi system as a candidate ligand, and evaluated for its potentiating effect on the activity of noreciferase.
  • cyclopentenone structures such as prostaglandin A 2 , prosta glandin A, 15 (R) -15-methyl prostaglandin A 2 , 16-phenoxy tetranor prosta glandin A 2 , and 17-phenyl trinor prostaglandin A 2 It was found that prostaglandins having the function of enhancing the transcriptional activity of N0R-1 (MINOR) (Fig. 5, Tables 7 to 13).
  • Nor1 GST-LBD was expressed and purified in E. coli.
  • Biacore S51 it was possible to capture the binding of PGA1 and PGA2 to the Nor1 LBD under comparison with GST (Fig. 8).
  • Anti-Fas antibody does not induce N or 1 despite slower response than anti-CD30 antibody but apoptosis occurs, suggesting a different eosinophil-specific apoptosis pathway. is there. These phenomena (induction of apoptosis and induction of N or 1 expression) were also observed when an eosinophil-specific cell line, AML14.3D10, was treated with an anti-CD30 antibody (Figs. 10 and 11). ).
  • Promoting this eosinophil-specific pathway leading to cell death through enhancement of the function of N or 1 is not limited to asthma, but also to various allergies including atopic dermatitis examined by the present inventors. It is likely to lead to treatment of one disease.
  • An example of a treatment strategy intended by the present inventors is shown in FIG.
  • This surveillance provided a gene that is differentially expressed in eosinophils during the exacerbation and remission periods of patients with atopic dermatitis.
  • the expression level of the allergic disease-related gene in the present invention can be easily known regardless of the type of allergen. Therefore, the pathology of allergic reactions can be comprehensively understood.
  • the method for testing an allergic disease of the present invention can analyze the expression level of peripheral blood eosinophils as a sample, and thus has low invasiveness to patients. Higher throughput and lower cost of gene analysis technology are progressing year by year. Therefore, the method for detecting an allergic disease according to the present invention is expected to be an important diagnostic method at the bedside in the near future. In this sense, the diagnostic value of the method of the invention is high. Furthermore, the screening method of the present invention is carried out using, as an index, a gene function closely related to an increase or decrease in eosinophils, which is a typical clinical marker for atopic dermatitis. Therefore, compounds that can be found by this screening method are expected to be useful for controlling a wide variety of allergic diseases.
  • the therapeutic drug for allergic diseases is useful as a drug having a completely new mechanism of action, that is, activation of NOR-1 and accompanying induction of eosinophil apoptosis.

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Abstract

ディファレンシャルディスプレイ法により、アトピー性皮膚炎患者の増悪期と寛解期に採取した好酸球において発現に差の見られる遺伝子を探索した。その結果、好酸球の減少を伴う寛解期にある患者の好酸球において、有意に発現が上昇しているNOR-1(MINOR)遺伝子を同定することに成功した。本発明者らは、該遺伝子をアレルギー性疾患の検査、および治療薬候補化合物のスクリーニングに使用できることを見出した。

Description

明細書 ァレルギ一性疾患の検査方法、 およぴ治療のための薬剤 技術分野
本発明は、 アレルギー性疾患に関連する N O R— 1遺伝子の発現を指標とした ァレルギ一性疾患の検査方法、 およぴァレルギ一性疾患治療薬候補ィ匕合物のスク リ一ユング方法、 並ぴにァレルギ一性疾患の治療のための薬剤に関する。 背景技術
アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患は、 多因子性の病気 (multifactorial diseases)と考えられている。 これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互 作用によって起こり、 これらの個々の遺伝子の発現は、 複数の環境要因によって 影響を受ける。 このため、 特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、 非常に困難である。
またアレルギー性疾患には、 変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、 特定の遺伝 子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。 病気に関して遺 伝子発現が果たしている役割を解明するためには、 遺伝子が努症にどのように関 わり、 薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解す る必要がある。
近年の遺伝子発現の解析技術の発達により、 多くの臨床試料で、 遺伝子の発現 を解析 ·比較することが可能となった。 このような方法としては、 ディファレン シャノレディスプレイ（DD)法が有用である。 ディファレンシャルディスプレイ法は、 ライアンおよぴパディー（Liang and Pardee)によって 1992年に最初に開発され た（Science, 1992, 257 : 967-971)。 この方法を用いることによって、 1回に数十種 類以上のサンプルをスクリーユングすることができ、 それらのサンプル中で発現 が変化した遺伝子を検出することが可能である。 このような方法を用いて、 変異 が生じた遺伝子や、 時間や環境とともに発現が変わるような遺伝子を調べること によって、 病因遺伝子の解明のために重要な情報がもたらされることが期待され る。 これらの遺伝子には、 環境要因によって発現に影響を受けるような遺伝子も 含まれる。
さて、 現在アレルギー性疾患の診断においては、 一般に、 問診、 家族歴、 そし て本人の既往症の確認が重要な要素となっている。 またアレルギーをより客観的 な情報に基づいて診断するために、 血液を試料とする試験方法や、 アレルゲンに 対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。 前者の例として、 アレルゲン特異的 IgE測定、 白血球ヒスタミン遊離試験、 あるいはリンパ球幼若 化試験等が挙げられる。 ァレルゲン特異的 IgEの存在は、 そのァレルゲンに対す るアレルギー反応の証明である。 しかし患者によっては、 必ずしもアレルゲン特 異的な IgEを検出できるとは限らない場合もある。 また、 その測定原理上、 診断 に必要なアレルゲンの全てに対して、 試験を実施しなければならない。 白血球ヒ スタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、 免疫システムのァレルゲンに対する 反応を ' roで観察する方法である。 これらの方法は、 操作が煩雑である。 一方、 患者を実際にァレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をァレ ルギ一の診断に役立てる方法 （後者） も公知である。 プリック 'テスト、 スクラ ツチ ·テスト、 パッチ ·テスト、 皮内反応、 あるいは誘発試験等が、 この種の試 験に含まれる。 これらの試験では、 患者のアレルギー反応を直接診断することが できる反面、 実際に被検者をァレルゲンに曝露する侵襲性の高い検查であると言 うことができる。
この他、 アレルゲンにかかわらず、 アレルギー反応の関与を証明するための試 験方法も試みられている。 例えば、 血清 IgE値が高値である場合、 その患者には アレルギー反応が起きていると推定することができる。 血清 IgE値は、 アレルゲ ン特異 IgEの総量に相当する情報である。 アレルゲンの種類にかかわらず IgEの 総量を決定することは容易であるが、 非ァトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者 では、 IgEが低値となる場合がある。
好酸球数と ECP値は、 I型アレルギーに引き続いて起きる遅延型反応や、 ァレ ルギー性炎症反応に関連する診断項目である。 好酸球の数は、 アレルギー症状の 進展を反映するとされている。 また、 好酸球の顆粒に含まれるタンパク質である ECP (eosinophil cationic protein)も、 喘息患者の発作に伴って強く活性化され る。 これらの診断項目は、 確かにアレルギー症状を反映するものではある。 しか し、 実際に診断の指標とできる範囲は限られている。
従って、 アレルゲンにかかわらず、 アレルギー患者の病態の把握や治療方針の. 決定に役立てることができる診断指標が求められていた。 患者に対する危険が少 なく、 しかも診断に必要な情報を容易に得ることができるァレルギ一性疾患のマ 一力一は非常に有用である。 アレルギー性疾患に関連する遺伝子を同定すること ができれば、 該遺伝子の発現を指標とすることにより、 アレルギー性疾患の検査 が可能となる。 さらに、 該タンパク質の細胞における機能が解明すれば、 その機 能に関する知見を基に、 アレルギー性疾患の治療方法、 および治療のための薬剤 の開発が進むものと期待される。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 アレル ギー性疾患に関連する遺伝子を同定することにある。 さらに、 本発明は、 該遺伝 子の発現を指標としたァレルギ一性疾患の検査方法、 およぴァレルギ一性疾患治 療薬候補化合物のスクリーニング方法、 並びにアレルギー性疾患の治療のための 薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、 既に確立された 「蛍光 DD (Fluorescent DD)法」 （T. Itoら， 199 4, FEBS Lett. 351： 231- 236)の手順に基づき、 複数のヒトの血液から調製した 白血球細胞 RNAサンプルを解析できる DDシステムを開発した （特願平 11-12048 9) 。 そして該システムを利用して、 アレルギー性疾患特異的に発現量が異なる 遺伝子の同定を試みた。
すなわち、 まず本発明者らは、 代表的なアレルギー性疾患であるアトピー性皮 膚炎の患者について、 皮膚炎症状の増悪期と寛解期とでァレルギ一症状に関連す るいくつかのパラメーターを比較した。 その結果、 一部の患者で寛解期における 好酸球の減少が観察された。 一般に好酸球は、 アトピー性皮膚炎の代表的な臨床 指標とされていることから、 本発明者らはこの知見に着目した。 そして、 同一患 者の増悪期と寛解期の間で、 好酸球において発現レベルが変化する遺伝子を単離 することができれば、 ァトピー性皮膚炎に直接的に関与する遺伝子の単離が可能 となるものと考えた。
そこで、 複数の被検者について、 アトピー性皮膚炎の増悪期と寛解期に好酸球 を採取して、 前記システムを利用して好酸球で発現量が変化する遺伝子のスクリ 一ユングを行った。 その結果、 寛解期に好酸球の減少が観察された患者において 有意に高い発現量を示す配列 「2250-01」 の単離に成功した。 ゲノムデータべ一 ス解析の結果、 NOR- 1 (MINOR)と呼ばれる核内ォーファン受容体のィントロン部分 であることが分かった。 そこで、 NOR- 1 (MINOR)の報告されているェクソン配列に ついて発現測定を行ったところ、 イントロン部分で測定したときの結果と同様に、 好酸球減少の見られた著効例の寛解期に誘導されるという傾向が見られた。 N0R- 1遺伝子はこれまでのところ、 ァレルギ一性疾患との関連については報告されて いない。
ァトピー性皮膚炎の治療による寛解期に末梢血好酸球で、 アポトーティックな 性格が示唆されるような遺伝子の亢進が見られるのは、 末梢血好酸球数の減少と よく対応しており、 N0R-1遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性が高い ものと考えられる。
本発明の N0R - 1遺伝子の発現量を指標とすることにより、 アレルギー性疾患を 検査することが可能である。 また、 NOR- 1受容体はォーファン受容体であり生体内リガンドゃ活性化物質は これまでのところ見つかっていなかった。 本発明者らは、 リガンドの探索のため のハイスループット系を開発し、 この系を使用することにより NOR- 1の転写活性 化作用を有すると考えられる化合物の取得に成功した。 該化合物はシク口ペンテ ノン構造を持つプロスタグランジン （PGA誘導体） であり、 NOR- 1受容体の生体 内リガンドである可能性が考えられた。 また、 該受容体のリガンド結合ドメィン (LBD)領域を欠失させた変異体を用いた実験から、 プロスタグランジン誘導体が 実際に該受容体の LBD領域に作用して働くことが示唆された。 さらに、 ビアコア を利用した実験から、 PGA誘導体が NOR - 1へ結合することが証明された。
即ち本発明者らは、 アレルギー性疾患治療薬候補ィ匕合物のスクリーニングを行 うことが可能であること、 および、 PGA誘導体が NOR- 1のリガンド活性物質であ ることを見出した。
さらに本発明者らは、 ファーマコフォァモデルにより、 PGA誘導体の NOR- 1リ ガンド結合領域に対する結合位置をシミュレートし、 PGA誘導体のレポーター系 における構造活性相関情報から、 結合ポケットに適合する PGA誘導体以外の化合 物をデータベースより選択した。 これらの化合物は、 N0R - 1受容体のリガンドと して機能することが期待される。
NOR- 1遺伝子の発現を誘導する化合物、 あるいは N0R-1受容体と結合し、 転写 活性を促進する化合物 （例えば、 リガンド活性物質） は、 アレルギー性疾患に対 する治療効果が期待される。
また本発明者らは、 好酸球 CD30に対するァゴニスト活性をもつた抗 CD30抗体 で細胞のアポトーシス刺激を行ったところ、 培養末梢血好酸球中で NOR- 1の発現 が劇的に誘導されることを初めて見出した。 このことから、 好酸球 CD30リガン ド刺激によって、 NOR- 1遺伝子の発現を上昇させ、 好酸球における Norlの下流 遺伝子の発現を制御することによって好酸球のアポトーシスを誘導することを機 序とするァレルギ一性疾患治療薬が提供される。 さらに本発明者らは、 ヒト NOR- 1遺伝子をァクチンプロモーターによって発現 誘導させたトランスジエニックマウスを確立することに成功した。 このマウスは、 NOR- 1を介したアレルギー疾患の解析のための動物モデルとして非常に有用であ る。
本発明は、 アレルギー性疾患時、 特に好酸球の減少を伴う寛解期において高い 発現を示す N0R-1遺伝子の発現を指標としたァレルギ一性疾患の検查方法、 およ ぴアレルギー性疾患治療薬候補化合物のスクリーニング方法、 並びにアレルギー 性疾患の治療のための薬剤に関し、 より具体的には、
〔1〕 次の工程を含む、 アレルギー性疾患の検查方法、
(a) 被検者の好酸球細胞における、 NOR— 1受容体タンパク質、 または前記 タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
(b) 健常者の好酸球細胞における前記タンパク質または遺伝子の発現レベルと 比較する工程
〔2〕 遺伝子の発現レベルを、 cDNAの PCRによって測定する、 〔1〕 に記 载の検査方法、
〔3〕 アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、 〔1〕 または 〔2〕 に 記載の検查方法、
〔4〕 NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそ の相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 15塩基の長さを有するオリゴ ヌクレオチドからなる、 アレルギー性疾患検査用試薬、
〔5〕 次の工程 (1) および （2) を含む、 侯補化合物が下記 （a) または (b) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法、 (1) 下記 (a) または （b) に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に候補 化合物を接触させる工程
(a) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド (b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリン ジヱントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、 ァトピー性 皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク 質をコードするポリヌクレオチド
(2) 前記 （a) または （b) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定す る工程
〔6〕 細胞が株化白血球細胞である 〔5〕 に記載の方法、
〔7〕 次の工程 (1) および （2) を含む、 侯補化合物が下記 （a) または ( b ) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法、 (a) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 了トピー性 皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴つて好酸球において発現が増加するタンパク 質をコードするポリヌクレオチド
(1) 被検動物に候補化合物を投与する工程、 および
(2) 被検動物の好酸球細胞における前記 （a) または （b) に記載のポリヌク レオチドの発現強度を測定する工程
〔8〕 〔5〕 ~ 〔7〕 のいずれかに記載の方法によって、 前記発現レベルに 与える影響を検出し、 対照と比較して前記発現レベルを上昇させる化合物を選択 する工程を含む、 前記 (a) または （b) に記載のポリヌクレオチドの発現レべ ルを上昇させる化合物のスクリーニング方法、
〔9〕 次の工程 (1) および （2) を含む、 候補化合物が NOR— 1受容体 タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する 方法、 (1) NOR— 1受容体タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域と、 レポ ―タ一遺伝子とが機能的に結合した構造を有する D N Aを含む細胞または細胞抽 出液と、 候補化合物を接触させる工程、 および
(2) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
〔10〕 〔 9〕 に記載の方法によって、 候補ィ匕合物の前記活性に与える影響 を検出し、 対照と比較して前記活性を上昇させる化合物を選択する工程を含む、 NOR-1受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる化合 物のスクリーユング方法、
〔11〕 次の工程 (1) 〜 （3) を含む、 アレルギー性疾患治療薬のための 候補化合物をスクリーニングする方法、
( 1 ) NO -1受容体タンパク質と被験化合物を接触させる工程
(2) NOR— 1受容体タンパク質と被験ィヒ合物との結合活性を測定する工程
(3) NOR— 1受容体タンパク質と結合するィ匕合物を選択する工程
〔12〕 次の工程 (1) 〜 （4) を含む、 アレルギー性疾患治療薬のための 候補化合物をスクリ一ユングする方法、
( 1 ) NOR-1受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結合領域と転 写調節領域結合タンパク質との融合タンパク寳を発現し得る D N A、 および該転 写調節領域結合タンパク質の結合する D N A配列の下流にレポーター遺伝子が機 能的に結合した構造を有する D N A、 を導入した細胞を提供する工程
(2) 前記細胞と被検化合物を接触させる工程
(3) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
(4) 前記活性を変化させる化合物を選択する工程
〔13〕 〔10〕 〜 〔12〕 のいずれかに記載のスクリーニング方法によつ て得ることができる化合物を有効成分として含有する、 ァレルギ一性疾患治療薬、 〔14〕 〔1 0〕 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載のスクリーニング方法によつ て得ることができるシク口ペンテノン構造を有するプロスタダランジンを有効成 分として含有するアレルギー性疾患治療薬、
〔1 5〕 NOR— 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー
〔1 6〕 NOR— 1受容体のリガンドが、 シクロペンテノン構造を有するプ ロスタグランジンである、 〔1 5〕 に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔1 7〕 シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、 プロスタグ ランジン A2、 プロスタグランジン Aい 16， 16-ジメチル プロスタグランジン A2、 15(R) - 15 -メチル プロスタグランジン A2、 16 -フエノキシ テトラノル プロスタ グランジン A2、 17 -フエニル トリノル プロスタグランジン A2、 15-デォキシ-デ ルタ 12， 14-プロスタグランジン J2、 および 8 -イソ プロスタグランジン から なる群より選択される、 〔1 6〕 に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔1 8〕 NOR— 1受容体のリガンドが、 表 14〜 58に掲載されたいずれ かの化合物である、 〔1 5〕 に記載のアレルギー性疾患治療薬、
〔1 9〕 ァレルギ一性疾患がァトピ一性皮膚炎である、 〔 1 3〕 〜 [； 1 8〕 のいずれかに記載の治療薬、
〔20〕 下記の （a) または （b) に記載のポリヌクレオチドの好酸球細胞 における発現強度を低下させたトランスジエニック非ヒト脊椎動物からなるァレ ルギー性疾患モデノレ動物、
(a) NOR- 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、 ァトピー性皮
'膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加するタンパク質 をコードするポリヌクレオチド 〔2 1〕 トランスジエニック動物が、 ノックアウト動物である 〔2 0〕 に記 載のモデル動物、
〔2 2〕 細胞における N O R _ 1受容体タンパク質を活性ィヒさせることを特 徴とする、 細胞のアポトーシス誘導方法、
〔2 3〕 〔1 0；] 〜 〔1 2〕 のいずれかに記載のスクリーニング方法によつ て得ることができるィ匕合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグラン ジンと、 細胞を接触させる工程を含む、 〔2 2〕 に記載のアポトーシス誘導方法、
〔2 4〕 細胞が好酸球細胞である、 〔 2 2〕 または 〔 2 3〕 に記載のァポト 一シス誘導方法、
〔2 5〕 〔1 0〕 〜 〔： 1 2〕 のいずれかに記載のスクリーニング方法によつ て得ることができる化合物またはシク口ペンテノン構造を有するプロスタグラン ジンを含む、 アポトーシス誘導剤、
〔2 6〕 NO R— 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシ ス誘導剤、
〔2 7〕 N O R— 1受容体のリガンドが、 シクロペンテノン構造を有するプ ロスタグランジンである、 〔2 6〕 に記載のアポトーシス誘導剤、
〔2 8〕 シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、 シクロペン テノン構造を有するプロスタグランジンが、 プロスタグランジン A2、 プロスタ グランジン 、 16， 16-ジメチル プロスタグランジン A2、 15 (R) - 15-メチル プロ スタグランジン A2、 16 -フエノキシテトラノル プロスタグランジン A2、 17 -フ ェニル トリノル プロスタグランジン A2、 15 -デォキシ-デルタ 12， 14-プロスタ グランジン J2、 および 8-イソ プロスタグランジン からなる群より選択される、 〔2 7〕 に記載のアポトーシス誘導剤、
〔2 9〕 N O R— 1受容体のリガンドが、 表 1 4〜5 8に掲載されたいずれ かの化合物である、 〔2 6〕 に記載のアポトーシス誘導剤、 〔3 0〕 好酸球 C D 3 0受容体のリガンドを含む、 NO R— 1遺伝子発現誘 導剤、 を提供するものである。
本発明者らは、 NOR - 1 (MINOR)遺伝子 （本明細書においては、 単に 「N0R - 1」 と 記載する場合あり） 力 アトピー性皮膚炎の患者の増悪期と寛解期との比較にお いて、 好酸球の減少を伴った寛解期にある患者の好酸球で発現量が増加すること を見出した。 従って、 NOR- 1遺伝子の発現レベルを指標することにより、 被検者 に対してァレルギ一性疾患の検査を行うことができる。
本発明は、 N0R - 1遺伝子の発現レベルを測定することを特徴とする、 アレルギ 一性疾患の検査方法を提供する。
本発明の方法の好ましい態様においては、 次の工程を含む。
( a ) 被検者の好酸球細胞における、 NOR- 1受容体タンパク質をコードする遺伝 子の癸現レベルを測定する工程
( b ) 健常者の好酸球細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較する工程 NOR- 1 (MINOR)受容体は、 表 1に示すような種々の呼び名を持つた 3つのサブフ アミリーを構成する核内ォーファン受容体の rタイプであり、 種を超えて主と して NOR- 1と呼ばれている。 表 1
Figure imgf000012_0001
これら NOR - 1 (MINOR)受容体タンパク質のァミノ酸配列、 または該タンパク質 をコードする遺伝子の塩基配列に関する情報は、 当業者においては公知の各種遺 伝子データベース等から容易に取得することができる。 具体的には、 ヒ ト N0R-1 受容体タンパク質をコードする遺伝子 （NOR- 1遺伝子） の塩基配列を配列番号： 1に、 NOR - 1受容体タンパク質のァミノ酸配列を配列番号： 2に示す。
本発明において、 アレルギー性疾患（allergic disease)とはアレルギー反応の 関与する疾患の総称である。 より具体的には、 アレルゲンが同定され、 アレルゲ ンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、 その病変に免疫学的な機序 が証明されることと定義することができる。 ここで、 免疫学的な機序とは、 ァレ ルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。 ァレルゲン としては、 ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アトピー性 皮膚炎、 花粉症、 あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。 アレルギー素 因（allergic diathesis)とは、 アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺 伝的な因子である。 家族性に発症するアレルギー性疾患はァトピー性疾患とも呼 ばれ、 その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。 アトピー 性皮膚炎は、 ァトピー性疾患のうち、 特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えら れた総称である。
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、 以下のような検査が含まれる。 例えば、 被検者がァレルギ一性疾患を罹患している力否かの検查、 ァレルギ一性 疾患を被り易い体質か否かの検查、 またはアレルギー症状が改善に向かっている のかどうかを判断するための検查等が挙げられる。 本発明の N0R-1遺伝子は、 特 に好酸球の減少を伴った寛解期にあるァトピー性皮膚炎患者の好酸球で発現量の 増カ卩を示した。 好酸球はァトピー性皮膚炎の代表的な臨床マーカーであることか ら、 その減少と関連する臨床マーカーは、 治療効果の判定に有用である。 より具 体的には、 NOR- 1遺伝子の発現の上昇は、 好酸球の減少を伴ってアレルギー性疾 患の改善が進んでいることを示している。 ァトピー性皮膚炎の重症度と好酸球数は相関しており、 好酸球数を積極的に減 らすことは治療につながる可能性がある。 数の減少に伴って好酸球に特異的に誘 導されてくるこの遺伝子を測定するとともに、 細胞の外から積極的に誘導するよ うな方法や物質を見つけ出せば、 ァトピー性皮膚炎の新しい治療法及びそれを評 価するための診断法につながる可能性がある。
本発明において、 NOR - 1遺伝子の発現レベルとは、 該遺伝子の mR Aへの転写、 並びにタンパク質への翻訳を含む。 従って、 本発明によるアレルギー性疾患の検 查方法は、 該遺伝子に対応する mRNAの発現強度、 あるいは該遺伝子によってコ ードされるタンパク質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明のァレルギ一性疾患の検査方法における NOR- 1遺伝子の発現レべノレの測 定は、 当業者においては、 公知の遺伝子解析方法に従って実施することができる。 具体的には、 例えば NOR- 1遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハ イブリダイゼーション技術、 または本発明の遺伝子にハイプリダイズする DNAを プライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明のアレルギー性疾患検査用試薬として用いられるプロープまたはプライ マーとしては、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、 また はその相補鎖に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを 挙げることができる。 ここで 「相補鎖」 とは、 A:T (RNAの場合は U) 、 G: Cの塩 基対からなる 2本鎖 DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相ネ甫的」 とは、 少なくとも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場 合に限られず、 少なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。 塩基 配列の相同性は、 BLASTN等のァノレゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドを検出、 単離するためのプローブとして、 また、 本発明のポリヌクレオチ ドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。 プライマーと して用いる場合には、 通常、 15bp〜100bp、 好ましくは 15bp〜35bpの鎖長を有す る。 また、 プローブとして用いる場合には、 本発明のポリヌクレオチドの少なく とも一部若しくは全部の配列を有し、 少なくとも 15bpの鎖長の DNAが用いられ る。 プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的である必要があるが、 5' 側には制限酵素認識配列ゃタグなどを付加することができる。
なお、 本発明における 「ポリヌクレオチド」 は、 DNAあるいは RNAであること ができる。 これらポリヌクレオチドは、 合成 （単離） されたものでも天然のもの でもよい。 また、 ハイプリダイゼーシヨンに用いるプローブ DNAは、 通常、 標識 したものが用いられる。 標識方法としては、 例えば次のような方法を示すことが できる。.なお用語オリゴヌクレオチドは、 ポリヌクレオチドのうち、 重合度が比 較的低いものを意味している。 オリゴヌクレオチドは、 ポリヌクレオチドに含ま しる。
• DNAポリメラーゼ Iを用いるニックトランスレーションによる標識
•ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
'クレノーフラグメントによるフィルィン末端標識 (Berger SL, Kimmel AR. (1
987) Guide to. Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymo丄 ogy, Academ ic Press ; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes : A Practical Approach. IRL Press； Sambrook J, Fritsch EF， Maniatis T. (1989) Molecular Clonin g: a Laboratory Manual, 2nd Edn. し old Spring Harbor Laboratory Press) · RNAポリメラーゼを用いる転写による標識 （Melton DA, Krieg, PA, Rebagkiat i MR, Maniatis T， Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res. ， 12, 7035—70
56)
•放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドを DNAに取り込ませる方法 (Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press)
ハイプリダイゼーシヨン技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、 例えば、 ノーザンハイプリダイゼーシヨン法、 ドットプロット法、 DNAマイクロアレイを 用いた方法などを使用して行うことができる。 さらには、 RT - PCR法等の遺伝子 増幅技術を利用することができる。 RT- PCR法においては、 遺伝子の増幅過程に おいて PCR増幅モユタ一法を用いることにより、 本発明の遺伝子の発現について、 より定量的な解析を行うことが可能である。
PCR遺伝子増幅モニター法においては、 両端に互いの蛍光を打ち消し合う異な つた蛍光色素で標識したプロープを用い、 検出対象 (DNAもしくは RNAの逆転写 産物） にハイプリダイズさせる。 PCR反応が進んで Taqポリメラーゼの 5， - 3， ェクソヌクレアーゼ （exonuclease) 活性により同プロープが分解されると二つ の蛍光色素が離れ、 蛍光が検出されるようになる。 この蛍光の検出をリアルタイ ムに行う。 検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定す ることにより、 PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコ ピー数を決定する （Holland, P. M. et al.， 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7276-7280； Livak, K. J. et al. , 1995， PCR Methods and Applications 4 (6) : 357-362； Heid, C. A. et al. , Genome Research 6: 986—994; Gibson, E. M. U. et al. , 1996, Genome Research 6: 995-1001) 。 PCR増幅モニター法におい ては、 例えば、 ABI PRISM7700 (PEバイオシステムズ社） を用いることができる。 また本発明のァレルギ一性疾患の検查方法は、 NOR- 1遺伝子によりコードされ るタンパク質を検出することにより行うこともできる。 このような検查方法とし ては、 例えば、 該遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を利用 したウェスタンプロッティング法、 免疫沈降法、 ELISA法などを利用することが できる。
この検出に用いる NOR- 1タンパク質に結合する抗体は、 当業者に周知の技法を 用いて得ることができる。 本発明に用いる抗体は、 ポリクローナル抗体、 あるい はモノクローナル抗体 (Milstein C， et al.， 1983， Nature 305 (5934)： 537-4 0) であることができる。 例えば、 本発明のタンパク質に対するポリクローナル 抗体は、 抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、 この血液から公知の方法に より血清を分離する。 ポリクローナル抗体としては、 ポリクロ一ナル抗体を含む 血清を使用することができる。 あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナ ル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。 また、 モノクローナル抗体を 得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞な どと細胞融合させる。 こうして得られたハイプリドーマをクローユングして、 そ の培養物から抗体を回収しモノクローナ /レ抗体とすることができる。
NOR- 1タンパク質の検出には、 これらの抗体を適宜標識して用いればよい。 ま た、 この抗体を標識せずに、 該抗体に特異的に結合する物質、 例えば、 プロティ ン Aやプロティン Gを標識して間接的に検出することもできる。 具体的な検出方 法としては、 例えば、 ELISA法を挙げることができる。
抗原に用いるタンパク質もしくはその部分べプチドは、 例えば NOR- 1遺伝子も しくはその一部を発現ベクターに組込み、 これを適当な宿主細胞に導入して、 形 質転換体を作成し、 該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、 発 現させた組み換えタンパク質を培養体または培養上清から精製することにより得 ることができる。 あるいは、 NOR - 1遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の 部分アミノ酸配列からなるオリゴぺプチドを化学的に合成し、 免疫原として用い ることもできる。
本発明においては、 被検者の好酸球細胞を試料とすることが好ましい。 好酸球 細胞は、 末梢血から公知の方法によって調製することができる。 すなわち、 例え ばへパリン採血した血液を遠心分離によって分画し、 白血球細胞を分離する。 次 に白血球細胞から、 フイコールによる遠心分離等によって顆粒球細胞を分取し、 更に CD16抗体を用いた好中球のディプリーション等によって好酸球細胞を分離 することができる。 分離された好酸球を破壊してライセートとすれば、 前記タン パク質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。 あるいはこのライセ ートから mRNAを抽出すれば、 前記遺伝子に対応する mR Aの測定のための試料と することができる。 好酸球のライセートや mR Aの抽出には、 市販のキットを利 用すると便利である。
あるいは、 好酸球の分離を行わず、 全血や、 末梢血白血球集団を対象として、 本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルを測定しても良い。 この場合に は、 測定値の補正を行うことによって、 細胞における遺伝子の発現レベルの変化 を求めることができる。 例えば好酸球に特異的に発現し、 かつ細胞の状態にかか わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子 （ハウスキーピング遺伝子） の発現 レベルの測定値に基づいて、 本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの 測定値を補正することができる。
また検出すべきタンパク質が分泌型のタンパク質である場合には、 被検者の血 液や血清などの体液試料に含まれる目的とするタンパク質の量を測定することに よって、 それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。
本突明によるァレルギ一性疾患の検査の結果、 特にァトピー性皮膚炎等のァレ ルギー性疾患の患者において本発明の遺伝子の発現レベルが上昇している場合に、 好酸球の減少を伴ってァレルギ一症状の改善が進んでいるものと推定される。 また本発明は、 下記の （a ) または （b ) に記載のポリヌクレオチドの好酸球 細胞における発現レベルを低下させたトランスジエニック非ヒト動物からなるァ レルギ一性疾患モデル動物に関する。
( a ) NOR- 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( b ) N0R-1受容体タンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 ァトピー性皮膚炎 の寛解期に好酸球の減少に伴つて好酸球において発現が増加するタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド。
'本発明において、 発現レベルの低下とは、 遺伝子の機能を実質的に消失させた ノックアウト状態が含まれる。 本発明において、 遺伝子の機能が実質的に消失し た状態とは、 遺伝子の発現や、 この遺伝子によってコードされるタンパク質の活 性を見出すことができない状態を言う。 遺伝子の発現レベルは、 例えば実施例に 示すような定量的な PCRにより確認することができる。 また翻訳産物であるタン パク質の活性が実質的に見出せないことは、 正常な状態と比較することにより確 認することができる。
このようなトランスジエニック動物には、 例えば遺伝子のコード領域に変異を 導入し、 人為的にアミノ酸配列の変異や終止コドンを生じさせて、 本来のタンパ ク質の活性を発現できない状態とした動物などを示すことができる。 ァミノ酸配 列の変異には、 置換、 欠失、 揷入、 あるいは付加を示すことができる。 その他、 遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、 本発明の遺伝子の発現そのもの を調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、 トランスジエニック動物を得る方法は公知である。 すなわち、 遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、 位相差顕 微鏡下で前核期卵の核に、 微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法 （マイクロ インジェクション法、 米国特許第 4873191号） 、 胚性幹細胞 （ES細胞） を使用 する方法などによってトランスジエニック動物を得ることができる。 その他、 レ トロウィルスベクターに遺伝子を揷入し、 卵に感染させる方法、 また、 精子を介 して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。 精子ベクター法 とは、 精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーシヨン等の方法で精子細 胞内に取り込ませた後に、 卵子に受精させることにより、 外来遺伝子を導入する 遺伝子組換え法である （M. Lavitranoetら Cell, 57, 717, 1989) 。
本発明のトランスジエニック動物は、 ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して 作成することができる。 具体的には、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ミニブタ、 ャギ、 ヒッジ、 あるいはゥシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを 改変されたトランスジエニック動物が作り出されている。
本発明のトランスジェニック動物には、 例えば、 配列番号： 1に示す塩基配列 からなるヒト NOR- 1遺伝子の非ヒト動物種におけるホモ口グの発現が抑止された ノックァゥト動物が含まれる。 ノックァゥト動物の表現型を観察することにより、 ノックアウトした遺伝子の働きを具体的に知ることができる。 配列番号： 1に示 す塩基配列からなる NOR - 1遺伝子は、 ヒトにおいてァトピー皮膚炎の好酸球の減 少を伴った寛解期における好酸球中で宪現が上昇していた。 従って、 そのホモ口 グをノックアウトした動物は、 ァレルギ一性疾患のモデル動物として有用である。 例えば、 本発明によるノックアウト動物が皮膚炎を発症したり、 何らかのァレ ルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、 それを回復させる作用を持った 化合物を探索するスクリーユングシステムが構築できる。
ノックアウト動物の作製方法は公知である。 例えばマウスにおいて、 胚性幹細 胞を用いて相同組換えを行い、 一方の対立遺伝子を改変'破壊した胚性幹細胞を 選別し、 ノックアウト動物を作製する方法が公知である。 例えば、 受精卵に遺伝 子を操作した胚性幹細胞を注入して、 胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混 ざったキメラ動物を得る。 このキメラ動物 （キメラとは、 2個以上の受精卵に基 づいた体細胞で形成される単一個体をいう） と正常マウスを交配すると、 一方の 対立遺伝子の全てが改変 ·破壊されたへテロ接合体を作製することができる。 さ らに、 ヘテロ接合体同士を交配すれば、 ホモ接合体が作製できる。 本発明による トランスジエニック動物は、 これらへテロ接合体と、 ホモ接合体のいずれをも含 む。
栢同組換えとは、 遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、 または非常に類似して いる 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。 相同組換えを起こした細胞の 選別には PCRを使用することができる。 挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領 域の一部をプライマーとして使った PCR反応を行い、 増幅産物ができた細胞で相 同組換えを起こしていることが判明する。 また、 胚幹細胞で発現している遺伝子 に相同組み換えを起こさせる場合には、 導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を 結合させておき、 導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択する ことができる等、 公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することが できる。
本発明者らは、 後述の実施例で示すように実際にヒト NOR - 1遺伝子をァクチン プロモーターで発現誘導させたトランスジエニック（TG)マウスを確立することに 成功した。 本発明のトランスジエニック動物の好ましい態様の一例として、 上記 TGマウスを示すことができる。
本発明によるトランスジエニック動物は、 後に述べるアレルギー性疾患の治療 または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、 アレルギー性疾患のメカ 二ズムの解明、 さらにはスクリ一ユングされた化合物の安全性の試験に有用であ る。
本発明によって、 N0R-1遺伝子の発現レベルが好酸球の減少を伴う寛解期にあ るアトピー性皮膚炎患者の好酸球において、 上昇することが明らかとなった。 従 つて、 好酸球細胞において NOR- 1遺伝子、 または該遺伝子と機能的に同等な遺伝 子の発現レベルを人為的に低下させた動物は、 ァレルギ一性疾患のモデル動物と して利用することができる。 なお好酸球における発現レベルの低下とは、 白血球 集団全体における前記遺伝子の発現レベルの低下を含む。 すなわち、 前記遺伝子 の発現レベルを低下させるのは好酸球のみである場合のみならず、 白血球集団全 体において前記遺伝子の発現レベルが低下している場合を含む。 本発明において 機能的に同等な遺伝子とは、 通常、 前記 ( a ) または （b ) に記載した遺伝子の いずれかを意味する。 より具体的には、 本発明における機能的に同等な遺伝子と して、 NOR - 1をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズす る遺伝子も挙げられる。 本発明におけるストリンジェントな条件として、 一般的 には以下のような条件を示すことができる。 例えば、 4xSSC、 65°Cでハイブリダ ィゼーションさせ、 0· lxSSCを用いて 65°Cで 1時間洗浄する。 ストリンジェンシ 一を大きく左右するハイプリダイゼーションゃ洗浄の温度条件は、 融解温度 (T m) に応じて調整することができる。 Tmはハイブリダィズする塩基対に占める構 成塩基の割合、 ハイプリダイゼーシヨン溶液組成 （塩濃度、 ホルムアミドゃドデ シル硫酸ナトリウム濃度） によって変動する。 従って当業者であれば、 これらの 条件を考慮して同等のストリンジエンシーを与える条件を実験または経験的に設 定することができる。
本発明におけるモデル動物には、 例えば前記トランスジエニック動物等を利用 することができる。
更に本発明は、 候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える 影響を検出する方法を提供する。 本発明において、 NOR- 1遺伝子は、 好酸球の減 少を伴う寛解期にあるァトピー性皮膚炎患者の好酸球において有意に発現レベル が上昇している。 従って、 これらの遺伝子の発現レベルに与える影響を検出する 方法に基づいて、 その発現レベルを上昇させることができる化合物を選択するこ とによって、 アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。 本発明において遺 伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、 遺伝子の転写、 翻訳、 タンパク質の 活性発現のいずれかのステップを誘導する作用を持つ化合物である。 本発明はさ らに、 NOR- 1遺伝子の発現レベルに加えて、 NOR- 1遺伝子産物タンパク質の活性 (転写活性化能） を検出する方法を提供するとともに、 NOR - 1遺伝子産物タンパ ク質の活性 （転写活性化能） を上昇させる化合物を選択することによって、 ァレ ルギ一の治療薬を得ることができる。
候補化合物が本発明のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響の検出方法 は、 in vivoで行うことも vitroで行うこともできる。 in vivoでの影響を検 出するには、 適当な被検動物を利用する。 被検動物には、 例えばアレルギー性疾 患モデル動物や、 前記 （a ) または （b ) に記載の遺伝子の好酸球細胞における 発現が抑制されたトランスジエニック非ヒト動物からなるァレルギ一性疾患モデ ル動物を利用することができる。 本発明に基づく in iwでの発現レベルに与え る影響の検出は、 例えば以下のような工程に従って実施することができる。 ( 1 ) 被検動物に候補化合物を投与する工程 ( 2 ) 被検動物の好酸球細胞における前記 （a ) または （b ) に記載のポリヌク レオチドの発現レベルを測定する工程
本発明の検出方法における被検動物としては、 例えば、 N0R-1遺伝子のアンチ センスを発現させることにより NOR - 1遺伝子の発現を低下させたトランスジェニ ック動物を利用することができる。 このようなトランスジエニック動物は、 例え ば以下のようにして作成することができる。 すなわち、 まず N0R-1遺伝子の配列 の全長配列もしくは部分配列を、 適当なプロモーター配列の下流に逆向きの方向 で ,祖み込み、 アンチセンス RNA発現ベクターを構築する。 この発現ベクターを核 へ導入すれば、 NOR- 1遺伝子のアンチセンスを発現し、 NOR- 1遺伝子の発現が低 下したトランスジエニック動物を得ることができる。 発現べクタ一に使用するプ 口モーターとして、 適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを 用レヽれば、 該物質の投与によってトランスジエニック動物における NOR- 1遺伝子 の発現レベルを調整することができる。
このようにして N0R-1遺伝子の発現を低下させたモデル動物に薬剤候補化合物 を投与し、 モデル動物の好酸球における NOR- 1遺伝子の発現に対する化合物の作 用をモニターすることにより、 N0R - 1遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補ィ匕合 物の影響を検出することができる。
本発明のスクリ一ユング方法により、 NOR- 1遺伝子の発現に様々な形で関与す る薬剤を選択することができる。 具体的には、 例えば次のような作用点を持つ薬 剤候補化合物を見出すことができる。
• N0R-1遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化
• NOR- 1遺伝子の転写活性の上昇
• N0R - 1遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の阻害、 等
また、 in 'troにおいては、 例えば、 前記 ( a ) または （b ) に記載した遺 伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、 前記遺伝子の発現レベルを検出す る方法を利用することができる。 具体的には、 例えば以下のような工程に従って 実施することができる。
( 1 ) 前記 ( a ) または （b ) に記載したポリヌクレオチドを発現する細胞に候 補化合物を接触させる工程
( 2 ) 前記 ( a ) または （b ) に記載したポリヌクレオチドの発現レベルを測定 する工程
本癸明において、 工程 ( 1 ) に用いるための細胞は、 これらポリヌクレオチド を適当な発現ベクターに挿入し、 該ベクターを適当な宿主細胞に導入することに より得ることができる。 利用できるベクター、 および宿主細胞は、 本発明の遺伝 子を発現し得るものであればよい。 宿主一ベクター系における宿主細胞としては、 大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞等が例示でき、 それぞれ利用できるベクター を適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、 生物学的方法、 物理的方法、 化学的方 法などを示すことができる。 生物学的方法としては、 例えば、 ウィルスベクター を使用する方法、 特異的受容体を利用する方法、 細胞融合法 (HVJ (センダイゥ ィルス）、 ポリエチレングリコール （PEG) 、 電気的細胞融合法、 微少核融合法
(染色体移入） ) が挙げられる。 また、 物理的方法'としては、 マイクロインジェ クシヨン法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 ジーンパーティクルガン （gene gun) を用いる方法が挙げられる。 化学的方法としては、 リン酸カルシウム沈殿法、 リ ポソーム法、 DEAEデキストラン法、 プロトプラスト法、 赤血球ゴースト法、 赤 血球膜ゴースト法、 マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明の検出方法においては、 前記 （a ) または （b ) に記載したポリヌクレ ォチドを発現する細胞として、 株ィ匕白血球細胞を用いることもできる。 株化白血 球細胞としては、 Eol、 YY - 1、 HL - 60、 TF - 1、 および AML14. 3D10など白血球由来 の株化細胞を例示できる。 白血球細胞株の中でも、 好酸球に由来する細胞株は、 本発明の検出方法に好適である。 好酸球に由来する細胞株としては、 例えば、 Eo 1、 YY - 1、 AML14. 3D10等を挙げることができる。
Eol (Eol - 1 : Saito H et al, Establishment and character i zat i on of a new human eosinophilic leukemia cell line. Blood 66, 1233 1240， 1985)は、 林 原研究所より入手することができる。 同様に YY - 1 (Ogata N et al, The activat ion od the JAK2/STAT5 pathway is commonly involved in signaling through the human IL—5 receptor. Int. Arch. Allergy Immunol.， Suppl 1， 24-27, 199 7)は、 サイトシグナル研究所より分与される。 また AML14. 3D10 (Baumann MA et al, The AML14 and AML14. 3D10 cell lines : a long-overdue model for the st udy of eosinophils and more. Stem Cells, 16, 16-24， 1998)は、 米国オハイオ 州、 Research Service, VA Medical Center Daytonの Paul CCより、 商業的に 入手可能である。
その他、 未分化白血球細胞株である HL- 60クローン 15 (ATCC CRL- 1964)は、 酪 酸存在下で 1週間程度培養すれば、 好酸球に分化し好酸球細胞株とすることがで きる。 好酸球であることは、 形態的に、 多形核で好酸球顆粒が認められることに より判別することができる。 形態的な観察は、 ギムザ染色やディフクイック染色 によって行われる。 一般に、 好酸球を含むヒト白血球細胞株は、 白血病の患者サ ンプルから不死化した細胞をクローユングすることにより樹立することができる。 従って、 当業者は、 必要に応じて好酸球細胞株を公知の方法によって得ることも できる。 このスクリーニング方法においては、 まず前記株化白血球細胞に候補ィ匕 合物を添加する。 その後、 該株ィ匕白血球細胞における前記 ( a ) または （b ) に 記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、 該遺伝子の発現レベルを上昇さ せる化合物を選択する。
in ζ'ί ·りにおける検出方法のための細胞として、 前記 （a ) または （b ) に 記載したポリヌクレオチドの発現を調節した形質転換細胞を用いることができる。 このような形質転換細胞としては、 例えば当該ポリヌクレオチドのアンチセンス 発現ベクターを形質転換した細胞を挙げることができる。 アンチセンス発現べク ターによる形質転換細胞は、 前記トランスジェニック動物の作成と同様の原理に よって得ることができる。 得られた形質転換細胞を用いて該遺伝子の発現レベル に与える候補化合物の影響を検出することもできる。
なお本発明の方法において、 前記 ( a ) または （ b ) に記載のポリヌクレオチ ドの発現レベルは、 これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみな らず、 対応する mRNAを検出することにより比較することもできる。 mR Aによつ て発現レベルの比較を行うには、 タンパク質試料の調製工程に代えて、 先に述べ たような mRNA試料の調製工程を実施する。 mRNAやタンパク質の検出は、 先に述 ベたような公知の方法によって実施することができる。
さらに NOR- 1遺伝子の転写調節領域を取得し、 レポ一ターアツセィ系を構築す ることができる。 レポーターアツセィ系とは、 転写調節領域の下流にこの転写調 節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子の発現量を指標として、 該転写調節 領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアツセィ系をいう。
転写調節領域としては、 プロモーター、 ェンハンサー、 さらには、 通常プロモ 一ター領域に見られる CMTボックス、 TATAボックス等を例示することができる。 またレ;^一ター遺 子として、 CAT (chloramphenicol acetyltransferaseリ遣伝子、 ルシフェラーゼ（lucif erase)遺伝子、 成長ホルモン遺伝子等を利用することがで きる。
NOR - 1遺伝子の転写調節領域は、 当業者においては、 一般的な方法、 例えば、 以下の方法により取得することができる。 まず、 配列番号： 1に記載された塩基 配列に基づいて、 BACライブラリ一、 YACライブラリ一等のヒトゲノム DNAライ ブラリーから、 PCRまたはハイプリダイゼーシヨンを用いる方法によりスクリー ニングを行い、 該 cDNAの配列を含むゲノム DNAクローンを得る。 得られたゲノ ム DNAの配列を基に、 NOR- 1遺伝子の転写調節領域を推定し、 該転写調節領域を 取得する。 得られた転写調節領域を、 レポーター遺伝子の上流に位置するように クローユングしてレポーターコンストラクトを構築する。 得られたレポーターコ ンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーユング用の形質転換体とする。 こ の形質転換体に候補化合物を接触させ、 レポーター遺伝子の発現を検出すること によって、 転写調節領域に対する候補ィ匕合物の作用を評価することができる。 本発明の前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法に基 づいて、 前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニン グを行うことができる。 本発明は、 次の工程を含む前記 （a ) または （b ) に記 載のポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物のスクリーニング方法に 関する。
すなわち本発明は、 in ζ>οおよび/または ώ 'iroにおいて、 候補化合物 による前記ポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出し、 対照と比較し て前記発現レベルを上昇させるィ匕合物を選択する工程を含む、 前記 （a ) または ( b ) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを上昇させる化合物のスクリー二 ング方法を提供する。
あるいは本発明は、 NOR- 1遺伝子の転写調節領域を利用するレポーターァッセ ィによる、 転写調節領域に作用する化合物のスクリーニング方法に関する。 本発 明によるレポーターアツセィの結果に基づいて、 対象と比較してレポーター遣伝 子の発現を上昇させる化合物を選択することにより、 NOR- 1遺伝子の発現を誘導 する化合物を取得することができる。 あるいは、 リガンド結 域に結合するァ ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
本発明者らによってアレルギー性疾患に関連するタンパク質として見出された NOR- 1 (MINOR)受容体タンパク質は、 ォーファン受容体であり生体内リガンド活性 物質はこれまでのところ見つかっていない。 NOR- 1タンパク質のリガンド活性物 質は、 好酸球細胞内でダイレクトに N0R - 1を活性化し、 アポトーシスを促進させ るものと考えられる。 従って、 NOR- 1受容体のリガンド活性物質はアレルギー性 疾患治療薬となるものと期待される。 通常、 受容体タンパク質と結合し得る化合 物の探索を行うことにより、 該受容体のリガンドを取得することが可能である。 本発明は、 NOR - 1 タンパク質と結合し得る化合物を選択することを特徴とする、 アレルギー性疾患治療薬のための候補化合物のスクリ一ユング方法を提供する。 本方法においては、 NOR- 1受容体タンパク質と被験化合物を接触させ、 次いで、 NOR - 1受容体タンパク質と被験化合物との結合活性を測定し、 NOR - 1受容体タン パク質と結合する化合物を選択する。 また、 単に結合をするのみでなく、 NOR- 1 の転写活性を測定し、 ァゴニスト、 アンタゴニストを選択する。
本方法における NOR- 1受容体タンパク質には、 その部分べプチドも含まれる。 上記方法における N0R-1受容体タンパク質と被検化合物との結合活性の測定は、 当業者においては公知の方法を利用して実施することができる。
例えば、 NOR- 1と結合する化合物がタンパク質である場合には、 本発明のスク リーユング方法は、 ウェストウエスタンブロッテイング法により行うことができ る。 具体的には、 NOR- 1タンパク質と結合するタンパク質 （被検タンパク質） を 発現していることが予想される組織または細胞よりファージベクター （A gtll, ZAPIIなど） を用いた cDNAライブラリ一を作製し、 これを LB-ァガロース上で発 現させフィルターに発現させたタンパク質を固定する。 次いで、 NOR- 1タンパク 質をビォチンラベル化、 あるいは GSTタンパク質との融合タンパク質として精製 し、 これを上記フィルターと反応させ、 被検タンパク質を発現しているプラーク を、 ストレプトアビジンゃ抗 GST抗体などにより検出を行うことにより、 結合活 性を評価することができる。
また、 本発明のァレルギ一性疾患治療薬のための候補化合物のスクリーニング 方法の別の態様においては、 下記の工程を含む。
( 1 ) N0R - 1受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結^域と転写調 節タンパク質との融合タンパク質を発現し得る DNA、 およぴ該転写調節タンパク 質の結合する DNA配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した構造を有す る DNA、 を導入した細胞を提供する工程
( 2 ) 前記細胞と被検化合物を接触させる工程
( 3 ) 前記レポ一ター遺伝子の活性を測定する工程
( 4 ) 前記活性を変化させる化合物を選択する工程
上記方法における 「機能的に結合した」 とは、 N0R-1受容体タンパク質または 該タンパク質のリガンド結^ ϋ域が、 該受容体タンパク質のリガンドもしくはリ ガンド様ィヒ合物と結合した際に、 レポーター遺伝子が発現し得るように結合した 状態を指す。 上記方法における 「転写調節領域結合タンパク質」 としては、 通常、 GAL4タンパク質を好適に使用することができる。 また、 上記 「転写調節領域結 合タンパク質の結合し得る DNA配列」 としては、 例えば、 GAL4結合 DNA領域を 挙げることができる。 さらに本発明の上記スクリーニング方法は、 ハイスループ ットで行うことが可能である。
上記スクリーニング方法の好ましい態様としては、 rtwoハイプリッドシステ ム」 （例えば、 「MATCHMARKER Two-Hybrid System] , 「Ma匪 alian MATCHMAKER T wo一 Hybrid Assay Kit」 ， 「MATCHMAKER One-Hybrid SystemJ (いずれも clontech 社製）、 rHybriZAP Two-Hybrid Vector SystemJ (stratagene社製）、 文献 「Dal ton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP - 1， a protein recruit ed by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612」 ） を用いてスクリーニングを行うことができる。 本発明の上記方法は、 より具体的には、 以下のようにして実施することができるが、 この方法に特に限 定されず、 当業者においては、 以下に例示した方法を適宜改変して実施すること が可能である。
two-ハイプリッドシステムにおいては、 NOR- 1タンパク質またはその部分ぺプ チドを、 通常、 GAL4 DNA結^ IB域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、 N0R - 1 タンパク質またはその部分ペプチドと結合するタ パク質を発現していることが 予想される細胞より、 VP16または GAL4転写活性化領域と融合する形で発現する ような cDNAライブラリーを作製し、 これを上記酵母細胞に導入し、 検出された 陽性クローンからライプラリ一由来 cDNAを単離する （酵母細胞内で NOR - 1タン パク質またはそのリガンド結合領域を含む部分べプチドと結合するタンパク質が 発現すると、 両者の結合によりレポーター遺伝子が活性ィ匕され、 陽性のクローン が確認できる） 。 単離した cDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、 該 cDNAがコードするタンパク質を得ることができる。 これにより NOR- 1タンパク 質またはその部分べプチドに結合するタンパク質またはその遺伝子を調製するこ とが可能である。 twoハイプリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝 子としては、 例えば、 HIS3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺伝子、 ノレンフエフーセ遺 is十、 PAI - 1 (Plasminogen activator inhibitor typel) jfcfe 子等が挙げられるが、 これらに制限されない。 twoハイブリッド法によるスクリ 一二ングは、 酵母の他、 喃乳動物細胞等を使って行うこともできる。
本発明者らは、 哺乳動物細胞を用いた twoハイプリッドシステムを応用して、 N0R - 1タンパク質の転写活性化機能を上昇させるリガンドをスクリ一ユングする ことが可能なハイスノレ一プット系を構築した。 この系は、 従来の哺乳動物におけ る twoハイブリッドシステムを改良したものであり、 この系の概略を図 3に示す (詳細は後述の実施例を参照） 。
本発明のスクリ一ユング方法は、 好ましくは、 上記の本究明者らによって開発 されたハイスループット系を用いて行うことができる。 NOR- 1は、 他のサブファ ミリ一 （びと iS ) とは異なり、 転写活性にリガンド結合領域だけでなく、 N末 近傍の AF1領域 （図 4 ) が重要であること力 本発明者らによって示唆された。 従って、 上記の方法における、 GAL4と融合タンパク質を形成させる N0R-1タン パク質は、 リガンド結 ^域だけではなく、 全長タンパク質であることが好まし い。 NOR- 1は、 ァトピー性皮膚炎末梢血のような白血球が機能亢進した状態で発現 誘導され、 その結果として細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。 生体 内に存在するリガンドは、 核内受容体が高発現している場所に存在する可能性が ある。 そこで本発明者らは、 このような条件で産生されると予想される低分子の 脂溶性メディエーターをリガンド侯補被検化合物として、 上記の方法によりスク リ一ユングを行った。 そして本発明者らは、 脂溶性メディエーターの中から、 リ ガンド活' [4物質として、 プロスタグランジン A2 (prostaglandin A2)、 プロスタ グランジン (prostaglandin ）、 16, 16-ジメチノレ プロスタグランジン A2 (16， 16 - dimethyl prostaglandin A2)、 15 (R) - 15-メチルプロスタグランジン A2 (15 (R) - 15- methyl prostaglandin A2)、 16 -フエノキシテトラノルプロスタグラン ンン A2 (16-phenoxy tetranor prostaglandin A2)、 17—フエ二ノレ リノノレ ァロ スタグランジン A2 (17— phenyl trinor prostaglandin A2)、 15—デォキシ―ァノレタ 12, 14-プロスタグランジン J2 (15 deoxy-deltal2, 14一 prostaglandin J2)、 8—ィ ソ プロスタグランジン （8 - iso prostaglandin ）等を取得することに成功し た。 これらの化合物は、 シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンであ る。 このことは、 本発明の方法によって N0R - 1 (MINOR)の転写活性化機能をァッ プレギュレートするリガンド活性物質を実際に取得することが可能であることを 示すものである。
N0R-1タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、 アブイ二ティーク口 マトグラフィーを用いて行うこともできる。 例えば、 NOR- 1タンパク質をァフィ 二ティーカラムの担体に固定し、 ここに N0R - 1タンパク質と結合するタンパク質 を発現していることが予想される被検試料を適用する。 この の被検試料とし ては、 例えば細胞抽出物、 細胞溶解物等が挙げられる。 被検試料を適用した後、 カラムを洗浄し、 N0R - 1タンパク質と結合したタンパク質を調製することができ る。 取得したタンパク質は、 例えば、 該タンパク質のアミノ酸配列を分析し、 それ を基にオリゴ DNAを合成し、 該 DNAをプロ一プとして cDNAライプラリーをスク リ一ユングすることにより、 該タンパク質をコードする DNAを得ることができる。 本発明において、 結合した化合物を検出又は測定する手段として表面ブラズモ ン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。 表面プラズモン 共鳴現象を利用したバイオセンサーは、 NOR - 1タンパク質と被検化合物との間の 相互作用を、 表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが 可能である （例えば BIAcore、 Pharmacia製） 。 従って、 BIAcore等のパイォセ ンサ一を用いることにより NOR- 1タンパク質と被検化合物との結合を評価するこ とが可能である。
NOR - 1タンパク質と結合する化合物を単離することは、 当業者においては通常 行い得ることである。 上記以外の方法として、 例えば、 固定した N0R-1タンパク 質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはランダムファージぺプチドディスプ レイライブラリーを作用させ、 本発明のタンパク質に結合する分子をスクリー二 ングする方法等を示すことができる。
本発明による、 候補化合物の NOR- 1遺伝子の発現レベルや転写活性化機構に与 える影響を検出する方法に用いられる細胞、 並びに該遺伝子の発現レベルを調べ るためのポリヌクレオチド、 あるいは抗体を組み合わせて、 この方法のための検 出用キットとすることができる。 キットには、 陽性対照や陰性対照として用いら れる候補ィヒ合物や指示書を組み合わせることもできる。 本発明に基づく候補ィ匕合 物の NOR- 1遺伝子の発現レベルや転写活性化機構に与える影響を検出するための キットは、 例えば、 NOR- 1遺伝子の発現レベルや転写活性化機構を修飾する化合 物のスクリーニング用キットとして利用することができる。
本努明のスクリーニング方法に用いる被検侯補化合物としては、 特に制限され ないが、 例えば、 ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物 標品、 コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品、 動 '植物組 織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、 精製タンパク 質、 遺伝子ライプラリーの発現産物、 合成ペプチドのライブラリ一等が挙げられ る。 また、 本発明の NOR- 1タンパク質と結合する化合物のスクリーニング方法に おいては、 特に制限されないが、 低分子の脂溶性メディエーターを被検候補化合 物とすることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、 アレルギー性疾患 の治療薬として有用である。 NOR- 1遺伝子は、 ァトピー性皮膚炎の寛解期に好酸 球の減少に伴って好酸球において発現が増加する。 従って、 この遺伝子の発現あ るいは機能を増強することができる化合物には、 ァトピー性皮膚炎の症状を抑え る作用が期待できる。 また、 本発明のスクリーニング方法によって選択される化 合物は、 NOR - 1活性化とそれに伴う好酸球アポトーシス誘導という全く新しい作 用機序を有するァレルギ一性疾患治療薬となるものと期待される。 従つて本発明 は、 本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分と して含有するアレルギー性疾患治療薬を する。 なお上記化合物には、 本発明 のスクリ一-ング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、 付加、 欠失及 ぴ Z又は置換により変換されるィ匕合物も含まれる。 上述のように、 脂溶 '14メディ ェ一ターの中から、 NOR- 1の転写活性化能を増強する化合物 （NOR- 1のリガンド 活性物質） として本発明者らにより、 シクロペンテノン構造を有するプロスタグ ランジンが見出された。 従って、 本発明のアレルギー性疾患治療薬として、 例え ば、 本発明のスクリーニング方法によって得ることができるシクロペンテノン構 造を有するプロスタグランジンを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療 薬を好適に挙げることができる。 該プロスタグランジンの具体例としては、 プロ スタグランジン A2 (prostaglandin A2)、 プロスタグランジン A (prostaglandin Aj) s 16， 16-ジメチル プロスタグランジン A2 (16， 16- dimethyl prostaglandin A2)、 15 (R) - 15-メチル プロスタグランジン A2 (15 (R) - 15- methyl prostaglandin A2)、 16 -フエノキシテトラノノレプロスタグランジン A。 (16-phenoxy tetranor prostaglandin A2)、 17-フエニル トリノルプロスタグランジン A2 (17- phenyl trinor prostaglandin A2)、 15-デォキシ-デルタ 12， 14-プロスタグランジン：) "2 (15 deoxy-deltal2, 14- prostaglandin J2)、 8-ィソ プロスタグランジン
(8-iso prostaglandin A 等を挙げることができる。
また本発明の NOR- 1受容体のリガンド活性を有する物質は、 好酸球のアポトー シスを誘導し、 抗アレルギー作用を有するものと考えられる。 従って、 本発明は、 NOR- 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤、 並びに、 NOR- 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー性疾患治療薬を提 供する。 本発明のアポトーシス誘導剤は、 好ましくは、 好酸球のアポトーシス誘 導剤である。
NOR- 1受容体のリガンドとしては、 上記のシク口ペンテノン構造を有するプロ スタグランジン、 後,述の表 1 4〜5 8に掲載の化合物等を挙げることができる。 その他、 N0R - 1の転写に影響を与える化合物として例えば、 文献『Abayratna Wa nsa KS, Harris Jl， Yan G, Ordentlich P, Muscat GE, The AF- 1 domain of NO R-1/NR4A3 mediates trans-act ivat ion, coactivator recruitment, and activa tion by the purine anti-metabolite 6-Mercaptopurine； J Biol Chem. 2003 A pr 22 [E- publication ahead of print] J に記載の化合物を挙げることができる。 また、 N0R-1 (MINOR)の合成リガンドは、 当業者においては N0R - 1の立体構造と のドッキングスタディーから容易に推察され合成展開することが可能である。
「ドッキングスタディー」 とは通常、 受容体の立体構造に基づいた 3 Dクェリ 一ファーマコファ一モデルにより、 数 10万個の化合物の 3次元 D Bの中から、 リガンド結合ドメインにブイットする化合物ゃコンフォーメーションをコンビュ ータ上で探索することを言う。 ドッキングスタディ一は、 例えば、 以下の （1 ) 〜 （4 ) の手順に従って行われる。
( 1 ) Modelerによるタンパクの 3 D構造の構築 （ホモロジ一モデル）
( 2 ) C 2 . . LigandFitによる結合部位の検索 ( 3 ) C 2 . S B Fによる結合部位の Pharmacophore クエリ構築
( 4 ) Pharmacophoreクエリによる 3 Dデータベースの検索
3 D Pharamocophore検索に関する文献としては、 例えば、 Pharmacophore Pe rception, Development, ana Use in Drug Design (Iul Biotechnology Series, 2) -US-ISBN: 0963681761 (Hardcover) Guner, Osman F. (Edt) /Publisher : Intl Univ Line Published 1999/12等を挙げることができる。
このような合成リガンドを有効成分として含有する薬剤もまた、 本発明のァレ ルギー性疾患治療薬に含まれる。 また、 上記合成リガンドは被検候補ィ匕合物とし て、 本発明の上記方法に供することにより、 真のリガンドであるカゝ否かを評価す ることも可能である。
また本発明者らは、 本発明の N0R - 1受容体の発現が好酸球内で特異的に誘導さ れることを初めて見出したことから、 該受容体の低分子リガンドの探索を行った。 より詳しくは、 ファーマコフォァモデルにより、 PGA誘導体の NOR- 1リガンド結 合領域に対する結合位置をシミュレートし、 PGA誘導体のレポーター系における 構造活性相関情報から、 結合ポケットに適合する PGA誘導体以外の化合物をデー タベースより選択した。 従って、 本発明の NOR- 1受容体のリガンドとして、 上記 のようにして選択された化合物を挙げることができる。 より具体的には表 1 4〜 5 8に掲載の化合物を示すことができる。 これらの化合物は、 本発明の受容体に 対するァゴニスト抗体よりも、 有用であるものと考えられる。
また本発明者らは、 好酸球 CD30リガンド刺激によって、 NOR- 1遺伝子の発現 を上昇させることを見出した。 本発明は、 好酸球 CD30受容体のリガンドを含む、 N0R-1遺伝子の発現誘導剤を する。 該発現誘導剤は、 好酸球における Norl の下流遺伝子の発現を制御することによって好酸球のアポトーシスを誘導するこ とを機序とする、 アレルギー性疾患治療薬となることが期待される。
本発明のアレルギー性疾患治療薬は、 生理学的に許容される担体、 賦形剤、 あ るいは希釈剤等と混合することによって製造することも可能である。 本発明のァ レルギ一性疾患の治療剤は、 ァレルギ一症状の改善を目的として、 経口、 あるい は非経口的に投与することができる。
経口剤としては、 顆粒剤、 散剤、 錠剤、 カプセル剤、 溶剤、 乳剤、 あるいは懸 濁剤等の剤型を選択することができる。 非経口剤としては、 例えば、 注射剤、 座 薬、 塗り薬等を挙げることができる。 注射剤としては、 皮下、 剤、 筋肉注射剤、 あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重および症状、 治療効果、 投与方法、 処理時 間、 あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、 通 常成人一人あたり、 一回につき 0. 1 mgから 500 mgの範囲で、 好ましくは 0. 5 m gから 20 mgの範囲で投与することができる。 しかし、 投与量は種々の条件によ り変動するため、 上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、 また上記の範 囲を超える投与量が必要な場合もある。
また本発明者らは、 N0R-1受容体タンパク質の発現が亢進することにより、 細 胞がアポトーシス誘導することを見出した。 従って、 細胞において N0R-1タンパ ク質を活性ィヒさせることにより、 アポトーシスを誘導させることが可能である。 従って本発明は、 細胞における NOR - 1受容体タンパク質を活性化させることを特 徴とする、 細胞のアポトーシス誘導方法を提供する。 上記方法には、 NOR- 1遺伝 子の発現を活性化させることにより、 細胞のアポトーシス誘導を行う方法も含ま れる。
本方法の好ましい態様においては、 本発明のスクリーニング方法によって得る ことができる化合物またはシク口ペンテノン構造を有するプロスタダランジンと 細胞とを接触させることにより、 アポトーシスの誘導を行う。 本発明の上記方法 における細胞は、 好酸球細胞であることが好ましい。 アトピー性皮膚炎の治療に おける寛解期において末梢血好酸球数が減少することが知られている。 よって、 本発明の方法を利用して好酸球を特異的に細胞死に導くことにより、 ァレルギ一 性疾患を治療することが可能と考えられる。 即ち、 本方法は、 アレルギー性疾患 の治療方法として有用である。
また、 本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物またはシ ク口ペンテノン構造を有するプロスタグランジンは、 アポトーシスを誘導する作 用があるものと考えられることから、 本発明は、 これら化合物を含有するアポト 一シス誘導剤も提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 アトピー性皮膚炎患者 （患者番号 1〜7 ) の、 増悪期と寛解期におけ る Sァクチンにより補正した 2250 - 01発現量 (copy/ng RNA) を示す図である。 図 2は、 增悪期から寛解期に伴って好酸球数の減少する患者のみにおける、 NO R-1遺伝子の 0RF部位で測定した発現量を示す図である。
図 3は、 本発明者らによつて構築された NOR- 1受容体のリガンド探索系を模式 的に示す図である。 に NOR- 1の全長遺伝子またはリガンド結合部位、 Yに ret inoic acid X receptor (RXR) aの全長遺伝子を揷入する。 これらを NIH3T3細 胞に遺伝子導入し、 誘導されてくるルシフェラーゼの活性を測定する。
図 4は、 N0R-1受容体タンパク質の構造を模式的に示す図である。
図 5は、 図 3のシステムを用いたときの prostaglandin A2および rostagland in A,の NOR- 1転写活性化作用を示す図である。
図 6は、 ファ一マコフォァモデルにより、 PGA誘導体の NOR- 1リガンド結合領 域に対する結合位置をシミュレートした、 ガンマモデルにおける 15 (10 -15 -メチ ル-プ口スタグランジン A2 (15 (R) -15_Methyl- Prostaglandin A。 in gamma mode 1) の図である。
図 7は、 NOR- 1の LBD欠失変異体による prostaglandin A2の転写活性低下の結 果を示すグラフである。 ALBDが欠失変異体である。 図 8は、 ビアコァ S51を用いて NOR- 1の LBDに PGA1、 PGA2が結合する様子を 捉えた図である。 GSTを比較対照として用いた。 13, 14- dihydro - 15- keto- PGA2を ネガティブコント口ールとして使用した。
図 9は、 抗 CD30抗体または抗 Fas抗体によって、 末梢血好酸球をアポトーシ ス刺激した場合の NOR- 1の発現誘導結果を示すグラフである。 beta-ァクチン補 正値、 GAPDH補正値を示す。
図 1 0は、 好酸球特異的細胞株である AML14. 3D10を抗 CD30抗体、 抗 Fas抗体 で処理した場合のアポトーシス誘導効果を示すダラフである。
図 1 1は、 好酸球特異的細胞株である AML14. 3D10を抗 CD30抗体または抗 Fas 抗体で処理した場合の NOR- 1の発現誘導を示すグラフである。
図 1 2は、 Norlを含む核内受容体 Nurサブフアミリ一による好酸球細胞死に よるァレルギ一疾患治療の作業仮説を示す図である。
図 1 3は、 N0R-1 トランスジエニックマウスおよび野生型マウスの写真である。 トランスジエニックマウスの特徴としては、 体重が半分にまで減少すること、 胸 腺萎縮、 脾臓萎縮などが観察された。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。
[実施例 1 ] ディファレンシャルディスプレイ解析
アトピー性皮膚炎の同一患者における增悪期と、 薬物治療その他による寛解期 の末梢血より単離した血球細胞を比較して、 発現変動している新しい治療関連遺 伝子あるいは診断に有用な遺伝子を見出すことを目的としてスクリーニングを行 つた。 ( 1 ) 被検者
血液を採取した 7例のァトピー性皮膚炎患者のプロフィールを表 2に示す。 ァ レルゲン非特異的 （Total IgE) 、 ダニおよびスギ特異的 IgEは EIA法により測 定した。 すなわち、 抗ヒト IgE抗体を結合させたキャップに被検血清を反応させ、 血清中のァレルゲン非特異的 IgE抗体、 またはダニ、 スギ特異的 IgE抗体を結合 させた。 次に、 - D-ガラクトシダーゼ標識抗ヒト IgE抗体と基質液 （4-メチル ゥンベルフエリル - )S - D-ガラクトピラノシド） を加え、 反応させて蛍光物質を生 成させた。 反応停止液を加えて反応を停止させ、 同時測定の標準 IgEの蛍光強度 より抗体濃度を決定した。 LDHの測定は、 UV法 （Wroblewski- La Due法） により、 ピルビン酸と NADHの反応による NADHの減少速度を吸光度の減少から算出した。 LDH値の測定には、 Lタイプヮコ LDH (和光純薬） と 7170型自動分析装置 （日 立） を用いた。 好酸球数は、 EDTA添加血液 2ml を試料として鏡検法と自動血球 分析装置 SE- 9000 (RF/DCインピーダンス方式、 Sysmex製造） により測定した。
患者番号 . / . 3 4 '：：'：■■ . 5 ；；：；.,：·：； 6
Donor ID ΡΑ00002 PA00068 PA00069 PA00070 PA00071 PA00 病態 増悪期 寛解期增悪期 寛解期増悪期 寛解期增悪期 寛解期增悪期 寛解期增悪期
T-lgE 6100 7100 2600 2100
ダニ 82.1 73.8 66.4 >100
スギ 57.1 77.2 14.4 19.7
し DH 910 475 293 296
Figure imgf000040_0001
好酸球 (%) 零 11:7 :; 麵:； W:1 8.6 12.1 13.4 好酸球
1620 ： : m: i / ひ ： ：: mo: ,稱: 945 (/mm3) 2 Q 527 738 752
■ 11 η 7 **** Q C C
内月 δ /ノレ丁ンン吸,丁サン丁ン in cs i o c?
O O CM CJ Cs ザジデン、消風セル亍 ザジデン D オドール 散 ク卜 インタ一 インタ一ル吸,ザ M C
MD C C OM < ァタラックス P インタ一ル経口
、 * ,
o
外用 身体：ザルック身体：ロコイド 身体：ザルック身体:ロコイド 身体：ロコイド 身体：ザ ス ス CO OI ス O デロン V
§1： 顏:非ステロイド顔:非ステロイド顏:非ステロイド顏:非ステロイド顔： ロコイド ロコイド
o
他の疾病喘息（中等症） 喘息（中等症）
CO o
患者から採取した全血に 3 %デキストラン溶液を加えて 30分室温放置し、 赤 血球を沈降させた。 上層の白血球画分を回収し、 ブイコール溶液 (Ficoll-Paque PLUS ; アマシャムフアルマシアバイオテク） の上に載せて 1500rpm、 30分室温 で遠心した。 下層に回収された顆粒球画分を CD16抗体磁気ビーズと 4°Cで 30分 反応させ、 MACSを用いた分離でトラップさせずに溶出する細胞を好酸球として 実験に用いた。
上記のように調製した好酸球を Isogen (日本ジーン；和光純薬） に溶解し、 この溶液から、 Isogenに添付されているプロトコルに従って RNAを分離した。 クロ口ホルムを加え、 攪拌遠心して水層を回収した。 次にイソプロパノールを加 え、 攪拌遠心して沈殿の全 RNAを回収した。 回収した全 RNAは、 DNase (日本ジ ーン；和光純薬） を加えて 37°C15分反応させ、 フエノ一ル-ク口口ホルム抽出し てェタノール沈殿で RNAを回収した。
このように調製した全 RNAを用いて蛍光ディファレンシャルディスプレイ （F1 uorescent Differential Display, 「DD」 と略記する） 解析を行った。 DD解析は 文献 (T. Itoら， 1994， FEBS Lett. 351： 231-236) に記載の方法に準じて行つ た。 まず全 RNAを逆転写し、 cDNAを得た。 第一次 DD-PCR反応用には 3種のアン カープライマーの各々について全 RNAの各 0. 2 // gを用いて cDNAを調製した。 第 二次 DD- PCR反応用には、 3種のアンカープライマーの各々について RNA 0. 4 g を用いて cDNAを調製した。 いずれの cDNAも、 0. 4ng/ / l RNA相当の最終濃度に 希釈し、 実験に用いた。 1反応あたり 1 ng RNA相当の cDNAを用いて DD-PCR反 応を行った。 反応液の組成は表 3の通りである。 表 3
cDNA (0. 4ng/ 1 腿相当） 2. 5 / 1 任意プライマー （2〃M) 2. 5/i l
10 x AmpliTaq PCR / ッファー 1. 0 1
2. 5mM dNTP 0. 8 // 1
アンカープライマー O. l jw l
(GT15A, GT15C, GT15G)
Gene Taq (5U/ β 1) 0. 05 1
AmpliTaq (5U/ μ 1) 0. 05〃1
Figure imgf000042_0001
PCRの反応条件は、 「95°C3分、 40°C5分、 72°C5分」 を 1サイクル、 続いて、 「94°C15秒、 40°C2分、 72°C1分」 を 30サイクルの後、 72°C5分、 その後連続的 に 4°Cにした。
使用したプライマー対はアンカープライマーである GT15A (配列番号： 3 ) 、 GT15C (配列番号： 4 ) 、 および GT15G (配列番号： 5 ) に対して任意プライマ 一をそれぞれ AG 1〜： 110、 AG 111〜199、 および AG 200〜287を糸且み合わせ、 計 2 87組の反応をおこなった。 なお、 任意プライマーとしては GC含量 50%の 10ヌ クレオチドからなるオリゴマーを設計し、 合成して用いた。
ゲル電気泳動は、 6%変性ポリアクリルアミドゲルを作製し、 2. 5 1の試料を アプライし、 40Wで 210分間泳動した。 その後、 日立製蛍光イメージアナライザ 一 FMBIO IIを用いてゲル板をスキャンし、 蛍光検出によって泳動画像を得た。 増悪期及び寛解期の両サンプルを並べて泳動し、 ほとんどの患者で同方向に発 現が変動している遺伝子パンドを目で判定し、 切り取って TAクローユングおよ ぴ配列決定を行った。 その結果、 増悪期に比べ寛解期に有意に発現の亢進する！） NA配列 （DD解析のパンド ID 2250 - 01；以後、 この配列を 「2250-01」 と称す） を見出した。 パンド ID 2250-01 の増幅に用いたプライマーセットを以下に示す。 パンド I D： 2250-01
断片の長さ ： 421 to (プライマーの配列を除く） アンカ一プライマー： GT15C
任意プライマーの名前： AG00164
任意プライマーの配列： CATTCTCAGG (配列番号： 6 ) ( 3 ) 発現解析
2250-01の発現量を定量的に確認するために、 同一臨床サンプルを用いてさら に ABI 7700による定量的 PCRを行った。 ABI 7700による測定に用いたプライマ 一および TaqManプロープは、 ディファレンシャルディスプレイ法によって得ら れた配列情報から Primer Express (PEバイオシステムズ） により設計した。 Taq Manプロープの 5，末端は FAM (6- carboxy- fluorescein)で、 また 3'末端は TAMRA (6-carboxy-N, N, N，， N， -tetramethylrhodamine)で標識されている
• 2250-01フォーヮードプライマ一
TGCCTTGTCTAGAACTGCACAG (配列番号： 7 )
• 2250-01リパースプライマ一
MGTGTGTTGGACCMGCAGC (配列番号： 8 )
• 2250-01 TaqManプローブ
AAGTCAGTGCAGAGCCTGGATGAGGA (配列番号： 9 )
铸型には全 RNAからポリ T (12〜18mer)をプライマーとして逆転写した cDNAを 用いた。 コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配 列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、 その段階希釈 を铸型として反応を行った。 PCR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表 4に示した。 表 4
ABI-PRISM 7700の反応組成 ( 1ゥエルあたりの反応量） 滅菌蒸留水 25.66 (μΐ)
10x TaqManパ、ッファー A 5
25mM MgCl2 7
dATP(lOmM) 1.2
dCTP(lOmM) 1.2
dGTP(lOmM) 1.2
dUTP(lOmM) 1.2
Forward Primer (100 M) 0.15
Reverse Primer (100/ M) 0.15
TaqManプローブ（6.7〃 M) 1.49
AmpliTaq Gold (5U/ μ L) 0.25
AmpErase U G (1U/ /L) 0.5
テンプレート溶液 5
50 また、 試料中の cDNA濃度の差を補正するため、 補正用内部標準として -ァ クチン（ - actin)遺伝子について同様の定量解析を行い、 それら遺伝子のコピー 数を基に補正して、 目的遺伝子のコピー数を算出した。 i8 -ァクチン（)8 - actin) 遺伝子の定量には、 ヒト cDNAを铸型として用いた。
βァクチン測定用のプライマーとプローブは、 TaqMan ^S-actin Control Rea gents (PEバイオシステムズ） に添付のものを用いて行った。 塩基配列は以下の 通りである。 βァクチンにより補正した 「2250-01」 発現量 (copy/ng RNA) を 表 5およぴ図 1に示す。
• β ァクチンフォーワードプライマ一
TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG Α (配列番号： 10)
• β ァクチンリパースプライマー
CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G (配列番号： 1 1)
. iSァクチン TaqManプローブ
5， - (FAM) ATGCCC-T (TAMRA) - CCCCCATGCCATCCTGCGTp- 3， （配列番号： 1 2) FAM: 6 - carboxy -; luorescein
TAMRA:6 - carboxy— N, N， '， N， -tetramethylr odamine
表 5
2250- 01発現量 (co 'Py/ng RNA)
患者番号 增悪期 寛解期
1 454. 19 5298. 42
2 137. 06 167. 13
3 53. 86 4543. 94
4 1577. 46 642. 43
5 403. 84 4655. 96
6 3745. 25 801. 14
7 173. 98 286. 83
( 4 ) 統計解析
上記のデータを利用して、 パラメトリック多重比較検定、 およびノンパラメト リック多重比較検定を行った。 上記のアトピー性皮膚炎患者 7例の内 4例 （患者 番号 1， 2， 3, 5) については， 治療による寛解期への移行に伴って好酸球数が 顕著に減少する。 血中好酸球数は， アトピー性皮膚炎の有用な臨床指標となって いる。 そこで、 寛解期への に伴って好酸球数が顕著に減少する患者試料 （患 者番号 1, 2, 3， 5) (n=4) 4例のみについても統計的に解析した。 統計解析は、 The SAS SYSTEMの SAS前臨床パッケージ Version 4. 0 (SAS Institute Inc. )を 用いて行った。 結果を表 6に示す。 表 6
2250-01発現量 （copy/ng RNA)
対応のある 2群の検定 好酸球減少群 (n=4) \Z
t検定 Wilcoxon検定 ついての対応のある 2群 パラメトリック ノンパラメ トリック の t 定
E<R D=0. 274 E<R p=0. 2969 E<R p=0. 0572 その結果、 上記のアトピー性皮膚炎患者 7例中 3例の患者 （患者番号 1, 3, 5) において、 2250- 01の発現の著しい上昇が観察された。 この 3例の患者は、 治療による寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少する 4例 （表 2参照） の患者に含まれていた。 血中好酸球数は、 アトピー性皮膚炎の有用な臨床指標と なっている。 そこで、 寛解期への移行に伴って好酸球数が顕著に減少するこれら 4例の患者試料 （患者番号 1, 2, 3, 5) (n=4) の 2250- 01の発現量の変化を統 計的に解析した。 統計解析は、 The SAS SYSTEMの SAS前臨床パッケージ Version 4. 0 (SAS Institute Inc. )を用いて行った。
その結果、 増悪期に比べ寛解期で有意に発現が上昇することが確認された （P= 0. 0572) 。 逆に好酸球の減少が見られない患者には、 発現の著しい低下が見られ た （患者番号 4, 6) 。 以上の知見は、 2250- 01がアトピー性皮膚炎の寛解期にお ける好酸球の減少に伴って、 発現が上昇することを示している。
[実施例 2 ] 各種血液細胞での 2250-01の発現
5人の健常人の末梢血から分離した細胞での 2250-01の発現を調べた。 好酸球 (E) の分離は上記の通り行った。 好中球 （N) は好酸球を溶出させた後、 CD16 抗体磁気ビーズでトラップされた細胞を磁界から外して溶出、 回収して調製した。 一方、 フイコール遠心分離で中間層に回収される単球画分を、 MACS CD3抗体磁 気ビーズにより溶出画分 (M: monocyteと B cell の混合物） とトラップされる画 分 （T cell画分） に分離した。 次に、 溶出画分を MACS CD14抗体磁気ビーズに より、 溶出画分 (B cell画分）とトラップされる画分 （moocyte画分） に分け、 そ れぞれを精製 T細胞、 精製 B細胞、 そして精製単球とした。
好酸球は Isogen、 好中球、 T細胞、 B細胞、 そして単球は RNeasy (Qiagen)を 用いて可溶化し、 全 RNA抽出、 DNase処理後 （方法は前述の通り） 遺伝子発現解 析に供した。 用いたプライマー、 プローブ等は上記と同一である。 これらの血球 細胞での平均発現量 （AVERAGE: copy/ng (補正値)） は以下の通りであった。 好酸球 (E) ：960
好中球 (N) ： 73
好塩基球 (B) ： 36
T細胞 (T) ： 11
単球 (M) : 103
この結果は、 2250-01が好酸球特異的に発現していることを示している。
[実施例 3 ] 塩基配列の伸長
実施例 1で決定した塩基配列に基づいて、 5， RACE法により 2250-01の塩基配 列解析を進めた。 さらに、 SMART cDNA Library Construction kit (CL0NTECH) により末梢血好酸球 RNAから作製したファージ cDNAライブラリ一を用いて、 プ ラークハイブリダィゼーシヨンによるクローニングを行った。 2250-01の配列内 に設計したプライマー 2250- 01F及ぴ 2250- 01Rを用いて 2250-01の配列を含むプ ラスミドを錶型に増幅後、 精製した 259bpの PCR産物をプロープとして用いた。 その結果 2250-01の配列を含む約 2kbのィンサ一トを持つクローンが得られた。 決定した塩基配列 2087bpを配列番号： 1 5に示す。 ゲノムデータベース解析の 結果、 この配列は NOR- 1 (MINOR)と呼ばれる核内ォーファン受容体のィントロン 部分であることが分かった。
·プライマー配列
2250-01F ： GTTCCAGGCAATAACATCATACC (配列番号： 1 3 ) 2250-01R ： GCTACTTGTGAAACTCCCAAATG (配列番号： 1 4 ) [実施例 4 ] NOR- 1遺伝子の発現解析
NOR- 1 (MINOR)の報告されているェクソン配列について 7700による発現測定を 行った。 TaqMan法に使用したプライマーおょぴプローブは次の通りである。
Primerl (5' ) ： TGGGTGCCCTGGTAGAACT (配列番号： 1 6 )
Primer2 (3，） ： GCTTCAGGTAGAAGATGCGCT (配列番号： 1 7 )
TaqMan probe ： AGGAAGATCTGCACCCTGGGCCTC (配列番号： 1 8 )
その結果、 イントロン部分で測定したときの結果と同様に、 好酸球減少のみら れた著効例の寛解期に誘導されるという傾向は再現した （図 2 ) 。
ァトピー性皮膚炎の、 治療による寛解期に末梢血好酸球でこのようなアポトー ティックな性格が示唆されるような遺伝子が亢進しているのは、 末梢血好酸球数 の減少とよく対応しており、 この遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性 が高いと考えられる。
[実施例 5 ] NOR- 1受容体リガンドの探索 . 好酸球を特異的に細胞死に導く経路を、 NOR- 1 (MINOR)の機能の増強を通じて促 進することは、 喘息のみでなく、 本発明者らが調べたアトピー性皮膚炎も含めた 種々のァレルギ一性疾患の治療に繋がる可能性が高い。 NOR- 1 (MINOR)は構造上核 内受容体である力 オーブァン受容体であり生体内リガンドゃ活性化物質はまだ わかっていない。 もしもそれらが見出されれば、 好酸球細胞内でダイレクトに N 0R - 1 (MIN0R)を活性ィ匕しアポトーシスを促進させることができる。 従って、 リガ ンド活性物質は抗ァレルギ一薬としての可能4が高いと考え、 リガンドスタリー ユングのためのハイスループット系を構築した。
Mammalian Two Hybrid のシステムを若干改変し、 図 3のように、 pBIND の中 に N0R - 1 (MINOR)のリガンド結合領域配列または全長遺伝子 （図 4 ) を揷入し、 N OR- 1と GAL4の DNA結合領域が in frameで融合したタンパク質が発現されるよ うにした。 NOR- 1 (MINOR)の場合は、 他のサブファミリー （び と iS ) と異なり、 転写活性に N末に近い A F 1領域が重要であることが推察され、 Mammalian Hybr id システムにおいてもリガンド結合領域だけでなく全長遺伝子を挿入すること が必要であることが分かった。 実際、 リガンド結^ ϋ域のみを組み込んだスクリ 一二ング系では、 哺乳類のメタポリックマップ上に存在する、 生体内リガンドの 可能性のあるどのような脂溶性代謝物にも活性が見出されなかつた。 N0R-1 (MIN0 R)の全長遺伝子を pBINDに揷入したプラスミドと GAL4結合サイトをもつたルシ フェラーゼレポータープラスミドを NIH3T3細胞にコトランスフエクシヨンし、 ルシフェラーゼ活性を自動測定した。 この系にさらに低分子物質を加えて、 転写 増強活 14でスクリーユングを行うことができる。
NOR- 1 (MINOR)は、 ァトピー性皮膚炎末梢血のような白血球が機能亢進した状態 で発現誘導され、 その結果として細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。 生体内に存在するリガンドは、 核内受容体が高発現している場所に存在する可能 性がある。 そこで、 このような条件で産生されると予想される低分子の脂溶性メ ディエーターをリガンド候補としてアツセィ系に加え、 ノレシフェラーゼ活生の増 強作用で評価した。 脂溶性メディエーターの中から、 prostaglandin A2、 prosta glandin A，、 15 (R) - 15- methyl prostaglandin A2、 16-phenoxy tetranor prosta glandin A2、 17— phenyl trinor prostaglandin A2等のシクロペンテノン構造を もったプロスタグランジンに、 N0R - 1 (MINOR)の転写活性ィヒ能を増強させる作用が あることを見出した （図 5、 表 7〜1 3 ) 。 このように本発明者らの確立した方 法によって、 ハイスループットで NOR- 1 (MINOR)の生体内リガンド及ぴ合成リガ ンドを発見する道が開かれたとともに、 prostaglandin A2、 prostaglandin 等 の化合物おょぴその近辺の代謝物が、 NOR- 1 (MINOR)の真の生体内リガンドとして の可能性が高いことが明らかになった。 Norl LBD -リ^ 化合物名 構造式 活性
RXR(+) RXR (-）
Prostaglandin A2 x x
Prostaglandin A x x
Figure imgf000050_0001
OH
16,16 - dimethyl
Prostaglandin A2 X X
OH
Prostaglandin A3 x X
Figure imgf000051_0001
OH
Prostaglandin
ethyl ester x X
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OH
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17 - phenyl trinor
Prostaglandin A2 x x o O
10/ M 10// M
17-phenyl trinor- 13,14-dihydro X x x x
Prostaglandin A2
19(R)-hydroxy
Prostaglandin A2 x X X x
11 15-deoxy-A 12'14- Prostaglandin A, COOH X X X X
Prostaglandin J2 X X X X
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15- deoxy-厶 12'14- COOH X X o X Prostaglandin J2 10 M
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5 [実施例 6 ] パーチャル化合物
ファーマコフォアモデルにより、 P GA誘導体の Norlリガンド結合領域に対 する結合位置をシミュレートし （図 6 ) 、 P G A誘導体のレポーター系における 構造活性相関情報から、 結合ポケットに同様にはまる P GA誘導体以外の化合物 をカタリスト D Bにより選択した （BioByte Master File 2001 39, 383化合物、 2, 198, 646 confsよりスクリ一ユング） 。 シミュレーションの結果、 強く結合す る化合物として選ばれてきた 1 5 5化合物のリスト （含む構造式） を表 1 4〜4 9、 次に選ばれてきた 2 8 1化合物のリストを表 5 0〜 5 8に示す。
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[実施例 7 ] LBD欠失変異体 （LBD deletion mutant) による活性低下
Mammalian Two Hybrid レポーター系において、 N o r 1の L B D領域を完全 に欠失させた遺伝子を導入したところ、 prostaglandin A2による転写活性は顕 著に抑制された （図 7 ) 。 したがって、 prostaglandin A2は実際にこれらの核 内受容体の L B D領域に作用して働いていることが示唆された。
[実施例 8 ] ビアコアによる P G A誘導体の N o r 1への結合の証明
Mammalian Two Hybrid レポーター系において明らかになった、 N o r 1に対 する PGA誘導体のリガンド結合活性を完全証明するために、 N o r 1の G S T— L B Dを大腸菌で発現させ精製した。 ビアコア S 5 1を用い、 GSTとの比較対照 のもと、 N o r 1の LBDに PGA1、 PGA2が結合している様子を捉えることができ た （図 8 ) 。 レポーターで活性のなかったネガティブコントロール化合物の 13, 14-dihydro-15-keto-PGA2では LBDに結合しなかった。
[実施例 9 ]
了トピー性皮膚炎の、 治療による寛解期に末梢血好酸球でこのようなアポトー ティックな性格が示唆されるような遺伝子が亢進しているのは、 末梢血好酸球数 の減少とよく対応しており、 この遺伝子の発現誘導は治療効果と相関する可能性 が高いと考えられる。 そこで、 どのような刺激でこの遺伝子が好酸球から発現さ れるかを 7 で調べた。
健常人から末梢血好酸球を大量に採取し、 シャーレでの活性化を抑えて浮遊培 養させ、 IL- 5や IL- 4などのサイトカイン刺激で活性化させたが、 N o r 1の誘 導はみられなかった。 それに対し、 好酸球に特異的な細胞内経路でアポトーシス を誘導させ、 喘息などの治療薬として可能性があることから最近注目されている 好酸球 CD30に対するァゴニスト活性をもった抗 CD30抗体で、 細胞をアポトーシ ス刺激すると、 1― 3時間の処理の間に培養末梢血好酸球中で N o r 1が劇的に 誘導されることが明らかになった （表 5 9、 図 9 ) 。 以下の表 5 9は、 ヒ ト末梢 血好酸球のアポト一シス誘導についてまとめたものである。 表 5 9
ヒト末梢血好酸球のアポトーシス誘導
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抗 Fas抗体では、 抗 CD30抗体より反応が遅いながらアポトーシスが起こるに も関わらず、 N o r 1の誘導がかからなかったので、 これまでとは違った好酸球 特異的アポトーシス経路の可能性がある。 これらの現象 （アポトーシス誘導及ぴ N o r 1の発現誘導） は、 好酸球特異的細胞株である AML14. 3D10を抗 CD30抗体 で処理したときも同様に観察された （図 1 0、 1 1 ) 。
この、 好酸球を特異的に細胞死に導く経路を、 N o r 1の機能の増強を通じて 促進することは、 喘息のみでなく、 本発明者らの調べたアトピー性皮膚炎も含め た種々のァレルギ一疾患の治療に繋がる可能性が高い。 本発明者らの意図する治 療戦略の一例を図 1 2に示す。
[実施例 1 0 ] トランスジエニック （TG) マウスの確立 ヒト N o r 1遺伝子をァクチンプロモーターで導入した T Gマウスの確立に成 功した （図 1 3 ) 。 このマウスは、 体重が野生株の半分しかなく、 胸腺、 脾臓の 萎縮が観察された。 脾臓細胞数が減少し、 その機能も低下していた。 N o r 1を 介したアレルギー疾患解析の動物モデルとして使用できる。 産業上の利用の可能性
本突明により、 アトピー性皮膚炎患者の増悪期と寛解期とで好酸球において発 現に差の見られる遺伝子が提供された。 本発明の遺伝子の発現を指標にすること により、 アレルギー性疾患の検査、 および治療薬候補化合物のスクリーニングを 行うことが可能となった。
本発明におけるアレルギー性疾患関連遺伝子は、 ァレルゲンの種類にかかわら ず、 簡便にその発現レベルを知ることができる。 従って、 アレルギー反応の病態 を総合的に把握することができる。
また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、 末梢血好酸球を試料としてその 発現レベルを解析することができるので、 患者に対する侵襲性が低い。 遺伝子解 析技術は、 年々ハイスループット化、 低価格化が進行している。 従って本発明に よるアレルギー性疾患の検查方法は、 近い将来、 ベッドサイドにおける重要な診 断方法となることが期待される。 この意味で本発明の方法の診断的価値は高い。 更に、 本発明のスクリーニング方法は、 アトピー性皮膚炎の代表的な臨床マー カーである好酸球の増減と密接に関連する遺伝子機能を指標として実施される。 従って、 このスクリーニング方法によって見出すことができる化合物は、 幅広い ァレルギ一の病態制御に有用であると期待できる。
また本発明により されるアレルギー性疾患治療薬は、 NOR - 1の活性化とそ れに伴う好酸球のアポトーシス誘導という全く新し 、作用機序をもった医薬品と して有用である。

Claims

請求の範囲
1. 次の工程を含む、 アレルギー性疾患の検査方法。
(a) 被検者の好酸球細胞における、 NOR— 1受容体タンパク質、 または前 記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
( b ) 健常者の好酸球細胞における前記タンパク質または遺伝子の発現レベル と比較する工程
2. 遺伝子の発現レベルを、 cDNAの PCRによつて測定する、 請求項 1に記載 の検査方法。
3. アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、 請求項 1または 2に記載の 検査方法。
4. NO -1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその相 補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴ ヌクレオチドからなる、 ァレルギ一性疾患検查用試薬。
5. 次の工程 (1) および （2) を含む、 候補化合物が下記 （a) または
(b) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
(1) 下記 （a) または （b) に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞に侯補 化合物を接触させる工程
(a) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 ァ トピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が 増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2) 前記 （a) または （b) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定す る工程、
6. 細胞が株化白血球細胞である請求項 5に記載の方法。 .
7. 次の工程 (1) および （2) を含む、 候補化合物が下記 （a) または (b) に記載のポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する方法。
(a) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、 ァ トピー性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴つて好酸球において発現が 増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(1) 被検動物に候補化合物を投与する工程、 および
(2) 被検動物の好酸球細胞における前記 （a) または （b) に記載のポリヌク レオチドの発現強度を測定する工程、
8. 請求項 5〜 7のいずれかに記載の方法によって、 前記発現レベルに与える 影響を検出し、 対照と比較して前記発現レベルを上昇させる化合物を選択す る工程を含む、 前記 (a) または （b) に記載のポリヌクレオチドの発現レ ベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法。
9. 次の工程 (1) および （2) を含む、 候補化合物が NOR— 1受容体タン パク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルに与える影響を検出する 方法。
(1) NOR— 1受容体タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域と、 レポ 一タ一遺伝子とが機能的に結合した構造を有する D N Aを含む細胞または 細胞抽出液と、 候補化合物を接触させる工程、 および
(2) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
1 0. 請求項 9に記載の方法によって、 候補化合物の前記活性に与える影響を 検出し、 対照と比較して前記活性を上昇させる化合物を選択する工程を含 む、 NOR— 1受容体タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇 させる化合物のスクリーニング方法。
11. 次の工程 (1) 〜 （3) を含む、 アレルギー性疾患治療薬のための候補 化合物をスクリーニングする方法。
( 1 ) NO R— 1受容体タンパク質と被験化合物を接触させる工程
(2) NOR— 1受容体タンパク質と被験化合物との結合活性を測定する工程
(3) NOR-1受容体タンパク質と結合する化合物を選択する工程
12. 次の工程 (1) 〜 （4) を含む、 アレルギー性疾患治療薬のための候補 化合物をスクリーユングする方法。
( 1 ) NOR-1受容体タンパク質または該タンパク質のリガンド結 ^域と転 写調節領域結合タンパク質との融合タンパク質を発現し得る D N A、 およ び該転写調節領域結合タンパク質の結合する D NA配列の下流にレポータ 一遺伝子が機能的に結合した構造を有する DNA、 を導入した細胞を提供 する工程
(2) 前記細胞と被検化合物を接触させる工程
(3) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
(4) 前記活性を変化させる化合物を選択する工程
13. 請求項 10〜12のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得る ことができる化合物を有効成分として含有する、 ァレルギ一性疾患治療薬。
14. 請求項 10〜12のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得る ことができるシク口ペンテノン構造を有するプロスタダランジンを有効成 分として含有するァレルギ一性疾患治療薬。
15. NOR— 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアレルギー性疾
16. NOR— 1受容体のリガンドが、 シクロペンテノン構造を有するプロス タグランジンである、 請求項 15に記载のアレルギー性疾患治療薬。
17. シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、 プロスタグラン ジン A2、 プロスタグランジン 、 16, 16-ジメチル プロスタグランジン A2、 15 (R) - 15 -メチルプロスタグランジン A2、 16-フエノキシテトラノルブ ロスタグランジン A2、 17 -フエュル トリノル プロスタグランジン A2、 15- デォキシ-デルタ 12, 14-プロスタグランジン J2、 および 8-イソ プロスタ グランジン からなる群より選択される、 請求項 1 6に記載のアレルギー
1 8. NOR— 1受容体のリガンドが、 表 14〜 58に掲載されたいずれかの 化合物である、 請求項 1 5に記載のアレルギー性疾患治療薬。
1 9. ァレルギ一性疾患がァトピー性皮膚炎である、 請求項 1 3〜 1 8のいず れかに記載の治療薬。
20. 下記の （ a ) または （ b ) に記載のポリヌクレオチドの好酸球細胞にお ける発現強度を低下させたトランスジエニック非ヒト脊椎動物からなるァ レルギ一性疾患モデル動物。
(a) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(b) NOR— 1受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、 アトピ 一性皮膚炎の寛解期に好酸球の減少に伴って好酸球において発現が増加す るタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
2 1. トランスジエニック動物が、 ノックアウト動物である請求項 20に記載 のモデル動物。 .
22. 細胞における NOR— 1受容体タンパク質を活性化させることを特徴と する、 細胞のアポトーシス誘導方法。
23. 請求項 1 0〜1 2のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得る ことができる化合物またはシク口ペンテノン構造を有するプロスタグラン ジンと、 細胞を接触させる工程を含む、 請求項 22に記載のアポトーシス 誘導方法。
2 4 . 細胞が好酸球細胞である、 請求項 2 2または 2 3に記載のアポトーシス
2 5 . 請求項 1 0〜 1 2のいずれかに記載のスクリ一二ング方法によって得る ことができるィ匕合物またはシクロペンテノン構造を有するプロスタグラン ジンを含む、 アポトーシス誘導剤。
2 6 . N O R— 1受容体のリガンドを有効成分として含有するアポトーシス誘
2 7 . N O R— 1受容体のリガンドが、 シクロペンテノン構造を有するプロス タグランジンである、 請求項 2 6に記載のアポトーシス誘導剤。
2 8 . シクロペンテノン構造を有するプロスタグランジンが、 シクロペンテノ ン構造を有するプロスタグランジンが、 プロスタグランジン A2、 プロス タグランジン Aい 16， 16-ジメチルプロスタグランジン A2、 15 (R) - 15-メ チル プロスタグランジン A2、 16 -フエノキシ テトラノル プロスタグラ ンジン A2、 17-フエエル トリノルプロスタグランジン A2、 15-デォキシ- デルタ 12， 14-プロスタグランジン J2、 および 8-イソ プロスタグランジ ン からなる群より選択される、 請求項 2 7に記載のアポトーシス誘導 剤。
2 9 . N O R— 1受容体のリガンドが、 表 1 4〜 5 8に掲載されたいずれかの 化合物である、 請求項 2 6に記載のアポトーシス誘導剤。
3 0 . 好酸球 C D 3 0受容体のリガンドを含む、 N O R— 1遺伝子発現誘導剤。
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