WO2004087763A1 - Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用 - Google Patents

Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用 Download PDF

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Masayuki Tsuchiya
Naoki Kimura
Tatsuya Fukuda
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a low-molecular-weight antibody that recognizes CD22.
  • CD22 is a molecule belonging to the Ig superfamily, and its expression is thought to be specific to B cells and to play a role in suppressing signals from B cell receptors. It is known that CD22 is expressed on various B-cell leukemias and malignant lymphoma cells in hematopoietic diseases. Since soluble CD22 was not detected in the serum, it is considered that CD22 can be used for antibody therapy (Non-Patent Documents 1 to 5).
  • Patent Documents 1 and 2 disclose the relationship between the anti-CD22 antibody and apoptosis-inducing activity.
  • Non-Patent Document 6 Non-Patent Document 6
  • apoptosis induction there is no description about apoptosis induction.
  • Non-Patent Document 1 Kazuhiro Nishii CURRENT RHERAPY Vol. 20 No. 1 47-50
  • Non-patent document 2 Tedder et al., Ann Rev Immunol 15: 481-504 (1997) (Non-patent document 3) Clark EA J Immunol 150: 4715-4718 (1993
  • Non-Patent Document 5 Li et al., Cell Immunol 118: 85-99 (1993)
  • Non-Patent Document 6 Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7509-7514 (199 7)
  • Patent Document 1 (Patent Document 1) Special Table 2001-518930
  • Patent Document 2 Tokiohei 10-505231
  • Patent Document 3 W099 / 02567 Disclosure of the Invention
  • a first object of the present invention is to provide a low-molecular-weight antibody that recognizes CD22.
  • a further object of the present invention is to provide a new method for treating hematopoietic tumors using the low-molecular-weight antibody.
  • the present inventors aimed at producing a diabody which is a low-molecular-weight antibody against CD22.
  • the nucleotide sequence of the CD22 diabody in which the variable regions were linked by a 5-mer linker was designed and synthesized (Flag-tag was inserted into the diabody to facilitate purification).
  • the synthesized cDNA is introduced into an animal cell expression vector, and this is introduced into DG44 cells or C0S7 cells. From the culture supernatant, the produced diabody is used as an anti-Flag M2 agaro
  • the product was purified using a source.
  • the present inventors then examined the two types of diabodies thus obtained for their activity in binding to lymphoma cells and inducing cell death (apoptosis). As a result, it was found that all of these diabodies bind to Raji cells, which are B lymphoma cell lines, and that the diabodies also have an activity of inducing apoptosis in Raji cells and Daudi cells, which are also eight lymphoma cell lines.
  • the above results indicate that a low-molecular-weight antibody that recognizes CD22 can be used as an apoptosis inducer for tumor cells such as lymphoma cells.
  • the present invention provides the following (1) to (12).
  • a low molecular weight antibody functionally equivalent to the low molecular weight antibody according to (c).
  • a low molecular weight antibody having the amino acid sequence of the CDR of SEQ ID NO: 9 and the CDR of SEQ ID NO: 11.
  • a low-molecular-weight antibody which is functionally equivalent to the low-molecular-weight antibody according to (c).
  • the low molecular weight antibody according to any one of (1) to (3) As an active ingredient, the low molecular weight antibody according to any one of (1) to (3), and the low molecular weight antibody produced by the method according to any one of (4) to (6). , Antitumor agents.
  • the present invention provides minibodies that recognize CD22.
  • the minibodies of the present invention are useful in that their activities are increased.
  • the activity refers to a biological action caused by binding of an antibody to an antigen.
  • a specific example is Apoto It has a cis-inducing effect and an antitumor effect.
  • Cells targeted for apoptosis-inducing action, anti-tumor action and the like are not particularly limited, and tumor cells are preferable. As specific examples of tumor cells, lymphoma cells and leukemia cells are most preferred.
  • administration of the low-molecular-weight antibody recognizing the above-mentioned CD22 enables administration of, for example, tumors such as hematologic tumors (specific examples include leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, chronic myeloid leukemia, Cellular abnormalities (multiple myeloma, macroglobulinemia), myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocythemia, idiopathic myelofibrosis), and autoimmune disorders (specific examples) Rheumatism, autoimmune hepatitis, autoimmune thyroiditis, autoimmune bullous disease, autoimmune adrenocortitis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune atrophic gastritis, Autoimmune neutropenia, autoimmune orchitis, autoimmune encephalomyelitis, autoimmune receptor disease, autoimmune infertility, Crohn's disease, system
  • CD22 belongs to the Ig superfamily, is composed of seven Ig-like domains, and is a molecule present on 19ql3.1 on the gene (Tedder et al., Ann Rev Immunol 15: 481-504 (1997) ).
  • the low-molecular-weight antibody is not particularly limited as long as it includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (such as whole and ibody, for example, whole IgG) is deleted and has an antigen-binding ability.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody, and preferably contains a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL), and particularly preferably VH And a fragment containing both VL.
  • the antibody fragment include, for example, Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, scFv (single chain Fv), and the like, preferably scFv (Huston, JS et al., Pro Natl. A cad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883, Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies J Vol. 113, Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)".
  • the antibody is treated with an enzyme, for example, papain, pepsin, etc., to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and expressed.
  • expression can be carried out in a suitable host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (198 9) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, Rous seaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, RE and Walker, BW, Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).
  • a suitable host cell for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A.
  • the minibodies of the present invention preferably have smaller molecular weights than full-length antibodies, but for example, may form multimers such as dimers, trimers and tetramers, and have a lower molecular weight than full-length antibodies. It can be large.
  • a preferred low-molecular-weight antibody in the present invention is an antibody containing two or more VHs and two or more VLs of an antibody, wherein these variable regions are directly or indirectly bound via a linker or the like.
  • the bond may be a covalent bond or a non-covalent bond, and may be both a covalent bond and a non-covalent bond.
  • More preferred low-molecular-weight antibodies are antibodies containing two or more VH-VL pairs formed by non-covalent bonding of VH and VL. In this case, an antibody in which the distance between one VH-VL pair and the other VH-VL pair in the minibodies is shorter than the distance in a full-length antibody is preferable.
  • a particularly preferred low-molecular-weight antibody in the present invention is Diabody.
  • Diabody is a dimerization of two variable regions (e.g., scFv, etc.) in which a variable region is linked with a linker or the like (hereinafter, fragment 1 constituting Diabody) by linking two fragments. , Two VLs and two VHs (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993), EP404097, W093 / 11161, Johnson et al.
  • the bond between the fragments constituting Diabody may be non-covalent or covalent, but is preferably non-covalent.
  • fragments constituting the diabody can be linked to each other with a linker or the like to form a single-chain diabody (scDiabody).
  • scDiabody single-chain diabody
  • fragments constituting Diabody examples include VL and VH, VL and VL, VH and VH, and preferably VH and VL.
  • the linker that binds the variable regions is not particularly limited. However, it is preferable to use a linker that is short enough to prevent non-covalent bonding between the variable regions in the same fragment.
  • the length of such a linker can be appropriately determined by those skilled in the art, but is usually 2 to 14 amino acids, preferably 3 to 9 amino acids, and particularly preferably 4 to 6 amino acids.
  • diabody in the present invention examples include the following, but are not limited thereto. 1. Diabody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3
  • One or more amino acid sequences in the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 5 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 7 are mutated (substitution, deletion, insertion, and A diabody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and a CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 5 and a CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 7;
  • the target diabody is a diabody having the sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3, a CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 5, and a CDR of SEQ ID NO: 7 (Or a variable region), or an equivalent activity to a Diabody having the CDR (or variable region) sequence of SEQ ID NO: 9 and the CDR (or variable region) of SEQ ID NO: 11 (eg, CD22 binding activity, apoptosis-inducing activity, etc.).
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids. Preferably it is less than 15 amino acids, more preferably less than 5 amino acids (for example, less than 3 amino acids). It is desirable that the amino acid residue to be mutated is mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • amino acids having an aromatic-containing side chain H, F, Y, W
  • amino acid sequence corresponding to the variable region described in SEQ ID NO: 5 31 to 35 correspond to CDR1, 50 to 66 correspond to CDR2, and 99 to 105 correspond to CDR3.
  • amino acid sequence corresponding to the variable region described in SEQ ID NO: 7 24 to 40 correspond to CDR1, 56 to 62 correspond to CDR2, and 95 to 103 correspond to CDR3.
  • SEQ ID NO: 11 is an amino acid sequence corresponding to the variable region described in 11, 24 to 34 correspond to CDR1, 50 to 56 correspond to CDR2, and 89 to 97 correspond to CDR3.
  • the low molecular weight antibody that recognizes CD22 is not particularly limited as long as it specifically binds to CD22 and has a biological effect.
  • the minibodies of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, as described in Examples, gene recombination techniques known to those skilled in the art based on the sequence of an antibody that recognizes CD22 (particularly the sequence of the variable region and the sequence of the complementary chain determining region (CDR)). It is possible to produce using.
  • sequence of the antibody recognizing CD22 a sequence of a known antibody can be used.
  • an anti-CD22 antibody is prepared by a method known to those skilled in the art, and the sequence of the antibody is used. Can be obtained and used. Specifically, for example, it can be performed as follows.
  • the CD22 protein or a fragment thereof is used as a sensitizing antigen, and immunized according to a usual immunization method.
  • the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, and a usual screening method is performed. Screens monoclonal antibody-producing cells (Hypridoma).
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using baculovirus (TO98 / 46777, etc.).
  • the production of the hybridoma can be performed, for example, according to the method of Milstin et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). If the immunogenicity of the antigen is low, it can be conjugated with a macromolecule having immunogenicity such as aluminin and immunized. Thereafter, cDNA for the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase, and the sequence of the obtained cDNA may be decoded by a known method.
  • the antibody that recognizes CD22 is not particularly limited as long as it binds to CD22, and a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a sheep antibody, a human antibody, and the like can be used as appropriate.
  • artificially modified genetics for the purpose of reducing xenoantigenicity to humans, etc.
  • Recombinant antibodies for example, chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can also be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than human, for example, an antibody comprising a heavy chain and light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and light chain constant region of a human antibody. It can be obtained by ligating the encoding DNA to the DNA encoding the constant region of the human antibody, inserting the DNA into an expression vector, introducing the DNA into a host, and producing.
  • the humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody.
  • the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than human, for example, a mouse antibody is complementarily determined by the human antibody. It has been transplanted into a region, and its general gene recombination technique is also known. Specifically, several DNA sequences designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody were prepared with an overlapping portion at the end. Is synthesized from the oligonucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No.
  • the molecular weight can be reduced and then chimerized or humanized, or the molecular weight can be reduced after chimerized and humanized. You can.
  • a method for obtaining a human antibody is known. For example, sensitizing human trimer cells in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and sensitizing lymphocytes to the human
  • the desired human antibody having antigen-binding activity can also be obtained by fusing it with an emoma cell, for example, U266 (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication No. WO 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735).
  • a technique for obtaining a human antibody by Panjung using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector containing the sequence.
  • the antibody of the present invention may be a conjugate antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, and a toxin.
  • PEG polyethylene glycol
  • a radioactive substance such as radioactive substance
  • a toxin such as toxin.
  • Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods for modifying antibodies have been already established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the present invention includes a DNA encoding the antibody of the present invention. It also includes a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions and encodes an antibody having an antigen-binding ability and activity.
  • Hybridization technology (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) is known to those skilled in the art, Can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Hybridization conditions include, for example, low stringency conditions. What is a low stringent condition?
  • the conditions are, for example, 42 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and preferably the conditions are 50 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • More preferable hybridization conditions include high stringency conditions.
  • High stringency conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that the higher the temperature, the more efficiently DNA with high homology can be obtained.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors that influence the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize similar stringency by appropriately selecting these factors. It is possible.
  • the DNA of the present invention is used not only for production of the antibody of the present invention in vivo or in ⁇ '/ ⁇ , but also for application to gene therapy, for example.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the antibody of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • DNAs having any base sequence based on the degeneracy of the genetic code are included as long as they can encode the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. Specifically, the DNA of the desired antibody is incorporated into the expression vector. At that time, it is incorporated into an expression vector so that the expression is controlled under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. At that time, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • pGEM-T for the purpose of cDNA subcloning and excision, pGEM-T, pDIRECT, pT7, etc. may be mentioned in addition to the above vectors.
  • a vector When a vector is used to produce the antibody of the present invention, Current vectors are useful.
  • an expression vector for example, when expression in Escherichia coli is intended, in addition to having the above-mentioned characteristics such that the betatta is amplified in Escherichia coli, the host can be used in Escherichia coli such as 109, DH5a, HB101, XLl-Blue, etc.
  • a promoter that can be efficiently expressed in Escherichia coli for example, lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J.
  • Such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), rQIAexpress system] (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase) in addition to the above vectors.
  • BL21 is preferred).
  • the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when produced in E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the Shii-Dani calcium method or the electroporation method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) or pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors ( For example, ⁇ 1, pMH 2), an expression vector derived from an animal virus (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), an expression vector derived from a retrovirus (eg, pZIPneo), an expression vector derived from a yeast (eg, rpichia Expression KitJ (manufactured by Invitrogen) ), PNV11 SP-Q01), and Bacillus subtilis-derived expression vectors (eg, pPL608, pKTH50).
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors ( For example, ⁇ 1, p
  • promoters necessary for expression in cells such as SV40 promoter (Mulli gan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EFICK promoter (Mizushima et al., ucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. It is more preferable to have a gene (for example, a drug-resistant gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)) for selecting transformation into cells. Examples of the vector having such characteristics include, for example, one, pDR2, pBK-RSV, pBK_CMV, pOPRSV ⁇ pOP13, and the like.
  • a vector having a DHFR gene that complements a nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell can be introduced and amplified with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • the gene expressing the SV40 T antigen can be transferred to the chromosome.
  • a method of transforming a COS cell with a vector having an SV40 origin of replication (eg, pcD) using the COS cell of the present invention can be used.
  • the expression vector is used as a selectable marker to amplify the gene copy number in the host cell system, such as aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, It can contain the dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, and for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method, an adenovirus method, or the like is used. And how to introduce it As a vector to be used, for example, an adenovirus vector
  • pAdexlcw and a retroviral vector (for example, pZIPneo), but are not limited thereto.
  • General gene manipulation such as introduction of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61-5.63). Administration into a living body may be performed by the e ⁇ method or the in 2o method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the antibody of the present invention.
  • Production systems for polypeptide production include ini and i / 7o production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • Animal cells include mammalian cells, for example, CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, African Mega frog oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 are known.
  • Examples of the CH0 cells include dhfr_CH0 (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector is introduced into a host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using force ribosome D0TAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, or a lipofection method. It is possible.
  • Nicotiana 'Tapakamu the mcotiana tabacum derived cell is known as a polypeptide production system and this may c fungal cells to callus culture, yeast, e.g., Saccharomyces ⁇ Saccharomyces) genus
  • yeast e.g., Saccharomyces ⁇ Saccharomyces
  • filamentous fungi such as genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger are known.
  • bacterial cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • JM109 JM109
  • DH5a DH5a
  • HB101 HB101
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • An antibody can be obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vit.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution for animal cells.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) may be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in ira include a production system using animals and a production system using plants.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the animals or plants and collected.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide uniquely produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target antibody can be obtained from milk produced by a transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing polypeptides produced from transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • a place to use silkworms the target polypeptide can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with the baculovirus into which the target DNA has been inserted (Susumu, M. et al.,
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA of interest is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • the bacteria are infected with tobacco, for example, Nicotia tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of the tobacco (Julian K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from host cells or extracellularly (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody.
  • the separation and purification of the antibody may be carried out by using the separation and purification methods used in ordinary antibody purification, and is not limited at all. For example, chromatographic columns, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. If combined, the antibody can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Cnaracterization: A Laooratory). (Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 0
  • chromatography methods can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. it can.
  • the present invention also encompasses highly purified antibodies using these purification methods.
  • the antigen-binding activity of an antibody can use known methods.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Enzyme immunoassay Enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay can be used.
  • whether or not the antibody of the present invention induces apoptosis in tumor cells can be determined based on whether or not to induce cell death in Daudi cells or Raji cells in the same manner as in the Examples. it can.
  • the present invention also provides an apoptosis inducer or an antitumor agent comprising the low-molecular-weight antibody of the present invention as an active ingredient. Since these activities of the minibodies of the present invention are considered to be particularly effective in lymphoma cells or leukemia cells, they are considered to be particularly effective in treating or preventing tumors such as cancer (particularly hematological tumors). When an anti-CD22 antibody that has not been reduced in molecular weight is used as an active ingredient, it is preferable to crosslink with an anti-IgG antibody or the like.
  • reagents can be bound to the above antibody and used as a conjugate antibody.
  • reagents can include chemotherapeutic agents, radioactive substances, toxins and the like.
  • a conjugate antibody can be prepared by a known method (US5057313, US5156840).
  • the above-mentioned drug can be administered as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method in addition to direct administration to a patient.
  • tablets, coated with bran, forcepsel, elixir, microforced orally, or sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or suspension It can be used parenterally in the form of suspension injections.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles It may be formulated in combination with a preservative, a binder, etc., as appropriate, by mixing in the unit dosage form required for accepted pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is indicated To obtain an appropriate capacity in the above range.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the preparation unit form is forcepsel, the above-mentioned materials may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride. It may be used in combination with an agent such as alcohol, specifically ethanol, polyalcohol such as propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant such as polysorbate 80 (TM) or HC0-50.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizing agents such as benzoyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, soothing agents such as proforce hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidants.
  • soothing agents such as proforce hydrochloride
  • stabilizers such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidants.
  • Administration to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. It can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by D
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the drug of the present invention may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, and administration method.
  • an adult usually has 1 dose. It is believed to be about 0.1 to 1000 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms and administration method.
  • it is usually 1 dose for adults (with a body weight of 60 kg).
  • it may be convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of the amount converted per body weight of 60 kg or the amount converted per body surface area.
  • FIG. 1 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of LL2diabody.
  • FIG. 2 is a view showing a base sequence and an amino acid sequence of RFB4diabody.
  • FIG. 3 is a photograph showing diabody purification. Each purified diabody was subjected to SDS-PAGE and subjected to CBB staining or Western blotting using an anti-Flag antibody. As a result, it was confirmed that all diabodies were not purified but almost purified.
  • FIG. 4 shows the confirmation of the binding ability of each diabody to Raji cells.
  • Each purified di abody was analyzed for its ability to bind to Raji cells. As a result, it was confirmed that each of the diabod y binds to Raji cells. Binding activity was stronger with RFB4diabody than with LL2diabody. However, since the LL2 antibody has been reported to have high internalize activity into cells, it is expected that many LL2 diabodies may be taken up after binding to cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing analysis of cytotoxic activity by each diabody.
  • Each diabody at each concentration (shown in the figure) was added to the cells, the cells after 20 hours by staining with PI, c the result of measuring the percentage of dead cells, relative to either CD22diabody also B lymphoma cell lines, confirmed to be induced cell death Was done. From these results, it was proved that the diabody-forming anti-CD22 antibody alone could induce cell death in B lymphoma cell lines.
  • SEQ ID NO: shows the sequence of the synthetic DNA used in 13 to 36.
  • the cDNA encoding Diabody was synthesized as follows. First, a DNA fragment of about 150 bp was prepared by mixing two oligo DNAs in an appropriate combination and subjecting them to anneal and extension reactions in a tube. Subsequently, by repeating the recombination reaction between the obtained DNA fragments several times, a cDNA of about 800 bp was finally synthesized.
  • LL2diabody high producing cell line The LL 2diabody high-producing cell line that had become confluent in the T-175 flask was transferred to two roller bottles (CH0-S-SFMII medium (GIBC0) 250 ml), and the culture supernatant was collected 5 days later. After removing dead cells by centrifugation, this was used for purification of LL2diabody through a 0.45 im filter.
  • pCXND3-RFB4DB 20 ⁇ g of pCXND3-RFB4DB was introduced into C0S7 cells by electroporation as follows. It was suspended in PBS C0S7 cells ICE-cold PBS in such that the LX10 7 / ml were washed twice. This was mixed with 20 g of the above plasmid, and an electric pulse (220 V, 950 ⁇ FD) was applied. Thereafter, all the cells were rolled into three T-225 flasks (DMEM + 10 ° / .FCS), and the culture supernatant was collected three days later. After removing dead cells by centrifugation, the cells were passed through a 0.45 ⁇ filter and used for purification of RFB42diabody.
  • the diabody was purified as follows. The diabody was adsorbed by adding Anti-Flag M2 Aga rose (SIGMA) to each of the collected culture supernatants and mixing at ⁇ 4 ° C. Anti-Flag M2 Agarose was collected by centrifugation, washed several times with PBS, and diabody was eluted with elution buffer (100 mM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20). The collected sample was immediately neutralized with Tris-HCl pH 8.0 to a final concentration of 25 mM. Concentrate this to 0.01% T e The buffer was replaced with PBS containing en20. A part of the collected sample was subjected to SDS electrophoresis, and Western blotting with anti-FLAG antibody and coomassie staining were performed to confirm that the target protein was purified.
  • SIGMA Anti-Flag M2 Aga rose
  • LL2diabody or RFB4diabody at 2 ° /.
  • the cells were added to the B lymphoma cell line Raji cells at a final concentration of 20 ⁇ g / ml and 8 wg / ml in PBS containing FCS and 0.02% NaN 3 and reacted on ice for 1 hour. Subsequently, an anti-Flag M2 antibody was added, and the mixture was further reacted on ice for 1 hour. After washing the cells, they were reacted with FITC-anti-mouse IgG on ice for 30 minutes, and the binding to the cell surface was measured using a flow cytoraetory (EPICS ELITE, COULTER).
  • B lymphoma cell lines, Raji and Daudi were seeded on a 24 well plate at 2-5 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the purified LL2diabody or RFB4diabody was added thereto, and the culture was continued at 37 ° C. After 20 hours, the cells were collected, and the dead cells were labeled by adding PI and reacting at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the proportion of dead cells stained was measured using flow cytometory (EPICS ELITE, COULTER).
  • the present invention is expected to provide a low-molecular-weight antibody having high specific activity.
  • a low-molecular-weight antibody By using such a low-molecular-weight antibody, sufficient drug efficacy can be expected even with a short half-life, and further, it is expected that a difference between drug efficacy and toxicity can be achieved.
  • the overall cost can be reduced, such as by reducing clinical doses and production costs, it is also expected to improve economic issues that are a problem in the development of antibody drugs.

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Abstract

既に公開されている二種類の抗CD22抗体の配列情報をもとに、重鎖と軽鎖の可変領域を5merのリンカーで連結させたCD22diabodyをそれぞれ作製した。作製した2種のdiabodyについて、リンパ腫細胞に対する結合及び細胞死（アポトーシス）誘導活性の検討を行った結果、これらdiabodyがいずれもBリンパ腫細胞株であるRaji細胞に結合し、さらに、いずれもRaji細胞および同じくBリンパ腫細胞株であるDaudi細胞にアポトーシスを誘導する活性があることが判明した。以上の結果は、CD22を認識する抗体の低分子化抗体がリンパ腫細胞などの腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導剤として利用できることを示している。

Description

C D 2 2に対する改変抗体およびその利用 技術分野
本発明は、 CD22を認識する抗体の低分子化抗体に関する。 背景技術
CD22は、 Igスーパーファミ リーに属する分子であり、 その発現は B細胞に特異的 で、 B細胞レセプターからのシグナルを抑制する機能を担っていると考えられてい る。 また、 CD22は、 造血器疾患において、 様々な B細胞性白血病、 悪性リンパ腫細 胞に発現していることが知られている。 血清中に可溶性の CD22は検出されていな いことから、 CD22は抗体療法が可能であると考えられている （非特許文献 1から 5 ) 。
造血器腫瘍における CD22抗体の利用に関しては、 ヒト化された抗 CD22抗体など を利用して B細胞悪性疾患の治療が可能である旨の報告がある （特許文献 1および 2 ) 。 しかしながら、 これら文献においては、 抗 CD22抗体とアポトーシス誘起活 性との関係については、 何ら開示されていない。
一方、 通常の抗 CD22抗体では認められなかったリンパ重細胞株である Daudiに対 する増殖抑制効果が、 抗 CD22抗体を架橋剤で化学的に cross- linkすることで、 認 められたとの報告がある （非特許文献 6 ) 。 ただし、 アポトーシス誘導に関する 記述はなされていない。
実際の治療において種々の利点を有する低分子化された抗体の利用に関しては、 CD22を含む数種の抗原に対する抗体 (Ig.Gヽ Fc部分を含まない Fab' 2) をクロスリ ンクし、 これを用いて腫瘍細胞のアポトーシスを誘起する方法が開示されている (特許文献 3 ) 。 し力 しながら、 この文献においては、 CD22に対する抗体は、 実 際に作成されておらず、 従って、 そのアポ 1、一シス誘起活性の検出も行われてい ない。
このように低分子化された抗 CD22抗体を利用して腫瘍細胞のアポトーシスを誘 導したとの報告はいまだなされていない。
なお、 本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献 1〕 西井一浩 CURRENT RHERAPY Vol. 20 No. 1 47 - 50
〔非特許文献 2〕 Tedder et al. , Ann Rev Immunol 15 : 481-504 (1997) 〔非特許文献 3〕 Clark EA J Immunol 150 : 4715-4718 (1993
〔非特許文献 4〕 Sato et al. , Immunity 5 : 551-562 (1996)
〔非特許文献 5〕 Li et al. , Cell Immunol 118 : 85-99 (1993)
〔非特許文献 6〕 Ghetie et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94： 7509-7514 (199 7)
〔特許文献 1〕 特表 2001- 518930
〔特許文献 2〕 特表平 10-505231
〔特許文献 3〕 W099/02567 発明の開示
そこで、 本発明の第一の目的は、 CD22を認識する抗体の低分子化抗体を提供す ることにある。 本発明のさらなる目的は、 この低分子化抗体を利用した新たな造 血器腫瘍の治療法を提供することにある。
本発明者らは、 CD22に対する低分子化抗体である diabodyを作製することを目的 として、 まず、 既に公開されている二種類の抗 CD22抗体の配列情報をもとに、 重 鎖と軽鎖の可変領域を 5merのリンカ一で連結させた CD22d i abodyの塩基配列をそれ ぞれ設計し、 その合成を行った （精製の容易化のため diabodyには Flag- tagを揷入 した） 。 合成した cDNAを動物細胞発現ベクターに揷入し、 これを DG44細胞あるい は C0S7細胞に導入し、 その培養上清から、 生産された diabodyを抗 Flag M2ァガロ ースを利用してァフイエティ一精製した。
本発明者らは、 次いで、 こうして得られた 2種の diabodyについて、 リンパ腫細 胞に対する結合及ぴ細胞死 （アポトーシス） 誘導活性の検討を行った。 その結果、 これら diabodyがいずれも Bリンパ腫細胞株である Raji細胞に結合し、 さらに、 レヽ ずれも Raji細胞および同じく 8リンパ腫細胞株である Daudi細胞にアポトーシスを 誘導する活性があることが判明した。 以上の結果は、 CD22を認識する抗体の低分 子化抗体がリンパ腫細胞などの腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導剤として利用 できることを示している。
即ち、 本発明は、 以下の （1 ) 〜 （1 2 ) を提供するものである。
( 1 ) CD22を認識する低分子化抗体。
( 2 ) Diabodyである （1 ) に記載の低分子化抗体。
( 3 ) 以下の （a ) 〜 （f) のいずれかに記載の低分子化抗体。
( a ) 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗 体。
( b ) 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列において 1もしくは 複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加した ァミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 （ a )に記載の低分子 化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
( c ) 配列番号： 5の CDRおよぴ配列番号： 7の CDRのァミノ酸配列を有 する低分子化抗体。
( d ) 配列番号： 5の CDRおよび配列番号： 7の CDRのァミノ酸配列にお いて、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 揷入、 および /または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、
( c ) に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
( e ) 配列番号： 9の CDRおよび配列番号： 1 1の CDRのァミノ酸配列を 有する低分子化抗体。 ( f ) 配列番号： 9の CDRおよび配列番号： 1 1の CDRのァミノ酸配列に おいて、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 揷入、 およ び/または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 ( c ) に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
(4) CD22を認識する抗体を低分子化することによって、 活性が上昇した抗 体を製造する方法。
(5) 低分子化が Diabody化である、 （4) に記載の方法。
(6) 活性がアポトーシス誘導活性である、 （4) または （5) に記載の方 法。
(7) (1) 〜 （3) のいずれかに記載の低分子化抗体、 （4) 〜 （6) の レ、ずれかに記載の方法によつて製造される低分子化抗体を有効成分とし て含有する、 アポトーシス誘導剤。
(8) 腫瘍細胞に対するアポトーシスを誘導する、 （7) に記載のアポトー シス誘導剤。
(9) 腫瘍細胞がリンパ腫細胞または白血病細胞である、 （8) に記載のァ ポトーシス誘導剤。
(1 0) (1) 〜 （3) のいずれかに記載の低分子化抗体、 （4) 〜 （6) のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分 として含有する、 抗腫瘍剤。
(1 1) 腫瘍が血液腫瘍である、 （10) に記載の抗腫瘍剤。
(1 2) 抗体が Diabodyである、 （7) から （9) のいずれかに記載のアポト 一シス誘導剤。
(1 3) 抗体が Diabodyである、 （10) または （1 1) に記載の抗腫瘍剤。 本発明は、 CD22を認識する低分子化抗体を提供する。 本発明における低分子化 抗体は、 活性が上昇している点で有用である。 ここで、 活性とは、 抗体が抗原に 結合することにより生じる生物学的作用をいう。 具体的な例としては、 アポトー シス誘導作用、 抗腫瘍作用である。
アポトーシス誘導作用、 抗腫瘍作用などの対象となる細胞は特に限定されない 、 腫瘍細胞が好ましい。 腫瘍細胞の具体的な例としては、 リンパ腫細胞や白血 病細胞が最も好ましい。
本発明においては、 上記 CD22を認識する低分子化抗体を投与することにより、 例えば、 血液腫瘍などの腫瘍 （具体的な例として、 白血病、 骨髄異形成症候群、 悪性リンパ腫、 慢性骨髄性白血病、 形質細胞異常症 （多発性骨髄腫、 マクログロ ブリン血症） 、 骨髄増殖性疾患 （真性赤血球増加症、 本態性血小板血症、 特発性 骨髄繊維症） など） や自己免疫疾患 （具体的な例として、 リウマチ、 自己免疫性 肝炎、 自己免疫性甲状腺炎、 自己免疫性水疱症、 自己免疫性副腎皮質炎、 自己免 疫性溶血性貧血、 自己免疫性血小板減少性紫斑病、 自己免疫性萎縮性胃炎、 自己 免疫性好中球減少症、 自己免疫性精巣炎、 自己免疫性脳脊髄炎、 自己免疫性レセ プター病、 自己免疫不妊、 クローン病、 全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症、 バセドウ病、 若年性糖尿病、 アジソン病、 重症筋無力症、 水晶体性ブドウ膜炎、 乾癬、 ベーチェット病、 など） のような疾患の治療、 予防などをおこなうことが 可能である。
本発明において、 CD22とは、 Igスーパーファミリーに属し、 7個の Ig様ドメイン からなり、 遺伝子上 19ql3. 1に存在する分子 (Tedder et al. , Ann Rev Immunol 1 5 : 481-504 (1997) ) を意味する。
本発明において低分子化抗体とは、 全長抗体 (whole andibody、 例えば whole Ig G等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、 抗原への結合能を有していれば特 に限定されない。 本発明の抗体断片は、 全長抗体の一部分であれば特に限定され ないが、 重鎖可変領域 (VH) 又は軽鎖可変領域 (VL) を含んでいることが好まし く、 特に好ましいのは VHと VLの両方を含む断片である。 抗体断片の具体例として は、 例えば、 Fab, Fab' 、 F (ab' ) 2、 Fv、 scFv (シングルチェイン Fv) 、 などを 挙げることができるが、 好ましくは scFv (Huston, J. S. et al. , Pro Natl. A cad. Sci. U. S. A. (1988) 85， 5879 - 5883、 Plickthun 「The Pharmacology of Mo noclonal AntibodiesJ Vol. 113, Resenburg及び Moore編， Springer Verlag, Ne w York, pp. 269-315, (1994) )である。 このような抗体断片を得るには、 抗体を酵 素、 例えば、 パパイン、 ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させる力、 又は、 これら抗体断片をコードする遗伝子を構築し、 これを発現べクタ一に導入した後、 適当な宿主細胞で発現させればよレ、 (例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra, A.， Methods Enzymol. (198 9) 178， 497-515 ； Lamoyi, E. , Methods Enzymol. (1986) 121, 652 - 663 ； Rous seaux, J. et al.， Methods Enzymol. (1986) 121， 663—669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9， 132- 137参照） 。
本発明における低分子化抗体は、 全長抗体よりも分子量が小さくなることが好 ましいが、 例えば、 ダイマー、 トリマー、 テトラマーなどの多量体を形成するこ と等もあり、 全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
本発明において好ましい低分子化抗体は、 抗体の VHを 2つ以上及び VLを 2つ以上 含み、 これら各可変領域を直接あるいはリンカ一等を介して間接的に結合した抗 体である。 結合は、 共有結合でも非共有結合でもよく、 また、 共有結合と非共有 結合の両方でよい。 さらに好ましい低分子化抗体は、 VHと VLが非共有結合により 結合して形成される VH-VL対を 2つ以上含んでいる抗体である。 この場合、 低分子 化抗体中の一方の VH - VL対と他方の VH - VL対との間の距離が、 全長抗体における距 離よりも短くなる抗体が好ましい。
本発明において特に好ましい低分子化抗体は Diabodyである。 Diabodyは、 可変 領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント (例えば、 scFv等) (以下、 Diabodyを構成するフラグメン 1、) を 2つ結合させて二量体化させたものであり、 通常、 2つの VLと 2つの VHを含む（P. Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9 0, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al. , Method in Enzymology, 203, 88 - 98, (1991)、 Holliger et al. , Protein Engineering, 9， 299-305, (1996)、 Peri sic et al.， Structure, 2， 1217 - 1226, (1994)、 John e t al. , Protein Engineering, 12 (7) , 597 - 604， (1999)、 Holliger et al, . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90， 6444-6448， （1993)、 Atwell et al. , Mo 1. Immunol. 33， 1301 - 1312， （1996) )。 Diabodyを構成するフラグメント間の結合は非共有結合で も、 共有結合でよいが、 好ましくは非共有結合である。
また、 Diabodyを構成するフラグメント同士をリンカ一などで結合して、 一本鎖 Diabody (scDiabody) とすることも可能である。 その際、 Diabodyを構成するフラ グメント同士を 20アミノ酸程度の長いリンカ一を用いて結合すると、 同一鎖上に 存在する Diabodyを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、 二量体 を形成する。
Diabodyを構成するフラグメントは、 VLと VHを結合したもの、 VLと VLを結合した もの、 VHと VHを結合したもの等を挙げることができるが、 好ましくは VHと VLを結 合したものである。 Diabodyを構成するフラグメント中において、 可変領域と可変 領域を結合するリンカ一は特に制限されないが、 同一フラグメント中の可変領域 の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカ一を用いることが好ましい。 そ のようなリンカ一の長さは当業者が適宜決定することができるが、 通常 2〜1 4 アミノ酸、 好ましくは 3〜9アミノ酸、 特に好ましくは 4〜6アミノ酸である。 この場合、 同一フラグメント上にコードされる VLと VHとは、 その間のリンカ一が 短いため、 同一鎖上の VLと VHの間で非共有結合がおこらず、 単鎖 V領域フラグメン トが形成されない為、 他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。 さらに、 Diabody作製と同じ原理で、 Diabodyを構成するフラグメントを 3つ以上結 合させて、 トリマー、 テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可 能である。
本発明における Diabodyとしては、 下記のものを例示できるが、 これらに限定さ れるものではない。 1 . 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列を有する Diabody
2 . 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミ ノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 揷入、 および zまたは付加） したアミノ酸配 列を有する Diabodyであって、 配列番号： 1または 3に記載の配列を有する Di abodyと機能的に同等な Diabody
3 . 配列番号： 5の CDR (又は可変領域） および配列番号： 7の CDR (又は可変領 域） のアミノ酸配列を有する Diabody
4 . 配列番号： 5の CDR (又は可変領域） および配列番号： 7の CDR (又は可変領 域） のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 揷入、 および Zまたは付加） したアミノ酸配列を有する Diabodyであつ て、 配列番号： 5の CDR (又は可変領域） および配列番号： 7の CDR (又は可 変領域） の配列を有する Diabodyと機能的に同等な Diabody
5 . 配列番号： 9の CDR (又は可変領域） および配列番号： 1 1の CDR (又は可変 領域） のァミノ酸配列を有する Diabody
6 . 配列番号： 9の CDR (又は可変領域） および配列番号： 1 1の CDR (又は可変 領域） のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異 （置換、 欠失、 挿入、 および/または付加） したアミノ酸配列を有する Diabodyであつ て、 配列番号： 9の CDR (又は可変領域） および配列番号： 1 1の CDR (又は 可変領域） の配列を有する Diabodyと機能的に同等な Diabody
ここで 「機能的に同等」 とは、 対象となる Diabodyが、 配列番号： 1または 3に 記載の配列を有する Diabody、 配列番号： 5の CDR (又は可変領域） および配列番 号： 7の CDR (又は可変領域） の配列を有する Diabody、 または、 配列番号： 9の C DR (又は可変領域） および配列番号： 1 1の CDR (又は可変領域） の配列を有する Diabodyと同等の活性 （例えば、 CD22への結合活性、 アポトーシス誘導活性など） を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、 通常、 30アミノ酸以内であり、 好 ましくは 15アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内 （例えば、 3ァ ミノ酸以内） であると考えられる。 変異するァミノ酸残基におレ、ては、 アミノ酸 側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。 例えば アミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、 親水性ァミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミ ノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 T、 Υ) 、 硫黄 原子含有側鎖を有するアミノ酸 （C、 M) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有す るアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族 含有側鎖を有するアミノ酸 （H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいず れもアミノ酸の一文字標記を表す） 。 あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個の アミノ酸残基の欠失、 付加及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾された ァミノ酸配列を有するポリぺプチドがその生物学的活性を維持することはすでに 知られている (Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5 662-5666 、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 64 87-6500 、 Wang, A. et al. , Science 224, 1431—1433 、 Dalbadie— McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409 - 6413) 。
また、 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列を有する Diabody、 配列番 号： 5の CDR (又は可変領域） および配列番号： 7の CDR (又は可変領域） の配列 を有する Diabody、 または配列番号： 9の CDR (又は可変領域） および配列番号： 1 1の CDR (又は可変領域） の配列を有する Diabodyを、 ヒ トに対する異種抗原性 を低下させること等を目的としてヒ ト型化、 キメラ化してもよい。
配列番号： 5に記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、 3 1〜3 5が CDR1、 5 0— 6 6が CDR2、 9 9〜： 1 0 5が CDR3に相当する。 配列番号： 7に 記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、 2 4〜4 0が CDR1、 5 6〜 6 2が CDR2、 9 5〜1 0 3が CDR3に相当する。 配列番号： 9に記載されている可 変領域に相当するァミノ酸配列で、 3 1〜 3 5が CDR1、 5 0 - 6 6が CDR2、 9 9 〜1 1 2が CDR3に相当する。 配列番号： 1 1に記載されている可変領域に相当す るァミノ酸配列で、 2 4〜 3 4が CDR1、 5 0〜 5 6が CDR2、 8 9 - 9 7が CDR3に 相当する。
本発明において CD22を認識する低分子化抗体は、 CD22に特異的に結合し、 生物 学的作用を有していれば特に制限されない。 本発明の低分子化抗体は、 当業者に 公知の方法により作製することが可能である。 例えば、 実施例に記載されている ように、 CD22を認識する抗体の配列 （特に可変領域の配列や相補鎖決定領域 （CD R) の配列） を基に、 当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可 能である。
CD22を認識する抗体の配列は、 既に公知の抗体の配列を用いることが可能であ り、 又、 CD22を抗原として、 当業者に公知の方法により抗 CD22抗体を作製し、 そ の抗体の配列を取得して用いることも可能である。 具体的には、 例えば、 以下の ようにして行うことができる。 CD22タンパク質若しくはその断片を感作抗原とし て使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通 常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法によ り、 モノクローナルな抗体産生細胞 （ハイプリ ドーマ） をスクリーエングする。 抗原の調製は公知の方法、 例えばバキュロウィルスを用いた方法 （TO98/46777な ど） 等に準じて行うことができる。 ハイプリ ドーマの作製は、 たとえば、 ミルス ティンらの方法 (Kohler. G. and Milstein, C.， Methods Enzymol. (1981) 73： 3-46 ) 等に準じて行うことができる。 抗原の免疫原性が低い場合には、 アルプミ ン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、 免疫を行えばよレ、。 その後、 ハイ プリ ドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 （V領域） の cDNAを合成 し、 得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればよい。
CD22を認識する抗体は、 CD22と結合する限り特に制限はなく、 マウス抗体、 ラ ット抗体、 ゥサギ抗体、 ヒッジ抗体、 ヒ ト抗体等を適宜用いることができる。 又、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝 子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized) 抗体 なども使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することがで きる。 キメラ抗体は、 ヒ ト以外の哺乳動物、 例えば、 マウス抗体の重鎖、 軽鎖の 可変領域とヒ ト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、 マウス抗体 の可変領域をコードする DNAをヒ ト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、 こ れを発現べクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることがで さる。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト以外の哺乳動 物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR ; complementarity determining region) をヒ ト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝 子組換え手法も知られている。 具体的には、 マウス抗体の CDRとヒ ト抗体のフレー ムワーク領域 (framework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、 末 端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチ ドから PCR法により合成する。 得られた DNAをヒ ト抗体定常領域をコードする DNAと 連結し、 次いで発現ベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し産生させること により得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 96 /02576参照） 。 CDRを介して連結されるヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好な 抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ ト抗体の相補 性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームヮ ーク領域のアミノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
これらキメラ抗体ゃヒ ト型化抗体などについては、 低分子化した後にキメラ化 ゃヒ ト型化等を行ってもよいし、 キメラ化ゃヒ ト型化等を行つた後に低分子化を 行ってもよレ、。
また、 ヒ ト抗体の取得方法も知られている。 例えば、 ヒ トリンバ球を / vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、 感作リンパ球をヒ トミ エローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 抗原への結合活性を有する所望のヒ ト抗 体を得ることもできる (特公平 1 - 59878参照） 。 また、 ヒ ト抗体遣伝子の全てのレ パートリーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望 のヒ ト抗体を取得することができる (国際特許出願公開番号 W0 93/12227， W0 92/ 03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735参照) 。 さらに、 ヒ ト抗体ライブラリーを用いて、 パンユングによりヒ ト抗体を取得する技術も知 られている。 例えば、 ヒ ト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) としてファージ ディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 抗原に結合するファージを選 択することができる。 選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合す るヒ ト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合 する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を揷入した適当な発現ベクターを 作製し、 ヒ ト抗体を取得することができる。 これらの方法は既に周知であり、 W0 92/01047， W0 92/20791， W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172， W0 95/01438, W0 95/15388を参考にすることができる。
本発明の抗体は、 ポリエチレングリコール （PEG) 、 放射性物質、 トキシン等の 各種分子と結合したコンジユゲート抗体でもよい。 このようなコンジユゲート抗 体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。 本癸明における 「抗 体」 にはこれらのコンジユゲート抗体も包含される。
本発明は、 本発明の抗体をコードする DNAを包含する。 又、 該 DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズし、 抗原への結合能及び活性を有する抗体をコ 一ドする DNAを包含する。 ハイブリダィゼーシヨン技術（Sambrook, J et al. , Mole cular Cloning 2nd ed.， 9. 47—9. 58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989) は 当業者に公知であり、 ハイブリダイゼーションの条件は、 当業者であれば適宜選 択することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 例えば、 低スト リンジェントな条件が挙げられる。 低ストリンジヱントな条件とは、 ハイブリダ ィゼーション後の洗浄において、 例えば 42°C、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSの条件であり、 好ましくは 50°C、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSの条件である。 より好ましいハイブリダイ ゼーシヨンの条件としては、 高ストリンジ工ントな条件が挙げられる。 高ストリ ンジェントな条件とは、 例えば 65°C、 5 X SSC及び 0. 1 %SDSの条件である。 これら の条件において、 温度を上げる程に高レ、相同性を有する DNAが効率的に得られるこ とが期待できる。 但し、 ハイブリダィゼーションのストリンジエンシーに影響す る要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら 要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能であ る。
本発明の DNAは、 本発明の抗体の ώ vivoや in τ ' /Όにおける生産に利用される 他、 例えば、 遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明の抗 体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mRNAから合成され た cDNAであるか、 ゲノム DNAである力、 化学合成 DNAであるかなどを問わない。 ま た、 本発明の抗体をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列 を有する DNAが含まれる。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。 具体的には、 目的とする抗体の DNAを発現べクタ一^ >組み込む。 その際、 発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込 む。 次に、 この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる。 その際には、 適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用するこ とができる。
べクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系べクタ一、 pBR322、 pBluescript, pCR-Scri ptなどが挙げられる。 また、 cDNAのサブクローニング、 切り出しを目的 とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM-T、 pDIRECT, pT7などが挙げら れる。
本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、 特に、 発 現ベクターが有用である。 発現ベクターとしては、 例えば、 大腸菌での発現を目 的とした場合は、 ベタターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を 109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、 大腸 菌で効率よく発現できるようなプロモーター、 例えば、 lacZプロモーター （Ward ら， Nature (1989) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6， 2422-2427) 、 araBプロ モ一ター （Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043 ) 、 または T7プロモータ 一などを持っていることが不可欠である。 このようなベクターとしては、 上記べ クタ一の他に pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製） 、 rQIAexpress system] (キアゲ ン社製） 、 pEGFP、 または pET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現してい る BL21が好ましい）などが挙げられる。
また、 ベクターには、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 ポリぺプチド分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリプラズ ムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bacteriol. (198 7) 169， 4379 ) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩ィ匕 カルシウム法、 エレクトロボレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明のポリペプチドを製造するためのベクターと しては、 哺乳動物由来の発現ベクター （例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製） や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17)， p5322)、 pEF、 pCDM8) 、 昆虫 細胞由来の発現ベクター （例えば 「Bac - to- BAC baculovairus expression syste m」 （ギブコ BRL社製） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH 2) 、 動物ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) 、 レト ロウィルス由来の発現ベクター (例えば、 pZIPneo) 、 酵母由来の発現ベクター (例えば、 rpichia Expression KitJ (ィンビトロゲン社製) 、 pNVl l SP-Q0 1) 、 枯草菌由来の発現ベクター (例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモーター （Mulli ganら， Nature (1979) 277, 108) 、 MMLV-LTRプロモーター、 EFI CKプロモーター (Mizushimaら, ucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) 、 CMVプロモータ一など を持っていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための遣伝子 (例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など) により判別できるような薬剤耐-性遗 伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターとしては、 例えば、 1通 1、 pDR2、 pBK-RSV, pBK_CMV、 pOPRSVヽ pOP 13などが挙げられ.る。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する DHFR 遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ トトレキセート （MT X) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目的とする 場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の 複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。 複製開始 点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィルス、 ゥシパピローマウイ ルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子 コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マーカーとして、 アミノグリコシドト ランスフ： ラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサン チングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒ ドロ葉 酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNAを 適当なベクターに組み込み、 例えば、 レトロウィルス法、 リボソーム法、 カチォ ニックリボソーム法、 アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが 拳げられる。 用いられるベクターとしては、 例えば、 アデノウイルスベクター
(例えば pAdexlcw) やレトロウィルスベクター（例えば pZIPneo) などが挙げられ るが、 これらに制限されない。 ベクタ一への本発明の DNAの揷入などの一般的な遺 伝子操作は、 常法に従って行うことが可能である （Molecular Cloning ， 5. 61-5. 6 3) 。 生体内への投与は、 e ぴ法であっても、 in 2 o法であってもよい。 また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。 本発明 のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、 例えば、 大腸菌や 種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の宿主細胞は、 例えば、 本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。 ポリべ プチド製造のための産生系は、 in i および i/7 oの産生系がある。 in vitro の産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙 げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945) 、 COS, 3T3、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeL a、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカッメガエル卵母細胞 （Valle, et al.， Nat ure (1981) 291， 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が知ら れている。 CH0細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞である dhfr_CH 0 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216—4220) や CHO K— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60， 1275) を好適に使用することができる。 動物細胞に おいて、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい。 宿主細胞へのベ クタ一の導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 力チォニ ックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製) を用いた方法、 エレク ト口 ポーレーション法、 リポフエクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ 'タパカム 、mcotiana tabacum) 由来 の細胞がポリペプチド生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい c 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス {Saccharomyces) 属、 例えば、 サッカロミセス ' セレビシェ Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 例えば、 ァスぺノレギノレス {Aspergillus) 属、 例えば、 ァスぺノレギノレス ·二ガー {Aspergil lus niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては、 大腸菌 coli) 、 例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯草 菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を ώ vit で培養することにより抗体が得られる。 培養は、 公知の方法に従い行うこと力 できる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IMDM を使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用するこ ともできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8であるのが好まし レ、。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要に応じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in iraでポリペプチドを産生させる系としては、 例えば、 動物を使用す る産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に目的と する DNAを導入し、 動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、 回収する。 本 発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glase r， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) 。 また、 哺乳類動物を用いる 場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ カゼインのような乳汁中に固有に産生される ポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この 融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚 を受容したャギから生まれるトランスジェニックャギ又はその子孫が産生する乳 汁から、 目的の抗体を得ることができる。 トランスジヱニックャギから産生され るポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトランスジェ ニックャギに使用してもよい (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 699-702) 。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的の DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、 こ のカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる （Susumu, M. et al. ,
Nature (1985) 315， 592-594) 。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的の DNAを植物発現用ベクター、 例えば pMON 530に揷入し、 このべ クターをァグロバタテリゥム · ッメファシェンス {Agrobac terium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテリアをタバコ、 例えば、 ニコチア ナ .タバカム Nicotia tabacum) に感染させ、 本タバコの葉より所望のポリべ プチドを得ることができる （Julian K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) 。
これにより得られた本発明の抗体は、 宿主細胞内または細胞外 （培地など） カ ら単離し、 実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。 抗体の分離、 精製は、 通常の抗体の精製で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマトグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせれ ば抗体を分離、 精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相クロ マトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる (Strategies for Prot ein Purification and Cnaracterization： A Laooratory Course Manual. Ed Dan iel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 0 これ らのクロマトグラフィ一は、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィ一を用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製方法 を用い、 高度に精製された抗体も包含する。
本発明において、 抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed H arlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手 段を使用することができる。 例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法) 、 EIA
(酵素免疫測定法) 、 RIA (放射免疫測定法) あるいは蛍光免疫法などを用いるこ とができる。
本発明において、 本発明の抗体が腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するか 否かは、 実施例と同様にして Daudi細胞又は Raji細胞に対して細胞死を誘導するか 否かにより判定することができる。
また、 本発明は、 本発明の低分子化抗体を有効成分として含有する、 アポトー シス誘導剤または抗腫瘍剤を提供する。 本発明の低分子化抗体のこれら活性は、 リンパ腫細胞または白血病細胞で特に効果が大きいと考えられるので、 癌などの 腫瘍 （特に血液腫瘍） の治療や予防に特に有効であると考えられる。 低分子化さ れていない抗 CD22抗体を有効成分として用いる場合には、 抗 IgG抗体などでクロス リンクすることが好ましい。
上記抗体には各種試薬を結合してコンジユゲート抗体として使用することもで きる。 このような試薬としては、 化学療法剤、 放射性物質、 トキシンなどを挙げ ることができる。 このようなコンジユゲート抗体は公知の方法により作製するこ とができる （US5057313、 US5156840) 。
上記薬剤は、 直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化し た医薬組成物として投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて糠衣を 施した錠剤、 力プセル剤、 ェリキシル剤、 マイクロ力プセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁 液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体も しくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面 活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み合 わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することに よつて製剤化することが考えられる。 これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 力プセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状 担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のような べヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D -ソルビトール、 D -マンノース、 D -マンニトール、 塩化ナトリ ゥムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非ィ オン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HC0-50と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ノレ、 ベンジルアルコールと併用してもよレ、。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよレ、。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が D によりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクターに組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 本発明の薬剤の投与量は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方 法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） にお いては、 1日あたり約 0. 1から 1000mg、 好ましくは約 1. 0から 50mg、 より好ましくは 約 1. 0から2 Omgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） においては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好 ましくは約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えら れる。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積あた りに換算した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 LL2diabodyの塩基配列およびァミノ酸配列を示す図である。
図 2は、 RFB4diabodyの塩基配列おょぴァミノ酸配列を示す図である。
図 3は、 diabodyの精製を示す写真である。 精製した各 diabodyを SDS-PAGEし、 C BB染色、 または、 抗 Flag抗体でウェスタンプロットを行った。 その結果、 いずれ の diabodyも完全ではないがほぼ精製されていることが確認された。
図 4は、 各 diabodyの Raji細胞への結合能の確認を示す図である。 精製した各 di abodyの、 Raji細胞への結合能について解析を行った。 その結果、 いずれの diabod yも Raji細胞へ結合することが確認された。 結合活性は LL2diabodyよりも RFB4diab odyの方が強かった。 ただし LL2抗体は細胞内への internalize活性が高いことが報 告されているため、 多くの LL2diabodyは細胞に結合後、 細胞内に取り込まれてし まっている可能性が予想される。
図 5は、 各 diabodyによる細胞傷害活性の解析を示す図である。 CD22を高度に発 現することが知られている 2種類の Bリンパ腫細胞株、 Daudi、 Raj iに対する CD22di abodyの細胞傷害活性を測定した。 それぞれの diabodyを各濃度 （図中に示す） で 細胞に添加し、 20時間後に細胞を PIで染色することで、 死細胞の割合を測定した c その結果、 いずれの CD22diabodyも Bリンパ腫細胞株に対して、 細胞死を誘導して いることが確認された。 この結果より、 diabody化した抗 CD22抗体が、 単独で Bリ ンパ腫細胞株に対して細胞死を誘導できることが証明された。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施 例に制限されるものではない。
[実施例 1 ] CD22diabody発現べクタ一の作製
既に公開されている二種類の抗 CD22抗体、 すなわち LL2 (特許第 3053873号） 、 R FB4 (JP 2002501488- A) の配列情報をもとに、 重鎖と軽鎖の可変領域を 5merのリ ンカーで連結させた CD22diabodyの塩基配列をそれぞれ設計した。 （LL2diabody、 R FB4diabody) 0 図 1 (配列番号： 1、 2 ) およぴ図 2 (配列番号： 3、 4 ) に、 そ れぞれの diabodyの配列を示す (リンカーをアンダーライン、 Flag-tagを波線で示 す） 。
設計した LL2diabody、 及び、 RFB4diabodyをコードする cDNAを合成するため、 各 diabodyにっきそれぞれ 12種類ずつオリゴ DNAを作製した （エスペックオリゴサー ビス株式会社） 。 配列番号： 1 3から 3 6に使用した合成 DNAの配列を示す。
Diabodyをコードする cDNAは以下のとおりに合成した。 まず、 各オリゴ DNA2本ずつ を適切な組み合わせで混合しそれぞれをチューブ内でァニール、 および伸長反応 させることで、 150bp程度の DNA断片を作製した。 続いて得られた DNA断片同士によ る recombination反応を数回繰り返すことで、 最終的に約 800bpからなる cDNAの合 成を行った。
合成して得られた各 cDNAを EcoRI - Notl切断し、 動物細胞発現べクター pCXND3の E coRI- Notl間に挿入した。 塩基配列を確認し、 LL2diabody発現ベクター（PCXND3- LL 2DB)および、 RFB4diabody発現ベクター（PCXND3- RFB4DB)の構築を終了した。 [実施例 2 ] CD22diabodyの精製
(1) LL2diabody発現細胞株の樹立と培養上清の回収
Pvulで切断し、 直鎖化した pCXND3-LL2DB 20 gを DG44細胞に以下のように elect roporation法により導入した。 DG44細胞を ice- cold PBSで 2回洗浄した後 lX107/ml になるように PBSに懸濁した。 これに ZO ^u gの上記プラスミドを混合し、 電気パル ス （1. 5KV, 25 FD) を与えた。 適当な割合で細胞を希釈し 96well plateに撒きこ み、 終濃度 500 /i g/ml G418 (GIBC0)存在下で培養を行った。 生育したコロニーを含 む wellより〜 30クローンほどピックアップし、 それら培養上清中の diabodyの発現 をウェスタンブロットにより調べた。 発現の認められたクローンを拡大後、 これ を LL2diabody高産生細胞株とした。 T- 175フラスコ中でコンフルェントになった LL 2diabody高産生細胞株を 2本のローラーボトル（CH0- S- SFMII培地（GIBC0) 250ml)に 移し、 5日後に培養上清を回収した。 遠心によって死細胞を除去した後、 0. 45 i m のフィルターを通してこれを LL2diabodyの精製に用いた。
(2) RFB4diabodyの cos7での一過性発現と培養上清の回収
pCXND3-RFB4DB 20 μ gを C0S7細胞に以下のように electroporation法により導入 した。 C0S7細胞を ice- cold PBSで 2回洗浄した後 lX107/mlになるように PBSに懸濁 した。 これに 20 gの上記プラスミドを混合し、 電気パルス （220V， 950 μ FD) を 与えた。 その後全細胞を T- 225フラスコ 3本に巻き込み（DMEM+10°/。FCS)、 3日後に培 養上清を回収した。 遠心によって死細胞を除去した後、 0. 45 μ πιのフィルターを通 してこれを RFB42diabodyの精製に用いた。
(3) diabodyの精製
diabodyの精製は以下のとおり行つた。 回収した各培養上清に Anti-Flag M2 Aga rose (SIGMA)を加え、 ー晚 4°Cで混合することにより diabodyを吸着させた。 Anti - Flag M2 Agarose を遠心により回収し PBSで数回洗浄した後、 溶出 Buffer (lOOmM Glycine H3. 5, 0. 01% Tween 20)で diabodyを溶出した。 回収したサンプルは直ち に終濃度 25mMになるように Tris-HCl pH8. 0で中和した。 これを濃縮し、 0. 01% T e en 20を含む PBSにバッファー置換した。 回収したサンプルの一部を SDS電気泳動し、 抗 FLAG抗体によるウェスタンブロット、 および、 クマシ一染色を行い、 目的の蛋 白が精製されていることを確認した。
[実施例 3 ] CD22diabodyのリンパ腫細胞への結合の確認
精製した LL2diabody、 または、 RFB4diabodyを 2°/。FCS, 0. 02%NaN3を含む PBS中で それぞれ終濃度が 20 μ g/ml、 8 w g/mlになるように Bリンパ腫細胞株 Raj i細胞に加 え、 氷上で 1時間反応させた。 続いて、 抗 Flag M2抗体を加え、 さらに氷上で 1時間 反応させた。 細胞を洗浄後、 FITC -抗マウス IgGと氷上で 30分反応させた後、 細胞 表面への結合を flow cytoraetoryを用いて測定した （EPICS ELITE, COULTER) 。
[実施例 4 ] CD22diabodyによるリンパ腫細胞の細胞死誘導活性の解析
Bリンパ腫細胞株、 Raji、 及び、 Daudiを、 2〜5 X 105 cells/wellになるように 2 4 well plateに細胞を撒いた。 これに、 精製した LL2diabody、 または RFB4diabody を添カ卩し 37°Cで培養を続けた。 20時間後細胞を回収し、 PIを加え室温で 15分反応 させることで死細胞をラベルした。 その後、 flow cytometoryを用いて染色された 死細胞の割合を測定した （EPICS ELITE, COULTER) 。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 高比活性の低分子化抗体を提供できるものと期待される。 該 低分子化抗体を使用することで、 短い半減期でも十分な薬効が期待でき、 さらに、 薬効と毒性の乖離が可能になるものと期待できる。 また、 臨床投与量の低減化お よび生産コストの低減化など、 コスト全体の低減化が図れるので抗体医薬品の開 発上問題になる経済面問題の改善もまた期待される。

Claims

請求の範囲
1 . CD22を認識する低分子化抗体。
2 . Diabodyである請求項 1に記載の低分子化抗体。
3 . 以下の ( a ) 〜 (f) のレ、ずれかに記載の低分子化抗体。
( a ) 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列を有する低分子化抗体。 ( b ) 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数 のァミノ酸配列が置換、 欠失、 揷入、 および/または付加したアミノ酸 配列を有する低分子化抗体であって、 （ a )に記載の低分子化抗体と機能 的に同等な低分子化抗体。
( c ) 配列番号： 5の CDRおよび配列番号： 7の CDRのァミノ酸配列を有する 低分子化抗体。
( d ) 配列番号： 5の CDRおよび配列番号： 7の CDRのァミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 挿入、 および Zまたは付 加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 （c ) に記載の低 分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
( e ) 配列番号： 9の CDRおよび配列番号： 1 1の CDRのァミノ酸配列を有す る低分子化抗体。
( f ) 配列番号： 9の CDRおよび配列番号： 1 1の CDRのァミノ酸配列におい て、 1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、 欠失、 挿入、 および Zまた は付加したァミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、 （ c ) に記載 の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
4 . CD22を認識する抗体を低分子化することによって、 活性が上昇した抗体を 製造する方法。
5 . 低分子化が Diabody化である、 請求項 4に記載の方法。
6 · 活性がアポトーシス誘導活性である、 請求項 4または 5に記載の方法。 請求項 1〜 3のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 4〜 6のいずれか に記載の方法によつて製造される低分子化抗体を有効成分として含有する、 アポトーシス誘導剤。
腫瘍細胞に対するアポトーシスを誘導する、 請求項 7に記載のァポトーシ ス誘導剤。
腫瘍細胞がリンパ腫細胞または白血病細胞である、 請求項 8に記載のアポ トーシス誘導剤。
. 請求項 1〜 3のいずれかに記載の低分子化抗体、 請求項 4〜 6のいずれ 力 こ記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分として含有す る、 抗腫瘍剤。
. 腫瘍が血液腫瘍である、 請求項 1 0に記載の抗腫瘍剤。
. 抗体が Diabodyである、 請求項 7から 9のいずれかに記載のアポトーシス . 抗体が Diabodyである、 請求項 1 0または 1 1に記載の抗腫瘍剤 c
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