WO2005056603A1 - 細胞死誘導剤 - Google Patents

細胞死誘導剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2005056603A1
WO2005056603A1 PCT/JP2004/018501 JP2004018501W WO2005056603A1 WO 2005056603 A1 WO2005056603 A1 WO 2005056603A1 JP 2004018501 W JP2004018501 W JP 2004018501W WO 2005056603 A1 WO2005056603 A1 WO 2005056603A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
chain variable
amino acid
variable region
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/018501
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Naoki Kimura
Masayuki Tsuchiya
Masahiko Nanami
Takashi Tomimatsu
Shigeto Kawai
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to US10/582,304 priority Critical patent/US20070280951A1/en
Priority to AU2004297109A priority patent/AU2004297109A1/en
Priority to CA002548929A priority patent/CA2548929A1/en
Priority to JP2005516197A priority patent/JP4767016B2/ja
Priority to EP04820311A priority patent/EP1712565A4/en
Publication of WO2005056603A1 publication Critical patent/WO2005056603A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to sc (Fv) 2, an antibody that recognizes HLA.
  • the HLA class I antigen is formed by a 45KD ⁇ -chain composed of three domains ( ⁇ 1, ⁇ 2, a3) and a 12KD ⁇ 2-microglobulin heterodimer.
  • the major role of the HLA molecule is to present CD8 + T cells with an antigenic peptide made of about 8-10 amino acids, which are produced in the cells, and the immune response and tolerance induced by this are It plays a very important role.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 There is a report that growth is suppressed (Non-Patent Documents 1 and 2). In addition, it has been reported that two kinds of antibodies against one domain, MoAb90 and YTH862, induce apoptosis on activated lymphocytes (Non-Patent Documents 2, 3, and 4).
  • Non-Patent Document 4 Apoptosis induced by these two antibodies has been shown to be a caspase-mediated response (Non-Patent Document 4), indicating that HLA class IA antigen expressed on lymphocytes is a signaling pathway for apoptosis. It is speculated that they are also involved.
  • Non-patent Document 6 Antibody RE2 against ⁇ 2 domain of HLA class IA (Non-patent Document 6) has also been reported to induce cell death in activated lymphocytes and the like. However, unlike the aforementioned apoptosis-inducing antibodies MoAb90 and 862, cell death induced by these antibodies has not been shown to be mediated by caspases. This suggests that cell death due to 5H7 or RE2 is a completely different type of cell death from the previously known mechanism of apoptosis. Has been measured.
  • the 2D7 antibody is a mouse monoclonal antibody obtained by immunizing Balb / c mice with human myeloma cells (Non-Patent Document 7). Until now, it has been confirmed that the 2D7 antibody binds to the cell surface of various lymphoid tumor cells with high ⁇ properties, but if the 2D7 antibody recognizes an antigen that is recognized, Did not.
  • Non-patent document 2 Genestier et al., Blood 90: 3629-3639 (1997)
  • Non-Patent Document 3 Genestier et al, Blood 90: 726-735 (1997)
  • Non-Patent Document 4 Genestier et al., J. Biol. Chem. 273: 5060-5066 (1998)
  • Non-Patent Document 5 Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997)
  • Non-Patent Document 6 Matsuoka et al., J. Exp.Med. 181: 2007-2015 (1995)
  • Non-Patent Document 7 Goto, et al. Blood 84: 1922 (1994)
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide an antibody that recognizes HLA class IA, has high cell death-inducing activity, and has excellent blood stability. It is in. More specifically, it is an object of the present invention to provide an antibody characterized by being a single-chain polypeptide comprising two heavy chain variable regions and two light chain variable regions and having a human leukocyte antigen (HLA) binding activity.
  • HLA human leukocyte antigen
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems.
  • the 2D7 antibody is a mouse antibody obtained by immunizing a patient-derived leukemia by the Tokushima University first internal medicine group.
  • the present inventors have found that the 2D7 antibody is raised on the cell surface of various lymphoid tumor cells. They found that they bind with high properties and recognize the 2D7 antibody activity LA-A, and filed a patent application (WO2004 / 033499). It has also been found that when a low-molecular-weight antibody such as a diabody is used as an anti-HLA antibody, the cell death-inducing activity increases (WO2004 / 033499).
  • the present inventors have further studied in order to increase the activity of the antibody, and as a result, have found that sc (Fv) 2 has high blood stability while maintaining very excellent activity. .
  • the heavy chain variable region sequence (VH) and the light chain variable region sequence (VL) of the 2D7 antibody were connected by a 15-mer linker so that they were arranged in a VH-VL-VH-VL sequence.
  • a DNA expression vector encoding 2D7sc (Fv) 2 was constructed, and the vector was introduced into CHO cells to establish a cell line expressing 2D7sc (Fv) 2.
  • 2D7sc (Fv) 2 expressed in the cell line was purified and subjected to a cell death induction experiment, 2D7sc (Fv) 2 had a very excellent activity of inducing cell death in a concentration-dependent manner. In addition, it was revealed that it had high blood stability. Furthermore, in order to examine the blood stability of 2D7sc (Fv) 2, the change in blood concentration in mice was analyzed. As a result, it was found that the blood elimination time was significantly prolonged as compared to 2D7diabody. From this, it became clear that 2D7sc (Fv) 2 is a low-molecular antibody having high cell death-inducing activity and cell growth-suppressing activity, and also excellent in blood stability.
  • the present invention relates to an antibody comprising two heavy chain variable regions and two light chain variable regions and being a single-chain polypeptide having a binding activity to human leukocyte antigen (HLA), The following [1]-[28] are provided.
  • HLA human leukocyte antigen
  • An antibody comprising a single heavy chain polypeptide comprising two heavy chain variable regions and two light chain variable regions, and having a binding activity to human leukocyte antigen (HLA).
  • HLA human leukocyte antigen
  • the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions are composed of a heavy chain variable region, a light chain variable region, a heavy chain variable region, and a light chain variable region starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having CDR1, 2, 3 having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, 4, 5.
  • sc (Fv) 2 comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2, and 3 having the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 6, 7, and 8.
  • sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • sc (Fv) 2 comprising a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • one or more amino acids are substituted, deleted, added and Z or inserted in the amino acid sequence according to any one of (8)-(15), and Sc (Fv) 2 having the same activity as the above antibody.
  • [21] A method for producing the antibody according to any one of [1] to [16], comprising the following steps.
  • a cell death inducer comprising the antibody according to any one of [1] to [16] as an active ingredient.
  • the cell death-inducing agent according to [23] which is an activated B cell or activated T cell.
  • a cell growth inhibitor comprising the antibody according to any one of [1] to [16] as an active ingredient.
  • an antitumor agent comprising the antibody of any one of [1] to [16] as an active ingredient; [27] the antitumor agent of [26], wherein the tumor is a hematological tumor;
  • a therapeutic agent for an autoimmune disease comprising the antibody according to any one of [1] to [16] as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a view showing the structure of a 2D7 low molecular weight antibody.
  • Figure 1A shows the 2D7diabody
  • Diabody (HL5) is formed by non-covalent dimerization of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) connected by a 5-mer linker.
  • Figure 1B shows the sc (Fv) 2 type, which is internally folded by connecting two pairs of VH and VL to a single strand with a 15-mer linker, as shown in B. Form a simple structure.
  • FIG. 2 is a view showing a base sequence and an amino acid sequence of 2D7sc (Fv) 2. Italic bold letters indicate the signal sequence of the heavy chain variable region, the underlined sequences indicate the linker region (15mer), and the C-terminal bold characters indicate the Flag tag region.
  • the base sequence enclosed in the frame indicates the cleavage sites of the restriction enzymes EcoRI, BamHI, and Notl from the 5 'side.
  • FIG. 3 is a chart showing a chart comparison between 2D7 diabody and 2D7 sc (Fv) 2 at the time of gel filtration chromatography purification.
  • (1) shows a gel filtration chromatogram elution chart of 2D7 sc (Fv) 2
  • (2) shows a gel filtration chromatogram elution chart of 2D7 diabody.
  • FIG. 4 is a view showing a comparison of cell death inducing activities of 2D7 diabody and 2D7 sc (Fv) 2 in vitro.
  • FIG. 5 is a view showing a comparison of the cell growth inhibitory activities of 2D7 diabody and 2D7 sc (Fv) 2.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in the radioactivity concentration of the TCA precipitated fraction in plasma after a single intravenous administration of radiolabeled 2D7sc (Fv) 2 and radiolabeled 2D7diabody (HL5) to mice.
  • the present invention provides an antibody, which is a single-chain polypeptide comprising two heavy chain variable regions and two light chain variable regions, and having a human leukocyte antigen (HLA) binding activity. I do.
  • the antibody of the present invention is useful in that the activity is increased.
  • the activity refers to a biological action caused by binding of an antibody to an antigen. Specific examples include cell death inducing action, apoptosis inducing action, cell growth inhibitory action, cell differentiation inhibitory action, cell division inhibitory action, cell proliferation inducing action, cell differentiation inducing action, cell division inducing action, cell cycle Although a regulatory action and the like can be mentioned, a cell death inducing action and a cell growth inhibitory action are preferred.
  • Cells targeted for the above-mentioned actions are not particularly limited, but blood cells and floating cells are preferred.
  • blood cells include lymphocytes (B cells and T cells), neutrophils, eosinophils, basophils, and monocytes (preferably activated peripheral blood mononuclear cells (peripheral blood mononuclear cells). mononuclear cells, PBMC)), myeloma cells, etc., lymphocytes (B cells, T cells), T cells or B cells favored by myeloma cells (especially activated B cells or activated cells) T cells) are most preferred.
  • Suspended cells are cells that proliferate in suspension when the cells are cultured, so that the cells do not adhere to the surface of a glass or plastic incubator.
  • adherent cells adherent cells are cells that adhere to the surface of an incubator such as glass or plastic when cells are cultured.
  • Whether or not the antibody of the present invention induces cell death on floating cells can be determined based on whether or not it has the ability to induce cell death on Jurkat cells or ARH77 cells. Whether or not to induce cell death on adherent cells can be determined based on whether or not to induce cell death in HeLa cells (WO2004 / 033499).
  • the present invention is characterized in that the polypeptide is a single-chain polypeptide comprising the above two heavy chain variable regions and two light chain variable regions and having a binding activity to human leukocyte antigen (HLA).
  • HLA human leukocyte antigen
  • tumors such as hematologic malignancies (hematopoietic malignancies), such as leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, chronic myeloid leukemia, Tumors, multiple myeloma, and macroglobulinemia), myeloproliferative disorders (e.g., polycythemia vera, essential thrombocythemia, idiopathic myelofibrosis), and autoimmune diseases (specifically, rheumatism).
  • hematopoietic malignancies such as leukemia, myelodysplastic syndrome, malignant lymphoma, chronic myeloid leukemia, Tumors, multiple myeloma, and macroglobulinemia
  • HLA means human leukocyte antigen.
  • HLA molecules are classified into classl and classll.
  • Classl is known to be HLA-A, B, C, E, F, G, H, J, etc.
  • Classl is known to be HLA-DR, DQ, DP, etc. Have been.
  • the antigen recognized by the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is an HLA molecule, but is preferably a molecule classified into class 1, and more preferably HLA-A.
  • the antibody of the present invention preferably has two heavy chain variable regions and two light chain variable regions.
  • the heavy chain variable region, the light chain variable region, and the heavy chain variable region are based on the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • sc (Fv) 2 can be exemplified as such an antibody.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which two heavy chain variable regions ([VH]) and two light chain variable regions ([VL]) are linked to each other with a linker or the like to form a single-chain polypeptide.
  • 0 sc (Fv) 2 is, for example, two scFv (single chain Fv) (Huston, JS et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879— 5883,
  • the order of the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions to be linked is not particularly limited, and may be arranged in any order, for example, the following arrangement.
  • sc (Fv) 2 having the arrangement of [VH] linker-1 [VL] linker-1 [VH] linker-1 [VL] is preferred.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or light chain variable region may be substituted, deleted, added, Z- or inserted. Furthermore, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated, a portion may be deleted or another polypeptide may be added as long as it has antigen-binding activity. Further, the variable region may be chimerized or humanized.
  • a linker that binds to the variable region of an antibody may be any peptide linker or synthetic compound linker that can be introduced by genetic engineering, for example, Protein
  • a preferred linker is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. Usually, the length is 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, and more preferably 5 to 30 amino acids. Amino acids, particularly preferably 12-18 amino acids (eg 15 amino acids).
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences. Ser
  • Synthetic chemicals linkers are commonly used crosslinking agents for crosslinking peptides, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) disuccinimidyl suberate (DSS), bis (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (Succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate ( Sulfo DST), bis [2- (succinimidoxycarboxy-roxy) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimid
  • examples of preferred sc (FV) 2 include the following (a) — (0 Antibodies include, but are not limited to:
  • sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having CDR1, 2, and 3 having the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5;
  • sc (Fv) 2 comprising a light chain variable region having CDRs 1, 2, and 3 having the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 6, 7, and 8.
  • D sc (Fv) 2 comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a light chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NOS: 9 and 10 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of the 2D7 heavy chain variable region, respectively.
  • the 50th to 54th CDR1 SEQ ID NO: 3
  • the 69th to 85th It corresponds to the visual acuity SCDR2 (SEQ ID NO: 4) and the 118th-123rd power SCDR3 (SEQ ID NO: 5).
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of the 2D7 light chain variable region, respectively, and the 46th-55th CDR1 (SEQ ID NO: 6) and the 71st-77th SCDR2 ( SEQ ID NO: 7), which corresponds to the 110th to 118th force SCDR3 (SEQ ID NO: 8).
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the scFV, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked by a linker is shown in SEQ ID NO: 13
  • the amino acid sequence of the scFV is shown in SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding sc (FV) 2
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of sc (FV) 2.
  • sc (Fv) 2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 may be humanized or chimeric for the purpose of, for example, reducing the heterologous antigenicity to humans.
  • These artificially modified antibodies can be produced using known methods.
  • “functionally equivalent” means that the antibody of interest has sc (FV) 2 having the sequence of SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It means that it has an activity equivalent to sc (FV) 2 having CDR (or variable region) (for example, binding activity to HLA-A, cell death inducing activity, etc.).
  • Antibody can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature. Thus, an antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the antibody of the present invention and functionally equivalent to the antibody is also included in the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (eg, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl group-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atom-containing side Amino acids with chain (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base containing side chains (R, K, H), aromatic containing side Amino acids having a chain (H, F, Y, W) (parentheses Each of them indicates the one-letter code of amino acids.) It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or another amino acid maintains its biological activity.
  • the antibodies of the present invention also include antibodies obtained by adding a plurality of amino acid residues to the amino acid sequence of the antibodies of the present invention. Further, fusion proteins in which these antibodies are fused with other peptides or proteins are also included.
  • a method for producing a fusion protein is as follows: a polynucleotide encoding the antibody of the present invention and a polynucleotide encoding another peptide or polypeptide are ligated in such a manner that their frames match, and this is introduced into an expression vector; It may be expressed, and a method known to those skilled in the art can be used.
  • peptides or polypeptides to be fused with the antibody of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine) residues. 6X His, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen
  • HA agglutinin
  • HA human c-myc fragment
  • VSV-GP fragment VSV-GP fragment
  • pl8HIV fragment agglutinin
  • T7-tag agglutinin
  • HSV-tag HSV-tag
  • E-tag SV40T antigen
  • peptides such as fragments, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag, and protein C fragment can be used.
  • polypeptides to be fused with the antibody of the present invention include, for example, GST (daltathione S—transferase), HA (influenza agglutinin), immoglobulin constant region, ⁇ -galactosidase, ⁇ (maltose Binding protein).
  • the antibody of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell or host producing the antibody or the purification method described below. However, as long as the obtained antibody has a function equivalent to that of the antibody of the present invention, it is included in the present invention.
  • the antibody of the present invention when expressed in prokaryotic cells, for example, E. coli, A methionine residue is added to the N-terminus of the body amino acid sequence.
  • the antibodies of the present invention also include such antibodies.
  • the antibody of the present invention may be a conjugate antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), a radioactive substance, and a toxin.
  • PEG polyethylene glycol
  • a radioactive substance such as radioactive substance
  • a toxin such as toxin.
  • Such a conjugate antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification.
  • Methods for modifying antibodies have already been established in the art (e.g., US5057313, US5156840) o These antibodies are "antibody" in the present invention are also encompassed.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the antibody of the present invention, or a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide under stringent conditions and encodes an antibody having an activity equivalent to that of the antibody of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the antibody of the present invention, and is a polymer having a base or a base pairing force, such as a plurality of deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • the polynucleotides of the present invention may contain non-naturally occurring bases.
  • the polynucleotide of the present invention can be used when expressing antibodies by genetic engineering techniques. When screening for an antibody having the same function as the antibody of the present invention, it can also be used as a probe. That is, a polynucleotide encoding the antibody of the present invention, or a part thereof, is used as a probe, and is hybridized with the polynucleotide under stringent conditions by techniques such as hybridization and gene amplification techniques (eg, PCR). It is possible to obtain a DNA encoding an antibody which hybridizes and has an activity equivalent to that of the antibody of the present invention. Such DNA is also included in the polynucleotide of the present invention.
  • Hybridization conditions include, for example, low stringency conditions.
  • the low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 in washing after hybridization.
  • More preferable hybridization conditions include high stringency conditions. High stringency conditions include, for example,
  • Antibodies functionally equivalent to the antibodies of the present invention which encode polynucleotide S obtained by the hybridization technique or the gene amplification technique, usually have high homology in amino acid sequence with these antibodies. .
  • the antibodies of the present invention also include antibodies that are functionally equivalent to the antibodies of the present invention and have high homology to the amino acid sequence of the antibodies. High homology usually means at least 50% identity, preferably 75% or more identity, more preferably 85% or more identity, and even more preferably 95% or more identity at the amino acid level. Point.
  • an algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730 may be used.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it can be prepared using a gene recombination technique known to those skilled in the art based on the sequence of an antibody that recognizes HLA. Specifically, a polynucleotide encoding sc (Fv) 2 is constructed based on the sequence of an antibody recognizing HLA, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co., MS et al "J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A.
  • the sequence of an antibody recognizing HLA can be a sequence of a known antibody.
  • an anti-HLA antibody is prepared by a method known to those skilled in the art, and It is also possible to obtain and use an array. Specifically, for example, it can be performed as follows. Using the HLA protein or a fragment thereof as a sensitizing antigen, immunization is performed according to a conventional immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and are then screened by a normal screening method. , Monoclonal antibody production Screen cells (hybridomas).
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using baculovirus (such as W098 / 46777).
  • the production of hybrids can be performed, for example, according to the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • immunization may be performed by binding to a macromolecule having immunogenicity such as albumin.
  • the mRNA of the hybridoma can also be determined by synthesizing cDNA for the variable region (V region) of the antibody using reverse transcriptase and decoding the sequence of the resulting cDNA by a known method.
  • a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a hidge antibody, a human antibody, and the like are not particularly limited as long as they bind to HLA.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody, a humanized antibody and the like can also be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, an antibody that acts as a variable region of a heavy or light chain of a mouse antibody and a constant region of a heavy or light chain of a human antibody. Is linked to a polynucleotide encoding the constant region of a human antibody, and this is inserted into an expression vector, introduced into a host, and produced.
  • the humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and is obtained by transplanting the complementarity-determining region of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, into the complementarity-determining region of a human antibody.
  • Genetic recombination techniques are also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 96/02576).
  • a polynucleotide sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared by constructing several polynucleotides having overlapping portions at the ends.
  • the obtained polynucleotide is ligated to a polynucleotide encoding the constant region of a human antibody, then inserted into an expression vector, and introduced into a host to produce the same (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Open number WO 96/02576).
  • the human antibody FR linked via CDR is selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site.
  • amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • These chimeric antibodies and humanized antibodies may be converted into sc (Fv) 2 and then chimerized or humanized, or may be converted into sc (Fv) 2 after chimerization or humanization.
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, for example, U266, to obtain a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos.
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of a phage by a phage display method using a phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the polynucleotide sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • a human antibody can be obtained by preparing an appropriate expression vector using the sequence.
  • These methods are already well known and can be referred to WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388. Wear.
  • the antibody of the present invention can be produced by a method known to those skilled in the art. Specifically, the DNA of the target antibody is inserted into an expression vector. At that time, the gene is incorporated into an expression vector so as to express under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. In that case, an appropriate combination of a host and an expression vector can be used.
  • vectors include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector when the expression vector is intended for expression in Escherichia coli, the expression vector may have the above-mentioned characteristics such that the vector is amplified in Escherichia coli, and may be used in a host such as E. coli such as JM109, DH5a, HB101, or XL1-Blue.
  • promoters that can be efficiently expressed in Escherichia coli such as lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter ( Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or having the T7 promoter is essential.
  • lacZ promoter Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • araB promoter Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043
  • T7 promoter is essential.
  • Such vectors include PGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase) Then, BL21 is preferred,;) and the like.
  • the vector contains a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for polypeptide secretion a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when produced by E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be carried out, for example, using the Shii-Dani calcium method or the elect-portion method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cell-derived expression vectors eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (manufactured by Gibco BRL), P BacPAK8), plant-derived expression Vector (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vector (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vector (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vector (eg, “Pichia
  • Expression KitJ manufactured by Invitrogen
  • pNVll pNVll
  • SP-Q01 an expression vector derived from Bacillus subtilis
  • an expression vector derived from Bacillus subtilis eg, pPL608, pKTH50.
  • a promoter required for expression in a cell such as the SV40 promoter (SV40 promoter
  • Vectors having such properties include, for example, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13, and the like.
  • a DHFR gene that complements the gene in a CHO cell deficient in a nucleic acid synthesis pathway is used.
  • MTX methotrexate
  • a method of using a COS cell having a gene expressing the SV40 T antigen on the chromosome and transforming it with a vector having a replication origin of SV40 is used.
  • a replication origin of SV40 such as pcD
  • those derived from poliovirus, adenovirus, ⁇ papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is selected as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, It can contain the folate reductase (dhfr) gene and the like.
  • the polynucleotide of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, retrovirus method, liposome method, cationic ribosome. And the method of introduction into a living body by the adenovirus method and the like.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (eg, pAdexlcw) and a retrovirus vector (eg, pZIPneo).
  • General genetic manipulation such as insertion of the polynucleotide of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method (Molecular Cloning, 5.61 to 5.63).
  • Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited. Animal cells and the like can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the antibody of the present invention.
  • Production systems for polypeptide production include in vitro and in vivo production systems. In vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • Animal cells include mammalian cells, for example, CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS-3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, African Megafrog oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as S19, Sf21, and Tn5 are known.
  • CHO cells in particular, DHFR-deficient CHO cells such as dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • CHO cells are particularly preferred for large-scale expression in animal cells.
  • the vector is introduced into the host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the cationic ribosome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), the electoral poration method, the lipofection, etc. Is possible.
  • Nicotiana tabacum cells derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum) are known as a polypeptide production system, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger. niger) is known.
  • bacterial cells include Escherichia coli (E. coli), for example, JM109, DH5a, HB101, and the like, and Bacillus subtilis.
  • an antibody By transforming these cells with the desired polynucleotide and culturing the transformed cells in vitro, an antibody can be obtained.
  • the culturing can be performed according to a known method.
  • a culture solution of animal cells for example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used.
  • serum replacement such as fetal calf serum (FCS)
  • FCS fetal calf serum
  • serum-free culture may be performed.
  • the pH during the culture is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using an animal and a production system using a plant.
  • a polynucleotide of interest is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the body of the animals or plants and collected.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and pests can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • a polynucleotide of interest is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide uniquely produced in milk, such as goat j8 casein.
  • a polynucleotide fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the desired antibody can be obtained from the milk produced by the transgenic goat born or the progeny thereof, which has received the embryo.
  • Transgeneic mosquitoes Hormones may optionally be used in transgenics to increase the amount of milk containing polypeptides produced (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12 , 699-702).
  • a silkworm can be used as an insect.
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with the baculovirus into which the target polynucleotide has been inserted (Susumu, M. et al., Nature (1985). ) 315, 592-594) o
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the polynucleotide of interest is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a vector such as Agrobacterium tumefaciens such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected to tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al "Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of a host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody.
  • the separation and purification of the antibody is not limited in any way as long as the separation and purification methods used in ordinary antibody purification are used. For example, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, and the like (Strategies for Protein Purification and
  • the antigen binding activity of the prepared antibody (Ant3 ⁇ 4odies A Laboratory)
  • the present inventors have found that the antibody of the present invention induces cell death. Based on this finding, there is provided a cell death inducer or cell growth inhibitor comprising the antibody of the present invention as an active ingredient. In addition, the present inventors have already found that a diabody obtained by miniaturizing an anti-HLA antibody has an antitumor effect on a human myeloma model animal (
  • T fine ⁇ activated may be particularly large effect on B cells. Therefore, the antibody of the present invention It is considered to be particularly effective in treating and preventing tumors such as cancer (particularly hematological tumors) and autoimmune diseases.
  • the present invention also provides an antitumor agent or a therapeutic agent for an autoimmune disease, comprising the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the antibody of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method in addition to direct administration to a patient.
  • a pharmaceutical composition formulated by a known pharmaceutical method in addition to direct administration to a patient.
  • tablets, capsules, elixirs, and microcapsules which are sugar-coated as necessary, orally, or aseptic solutions or suspensions in water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, It is possible to formulate a formulation by combining it with a preservative, a binder and the like as appropriate and mixing it in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin
  • a flavoring agent such as peppermint, akamono oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned materials.
  • Sterile compositions for injection can be formulated using vehicles such as distilled water for injection, according to standard formulation practice.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mantol, and sodium chloride. It may be used in combination with other solubilizing agents, for example, alcohols, specifically, ethanol, polyalcohols, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • solubilizing agents for example, alcohols, specifically, ethanol, polyalcohols, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • the oily liquid includes sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffers such as phosphate buffers, acetic acid It may be formulated with a sodium buffer solution, a soothing agent such as proforce hydrochloride, a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol, and an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
  • Administration to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a person skilled in the art. This can be done by any method.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by a polynucleotide, the polynucleotide may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms and administration method. For example, in the case of an injection, it is usually used in adults (assuming a body weight of 60 kg). It is believed to be about 0.1 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method.
  • administration method usually in adults (with a body weight of 60 kg).
  • the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area can be administered.
  • the present invention relates to a method for inducing cell death of a cell by using the antibody of the present invention. Specifically, the present invention relates to a method for inducing cell death in a cell by bringing the antibody of the present invention into contact with the cell.
  • a DNA expression vector encoding 2D7 sc (Fv) 2 connected with GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer (GlyGlyGlySer) was prepared by the following procedure.
  • VH-VL prepared by the method described in WO2004 / 033499 was used as a 5-mer linker
  • the 2D7diabody (HL5) expression vector ligated with GlyGlyGlyGlySer) was subjected to PCR using primer 2D7DBH1 (SEQ ID NO: 15) and primer 2D7PA2 (SEQ ID NO: 16) to amplify fragment A.
  • PCR was performed with primer 2D7PA3 (SEQ ID NO: 17) and primer 2D7PA5 (SEQ ID NO: 18) to amplify fragment B.
  • Fragment A and fragment B obtained here were mixed in the same tube, and a PCR-recombination reaction was performed to link fragment A and fragment B.
  • a DNA fragment "2D7diabodyHL15-l" containing a VH signal sequence at the N-terminus and having VH-VL linked by a 15-mer linker was obtained.
  • the 2D7diabody (HL5) expression vector was transformed into a type II, and a PCR reaction was performed with primer 2D7PA6 (SEQ ID NO: 19) and primer 2D7PA2 (SEQ ID NO: 16) to amplify fragment C.
  • PCR was performed with primer 2D7PA3 (SEQ ID NO: 17) and primer 2D7DBL2 (SEQ ID NO: 20) to amplify fragment D.
  • the fragments C and D obtained here were mixed in the same tube, and the two fragments were ligated by PCR-recombination reaction.
  • VH-VL was ligated with a 15-mer linker to obtain a DNA fragment "2D7diabodyHL15-2" containing a Flag-tag region at the C-terminus.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of 2D7sc (Fv) 2.
  • DG44 cells cultured in a CHO-S-SFM-II medium were washed twice with ice-cold PBS, and then suspended in PBS to 1 x 10 ml. To this, 20 g of the above plasmid was mixed to give an electric norse (1.5 KV, 25 FD). The cells were diluted at an appropriate ratio, seeded on a 96-well plate, and cultured in a CHO-S-SFM-II medium supplemented with G418 (Invitrogen) at a final concentration of 500 g / ml.
  • G418 Invitrogen
  • a single colony that grew was picked up by about 30 clones, and the expression level of 2D7sc (Fv) 2 in the culture supernatant was examined by Western blot using an anti-FLAG antibody (Sigma).
  • the clone with the highest expression was cultured in a nucleic acid-free CHO-S-SFM II medium (Invitrogen) containing 5 nM MTX, and the culture scale was expanded. The resulting strain was defined as a high-producing cell strain.
  • the human myeloma cell line ARH77 cells were seeded on a 24-well plate in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS at 1 ⁇ 10 5 cells / well.
  • purified 2D7sc (Fv) 2 was added to a final concentration of 100 ng / ml and 250 ng / ml.
  • purified 2D7diabody (HL5) was added to another well under the same conditions. After culturing at 37 ° C for 3 hours, each cell was collected and suspended in PI solution g / ml PI, 2% FCS / PBS). After incubation at room temperature for 15 minutes in the dark, the percentage of dead cells stained with PI was measured using flow cytometory (EPICS ELITE, COULTER).
  • 2D7sc (Fv) 2 had an activity of inducing cell death in a concentration-dependent manner. Its activity is 2D7diabody (VH and VL linked by linker 5mer) HL5) was found to be almost the same level. From the above results, regarding the in vitro cell death-inducing activity, it was confirmed that 2D7sc (Fv) 2 had the same activity as 2D7diabody (HL5) (FIG. 4).
  • Human EBV-transformed B cell line IM9 cells at 3 ⁇ 10 3 cells / well and human Burkitt lymphoma cell line HS-Sultan cells at 1 ⁇ 10 4 cells / well in RPMI1640 medium containing 10% FCS. It was diluted and spread on a 96-well plate. To this, purified 2D7sc (Fv) 2 and 2D7diabody (HL5) were added to a final concentration of 0, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2 ⁇ g / ml, and cultured at 37 ° C. After culturing for 3 days, the number of viable cells was measured using a cell number measurement WST-8 kit (Dojindani).
  • a round bottom polyethylene tube was cut to a depth of about 1 cm to a depth of about 1 cm.
  • the bottom portion was filled with 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) containing 250 mmol / L NaCl and Tween 20 0.05 vol%, Na 125
  • the I solution and the 2D7sc (Fv) 2 or 2D7diabody (HL5) solution were added.
  • the filter paper was replaced with a new filter paper impregnated with a 32 mg / mL Chloramine T solution, covered over the reaction tube in the same manner as described above, and left at room temperature for another 5 minutes.
  • the reaction solution is placed on a PD-10 column (Amersham Pharmacia) equilibrated with PBS (-) containing Tween 20 0.05 vol%, and Tween 20 0.05 Elution was performed with PBS (-) containing vol% to remove unreacted 1251 .
  • mice Male mice (C.B-17 / Icr Scid Jcl, CLEA Japan) received a single intravenous injection of radiolabeled 2D7 sc (Fv) 2 and radiolabeled 2D7diabody (HL5) at 1 mg / 5 MBq / kg. At 15, 30 minutes, 1, 2, 4, 8, and 24 hours after administration, the mice were laparotomized under ether anesthesia, and blood was collected from the heart using a heparin-treated thermosyringe with a 25G injection needle. The collected blood was immediately centrifuged at 12,000 rpm at 4 ° C for 5 minutes to separate plasma.
  • Fv radiolabeled 2D7 sc
  • HL5 radiolabeled 2D7diabody
  • the radioactivity of the plasma sample was measured with a ⁇ -counter.
  • the radioactivity of the administration solution was measured simultaneously, the specific activity of the radiolabeled test substance in the administration solution was calculated, and the total radioactivity concentration in plasma was calculated based on the radioactivity.
  • purified water and TCA 25 w / v% solution were added to the plasma sample, and the mixture was stirred and centrifuged at 4 ° C and 3000 rpm for 10 minutes. After aspirating the supernatant with an aspirator, the radioactivity of the precipitate was measured. The ratio of the radioactivity of the precipitate to the total radioactivity was multiplied by the total radioactivity concentration in plasma to calculate the radioactivity concentration in the TCA precipitate fraction in plasma.
  • Radiolabeled 2D7sc (Fv) 2 gives a morphism labeling 2D7diabod y (HL5) than the high ⁇ plasma TCA precipitation fraction radioactive concentration release, the half-life of the elimination phase, respectively 2.30 hours and 1.64 hours 2D7sc (Fv) 2 Gave a longer half-life than 2D7diabody (HL5).

Abstract

　本発明者らは2D7抗体の重鎖可変領域配列 (VH) と軽鎖可変領域配列 (VL) が、VH-VL-VH-VLの並びになるように、それぞれを15merのリンカーで接続した2D7 sc(Fv)2をコードするDNA発現ベクターを構築し、該ベクターをCHO細胞に導入して2D7sc(Fv)2産生発現細胞株を樹立した。該細胞株で発現させた2D7sc(Fv)2を精製し、細胞死誘導実験を行なったところ、2D7sc(Fv)2は濃度依存的に細胞死を誘導する活性を有していることが明らかになった。 　 　

Description

明 細 書
細胞死誘導剤
技術分野
[0001] 本発明は、 HLAを認識する抗体の sc(Fv)2に関する。
背景技術
[0002] HLA class I抗原は、 3つのドメイン（ α 1、 α 2、 a 3)からなる 45KDの α鎖と、 12KD の β 2ミクログロブリンのヘテロダイマーによって形成される。 HLA分子の主な役割は 、細胞の中で作られる 8— 10程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドを CD8+T細胞に提 示することであり、これによつて誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割 を担っている。
[0003] また、 HLA class IA抗原の抗体によるライゲーシヨンで、細胞増殖抑制や細胞死誘 導効果がリンパ球細胞にぉ 、て観察されており、 HLA分子のシグナル伝達分子とし ての可能性も示唆されて 、る。
[0004] すなわち、例えばヒト HLA class の oc 1ドメインに対する抗体 B9.12.1、 a 2ドメイン に対する抗体 W6/32、 α 3ドメインに対する抗体 TP25.99, A1.4は、活性化リンパ球に 対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献 1 , 2)。また、《1ドメインに 対する二種類の抗体 MoAb90, YTH862は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを 誘導することが報告されている（非特許文献 2, 3, 4)。この 2つの抗体によって誘導さ れるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許 文献 4)、このことからリンパ細胞で発現する HLA class IA抗原は、アポトーシスの信 号伝達にも関与して 、ると推測されて 、る。
[0005] さらに、ヒト HLA class \N oc 3ドメインに対する抗体 5H7 (非特許文献 5)、マウス
HLA class IAの α 2ドメインに対する抗体 RE2 (非特許文献 6)も、活性化リンパ球など に細胞死を誘導することが報告されて 、る。し力しながら前出のアポトーシス誘導抗 体 MoAb90や ΥΤΗ862とは違い、これらの抗体によって誘導される細胞死は、いずれ もカスパーゼを介さないことが示されている。このこと力 、 5H7や RE2による細胞死は 、従来知られているアポトーシスの機構とはまったく異なるタイプの細胞死であると推 測されている。
[0006] 以上のように、抗 HLA抗体による細胞増殖抑制、細胞死誘導作用に関する報告は これまで複数なされている。ただし、ここで利用されている抗体の分子形態はいずれ も IgG抗体、もしくは F(ab')2、 Fabであり、また F(ab')2や Fabのように抗体を低分子化す ることで、細胞死誘導活性が上昇したとの知見は今のところな 、。
[0007] 一方 2D7抗体は、ヒトミエローマ細胞を Balb/cマウスに免疫して得たマウスモノクロ一 ナル抗体である（非特許文献 7)。これまで 2D7抗体が、種々のリンパ系腫瘍細胞の 細胞表面に高 ヽ特性を持って結合することは確認されて ヽたが、 2D7抗体が認識す る抗原にっ 、ては同定されては 、なかった。
[0008] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 l : Fayen et al.， Int. Immunol 10: 1347-1358(1998)
非特許文献 2 : Genestier et al.， Blood 90: 3629-3639 (1997)
非特許文献 3 : Genestier et al, Blood 90: 726-735 (1997)
非特許文献 4 : Genestier et al., J. Biol. Chem. 273: 5060-5066 (1998)
非特許文献 5 :Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997)
非特許文献 6 : Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995)
非特許文献 7 : Goto, et al. Blood 84: 1922 (1994)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、 HLA class IAを 認識し、高い細胞死誘導活性及び優れた血中安定性を有する抗体を提供すること にある。詳しくは、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球 抗原 (HLA)への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。 2D7抗体は、徳島 大学第一内科のグループにより患者由来 leukemiaを免疫することにより得られたマウ ス抗体である。本発明者らは、 2D7抗体が種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面に高 い特性を持って結合すること、また、 2D7抗体力 ¾LA-Aを認識することを見出し、特 許出願を行った (WO2004/033499)。また、抗 HLA抗体を Diabodyなどの低分子化抗 体にすると細胞死誘導活性が上昇することも見出した (WO2004/033499)。本発明者 らは、抗体の活性を上昇させる為、さらに鋭意研究した結果、 sc(Fv)2にすることにより 非常に優れた活性を維持しながら、高い血中安定性を有することを見出した。具体 的には、 2D7抗体の重鎖可変領域配列（VH)と軽鎖可変領域配列（VL)が、 VH-VL-VH-VLの並びになるように、それぞれを 15merのリンカ一で接続した
2D7sc(Fv)2をコードする DNA発現ベクターを構築し、該ベクターを CHO細胞に導入 して 2D7sc(Fv)2産生発現細胞株を榭立した。該細胞株で発現させた 2D7sc(Fv)2を精 製し、細胞死誘導実験を行なったところ、 2D7sc(Fv)2は濃度依存的に細胞死を誘導 する非常に優れた活性を有し、かつ、高い血中安定性を有することが明らかになった 。さらに 2D7sc(Fv)2の血中安定性を調べるため、マウスでの血中濃度推移を解析し た結果、 2D7diabodyに比べて顕著に血中消失時間が延長されることが分かった。こ のことから、 2D7sc(Fv)2は、高い細胞死誘導活性および細胞増殖抑制能を有し、血 中安定性面でも優れた低分子抗体であることが明らかとなった。
即ち、本発明は、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球 抗原 (HLA)への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体に 関し、以下の〔1〕一〔28〕を提供するものである。
〔1〕 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原 (HLA)への 結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体。
〔2〕 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドの N末端 側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順 に並んでいることを特徴とする、〔1〕に記載の抗体。
〔3〕 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域がリンカ一で結合されて 、ることを 特徴とする、〔1〕または〔2〕に記載の抗体。
〔4〕リンカ一が 15アミノ酸であることを特徴とする、〔3〕に記載の抗体。
〔5〕HLAが HLA class Iである、〔1〕一〔4〕のいずれかに記載の抗体。
〔6〕HLA class Iが HLA- Aである、〔5〕に記載の抗体。 〔7〕 sc(Fv)2である〔1〕一〔6〕の 、ずれかに記載の抗体。
〔8〕配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変 領域を含む sc(Fv)2。
〔9〕配列番号： 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽鎖可変 領域を含む sc(Fv)2。
〔10〕配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変 領域および配列番号： 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽 鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
〔 11〕配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む sc(Fv)2。 〔12〕配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。 〔13〕配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号： 1 2に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
〔14〕配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
[15]配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
〔16〕〔8〕一〔15〕のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が 置換、欠失、付加および Zまたは挿入され、かつ〔8〕一〔15〕のいずれかに記載の抗 体と同等の活性を有する sc(Fv)2。
〔 17〕〔 1〕一〔 16〕の 、ずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔18〕〔17〕に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、か つ〔1〕一〔16〕のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリ ヌクレオチド。
〔19〕〔17〕または〔18〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔20〕〔17〕または〔18〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔19〕に記載のベクターを保 持する宿主細胞。
〔21〕以下の工程を含む〔1〕一〔16〕の 、ずれかに記載の抗体を作製する方法。
(a) HLAを認識する抗体を調製する工程
(b) (a)で調製した抗体の配列を基に、〔1〕一〔16〕の 、ずれかに記載の抗体をコード するポリヌクレオチドを作製する工程 (c) (b)のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
(d) (c)のベクターを宿主細胞に導入する工程
(e) (d)の宿主細胞を培養する工程
[22]〔1〕一〔16〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導 剤。
〔23〕 B細胞又は T細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、〔22〕に記載の 細胞死誘導剤。
〔24〕 B細胞又は T細胞力 活性化 B細胞又は活性化 T細胞である、〔23〕に記載の細 胞死誘導剤。
〔25〕〔1〕一〔16〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑 制剤。
〔26〕〔1〕一〔16〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。 〔27〕腫瘍が血液腫瘍である〔26〕に記載の抗腫瘍剤。
〔28〕〔1〕一〔16〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾 患治療剤。
図面の簡単な説明
[図 1]2D7低分子抗体の構造を示す図である。図 1Aは 2D7diabodyを示し、
diabody(HL5)は、 5merのリンカ一で接続された重鎖可変領域 (VH)と軽鎖可変領域（ VL)が、非共有結合により二量体化することで形成される。図 1Bは sc(Fv)2型を示し、 sc(Fv)2は、 2対の VHと VLを 15merのリンカ一で 1本鎖に接続することで、内部で折り たたまれ、 Bのような構造を形成する。
[図 2]2D7sc(Fv)2の塩基配列とアミノ酸配列を示す図である。イタリック太字は重鎖可 変領域のシグナル配列、下線で示した配列はリンカ一領域（15mer)、 C末太字は Flag タグ領域を示す。枠で囲った塩基配列は 5 '側から制限酵素 EcoRI, BamHI, Notlの切 断部位を示す。
[図 3]2D7 diabodyと 2D7 sc(Fv)2のゲルろ過クロマトグラフィー精製時のチャート比較 を示す図である。（1)は 2D7 sc(Fv)2のゲルろ過クロマトグラム溶出チャート、（2)は 2D7 diabodyのゲルろ過クロマトグラム溶出チャートを示す。 [図 4]in vitroにおける 2D7 diabodyと 2D7 sc(Fv)2の細胞死誘導活性の比較を示す図 である。
[図 5]2D7 diabodyと 2D7 sc(Fv)2の細胞増殖抑制活性の比較を示す図である。
[図 6]マウスに放射性標識 2D7sc(Fv)2および放射性標識 2D7diabody(HL5)単回静脈 内投与後の血漿中 TCA沈殿画分放射能濃度推移を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明は、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原 (HLA)への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体を提供 する。本発明における抗体は、活性が上昇している点で有用である。ここで、活性と は、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。具体的な例として は、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作 用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作 用、細胞周期調節作用などを挙げることができるが、好ましくは細胞死誘導作用、細 胞増殖抑制作用である。
[0014] 細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限 定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例として は、リンパ球 (B細胞、 T細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球 (好ましくは活性ィ匕 した末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC))、ミエローマ細胞など を挙げることができる力 リンパ球 (B細胞、 T細胞）、ミエローマ細胞が好ましぐ T細胞 又は B細胞 (特に活性ィ匕した B細胞又は活性ィ匕した T細胞）が最も好ましい。浮遊細 胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着す ることなぐ浮遊状で増殖する細胞である。これに対し、接着細胞 (付着細胞）とは、細 胞を培養した際、ガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。
[0015] 一般的に、全長抗 HLA抗体では細胞死誘導活性を示す為には抗 IgG抗体などでク ロスリンクする必要がある力 本発明の抗体では抗 IgG抗体でのクロスリンクがなくても 細胞死誘導活性を示すことが可能である。
[0016] 本発明の抗体が浮遊細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、 Jurkat細胞又は ARH77細胞に対して細胞死を誘導する力否かにより判定することができ、抗体が接 着細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、 HeLa細胞に対して細胞死を誘導する か否かにより判定することができる（WO2004/033499)。
[0017] 本発明においては、上記、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒ ト白血球抗原 (HLA)への結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とす る抗体を投与することにより、例えば、血液腫瘍 (造血器腫瘍)などの腫瘍 (具体的な 例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、形質細 胞異常症 (骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症)、骨髄増殖性疾患 (真性 赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄線維症)など)や自己免疫疾患 (具 体的な例として、リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水 疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少 性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣 炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、 全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重 症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、乾癬、ベーチェット病、など)のような疾患の治療 、予防などをおこなうことが可能である。また、本発明の抗体は生体内での安定性に 優れていると考えられる為、生体に投与する際には特に有効であると考えられる。
[0018] 本発明において、 HLAとは、ヒト白血球抗原を意味する。 HLA分子は classlと classll に分類され、 classlとしては HLA-A、 B、 C、 E、 F、 G、 H、 Jなどが知られており、 classll としては HLA- DR、 DQ、 DPなどが知られている。本発明の抗体が認識する抗原は HLA分子であれば特に制限されないが、好ましくは classlに分類される分子であり、よ り好ましくは HLA-Aである。
[0019] 本発明の抗体としては、好ましくは、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域 力 一本鎖ポリペプチドの N末端側を基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重 鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並んでいることを特徴とする抗体であり、より好ま しくは、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域がリンカ一で結合されて 、るこ とを特徴とする抗体であり、このような抗体としては sc(Fv)2が例示できる。
[0020] sc(Fv)2は、 2つの重鎖可変領域（[VH])及び 2つの軽鎖可変領域（[VL])をリンカ 一等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ;231 : 177-189) 0 sc(Fv)2は、例えば、 2つの scFv (シングルチェイン Fv) (Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883、
Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies J Vol.113, Resenburg及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994》をリンカ一等で結合するこ とにより作製することが可能である。結合される 2つの重鎖可変領域と 2つの軽鎖可変 領域の順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよぐ例えば、以 下のような配置を挙げることができる。
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
本発明にお 、ては、好ましくは、 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]の配 置を有する sc(Fv)2である。
[0021] 重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び Z又は 挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、 抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加し てもよい。又、可変領域はキメラ化ゃヒト化されていてもよい。
[0022] 本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカ一は、遺伝子工学により導入し 得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein
Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカ一を用いることができる。
[0023] 本発明において好ましいリンカ一はペプチドリンカ一である。ペプチドリンカ一の長 さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通 常、 1一 100アミノ酸、好ましくは 3— 50アミノ酸、更に好ましくは 5— 30アミノ酸、特に好 ましくは 12— 18アミノ酸 (例えば、 15アミノ酸)である。
[0024] ペプチドリンカ一のアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることが できる。 Ser
GlySer
GlyGlySer
Ser'GlyGly
Gly GlyGlySer
Ser'GlyGlyGly
Gly · Gly · Gly · Gly · Ser
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser)n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly)n
[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。
[0025] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、ジ スルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカルボ -ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシカル ボ -ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ— BSOCOES)などであり、これらの架橋剤は 市販されている。
[0026] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
[0027] 本発明にお 、て、好まし ヽ sc(FV)2の例としては、以下の (a)— (0の 、ずれかに記載 の抗体が挙げられる力 これらに限定されるものではない。
(a) 配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変 領域を含む sc(Fv)2。
(b) 配列番号： 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽鎖可変 領域を含む sc(Fv)2。
(c) 配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変 領域および配列番号： 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽 鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(d) 配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(e) 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(D 配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号： 12 に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
(g) 配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
(h) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
(0 (a)— (h)のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、付加および Zまたは挿入され、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する sc(Fv)2。
[0028] なお、配列番号： 9、 10はそれぞれ 2D7重鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配列を 示し、当該領域における、 50番目一 54番目力CDR1 (配列番号： 3)、 69番目一 85番 目力 SCDR2 (配列番号： 4)、 118番目一 123番目力 SCDR3 (配列番号： 5)に相当する。 また、配列番号： 11、 12はそれぞれ 2D7軽鎖可変領域の塩基配列、アミノ酸配列を 示し、当該領域における、 46番目一 55番目力CDR1 (配列番号： 6)、 71番目一 77番 目力 SCDR2 (配列番号： 7)、 110番目一 118番目力 SCDR3 (配列番号： 8)に相当する。 また、上記重鎖可変領域と軽鎖可変領域をリンカ一でつな 、だ scFVをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列を配列番号： 13に、 scFVのアミノ酸配列を配列番号： 14に 示し、本発明の sc(FV)2をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号： 1に、 sc(FV)2のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。
[0029] また、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2または、配列番号： 2に記 載のアミノ酸配列力もなる CDR (又は可変領域)を有する sc(Fv)2を、ヒトに対する異種 抗原性を低下させること等を目的としてヒトイ匕（Humanized)、キメラ（Chimeric)化して もよい。これらの人為的に改変した抗体は、既知の方法を用いて製造することができ る。
[0030] ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号: 2に記載の配列を有す る sc(FV)2、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なる CDR (又は可変領域)を 有する sc(FV)2と同等の活性 (例えば、 HLA-Aへの結合活性、細胞死誘導活性、など )を有することを意味する。
[0031] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763- 2766)などを用いて 、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を 調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように 、本発明の抗体のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸 配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
[0032] 変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましく は 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であ ると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて いる別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有 するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及 びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R 、 K、 H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧 内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数 個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾された アミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知ら れている（Mark, D. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487—6500、 Wang, A. et al" Science 224, 1431-1433、 Dalbadie - McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。
[0033] 本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付カロ された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した 融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコー ドするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを フレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させれ ばよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付され る他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、 FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210 )、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 X His、 10 X His,インフルエンザ凝集素（HA)、ヒト c-mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIV の断片、 T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, a -tubulinの断片、 B-tag、 Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明 の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、 GST (ダルタチオン S —トランスフェラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 β - ガラクトシダーゼ、 ΜΒΡ (マルトース結合タンパク質)等が挙げられる。市販されている これらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコ ードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発 現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
[0034] 本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、 アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしなが ら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれ る。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗 体のアミノ酸配列の N末端にメチォニン残基が付加される。本発明の抗体はこのよう な抗体も包含する。
[0035] 本発明の抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等の各種 分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られ た抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法 はこの分野においてすでに確立されている（例えば、 US5057313、 US5156840) o本 発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
[0036] また本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチ ドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を 有する抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本 発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデォキシリボ核酸 (DNA)また はリボ核酸 (RNA)等の塩基または塩基対力もなる重合体である。本発明のポリヌクレ ォチドは天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺 伝子工学的な手法により発現させる際に使用することができる。また本発明の抗体と 同等な機能を有する抗体をスクリーニングする際に、プローブとして用いることもでき る。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとし て用い、ハイブリダィゼーシヨン、遺伝子増幅技術 (例えば PCR)等の技術により、該 ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ本発明の抗体と 同等の活性を有する抗体をコードする DNAを得ることができる。このような DNAも本発 明のポリヌクレオチドに含まれる。ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular Cloning 2nd ed., 9.47—9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)は当業 者によく知られた技術である。ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、低スト リンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーショ ン後の洗浄において、例えば 42°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50 。C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件と しては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば
65°C、 5 X SSC及び 0.1%SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程 に高 、相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度な ど複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様の ストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0037] これらハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチド 力 Sコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸 配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に 同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い 相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好ましく は 75%以上の同一性、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95%以 上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献 (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)に記載のアルゴリズム にしたがえばよい。
[0038] 本発明の sc(Fv)2は当業者に公知の方法により作製することができる。例えば、 HLA を認識する抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製す ることが可能である。具体的には、 HLAを認識する抗体の配列を基に sc(Fv)2をコード するポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で 発現させればよい（例えば、 Co, M. S. et al" J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476—496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515； Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652—663； Rousseaux, J. et al" Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669； Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参 照)。
[0039] HLAを認識する抗体の配列は、既に公知の抗体の配列を用いることが可能であり、 又、 HLAを抗原として、当業者に公知の方法により抗 HLA抗体を作製し、その抗体の 配列を取得して用いることも可能である。具体的には、例えば、以下のようにして行う ことができる。 HLAタンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通 常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって 公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生 細胞 (ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキ ュロウィルスを用いた方法 (W098/46777など）等に準じて行うことができる。ハイブリド 一マの作製は、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が 低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行え ばよい。その後、ハイプリドーマの mRNA力も逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（ V領域）の cDNAを合成し、得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればよい
[0040] HLAを認識する抗体は、 HLAと結合する限り特に制限はなぐマウス抗体、ラット抗 体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する 異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体 、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体なども使用できる。これらの改変抗体は、既知の方 法を用いて製造することができる。
[0041] キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域力 なる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコ ードするポリヌクレオチドをヒト抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる
[0042] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえば マウス抗体の相補性決定領域をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023 、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照)。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト 抗体のフレームワーク領域 (framework region； FR)を連結するように設計したポリヌク レオチド配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のォ リゴヌクレオチドから PCR法により合成する (国際特許出願公開番号 W098/13388号 公報に記載の方法を参照)。得られたポリヌクレオチドをヒト抗体定常領域をコードす るポリヌクレオチドと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し 産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、国際特許出願公 開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定 領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト 抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域の フレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al.， Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。これらキメラ抗体やヒト化抗体などについては、 sc(Fv)2にした後にキメ ラ化ゃヒト化等を行ってもよいし、キメラ化やヒト化等を行った後に sc(Fv)2にしてもよい
[0043] また、ヒト抗体の取得方法も知られて 、る。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の 抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞 、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもで きる（特公平 1-59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトラ ンスジエニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することがで きる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用い て、パン-ングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変 領域を一本鎖抗体 (scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現 させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝 子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド 配列を決定することができる。抗原に結合する scFvのポリヌクレオチド配列が明らか になれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる 。これらの方法は既に衆知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることがで きる。
[0044] 本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目 的とする抗体の DNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、 ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。 次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる 。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 [0045] ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした 場合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。本 発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現べク ターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場 合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく 発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544-546 ; FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043)、または T7プロモーターなどを持っていることが不可 欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X- 1 (フアルマシ ァ社製）、「QIAexpress system] (キアゲン社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿 主は T7 RNAポリメラーゼを発現して 、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0046] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0047] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとして は、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEFゝ pCDM8)、昆虫細胞由 来の発現ベクター (例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」 (ギブコ BRL社製）、 PBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウイ ルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発 現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia
Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVl l、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現べクタ 一（例えば、 pPL608、 pKTH50)が挙げられる。
[0048] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（
Mulliganら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモータ 一（Mizushimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持 つていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、 薬剤 (ネオマイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば さらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0049] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、
SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起 点を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点として は、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由 来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発 現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、 チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフエ ラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0050] 一方、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチドを発現させる方法としては、本発 明のポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソ ーム法、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方 法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（ 例えば pAdexlcw)やレトロウイルスベクター (例えば pZIPneo)などが挙げられるが、こ れらに制限されない。ベクターへの本発明のポリヌクレオチドの挿入などの一般的な 遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。 生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。
[0051] また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明の ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や種々の 動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の 抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造の ための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては、 真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
[0052] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COSゝ 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生 類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature (1981) 291, 358-340)、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が知られている。 CHO細胞と しては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr- CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216- 4220)や CHO K— 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とす る場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リ ン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガ 一マンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポーレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの 方法で行うことが可能である。
[0053] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞と しては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セ レビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、ァスぺノレギノレス (Aspergillus) 属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（Aspergillus niger)が知られている。
[0054] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E. coli)、例えば、 JM109, DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知 られている。
[0055] これらの細胞を目的とするポリヌクレオチドにより形質転換し、形質転換された細胞 を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うこと ができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用する こともできるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6— 8であるのが好ましい。 培養は、通常、約 30— 40°Cで約 15— 200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気 、攪拌を加える。
[0056] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリ ヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。 本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0057] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ- ック動物を用いることができる。
[0058] 例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産 生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、こ の融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ 移植する。胚を受容したャギカ 生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生 する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジエニックャギカ 産生される ポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャ ギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al.， Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
[0059] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的 のポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、この力 ィコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Susumu, M. et al.， Nature (1985) 315, 592-594) o
[0060] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、目的のポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に挿入し、この ベクターをァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)のような ノ クテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ 'タパカム（ Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることがで きる（Julian K.-C. Ma et al" Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131—138)。 [0061] これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から単 離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は 、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定 されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、 溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電 点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製す ることがでさる。
[0062] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and
Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液ネ目クロマト グラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる 。ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテ イン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法 を用い、高度に精製された抗体も包含する。
[0063] 本発明にお!/、て、調製された抗体の抗原結合活性 (Ant¾odies A Laboratory
Manual. Εα riarlow, David Lane, Cold bpring Harbor Laboratory, 1988)の視 U定【こ i 公知の手段を使用することができる。例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法）、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)ある!/、は蛍光免疫法などを用いるこ とがでさる。
[0064] 本発明者らは、本発明の抗体が細胞死を誘導することを見出した。この知見に基づ き、本発明の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤または細胞増殖抑制剤 を提供する。また、既に本発明者らは、抗 HLA抗体を低分子化した Diabodyが、ヒト骨 髄腫モデル動物に対して、抗腫瘍効果を有することを見出している（
WO2004/033499) oさら〖こ、本発明の抗体の細胞死誘導活性は、活性化された T細 胞又は B細胞で特に効果が大きいと考えられる。従って、本発明の抗体は、 Diabody と同様に癌などの腫瘍 (特に血液腫瘍)や自己免疫疾患の治療や予防に特に有効 であると考えられる。本発明は、本発明の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤 または自己免疫疾患治療剤もまた提供するものである。
[0065] 本発明の抗体は、直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化 した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施し た錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水 もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤 の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体 的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香 味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められ た製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考 えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られ るようにするものである。
[0066] 錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーン スターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦 形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシゥ ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモ ノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合 には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のた めの無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って 処方することができる。
[0067] 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウムが挙 げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコ ール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤 、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO- 50と併用してもよい。
[0068] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸 ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアル コール、フエノール、酸ィ匕防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当 なアンプルに充填させる。
[0069] 患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔 内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行 いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であ れば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がポリヌクレオ チドによりコードされうるものであれば、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに 組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年 齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
[0070] 本発明の抗体の投与量は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方 法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人 (体重 60kgとして）において は、 1日あたり約 0.1から 1000mg、好ましくは約 1.0から 50mg、より好ましくは約 1.0から 20mgであると考えられる。
[0071] 非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与 方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人 (体重 60kgとして）におい ては、通常、 1日当り約 0.01力 30mg、好ましくは約 0.1から 20mg、より好ましくは約 0.1 から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物 の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投 与することができる。
さらに本発明は、本発明の抗体を用いることにより、細胞の細胞死を誘導する方法 に関する。具体的には、本発明の抗体を細胞に接触させることにより、該細胞に細胞 死を誘導する方法に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0072] 以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例 1〕2D7 sc(Fv)2型 DIABODY発現ベクターの作製 WO2004/033499に記載した通り、 HLAクラス Iに対する抗体 2D7モノクローナル抗体 を、重鎖および軽鎖可変領域を 5merのリンカ一で接続した低分子抗体 (2D7 diabody ) (図 1A)に改変することにより、ミエローマ細胞に対する細胞死誘導活性が劇的に上 昇したことを既に示した。そこで、この 2D7diabodyを、構造的により安定であると考え られる sc(Fv)2型 (図 1B)に改変し、細胞死誘導活性を従来型 diabody(HL5)と比較検討 した。
[0073] まず、 2D7抗体の重鎖可変領域配列（VH)と軽鎖可変領域配列（VL)が、
VH-VL-VH-VLの並びになるように、それぞれを 15merのリンカ一（
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySer)で接続した 2D7 sc(Fv)2をコー ドする DNA発現ベクターを以下の手順で作製した。
[0074] WO2004/033499に記載の方法で作成した、 VH-VLを 5merのリンカ一（
GlyGlyGlyGlySer)で連結した 2D7diabody(HL5)発現ベクターを铸型にして、プライマ 一 2D7DBH1 (配列番号： 15)、プライマー 2D7PA2 (配列番号： 16)で PCR反応を行い 、断片 Aを増幅した。同様に、プライマー 2D7PA3 (配列番号：17)、プライマー 2D7PA5 (配列番号： 18)で PCR反応を行い、断片 Bを増幅した。ここで得られた断片 A及び断片 Bを、同一チューブ内で混合し、 PCR-recombination反応を行うことで、断 片 Aと断片 Bを連結させた。これにより、 N末に VHのシグナル配列を含み、 VH-VLが 15merのリンカ一で連結した DNA断片 "2D7diabodyHL15-l"を得た。
[0075] 続、て、 2D7diabody(HL5)発現ベクターを铸型にして、プライマー 2D7PA6 (配列番 号： 19)、プライマー 2D7PA2 (配列番号： 16)で PCR反応を行い、断片 Cを増幅した。 同様に、プライマー 2D7PA3 (配列番号： 17)、プライマー 2D7DBL2 (配列番号： 20) で PCR反応を行い、断片 Dを増幅した。ここで得られた断片 C及び断片 Dを同一チュ ーブ内で混合し、 PCR-recombination反応により、 2つの断片を連結させた。この操 作によって、 VH-VLが 15merのリンカ一で連結し、 C末に Flag-tag領域を含む DNA断 片 "2D7diabodyHL15- 2"を得た。
[0076] 上記反応により得られた 2つの DNA断片、すなわち "2D7diabodyHL15-l" DNA断 片、及び、 "2D7diabodyHL15-2" DNA断片を、それぞれ EcoRI-BamHI、及び、 BamH卜 Notlで切断し、両 DNA断片をあらかじめ EcoR卜 Notlで切断し開裂した発現べ クタ一 pCXND3に挿入した。インサート DNAの塩基配列を解析し、 目的どおり signa VH(l 5)VL(15)VH(15)VL- Flagをコードする cDNAが、 pCXND3の EcoRI- Notl間 に挿入されて 、ることを確認し、 2D7sc(Fv)2発現ベクター (pCXND3- 2D7sc(Fv)2)の構 築を終了した。 2D7sc(Fv)2の塩基配列（配列番号： 1)およびアミノ酸配列（配列番号 : 2)を図 2に示す。
[0077] 〔実施例 2〕 2D7sc(Fv)2産生発現細胞株の榭立
Pvulで切断し直鎖化した pCXND3-2D7sc(Fv)2 20 μ gを CHO細胞（DG44株）に以 下のよつに electroporation法により導入した。
[0078] CHO- S- SFM- II培地（インビトロジェン）で培養した DG44細胞を ice- cold PBSで 2回 洗浄した後 1X10ソ mlになるように PBSに懸濁した。これに 20 gの上記プラスミドを混 合し、電気ノルス（1.5KV, 25 FD)を与えた。適当な割合で細胞を希釈し 96 well plateに細胞を撒きこみ、終濃度 500 g/mlの G418(インビトロジェン）を添加した CHO-S-SFM-Π培地中で培養を行った。生育した単一コロニーを約 30クローンほどピ ックアップし、それら培養上清中の 2D7sc(Fv)2の発現量を抗 FLAG抗体 (シグマ）を用 いたウェスタンブロットにより調べた。最も発現の高かったクローンを 5nM MTXを含む 核酸フリーの CHO-S-SFM II培地（インビトロジェン）で培養を行い、培養スケールを 拡大した。その結果得られた株を高産生細胞株とした。
[0079] 〔実施例 3〕2D7sc(Fv)2の大量精製
T-125フラスコでサブコンフルェントの 2D7sc(Fv)2高産生 CHO細胞株を lX105/mlに なるようにローラーボトル（CHO-S-SFM II培地 250ml/ボトル)に移した。 37°Cで培養 し、 6日後に培養液を回収した。遠心によって死細胞を除去した後、 0.45 mフィルタ 一を通してこれを精製に用いた。
[0080] 2D7sc(Fv)2の精製は以下のとおり行った。
まず、 buffer A (20mM Na- phosphate pH6.8)で平衡化した Hydroxyapatiteカラム（ micro prep ceramic Hydroxyapatite type I, Bio— Rad)に回収した; ¾r 上清を applyし た。 buffer Aでカラムを洗浄した後、 buffer C (250mM Na-phosphate pH6.8)で 2D7sc(Fv)2を溶出した。 2D7sc(Fv)2を含むフラクションを等量の buffer Aで希釈した 後、これを Anti-Flag M2ァガロースァフィ-ティカラム（Bio-Rad)に applyした。この力 ラムを buffer C (50mM Tris- HC1 pH7.4, 150mM NaCl, 0.01% Tween 20)で洗浄した 後、 buffer D (lOOmM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20)で 2D7sc(Fv)2を溶出した。回収 したサンプルは直ちに終濃度 25mMになるように Tris-HCl pH8.0で中和した。その後 、このフラクションを、セントリプレップ YM- 10 (AMICON)で濃縮し、 Superdex200HR (26/60)カラム (アマシャムフアルマシア）によるゲルろ過クロマトグラム精製に使用した
0.01% Tween 20を含む PBSでゲルろ過クロマトグラム精製を行い、サンプル溶出時 のチャートを図 3に示した。 2D7sc(Fv)2高産生 CHO細胞株より産生された低分子化 抗体は、そのほとんどが分子量約 52Kdの位置に溶出ピークを有し (図 3 (1)参照)、 同じく 52Kdで溶出される 2D7
Figure imgf000027_0001
(2)参照)。この ことから本発明で構築した 2D7sc(Fv)2は、当初の目的どおり図 1Bに示す構造（1本鎖 抗体が分子内で折れ曲がることで形成される sc(Fv)2構造)を形成していると考えられ た。
ゲルろ過クロマトグラム精製により分離された 52Kdのピークのみを回収し、これを 2D7sc(Fv)2蛋白標品とした。回収したサンプルの一部を SDS電気泳動および銀染色 を行うことで、 目的の蛋白が 100%の純度で精製されていることを確認した。回収した 精製標品はセントリブレップ YM- 10 (AMICON)で濃縮し、 2D7sc(Fv)2精製標品として 以下の実験に使用した。
[0081] 〔実施例 4〕 2D7sc(Fv)2の細胞死誘導活性の測定
ヒト骨髄腫細胞株 ARH77細胞を、 10% FCSを含む RPMI1640培地（インビトロジェン） で 1 X 105 cells/wellになるように 24 well plateに細胞を撒いた。これに、精製した 2D7sc(Fv)2を終濃度 100ng/ml、及び、 250ng/mlになるように添加した。また比較検体 として、精製した 2D7diabody(HL5)を別の wellに同一条件で添カ卩した。 37°Cで 3時間 培養後、各細胞を回収し、 PI溶液 g/ml PI, 2% FCS/ PBS) に細胞を懸濁した。 遮光して室温で 15分インキュベートした後、 flow cytometoryを用いて PIで染色された 死細胞の割合を測定した（EPICS ELITE, COULTER)。
[0082] その結果、 2D7sc(Fv)2は濃度依存的に細胞死を誘導する活性を有していることが 明らかになった。またその活性は、 linker 5merで VHと VLをつないだ 2D7diabody( HL5)とほぼ同レベルであることが分かった。以上の結果より、 in vitroにおける細胞死 誘導活性に関しては、 2D7sc(Fv)2は 2D7diabody (HL5)と同様の活性を有しているこ とが分力つた（図 4)。
[0083] 〔実施例 5〕 2D7sc(Fv)2の細胞増殖抑制活性の測定
ヒト EBV- transformed B細胞株 IM9細胞 (ATCC)を 3X103 cells/wellで、またヒトバー キットリンパ腫由来細胞株 HS- Sultan細胞を 1X104 cells/wellになるように 10% FCSを含 む RPMI1640培地で希釈し、 96 well plateに撒いた。これに、精製した 2D7sc(Fv)2、 および、 2D7diabody (HL5)を終濃度 0、 0.0032、 0.016、 0.08、 0.4、 2 μ g/mlになるよう に添加し、 37°Cで培養した。 3日間培養後、細胞数測定 WST-8キット (同仁ィ匕学)を用 いて生細胞数を測定した。
生細胞数の割合 (％) = (抗体存在下で培養した生細胞数)/ (抗体非添加で培養した 生細胞数)で算出し、これに 100を乗じ縦軸に示した (図 5)。
その結果、 2D7sc(Fv)2は濃度依存的に IM9細胞、および、 HS-Sultan細胞の増殖を 阻害し、 2D7 diabodyと同等の細胞増殖抑制活性を持つことがわ力つた。
[0084] 〔実施例 6〕放射性標識 2D7sc(Fv)2および放射性標識 2D7diabody(HL5)の調製
丸底ポリエチレンチューブの底の部分を約 1 cmの深さに切り取り、この底の部分に 250 mmol/L NaCl及び Tween 20 0.05 vol%含有 20 mmol/Lリン酸緩衝液（pH 7.0)、 Na125I溶液及び 2D7sc(Fv)2または 2D7diabody(HL5)溶液を添カ卩した。 0.15 mol/L NaCl溶液を染み込ませ乾燥させたろ紙 (5 X 5 mm)をカバーガラス上にのせ、ろ紙に 32 mg/mL Chloramine T溶液を染み込ませ、ろ紙が内側になるようにカバーガラスを 反応チューブの上にかぶせた。
[0085] 室温で 5分間放置した後、新たに 32 mg/mL Chloramine T溶液を染み込ませたろ紙 に取り替え、前述と同様に反応チューブの上にかぶせ室温でさらに 5分間放置した。 反応液に Tween 20 0.05 vol%含有 PBS (-)を添加後、反応液を Tween 20 0.05 vol% 含有 PBS (-)で平衡化した PD-10 column (アマシャムフアルマシア）にのせ、 Tween 20 0.05 vol%含有 PBS (-)にて溶出させ未反応の1251を除去した。さらに、 Superdex200 10/300GLカラム (アマシャムフアルマシア）によりゲルろ過精製し、放射性ョード標識 2D7sc(Fv)2および放射性ョード標識 2D7diabody(HL5)を調製した。 [0086] 〔実施例 7〕マウスに放射性標識 2D7sc(Fv)2および放射性 2D7diabody(HL5)を単回静 脈内投与したときの血漿中放射能濃度推移
雄性マウス（C.B- 17/Icr Scid Jcl、日本クレア）に放射性標識 2D7 sc(Fv)2および放 射性標識 2D7diabody(HL5)を 1 mg/5 MBq/kgで単回尾静脈内投与した。投与 15、 30 分、 1、 2、 4、 8、 24時間後にエーテル麻酔下マウスを開腹し、心臓よりへパリン処理し た 25G注射針付テルモシリンジを用いて採血した。採取した血液は直ちに 4°C、 12,000 rpmで 5分間遠心し、血漿を分離した。
血漿試料の放射能を γ -カウンタ一にて測定した。また、投与液の放射能を同時に 測定し、投与液中の放射性標識被験物質の比放射能を算出し、それを基に血漿中 総放射能濃度を算出した。放射能測定後、血漿試料に精製水および TCA 25 w/v% 溶液を加え、攪拌後、 4°Cで 3000 rpm、 10分間遠心分離した。上清をァスピレーター で吸引後、沈殿物の放射能を測定した。総放射能に対する沈殿物の放射能の割合 を血漿中総放射能濃度に乗じて血漿中 TCA沈殿画分放射能濃度を算出した。
[0087] 放射性標識 2D7sc(Fv)2および放射性標識 2D7diabody(HL5)投与群ともに血漿中 TCA沈殿画分放射能濃度は二相性で減少した（図 6)。放射性標識 2D7sc(Fv)2は放 射性標識 2D7diabody(HL5)より高 ヽ血漿中 TCA沈殿画分放射能濃度を与え、消失 相の半減期はそれぞれ 2.30時間および 1.64時間で 2D7sc(Fv)2は 2D7diabody(HL5)よ り長い半減期を与えた。
産業上の利用の可能性
[0088] HLA class IAを認識する低分子抗体 (diabody)を sc(Fv)2へと構造改変することによ り、高い細胞死誘導活性と細胞増殖抑制活性を保持させながら、血中での安定性を より高め、 in vivoにおいて優れた薬効を発揮させることにある。

Claims

請求の範囲
[I] 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域を含み、ヒト白血球抗原 (HLA)への結 合活性を有する一本鎖ポリペプチドであることを特徴とする抗体。
[2] 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域が、一本鎖ポリペプチドの N末端側を 基点として重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順に並 んで 、ることを特徴とする、請求項 1に記載の抗体。
[3] 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域がリンカ一で結合されて 、ることを特徴 とする、請求項 1または 2に記載の抗体。
[4] リンカ一が 15アミノ酸であることを特徴とする、請求項 3に記載の抗体。
[5] HLAが HLA class Iである、請求項 1一 4のいずれかに記載の抗体。
[6] HLA class Iが HLA- Aである、請求項 5に記載の抗体。
[7] sc(Fv)2である請求項 1一 6の 、ずれかに記載の抗体。
[8] 配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変領域 を含む sc(Fv)2。
[9] 配列番号: 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽鎖可変領域 を含む sc(Fv)2。
[10] 配列番号： 3、 4、 5に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する重鎖可変領域 および配列番号： 6、 7、 8に記載のアミノ酸配列力 なる CDR1、 2、 3を有する軽鎖可 変領域を含む sc(Fv)2。
[II] 配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
[12] 配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
[13] 配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号： 12に 記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む sc(Fv)2。
[14] 配列番号： 14に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
[15] 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有する sc(Fv)2。
[16] 請求項 8— 15の 、ずれかに記載のアミノ酸配列にお 、て 1又は複数のアミノ酸が置 換、欠失、付加および Zまたは挿入され、かつ請求項 8— 15のいずれかに記載の抗 体と同等の活性を有する sc(Fv)2。
[17] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
[18] 請求項 17に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、か つ請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポ リヌクレ才チド。
[19] 請求項 17または 18に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[20] 請求項 17または 18に記載のポリヌクレオチドまたは請求項 19に記載のベクターを保 持する宿主細胞。
[21] 以下の工程を含む請求項 1一 16の ヽずれかに記載の抗体を作製する方法。
(a) HLAを認識する抗体を調製する工程
(b) (a)で調製した抗体の配列を基に、請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体をコ ードするポリヌクレオチドを作製する工程
(c) (b)のポリヌクレオチドを含むベクターを作製する工程
(d) (c)のベクターを宿主細胞に導入する工程
(e) (d)の宿主細胞を培養する工程
[22] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤。
[23] B細胞又は T細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、請求項 22に記載の 細胞死誘導剤。
[24] B細胞又は T細胞力 活性化 B細胞又は活性化 T細胞である、請求項 23に記載の細 胞死誘導剤。
[25] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制 剤。
[26] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
[27] 腫瘍が血液腫瘍である請求項 26に記載の抗腫瘍剤。
[28] 請求項 1一 16のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾患 治療剤。
PCT/JP2004/018501 2003-12-12 2004-12-10 細胞死誘導剤 WO2005056603A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/582,304 US20070280951A1 (en) 2003-12-12 2004-12-10 Cell Death Inducing Agents
AU2004297109A AU2004297109A1 (en) 2003-12-12 2004-12-10 Cell death inducing agent
CA002548929A CA2548929A1 (en) 2003-12-12 2004-12-10 Cell death inducing agent
JP2005516197A JP4767016B2 (ja) 2003-12-12 2004-12-10 細胞死誘導剤
EP04820311A EP1712565A4 (en) 2003-12-12 2004-12-10 AGENTS INDUCING CELL DEATH

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-415758 2003-12-12
JP2003415758 2003-12-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005056603A1 true WO2005056603A1 (ja) 2005-06-23

Family

ID=34675142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/018501 WO2005056603A1 (ja) 2003-12-12 2004-12-10 細胞死誘導剤

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070280951A1 (ja)
EP (1) EP1712565A4 (ja)
JP (1) JP4767016B2 (ja)
KR (1) KR20060130606A (ja)
AU (1) AU2004297109A1 (ja)
CA (1) CA2548929A1 (ja)
WO (1) WO2005056603A1 (ja)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006132363A1 (ja) 2005-06-10 2006-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha メグルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用
WO2008007755A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha inducteur de mort cellulaire
JPWO2005100560A1 (ja) * 2004-04-09 2008-03-06 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
WO2008111597A1 (ja) 2007-03-12 2008-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用
WO2010107658A2 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Vallera Daniel A Methods and compositions for bi-specific targeting of cd19/cd22
WO2011014432A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Carbylan Biosurgery, Inc. Modified hyaluronic acid polymer compositions and related methods
WO2011037160A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 Hlaクラスiを認識する抗体
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
RU2408606C2 (ru) 2000-10-20 2011-01-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Соединение - агонист тро
EP2351838A1 (en) * 2000-10-20 2011-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Crosslinking agonistic antibodies
WO2004033499A1 (ja) 2002-10-11 2004-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 細胞死誘導剤
JP2004279086A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
WO2004087763A1 (ja) * 2003-03-31 2004-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
TW200530269A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
US20090022687A1 (en) * 2005-05-18 2009-01-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel Pharmaceuticals That Use Anti-HLA Antibodies
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07503622A (ja) * 1992-12-11 1995-04-20 ザ　ダウ　ケミカル　カンパニー 多価の一本鎖抗体
WO2004033499A1 (ja) * 2002-10-11 2004-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 細胞死誘導剤

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5077216A (en) * 1988-07-06 1991-12-31 The Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies specific for a human mononculear phagocyte-specific antigen
US5223241A (en) * 1990-10-01 1993-06-29 The General Hospital Corporation Method for early detection of allograft rejection
US5368596A (en) * 1992-03-18 1994-11-29 Burkhart; Stephen S. Augmented awl for creating channels in human bone tissue
US5837821A (en) * 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
CA2150262C (en) * 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5780021A (en) * 1993-03-05 1998-07-14 Georgetown University Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i
US5747654A (en) * 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
CN1046314C (zh) * 1993-09-03 1999-11-10 中外制药株式会社 具有引起细胞程序性死亡的特征的单克隆抗体
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5885574A (en) * 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
IL114909A (en) * 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US8771694B2 (en) * 1994-08-12 2014-07-08 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for B-cell lymphoma and leukemia cells
US6451523B1 (en) * 1994-09-14 2002-09-17 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
CA2210309C (en) * 1995-02-28 2002-04-16 The Procter & Gamble Company Preparation of noncarbonated beverage products having superior microbial stability
CA2245835A1 (en) * 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
CA2241564C (en) * 1996-01-08 2013-09-03 Genentech, Inc. Wsx receptor and ligands
FR2745008A1 (fr) * 1996-02-20 1997-08-22 Ass Pour Le Dev De La Rech En Recepteur nucleaire de glucocorticoides modifie, fragments d'adn codant pour ledit recepteur et procedes dans lesquels ils sont mis en oeuvre
EP0903149A4 (en) * 1996-03-06 2002-02-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR SCREENING SUBSTANCES INDUCING APOPTOSIS
JP3806445B2 (ja) * 1996-05-09 2006-08-09 ファーマ・パシフィック・プロプライエタリー・リミテッド 治療方法
EP0852951A1 (de) * 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
US6323000B2 (en) * 1996-12-20 2001-11-27 Clark A. Briggs Variant human α7 acetylcholine receptor subunit, and methods of production and uses thereof
US6342220B1 (en) * 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
KR20010023866A (ko) * 1997-09-11 2001-03-26 나가야마 오사무 아포토시스를 유기하는 모노클로날 항체
US7081360B2 (en) * 1998-07-28 2006-07-25 Cadus Technologies, Inc. Expression of G protein-coupled receptors with altered ligand binding and/or coupling properties
US6232000B1 (en) * 1998-08-28 2001-05-15 Stoody Company Abrasion, corrosion, and gall resistant overlay alloys
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
US20020028178A1 (en) * 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20040058393A1 (en) * 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
RU2408606C2 (ru) * 2000-10-20 2011-01-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Соединение - агонист тро
EP2351838A1 (en) * 2000-10-20 2011-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Crosslinking agonistic antibodies
IL161418A0 (en) * 2001-10-15 2004-09-27 Immunomedics Inc Direct targeting binding proteins
KR20050036852A (ko) * 2001-10-15 2005-04-20 기린 비루 가부시키가이샤 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체
US20050118163A1 (en) * 2002-02-14 2005-06-02 Hidefumi Mizushima Antibody-containing solution pharmaceuticals
JP2005526044A (ja) * 2002-02-21 2005-09-02 デューク ユニバーシティ 抗ｃｄ２２抗体を使用した治療方法
US8030461B2 (en) * 2002-04-15 2011-10-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for constructing scDb libraries
EP1510943A4 (en) * 2002-05-31 2007-05-09 Celestar Lexico Sciences Inc INTERACTION PREDICTION DEVICE
US7456260B2 (en) * 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
JPWO2004003198A1 (ja) * 2002-06-27 2005-10-27 株式会社ジェノックス創薬研究所 アレルギー性疾患の検査方法、および治療のための薬剤
JPWO2004037293A1 (ja) * 2002-10-22 2006-02-23 大日本住友製薬株式会社 安定化組成物
JP2004279086A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
WO2004087763A1 (ja) * 2003-03-31 2004-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
CA2545166A1 (en) * 2003-11-11 2005-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-cd47 antibody
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
JPWO2005056605A1 (ja) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
KR20070010046A (ko) * 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
US20080274110A1 (en) * 2004-04-09 2008-11-06 Shuji Ozaki Cell Death-Inducing Agents
EP1870458B1 (en) * 2005-03-31 2018-05-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS
US20090022687A1 (en) * 2005-05-18 2009-01-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel Pharmaceuticals That Use Anti-HLA Antibodies
KR101367544B1 (ko) * 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
WO2006132341A1 (ja) * 2005-06-10 2006-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2部位特異的変異体
KR20090038896A (ko) * 2006-07-13 2009-04-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포사 유도제
EP3111955B1 (en) * 2006-08-14 2019-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
CL2008000719A1 (es) * 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07503622A (ja) * 1992-12-11 1995-04-20 ザ　ダウ　ケミカル　カンパニー 多価の一本鎖抗体
WO2004033499A1 (ja) * 2002-10-11 2004-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 細胞死誘導剤

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUENKE J. ET AL: "A recombinant bispecific single-chain Fv antibody against HLA class of lymphoma cells", BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, vol. 125, no. 2, April 2004 (2004-04-01), pages 167 - 179, XP002987121 *
CO M.S. ET AL: "A humanized antibody specific for the platelet integrin gpIIb/IIIa", J.IMMUNOL., vol. 152, no. 6, 1994, pages 2968 - 2976, XP002987123 *
GENESTIER L. ET AL: "Fas-Independent Apoptosis of Activated T Cells Induced by Antibodies to the HLA CLass I 1 Domain", BLOOD, vol. 90, no. 9, 1997, pages 3629 - 3639, XP002964772 *
HUDSON P.J. ET AL: "High avidity scFv multimers: diabodies and triabodies", J.IMMUNOL.METHODS., vol. 231, no. 1-2, 1999, pages 177 - 189, XP004186084 *
KIPRIYANOV S.M. ET AL: "Effect of domain order on the activity of bacterially produced bispecific single-chain Fv antibodies", J.MOL.BIOL., vol. 330, no. 1, June 2003 (2003-06-01), pages 99 - 111, XP004445110 *
See also references of EP1712565A4 *
SEKIMOTO E. ET AL: "A recombinant HLA Class I-Specific Single Fv Diabody Induces Cell Death in Human Lymphoid Malignancies", BLOOD, vol. 102, no. 11, November 2003 (2003-11-01), pages 933A - ABSTRACT #3474, XP002987122 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4799405B2 (ja) * 2004-04-09 2011-10-26 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
JPWO2005100560A1 (ja) * 2004-04-09 2008-03-06 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
WO2006132363A1 (ja) 2005-06-10 2006-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha メグルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
WO2008007755A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha inducteur de mort cellulaire
WO2008111597A1 (ja) 2007-03-12 2008-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hlaクラスiを認識する抗体を有効成分として含有する化学療法剤耐性癌治療剤、およびその利用
US9371386B2 (en) 2009-03-16 2016-06-21 Daniel A. Vallera Methods and compositions for bi-specific targeting of CD19/CD22
WO2010107658A3 (en) * 2009-03-16 2011-01-20 Vallera Daniel A Methods and compositions for bi-specific targeting of cd19/cd22
WO2010107658A2 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Vallera Daniel A Methods and compositions for bi-specific targeting of cd19/cd22
WO2011014432A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Carbylan Biosurgery, Inc. Modified hyaluronic acid polymer compositions and related methods
WO2011037160A1 (ja) 2009-09-24 2011-03-31 中外製薬株式会社 Hlaクラスiを認識する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
US20070280951A1 (en) 2007-12-06
EP1712565A1 (en) 2006-10-18
AU2004297109A1 (en) 2005-06-23
KR20060130606A (ko) 2006-12-19
JP4767016B2 (ja) 2011-09-07
JPWO2005056603A1 (ja) 2009-05-28
EP1712565A4 (en) 2009-03-11
CA2548929A1 (en) 2005-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4767016B2 (ja) 細胞死誘導剤
WO2004087763A1 (ja) Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
AU2015244814B2 (en) Immunoactivating antigen-binding molecule
JP5224580B2 (ja) ｓｃ（Ｆｖ）２部位特異的変異体
AU2002210917B2 (en) Degraded TPO agonist antibody
US8034903B2 (en) Degraded TPO agonist antibody
JP5623690B2 (ja) 抗体
JP2010155841A (ja) 細胞死誘導剤
US20080206229A1 (en) Modified Antibodies Recognizing Receptor Trimers or Higher Multimers
KR20060121150A (ko) 인간화 항-ｃｄ47 항체
KR20090021217A (ko) 조혈 줄기세포 증가 촉진제
JP4799405B2 (ja) 細胞死誘導剤
JPWO2008007755A1 (ja) 細胞死誘導剤
CA3126108A1 (en) Anti-adam28 antibody for treating cancer
WO2021197393A1 (zh) 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005516197

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2548929

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004297109

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004820311

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067013909

Country of ref document: KR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2004297109

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20041210

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004297109

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004820311

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020067013909

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10582304

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10582304

Country of ref document: US