WO2006132363A1 - メグルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用 - Google Patents

メグルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用 Download PDF

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Tomoyuki Igawa
Daisuke Kameoka
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a drug that stabilizes a protein containing medalmin, which is one of the amino sugars.
  • the present invention relates to an agent for stabilizing antibody molecules containing medalmin, and a method for stabilizing antibody molecules, including a step of adding medalmin.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing an antibody molecule stabilized with medalmin, and a method for producing the same.
  • Non-patent Document 1 a preparation capable of stably storing a protein used as a drug is required.
  • protein degradation pathways include degradation pathways associated with physical association of protein molecules such as the formation of soluble multimers and the formation of precipitates (insoluble matter) (Non-Patent Document 2), and hydrolysis / desorption.
  • Degradation pathways by chemical modification such as amidation reaction 'methionine oxidation reaction (non-patent document 3) are known.
  • optimization of solution pH, buffer solution salt type and concentration, and stabilizer type and concentration are performed.
  • Non-patent Document 5 discloses an antibody high-concentration stable preparation containing an acidic component, and MgCl and CaCl are used as additives for antibody stabilization.
  • Non-Patent Documents 8 and 9 discloses an antibody high-concentration stable preparation containing an acidic component, and MgCl and CaCl are used as additives for antibody stabilization.
  • low-molecular-weight antibodies are known to be associated and have very low stability (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 10
  • Non-Patent Documents 11, 12, and 13 It has been reported that sucrose is effective as an excipient when lyophilizing IgG antibodies (Non-patent Document 14).
  • Medalmin has been used in X-ray contrast media (amidotrizoate medalmin), MRI contrast media (gadopentetate medalmin), etc. So far, the effect of stabilizing proteins has been reported. There wasn't.
  • Non-Patent Document 1 Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4 (4), 298-306
  • Non-Patent Document 2 Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30
  • Non-Patent Document 3 Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188
  • Non-Patent Document 4 J. Pharm. Sci. 2004, 93 (6), 1390-1402
  • Non-Patent Document 5 Pharmaceutical Research 1994, 11 (5), 624-632
  • Non-Patent Document 6 Clin. Chem. Lab. Med. 2000, 38 (8): 759-764
  • Non-Patent Literature 7 Journal of Immunological Methods, 111 (1988), 17-23
  • Non-Patent Document 8 FEBS Letters Volume 360, Issue 3, 1995, 247-250
  • Non-Patent Document 9 FEBS Letters, 1995, 441, 458-462
  • Non-Patent Document 10 J. Mol. Biol. 2002, 320, 107-127
  • Non-patent literature l l Pharm Biotechnol, 2002, 13, 109-33
  • Non-Patent Document 12 Int. J. Pharm. 2000, 203 (1-2), 1-60
  • Non-Patent Document 13 Pharm. Res. 1997, 14 (8), 969-75
  • Non-Patent Document 14 J. Pharm. Sci. 2001, 90 (3), 310-21
  • Patent Document 1 WO02 / 096457
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for stabilizing a protein, including a step of adding medalmin, which is one of the amino sugars, to the protein. It is in.
  • an object of the present invention is to provide a method for stabilizing antibody molecules or a method for suppressing association of antibody molecules, which comprises a step of adding medalmin to antibody molecules. It is another object of the present invention to provide an agent that stabilizes antibody molecules or suppresses association of antibody molecules, which contains medalmin. It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition containing an antibody molecule stabilized by medalmin, a method for producing the pharmaceutical composition, and a kit containing the pharmaceutical composition.
  • the present inventors examined the antibody stabilizing effect of medamine, one of the amino sugars.
  • the present inventors examined the inhibitory effect of the association reaction by medamine using hVB22B sc (Fv) 2, which is sc (Fv) 2. As a result, it was revealed that the addition of medalmin greatly improved the residual ratio of monomers and significantly suppressed the WB22B association reaction. In this study, we found that the addition of medalmin to a low molecular weight antibody with low stability significantly improves the stability. This study also revealed that it is useful as a stabilizer for meglumine S protein for the first time.
  • medalmin has a greater inhibitory effect on the formation of aggregates in solution preparations, freeze-drying stresses, and freeze-dried preparations than sucrose.
  • Medamemin was also found to have a high stabilizing effect, regardless of the solution or lyophilized state, even for very high concentrations of antibody at 100 mg / mL.
  • the addition of medalmin suppresses the association of antibody molecules even during long-term storage at low temperatures or at room temperature. That is, the present inventors have found that medamine is useful as a stabilizer for antibody molecules for the first time according to the present invention, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [21].
  • a method for stabilizing a protein for a long period of time including a step of adding medalmin to the protein.
  • a method for suppressing protein association comprising a step of adding medalmin to a protein.
  • the antibody molecule is any one of a full-length antibody, a fragmented antibody, a low molecular weight antibody, a modified antibody, or an antibody-like molecule.
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing antibody molecules comprising a step of adding meglumine to an antibody-containing composition.
  • a method for producing a pharmaceutical composition containing an antibody molecule comprising the following steps (1) and (2):
  • FIG. 1 is a diagram showing the stabilization effect of B22B by medalmin.
  • FIG. 2 is a graph showing the stabilizing effect of medalmin on sc (Fv) 2 molecules and full-length antibodies.
  • the numerical value in the figure indicates the content (%) of the aggregate in the solution acceleration condition.
  • FIG. 3 is a graph showing the stability effect of medalmin in IgG solution formulation and freeze-dried formulation.
  • FIG. 4 is a graph showing the stability effect of meglumine in single chain diabody type sc (Fv) 2 during long-term low-temperature storage (_20 ° C. ′ 6 months).
  • FIG. 5 is a graph showing the stability effect of medamine on long-term storage at room temperature (25 ° C. for 2 months) of a humanized bispecific antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing a production process of a single chain antibody sc (Fv) 2.
  • the present invention relates to a method for stabilizing a protein, comprising the step of adding medalmin to the protein.
  • the stabilization of the present invention may be long-term stabilization.
  • “long-term stabilization” is defined as follows. In the case of a solution preparation of a low molecular weight antibody, the aggregate amount after storage at 55 ° C for 2 weeks is 35% or less, or the aggregate amount after storage at 40 ° C for 2 weeks is 10% or less, preferably 7% Meaning that the amount of aggregates after storage at 25 ° C for 2 months is 1% or less, or the amount of aggregates after storage at 20 ° C for 6 months is 2% or less, preferably 1% or less To do.
  • the amount of aggregates after storage at 60 ° C for 3 weeks is 20% or less, preferably 10% or less, or 20 ° C for 6 months It means that the amount of aggregates after storage is 2% or less, preferably 1% or less.
  • the amount of aggregates after storage at 40 ° C for 1 month is 5% or less, preferably 1% or less, more preferably 0. Means 5% or less.
  • “medalmine” is also known as N-methyldalcumamine, chemical formula Deoxy-methylamino-D-glucitol, and a compound represented by the following chemical formula.
  • “meglumine” includes medalmin derivatives and medalmin salts.
  • Medalmin derivatives and medamine salts include amidodolizate medalmine, sodium amidorizoate medalmin, cadpentetate medalmine, gadoterate meglumine, iotalamate megnoremine, iotrotas acid medalmin, gadobenic acid medalmin, odoxamic acid medalmin, flunixin medalmin, gastro Grafein (medalmine sulfate)
  • the medalmin of the present invention also includes those chemically modified such as hydroxyl group and amino group of medalmin.
  • the pharmaceutical composition (protein) to be stabilized in the present invention is a protein containing a peptide or other biopolymer, synthetic polymer compound, low-molecular compound, or derivative thereof, or a combination thereof. Any of the complexes
  • Preferred examples of the present invention include antibodies.
  • an antibody to be stabilized in the present invention a known antibody can be used, and it may be any of a full-length antibody, a fragmented antibody, a modified antibody, or a low molecular weight antibody.
  • full-length antibodies include IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgE, IgM, IgY, etc.
  • the full-length antibody also includes a bispecific IgG antibody (J Immunol Methods. 2001 Feb 1; 248 (1_2): 7_15). It is also possible to target antibodies produced by methods known to those skilled in the art using novel antigens. Specifically, for example, a novel antibody can be prepared as follows.
  • a novel antigen protein or a fragment thereof is used as a sensitizing antigen, and this is immunized according to a normal immunization method.
  • the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method.
  • monoclonal antibody-producing cells (hypridoma) are screened.
  • the antigen can be prepared according to a known method, for example, a method using baculovirus (W098 / 46777 etc.).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
  • the immunogenicity of the antigen When the immunogenicity of the antigen is low, it may be immunized by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin. After that, the cDNA of the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the mRNA of the hyperidoma using reverse transcriptase, and the resulting cDNA sequence is decoded by a known method.
  • an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • an antibody that recognizes a novel antigen a mouse antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a Hedge antibody, a human antibody, and the like that are not particularly limited as long as they bind to the novel antigen can be used as appropriate.
  • artificially modified gene recombination for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans, etc.
  • chimeric antibodies, humanized antibodies, and the like can also be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than human, for example, an antibody comprising a heavy chain of a mouse antibody, a variable region of a light chain and a heavy chain of a human antibody, a constant region of a light chain, etc., and encodes the variable region of a mouse antibody.
  • the DNA to be obtained can be obtained by ligating the DNA encoding the constant region of the human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it.
  • a humanized antibody is also called a reshaped human antibody, and a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, is used as the complementarity determining region of a human antibody. It is transplanted and its general genetic recombination technique is also known. Specifically, several DNA sequences designed to link mouse antibody CDRs and human antibody framework regions (FR) with overlapping portions at the ends are prepared. The oligonucleotide is synthesized from the oligonucleotide by PCR.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody constant region, and then incorporating it into an expression vector and introducing it into a host for production (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application). Publication number WO 96/02576).
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al, Cancer Res (1993) 53, 851-856).
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells such as U266, and the desired human antibody having activity to bind to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method.
  • Phages that bind to the antigen can be selected.
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector having the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • the antibody to be stabilized in the present invention can include a fragmented antibody or a low molecular weight antibody. These may be either known antibodies or newly prepared antibodies.
  • the fragmented antibody or low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (whole antibody such as who le IgG) is deleted and has an ability to bind to an antigen.
  • Specific examples of the antibody fragment include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv) (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)
  • the preferred low molecular weight antibody in the present invention is an antibody comprising two or more VHs and two or more VLs of an antibody, and these variable regions are bound directly or indirectly through a linker or the like.
  • the bond may be covalent or non-covalent, and may be both covalent and non-covalent.
  • Further preferred low molecular weight antibodies are those in which VH and VL are bound non-covalently. It is an antibody containing two or more VH-VL pairs formed. In this case, an antibody in which the distance force between one VH-VL pair and the other VH-VL pair in the low molecular weight antibody is shorter than the distance in the full-length antibody is preferable.
  • Examples of low molecular weight antibodies in the present invention include scFv, Diabody, or sc (Fv) 2.
  • scFv is a fragment in which a variable region and a variable region are joined by a linker or the like.
  • Diabody is a dimerization by linking two scFvs etc. (hereinafter, fragments constituting Diabody), and usually contains 2 VLs and 2 VHs.
  • the bond between the fragments constituting the diabody may be a non-covalent bond or a covalent bond, but is preferably a non-covalent bond.
  • Fragments that constitute Diabody include VL and VH combined, VL and VL combined, VH and VH combined, etc. Preferably, VH and VL are combined. is there.
  • the linker that binds the variable region to the variable region in the fragment constituting the diabody is not particularly limited, but should be short enough so that non-covalent bonding does not occur between the variable regions in the same fragment. Is preferred.
  • the length of such a linker can be appropriately determined by those skilled in the art. Usually, it is 2 to 14 amino acids, preferably 3 to 9 amino acids, particularly preferably 4 to 6 amino acids.
  • VL and VH encoded on the same fragment have a short linker between them, so no non-covalent bond occurs between VL and VH on the same chain, and no single-chain V region fragment is formed.
  • a multimerized antibody such as a trimer or tetramer by combining three or more of the fragments constituting Diabody on the same principle as in the preparation of Diabody.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which two heavy chain variable regions ([VH]) and two light chain variable regions ([VL]) are combined with a linker to form a single chain polypeptide.
  • VH heavy chain variable regions
  • VL light chain variable regions
  • sc (Fv) 2 is, for example, two scFv (single chain Fv) (Huston, J. S.
  • a peptide linker is preferred.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. Usually, 1 to 100 amino acids, preferably 5 to 30 amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids. (For example, 15 amino acids).
  • the order of the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions to be joined is not particularly limited, and may be arranged in any order.
  • sc (Fv) 2 having an arrangement of [VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL] is preferable.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or the light chain variable region may be substituted, deleted, added, and Z or inserted. Furthermore, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated with each other, as long as they have antigen binding activity, a part thereof may be deleted, or another polypeptide may be added.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • the linker that binds the variable region of the antibody may be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker such as Protein Engineering, 9 (3), 299-305. , 1996 can be used.
  • the preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30. Amino acids, especially good Preferably it is 12-18 amino acids (eg 15 amino acids).
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences. uly ber
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (Succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartaric acid Salts (sulfo 1 DST), bis [2- (succinimidoxycarbonyloxy) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoxycarbonyloxy) ethy
  • sc (Fv) 2 can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • sc (Fv) 2 can be prepared by introducing a vector containing DNA encoding sc (Fv) 2 into a host cell, expressing sc (Fv) 2, and collecting the expression product.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably retains the inserted DNA.
  • the cloning vector such as pBluescript vector (Stratagene) is used.
  • pBluescript vector Stratagene
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the sc (Fv) 2 of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses sc (Fv) 2 in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism, for example, pBEST vector for in vitro expression.
  • pET vector Invitrogen
  • pME18S_FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466- 47 2 (1988)
  • the insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 1 1.4-11.11).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing sc (Fv) 2 include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insects.
  • Examples include cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • Vector introduction into host cells can be carried out by, for example, calcium phosphate precipitation method, i £ nore sedation method (Current protocols in Molecular Biology eait. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipophectamine. It can be carried out by a known method such as a method (manufactured by GIBCO-BRL) or a microinjection method.
  • the sc (Fv) 2 is recovered when the sc (Fv) 2 of the present invention is secreted into the medium. And can be implemented. When sc (Fv) 2 is produced intracellularly, the cell is first lysed, and then the sc (Fv) 2 composition is recovered.
  • an antibody functionally equivalent to the antibody of the present invention by appropriately introducing mutations.
  • Amino acid mutations can also occur in nature.
  • an antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the antibody of the present invention and functionally equivalent to the antibody is also included in the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chains are: hydrophobic degenerate amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic degenerate amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • Amino acids with side chains C, M
  • amino acids with side chains containing carboxylic acids and amides D, N, E, Q
  • amino acids with side chains R, K, ⁇
  • aromatics examples include amino acids (H, F, Y, W) having side chains (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • the antibody used in the present invention may be a modified antibody.
  • the modified antibody may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substance, and toxin. .
  • the modified antibody may be a fusion protein of an antibody molecule, an antibody molecule fragment, an antibody-like molecule, and another protein / peptide. Fusion proteins include TNF a and Fc (Int J Clin Pract. 2005 Jan; 59 (l): 114_8.) And IL2 and scFv (J Immunol Methods. 2004 Dec; 295 (l-2 ): 49_56.), Etc.
  • the power is not particularly limited to these.
  • the antibody used in the present invention may be an antibody-like molecule.
  • antibody-like molecules include affibody (Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Mar 18; 100 (6): 3191-6) and ankyrin (Nat Biotechnol. 2004 May; 22 (5): 575_82). , Especially not limited to these.
  • the above-described antibodies can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, the DNA of the target antibody is incorporated into an expression vector. In that case, it is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. In that case, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR_Script, and the like.
  • pGEM_T pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the host may be E. coli such as JM109, DH5, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 54 4-546; FASEB J.
  • T7 promoter is essential.
  • pGEX-5X_l Pulpacia
  • QIAexpress system QIAGEN
  • pEGFP pEGFP
  • pET in this case, the host expresses T7 RNA polymerase
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electopore position method.
  • vectors for producing the polypeptide of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S (Nucleic Acids.
  • insect cell-derived expression vectors for example, ⁇ Bac-to- BAC baculovairus expression system '' (GIBCO BRL), p BacPAK8), plant-derived Expression vectors (for example, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit J ( Invitrogen), pNVll, SP-Q01), and an expression vector derived from Bacillus subtilis (eg, pPL608, pK 50).
  • GEBCO BRL Bac-derived Expression vector
  • plant-derived Expression vectors for example, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors for example, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived expression vectors for example, pZIPneo
  • yeast-derived expression vectors for example,
  • a promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 108), MMLV-LTR promoter, EF1 promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. It is even more preferable if you have a gene to do this (for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)).
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK_RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a DHFR residue that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used.
  • examples include a method of introducing a vector having a gene (eg, pCHOI) and amplifying with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • transient expression of the gene is intended, express SV40 T antigen.
  • a COS cell having the gene to be transformed on a chromosome may be used to transform with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin.
  • the expression vector is used as a selectable marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydro A folate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydro A folate reductase
  • “adding” medalmin to protein also means mixing medalmin and protein.
  • mixing medalmin and protein may be one in which protein is dissolved in a solution containing medalmin.
  • stabilize refers to maintaining a protein in a natural state or in a state of maintaining activity.
  • the stabilizer containing medamine of the present invention when the activity of the protein is higher than that in the natural state or control, or the decrease in activity due to the combination during storage is smaller. In any case, it can be considered that the protein is stabilized.
  • whether or not the activity of an antibody molecule has increased can be confirmed by measuring the target activity under the same conditions.
  • the antibody molecule that is the target of stabilization may be newly synthesized or isolated from an organism.
  • the activity is not particularly limited as long as it is a binding activity, neutralizing activity, cytotoxic activity, agonist activity, antagonist activity, enzyme activity, etc. It is preferable that the activity has a quantitative and Z or qualitative change or influence on a living body, tissue, cell, protein, DNA, RNA or the like, and particularly an agonist activity is preferred.
  • the agonist activity is an activity that induces a change in some physiological activity by binding a signal to an antigen such as a receptor so that a signal is transmitted into a cell.
  • physiological activities include proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphorylation / dephosphorylation activity, redox activity, transfer.
  • the antigen is not particularly limited, and any antigen may be used.
  • antigens include receptors, cancer antigens, MHC antigens, differentiation antigens, and the like.
  • receptors include, for example, hematopoietic factor receptor family, cytoforce-in receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine Z threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G protein coupled receptor Examples include receptors belonging to the receptor family such as family, GPI-anchored receptor family, tyrosine phosphatase-type receptor family, adhesion factor family, and hormone receptor family. Numerous references exist regarding the receptors belonging to these receptor families and their characteristics.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi Etine (TPO) receptor, human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet-derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)-, j3 receptor Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Examples include leukemia inhibitory factor (LIF) receptor and human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor (hEPOR: Simon, S.
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • TPO thrombopoi Etine
  • hG-CSFR Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.
  • -CSFR Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350 .
  • hTPOR Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644 .
  • mTPOR Skoda, RC. Et al. 1993) 12, 2645-2653 .
  • hlnsR Ullrich, A.
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also called tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous also become cancer antigens, and are particularly called cancer sugar chain antigens.
  • cancer antigens include CA19-9, CA 15-3, serial SSEA-1 (SLX), and the like.
  • MHC antigens are roughly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens, and MHC class I antigens include HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, and -H.
  • MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, and -DP.
  • CDl CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDl la, CDllb, CDl lc, CD13, CD14
  • any detection index used for measuring a change in activity can be used as long as a quantitative and / or qualitative change can be measured.
  • a cell-free (cell free assay) index a cell-based (eel-based assay) index, a tissue system index, and a biological system index can be used.
  • enzymatic reactions and quantitative and Z or qualitative changes in proteins, DNA, and RNA can be used.
  • the enzyme reaction include amino acid transfer reaction, sugar A transfer reaction, dehydration reaction, dehydrogenation reaction, substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, etc., and DNA, RNA amplification, cleavage, and extension can be used.
  • phosphorylation of a protein present downstream in the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Cell line indicators include changes in cell phenotype, such as quantitative and Z or qualitative changes in the product, changes in proliferative activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in properties, etc. Can be used. As production substances, secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like can be used. Changes in morphology include changes in protrusion formation and / or the number of protrusions, changes in flatness, changes in elongation / aspect ratio, changes in cell size, changes in internal structure, and deformities as a cell population / Uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by microscopic observation.
  • Cell motility includes cell invasion activity and cell migration activity.
  • changes in intracellular substances include enzyme activity, mRNA levels, intracellular signaling substances such as Ca 2+ and cAMP, and intracellular protein levels.
  • changes in cell proliferation activity induced by receptor stimulation can be used as an index.
  • tissue index a change in function according to the tissue used can be used as a detection index.
  • Biological indicators include tissue weight changes, blood system changes such as changes in blood cell count, protein content, enzyme activity, changes in electrolysis mass, and changes in the circulatory system such as blood pressure and heart rate. Or the like can be used.
  • the absorption spectrum can be measured by a commonly used photometer or plate reader, the emitted light can be measured by a luminometer, and the fluorescence can be measured by a fluorometer.
  • Mass is mass It can be measured using an analyzer. Radioactivity is measured using a gamma counter or other measuring device depending on the type of radiation, fluorescence polarization is measured by BEACON (Takara Shuzo), surface plasmon resonance signal is measured by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer is measured by ARVO, etc. it can.
  • a flow cytometer or the like can also be used for measurement.
  • measurement methods can be further increased by measuring two or more types of measurement simultaneously and / or continuously if it is convenient to measure two or more types of detection indices with a single measurement method. It is also possible to measure the detection index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
  • the agonist activity can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, as described in the examples, determination can be made by a method of measuring agonist activity using cell proliferation as an index. More specifically, an antibody whose agonist activity is to be measured is added to cells that exhibit agonist-dependent growth and cultured. Then, it is possible to measure the absorbance by adding a reagent that exhibits a color reaction at a specific wavelength according to the number of living cells such as WST-8, and measure the agonist activity using the obtained absorbance as an index. .
  • Cells exhibiting agonistist-dependent proliferation can also be produced by methods known to those skilled in the art.
  • an antigen is a receptor that emits a cell proliferation signal
  • the receptor is expressed.
  • Cells may be used.
  • the antigen is a receptor that does not emit a cell proliferation signal
  • a chimeric receptor consisting of an intracellular region of a receptor that emits a cell proliferation signal and an extracellular region of the receptor that does not emit a cell proliferation signal. And then expressing the chimeric receptor in cells.
  • receptors that emit cell proliferation signals include G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-kit, FLT-3, and the like.
  • Examples of cells that express the receptor include BaF3, NFS60, FDC P-1, FDCP_2, CTLL-2, DA_1, and KT_3.
  • the term "stabilizes" a protein is a state in which the association reaction of the protein is suppressed, and it suppresses an increase in protein aggregates that occur during storage, and Z Alternatively, the increase in insoluble aggregates (precipitates) of the protein that occurs during storage is suppressed and / or the function of the protein is retained. Suppresses the increase of aggregates.
  • the present invention relates to a method for suppressing protein association, comprising the step of adding medalmin, which is one of the amino sugars, to a protein. More specifically, the present invention relates to a method for suppressing the association of antibody molecules, comprising the step of adding medalmin to antibody molecules.
  • association means that proteins (antibody molecules) associate irreversibly or reversibly to form multimers of two or more antibody molecules. Whether or not the association is suppressed can be determined by methods known to those skilled in the art, for example, sedimentation equilibrium method (ultracentrifugation method), osmotic pressure method, light scattering method, low angle laser light scattering method, X-ray small angle scattering method, neutron small angle. It can be carried out by measuring the content of antibody molecules in association with a scattering method or a gel filtration method. By adding meglumine, it can be interpreted that the association was suppressed when the content of the antibody aggregate during storage decreased.
  • “stabilize antibody molecules” means to stabilize antibody molecules contained in a solution antibody preparation, a lyophilized antibody preparation, or a spray-dried preparation regardless of the concentration or state of the antibody. Also good. Alternatively, it may stabilize antibody molecules stored for a long time at a low temperature or at a normal temperature.
  • low-temperature storage includes storage at 80 ° C. to 10 ° C. as an example, and frozen storage is also included in the storage form. As a preferable example of the low temperature, a force capable of giving -20 ° C or 5 ° C is not limited to this temperature.
  • the term “room temperature storage” includes storage at 15 ° C. to 30 ° C. as an example. A preferred example at room temperature is 25 ° C, but it is not limited to this temperature.
  • Solution formulation can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • non-patent literature J.
  • Lyophilization can be performed by methods well known to those skilled in the art (Pharm. Biotechnol, 2002, 13, 109-33, Int. J. Pharm. 2000, 203 (1-2), G 60, Pharm. Res. 1997, 14 (8), 969-75). For example, dispense an appropriate amount of the solution into a container such as a vial used for lyophilization, and store it in a freezer or This can be done in a lyophilizer or by immersing in a refrigerant such as acetone / dry ice or liquid nitrogen.
  • a refrigerant such as acetone / dry ice or liquid nitrogen.
  • spray-dry formulation can be performed by methods well known to those skilled in the art (J. Pharm.
  • Solution formulation and lyophilization can be carried out by the methods described in the Examples, but are not limited thereto.
  • the present invention relates to an agent for stabilizing a protein or an agent for suppressing protein association, which contains medalmin, which is one of the amino sugars. More specifically, the present invention relates to a drug containing meglumine that stabilizes antibody molecules or a drug that suppresses association of antibody molecules.
  • the present invention also relates to an agent that stabilizes an antibody molecule containing medalmin, or an agent that stabilizes an antibody molecule contained in a lyophilized antibody preparation.
  • a pharmaceutical acceptable carrier such as a preservative and a stabilizer may be added to the drug.
  • “Pharmaceutically acceptable” may be a material that itself has a stabilizing effect on the above protein, or a material that does not have a stabilizing effect, and can be administered together with the above drug. It means a pharmaceutically acceptable material. Further, even a material that does not have a stabilizing action may be a material that has a synergistic or additive stabilizing effect when used in combination with medalmin.
  • Examples of the materials acceptable for the preparation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monomylate and glycerin monostearate; Polyglyceryl fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate and decaglyceryl monolinoleate; Polyoxyethylene sorbitan monolaurate , Polyoxyethylene Sonor Vitan Monoole , Polyoxyethylene sorbitan monostearate, Poriokishechi Polyoxyethylene
  • Oxyethylene glycerin fatty acid ester such as polyethylene glycol distearate; polyoxyethylene alkyl ether such as polyoxyethylene lauryl ether; polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene propyl ether, polyoxyethylene Polyoxyethylene polyoxyp such as polyoxypropylene cetyl ether Pyrene alkyl ethers; Polyoxyethylene alkyl phenyl ethers such as polyoxyethylenol phenyl ether; Polyoxyethylene hydrogenated castor oils such as polyoxyethylene castor oil and polyoxyethylene hydrogenated castor oil (polyoxyethylene hydrogen castor oil) Polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene sorbite beeswax; polyoxyethylene lanolin derivatives such as polyoxyethylene lanolin; polyoxyethylene fatty acid amides such as polyoxyethylene stearamide; those having HLB 6 to 18: etc. As a typical example.
  • the surfactant also include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetinole sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate, etc .; polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium lauryl sulfate; alkyl groups such as ester sodium lauryl sulfosuccinate Alkylsulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 carbon atoms; natural surfactants such as lecithin, glyce mouth phospholipids; fingophospholipids such as sphingomyelin; 12 to 18 fatty acid shorts Typical examples include sugar fatty acid esters.
  • surfactants can be added to the preparation of the present invention.
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, Sonoret 20 & 80 power S Especially preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycols such as poloxamers (such as Pull Knick F-68 (registered trademark)).
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used. In the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mgZmL, preferably 0.003 to 50 mg / mL. More preferably, it is 0.005 to 2 mg / mL.
  • buffer phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, darconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicy
  • organic acids such as formic acid, triethanolamine, fumaric acid, etc., or carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like can be mentioned.
  • the solution preparation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution preparation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to:! OOmM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the drug of the present invention contains other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin and gelatin immunoglobulin, sugars such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols. It ’s okay.
  • the amino acid is a basic amino acid such as arginine, lysine, histidine, ornithine, or an inorganic salt of these amino acids (preferably hydrochloride, phosphate salt form, that is, phosphate amino acid).
  • the preferred pH value is a suitable physiologically acceptable buffer substance, such as an inorganic acid, especially a salt of hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, oxalic acid or salts thereof. It is adjusted by.
  • the use of phosphate is particularly advantageous in that a stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and their salts (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine , Valine, methionine, cysteine, or alanine, or an aromatic amino acid such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can also be used.
  • neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine , Valine, methionine, cysteine, or alanine
  • an aromatic amino acid such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sonorebitole, inositol and the like.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • an appropriate solubilizing agent such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) etc. may be used in combination.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and the like.
  • examples thereof include salts, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having from 7 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutyl hydroxide, butinorehydroxyanisole, hitocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate,
  • examples of chelating agents such as L-ascorbic acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate. I can do it.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid], etc.
  • colloid drug delivery system Ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, nanopower psenore, etc. (see Remingtons Pharmaceutical Science 1 edition, Oslo Ed., 1980, etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al, Biopolymers 1983, 22: 547-556? 133,988).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody molecule stabilized by medalmin, one of the amino sugars.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing an antibody molecule whose association is suppressed by medalmin, one of the amino sugars.
  • the present invention relates to a kit comprising the pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition and kit of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable material in addition to the above-described stabilized antibody molecule.
  • a pharmaceutically acceptable material in addition to the above-described stabilized antibody molecule. Examples of materials acceptable for pharmaceutical preparations include those described above.
  • the form (dosage form) of the pharmaceutical composition of the present invention includes, but is not limited to, an injection form, a lyophilized form, a solution form, or a spray-dried form.
  • the formulations of the present invention can be supplied in containers of a defined volume, such as normally sealed, sterilized plastic or glass vials, ampules, syringes, and large volume containers such as bottles. . From the viewpoint of convenience of use, a prefilled syringe is preferred.
  • parenteral administration for example, injection administration.
  • injection administration it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage for example, protein, peptide, and antibody can be selected in the range of O.OOOlmg to lOOOmg per kg of body weight at a time.
  • the dose can be selected within the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the present invention is not limited to these doses and administration methods.
  • Low molecular weight For compounds, the amount of active ingredient for adults is in the range of 0.1 to 2000 mg per day. However, the present invention is not limited to these dosages and administration methods.
  • the freeze-dried preparation or spray-dried preparation of the present invention can be made into a solution preparation before use.
  • the present invention also provides a kit comprising the lyophilized formulation or spray-dried formulation of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not limited as long as it can form a lyophilized preparation or spray-dried preparation of the present invention as a solution preparation, but is not limited in terms of the type of carrier, the presence or absence of combination, and the like.
  • the present invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition containing an antibody molecule, comprising the step of adding medalmin to the antibody and stabilizing the antibody molecule. Further, the present invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition containing an antibody molecule, comprising a step of adding medalmin to an antibody and suppressing association of the antibody molecule. The present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition containing an antibody molecule, comprising (1) a step of adding medalmin to an antibody, and (2) a step of forming a mixture of (1) into a solution formulation. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition containing an antibody molecule, comprising the steps of (1) adding medalmin to an antibody, and (2) lyophilizing the mixture of (1).
  • Solution formulation and lyophilization can be performed by the methods described above. All prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Medamine 20 mM sodium quenate, pH 6.5, 10% megnolemin
  • the monomer residual rate was measured using SEC (Size Exclusion Chromatography) at 55 ° C-3 days and 6 days later (the monomer residual rate is the initial state). % Of the monomer peak area of the thermally accelerated sample relative to the monomer peak area of The analysis conditions of SEC are shown below.
  • Fig. 1 shows the results of SEC analysis.
  • Figure 1 shows initial, 55 ° C_3 days after the above solution conditions,
  • mVB22B 28 ug / mL, measured at 40 ° C_1 week and 2 weeks later.
  • 2D7 59 ug / mL, measured after 40 ° C_1 week and after 2 weeks.
  • IgG 6.84 mg / mL, measured after 60 ° C_1 weeks and 3 weeks later.
  • Fig. 2 shows changes with time of aggregates under the above-mentioned solution acceleration conditions.
  • the formation of aggregates was suppressed by meloamine-added calodium in any molecular form, not limited to sc (Fv) 2 and IgG. From the above results, it was revealed that the addition of medamine has the effect of suppressing the association not only in sc (Fv) 2 but also in the whole antibody molecule such as IgG of full-length antibody.
  • Medamine has been reported as a stabilizer for antibody molecules for the first time in this study, which has never been reported as a stabilizer for antibody molecules.
  • Sample 1 IgG 80 mg / via U sucrose 100 mg / vial, polysorbate 80 1 mg / vial, sodium phosphate 30 ⁇ mol / via pH6.0
  • Sample 2 IgG 80 mg / via U sucrose 70 mg / vial, polysorbate 80 1 mg / vial, sodium phosphate salt 30 ⁇ mol / via pH6.0
  • Sample 4 IgG 80 mg / via U megnoremine 55 mg / via polysorbate 80 1 mg / vial, sodium phosphate 30 ⁇ mol / via U pH 6.0
  • Sample 5 IgG 80 mg / via U megnoremine 40 mg / via polysorbate 80 1 mg / vial, sodium phosphate 30 ⁇ mol / via U pH 6.0
  • each vial was filled with 2 mL of the pre-lyophilized solution prepared so that the IgG concentration was 40 mg / mL, and the following was performed using a shelf-type lyophilizer. It was prepared by lyophilization consisting of the following conditions.
  • the solution preparation of the above sample was prepared by adding 0.6 mL of injection water per vial of the lyophilized preparation. At this time, the IgG concentration is about 120 mg / mL.
  • Freeze-dried preparation 40 ° C—Measured using a sample stored for 1 month.
  • Solution formulation 25 ° C—measured on samples stored for 2 weeks.
  • pH 7.0 phosphate buffer PH 7.0 50 mmol / L phosphate buffer containing 300 mmol / L sodium chloride and 0.05% sodium azide
  • Figure 3 shows the comparison of sucrose and medalmin on the aggregate content before and after lyophilization (pre-lyophilized solution and lyophilized formulation), and the lyophilized formulation was prepared and accelerated at 40 ° C for 1 month.
  • a comparison of sucrose and medalmin on the aggregate content after the test, and a comparison of sucrose and medalmin on the aggregate content after an accelerated test at 25 ° C for 2 weeks in the solution formulation are shown.
  • medalmine had a lower aggregate content than sucrose. From this, we found that medalmin has a greater stabilizing effect on the formation of aggregates than sucrose. In addition, the stabilizing effect was dependent on the concentration of medalmin, and the higher the medalmin concentration, the higher the stabilizing effect. That is, by adding medamine to the drying stress of the antibody in the lyophilization process, it was possible to suppress the increase in aggregates due to lyophilization in a concentration-dependent manner. In addition, the association of freeze-dried preparations after storage at 40 ° C for 1 month could be similarly suppressed. In addition, the solution formulation with a concentration of about 120 mg / mL was similarly able to suppress association by storage at 25 ° C_2 weeks. It was also found that medamine has a higher stabilizing effect than sucrose, even in such high-concentration solution formulations exceeding lOOmg / mL, whether in solution or lyophilized. .
  • hVB22B u2-wz4 was expressed by the method shown in Reference Examples:! to 3, WO2005 / 056603 or WO2005 / 0566 04 of the present invention, and single chain diabody type sc (Fv) 2 was purified. Prepared the following solution conditions (Fl and F2) using purified s ingle chain diabody type sc (Fv) 2 did.
  • Fig. 4 shows the aggregate content of the sample before storage and the sample after 20 ° C '6 months analyzed by SEC.
  • the increase in aggregates at _20 ° C '6 Ryugoku increased by 4.8% in F1 without medalmin, whereas the increase in aggregates in F2 with medalmin as a stabilizer. It was possible to suppress to 0.4%.
  • medamine has an action to stabilize proteins even in a frozen state.
  • Formulations having the following solution conditions were prepared using the purified humanized bispecific antibody hA69-KQ I hB26-PF I hAL-AQ.
  • hA69_KQ / hB26-PF I hAL-AQ is a humanized bispecific antibody that is an IgG4 type antibody.
  • AF1 20 mM histidine — HC1, 50 mM NaCl, pH 5.8, 120 mg / mL hA69_KQ / hB26-PF I hAL-AQ
  • AF2 20 mM histidine — HC1, 50 mM NaCl, 200 mM megnoremin, H5.8, 120 mg / mL hA 69-KQ / hB26-PF I hAL-AQ
  • AF3 20 mM histidine—HC1, 50 mM NaCl, 200 mM arginine—HC1, pH5.8, 120 mg / mL hA69-KQ / hB26-PF I hAL-AQ
  • Fig. 5 shows the aggregate content of the sample before storage and the sample after 2 months at 25 ° C analyzed by SEC.
  • the increase in aggregates at 25 ° C in '6 months showed an increase of 0.51% aggregates in AF1, which did not contain a stabilizer, whereas in AF2, which contained medamine as a stabilizer, AF1 increased.
  • the increase can be suppressed to 0.26%, and in AF 3 containing arginine as a stabilizer, the increase in aggregates was 0.27%, so medamine has a stabilizing effect equal to or higher than that of arginine. It was shown that.
  • Example 3 it was shown that medamine has a stabilizing effect even in a high concentration humanized bispecific antibody hA69_KQ / hB26_PF I hAL-AQ solution consisting of 120 mg / mL. It was done. Also Since megnoremin has been shown to have a stabilizing effect not only in IgG and sc (Fv) 2, but also in bispedfic IgG, it can be widely used as a protein stabilizer.
  • reference examples of the method for producing the sc (Fv) 2 antibody (hVB22B, mVB22B, 2D7) of the present invention are illustrated, but the present invention is not limited to these reference examples.
  • Kojiki monkey Mpl cDNA (SEQ ID NO: 7) was cloned from the total RNA extracted from Kikisei monkey bone marrow cell force using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). The resulting force quizal cDNA was inserted into pCOS2 to construct pCOS2-monkeyMplilill.
  • mouse Mpl cDNA (GenBank # NM_010823) was amplified by PCR, inserted into pCOS2, and pCOS2-mouseMilliill was constructed.
  • Each vector was prepared (20 mu g) was mixed with BaF3 cells suspended in PBS (lxl0 7 cells / mL) , was added to the Gene Pulser cuvette, using Gene Pulser II (manufactured by Bio-Rad) A pulse was applied with a capacity of 0.33 kV and 950 ⁇ FD.
  • Ba F3 cells transfected with Elect Mouth poration were treated with Ing / mL mouse interleukin 3 (hereinafter, mIL-3, manufactured by P-mark rotech), 500 ⁇ g / m L Geneticin Gnvitrogen, 10% FBS (Invitrogen)
  • mIL-3 mouse interleukin 3
  • FBS Invitrogen
  • human Mpl-expressing BaF3 cell line hereinafter BaF3_human Mpl
  • monkey Mpl-expressing BaF3 cell line hereinafter BaF3_monkey Mpl
  • mouse Mpl-expressing BaF3 cell line Hereafter, BaF3-mouse Mpl
  • an expression vector pCXND3 was prepared by inserting a DHFR gene expression site of pCHOI into the Hindlll site of pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-199).
  • pCOS2_hMplfull, pCOS2-monkeyMplfill and pCOS2-mouseMplflill in a saddle shape, and each Mpl gene amplified by PCR using a primer containing His-tag sequence was cloned into pCXND3, and pCXND3-hMp ⁇ His, pCXND3-monkey Mp ⁇ His and pCXND3- mouse Mp to His were constructed.
  • Each vector was prepared (25 mu g) was mixed with CHO-DG44 cells (lxl0 7 cells / mL) suspended into PBS, added to the Gene Pulser cuvette, Gene Pulser II (manufactured by Bio-Rad) A pulse was applied with a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • Human Mpl-expressing CHO cells are selected by adding CHO cells that have been transfected by electoporation with CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 500 ⁇ g / mL Geneticin, lxHT (Invitrogen).
  • CHO-human Mpl monkey Mpl-expressing CHO cell line
  • CHO-mouse Mpl mouse Mpl-expressing CHO cell line
  • a gene with a FLAG tag added downstream of the extracellular region of human Mpl (Gln26 to Trp491) was prepared, inserted into the Pstl-Smal site of pBACSurf-1 Transfer Plasmid (Novagen), and pB ACSurfl-hMptoFLAG was made. Subsequently, 4 ⁇ g of pBACSurfl_hMptoFLAG was introduced into Sf9 cells using Bac-N-Blue Transfection Kit (Invitrogen). After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the recombinant virus was isolated by plaque assay. After the virus stock was prepared, it was infected with Sf9 cells and the culture supernatant was collected.
  • Soluble human Mpl protein was purified as follows using the obtained culture supernatant.
  • the culture supernatant was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) and then dissolved in 5 OmM Na-Phosphate Buffer, 0.01% (v / v) Tween20, 500 mM NaCl (pH 7.2). I put it out.
  • the eluate was adsorbed on FLAG M2-Agarose (manufactured by SIGMA-ALDRICH), and then eluted with 1 OOmM Glycine-HCl, 0.01% (v / v) Tween20 (H 3.5).
  • the human MpHgG Fc fusion protein gene was prepared according to the method of Bennett et al. (Bennett et al., J. Biol. Chem. 1991; 266: 23060-23067).
  • the base sequence encoding the extracellular region of human Mpl (from Gln26 toumblen 49 1) is linked to the base sequence encoding the Fc region of HgG- ⁇ 1 (the region downstream from Asp216), and the Fusion Linker at the junction
  • the BstEII sequence (amino acid Va ⁇ Thr) was added as
  • the signal sequence used was 19 amino acids of the signal peptide of the HgG H chain variable region.
  • the resulting human MpHgG Fc fusion protein gene was cloned into pCXND3 to construct pCXND3_hMp ⁇ Fc.
  • [0104] generated vector of (25 mu g) were combined mixed in CHO-DG44 cells suspended in PBS (lxl0 7 cells / mL) , was added to the Gene Pulser cuvette, Gene Pulser II (manufactured by Bio-Rad) The pulse was applied with a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • CHO cells that had been transfected by electoporation treatment were selected by adding to CHO-S-SFMII medium containing 500 ⁇ g / mL Geneticin and ⁇ to establish a shMPL_Fc-expressing CHO cell line (CHO_hMp ⁇ Fc).
  • human MpHgG Fc fusion protein was purified as follows.
  • the culture supernatant was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) and then dissolved with 50 mM Na-Phosphate Buffer, 0.01% (v / v) Tween20, 1M NaCl (pH 7.6). did.
  • the eluate was adsorbed on a HiTrap proteinG HP column (manufactured by Amersham Biosciences) and then eluted with 0.1 M Glycine-HCl, 150 mM NaCl, 0.01% (v / v) Tween20 (pH 2.7).
  • hMpMFc The purified soluble Mpl protein is called hMpMFc.
  • MRL / MpJUmmCrj—lpr / lpr mice purchased from Nihon Chayores Riba.
  • Freund's complete adjuvant H37 Ra, manufactured by Betaton Dickinson was added to 100 zg / animal shMPL-FLAG, and an emulsion was administered subcutaneously.
  • Antibody concentration was determined by conducting mouse IgG sandwich ELISA using goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED) and alkaline phosphatase-goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED). A standard curve was prepared using GraphPad Prism (GraphPad Software, USA) as a standard, and the antibody concentration was converted.
  • the antibody isotype was determined by antigen-dependent ELISA using an isotype-specific secondary antibody.
  • hMp ⁇ Fc to 1 ⁇ g / mL coating buffer (O.lmM NaHCO (pH 9.
  • Diluent buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.1), ImM MgCl, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Twee
  • the binding activity to shMp ⁇ FLAG and hMPL-Fc was evaluated by ELISA.
  • the purified shMp-to-FLAG and hMPL-Fc were coated at 1 ⁇ g / mL and subjected to blocking treatment with a diluent buffer.
  • the culture supernatant of hyperidoma was collected and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then an anti-mouse IgG antibody labeled with Alkaline Phosphatase (manufactured by Zymed) was added, and color development was performed in the same manner as described above. After color development for 1 hour at room temperature, the absorbance at 405 nm was measured, and the EC value was calculated using GraphPad Prism.
  • CHO-human Mp and CHO-monkey Mpl were collected and suspended in FA CS Buffer (1% FBS / PBS) so as to be lxl0 6 cells / mL.
  • the solution was dispensed into Multiscreen (Millipore) at 100 ⁇ L / well, and the culture supernatant was removed by centrifugation.
  • the culture supernatant diluted to 5 xg / mL was added and reacted on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed once with FACS buffer, FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Beckman Coulter) was added, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes.
  • the agonist activity of the antibody was evaluated using BaF3-human Mp or BaF3_monkey Mpl showing TPO-dependent proliferation.
  • Each cell was suspended in RPMI1640 (manufactured by Invitrogen) containing 10% Fetal Bovine Serum Gnvitrogen) at 4xl0 5 cells / mL, and dispensed into a 96-well plate at 60 ⁇ L / we11.
  • the concentrations of rhTPO (manufactured by R & D) and hypridoma culture supernatant were varied, and 40 ⁇ L of each well was cultured and cultured at 37 ° C., 5% CO for 24 hours. 10 ⁇ L / well
  • TA136 was established from BaF3_human Mpl immunized mice, and the other antibodies were established from shMp ⁇ Flag immunized mice.
  • the anti-human Mpl antibody was purified as follows using the culture supernatants of the wild and hybridomas.
  • the culture supernatant was adsorbed on a HiTrap proteinG HP column (Amersham Biosciences) and then eluted with 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7). Immediately after elution, the solution was immediately neutralized with 1M Tris-Cl (pH 9.0) and dialyzed overnight with PBS to replace the buffer.
  • Anti-human Mpl antibody VB22B force Utilizing the properties that can be used for Western blotting, we constructed a fusion protein of human Mpl partial sequence and GST, and analyzed VB22B epitope.
  • the plasmid DNA is introduced into DH5a to obtain a transformant, and the expression of GST fusion protein is induced by immobilizing IPTG so that it becomes ImM in the transformant in the logarithmic growth phase. The body was recovered.
  • fusion proteins of MG3 (Gln26 force is also Alal89), MG4 (Gln26 to Prol06), MG5 (Gln26 to Glu259), MG6 (Gln26 to Gly245) and GST were prepared, and Western blotting was performed in the same manner.
  • VB22B did not recognize MG5 and MG4, which recognized MG5 and MG6, the epitope of VB22B was expected to exist around Alal89 to Gly245.
  • the fusion protein of MG7 (Gln26 to Ala231), MG8 (Gln26 to Pro217) and GST was prepared and evaluated.
  • VB22B recognized MG7, and MG8 did not recognize. Force was also shown to be present around Ala231. Furthermore, since the binding of MG10 (Gln213 to Ala231) and the GST fusion protein was confirmed, VB22B epitope Gln213 was also limited to 19 amino acids of Ala231.
  • the kinetic analysis of the antigen-antibody reaction between the human MpHgG Fc fusion protein and VB22B IgG shown in Example 1.4 was performed using the property that the anti-human Mpl antibody VB22B binds to soluble recombinant Mpl.
  • Sensor Chip CM5 (Biacore) was set in Biacore 2000 (Biacore), and human MpHgG Fc fusion protein was immobilized by the amine coupling method.
  • prepare 1.25-20 ⁇ g / mL VB22B IgG using HBS-EP BuffeKBiacore) add VB 22B IgG for 2 minutes to obtain the binding region, and then add HBS-EP Buffer.
  • the dissociation region was obtained by adding for 2 minutes.
  • VB22 B IgG bound to the human MpHgG Fc fusion protein on the Sensor Chip was removed by adding 10 mM NaOH for 15 seconds to regenerate the Sensor Chip.
  • HBS-EP Buffer was used as a running buffer, and the flow rate was 20 ⁇ L / min.
  • reaction rate constants were calculated from sensorgrams obtained at each concentration.
  • the dissociation constant of VB22B IgG (KD) was 1.67 ⁇ 0.713 X 10- 9 M.
  • a single-chain antibody expression system was constructed using genetic engineering techniques for 23 types of antibodies that had high binding and agonist activity.
  • An example of producing a single chain antibody of anti-human Mpl antibody VB22B is shown below.
  • RNA extracted from the hybridoma producing the anti-human Mpl antibody was amplified by RT-PCR.
  • Total RNA was extracted from hyprideoma of lxlO 7 cells using RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN).
  • composition of the PCR reaction solution (50 / i L) is shown below. 5 ⁇ L of 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the PCR product was purified by agarose gel force using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) and then cloned into pGEM-T Easy vector (Promega). Furthermore, the base sequence was determined using ABI 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer).
  • VB22B-VH The nucleotide sequence of the cloned VB22B heavy chain variable region (hereinafter VB22B-VH) is SEQ ID NO: 10, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region (hereinafter VB22B-VL) nucleotide sequence.
  • SEQ ID NO: 12 the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 13.
  • VB22B Diabody single chain Fv (hereinafter referred to as VB22B Diabody) using a linker sequence consisting of 5 amino acids is the 3 ′ end of the gene encoding VB22B-VH and 5 of the gene encoding VB22B-VL.
  • 'Linker consisting of (Gly Ser) force at the end
  • VB22B-VH forward primer 70 '115HF (SEQ ID NO: 14) was designed to have an EcoRI site, and VB22B-VH rear primer 33' 115HR (SEQ ID NO: 15) was A linker that hybridizes to the DNA encoding the C terminus and has (Gly Ser) power And a base sequence that hybridizes to DNA encoding the N-terminus of VB22B-VL.
  • the VB22B-VL forward primer 33-115LF (SEQ ID NO: 16) contains a base sequence encoding the N-terminus of VB22B-VL and a (Gly Ser) sequence.
  • Base sequence 1J encoding the linker was designed to have a base sequence encoding the C-terminus of VB22B-VH.
  • the rear primer 33'115LR (SEQ ID NO: 17) of VB22B-VL hybridizes to the DNA encoding the C-terminus of VB22B-VL, and the nucleotide sequence encodes the FLAG tag (AspTyrLysAspAsp A spAspLysZ SEQ ID NO: 18). And have a Notl site.
  • composition of the PCR reaction solution (50 / i L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the composition of the PCR reaction solution (50 / i L) is shown below. 5 z L (D10 X PCR Buffer,
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • PCR product was purified from agarose gel using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) and restriction enzyme Notl (Takara Shuzo). Then, it was purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) and cloned into pCXND3 to prepare pCXND3-VB22B db.
  • the 3 'end of the gene encoding VB22B-VH and the 5' end of the gene encoding VB22B-VL have a base sequence encoding a 15-amino acid linker (Gly Ser) attached to the gene.
  • Gly Ser 15-amino acid linker
  • VB22B-VH forward primer VB22B-fpvu (Primer A, SEQ ID NO: 19) has an EcoRI site at the 5 'end, and was designed so that Gln22 and Leu23 of VB22B db are converted to PvuII sites.
  • the rear primer sc_rL15 (primer B, SEQ ID NO: 20) of VB22B-VH hybridizes to the DNA encoding the C-terminal end of VB22B-VH and encodes a linker that consists of (Gly Ser) force. It was designed to have a base sequence and a base sequence that hybridizes to DNA encoding the N-terminus of VB22B-VL.
  • the VB22B-VL forward primer sc_fL15 (Primer C, SEQ ID NO: 21) has the nucleotide sequence encoding the N-terminus of VB22B-VL as well as the (Gly Ser) force.
  • composition of the PCR reaction solution (50 / i L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • PCR product was purified from agarose gel using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), and then digested with restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) and restriction enzyme Notl (Takara Shuzo). Then, it was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and cloned into pBacPAK9 (manufactured by CLONTECH) to prepare pBacPAK9_scVB22B.
  • QIAquick PCR Purification Kit manufactured by QIAGEN
  • pBacPAK9 manufactured by CLONTECH
  • Two new primers were designed and this fragment was generated using PCR.
  • the front primer Fv2-f (primer E, SEQ ID NO: 22) of the target fragment was designed to have a Pvull site at the 5 ′ end and a sequence on the 5 ′ end side of VB22B-VH.
  • the rear primer Fv2-r (primer F, SEQ ID NO: 23) of the target fragment hybridizes to the DNA encoding the C-terminus of VB22B-VL and also has a (Gly Ser) power.
  • pBacPAK9_scVB22B was made into a saddle type and PCR was performed as follows.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below.
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • a cell line stably expressing a single-chain antibody using CHO-DG44 cells was prepared as follows. Genes were introduced by the electopore position method using Gene Pulserll (manufactured by BioRad). A mixture of the expression vector (25 ⁇ g) and 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then 1.5 kV, 25 A pulse was given with a capacity of ⁇ FD. After a 10-minute recovery period at room temperature, the electrovoked cells were selected and expressed in CHO-SS FMII medium (Invitrogen) containing 500 ⁇ g / mL Geneticin (Invitrogen). A CHO cell line was established. VB22B sc For (Fv) 2, a stable expression cell line and its culture supernatant were prepared by this method.
  • Gene Pulserll manufactured by BioRad.
  • Transient expression of single chain antibodies using COS7 cells was performed as follows. A mixture of the expression vector (10 ⁇ g) and 0.75 mL of C0S7 cells (1 X 10 7 cells / mL) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then 1.5 kV, 25 A pulse was given with a capacity of ⁇ FD. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electoporation were transferred to DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS, cultured in sputum, washed with PBS, and then washed with CHO-S. -SFMII medium was added and cultured for about 3 days. VB22B Diabody prepared the culture supernatant by this method.
  • DMEM medium Invitrogen
  • the concentration of the anti-human Mpl-chain antibody transiently expressed in COS cells in the culture supernatant was measured using surface plasmon resonance. That is, Sensor Chip CM5 (Biacore) was set on Biacore 2000 (Biacore) and ⁇ -FLAG M2 Monoclonal Antibody (SIGMA-A LDRICH) was bound. An appropriate concentration of sample was flowed at a flow rate of 5 mL / sec, and 50 mM jetylamine was flowed to dissociate the bound antibody. The change in mass when the sample was flowed was measured, and the concentration was calculated using a calibration curve created based on the change in mass of the standard product.
  • the standard for Diabody used dbl2E10 (see WO02 / 33073, WO02 / 33072), and the standard for sc (Fv) 2 used 12E10 sc (Fv) 2 having the same gene structure.
  • Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIG MA-ALDRICH) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, culture supernatant of VB22B Diabody expressing C0S7 cells or CH0 cells
  • the column was adsorbed and eluted with 100 mM Glycine-HCl (pH 3.5).
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0) and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (Amersham-Bioscience) column.
  • PBS 0.01% Tween 20 was used as a buffer for gel filtration chromatography.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0), and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg column.
  • As a buffer for gel filtration chromatography 20 mM acetate buffer (pH 6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • confirmation of Diabody and sc (Fv) 2 was performed using Western Blotting using SDS-PAGE and anti-Flag antibody (SIGMA-ALDLICH).
  • SIGMA-ALDLICH anti-Flag antibody
  • CHO-human Mpl, CHO-monkey Mpl, and CHO_mouse Mpl were collected and suspended in FACS Buffer (1% FBS / PBS) so that lxl0 6 cells / mU.
  • FACS Buffer 1% FBS / PBS
  • the solution was dispensed into Multiscreen-HV Filter Plates (manufactured by Millipore) at 100 ⁇ L / well, and the supernatant was removed by centrifugation. Appropriate concentration of Diabody or sc (Fv) 2 was added and reacted on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed once with 200 ⁇ L of FACS buffer, 10 ⁇ g / mL of ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was added, and reacted on ice for 30 minutes.
  • FITC-labeled anti-mouse IgG antibody Bee kman Coulter
  • FACS Buffer 400 ⁇ LJ was suspended.
  • EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter) was used for flow cytometry. A gate was set on the live cell population in a histogram of forward scatter and side scatter.
  • Humanized antibodies were prepared by grafting complementary antigen determining regions (hereinafter CDR) into the framework regions (hereinafter FR) of these antibodies.
  • CDR complementary antigen determining regions
  • FR framework regions
  • Humanized antibody sc (Fv) 2 was expressed in CHO-DG44 cells, and the agonist activity using BaF3-human Mpl was evaluated. Using the agonist activity as an indicator, amino acid substitutions were included in the FR, and humanized VB22B sc (Fv) 2 having an agonist activity equivalent to that of mouse-type VB22B sc (Fv) 2 was prepared.
  • sc (Fv) 2 was prepared in the same manner as in Example 2.3, cloned into the expression vector pCXND3, and each expression vector PCXND3-hVB22B containing humanized VB22B sc (Fv) 2 pz sc (Fv) 2, pCXND3-hVB22B g- e sc (Fv) 2, pCXND3-hVB22B e sc (Fv) 2, pCXND3_hVB22B u2— wz4 sc (Fv) 2, pCXND3_hVB 22B q-wz5 sc (Fv) 2 Produced.
  • the nucleotide sequence of hVB22B pz sc (Fv) 2 contained in this plasmid is SEQ ID NO: 24, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 25, and the nucleotide sequence of hVB22B g_e sc (Fv) 2 is SEQ ID NO: 26.
  • the sequence is SEQ ID NO: 27, the base sequence of hVB22B e sc (Fv) 2 is SEQ ID NO: 28, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 29, and the base sequence of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 is SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1
  • the base sequence of hVB22B q_wz5 sc (Fv) 2 is shown in SEQ ID NO: 31
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 32.
  • the base sequence of mouse-type V B22B sc (Fv) 2 is shown in SEQ ID NO: 33, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Humanized VB22B sc (Fv) 2-expressing CHO cell culture supernatant was loaded onto a column immobilized with MG10-GST fusion protein equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80, and humanized.
  • VB22B sc (Fv) 2 was adsorbed and eluted with lOOmM Glycine-HCl (pH 3.5), 0.01% Tween80.
  • the elution fraction was immediately neutralized with 1M Tris_HCl (pH 7.4), and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences).
  • As the buffer for gel filtration chromatography 20 mM citrate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.01% Tween 80 was used.
  • cells against myeloma cells can be obtained by modifying the antibody 2D7 monoclonal antibody against HLA class I into a small molecule antibody (2D7 diabody) in which the heavy and light chain variable regions are connected by a 5-mer linker.
  • 2D7 diabody small molecule antibody
  • death-inducing activity has increased dramatically. Therefore, this 2D7diabody was modified to sc (Fv) 2 type, which is considered to be structurally more stable, and the cell death inducing activity was compared with that of the conventional diabody (HL5).
  • each of the 2D7 antibody heavy chain variable region sequence (VH), light chain variable region sequence (VL), and VH-VL-VH-VL are arranged in a 15mer linker (GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySer)
  • a DNA expression vector encoding 2D7 sc (Fv) 2 connected in step 1 was prepared by the following procedure.
  • a 2D7diabody (HL5) expression vector was used as a saddle, PCR reaction was performed with primer 2D7PA6 (SEQ ID NO: 38) and primer 2D7PA2 (SEQ ID NO: 35), and fragment C was amplified. did. Similarly, PCR was performed with primer 2D7PA3 (SEQ ID NO: 36) and primer 2D7DBL2 (SEQ ID NO: 39) to amplify fragment D. Fragment C and fragment D obtained here were mixed in the same tube, and the two fragments were ligated by PCR-recombination reaction. By this operation, a DNA fragment “2D7diabodyHL15_2” in which VH-VL was linked by a 15-mer linker and contained a Flag-tag region at the C-terminus was obtained.
  • the two DNA fragments obtained by the above reaction ie, the "2D7diabodyHL15_ 'DNA fragment and the" 2D7diabodyHL15_2 "DNA fragment, were digested with EcoRI_BamHI and BamH to Notl, respectively, and both DNA fragments were preliminarily stored in EcoR.
  • the insert DNA was inserted into the expression vector PCXND3 that had been cleaved and cleaved, and the nucleotide sequence of the insert DNA was analyzed, and the cDNA encoding signa ⁇ VH (15) VL (15) VH (15) VL_Flag was analyzed as desired.
  • DG44 cells cultured in CHO-S-SFM- ⁇ medium were washed twice with ice-cold PBS and then suspended in PBS to 1 ⁇ 10 ml. This was mixed with 20 ⁇ g of the above plasmid, and an electric pulse (1.5 KV, 25 ⁇ FD) was given. Cells were diluted at an appropriate ratio, seeded in 96-well plates, and cultured in CHO-S-SFM-II medium supplemented with G418 (Invitrogen) at a final concentration of 500 zg / ml.
  • the subconfluent 2D7sc (Fv) 2 high-producing CHO cell line was transferred to a roller bot- nore (CHO-S-SFM II medium 250 ml / bottle) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 / ml in a T-125 flask. After culturing at 37 ° C, the culture solution was recovered after 6 days. After removing dead cells by centrifugation, this was used for purification through 0.45 ⁇ m finorelet.
  • Hydroxyapatite column micro prep ceramic Hydroxyapatite type I, Bio-Rad
  • buffer A 20 mM Na-phosphate pH6.8
  • ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 was applied.
  • the column was washed with buffer A.
  • 2D7sc (Fv) 2 was eluted with buffer C (250 mM Na-phosphate ⁇ 6 ⁇ 8) After the fraction containing 2D7sc (Fv) 2 was diluted with an equal volume of buffer A, this was 3 ⁇ 4r Anti-Flag M2 This column was applied to a tea column (Bio-Rad), which was washed with buffer C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and then buffer D (lOOmM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20) eluted 2D7sc (Fv) 2.
  • buffer C 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • buffer D lOOmM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20
  • the medamine-containing stabilizer of the present invention By using the medamine-containing stabilizer of the present invention, it is possible to suppress the association reaction of antibody molecules and allow the antibody molecules to exist in a monomer state. In order to develop antibodies as pharmaceutical products, each antibody molecule must exist stably and be used during drug storage. It is necessary to minimize the synthesis reaction.
  • the stabilizer of the present invention can stabilize antibody molecules and suppress the association reaction even when the antibody to be stabilized is in a very high concentration state. would be very useful.
  • the meglumine-containing drug of the present invention has the effect of stabilizing antibody molecules even when antibody molecules are formulated into solutions or lyophilized. Alternatively, it has the effect of stabilizing antibody molecules against lyophilization stress during lyophilized formulation. Furthermore, the stabilizer of the present invention exhibits a stabilizing effect on any of full-length antibodies, fragmented antibodies, and low-molecular-weight antibodies, and is widely useful in the production of antibody preparations. Become.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody molecule stabilized by medalmin of the present invention is suppressed in denaturation and association of antibody molecules. It is expected that the decrease in activity due to crystallization becomes smaller.

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Abstract

　本発明は、メグルミンをタンパク質に添加する工程を含む、タンパク質を安定化させる方法、またはタンパク質の会合化を抑制する方法を提供することを課題とする。また、メグルミンを含有する、タンパク質を安定化する薬剤、またはタンパク質の会合化を抑制する薬剤の提供を課題とする。さらに、メグルミンにより安定化された抗体分子を含有する医薬組成物、該医薬組成物の製造方法、および該医薬組成物を含むキットの提供についても課題とする。 　本発明者らは、上記の課題を解決するために、アミノ糖の一つであるメグルミンの抗体安定化効果について検討を行った。その結果、メグルミンが抗体分子の安定化剤として有用であること、また凍結乾燥製剤の賦形剤としても有用であることを見出した。

Description

明 細 書
メダルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用 技術分野
[0001] 本発明は、ァミノ糖の一つであるメダルミンを含有するタンパク質を安定化する薬剤
、およびその利用に関する。より具体的には、メダルミンを含有する抗体分子を安定 化する薬剤、およびメダルミンを添加する工程を含む、抗体分子を安定化させる方法 に関する。また、メダルミンにより安定化された抗体分子を含有する医薬組成物、およ びその製造方法に関する。
背景技術
[0002] ノくィォ医薬品の製剤化においては、医薬品として使用されるタンパク質を安定に保 存することができる製剤が必要である（非特許文献 1)。
一般にタンパク質の劣化していく経路としては、可溶性の多量体の形成や沈殿'不 溶物の生成等のタンパク質分子の物理的会合化に伴う劣化経路 (非特許文献 2)と、 加水分解 ·脱アミド化反応'メチォニン酸化反応等による化学的修飾による劣化経路 (非特許文献 3)が知られている。医薬品としてタンパク質を開発するにあたっては、こ れら両方の劣化経路を最小限に抑え、保存中にそのタンパク質の生物学的活性の 低下が起こらない製剤を提供する必要がある。このような劣化経路を最小限に抑制 する方法として、溶液 pHの最適化、緩衝液'塩の種類と濃度、および、安定化剤の種 類と濃度の最適化が行われる。
[0003] 医薬品として使用可能な抗体には、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾 抗体 (抗体と他のタンパク質の融合タンパク質および抗体コンジュゲート）等が知られ ている。 IgGの抗体製剤は、一般に非常に高濃度の製剤が要求されるため、非常に 困難であることが知られている（非特許文献 5)。そのため緩衝液種と pHの最適化以 外で、抗体を安定化させる種々の試みがなされている。例えば、 WO02/096457 (特 許文献 1)においては、酸性成分を含有する抗体高濃度安定製剤が開示され、抗体 の安定化のために MgCl， CaClを添加剤として使用している。また、低分子抗体等は 会合化しやすぐ安定性が非常に低いことが知られており（非特許文献 8, 9)、 scFv の単量体は非常に会合化しやすく高濃度条件下では単量体が会合化し 2量体を形 成することが知られている（非特許文献 10)。そのため、これらの抗体を溶液製剤とし て医薬品開発するに当たっては、抗体分子を溶液中で安定化させること（すなわち 会合化を抑制すること）が非常に重要な課題となっている。
[0004] 一般的にタンパク質は凍結乾燥することによって溶液状態よりも安定化する（会合 化が抑制される)ことから、上述の抗体製剤が溶液製剤化が困難な場合、凍結乾燥 製剤化することが考えられる（非特許文献 11， 12， 13)。 IgG抗体の凍結乾燥の際は スクロースが賦形剤として有効であることが報告されている（非特許文献 14)。
[0005] メダルミンは、これまで X線用造影剤（アミドトリゾ酸メダルミン）、 MRI用造影剤（ガド ペンテト酸メダルミン)等に利用されてきた力 これまでタンパク質を安定化させる効 果については報告されてこなかった。
非特許文献 1 : Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4(4), 298-306
非特許文献 2 : Int. J. Pharm. 2005， 289, 1-30
非特許文献 3 : Int. J. Pharm. 1999， 185, 129-188
非特許文献 4 : J. Pharm. Sci. 2004, 93(6), 1390-1402
非特許文献 5 : Pharmaceutical Research 1994, 11(5)， 624-632
非特許文献 6 : Clin. Chem. Lab. Med. 2000, 38(8):759-764
非特許文献 7 Journal of Immunological Methods, 111 (1988), 17-23
非特許文献 8 : FEBS Letters Volume 360, Issue 3， 1995， 247-250
非特許文献 9 : FEBS Letters, 1995, 441, 458-462
非特許文献 10 : J. Mol. Biol. 2002, 320, 107-127
非特許文献 l l : Pharm Biotechnol, 2002, 13， 109-33
非特許文献 12 : Int. J. Pharm. 2000, 203(1-2)， 1-60
非特許文献 13 : Pharm. Res. 1997， 14(8), 969-75
非特許文献 14 : J. Pharm. Sci. 2001, 90(3), 310-21
特許文献 1： WO02/096457
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0006] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ァミノ糖の一つ であるメダルミンをタンパク質に添加する工程を含む、タンパク質を安定化する方法 を提供することにある。
より具体的には、メダルミンを抗体分子に添加する工程を含む、抗体分子を安定化 させる方法、または抗体分子の会合化を抑制する方法を提供することにある。また、 メダルミンを含有する、抗体分子を安定化する薬剤、または抗体分子の会合化を抑 制する薬剤を提供することを課題とする。さらに、メダルミンにより安定化された抗体 分子を含有する医薬組成物、該医薬組成物の製造方法、および該医薬組成物を含 むキットを提供することも課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、ァミノ糖の一つであるメダルミンの抗 体安定化効果について検討を行った。
まず、本発明者らは、 sc(Fv)2である hVB22B sc(Fv)2を用いて、メダルミンによる会合 反応の抑制効果の検討を行った。その結果、メダルミンを添加することによって、大 幅にモノマー残存率が向上し、 WB22Bの会合化反応は大幅に抑制できることが明ら 力^なつた。本研究により、安定性が低い低分子化抗体に対してメダルミンを添加す ることで著しく安定性が向上することを見出した。また本研究により、初めてメグルミン 力 Sタンパク質の安定化剤として有用であることを明らかにした。
[0008] 次に、メダルミンによる、他の sc(Fv)2分子、および全長抗体への安定化効果につい て検討を行った。その結果、メダルミンを添加することによって、 sc(Fv)2のみならず、 全長抗体の IgG等、抗体分子全般において会合化を抑制する効果があることが明ら かとなつた。
[0009] さらに、スクロースに比べてメダルミンのほうが会合体の生成に対する抑制効果が、 溶液製剤、凍結乾燥ストレス、凍結乾燥製剤において大きいことが明らかとなった。ま た、メダルミンは、抗体濃度が 100mg/mLという非常に高濃度の製剤に対しても、溶液 状態、凍結乾燥状態を問わず高い安定化効果を示すことが明らかとなった。さらに、 メダルミンを添加することにより、低温下または常温下の長期保存においても、抗体 分子の会合化が抑制されることが明らかとなった。 即ち、本発明者らは、本発明により初めてメダルミンが抗体分子の安定化剤として 有用であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔21〕を提供するものである。
〔1〕メダルミンを含有する、タンパク質を長期安定化する薬剤。
〔2〕メダルミンを含有する、タンパク質の会合化を抑制する薬剤。
〔3〕タンパク質が抗体分子である、〔1〕または〔2〕に記載の薬剤。
〔4〕抗体分子が、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体様 分子のレ、ずれかである〔3〕または〔4〕に記載の薬剤。
〔5〕剤形が凍結乾燥製剤である、 〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の薬剤。
〔6〕メダルミンがその塩またはその誘導体である〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の薬 剤。
[7]タンパク質にメダルミンを添加する工程を含む、タンパク質を長期安定化する方 法。
〔8〕タンパク質にメダルミンを添加する工程を含む、タンパク質の会合化を抑制する 方法。
〔9〕〔7〕または〔8〕に記載の方法であって、長期低温保存条件において、タンパク質 を長期安定化、またはタンパク質の会合化を抑制する方法。
〔10〕〔7〕または〔8〕に記載の方法であって、長期常温保存条件において、タンパク 質を長期安定化、またはタンパク質の会合化を抑制する方法。
〔11〕タンパク質が抗体分子である、〔7〕から〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕抗体分子が、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体 様分子のいずれかである〔11〕に記載の方法。
〔13〕メダルミン添加する工程の後、タンパク質を凍結乾燥する工程を含む、〔7〕から [12]のいずれかに記載の方法。
〔14〕メダルミンがその塩またはその誘導体である〔7〕から〔13〕のいずれかに記載の 方法。
〔15〕メダルミンを添加した医薬組成物。
〔16〕剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、〔15〕に記載の医薬組成物。 〔17〕メダルミンがその塩またはその誘導体である〔15〕または〔16〕に記載の医薬組 成物。
〔18〕抗体含有組成物にメグルミンを添加する工程を含む、抗体分子を含有する医 薬組成物の製造方法。
〔19〕以下の（1)および（2)の工程を含む、抗体分子を含有する医薬組成物の製造 方法。
( 1 )メダルミンを抗体含有組成物に添加する工程
(2) (1)の混合物を凍結乾燥する工程
〔20〕抗体分子が全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体様 分子のいずれかである〔18〕または〔19〕に記載の医薬組成物の製造方法。
〔21〕メダルミンがその塩またはその誘導体である〔18〕から〔20〕のいずれかに記載 の製造方法。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]メダルミンによる B22Bの安定化効果を示す図である。
[図 2]メダルミンによる、 sc(Fv)2分子、および全長抗体への安定化効果を示す図であ る。図中の数値は溶液加速条件における会合体の含有率（％)を示す。
[図 3]IgGの溶液製剤化および凍結乾燥製剤化における、メダルミンによる安定性効 果を示す図である。
[図 4]single chain diabody型 sc(Fv)2の長期低温保存（_ 20°C ' 6ヶ月）における、メグ ルミンによる安定性効果を示す図である。
[図 5]ヒト化二重特異性抗体の長期常温保存 (25°C ' 2ヶ月）におけるメダルミンによる 安定性効果を示す図である。
[図 6]—本鎖抗体 sc(Fv)2の作製過程を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明者らは、 sc(Fv)2の安定化製剤を検討する過程で、ァミノ糖の一つである新 規安定化剤メダルミンを見出した。さらに、このメダルミンは低分子抗体である sc(Fv)2 のみならず、全長抗体も安定化することを見出した。さらに、メダルミンは、蛋白質医 薬製剤中の安定化剤として一般的に使われているスクロース等の糖ゃァミノ糖に比 ベ、抗体分子などの蛋白質あるいはペプチドに対して優れた安定化効果を示すこと を見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。
本発明は、メダルミンをタンパク質に添加する工程を含む、タンパク質を安定化させ る方法に関する。本発明の安定化は、長期にわたる安定化であってもよい。本発明 において「長期安定化」とは以下のように定義される。低分子化抗体の溶液製剤の場 合は、 55°C2週間保存後における会合体量が 35%以下であること、或いは 40°C2週間 保存後における会合体量が 10%以下、好ましくは 7%以下であること、あるいは 25°C2 ヶ月保存後における会合体量が 1%以下であること、あるいは 20°C6ヶ月保存後に おける会合体量が 2%以下、好ましくは 1%以下であることを意味する。低分子化抗体を 除く全ての抗体或いは一般的な蛋白質の溶液製剤の場合は、 60°C3週間保存後に おける会合体量が 20%以下、好ましくは 10%以下であること、あるいは 20°C6ヶ月保 存後における会合体量が 2%以下、好ましくは 1%以下であることを意味する。また、 IgG 、低分子化抗体を含む全ての抗体或いは一般的な蛋白質の凍結乾燥製剤の場合 は 40°C1ヶ月保存後における会合体量が 5%以下、好ましくは 1%以下さらに好ましくは 0 .5%以下であることを意味する。
本発明において、「メダルミン」とは、別名 N-メチルダルカミン、化学式ト Deoxy-ト methylamino-D-glucitolおよび、以下の化学式で示される化合物である。
[化 1]
ΗΟ CH3
Figure imgf000008_0001
1 -デォキシ- 1 -メチルァミノ- D-グルシ I ル
本発明において「メグルミン」には、メダルミン誘導体やメダルミンの塩等が含まれる 。メダルミン誘導体やメダルミンの塩としては、アミドドリゾ酸メダルミン、アミドドリゾ酸 ナトリウムメダルミン、カドペンテト酸メダルミン、ガドテル酸メグルミン、ィオタラム酸メ グノレミン、ィォトロタス酸メダルミン、ガドベン酸メダルミン、ョードキサム酸メダルミン、 フルニキシンメダルミン、ガストログラフイン (メダルミン硫酸塩)等を挙げることが出来 るがこれらに限定されるものではない。また、上記のメダルミンの水酸基、アミノ基等 力 化学的に修飾を受けたものも、本発明のメダルミンに含まれる。
[0014] 本発明において安定化の対象となる医薬組成物（タンパク質）は、ペプチドを含む タンパク質またはその他の生体高分子、合成高分子化合物、低分子化合物、または それらの誘導体、またはそれらの組み合わせからなる複合体のいずれであってもよい
。本発明の好ましい例としては、抗体を挙げることが出来る。
[0015] 本発明において安定化の対象となる抗体は、既に公知の抗体を用いることが可能 であり、全長抗体、断片化抗体、修飾抗体または低分子化抗体のいずれであっても よい。
公知の全長抗体としては IgG (IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 IgD、 IgE、 IgM、 IgY等を挙 げること力 Sできる力 その種類は特に限定されるものではなレ、。また全長抗体としては 、二重特異性 IgG抗体 (J Immunol Methods. 2001 Feb 1;248(1_2):7_15)も含まれる。 又、新規の抗原を用いて、当業者に公知の方法により作製された抗体も対象とする こと力 Sできる。具体的には、例えば、新規抗体の作製は以下のようにして行うことがで きる。
[0016] 新規抗原タンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免 疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の 親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ ハイプリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウ ィルスを用いた方法 (W098/46777など）等に準じて行うことができる。ハイプリドーマ の作製は、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.， Methods En zymol. (1981) 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合に は、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その 後、ハイプリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領域）の cD NAを合成し、得られた cDNAの配列を公知の方法により解読すればょレ、。
[0017] 新規抗原を認識する抗体は、新規抗原と結合する限り特に制限はなぐマウス抗体 、ラット抗体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒト に対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換 え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒトイ匕（Humanized)抗体なども使用できる 。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒ ト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、 軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒ ト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主 に導人し産生させることにより得ること力できる。
[0018] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえば マウス抗体の相補性決定領域 (CDR; complementarity determining region)をヒト抗 体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知ら れている。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framewor k region ; FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部 分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得ら れた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み 込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 E P 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結されるヒト 抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される 。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成する ように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al , Cancer Res. (1993) 53， 851-856)。
[0019] また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の 抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞 、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもで きる（特公平 1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトラ ンスジヱニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することがで きる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94 /25585， WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領 域を一本鎖抗体（scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現さ せ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子 を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定す ることができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を有 する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は 既に周知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO
93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0020] 本発明の安定化の対象となる抗体としては、断片化抗体または低分子化抗体を挙 げること力 S出来る。これらは公知の抗体または新規に作製する抗体のいずれであって もよい。断片化抗体または低分子化抗体とは、全長抗体 (whole antibody,例えば who le IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれ ば特に限定されない。抗体断片の具体例としては、例えば、 Fab, Fab'、 F(ab')2、 Fv、 scFv (シングルチェイン Fv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)
85, 5879-5883、 Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal AntibodiesJ Vol.113, Resenburg及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269- 315， (1994))、 VHH ( camelid VH、 J Biotechnol. 2001 Jun;74(4):277_302.)、または sc(Fv)2などを挙げること ができるが、好ましくは sc(Fv)2である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、 例えば、ノ パイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させる力、又は、これら抗 体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主 細胞で発現させればよい（例えば、 Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2 976； Better, M. and Horwitz, A. Η· , Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496； Pluc kthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515； Lamoyi, Ε· , Met hods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. et al , Methods Enzymol. (1986)
121, 663-669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-1 37参照）。
[0021] 本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体の VHを 2つ以上及び VLを 2つ以上 含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカ一等を介して間接的に結合した抗体 である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよぐまた、共有結合と非共有結合の 両方でもよい。さらに好ましい低分子化抗体は、 VHと VLが非共有結合により結合し て形成される VH-VL対を 2つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体 中の一方の VH-VL対と他方の VH-VL対との間の距離力 全長抗体における距離よ りも短くなる抗体が好ましい。
[0022] 本発明において低分子化抗体としては、 scFv、 Diabody,または sc(Fv)2を挙げるこ とが出来る。 scFvは可変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメントである。
Diabodyは、 scFv等（以下、 Diabodyを構成するフラグメント）を 2つ結合させて二量体 化させたものであり、通常、 2つの VLと 2つの VHを含む。 Diabodyを構成するフラグメン ト間の結合は非共有結合でも、共有結合でもよいが、好ましくは非共有結合である。
[0023] Diabodyを構成するフラグメントは、 VLと VHを結合したもの、 VLと VLを結合したもの 、 VHと VHを結合したもの等を挙げることができる力 好ましくは VHと VLを結合したも のである。 Diabodyを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合す るリンカ一は特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合 がおこらない程度に短レ、リンカ一を用いることが好ましい。そのようなリンカ一の長さ は当業者が適宜決定することができる力 通常 2〜14アミノ酸、好ましくは 3〜9アミノ 酸、特に好ましくは 4〜6アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされる V Lと VHとは、その間のリンカ一が短いため、同一鎖上の VLと VHの間で非共有結合が おこらず、単鎖 V領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合 による二量体を形成する。さらに、 Diabody作製と同じ原理で、 Diabodyを構成するフ ラグメントを 3つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作 製することも可能である。
[0024] sc(Fv)2は、 2つの重鎖可変領域（[VH] )及び 2つの軽鎖可変領域（[VL] )をリンカ 一等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Met hods 1999 ; 231 : 177-189)。この 2つの VHと VLは異なるモノクローナル抗体由来であ つてもよレ、。例えば、 Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374に開示されるよう な 2種類の抗原、あるいは 2種類のェピトープを認識する二重特異性 (bispecific) sc(F v)2が挙げられる。 sc(Fv)2は、例えば、 2つの scFv (シングルチヱイン Fv) (Huston, J. S . et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883、 Plickthun「The Pharm acology of Monoclonal AntibodiesJ Vol. l l3， Resenburg及び Moorefe, Springer Verl ag, New York, pp.269-315, (1994))をリンカ一等で結合することにより作製することが 可能である。リンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカ一 、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開 示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明においてはペプチドリンカ一が好 ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的に応じて当業者が適宜選択 することが可能である力 通常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 5〜30アミノ酸、特に好ま しくは 12〜18アミノ酸（例えば、 15アミノ酸）である。
[0025] 結合される 2つの重鎖可変領域と 2つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、ど のような順序で並べられていてもよぐ例えば、以下のような配置を挙げることができる
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
本発明においては、好ましくは、 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]の 配置を有する sc(Fv)2である。
[0026] 重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び Z又は 揷入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、 抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加し てもよレ、。又、可変領域はキメラ化ゃヒト化されていてもよい。
[0027] 本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカ一は、遺伝子工学により導入し 得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineerin g， 9(3)， 299-305, 1996に開示されるリンカ一を用いることができる。
本発明において好ましレ、リンカ一はペプチドリンカ一である。ペプチドリンカ一の長 さは特に限定されず、 目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通 常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 3〜50アミノ酸、更に好ましくは 5〜30アミノ酸、特に好 ましくは 12〜 18アミノ酸（例えば、 15アミノ酸）である。
[0028] ペプチドリンカ一のアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることが できる。 uly ber
uly ly ber
ser' Gly ly
Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：41)
Ser · Gly · Gly · Gly (配列番号： 42)
Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：43)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 44)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：45)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号：46)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 47)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 48)
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 43))n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 44))n
[nは 1以上の整数である]
[0029] 合成化学物リンカ一（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 斉' J、例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、 ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロピオ ネート）（DSP)、ジチォビス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、ェチレ ングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スル ホスクシンィミジルスクシネート）（スルホ一EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST) 、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩（スルホ一 DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルボニルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボニルォキシ）ェチル]スルホン（スルホ— BSOCOES)などであり、これらの架橋 剤は市販されている。 [0030] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となるが、全 て同じリンカ一を用いてもよいし、異なるリンカ一を用いてもよい。
sc(Fv)2は、当業者に周知の方法で作製することができる。例えば、 sc(Fv)2をコード する DNAを揷入したベクターを宿主細胞へ導入し、 sc(Fv)2を発現させ、発現産物を 回収することで、 sc(Fv)2を作製できる。
[0031] 該ベクターとしては、揷入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず 、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしては pBluesc riptベクター (Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用するこ とができる。本発明の sc(Fv)2を生産する目的においてベクターを用いる場合には、 特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養 細胞内、生物個体内で sc(Fv)2を発現するベクターであれば特に制限されなレ、が、例 えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pET ベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S_FL3ベクター（GenBank Acce ssion No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-47 2(1988))などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの挿入は、常法により、例えば 、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 1 1.4-11.11)。
[0032] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。 sc(Fv)2を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカ ス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ァス ペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を 例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿 法、 i£ ノヽノレス 孑し法 (Current protocols in Molecular Biology eait. Ausubel et al. ( 1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIBCO- BR L社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0033] sc(Fv)2の回収は、本発明の sc(Fv)2が培地に分泌される場合は、培地を回収するこ とで実施できる。また、 sc(Fv)2が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し 、その後に sc(Fv)2組成物を回収する。
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene
152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、 K ramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 944ト 9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol. 154, 350—367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA.
82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、本発 明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製す ることができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発 明の抗体のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を 有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
変異するアミノ酸数は特に制限されなレ、が、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましく は 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であ ると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて いる別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水十生アミノ酸（A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水十生アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有 するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、 M)、カルボン酸及 びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R 、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる (括弧 内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個 のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミ ノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られて いる（Mark, D. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487—6500、 Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、 Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409-6413) また、抗体の定常領域などのアミノ酸配列は当業者に公 知である。
[0035] また、本発明に使用する抗体は、修飾抗体であってもよぐ修飾抗体としては、ポリ エチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲ ート抗体でもよい。
また、修飾抗体は、抗体コンジュゲートのほかに、抗体分子、抗体分子断片、抗体 様分子と、他タンパク質 ·ペプチドとの融合タンパクであってもよい。融合タンパクとし ては TNF aと Fcの融合タンパク（Int J Clin Pract. 2005 Jan;59(l):114_8.)や IL2と scFv との融合タンパク（J Immunol Methods. 2004 Dec;295(l-2):49_56.)等が挙げられる 力 特にこれらに限定されるものではない。
また、本発明に使用する抗体は、抗体様分子であってもよい。抗体様分子としては affibody(Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Mar 18;100(6):3191- 6)や ankyrin(Nat Biote chnol. 2004 May;22(5):575_82)等が挙げられる力 S、特にこれらに限定されるものでは なレ、。
[0036] 上述の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、 目的 とする抗体の DNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、ェ ンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次 に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。 その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript, pC R_Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場 合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM_T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。
[0037] 抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクター が有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は 、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 ひ、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現 できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 54 4-546 ; FASEB J. (1992) 6， 2422-2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。こ のようなベクターとしては、上記ベクターの他に pGEX-5X_l (Pharmacia社製）、「QIAe xpress system] (QIAGEN社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリ メラーゼを発現している BL21が好ましい）などが挙げられる。
[0038] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0039] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとして は、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (Invitrogen社製）や、 pEGF-BO S (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現べ クタ一 (例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」 (GIBCO BRL社製)、 p BacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の 発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw) ,レトロウイルス由来の発現ベクター (例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression KitJ (Inv itrogen社製）、 pNVl l、 SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pK ΤΗ50)が挙げられる。
[0040] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1ひプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)、 CMVプロモーターなどを持っているこ とが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオ マイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ま しレ、。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK_RSV、 p BK-CMV、 pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0041] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点 を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、 また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来の ものを用レ、ることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べ クタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジ ンキナーゼ（TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0042] 本発明においてメダルミンをタンパク質に「添加する」とは、メダルミンとタンパク質を 混合させることも意味する。本発明において、メダルミンとタンパク質を混合させるとは 、メダルミンを含有する溶液に、タンパク質を溶解させるものであってもよい。
本発明において、「安定化する」とは、タンパク質が天然の状態または、活性を保つ 状態を保持することをいう。
[0043] また、本発明のメダルミンを含有する安定化剤を添加することにより、タンパク質の 活性が、天然状態もしくはコントロールよりも上昇した場合、または保存時において会 合化による活性の低下がより小さくなつた場合にも、タンパク質が安定化されたとみな すことができる。タンパク質の具体例として、抗体分子の活性が上昇したか否かは、 同一の条件下で目的の活性を測定することにより確認することができる。安定化の標 的となる抗体分子は新たに合成されたものや、生物体から単離されたものでもよい。
[0044] 本発明におレ、て活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、ァゴニスト活性、ァ ンタゴ二スト活性、酵素活性など、レ、かなる活性でもよぐ特に限定されないが、生体 、組織、細胞、タンパク質、 DNA、 RNA等に量的及び Z又は質的な変化、影響をもた らす活性であることが好ましく、特にァゴニスト活性が好ましレ、。
ァゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグ ナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理 的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、 結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化/脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移 活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを 挙げること力 Sできる力 これらに限定されるわけではない。
[0045] 本発明において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例として は、例えば、受容体、癌抗原、 MHC抗原、分化抗原、などを挙げること力できる。受 容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容体ファミリー 、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受容体ファミリ 一、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアンカー型受容 体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモ ン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。 これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存 在し、 列えは、 Cooke BA. , King RJB., van der Molen HJ. ed. Newし omprehesive Bio chemistry V0I.I8B "Hormones and their Actions Part ΐ 'ρρ.1-46 (1988) Elsevier Sci ence Publishers BV. , New York, USAヽ Patthyし (1990) Cell, 61 : 13—14.、 Ullrich A" et al. (1990) Cell, 61 : 203— 212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067— 1070.、 Miyajima A., et al. (1992) A画. Rev. Immunol., 10: 295- 331.、 Taga T. and Kishimoto T. (19 92) FASEB J" 7: 3387—3396·、 Fantl WL , et al. (1993) A匪. Rev. Biochem" 62: 45 3-481·、 Smith CA.， et al. (1994) Cell, 76: 959-962·、 Flower DR. (1999) Biochim. Bi ophys. Acta, 1422: 207-234.、宫坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「 接着因子ハンドブック」（1994) (秀潤社，東京， 日本)等が挙げられる。
[0046] 上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスェ リスロポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容 体、ヒト又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、 ヒト又はマウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF)受 容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN) -ひ 、 j3受容体、ヒト又はマウスレプチン受 容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL) -10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血 病抑制因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を 例示することができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76， 31-35·; mEPOR: D' Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57， 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87， 8702-8706. ; mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350. ; hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644. ; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hlnsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756- 761. ; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91， 459—463.; hPD GFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hi FN a / j3 R: Uze, G. et al. (1990) Cell 60， 225-234.及び Novick, D. et al. (1994) C ell 77, 391-400.)。
[0047] 癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれ る。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌 抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、 CA19-9、 CA 15-3、シリアル SSEA-l(SLX)などを挙げることができる。
MHC抗原には、 MHC class I抗原と MHC class II抗原に大別され、 MHC class I抗 原には、 HLA- A，-B,-C,-E,-F，- G,-Hが含まれ、 MHC class II抗原には、 HLA-DR,- DQ， -DPが含まれる。
[0048] 分化抗原には、
CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CDl la,CDllb,CDl lc,CD13,CD14
,CD15s，CD16,CD18，CD19，CD20,CD21,CD23，CD25,CD28,CD29，CD30,CD32,CD3
3,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43,CD44,CD45,CD45
RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,CD54,CD55,CD56,C
D57，CD58,CD61,CD62E，CD62L，CD62P,CD64,CD69，CD71,CD73,CD95，CD102，C
D106，CD122,CD126,CDwl30などが含まれる。
[0049] 活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び/又は質的な変化 が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指 標、細胞系 (eel卜 based assay)の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることが できる。
無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量的及び Z又は 質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖 転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タ ンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの 増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在する タンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。
[0050] 細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び Z又 は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用い ることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 m RNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び/又は突起の数の 変化、偏平度の変化、伸長度/縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変 ィ匕、細胞集団としての異形性/均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。こ れらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、 足場依存性、サイト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細 胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性として は、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質 量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって 誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。
[0051] 組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることがで きる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変 ィ匕、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、 血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
[0052] これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍 光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量 、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これ らの測定方法は当業者にとっては周知であり、 目的に応じて、適宜選択することがで きる。
例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発 光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量分 析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウ ンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面プラズモン 共鳴シグナノレは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVO などにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。こ れらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ簡便 であれば、 2種以上の測定を同時及び/又は連続して測定することによりさらに多数 の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を 同時にフルォロメータで測定することができる。
[0053] 本発明において、ァゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可 能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にァゴニスト活性を測定す る方法により判定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示 す細胞に、ァゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、 WST-8の ような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光 度を測定し、得られた吸光度を指標にァゴニスト活性を測定することが可能である。
[0054] ァゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能 であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容 体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受 容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖 シグナルを出さなレ、受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受 容体を細胞で発現させればょレ、。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、 例えば、 G-CSF受容体、 mpl、 neu、 GM-CSF受容体、 EPO受容体、 c- kit、 FLT- 3等を 挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDC P- 1、 FDCP_2、 CTLL-2、 DA_1、 KT_3等を挙げることができる。
[0055] また、本発明において、タンパク質が「安定化する」とは、タンパク質の会合化反応 が抑制された状態であって、保存中に生じるタンパク質の会合体の増加を抑制する こと、及び Z又は、保存中に生じるタンパク質の不溶性会合体 (沈殿物）の増加を抑 制すること及び/又は、タンパク質の機能を保持していることをレ、い、好ましくは、保 存中に生じるタンパク質の会合体の増加を抑制することをいう。 [0056] 本発明は、ァミノ糖の一つであるメダルミンをタンパク質に添加する工程を含む、タ ンパク質の会合化を抑制する方法に関する。より具体的には、メダルミンを抗体分子 に添加する工程を含む、抗体分子の会合化を抑制する方法に関する。
本発明において、会合とは、タンパク質 (抗体分子）が不可逆的あるいは可逆的に 会合化し抗体 2分子以上の多量体が形成されることを言う。会合が抑制されたか否か については、当業者に公知の方法、例えば、沈降平衡法 (超遠心法）、浸透圧法、光 散乱法、低角レーザー光散乱法、 X線小角散乱法、中性子小角散乱法、またはゲル ろ過法等により抗体分子の会合体含有率を測定することで行うことが出来る。メグルミ ンを添加することにより、保存時の抗体の会合体含有率が低下した場合に、会合化 が抑制されたと解釈することが出来る。
[0057] 抗体の会合体含有率の測定する方法としては、実施例に記載の通り、 SEC (Size Ex elusion Chromatography :サイズ排除クロマトグラフィー）を用いて行う方法が挙げられ る力 S、これらの方法に限定されるものではない。
本発明において「抗体分子を安定化する」とは、抗体の濃度や状態は問わず、溶 液抗体製剤、凍結乾燥抗体製剤、またはスプレードライ製剤に含まれる抗体分子を 安定化するものであってもよい。また、低温下または常温下で長期保存された抗体分 子を安定化するものであってもよい。本発明において低温保存とは、一例として 80 °C〜10°Cにおける保存を挙げることが出来、凍結保存も保存形態に含まれる。低温 の好ましい例としては、 _ 20°Cまたは 5°Cを挙げることができる力 この温度に限定さ れるものではない。また、本発明において常温保存とは、一例として 15°C〜30°Cにお ける保存を挙げることが出来る。常温の好ましい例としては、 25°Cを挙げることができ るが、この温度に限定されるものではない。
[0058] 溶液製剤化は、当業者に周知の方法によって実施できる。例えば、非特許文献 (J.
Pharm.Sc, 2004, 93(6), 1390-1402)に記載されているように、通常 TFF膜を利用した 膜濃縮法が用いられる。
凍結乾燥は、当業者に周知の方法によって実施できる（Pharm. Biotechnol, 2002, 13, 109-33、 Int. J. Pharm. 2000, 203(1-2),ト 60、 Pharm. Res. 1997, 14(8), 969-75) 。例えば、溶液を凍結乾燥に用いるバイアル等の容器に適当量分注し、凍結庫また は凍結乾燥庫中にて行なうか、またはアセトン/ドライアイス、液体窒素などの冷媒 中に浸漬して行なう。
[0059] また、スプレードライ製剤化は当業者に周知の方法によって実施できる (J. Pharm.
Sci. 1998 Nov;87(l l):1406-l l) o
溶液製剤化および凍結乾燥については、実施例に記載の方法で行うことも出来る 、それらに限定されるものではない。
[0060] 本発明は、ァミノ糖の一つであるメダルミンを含有する、タンパク質を安定化させる 薬剤、またはタンパク質の会合化を抑制する薬剤に関する。より具体的には、メグルミ ンを含有する、抗体分子を安定化させる薬剤、または抗体分子の会合化を抑制する 薬剤に関する。
また、メダルミンを含有する、抗体分子を安定化させる薬剤、または、凍結乾燥抗体 製剤に含まれる抗体分子を安定化させる薬剤に関する。
[0061] 本発明において、薬剤には保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加され ていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記のタンパク質の安定化作用を 有する材料であってもよいし、安定化作用を有さない材料であってもよぐ上記の薬 剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、安定化作用を有さな い材料であっても、メダルミンと併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化 効果を有する材料であつてもよい。
[0062] 製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、 緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる 本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル;グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、 グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレ ート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂 肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソノレ ビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキ シエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレング リセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレ ングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェ チレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレ ンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピル エーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシェ チレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシェチェレンノユルフェニル エーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマ シ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオ キシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェチ レンミツロウ誘導体;ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体 ；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の HLB 6〜： 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチノレ 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレィル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜： 18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩;天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のフィンゴリン脂質;炭素原子数 12〜： 18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を 典型的例として挙げることができる。
本発明の製剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添 加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベー ト 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリ ソノレべート 20及び 80力 S特に好ましレ、。また、ポロキサマー（プル口ニック F— 68 (登録 商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好まし レ、。
界面活性剤の添力卩量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0. 001〜100mgZmLであり、好ま しくは 0. 003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは 0. 005〜2mg/mLである。
[0064] 本発明におレ、て緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製し てもよい。緩衝液の濃度は一般には l〜500mMであり、好ましくは 5〜： !OOmMであ り、さらに好ましくは 10〜20mMである。
[0065] また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチ ンゃ免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖ァ ルコールを含んでレ、てもよレ、。
本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル二チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟮酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。 好ましい アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル二チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグルタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、バリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ェニルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することもできる。
[0066] 本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス，トレハロース、ラフイノース等を挙げることができる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソノレビトーノレ、イノシ トール等を挙げることができる。
[0067] 注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリ ゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコ ール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO -50)等と併用してもよい。
[0068] 所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化 防止剤等を含有してもよい。
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数:!〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げることができる。
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド 口キシトノレェン、ブチノレヒドロキシァニソーノレ、 ひ一トコフエロール、酢酸トコフェローノレ 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
[0069] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ [メ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition， Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al , J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al , Biopolymers 1983， 22: 547-556 ？第133,988号)。
[0070] 本発明は、ァミノ糖の一つであるメダルミンにより安定化された抗体分子を含有する 医薬組成物に関する。また、本発明はァミノ糖の一つであるメダルミンにより会合化が 抑制された抗体分子を含有する医薬組成物に関する。さらに、該医薬組成物、およ び薬学的に許容される担体を含むキットに関する。
本発明の医薬組成物およびキットには、上記の安定化された抗体分子以外に、製 剤上許容される材料が含まれてもよい。製剤上許容される材料としては、上記に記載 のものを挙げることが出来る。
本発明の医薬組成物の形態 (剤形)としては、注射剤形、凍結乾燥剤形、溶液剤形 、またはスプレードライ製剤形などが例示できる力 これらに限定されるものではない
本発明の製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチック又はガラス製のバイアル、ァ ンプル、注射器のような規定容量の形状の容器、ならびに瓶のような大容量の形状 の容器で供給することができる。使用の便宜性の点からはプレフィルドシリンジが好ま しい。
[0071] 患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能である力 好ましくは非経口 投与であり、例えば、注射投与が可能である。注射投与の例としては、例えば、静脈 内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与す ることができる。また、患者の年齢、症状によって適宜投与方法を選択することができ る。投与量としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体については一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、 患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら 、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。低分子化 合物については、成人に対して有効成分量として、一日当たり、 0.1〜2000mgの範 囲である。し力しながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるも のではない。
[0072] 本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤は、使用前に、溶液製剤とするこ とができる。従って、本発明は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤、 および薬学的に許容される担体を含むキットもまた提供する。薬学的に許容される担 体は、本発明の凍結乾燥製剤またはスプレードライ製剤を溶液製剤化できるもので あれば、担体の種類、組み合わせの有無等に制限はないが、薬学的に許容される担 体として、またその一部として、本発明の安定化剤を用いることで、溶液製剤中での 抗体分子の会合化を抑制することができる。
[0073] 本発明は、メダルミンを抗体に添加し、抗体分子を安定化させる工程を含む、抗体 分子を含有する医薬組成物の製造方法に関する。また、メダルミンを抗体に添加し、 抗体分子の会合化を抑制する工程を含む、抗体分子を含有する医薬組成物の製造 方法に関する。また、（1)メダルミンを抗体に添加工程、および（2) (1)の混合物を溶 液製剤化する工程を含む、抗体分子を含有する医薬組成物の製造方法に関する。 さらに、 （1)メダルミンを抗体に添加する工程、および（2) (1)の混合物を凍結乾燥す る工程の工程を含む、抗体分子を含有する医薬組成物の製造方法に関する。
溶液製剤化および、凍結乾燥に関しては上記に記載の方法で行うことが出来る。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0074] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕メダルミンによる WB22Bの安定化の検討
高純度に精製した sc(Fv)2である hVB22B sc(Fv)2 u2_wz4 (配列番号： 1、以下参考 例を参照）を用いて、メダルミンによる会合反応の抑制効果の検討を行った。安定性 試験における溶媒の条件、 WB22B濃度は以下の通りである。
[0075] く安定性試験条件〉 コントロール： 20mMクェン酸ナトリウム（pH6.5)
メダルミン： 20mMクェン酸ナトリウム、 pH6.5、 10%メグノレミン
hVB22B u2-wz4： l.Omg/mL
[0076] 上記条件下において、 55°C-3日後および 6日後に、 SEC (Size Exclusion Chromato graphy:サイズ排除クロマトグラフィー）を用いて、モノマー残存率を測定した（モノマ 一残存率は、初期状態のモノマーピークエリアに対する熱加速サンプルのモノマー のピークエリアの％である）。 SECの分析条件を下記に示す。
[0077] く SECの分析条件〉
カラム ： TSKgel Super2000sw (TOSOH)
溶出液： 50mMリン酸ナトリウム、 300mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.2ml/ min
検出波長： 220nm
[0078] SECの分析結果を図 1に示す。図 1は、上記溶液条件における initial, 55°C_3日後，
6日後のモノマー残存率の経時変化である。
以上の結果により、コントロールと比較してメダルミンを添カ卩することによって、大幅 にモノマー残存率が向上し、 hVB22Bの会合化反応は大幅に抑制できることが明らか となった。本研究により、安定性が非常に低い低分子化抗体に対してメグルミンを添 加することで著しく安定性が向上することを見出した。また本研究により、初めてメグ ルミンがタンパク質の安定化剤として有用であることを明らかにした。
[0079] 〔実施例 2〕メダルミンの及ぼす他の sc(Fv)2分子、および全長抗体への安定化効果の 検討
〔実施例 1〕に示した hVB22B以外の sc(Fv)2 :下記に示す mVB22B (配列番号： 2、以 下参考例を参照）、 12E10 (配列番号： 3、 WO02/33072)、 2D7 (配列番号: 4、以下参 考例を参照）においてメダルミンの安定化効果を検討した。また、 sc(Fv)2ではなぐ全 長抗体 IgGlであるヒト化抗 IL-6受容体抗体 (H鎖-配列番号： 5、 L鎖-配列番号： 6 、 W092/19759)における安定化効果も検討した。安定性試験における溶媒の条件、 各抗体濃度は以下の通りである。
[0080] く安定性試験条件〉 コントロール： 20mMクェン酸バッファー、 pH6.5
メダルミン： 20mMクェン酸バッファー、 10%メダルミン、 pH6.5
mVB22B： 28ug/mL, 40°C_1週間後、 2週間後について測定を行った。
2D7 : 59ug/mL、 40°C_1週間後、 2週間後について測定を行った。
12E10 : 10ug/mL、 55°C_1週間後、 2週間後について測定を行った。
IgG : 6.84mg/mL、 60°C_1週間後、 3週間後について測定を行った。
上記条件において、熱加速試験を実施した。
[0081] く SECの分析条件〉
mVB22B, 2D7, 12E10に関しては、分析は下記の条件で行った。
カラム ： TSKgel Super2000SW (TOSOH)
溶出液： 50mMリン酸ナトリウム、 300mM KC1, pH7.0
Flow rate： 0.2ml/ min
検出波長： 220nm
[0082] IgGに関しては、分析は下記の条件で行った。
カラム ： TSKgel G3000SWxl (TOSOH)
溶出液： DPBS (-)
Flow rate： 0.5ml/ min
検出波長： 220nm
[0083] 図 2に、上記の各溶液加速条件における会合体 (aggregate)の経時変化を示す。安 定性試験の結果、 sc(Fv)2、 IgGに限らず、いずれの分子形においてもメダルミン添カロ により、会合体の生成が抑制された。以上の結果よりメダルミンを添加することによつ て、 sc(Fv)2のみならず、全長抗体の IgG等、抗体分子全般において会合化を抑制す る効果があることが明らかとなった。メダルミンはこれまで抗体分子の安定化剤として の報告がなぐ本検討により初めてメダルミンが抗体分子の安定化剤として有用であ ることを明らかにした。
[0084] 〔実施例 3〕 IgGの溶液安定化剤、凍結乾燥製剤の賦形剤としてのメダルミンの検討
IgGの溶液製剤の安定化剤として、あるいは、凍結乾燥製剤の賦形剤としてメグルミ ンの安定化効果を検討した。 IgGの安定化剤 (賦形剤）の比較として、一般的なスクロ ースを用いた。スクロースは抗体の凍結乾燥製剤として非常に有用であることが報告 されている。試験に供した試料及び安定性試験条件は以下の通りである。
[0085] く試験に供した試料〉
試料 1 : IgG 80 mg/viaUスクロース 100 mg/vial,ポリソルベート 80 1 mg/vial,リン酸 ナトリウム塩 30 μ mol/via pH6.0
試料 2 : IgG 80 mg/viaUスクロース 70 mg/vial,ポリソルベート 80 1 mg/vial,リン酸ナ トリウム塩 30 μ mol/via pH6.0
試料 3 : IgG 80 mg/viaUスクロース 50 mg/vial、ポリソルベート 80 1 mg/via リン酸ナ トリウム塩 30 μ mol/viaU pH6.0
試料 4 : IgG 80 mg/viaUメグノレミン 55 mg/via ポリソルベート 80 1 mg/vial,リン酸ナ トリウム塩 30 μ mol/viaU pH6.0
試料 5 : IgG 80 mg/viaUメグノレミン 40 mg/via ポリソルベート 80 1 mg/vial,リン酸ナ トリウム塩 30 μ mol/viaU pH6.0
試料 6 : IgG 80 mg/viaUメグノレミン 30 mg/via ポリソルベート 80 1 mg/vial,リン酸ナ トリウム塩 30 μ mol/viaU pH6.0
[0086] 上記試料の凍結乾燥製剤にっレ、ては、 IgG濃度が 40 mg/mLとなるように調製した 凍結乾燥前溶液をバイアルに 2mLずつ充填し、棚型凍結乾燥機を用いて以下の条 件からなる凍結乾燥を行うことにより調製した。
※ 凍結乾燥条件
工程名 温度
予備凍結 _50°C
一次乾燥 _20°C
二次乾燥 25→30°C
また、上記試料の溶液製剤については、凍結乾燥製剤 1バイアル当たり 0.6mLの注 射用水を添加することにより調製した。このとき、 IgG濃度は約 120 mg/mLとなる。
[0087] く安定性試験条件〉
凍結乾燥前後：凍結乾燥前溶液及び凍結乾燥製剤について測定を行った。
凍結乾燥製剤： 40°C— 1力月保存試料にっレ、て測定を行った。 溶液製剤： 25°C— 2週間保存試料について測定を行った。
[0088] く SECの分析条件〉
以下の分析条件にて測定を行った。
カラム： TSKgel G3000SWxl (TOSOH)
溶出液： pH7.0のリン酸緩衝液（300 mmol/L塩化ナトリウム及び 0.05%アジ化ナトリウ ムを含む PH7.0の 50 mmol/Lリン酸緩衝液）
Flow rate： lml/mm
検出波長： 280nm
[0089] 図 3に、凍結乾燥前後（凍結乾燥前溶液と凍結乾燥製剤）の会合体含有量に及ぼ すスクロースとメダルミンの比較、及び、凍結乾燥製剤を作製し 40°C-1ヶ月の加速試 験後の会合体含有量に及ぼすスクロースとメダルミンの比較、及び、溶液製剤におけ る 25°C-2週間の加速試験後の会合体含有量に及ぼすスクロースとメダルミンの比較 を示した。
[0090] いずれの比較においても、スクロースと比較してメダルミンのほうが、会合体含有率 が低かった。これよりスクロースに比べてメダルミンのほうが会合体の生成に対する安 定化作用が大きいことを見出した。また、その安定化作用にはメダルミンの濃度依存 性が見られ、メダルミンが高濃度であるほど高い安定化作用が見られた。すなわち、 凍結乾燥工程における抗体の乾燥ストレスに対して、メダルミンを添加することによつ て、メダルミンの濃度依存的に凍結乾燥による会合体の増加を抑制することが出来た 。また、凍結乾燥製剤の 40°C_1ヶ月保存による会合化も同様に抑制することができた 。さらに、濃度約 120mg/mLの溶液製剤について、 25°C_2週間保存による会合化も同 様に抑制することができた。そして、このような lOOmg/mLを超えるような高濃度溶液 製剤に対しても、また溶液状態あるいは凍結乾燥状態のいずれを問わず、メダルミン はスクロースに比べて高い安定化効果があることを見出した。
[0091] 〔実施例 4〕hVB22B u2_wz4の- 20°C凍結保存時におけるメグルミンの安定化効果
hVB22B u2-wz4を、本発明の参考例:!〜 3、 WO2005/056603または WO2005/0566 04に示された方法で発現し、 single chain diabody型 sc(Fv)2を精製した。精製された s ingle chain diabody型 sc(Fv)2を用いて以下の溶液条件の処方（Flおよび F2)を調製 した。
Fl： lOmg/mL single chain diabody型 sc(Fv)2
20mMヒスチジン（pH6.8) + 150mM NaCl + 0.5mg/mL Polysorbate80
F2： lOmg/mL single chain diabody型 sc(Fv)2 + 150mMメグルミン
20mMヒスチジン（pH6.8) + 150mM NaCl + 0.5mg/mL Polysorbate80
これらの試料を一 20°Cにおいて 6ヶ月凍結保存した。保存前の試料 (initial)の会合 体含有率および— 20°C '6ヶ月保存後の試料 (_20°C_6M)の会合体含有率を、 SEC ( ゲルろ過クロマトグラフィー）を用いて以下の条件で分析した。
液体クロマトグラフィー
カラム ： TSKgel G3000SWXL (東ソ一）
移動相 ： 50mMリン酸緩衝液（pH 7.0) + 300mM塩化カリウム
流速 ： 0.5 mL/min
検出 ： 220 nm
試料注入量 ： 10 / L
カラム温度： 室温
サンプル温度： 5°C
[0092] 図 4に SECにより解析された保存前の試料と 20°C '6ヶ月後の試料の会合体含有 率を示した。 _20°C '6力月の会合体増加分は、メダルミンを含まない F1においては 4. 8%会合体が増加したのに対して、メダルミンを安定化剤として含む F2においては会 合体の増加は 0.4%に抑制することができた。本実施例にぉレ、て、メダルミンは凍結状 態においてもタンパク質を安定化する作用を有することが示された。
[0093] 〔実施例 5〕ヒトイ匕二重特異性抗体 hA69-KQ / hB26-PF I hAL_AQにおけるメグルミ ンの安定化効果
精製されたヒト化二重特異性抗体 hA69-KQ I hB26-PF I hAL-AQを用いて以下 の溶液条件の処方（AF1、 AF2、 AF3)を調製した。 hA69_KQ / hB26-PF I hAL-AQ 力 なるヒト化二重特異性抗体は、 IgG4タイプの抗体であり、配列番号： 49で示され る第 1の H鎖の可変領域 (hA69_KQ)、配列番号： 50で示される第 2の H鎖の可変領 域（hB26_PF)、およびそれぞれの H鎖に共通の配列番号： 51で示される L鎖の可変 領域 (hAL-AQ)を含む抗体である。
AF1： 20mMヒスチジン— HC1， 50mM NaCl, pH5.8, 120mg/mL hA69_KQ / hB26-PF I hAL-AQ
AF2： 20mMヒスチジン— HC1， 50mM NaCl, 200mMメグノレミン， H5.8, 120mg/mL hA 69-KQ / hB26-PF I hAL-AQ
AF3： 20mMヒスチジン— HC1， 50mM NaCl, 200mMアルギニン— HC1, pH5.8, 120mg/ mL hA69-KQ / hB26-PF I hAL-AQ
[0094] これらの試料を 25°Cにおレ、て 2ヶ月常温保存した。保存前の試料 (initial)の会合体 含有率および 25°C '2ヶ月保存後の試料 (25°C-2M)の会合体含有率を、 SEC (ゲルろ 過クロマトグラフィー）を用いて以下の条件で分析した。測定にあたり、 AF1、 AF2、 AF 3を SECの移動相を用いて lmg/mLに希釈し、希釈した試料を用いて分析を行った。 液体クロマトグラフィー
カラム ： TSKgel G3000SWXL (東ソ一）
移動相 ： 50mMリン酸緩衝液（pH 7.0) + 300mM塩化カリウム
流速 ： 0.5 mL/min
検出 ： 220 nm
試料注入量 ： 10 i L (120mg/mLの溶液を移動相で lmg/mLに希釈した溶液を 注入）
カラム温度： 室温
サンプル温度： 5°C
[0095] 図 5に SECにより解析された保存前の試料および 25°C '2ヶ月後の試料の、会合体 含有率を示した。 25°C '6力月の会合体増加分は、安定化剤を含まなレ、 AF1において は 0.51%会合体が増加したのに対して、メダルミンを安定化剤として含む AF2において は会合体の増加は 0.26%に抑制することができ、アルギニンを安定化剤として含む AF 3においては会合体の増加は 0.27%であったことから、アルギニンと比較してメダルミン は同等以上の安定化効果を有することが示された。また、実施例 3と同様において示 されたように、 120mg/mLからなる高濃度のヒト化二重特異性抗体 hA69_KQ / hB26_ PF I hAL-AQ溶液においてもメダルミンは安定化効果を有することが示された。また 、メグノレミンは IgG、 sc(Fv)2のみならず、 bispedfic IgGにおいても安定化効果を有する ことが示されたことから、広くタンパク質の安定化剤として使用することが可能である。 以下、本発明の sc(Fv)2抗体（hVB22B、 mVB22B、 2D7)の作成方法について、参考 例を例示するが、本発明はこれら参考例に制限されるものではない。
[0096] 〔参考例 1〕 抗ヒト Mpl抗体の作製
1.1 Mpl発現 BaF3細胞株の樹立
TPO依存増殖性細胞株を得るために、全長 Mpl遺伝子を発現する BaF3細胞株の 樹立を行った。
全長ヒト Mpl cDNA (Palaciosら、 Cell 1985 ;41 : 727-734) (GenBank#NM— 005373)を P CRにより増幅し、 pCHOI(Hirataら、 FEBS Letter 1994 ; 356 : 244-248)の DHFR遺伝子 発現部位を除去し、 HEF-VH-g γ l(Satoら、 Mol Immunol. 1994 ; 31 : 371-381)の Neo mycin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクター pCOS2にクローユングし、 pCOS 2-hMplilillを構築した。
[0097] また、力二クイザル骨髄細胞力 抽出した Total RNAから SMART RACE cDNA Amp lification Kit (Clontech社製)を用いて、力二クイザル Mpl cDNA (配列番号： 7)をクロ 一二ングした。得られた力二クイザル cDNAを pCOS2に挿入、 pCOS2-monkeyMplilill を構築した。
さらに、全長マウス Mpl cDNA(GenBank#NM_010823)を PCRにより増幅し、 pCOS2に 揷入し、 pCOS2-mouseMpli illを構築した。
[0098] 作製した各ベクター (20 μ g)を PBSに懸濁した BaF3細胞 (lxl07cells/mL)に混合し、 Gene Pulserキュベットに加え、 Gene Pulser II (Bio-Rad社製)を用いて 0.33kV, 950 μ FDの容量でパルスを加えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入した Ba F3細胞を Ing/mLマウスインターロイキン 3 (以下、 mIL- 3、 P印 rotech社製）、 500 μ g/m L GeneticinGnvitrogen社製)、 10% FBS(Invitrogen社製)を含む RPMI1640培地（Invitro gen社製）に加えて選抜し、ヒト Mpl発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3_human Mpl)、サル Mpl発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3_monkey Mpl)およびマウス Mpl発現 BaF3細胞株（ 以下、 BaF3-mouse Mpl)を樹立した。選抜後は、 Ing/mL rhTPO(R&D社製)、 10% FB Sを含む RPMI1640培地を用いて培養、維持した。 [0099] 1.2 Mpl発現 CHO細胞株の樹立
Flow Cytometryを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長 Mpl遺伝子 を発現する CHO細胞株の樹立を行った。
はじめに、 pCXN2(Niwaら、 Gene 1991 ; 108： 193-199)の Hindlll部位に pCHOIの DH FR遺伝子発現部位を揷入して、発現ベクター pCXND3を作製した。 pCOS2_hMplfull 、 pCOS2-monkeyMplf illおよび pCOS2- mouseMplflillを铸型にして、 His- tag配列を含 むプライマーを用いて PCRにより増幅した各 Mpl遺伝子を pCXND3にクローニングし、 pCXND3- hMp卜 His、 pCXND3- monkey Mp卜 Hisおよび pCXND3- mouse Mpト Hisを 構築した。
[0100] 作製した各ベクター (25 μ g)を PBSに懸濁した CHO-DG44細胞 (lxl07cells/mL)に 混合し、 Gene Pulserキュベットに加え、 Gene Pulser II (Bio-Rad社製)を用いて 1.5kV, 25 μ FDの容量でパルスを加えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入し た CHO細胞を 500 μ g/mL Geneticin, lxHT (Invitrogen社製)を含む CHO-S-SFMII 培地 (Invitrogen社製)に加えて選抜し、ヒト Mpl発現 CHO細胞株（以下、 CHO-human Mpl)およびサル Mpl発現 CHO細胞株（以下、 CHO-monkey Mpl)およびマウス Mpl発 現 CHO細胞株（以下、 CHO-mouse Mpl)を樹立した。
[0101] 1.3 可溶型ヒト Mplタンパク質の調製
可溶型ヒト Mplタンパク質を調製するため、昆虫細胞 Sf9細胞で分泌産生する発現 系を以下のように構築した。
ヒト Mplの細胞外領域（Gln26から Trp491)の下流に FLAGタグを付加した遺伝子を 作製し、 pBACSurf-1 Transfer Plasmid (Novagen社製）の Pstl- Smal部位に揷入し、 pB ACSurfl- hMpト FLAGを作製した。続いて、 Bac- N- Blue Transfection Kit (Invitrogen )を用いて、 4 μ gの pBACSurfl_hMpト FLAGを Sf9細胞に導入した。培養 3日後に培養 上清を回収し、プラークアツセィにより組換えウィルスを単離した。ウィルスストックを 調製後に Sf9細胞に感染させて培養上清を回収した。
[0102] 得られた培養上清を用いて、以下のように可溶型ヒト Mplタンパク質を精製した。培 養上清を Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences社製)に吸着させた後に、 5 OmM Na-Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 500mM NaCl (pH 7.2)を用いて溶 出した。溶出液を FLAG M2 -Agarose (SIGMA-ALDRICH社製)に吸着させた後に、 1 OOmM Glycine-HCl, 0.01%(v/v) Tween20 ( H 3.5)を用いて溶出した。溶出後、直ち に 1M Tris-Cl (ρΗ8·0)により中和し、 PD-10 column (Amersham Biosciences社製)を 用いて、 PBS(-), 0.01% (v/v) Tween20に置換を行った。精製した可溶型 Mplタンパク 質を shMp卜 FLAGと称する。
[0103] 1.4 ヒト MpHgG Fc融合タンパク質の調製
ヒト MpHgG Fc融合タンパク質遺伝子は、 Bennettらの方法 (Bennettら、 J.Biol.Chem . 1991 ; 266 : 23060-23067)に従って作製した。ヒト Mplの細胞外領域 (Gln26から丁卬49 1)をコードする塩基配列をヒ HgG- γ 1の Fc領域 (Asp216よりの下流の領域）をコード する塩基配列に連結し、連結部に Fusion Linkerとして BstEII配列（アミノ酸 Va卜 Thr) を付加した。シグナル配列は、ヒ HgG H鎖可変領域のシグナルペプチド 19アミノ酸を 使用した。得られたヒト MpHgG Fc融合タンパク質遺伝子を pCXND3にクローニング し、 pCXND3_hMp卜 Fcを構築した。
[0104] 作製したベクター (25 μ g)を PBSに懸濁した CHO-DG44細胞 (lxl07cells/mL)に混 合し、 Gene Pulserキュベットに加え、 Gene Pulser II (Bio-Rad社製)を用いて 1.5kV, 2 5 μ FDの容量でパルスを加えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入した CHO細胞を 500 μ g/mL Geneticin, ΙχΗΤを含む CHO-S-SFMII培地に加えて選抜し 、 shMPL_Fc発現 CHO細胞株（CHO_hMp卜 Fc)を樹立した。
得られた培養上清を用いて、以下のようにヒト MpHgG Fc融合タンパク質を精製し た。
[0105] 培養上清を Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences社製)に吸着させた後 に、 50mM Na-Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 1M NaCl (pH 7.6)を用いて溶 出した。溶出液を HiTrap proteinG HPカラム（Amersham Biosciences社製）に吸着さ せた後に、 0.1 M Glycine-HCl, 150 mM NaCl, 0.01%(v/v) Tween20 (pH 2.7)を用い て溶出した。溶出後、直ちに 1M Tris-Cl (pH8.0)により中和し、 PD- 10 column (Amers ham Biosciences社製)を用いて、 PBS (-)， 0.01% (v/v) Tween20に置換を行った。精製 した可溶型 Mplタンパク質を hMp卜 Fcと称する。
[0106] 1.5 shMp卜 FLAGまたは BaF3-human Mplの免疫およびハイプリドーマの選抜 MRL/MpJUmmCrj— lpr/lprマウス（以下、 MRL/lprマウス、 日本チヤーノレス'リバ一よ り購入）を用いて、 8週齢より免疫を開始した。初回免疫は 100 z g/匹の shMPL-FLAG にフロイント完全アジュバント（H37 Ra、ベタトン'ディッキンソン社製）を加え、ェマル ジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は 50 μ g/匹の shMPL-FLAGにフロイン ト不完全アジュバント（ベタトン'ディッキンソン社製）を加え、ェマルジヨン化したものを 皮下に投与した。合計 6回免疫を行ったマウス 3匹に対し、 50 z g/匹の shMPL-FLAG を尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞 P3-X63Ag8 Ul (P3U1、 ATCCより購入）とマウス脾臓細胞を混合し、 Polyethylene Glycol 1500 (Ro che Diagnostics社製）を加えながら混合することにより細胞融合を行った。翌日より H AT培地を用いて選抜を行レ、、培養上清を用いて shMp卜 FLAGまたは hMpト Fcを固相 ィ匕したィムノプレートを用いた ELISAおよび BaF3-human Mplを用いた細胞増殖活性 を指標としたスクリーニングを実施した。また、 BaF3-human Mplを Balb/Cマウスに 1.0 X 107細胞ずつ 1週間から 5ヶ月の間隔で腹腔内投与し、合計 11回免疫した。同様に 細胞融合によりハイプリドーマを作製し、 BaF3-human Mplを用いた細胞増殖活性を 指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希釈法によりモノ クローン化した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。
[0107] 1.6 抗ヒト Mpl抗体の解析
抗体濃度はャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED社製)とアルカリフォスファターゼ - ャギ抗マウス IgG (gamma)(ZYMED社製)を用いたマウス IgGサンドイッチ ELISAを行い 、 Isotypeの等しい巿販抗体をスタンダードにして、 GraphPad Prism (GraphPad Softwa re, USA)を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。
[0108] 抗体のアイソタイプは、アイソタイプ特異的な二次抗体を用いた抗原依存的 ELISA にて決定した。 hMp卜 Fcを 1 μ g/mLとなるように coating buffer (O.lmM NaHCO (pH9.
3
6), 0.02%(w/v) NaN )で希釈したものを加え、 4°Cにてー晚反応し、コーティングした。
3
Diluent buffer (50mM Tris-HCl(pH8.1), ImM MgCl , 150mM NaCl, 0.05%(v/v) Twee
2
n20, 0.02%(w/v) NaN， l%(w/v) BSA)にてブロッキング処理を行った後、ハイプリドー
3
マの培養上清を加え、室温で 1時間放置した。 Rinse buffer (0.05%(v/v) Tween20, PB S)にて洗浄した後、 Alkaline phosphatase標識したアイソタイプ特異的二次抗体を加 え、室温で 1時間放置した。発色は SIGMA104(SIGMA-ALDRICH社製)を lmg/mLと なるように Substrate Buffer (50mM NaHCO (pH9.8)， lOmM MgCl )に希釈したものを 用レ、、 405nmの吸光度を Benchmark Plus (Bio_Rad社製）にて測定した。
[0109] shMp卜 FLAGおよび hMPL-Fcに対する結合活性は、 ELISAにより評価した。精製し た shMpト FLAGおよび hMPL-Fcを 1 μ g/mLになるようにコーティングし、 Diluent buffe rにてブロッキング処理を行った。ハイプリドーマの培養上清をカ卩え、室温で 1時間放 置した後、 Alkaline Phosphatase標識した抗マウス IgG抗体（Zymed社製）を加え、上記 方法と同様に発色を行った。室温で 1時間発色させた後に 405nmの吸光度を測定し、 GraphPad Prismを用いて EC 値を算出した。
[0110] CHO- human Mpほたは CHO- monkey Mplを回収し、 lxl06cells/mLになるように FA CS Buffer (1% FBS/ PBS)に懸濁した。 100 μ L/wellとなるように Multiscreen (Millipore 社製)に分注し、遠心操作にて培養上清を除去した。 5 x g/mLになるように希釈した 培養上清を加え、氷上にて 30分間反応させた。細胞を FACS bufferにて 1回洗浄し、 F ITC標識抗マウス IgG抗体（Beckman Coulter社製）を添加し、氷上にて 30分間反応さ せた。反応後、 500卬 mで 1分間遠心し、上清を除き、 FACS Buffer 400 μ Lに懸濁し、 EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter)を用いてフローサイトメトリーを行った。前方散 乱光（forward scatter)及び側方散乱光（side scatter)のヒストグラムにて生細胞集団 にゲートを設定した。
[0111] 抗体のァゴニスト活性は、 TPO依存性増殖を示す BaF3-human Mpほたは BaF3_mo nkey Mplを用いて評価した。各細胞をそれぞれ 4xl05cells/mLとなるように 10% Fetal Bovine SerumGnvitrogen社製)を含む RPMI1640(Invitrogen社製)に懸濁し、 60 μ L/we 11で 96well plateに分注した。 rhTPO (R&D社製)およびハイプリドーマ培養上清の濃度 を振り、各 wellに 40 μ Lカロえ、 37°C、 5%CO条件下で、 24時間培養した。 10 μ L/wellで
Cell Count Reagent SF (ナカライテスタ社製)を加え、 2時間培養後に、 450 nmの吸光 度 (対照 655nm)を Benchmark Plusにて測定し、 GraphPad Prismを用いて EC 値を算 出した。
これらの解析により、ヒト Mplに結合するマウスモノクローナル抗体を合計 163個取得 した。 以下に記載する抗ヒト Mpl抗体の中で、 TA136は BaF3_human Mpl免疫マウスより樹 立され、それ以外の抗体は shMp卜 Flag免疫マウスより樹立した。
[0112] 1.7 抗ヒト Mpl抗体の精製
ノ、イブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒト Mpl抗体を精製した。
培養上清を HiTrap proteinG HPカラム（Amersham Biosciences社製）に吸着させた 後に、 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7)を用いて溶出した。溶出後、直ちに 1M Tris-Cl (p H9.0)により直ちに中和し、 PBSで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。
[0113] 1.8抗ヒト Mpl抗体 VB22Bのェピトープの決定
抗ヒト Mpl抗体 VB22B力 Western blottingに使用可能である性質を利用し、ヒト Mplの 部分配列と GSTの融合蛋白質を構築し VB22Bのェピトープ解析を行った。 MG1 (Gin 26から TYp491)、 MG2 (Gln26から Leu274)の領域をそれぞれ PCR増幅し、 GST融合蛋 白質として発現されるように PGEX-4T-3 (Amersham社）へクローニングした。プラスミ ド DNAを DH5 aへ導入し形質転換体を得、対数増殖期にある形質転換体に ImMと なるように IPTGをカ卩えることにより GST融合蛋白質の発現を誘導し、 2時間培養後に 菌体を回収した。 Sonicationにより破砕後、 XL-80 Ultracentriilige (Beckman, Rotor 7 O. ITi)を用い 35, 000卬 mで 30分遠心後の培養上清を回収し、 GST Purification Modul es (Amersham社)を用いて精製した。 10%-SDS-PAGEにより分離後、 PVDF膜にトラン スファーし、 VB22Bマウス抗体を用いた western blottingを行った。 VB22Bは MG- 1、 M G-2を認識した事から、 VB22Bのェピトープは Gln26から Leu274の領域にあることが判 明した。
[0114] 次に、 MG3 (Gln26力も Alal89)、 MG4 (Gln26から Prol06)、 MG5 (Gln26から Glu259) 、 MG6 (Gln26から Gly245)の領域と GSTの融合蛋白を作製し同様に western blotting を行った結果、 VB22Bは MG5、 MG6を認識した力 MG3、 MG4を認識しなかった事か ら、 VB22Bのェピトープは Alal89から Gly245の周辺に存在する事が予想された。さら に MG7 (Gln26から Ala231)、 MG8 (Gln26から Pro217)と GSTの融合蛋白質を作製し評 価した結果、 VB22Bは MG7を認識した力 MG8は認識しなかった事から、 VB22Bのェ ピトープは Gln217力も Ala231の周辺に存在することが示された。さらに MG10 (Gln213 から Ala231)と GSTの融合蛋白質との結合が確認されたことから、 VB22Bのェピトープ は Gln213力も Ala231の 19アミノ酸に限定された。
[0115] 1.9 抗ヒト Mpl抗体 VB22Bの抗原抗体反応の反応速度論的解析
抗ヒト Mpl抗体 VB22Bが可溶型組換え Mplに結合する性質を利用し、実施例 1.4で 示したヒト MpHgG Fc融合タンパク質と VB22B IgGとの抗原抗体反応における速度論 的な解析を行った。 Biacore 2000(Biacore社製)に Sensor Chip CM5(Biacore社製)を セットし、ァミンカップリング法にてヒト MpHgG Fc融合タンパク質を固定化した。次に 、 HBS-EP BuffeKBiacore社製)を用いて 1 ·25〜20 μ g/mLの VB22B IgGを調製し、 VB 22B IgGを 2分間添加し、結合領域を得た後に、 HBS-EP Bufferを 2分間添加すること で解離領域を得た。 Sensor Chip上のヒト MpHgG Fc融合タンパク質に結合した VB22 B IgGは、 10mM NaOHを 15秒間添加して除去し、 Sensor Chipを再生した。ランニング ノくッファーとして HBS-EP Bufferを用い、流速は 20 μ L/minとした。 BIAevaluation ver .3.1ソフトウェア (Biacore社製)を用いて、各濃度で得られたセンサーグラムより反応速 度定数を算出した。その結果、 VB22B IgGの解離定数（KD)は 1.67 ± 0.713 X 10— 9M であった。
[0116] 〔参考例 2〕 抗ヒト Mpl—本鎖抗体の作製
取得した抗ヒト Mpl抗体の中で、結合活性およびァゴニスト活性が高かった 23種類 の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。以下に 抗ヒト Mpl抗体 VB22Bの一本鎖抗体作製例について示す。
[0117] 2.1 抗ヒト Mpl抗体可変領域のクローニング
抗ヒト Mpl抗体を産生するハイブリドーマより抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR 法によって増幅した。 Total RNAは、 RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN社製）を用いて lxlO7細胞のハイプリドーマより抽出した。
1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTEC H社製）を用いて、マウス IgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチド MH C-IgG2b (配列番号： 8)またはマウス κ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴ ヌクレオチド kappa (配列番号： 9)を用いて、 5'末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写 反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させた。
[0118] PCR反応溶液 (50 /i L)の組成を次に示す。 5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix,
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれも CLONTECH社製）、
2.5 z Lの逆転写反応産物、
lOpmolの合成オリゴヌクレオチド MHC_IgG2bまたは kappa
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。
PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル 力ら精製した後、 pGEM-T Easyベクター（Promega社製）へクローニングした。さらに、 ABI 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer社製)を用いて塩基配列を決定した。
[0119] クローニングした VB22B H鎖可変領域（以下、 VB22B-VH)の塩基配列を配列番号 ： 10、アミノ酸配列を配列番号： 11、および L鎖可変領域（以下、 VB22B-VL)の塩基 配列を配列番号： 12、アミノ酸配列を配列番号： 13に示す。
[0120] 2.2 抗ヒト Mpl抗体 Diabody発現ベクターの作製
5アミノ酸からなるリンカ一配列を用いた VB22B—本鎖 Fv (以下、 VB22B Diabody)を コードする遺伝子は、 VB22B-VHをコードする遺伝子の 3'末端および VB22B-VLをコ ードする遺伝子の 5'末端に（Gly Ser)力 成るリンカ
4 1 一をコードする塩基配列を付カロ させた遺伝子について、それぞれ PCR法を用いて増幅し、連結することにより構築し た。
[0121] VB22B-VHの前方プライマー 70 ' 115HF (配列番号： 14)は、 EcoRI部位を有するよ うに設計し、 VB22B-VHの後方プライマー 33 ' 115HR (配列番号： 15)は、 VB22B-VH の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、かつ（Gly Ser)力 成るリンカ一をコー ドする塩基配列ならびに VB22B-VLの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする 塩基配列を有するように設計した。 VB22B-VLの前方プライマー 33 -115LF (配列番 号： 16)は、 VB22B-VLの N末端をコードする塩基配列ならびに（Gly Ser)から成るリ
4 1 ンカーをコードする塩基配歹 1J、 VB22B-VHの C末端をコードする塩基配列を有するよ うに設計した。 VB22B-VLの後方プライマー 33'115LR (配列番号： 17)は、 VB22B-V Lの C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、かつ FLAGタグ (AspTyrLysAspAsp A spAspLysZ配列番号： 18)をコードする塩基配列を有し、さらに Notl部位を有するよう IX十し/
[0122] 第一 PCRにおいて、 VB22B-VHおよびリンカー配歹 IJと VB22B-VLおよびリンカ一配 列を含む 2つの PCR反応物を以下のように合成した。
PCR反応溶液 (50/i L)の組成を次に示す。
5/i L( 10XPCR Buffer,
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ,
2.5ュニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
10ngの VB22B- VHまたは VB22B- VL遺伝子を含む pGEM- T Easyベクター、 lOpmolの合成オリゴヌクレオチド 70'115HF、 33· 115HRまたは 33· 115LF、 33-115 し R
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0123] 約 400bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、各 PCR産物の一部を用いて以下のように第二 PCRを行 つた。
PCR反応溶液 (50/i L)の組成を次に示す。 5 z L(D10 X PCR Buffer,
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
1 μ Lの第一 PCR産物（2種類)、
lOpmolの合成オリゴヌクレオチド 70 · 115HF、 33 - 115LR
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0124] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）および制限酵素 Notl (宝 酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて 精製し、 pCXND3にクローニングし、 pCXND3-VB22B dbを作製した。
[0125] 2.3 抗ヒト Mpl抗体 sc(Fv)2発現ベクターの作製
VB22B由来の 2つの H鎖可変領域および 2つの L鎖可変領域を含む改変抗体 [sc(Fv )2]を発現するプラスミドを作製するために、前述の pCXND3_VB22B dbを用いて以下 のように PCR法により修飾した。
[0126] はじめに、 VB22B-VHをコードする遺伝子の 3'末端および VB22B-VLをコードする 遺伝子の 5'末端に 15アミノ酸から成るリンカ一（Gly Ser)をコードする塩基配列を付 カロさせた遺伝子について、それぞれ PCR法を用いて増幅し、連結することにより構築 した。この構築過程において、 3種類のプライマーを新たに設計した。 VB22B- VHの 前方プライマー VB22B-fpvu (プライマー A，配列番号： 19)は、 5'末端に EcoRI部位を 有し、 VB22B dbの Gln22および Leu23が PvuII部位に変換するように設計した。 VB22B -VHの後方プライマー sc_rL15 (プライマー B,配列番号： 20)は、 VB22B- VHの C末 端をコードする DNAにハイブリダィズし、かつ（Gly Ser)力ら成るリンカ一をコードする 塩基配列ならびに VB22B-VLの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする塩基配 列を有するように設計した。 VB22B-VLの前方プライマー sc_fL15 (プライマー C，配列 番号： 21)は、 VB22B-VLの N末端をコードする塩基配列ならびに（Gly Ser)力も成る
4 3 リンカ一をコードする塩基配歹 |J、 VB22B-VHの C末端をコードする塩基配列を有する ように設計した。
[0127] 第一 PCRにおいて、 VB22B-VHおよびリンカ一配列と VB22B-VLおよびリンカ一配 列を含む 2つの PCR反応物を以下のように合成した。
PCR反応溶液 (50 /i L)の組成を次に示す。
5 /i L( 10 X PCR Buffer,
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ,
2.5ュニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
10ngの pCXND3-VB22B db、
lOpmolの合成オリゴヌクレオチド VB22B_fpvu、 sc_rL15または sc_fL15、 33 - 115LR (プライマー D)
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0128] 約 400bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、各 PCR産物の一部を用いて以下のように第二 PCRを行 つた。
PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 z L(D10 X PCR Buffer,
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ュニットのDNAポリメラーゼTaKaRa Ex Taq (以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
1 μ Lの第一 PCR産物（2種類)、
lOpmolの合成オリゴヌクレオチド 70 · 115HF、 33 - 115LR
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0129] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製）および制限酵素 Notl (宝 酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて 精製し、 pBacPAK9(CLONTECH社製)にクローニングし、 pBacPAK9_scVB22Bを作 製した。
[0130] 次に、 pBacPAK9_scVB22Bの PvuII部位に挿入する断片を作製した。すなわち N末 端が欠けた VB22B-VHと VB22B-VLを（Gly Ser)力 成るリンカ一で連結したアミノ酸
4 3
をコードする遺伝子をさらに VB22B-VHの N末端をコードする遺伝子と（Gly Ser)力
4 3 成るリンカ一をコードする塩基配列で連結する断片で、両末端が PvuII認識配列とな る断片である。 2種類のプライマーを新たに設計し、 PCR法を用いて、この断片を作製 した。 目的断片の前方プライマー Fv2-f (プライマー E，配列番号： 22)は、 5'末端に Pv ull部位を有し、 VB22B- VHの 5'末端側の配列を持つように設計した。 目的断片の後 方プライマー Fv2-r (プライマー F，配列番号： 23)は、 VB22B-VLの C末端をコードす る DNAにハイブリダィズし、かつ（Gly Ser)力も成るリンカ
4 3 一をコードする塩基配列な らびに VB22B-VHの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする塩基配歹 1J、さらに P vull部位を有するように設計した。 pBacPAK9_scVB22Bを铸型にして、以下のように P CRを行った。
PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 /i L( 10 X PCR Buffer, 0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分はいずれも宝酒造社製）、
10 μ gの pBacPAK9— scVB22B、
lOpmolの合成オリゴヌクレオチド Fv2- f、 Fv2-r
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復、
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0131] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、 pGEM-T Easyベクター（Promega社製）へクローニングし た。塩基配列の決定後、制限酵素 PvuII (宝酒造社製)で消化した後に、 目的断片を 回収した。 pBacPAK9_scVB22Bを制限酵素 PvuII (宝酒造社製）で消化した後に、回 収した断片を連結し、 pBacPAK9-VB22B sc(Fv)2を作製した。作製したベクターを制 限酵素 EcoRI (宝酒造社製）および制限酵素 Notl (宝酒造社製)で消化した後に、 QI Aquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 1600bpの断片をァガロース ゲルから精製し、発現ベクター pCXND3にクローニングし、 pCXND3-VB22B sc(Fv)2 を作製した。
[0132] 2.4 動物細胞を用いた抗ヒト Mpl—本鎖抗体の発現
CHO-DG44細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして 行った。 Gene Pulserll (BioRad社製）を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子 導入した。発現ベクター (25 μ g)と PBSに懸濁した CHO-DG44細胞（1 X 107細胞/ mL )の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロボレ ーシヨン処理された細胞を、 500 μ g/mL Geneticin (Invitrogen社製）を含む CHO-S-S FMII培地（Invitrogen社製）に加えて選抜し、発現 CHO細胞株を樹立した。 VB22B sc (Fv)2は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。
[0133] COS7細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現べクタ 一 (10 μ g)と PBSに懸濁した C0S7細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合したものを 氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与 えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 1 0% FBSを含む DMEM培地（Invitrogen社製）にカロえ、ー晚培養した後に、 PBSで洗浄 後に CHO-S-SFMII培地を加えて約 3日間培養した。 VB22B Diabodyは、この方法で 培養上清を調製した。
[0134] 2.5 培養上清中の抗ヒト Mpl—本鎖抗体の定量
COS細胞に一過性発現させた抗ヒト Mpl—本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面 プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわち Biacore 2000(Biacore社製)に Sensor C hip CM5 (Biacore社製）をセットし、 ΑΝΉ- FLAG M2 Monoclonal Antibody (SIGMA- A LDRICH社製)を結合した。流速 5mL/secで適濃度のサンプルを流し、 50mMジェチル アミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質量変化を測定 し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を算出した。 Diabo dyについての標準品は、 dbl2E10(WO02/33073、 WO02/33072参照)を使用し、 sc(F v)2についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ 12E10 sc(Fv)2を使用した。
[0135] 2.6 抗ヒト Mpl Diabodyおよび一本鎖抗体の精製
VB22B Diabody発現 C0S7細胞あるいは CH0細胞の培養上清を、 50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡化した Anti- Flag M2 Affinity Gel (SIG MA-ALDRICH社製)カラムに吸着させ、 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)で溶出させた 。溶出画分は、直ちに 1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行レ、、 HiLoad 26/60 Superdex2 00pg (Amersham-Bioscience社製)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った 。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファ一は、 PBS、 0.01% Tween20を使用した。
[0136] VB22B sc(Fv)2発現 COS7細胞あるいは CHO細胞の培養上清を、 Diabody精製と同 一条件で精製を行った。また、大量に調製する場合には、 CHO細胞の培養上清を 20 mMリン酸緩衝液（pH6.8)で平衡ィ匕した Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I (Bio-Rad社製)カラムにかけ、 250mMリン酸緩衝液 (pH6.8)で段階的に溶出した。溶 出画分は、限外ろ過膜を用いて濃縮後、 HiLoad 26/60 Superdex200pgカラムを用い てゲルろ過クロマトグラフィーを行レ、、分子量が約 40kD〜70kDに相当する画分を分 取した。この画分を、 50 mM Tris-HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡 ィ匕した Anti- Flag M2 Affinity Gelカラムに吸着させ、 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)で 溶出させた。溶出画分は、直ちに 1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行レ、、 HiLoad 26/60 Superdex200pgカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマト グラフィ一のバッファ一は、 20 mM酢酸緩衝液（pH6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。各精製ステップにおいて、 Diabodyおよび sc(Fv)2の確認は、 SDS-PA GEおよび抗 Flag抗体（SIGMA-ALDLICH社）を用いた Western Blottingを用いて行な つた。それぞれ、分取したピーク画分を Laemliの方法に準じて電気泳動し、クマシ一 ブリリアントブルーで染色した結果、 Diabodyでは、見かけ上の分子量約 29kDaに、ま た sc(Fv)2では、見かけ上の分子量約 55kDaに、それぞれ単一のバンドが検出された
[0137] 2.7 Flow Cytometryによる抗ヒト Mpl—本鎖抗体の結合活性の評価
CHO-human Mpl、 CHO-monkey Mplおよび CHO_mouse Mplを回収し、 lxl06cells /mUこなるように FACS Buffer (1% FBS/ PBS)に懸獨した。 100 μ L/wellとなるように Mu ltiscreen - HV Filter Plates (Millipore社製）に分注し、遠心操作にて上清を除去した 。適濃度の Diabodyまたは sc(Fv)2を加え、氷上にて 30分間反応させた。細胞を 200 μ Lの FACS bufferにて 1回洗浄し、 10 μ g/mLの ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody (SIGMA-ALDRICH社製）を添加し、氷上にて 30分間反応させた。次に 200 z Lの FA CS bufferにて細胞を 1回洗浄した後、 100倍希釈した FITC標識抗マウス IgG抗体（Bee kman Coulter社製）を添カ卩し、氷上にて 30分間反応させた。最後に遠心し上清を除き 、 FACS Buffer 400 μ LJこ懸獨し、 EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter社)を用レヽて Fl ow Cytometryに供した。前方散乱光（forward scatter)及び側方散乱光（side scatter )のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。
[0138] 精製した VB22B sc(Fv)2を用いて、各種 Mplを発現させた CHO細胞に対する結合 活性を評価した。宿主細胞である CHOおよび CHO-mouse Mplに対しては結合活性 を示さず、 CHO-human Mplおよび CHO-monkey Mplに特異的に結合することが確 認された。この結合活性の傾向は、 VB22B IgGと変わらないことから、低分子化により 抗体の結合部位は変化してレ、なレ、ことが推測された。
[0139] 2.8 抗ヒト Mpl—本鎖抗体のヒトイ匕
VB22B sc(Fv)2のヒトイ匕を実施するために、公開されている Kabat Database (ftp: //ft p. ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)より抗体の配列データを入手し、 H鎖可変領域、 L鎖可変領域に分けてホモロジ一検索を行った。その結果、 H鎖可変領域は DN13(S mithsonら、 Mol Immunol. 1999 ; 36 : 113-124)と高い相同性を持つことが分かった。ま た、 L鎖可変領域は ToP027(Hougsら、 J. Immunol. 1999； 162： 224-237)と高い相同性 を持つことが分かった。これらの抗体のフレームワーク領域 (以下、 FR)に相補性抗原 決定領域 (以下、 CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。ヒト化抗体 sc(Fv)2を CHO- DG44細胞にて発現させ、 BaF3-human Mplを用いたァゴニスト活性を評価した。ァゴ 二スト活性を指標に、 FR内にアミノ酸置換をカ卩え、マウス型 VB22B sc(Fv)2と同等のァ ゴニスト活性を有するヒト化 VB22B sc(Fv)2を作製した。
[0140] 具体的には、 50base程度の合成オリゴ DNAを約 20base程度ハイブリダィズするよう に設計し、これらの合成オリゴ DNAを PCR法によりアッセンブリさせて各可変領域をコ ードする遺伝子を作製した。これらの遺伝子を用いて、実施例 2.3の方法と同様に、 s c(Fv)2を作製し、発現ベクター pCXND3にクローユングし、ヒト化 VB22B sc(Fv)2を揷 入した各発現ベクター PCXND3- hVB22B p-z sc(Fv)2、 pCXND3-hVB22B g- e sc(Fv) 2、 pCXND3-hVB22B e sc(Fv)2、 pCXND3_hVB22B u2— wz4 sc(Fv)2、 pCXND3_hVB 22B q-wz5 sc(Fv)2を作製した。本プラスミドに含まれる hVB22B p-z sc(Fv)2の塩基配 列を配列番号： 24に、アミノ酸配列を配列番号： 25に、 hVB22B g_e sc(Fv)2の塩基 配列を配列番号： 26に、アミノ酸配列を配列番号： 27に、 hVB22B e sc(Fv)2の塩基 配列を配列番号： 28に、アミノ酸配列を配列番号： 29に、 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の 塩基配列を配列番号： 30に、アミノ酸配列を配列番号： 1に、 hVB22B q_wz5 sc(Fv)2 の塩基配列を配列番号： 31に、アミノ酸配列を配列番号： 32に示す。またマウス型 V B22B sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 33に、アミノ酸配列を配列番号： 2に示す。実 施例 2.4の方法と同様に CHO-DG44細胞に発現させ、培養上清を回収した。ヒト化 V B22B sc(Fv)2は Flagタグを付加していないことから、培養上清からの精製は、実施例 1.8に記載した VB22Bが認識するェピトープである MG10(Gln213から Ala231)と GST融 合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製は、 Glutathione Sephar ose 4B (Amersham Biosciences社製）を用レヽて、メーカーのプロトコ一ノレに従って精製 した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーのプロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固定ィ匕し、ァフィ二ティカ ラムを作製した。ヒト化 VB22B sc(Fv)2発現 CHO細胞の培養上清を、 50mM Tris-HCl( pH7.4), 150mM NaCl, 0.01% Tween80で平衡化した MG10-GST融合蛋白質固定化 カラムに流し、ヒト化 VB22B sc(Fv)2を吸着させ、 lOOmM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% T ween80で溶出させた。溶出画分は直ちに 1M Tris_HCl(pH7.4)で中和を行レ、、 HiLoa d 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosciences社製）を用いてゲルろ過クロマトグラ フィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20mMクェン酸緩衝液（pH7. 5) , 300mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。
[0141] 〔参考例 3〕2D7 sc(Fv)2型 DIABODY発現ベクターの作製
WO2004/033499に記載した通り、 HLAクラス Iに対する抗体 2D7モノクローナル抗体 を、重鎖および軽鎖可変領域を 5merのリンカ一で接続した低分子抗体（2D7 diabody )に改変することにより、ミエローマ細胞に対する細胞死誘導活性が劇的に上昇した ことを既に示した。そこで、この 2D7diabodyを、構造的により安定であると考えられる s c(Fv)2型に改変し、細胞死誘導活性を従来型 diabody(HL5)と比較検討した。
[0142] まず、 2D7抗体の重鎖可変領域配列（VH)と軽鎖可変領域配列（VL) 、 VH-VL- VH-VLの並びになるように、それぞれを 15merのリンカ一（GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGl yGlySer GlyGlyGlyGlySer)で接続した 2D7 sc(Fv)2をコードする DNA発現ベクターを 以下の手順で作製した。
[0143] WO2004/033499に記載の方法で作成した、 VH-VLを 5merのリンカ一（GlyGlyGlyG lySer)で連結した 2D7diabody(HL5)発現ベクターを鎳型にして、プライマー 2D7DBH1 (配列番号： 34)、プライマー 2D7PA2 (配列番号： 35)で PCR反応を行レ、、断片 Aを増 幅した。同様に、プライマー 2D7PA3 (配列番号： 36)、プライマー 2D7PA5 (配列番号 : 37)で PCR反応を行い、断片 Bを増幅した。ここで得られた断片 A及び断片 Bを、同 一チューブ内で混合し、 PCR-recombination反応を行うことで、断片 Aと断片 Bを連結 させた。これにより、 N末に VHのシグナル配列を含み、 VH-VLが 15merのリンカ一で 連結した DNA断片 "2D7diabodyHL15_l"を得た。
[0144] 続レ、て、 2D7diabody(HL5)発現ベクターを鎳型にして、プライマー 2D7PA6 (配列番 号： 38)、プライマー 2D7PA2 (配列番号： 35)で PCR反応を行レ、、断片 Cを増幅した。 同様に、プライマー 2D7PA3 (配列番号： 36)、プライマー 2D7DBL2 (配列番号： 39) で PCR反応を行い、断片 Dを増幅した。ここで得られた断片 C及び断片 Dを同一チュ ーブ内で混合し、 PCR-recombination反応により、 2つの断片を連結させた。この操 作によって、 VH- VLが 15merのリンカ一で連結し、 C末に Flag-tag領域を含む DNA断 片 "2D7diabodyHL15_2"を得た。
[0145] 上記反応により得られた 2つの DNA断片、すなわち "2D7diabodyHL15_ ' DNA断 片、及び、 "2D7diabodyHL15_2" DNA断片を、それぞれ EcoRI_BamHI、及び、 BamH ト Notlで切断し、両 DNA断片をあらかじめ EcoRト Notlで切断し開裂した発現ベクター PCXND3に挿入した。インサート DNAの塩基配列を解析し、 目的どおり signa卜 VH(15) VL(15)VH(15)VL_Flagをコードする cDNAが、 pCXND3の EcoRI-Notl間に挿入されて レ、ることを確認し、 2D7sc(Fv)2発現ベクター (pCXND3_2D7sc(Fv)2)の構築を終了した 。 2D7sc(Fv)2の塩基配列を配列番号: 40に、アミノ酸配列を配列番号: 4に示す。
[0146] 〔参考例 4〕 2D7sc(Fv)2産生発現細胞株の樹立
Pvulで切断し直鎖化した pCXND3_2D7sc(Fv)2 20 μ gを CHO細胞（DG44株）に以 下のように electroporation法により導入した。
CHO-S-SFM-Π培地（インビトロジェン）で培養した DG44細胞を ice-cold PBSで 2回 洗浄した後 1X10ソ mlになるように PBSに懸濁した。これに 20 μ gの上記プラスミドを混 合し、電気パルス（1.5KV, 25 x FD)を与えた。適当な割合で細胞を希釈し 96 well pla teに細胞を撒きこみ、終濃度 500 z g/mlの G418(インビトロジェン）を添加した CHO-S - SFM-II培地中で培養を行った。生育した単一コロニーを約 30クローンほどピックアツ プし、それら培養上清中の 2D7sc(Fv)2の発現量を抗 FLAG抗体（シグマ）を用いたゥ エスタンブロットにより調べた。最も発現の高かったクローンを 5nM MTXを含む核酸フ リーの CHO-S-SFM II培地（インビトロジヱン）で培養を行レ、、培養スケールを拡大し た。その結果得られた株を高産生細胞株とした。 [0147] 〔参考例 5〕2D7sc(Fv)2の大量精製
T-125フラスコでサブコンフルェントの 2D7sc(Fv)2高産生 CHO細胞株を lX105/mlに なるようにローラーボトノレ （CHO-S-SFM II培地 250ml/ボトル)に移した。 37°Cで培養 し、 6日後に培養液を回収した。遠心によって死細胞を除去した後、 0.45 μ mフィノレタ 一を通してこれを精製に用いた。
[0148] 2D7sc(Fv)2の精製は以下のとおり行った。
まず、 buffer A (20mM Na-phosphate pH6.8)で平衡化した Hydroxyapatiteカラム（ micro prep ceramic Hydroxyapatite type I, Bio-Rad)に回収しに; ί¾τϋτ¾ "を applyし た。 buffer Aでカラムを洗浄した後、 buffer C (250mM Na-phosphate ρΗ6·8)で 2D7sc( Fv)2を溶出した。 2D7sc(Fv)2を含むフラクションを等量の buffer Aで希釈した後、これ ¾r Anti-Flag M2ァガロースァフィ二ティカラム（Bio-Rad)に applyした。このカラムを buff er C (50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0.01% Tween 20)で洗浄した後、 buffer D (lOOmM Glycine H3.5, 0.01% Tween 20)で 2D7sc(Fv)2を溶出した。回収したサンプ ルは直ちに終濃度 25mMになるように Tris-HCl pH8.0で中和した。その後、このフラク シヨンを、セントリプレップ YM-10 (AMICON)で濃縮し、 Superdex200HR (26/60)カラ ム（アマシャムフアルマシア）によるゲルろ過クロマトグラム精製に使用した。
[0149] 0.01% Tween 20を含む PBSでゲルろ過クロマトグラム精製を行った。 2D7sc(Fv)2高 産生 CHO細胞株より産生された低分子化抗体は、そのほとんどが分子量約 52Kdの 位置に溶出ピークを有し、同じく 52Kdで溶出される 2D7 diabodyのピークと完全に一 致した。
ゲルろ過クロマトグラム精製により分離された 52Kdのピークのみを回収し、これを 2D 7sc(Fv)2蛋白標品とした。回収したサンプノレの一部を SDS電気泳動および銀染色を 行うことで、 目的の蛋白力 00。/oの純度で精製されていることを確認した。回収した精 製標品はセントリプレップ YM-10 (AMICON)で濃縮した。
産業上の利用可能性
[0150] 本発明のメダルミンを含有する安定化剤を用いることで、抗体分子の会合化反応を 抑制し、抗体分子をモノマーの状態で存在させることが可能となった。抗体を医薬品 として開発するためには、それぞれの抗体分子を安定に存在させ、製剤保存中の会 合化反応を最小限に抑制することが必要である。本発明の安定化剤は、安定化させ る抗体が非常に高濃度な状態であっても、抗体分子を安定化させ会合化反応を抑 制することができるため、抗体製剤を製造する際には非常に有用なものとなると考え られる。また、本発明のメグルミンを含有する薬剤は、抗体分子を溶液製剤化、また は凍結乾燥剤化する場合にも抗体分子を安定化させる効果を持つ。または凍結乾 燥製剤化時の凍結乾燥ストレスに対して、抗体分子を安定化させる効果を持つ。さら に、本発明の安定化剤は、全長抗体、断片化抗体、または低分子化抗体のいずれ の抗体に対しても安定化効果を示し、抗体製剤を製造する際には広く有用なものと なる。
本発明のメダルミンにより安定化された抗体分子を含有する医薬組成物は、抗体分 子の変性、会合が抑制されているため、従来の抗体製剤よりも、保存状態が良ぐ保 存時における会合化による活性の低下がより小さくなることが期待される。

Claims

請求の範囲
[I] メダルミンを含有する、タンパク質を長期安定化する薬剤。
[2] メダルミンを含有する、タンパク質の会合化を抑制する薬剤。
[3] タンパク質が抗体分子である、請求項 1または 2に記載の薬剤。
[4] 抗体分子が、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体様分 子のいずれかである請求項 3または 4に記載の薬剤。
[5] 剤形が凍結乾燥製剤である、請求項 1から 4のいずれかに記載の薬剤。
[6] メダルミンがその塩またはその誘導体である請求項 1から 5のいずれかに記載の薬 剤。
[7] タンパク質にメダルミンを添加する工程を含む、タンパク質を長期安定化する方法。
[8] タンパク質にメダルミンを添加する工程を含む、タンパク質の会合化を抑制する方 法。
[9] 請求項 7または 8に記載の方法であって、長期低温保存条件において、タンパク質を 長期安定化、またはタンパク質の会合化を抑制する方法。
[10] 請求項 7または 8に記載の方法であって、長期常温保存条件において、タンパク質を 長期安定化、またはタンパク質の会合化を抑制する方法。
[I I] タンパク質が抗体分子である、請求項 7から 10のいずれかに記載の方法。
[12] 抗体分子が、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体様分 子のレ、ずれかである請求項 11に記載の方法。
[13] メダルミン添加する工程の後、タンパク質を凍結乾燥する工程を含む、請求項 7から
12のいずれかに記載の方法。
[14] メダルミンがその塩またはその誘導体である請求項 7から 13のいずれかに記載の 方法。
[15] メダルミンを添加した医薬組成物。
[16] 剤形が凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項 15に記載の医薬組成物。
[17] メダルミンがその塩またはその誘導体である請求項 15または 16に記載の医薬組成 物。
[18] 抗体含有組成物にメダルミンを添加する工程を含む、抗体分子を含有する医薬組 成物の製造方法。
[19] 以下の（1)および（2)の工程を含む、抗体分子を含有する医薬組成物の製造方法
( 1 )メダルミンを抗体含有組成物に添加する工程
(2) (1)の混合物を凍結乾燥する工程
[20] 抗体分子が全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体、修飾抗体、または抗体様分 子のいずれかである請求項 18または 19に記載の医薬組成物の製造方法。
[21] メダルミンがその塩またはその誘導体である請求項 18から 20のいずれかに記載の 製造方法。
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