KR20080033253A - 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용 - Google Patents

메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메글루민을 단백질에 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질을 안정화시키는 방법, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 메글루민을 함유하는, 단백질을 안정화하는 약제, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 약제의 제공을 과제로 한다. 또한, 메글루민에 의해 안정화된 항체 분자를 함유하는 의약조성물, 이 의약조성물의 제조방법, 및 상기 의약조성물을 포함하는 키트의 제공에 대해서도 과제로 한다. 본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해, 아미노당의 하나인 메글루민의 항체 안정화 효과에 대하여 검토를 행하였다. 그 결과, 메글루민이 항체 분자의 안정화제로서 유용한 것, 또한 동결건조 제제의 부형제로서도 유용한 것을 발견하였다.

Description

메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의 이용{Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof}
본 발명은 아미노당의 하나인 메글루민을 함유하는 단백질을 안정화하는 약제, 및 그의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 메글루민을 함유하는 항체 분자를 안정화하는 약제, 및 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 메글루민에 의해 안정화된 항체 분자를 함유하는 의약조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
바이오 의약품의 제제화에 있어서는, 의약품으로서 사용되는 단백질을 안정하게 보존할 수 있는 제제가 필요하다(비특허문헌 1).
일반적으로 단백질이 열화(劣化)되어 가는 경로로서는, 가용성 다량체의 형성이나 침전·불용물의 생성 등 단백질 분자의 물리적 회합화(會合化)에 수반하는 열화경로(비특허문헌 2)와, 가수분해·탈아미드화 반응·메티오닌산화 반응 등에 따른 화학적 수식에 의한 열화경로(비특허문헌 3)가 알려져 있다. 의약품으로서 단백질을 개발하는데 있어서는, 이들 양쪽의 열화경로를 최소한으로 억제하고, 보존 중에 그 단백질의 생물학적 활성의 저하가 일어나지 않는 제제를 제공할 필요가 있다. 이와 같은 열화경로를 최소한으로 억제하는 방법으로서, 용액 pH의 최적화, 완 충액·염의 종류와 농도, 및 안정화제의 종류와 농도의 최적화가 행해진다.
의약품으로서 사용 가능한 항체에는 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체(항체와 다른 단백질의 융합 단백질 및 항체 콘쥬게이트(conjugate)) 등이 알려져 있다. IgG의 항체 제제는 일반적으로 매우 고농도의 제제가 요구되기 때문에, 매우 곤란하다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 5). 이로 인해 완충액종과 pH의 최적화 이외에, 항체를 안정화시키는 각종 시도가 행해지고 있다. 예를 들면 WO02/096457(특허문헌 1)에 있어서는, 산성성분을 함유하는 항체 고농도 안정 제제가 개시되어, 항체의 안정화를 위해 MgCl2, CaCl2를 첨가제로서 사용하고 있다. 또한 저분자 항체 등은 회합화하기 쉬워 안정성이 매우 낮은 것이 알려져 있고(비특허문헌 8, 9), scFv의 단량체는 매우 회합화하기 쉬워 고농도 조건하에서는 단량체가 회합화하여 이량체를 형성하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 10). 이로 인해, 이들 항체를 용액 제제로서 의약품 개발하는데 있어서는, 항체 분자를 용액 중에서 안정화시키는 것(즉 회합화를 억제하는 것)이 매우 중요한 과제가 되고 있다.
일반적으로 단백질은 동결건조함으로써 용액상태보다도 안정화하는(회합화가 억제되는) 점으로부터, 전술의 항체 제제가 용액 제제화가 곤란한 경우, 동결건조 제제화하는 것을 생각할 수 있다(비특허문헌 11, 12, 13). IgG 항체의 동결건조시에는 수크로오스가 부형제로서 유효한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 14).
메글루민은 지금까지 X선용 조영제(아미도트리조산 메글루민), MRI용 조영제(가도펜테틴산 메글루민) 등에 이용되어 왔으나, 지금까지 단백질을 안정화시키 는 효과에 대해서는 보고되지 않았다.
비특허문헌 1: Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4(4), 298-306
비특허문헌 2: Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30
비특허문헌 3: Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188
비특허문헌 4: J. Pharm. Sci. 2004, 93(6), 1390-1402
비특허문헌 5: Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624-632
비특허문헌 6: Clin. Chem. Lab. Med. 2000, 38(8): 759-764
비특허문헌 7: Journal of Immunological Methods, 111(1988), 17-23
비특허문헌 8: FEBS Letters Volume 360, Issue 3, 1995, 247-250
비특허문헌 9: FEBS Letters, 1995, 441, 458-462
비특허문헌 10: J. Mol. Biol. 2002, 320, 107-127
비특허문헌 11: Pharm Biotechnol, 2002, 13, 109-33
비특허문헌 12: Int. J. Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60
비특허문헌 13: Pharm. Res. 1997, 14(8), 969-75
비특허문헌 14: J. Pharm. Sci. 2001, 90(3), 310-21
특허문헌 1: WO02/096457
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 아미노당의 하나인 메글루민을 단백질에 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질을 안정화하는 방법을 제공하는 것에 있다.
보다 구체적으로는, 메글루민을 항체 분자에 첨가하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 안정화시키는 방법, 또는 항체 분자의 회합화를 억제하는 방법을 제공하는 것에 있다. 또한 메글루민을 함유하는, 항체 분자를 안정화하는 약제, 또는 항체 분자의 회합화를 억제하는 약제를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 메글루민에 의해 안정화된 항체 분자를 함유하는 의약조성물, 이 의약조성물의 제조방법, 및 이 의약조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것도 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해, 아미노당의 하나인 메글루민의 항체 안정화 효과에 대해서 검토를 행하였다.
먼저, 본 발명자들은 sc(Fv)2인 hVB22B sc(Fv)2를 사용하여, 메글루민에 의한 회합반응 억제효과의 검토를 행하였다. 그 결과, 메글루민을 첨가함으로써 대폭적으로 모노머 잔존율이 향상하고, hVB22B의 회합화 반응은 대폭적으로 억제할 수 있는 것이 명백해졌다. 본 연구에 의해, 안정성이 낮은 저분자화 항체에 대해서 메글루민을 첨가함으로써 현저하게 안정성이 향상하는 것을 발견하였다. 또한 본 연구에 의해 처음으로, 메글루민이 단백질의 안정화제로서 유용한 것을 명백하게 하였다.
다음으로, 메글루민에 의한 다른 sc(Fv)2 분자, 및 전장 항체로의 안정화 효과에 대해서 검토를 행하였다. 그 결과, 메글루민을 첨가함으로써 sc(Fv)2뿐 아니라, 전장 항체의 IgG 등 항체 분자 전반에 있어서 회합화를 억제하는 효과가 있는 것이 명백해졌다.
또한, 수크로오스에 비해 메글루민 쪽이 회합체 생성에 대한 억제효과가 용액 제제, 동결건조 스트레스, 동결건조 제제에 있어서 큰 것이 명백해졌다. 또한, 메글루민은 항체농도가 100 ㎎/mL라는 매우 고농도의 제제에 대해서도, 용액상태, 동결건조상태를 불문하고 높은 안정화 효과를 나타내는 것이 명백해졌다. 또한, 메글루민을 첨가함으로써 저온하 또는 상온하의 장기 보존에 있어서도, 항체 분자의 회합화가 억제되는 것이 명백해졌다.
즉, 본 발명자들은 본 발명에 의해 처음으로 메글루민이 항체 분자의 안정화제로서 유용한 것을 발견하고, 이에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 〔1〕~〔21〕을 제공하는 것이다.
〔1〕 메글루민을 함유하는, 단백질을 장기 안정화하는 약제.
〔2〕 메글루민을 함유하는, 단백질의 회합화를 억제하는 약제.
〔3〕 단백질이 항체 분자인 〔1〕 또는 〔2〕 기재의 약제.
〔4〕 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자(antibody-like molecule) 중 어느 하나인 〔3〕 또는 〔4〕 기재의 약제.
〔5〕 제형이 동결건조 제제인, 〔1〕~〔4〕 중 어느 하나 기재의 약제.
〔6〕 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 〔1〕~〔5〕 중 어느 하나 기재의 약제.
〔7〕 단백질에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질을 장기 안정화하는 방법.
〔8〕 단백질에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질의 회합화를 억제하는 방법.
〔9〕 〔7〕 또는 〔8〕 기재의 방법으로서, 장기 저온 보존조건에 있어서, 단백질을 장기 안정화, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 방법.
〔10〕 〔7〕 또는 〔8〕 기재의 방법으로서, 장기 상온 보존조건에 있어서, 단백질을 장기 안정화, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 방법.
〔11〕 단백질이 항체 분자인, 〔7〕~〔10〕 중 어느 하나 기재의 방법.
〔12〕 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자 중 어느 하나인 〔11〕 기재의 방법.
〔13〕 메글루민 첨가하는 공정 후, 단백질을 동결건조하는 공정을 포함하는, 〔7〕~〔12〕 중 어느 하나 기재의 방법.
〔14〕 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 〔7〕~〔13〕 중 어느 하나 기재의 방법.
〔15〕 메글루민을 첨가한 의약조성물.
〔16〕 제형이 동결건조 제제인 것을 특징으로 하는, 〔15〕 기재의 의약조성물.
〔17〕 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 〔15〕 또는 〔16〕 기재의 의약조성물.
〔18〕 항체 함유 조성물에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법.
〔19〕 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법.
(1) 메글루민을 항체 함유 조성물에 첨가하는 공정
(2) (1)의 혼합물을 동결건조하는 공정
〔20〕 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자 중 어느 하나인 〔18〕 또는 〔19〕 기재의 의약조성물의 제조방법.
〔21〕 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 〔18〕~〔20〕 중 어느 하나 기재의 제조방법.
도면의 간단한 설명
도 1은 메글루민에 의한 hVB22B의 안정화 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 메글루민에 의한, sc(Fv)2 분자, 및 전장 항체로의 안정화 효과를 나타내는 도면이다. 도면 중의 수치는 용액 가속조건에 있어서 회합체의 함유율(%)을 나타낸다.
도 3은 IgG의 용액 제제화 및 동결건조 제제화에 있어서, 메글루민에 의한 안정성 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 단일 사슬 디아바디(single chain diabody)형 sc(Fv)2의 장기 저온 보존(-20℃·6개월)에 있어서, 메글루민에 의한 안정성 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간화 이중특이성 항체의 장기 상온 보존(25℃·2개월)에 있어서 메글루민에 의한 안정성 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 단일 사슬 항체 sc(Fv)2의 제작과정을 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자들은 sc(Fv)2의 안정화 제제를 검토하는 과정에서, 아미노당의 하나인 신규 안정화제 메글루민을 발견하였다. 또한, 이 메글루민은 저분자 항체인 sc(Fv)2뿐 아니라, 전장 항체도 안정화하는 것을 발견하였다. 또한 메글루민은, 단백질 의약 제제 중의 안정화제로서 일반적으로 사용되고 있는 수크로오스 등의 당이나 아미노당에 비해, 항체 분자 등의 단백질 또는 펩티드에 대해서 우수한 안정화 효과를 나타내는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 지견(知見)을 토대로 하는 것이다.
본 발명은 메글루민을 단백질에 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 안정화는 장기에 걸친 안정화여도 된다. 본 발명에 있어서 「장기 안정화」란 이하와 같이 정의된다. 저분자화 항체의 용액 제제의 경우는 55℃ 2주간 보존 후에 있어서의 회합체량이 35% 이하인 것, 또는 40℃ 2주간 보존 후에 있어서의 회합체량이 10% 이하, 바람직하게는 7% 이하인 것, 또는 25℃ 2개월 보존 후에 있어서의 회합체량이 1% 이하인 것, 또는 -20℃ 6개월 보존 후에 있어서의 회합체량이 2% 이하, 바람직하게는 1% 이하인 것을 의미한다. 저분자화 항체를 제외한 모든 항체 또는 일반적인 단백질의 용액 제제의 경우는, 60℃ 3주간 보존 후에 있어서의 회합체량이 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하인 것, 또는 -20℃ 6개월 보존 후에 있어서의 회합체량이 2% 이하, 바람직하게는 1% 이하인 것을 의미한다. 또한 IgG, 저분자화 항체를 포함하는 모든 항체 또는 일반적인 단백질의 동결건조 제제의 경우는 40℃ 1개월 보존 후에 있어서의 회합체량이 5% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5% 이하인 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 「메글루민」이란, 별명 N-메틸글루카민, 화학식 1-데옥시-1-메틸아미노-D-클루시톨(1-Deoxy-1-methylamino-D-glucitol) 및, 이하의 화학식으로 나타내어지는 화합물이다.
Figure 112008002019149-PCT00001
본 발명에 있어서 「메글루민」에는 메글루민 유도체나 메글루민의 염 등이 포함된다. 메글루민 유도체나 메글루민의 염으로서는, 아미도드리조산 메글루민(meglumine amidotrizoate), 아미도드리조산나트륨 메글루민, 가도펜테틴산 메글루민(meglumine gadopentetate), 가도테르산 메글루민(meglumine gadoterate), 이오탈람산 메글루민(meglumine iotalamate), 이오트록식산 메글루민(meglumine iotroxate), 가도벤산 메글루민(meglumine gadobenate), 이오독사믹산 메글루민(meglumine iodoxamate), 플루닉신 메글루민(meglumine flunixin), 가스트로그라핀(gastrografin)(메글루민 황산염) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니 다. 또한, 상기 메글루민의 수산기, 아미노기 등이 화학적으로 수식을 받은 것도 본 발명의 메글루민에 포함된다.
본 발명에 있어서 안정화의 대상이 되는 의약조성물(단백질)은 펩티드를 포함하는 단백질 또는 기타 생체 고분자, 합성 고분자화합물, 저분자화합물, 또는 그들의 유도체, 또는 그들의 조합으로 되는 복합체 중 어느 것이어도 된다. 본 발명의 바람직한 예로서는 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 안정화의 대상이 되는 항체는 이미 공지의 항체를 사용하는 것이 가능하고, 전장 항체, 단편화 항체, 수식 항체 또는 저분자화 항체 중 어느 것이어도 된다.
공지의 전장 항체로서 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgE, IgM, IgY 등을 들 수 있으나, 그 종류는 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 전장 항체로서는 이중특이성 IgG 항체(J Immunol Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2): 7-15)도 포함된다.
또한, 신규의 항원을 사용하여, 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작된 항체도 대상으로 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 신규 항체의 제작은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
신규 항원 단백질 또는 그의 단편을 감작 항원으로서 사용하고, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어진 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포(親細胞)와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 생산세포(하이브리도마)를 스크리닝한다. 항원의 조제는 공지의 방법, 예를 들면 베큘로바 이러스를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들면 밀스테인들의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜, 면역을 행하면 된다. 그 후, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성하고, 얻어진 cDNA의 서열을 공지의 방법에 의해 해독하면 된다.
신규 항원을 인식하는 항체는 신규 항원과 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 양 항체, 인간 항체 등을 적절히 사용할 수 있다. 또한, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라(Chimeric) 항체, 인간화(Humanized) 항체 등도 사용할 수 있다. 이들 개변 항체는 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 키메라 항체는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 되는 항체 등으로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하여, 이를 숙주에 도입해 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP 239400호, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576호 참조). CDR을 매개로 하여 동결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들면 인간 림프구를 인비트로(in vitro)에서 목적의 항원 또는 목적의 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종세포(human myeloma cell), 예를 들면 U266과 융합시켜 항원으로의 결합활성을 갖는 목적의 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878호 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 목적의 항원으로 면역함으로써 목적의 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조). 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝(panning)에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법(phage display method)에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 해당 서열을 갖는 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지로서 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 안정화 대상이 되는 항체로서는, 단편화 항체 또는 저분자화 항체를 들 수 있다. 이들은 공지의 항체 또는 신규로 제작되는 항체 중 어느 것이어도 된다. 단편화 항체 또는 저분자화 항체란, 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 일부가 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, 항원으로의 결합능을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab′, F(ab′)2, Fv, scFv(단일 사슬 Fv)(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883, Plickthun 「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」 Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994)), VHH(camelid VH, J Biotechnol. 2001 Jun; 74(4): 277-302.), 또는 sc(Fv)2 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 sc(Fv)2이다. 이와 같은 항체 단편을 얻는데는, 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신 등으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이를 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Met hods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).
본 발명에 있어서 바람직한 저분자화 항체는 항체의 VH를 2개 이상 및 VL을 2개 이상 포함하고, 이들 각 가면영역을 직접 또는 링커 등을 매개로 간접적으로 결합한 항체이다. 결합은 공유결합이어도 되고, 비공유결합이어도 되며, 또한 공유결합과 비공유결합의 양쪽이어도 된다. 더욱 바람직한 저분자화 항체는 VH와 VL이 비공유결합에 의해 결합하여 형성되는 VH-VL쌍을 2개 이상 포함하고 있는 항체이다. 이 경우, 저분자화 항체 중 한쪽의 VH-VL쌍과 다른 한쪽의 VH-VL쌍 사이의 거리가 전장 항체에 있어서의 거리보다도 짧아지는 항체가 바람직하다.
본 발명에 있어서 저분자화 항체로서는, scFv, 디아바디, 또는 sc(Fv)2를 들 수 있다. scFv는 가변영역과 가변영역을 링커 등으로 결합한 프래그먼트이다.
디아바디는 scFv 등(이하, 디아바디를 구성하는 프래그먼트)을 2개 결합시켜 이량체화시킨 것으로, 통상 2개의 VL과 2개의 VH를 포함한다. 디아바디를 구성하는 프래그먼트간의 결합은 비공유결합이어도 되고, 공유결합이어도 되나, 바람직하게는 비공유결합이다.
디아바디를 구성하는 프래그먼트는 VL과 VH를 결합한 것, VL과 VL을 결합한 것, VH와 VH를 결합한 것 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 VH와 VL을 결합한 것이다. 디아바디를 구성하는 프래그먼트 중에 있어서, 가변영역과 가변영역을 결합하는 링커는 특별히 제한되지 않으나, 동일 프래그먼트 중의 가변영역 사이에서 비공 유결합이 발생하지 않을 정도로 짧은 링커를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 링커의 길이는 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 통상 2~14 아미노산, 바람직하게는 3~9 아미노산, 특히 바람직하게는 4~6 아미노산이다. 이 경우, 동일 프래그먼트 상에 코드되는 VL과 VH란, 그 사이의 링커가 짧으므로, 동일 사슬 상의 VL과 VH 사이에서 비공유결합이 발생하지 않고, 단일 사슬 V영역 프래그먼트가 형성되지 않으므로, 다른 프래그먼트와의 비공유결합에 의한 이량체를 형성한다. 또한, 디아바디 제작과 동일한 원리로, 디아바디를 구성하는 프래그먼트를 3개 이상 결합시켜, 트리머, 테트라머 등의 다량체화시킨 항체를 제작하는 것도 가능하다.
sc(Fv)2는 2개의 중쇄 가변영역([VH]) 및 2개의 경쇄 가변영역([VL])을 링커 등으로 결합하여 단일 사슬 폴리펩티드로 한 항체이다(Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 단일클론항체 유래여도 된다. 예를 들면, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374에 개시되는 바와 같은 2종류의 항원, 또는 2종류의 에피토프를 인식하는 이중특이성(bispecific) sc(Fv)2를 들 수 있다. sc(Fv)2는 예를 들면 2개의 scFv(단일 사슬 Fv)(Huston, J. S. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883, Plickthun 「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」 Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))를 링커 등으로 결합함으로써 제작하는 것이 가능하다. 링커로서는 유전자공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커, 예를 들면 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커 등을 사용할 수 있으나, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 통상 1~100 아미노산, 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면 15 아미노산)이다.
결합되는 2개의 중쇄 가변영역과 2개의 경쇄 가변영역의 순서는 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 나열되어 있어도 되며, 예를 들면 이하와 같은 배치를 들 수 있다.
[VH] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VL]
[VL] 링커 [VH] 링커 [VH] 링커 [VL]
[VH] 링커 [VL] 링커 [VL] 링커 [VH]
[VH] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VL]
[VL] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VH]
[VL] 링커 [VH] 링커 [VL] 링커 [VH]
본 발명에 있어서 바람직하게는 [VH] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VL]의 배치를 갖는 sc(Fv)2이다.
중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 추가로, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원결합활성을 갖는 한 일부를 결손시켜도 되고, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 항체의 가변영역을 결합하는 링커는 유전자공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커, 예를 들면 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하나, 통상 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들면 15 아미노산)이다.
펩티드 링커의 아미노산 서열로서는, 예를 들면 이하와 같은 서열을 들 수 있다.
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 41)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호: 42)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 43)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 44)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 45)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 46)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 47)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 48)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 43))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 44))n
[n은 1 이상의 정수이다]
합성화합물 링커(화학 가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등으로, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는, 통상 3개의 링커가 필요해지나, 모두 같은 링커를 사용해도 되고, 다른 링커를 사용해도 된다.
sc(Fv)2는 당업자에게 주지의 방법으로 제작할 수 있다. 예를 들면 sc(Fv)2를 코드하는 DNA를 삽입한 벡터를 숙주세포에 도입하고, sc(Fv)2를 발현시켜, 발현산물을 회수하는 것으로 sc(Fv)2를 제작할 수 있다.
상기 벡터로서는, 삽입한 DNA를 안정하게 보유하는 것이면 특히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주에 대장균을 사용하는 것이면, 클로닝용 벡터로서는 pBluescript벡터(Stratagene사제) 등이 바람직하나, 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 sc(Fv)2를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 sc(Fv)2를 발현하는 벡터이면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사제), 대장균이라면 pET 벡터(invitrogen사제), 배양세포이면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물 개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8: 466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA 삽입은 통상적인 방법에 의해, 예를 들면 제한효소 사이트를 사용한 리가아제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
상기 숙주세포로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 각종 숙주세포가 사용된다. sc(Fv)2를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면 세균세포(예: 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토미세스, 고초균), 진균세포(예: 효모, 아스페르길루스), 곤충세포(예: 드로소필라 S2, 스포도프테라 SF9), 동물세포(예: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 흑색종 세포) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면 인산칼슘 침전법, 전기펄스 천공법(electroporation)(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), 리포펙타민법(GIBCO-BRL사제), 마이크로인젝션법 등 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
sc(Fv)2의 회수는 본 발명의 sc(Fv)2가 배지에 분비되는 경우는, 배지를 회수함으로써 실시할 수 있다. 또한, sc(Fv)2가 세포내에 생산되는 경우는 그 세포를 먼저 용해하고, 그 후에 sc(Fv)2 조성물을 회수한다.
어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al.(1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하고, 본 발명의 항체에 적절히 변이를 도입함으로써, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에 있어서도 발생할 수 있다. 이와 같이, 본 발명 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체도 또한 본 발명의 항체에 포함된다.
변이하는 아미노산수는 특별히 제한되지 않으나, 통상 30 아미노산 이내이고, 바람직하게는 15 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면 3 아미노산 이내)라고 생각되어진다. 변이하는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타낸다). 어떤 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research(1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982) 79, 6409-6413). 또한, 항체의 정상영역 등의 아미노산 서열은 당업자에게 공지이다.
또한, 본 발명에 사용하는 항체는 수식 항체여도 되고, 수식 항체로서는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 방사성 물질, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다.
또한, 수식 항체는 항체 콘쥬게이트 외에, 항체 분자, 항체 분자 단편, 항체 유사 분자와, 다른 단백질·펩티드와의 융합 단백이어도 된다. 융합 단백으로서는 TNFα와 Fc의 융합 단백(Int J Clin Pract. 2005 Jan; 59(1): 114-8.)이나 IL2와 scFv의 융합 단백(J Immunol Methods. 2004 Dec; 295(1-2): 49-56.) 등을 들 수 있으나, 특히 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 사용하는 항체는 항체 유사 분자여도 된다. 항체 유사 분자로서는 어피바디(affibody)(Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Mar 18; 100(6): 3191- 6)나 안키린(ankyrin)(Nat Biotechnol. 2004 May; 22(5): 575-82) 등을 들 수 있으나, 특히 이들에 한정되는 것은 아니다.
전술의 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는 목적으로 하는 항체의 DNA를 발현 벡터로 삽입한다. 이때 발현 제어영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어 아래 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다. 그때는 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
벡터의 예로서는 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브 클로닝, 절단을 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다.
항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward들, Nature(1989) 341, 544-546; FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better들, Science(1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사제), 「QIAexpress system」(QIAGEN사제), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한 벡터에는, 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 일렉트로포레이션(electroporation)을 사용하여 행할 수 있다.
대장균 이외에도, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3(Invitrogent사제)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL사제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan들, Nature(1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima들, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결하고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한 세포내에서의 유전자 카피수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있으며, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는 SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus:BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 메글루민을 단백질에 「첨가한다」는 것은, 메글루민과 단백질을 혼합시키는 것도 의미한다. 본 발명에 있어서 메글루민과 단백질을 혼합시킨다는 것은, 메글루민을 함유하는 용액에 단백질을 용해시키는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 「안정화한다」는 것은, 단백질이 천연의 상태 또는 활성을 유지하는 상태를 유지하는 것을 말한다.
또한, 본 발명의 메글루민을 함유하는 안정화제를 첨가함으로써, 단백질의 활성이 천연상태 또는 대조(control)보다도 상승한 경우, 또는 보존시에 있어서 회합화에 의한 활성의 저하가 보다 작아진 경우에도, 단백질이 안정화되었다고 간주할 수 있다. 단백질의 구체예로서, 항체 분자의 활성이 상승했는지 여부는, 동일한 조건하에서 목적의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 안정화의 표적이 되는 항체 분자는 새롭게 합성된 것이나, 생물체로부터 단리된 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 활성은 결합활성, 중화활성, 세포상해활성, 아고니스트 활성, 안타고니스트 활성, 효소활성 등 어떤 활성이어도 되고, 특별히 한정되지 않으나, 생체, 조직, 세포, 단백질, DNA, RNA 등에 양적 및/또는 질적인 변화, 영향을 초래하는 활성인 것이 바람직하고, 특히 아고니스트 활성이 바람직하다.
아고니스트 활성이란, 수용체 등의 항원에 항체가 결합함으로써, 세포내에 시그널이 전달되거나 하여, 어떤 생리적 활성의 변화를 유도하는 활성이다. 생리적 활성으로서는, 예를 들면 증식활성, 생존활성, 분화활성, 전사활성, 막수송활성, 결합활성, 단백질 분해활성, 인산화/탈인산화활성, 산화환원활성, 전이활성, 핵산분해활성, 탈수활성, 세포사 유도활성, 아포토시스 유도활성 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떤 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면 수용체, 암 항원, MHC 항원, 분화 항원 등을 들 수 있다. 수용체의 예로서는, 예를 들면 조혈인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G 단백질 공역형 수용체 패밀리(G-protein coupled receptor family), GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체, 및 그 특징에 관해서는 다수의 문헌이 존재하고, 예를 들면 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry Vol.18B “Hormones and their Actions Part II” pp.1-46(1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USA, Patthy L.(1990) Cell, 61: 13-14., Ullrich A., et al.(1990) Cell, 61: 203-212., Massagul J.(1992) Cell, 69: 1067-1070., Miyajima A., et al.(1992) Annu. Rev. Immunol., 10: 295-331., Taga T. and Kishimoto T.(1992) FASEB J., 7: 3387-3396., Fantl WI., et al.(1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481; Smith CA., et al. (1994) Cell, 76: 959-962., Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234., 미야사카 마사유키 감수, 세포공학 별책 핸드북 시리즈 「접착인자 핸드북」(1994)(슈쥰샤, 도쿄, 일본) 등을 들 수 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들면 인간 또는 마우스 에리스로포이에틴(EPO) 수용체, 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 수용체, 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 수용체, 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체, 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식인자(PDGF) 수용체, 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α,β 수용체, 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터루킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 유사 증식인 자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스털 유사체 신경 영양인자(CNTF) 수용체 등을 예시할 수 있다(hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35.; mEPOR: D'Andrea, AD. Et al. (1989) Cell 57, 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702-8706.; mG-CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61, 341-350.; hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644.; mTPOR: Skoda, RC. Et al. (1993) 12, 2645-2653.; hInsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761.; hFlt-3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 459-463; hPDGFR: Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439.; hIFN α/β R: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225-234. 및 Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.).
암 항원은 세포의 악성화에 수반하여 발현하는 항원으로, 종양 특이성 항원이라고도 불린다. 또한, 세포가 암화되었을 때 세포표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 비정상의 당쇄도 암항원이 되어, 특히 암 당쇄 항원으로 불린다. 암 항원의 예로서는, 예를 들면 CA19-9, CA15-3, 시리얼 SSEA-1(SLX) 등을 들 수 있다.
MHC 항원에는 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 크게 나뉘고, MHC class I 항원에는 HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되고, MHC class II 항원에는 HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다.
분화 항원에는,
CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130 등이 포함된다.
활성의 변화를 측정하기 위해 사용하는 검출지표로서는 양적 및/또는 질적인 변화가 측정 가능한 한 사용할 수 있다. 예를 들면 무세포계(cell free assay)의 지표, 세포계(cell-based assay)의 지표, 조직계의 지표, 생체계의 지표를 사용할 수 있다.
무세포계의 지표로서는 효소반응이나 단백질, DNA, RNA의 양적 및/또는 질적인 변화를 사용할 수 있다. 효소반응으로서는, 예를 들면 아미노산 전이반응, 당 전이반응, 탈수반응, 탈수소반응, 기질 절단반응 등을 사용할 수 있다. 또한, 단백질의 인산화, 탈인산화, 이량화, 다량화, 분해, 괴리 등이나, DNA, RNA의 증폭, 절단, 신장을 사용할 수 있다. 예를 들면 시그널 전달경로의 하류에 존재하는 단백질의 인산화를 검출지표로 할 수 있다.
세포계의 지표로서는 세포의 표현형의 변화, 예를 들면 생산물질의 양적 및/또는 질적 변화, 증식활성의 변화, 세포수의 변화, 형태의 변화, 특성의 변화 등을 사용할 수 있다. 생산물질로서는 분비 단백질, 표면항원, 세포내 단백질, mRNA 등을 사용할 수 있다. 형태의 변화로서는 돌기 형성 및/또는 돌기 수의 변화, 편평도의 변화, 신장도/종횡비의 변화, 세포 크기의 변화, 내부구조의 변화, 세포집단으 로서의 이형성/균일성, 세포밀도의 변화 등을 사용할 수 있다. 이들 형태의 변화는 검경하에서의 관찰로 확인할 수 있다. 특성의 변화로서는 앵커리지 의존성, 사이토카인 의존 응답성, 호르몬 의존성, 약제내성, 세포 운동성, 세포 유주(遊走)활성, 박동성, 세포내 물질의 변화 등을 사용할 수 있다. 세포 운동성으로서는 세포 침윤활성, 세포 유주활성이 있다. 또한 세포내 물질의 변화로서는 예를 들면 효소활성, mRNA량, Ca2 +나 cAMP 등의 세포내 정보전달 물질량, 세포내 단백질량 등을 사용할 수 있다. 또한, 세포막 수용체의 경우에는 수용체의 자극에 의해 유도되는 세포 증식활성의 변화를 지표로 할 수 있다.
조직계의 지표로서는, 사용하는 조직에 따른 기능변화를 검출지표로 할 수 있다. 생체계의 지표로서는 조직 중량변화, 혈액계의 변화, 예를 들면 혈구세포수의 변화, 단백질량이나 효소활성, 전해질량의 변화, 또한 순환기계의 변화, 예를 들면 혈압, 심박수의 변화 등을 사용할 수 있다.
이들의 검출지표를 측정하는 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 흡광, 발광, 발색, 형광, 방사활성, 형광편광도, 표면 플라스몬 공명 시그널, 시간분해 형광도, 질량, 흡수 스펙트럼, 광산란, 형광 공명 에너지 이동 등을 사용할 수 있다. 이들 측정방법은 당업자에게 있어서는 주지로, 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 흡수 스펙트럼은 일반적으로 사용되는 포토미터나 플레이트 리더 등, 발광은 루미노미터 등, 형광은 플루오로미터 등으로 측정할 수 있다. 질량은 질량분석계를 사용하여 측정할 수 있다. 방사활성은 방사선의 종류에 따라서 감마 카운터 등의 측정기기를 사용하고, 형광편광도는 BEACON(다카라주조), 표면 플라스몬 공명 시그널은 BIACORE, 시간분해 형광, 형광 공명 에너지 이동 등은 ARVO 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 플로우 사이토미터 등도 측정에 사용할 수 있다. 이들 측정방법은 하나의 측정방법으로 2종 이상의 검출지표를 측정해도 되고, 간편하다면 2종 이상의 측정을 동시 및/또는 연속하여 측정함으로써 더욱 다수의 검출지표를 측정하는 것도 가능하다. 예를 들면, 형광과 형광 공명 에너지 이동을 동시에 플루오로미터로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 아고니스트 활성의 측정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 실시예에 기재한 바와 같이 세포증식을 지표로 아고니스트 활성을 측정하는 방법에 의해 판정하는 것이 가능하다. 보다 구체적으로는, 아고니스트 의존성 증식을 나타내는 세포에, 아고니스트 활성을 측정하고자 하는 항체를 첨가하고, 배양한다. 그 후, WST-8과 같은 생세포수에 따라 특정 파장에 있어서 발색반응을 나타내는 시약을 첨가하여 흡광도를 측정하고, 얻어진 흡광도를 지표로 아고니스트 활성을 측정하는 것이 가능하다.
아고니스트 의존성 증식을 나타내는 세포도 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작하는 것이 가능하고, 예를 들면 항원이 세포증식 시그널을 발하는 수용체인 경우에는, 상기 수용체를 발현하고 있는 세포를 사용하면 된다. 또한, 항원이 세포증식 시그널을 발하지 않는 수용체인 경우에는, 세포증식 시그널을 발하는 수용체의 세포내 영역과, 세포증식 시그널을 발하지 않는 수용체의 세포외 영역으로 되는 키메라 수용체를 제작하고, 상기 키메라 수용체를 세포에서 발현시키면 된다. 세포증 식 시그널을 발하는 수용체의 예로서는, 예를 들면 G-CSF 수용체, mpl, neu, GM-CSF 수용체, EPO 수용체, c-kit, FLT-3 등을 들 수 있다. 수용체를 발현시키는 세포로서는, 예를 들면 BaF3, NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, KT-3 등을 들 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 단백질이 「안정화된다」는 것은, 단백질의 회합화 반응이 억제된 상태로서, 보존 중에 발생하는 단백질 회합체의 증가를 억제하는 것, 및/또는 보존 중에 발생하는 단백질의 불용성 회합체(침전물)의 증가를 억제하는 것 및/또는 단백질의 기능을 유지하고 있는 것을 말하고, 바람직하게는 보존 중에 발생하는 단백질 회합체의 증가를 억제하는 것을 말한다.
본 발명은 아미노당의 하나인 메글루민을 단백질에 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질의 회합화를 억제하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 메글루민을 항체 분자에 첨가하는 공정을 포함하는, 항체 분자의 회합화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 회합이란, 단백질(항체 분자)이 불가역적 또는 가역적으로 회합화되어 항체 2 분자 이상의 다량체가 형성되는 것을 말한다. 회합이 억제되었는지 여부에 대해서는 당업자에게 공지의 방법, 예를 들면 침강평형법(초원심법), 삼투압법, 광산란법, 저각(低角) 레이저 광산란법, X선 소각(小角) 산란법, 중성자 소각 산란법, 또는 겔 여과법 등에 의해 항체 분자의 회합체 함유율을 측정하는 것으로 행할 수 있다. 메글루민을 첨가함으로써, 보존시의 항체 회합체 함유율이 저하한 경우에, 회합화가 억제되었다고 해석할 수 있다.
항체의 회합체 함유율의 측정하는 방법으로서는, 실시예에 기재된 바와 같이 SEC(Size Exclusion Chromatography: 사이즈 배제 크로마토그래피)를 사용하여 행하는 방법을 들 수 있으나, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 「항체 분자를 안정화한다」란, 항체의 농도나 상태는 불문하고, 용액 항체 제제, 동결건조 항체 제제, 또는 스프레이 드라이 제제에 포함되는 항체 분자를 안정화하는 것이어도 된다. 또한, 저온하 또는 상온하에서 장기 보존된 항체 분자를 안정화하는 것이어도 된다. 본 발명에 있어서 저온보존이란, 일례로서 -80℃~10℃에 있어서의 보존을 들 수 있고, 동결보존도 보존형태에 포함된다. 저온의 바람직한 예로서는 -20℃ 또는 5℃를 들 수 있으나, 이 온도에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명에 있어서 상온보존이란, 일례로서 15℃~30℃에 있어서의 보존을 들 수 있다. 상온의 바람직한 예로서는 25℃를 들 수 있으나, 이 온도에 한정되는 것은 아니다.
용액 제제화는 당업자에게 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면 비특허문헌(J. Pharm. Sc, 2004, 93(6), 1390-1402)에 기재되어 있는 바와 같이, 통상 TFF막을 이용한 막농축법이 사용된다.
동결건조는 당업자에게 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다(Pharm. Biotechnol, 2002, 13, 109-33, Int. J. Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60, Pharm. Res. 1997, 14(8), 969-75). 예를 들면 용액을 동결건조에 사용하는 바이알 등의 용기에 적당량 분주하고, 동결고(凍結庫) 또는 동결건조고 중에서 행하거나, 또는 아세톤/드라이아이스, 액체 질소 등의 냉매 중에 침지하여 행한다.
또한, 스프레이 드라이 제제화는 당업자에게 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다(J. Pharm. Sci. 1998 Nov; 87(11): 1406-11).
용액 제제화 및 동결건조에 대해서는 실시예에 기재의 방법으로 행하는 것도 가능하나, 그들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 아미노당의 하나인 메글루민을 함유하는, 단백질을 안정화시키는 약제, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 약제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 메글루민을 함유하는, 항체 분자를 안정화시키는 약제, 또는 항체 분자의 회합화를 억제하는 약제에 관한 것이다.
또한 메글루민을 함유하는, 항체 분자를 안정화시키는 약제, 또는 동결건조 항체 제제에 포함되는 항체 분자를 안정화시키는 약제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 약제에는 보존제나 안정제 등의 제제상 허용할 수 있는 담체가 첨가되어 있어도 된다. 제제상 허용할 수 있는 것이란, 그 자체는 상기의 단백질 안정화 작용을 갖는 재료여도 되고, 안정화 작용을 갖지 않는 재료여도 되며, 상기의 약제와 함께 투여 가능한 제제상 허용되는 재료를 의미한다. 또한, 안정화 작용을 갖지 않는 재료여도, 메글루민과 병용함으로써 상승적 또는 상가적(相加的)인 안정화 효과를 갖는 재료여도 된다.
제제상 허용되는 재료로서는, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 계면활성제로서는 비이온 계면활성제를 들 수 있고, 예를 들면 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테 이트 등의 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르; 폴리옥시에티에렌 노닐페닐 에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산아미드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB 6~18을 갖는 것 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
또한, 계면활성제로서는 음이온 계면활성제도 들 수 있고, 예를 들면 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등의 탄소원자수 10~18의 알킬기를 갖는 알킬황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴황산나트륨 등의 에틸렌옥시드의 평균 부가 몰수가 2~4이고 알킬기의 탄소원자수가 10~18인 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 황산염; 라우릴 설포숙신산 에스테르나트륨 등의 알킬기의 탄소원자수가 8~18인 알킬 설포숙신산 에스테르염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고 미엘린 등의 핑고 인지질; 탄소원자수 12~18의 지방산의 자당 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
본 발명의 제제에는 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하는 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이고, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또한, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜도 바람직하다.
계면활성제의 첨가량은 사용하는 계면활성제의 종류에 따라 상이하나, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80의 경우에는 일반적으로 0.001~100 ㎎/mL이고, 바람직하게는 0.003~50 ㎎/mL이며, 더욱 바람직하게는 0.005~2 ㎎/mL이다.
본 발명에 있어서 완충제로서는 인산, 구연산 완충액, 초산, 말산, 타르타르산, 숙신산, 젖산, 인산칼륨, 글루콘산, 카프릴산, 데옥시콜산, 살리실산, 트리에탄올아민, 푸마르산 등, 다른 유기산 등, 또는 탄산 완충액, 트리스 완충액, 히스티딘 완충액, 이미다졸 완충액 등을 들 수 있다.
또한 용액 제제의 분야에서 공지의 수성 완충액에 용해함으로써 용액 제제를 조제해도 된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1~500 mM이고, 바람직하게는 5~100 mM이며, 더욱 바람직하게는 10~20 mM이다.
또한, 본 발명의 약제는 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역 글로불린 등의 단백질, 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 당알코올을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산으로서는 염기성 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 등, 또는 이들 아미노산의 무기염(바람직하게는 염산염, 인산염의 형태, 즉 인산 아미노산)을 들 수 있다. 유리 아미노산(free amino acid)이 사용되는 경우, 바람직한 pH 값은 적당한 생리적으로 허용되는 완충물질, 예를 들면 무기산, 특히 염산, 인산, 황산, 초산, 포름산 또는 이들 염의 첨가에 의해 조정된다. 이 경우, 인산염의 사용은 특히 안정한 동결건조물이 얻어지는 점에서 특히 유리하다. 조제물이 유기산, 예를 들면 말산, 타르타르산, 구연산, 숙신산, 푸마르산 등을 실질적으로 함유하지 않는 경우 또는 대응하는 음이온(말산 이온, 타르타르산 이온, 구연산 이온, 숙신산 이온, 푸마르산 이온 등)이 존재하지 않는 경우에 특히 유리하다. 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 오르니틴이다. 또한, 산성 아미노산, 예를 들면 글루타민산 및 아스파라긴산, 및 그의 염의 형태(바람직하게는 나트륨염) 또는 중성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 시스테인, 또는 알라닌, 또는 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 유도체의 N-아세틸트 립토판을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물로서는, 예를 들면 덱스트란, 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 크실로오스, 만노오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로스, 라피노오스 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 당알코올로서는, 예를 들면 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 등을 들 수 있다.
주사용 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
목적에 따라 추가로 희석제, 용해보조제, pH 조정제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화방지제 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서 황 함유 환원제로서는, 예를 들면 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산(thioctic acid), 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소원자수 1~7의 티오알칸산(thioalkanoic acid) 등의 설프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 산화방지제로서는, 예를 들면 에리소르빈산, 디부틸히드록시 톨루엔, 부틸히드록시 아니솔, α-토코페롤, 초산토코페롤, L-아스코르브 산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산 트리아밀, 몰식자산 프로필 또는 에틸렌디아민 사초산이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다(“Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed., 1980 등 참조). 또한, 약제를 서방성 약제로 하는 방법도 공지로서 본 발명에 적용할 수 있다(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; 미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 제133,988호).
본 발명은 아미노당의 하나인 메글루민에 의해 안정화된 항체 분자를 함유하는 의약조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아미노당의 하나인 메글루민에 의해 회합화가 억제된 항체 분자를 함유하는 의약조성물에 관한 것이다. 또한 상기 의약조성물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 의약조성물 및 키트에는, 상기 안정화된 항체 분자 이외에 제제상 허용되는 재료가 포함되어 있어도 된다. 제제상 허용되는 재료로서는, 상기 기재의 것을 들 수 있다.
본 발명의 의약조성물 형태(제형)로서는 주사제형, 동결건조제형, 용액제형, 또는 스프레이 드라이 제제형 등을 예시할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제제는 통상 밀봉, 멸균된 플라스틱 또는 유리제의 바이알, 앰풀, 주사기와 같은 규정용량 형상의 용기, 및 병과 같은 대용량 형상의 용기로 공급할 수 있다. 사용 편의성의 측면에서는 프리필드 시린지(prefilled syringe)가 바람직하다.
환자로의 투여는 경구, 비경구투여 중 어느 것이어도 가능하나, 바람직하게는 비경구투여이고, 예를 들면 주사투여가 가능하다. 주사투여의 예로서는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는, 예를 들면 단백질, 펩티드, 항체에 대해서는 1회분에 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎에서부터 1000 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면 환자당 0.001~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이들의 투여량 및 투여방법 등에 제한되는 것은 아니다. 저분자화합물에 대해서는 성인에 대해 유효성분량으로서, 1일당 0.1~2000 ㎎의 범위이다. 그러나, 본 발명은 이들의 투여량 및 투여방법 등에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 동결건조 제제 또는 스프레이 드라이 제제는, 사용 전에 용액 제제로 할 수 있다. 따라서 본 발명은, 본 발명의 동결건조 제제 또는 스프레이 드라 이 제제, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트도 또한 제공한다. 약학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 동결건조 제제 또는 스프레이 드라이 제제를 용액 제제화 할 수 있는 것이면, 담체의 종류, 조합의 유무 등에 제한은 없으나, 약학적으로 허용되는 담체로서, 또한 그의 일부로서, 본 발명의 안정화제를 사용함으로써, 용액 제제 중에서의 항체 분자의 회합화를 억제할 수 있다.
본 발명은 메글루민을 항체에 첨가하고, 항체 분자를 안정화시키는 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 메글루민을 항체에 첨가하고, 항체 분자의 회합화를 억제하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법에 관한 것이다. 또한, (1) 메글루민을 항체에 첨가하는 공정, 및 (2) (1)의 혼합물을 용액 제제화하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법에 관한 것이다. 추가로 (1) 메글루민을 항체에 첨가하는 공정, 및 (2) (1)의 혼합물을 동결건조하는 공정의 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법에 관한 것이다.
용액 제제화 및, 동결건조에 관해서는 상기 기재의 방법으로 행할 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술문헌은 참조로서 본 명세서에 편입된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕 메글루민에 의한 hVB22B의 안정화의 검토
고순도로 정제한 sc(Fv)2인 hVB22B sc(Fv)2 u2-wz4(서열번호: 1, 이하 참고예를 참조)를 사용하고, 메글루민에 의한 회합반응의 억제효과의 검토를 행하였다. 안정성 시험에 있어서 용매의 조건, hVB22B 농도는 이하와 같다.
<안정성 시험조건>
대조: 20 mM 구연산나트륨(pH 6.5)
메글루민: 20 mM 구연산나트륨, pH 6.5, 10% 메글루민
hVB22B u2-wz4: 1.0 ㎎/mL
상기 조건하에 있어서 55℃-3일 후 및 6일 후에 SEC(Size Exclusion Chromatography: 사이즈 배제 크로마토그래피)를 사용하여, 모노머 잔존율을 측정하였다(모노머 잔존율은 초기 상태의 모노머 피크 면적에 대한 열가속 샘플 모노머의 피크 면적의 %이다). SEC의 분석조건을 하기에 나타낸다.
<SEC의 분석조건>
칼럼: TSKgel Super2000sw(TOSOH)
용출액: 50 mM 인산나트륨, 300 mM KCl, pH 7.0
유속: 0.2 ㎖/min
검출파장: 220 ㎚
SEC의 분석결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 상기 용액조건에 있어서의 초기, 55℃-3일 후, 6일 후의 모노머 잔존율의 경시변화이다.
이상의 결과에 의해, 대조와 비교하여 메글루민을 첨가함으로써, 대폭적으로 모노머 잔존율이 향상하고, hVB22B의 회합화 반응은 대폭적으로 억제할 수 있는 것 이 명백해졌다. 본 연구에 의해, 안정성이 매우 낮은 저분자화 항체에 대해서 메글루민을 첨가함으로써 현저하게 안정성이 향상하는 것을 발견하였다. 또한 본 연구에 의해 처음으로 메글루민이 단백질의 안정화제로서 유용한 것을 명확히 하였다.
〔실시예 2〕 메글루민이 미치는 다른 sc(Fv)2 분자, 및 전장 항체로의 안정화 효과의 검토
〔실시예 1〕에 나타낸 hVB22B 이외의 sc(Fv)2: 하기에 나타내는 mVB22B(서열번호: 2, 이하 참고예를 참조), 12E10(서열번호: 3, WO02/33072), 2D7(서열번호: 4, 이하 참고예를 참조)에 있어서 메글루민의 안정화 효과를 검토하였다. 또한 sc(Fv)2가 아니라, 전장 항체 IgG1인 인간화 항 IL-6 수용체 항체(H사슬-서열번호: 5, L사슬-서열번호: 6, WO92/19759)에 있어서의 안정화 효과도 검토하였다. 안정성 시험에 있어서 용매의 조건, 각 항체농도는 이하와 같다.
<안정성 시험조건>
대조: 20 mM 구연산 버퍼, pH 6.5
메글루민: 20 mM 구연산 버퍼, 10% 메글루민, pH 6.5
mVB22B: 28 ㎍/mL, 40℃-1주 후, 2주 후에 대하여 측정을 행하였다.
2D7: 59 ㎍/mL, 40℃-1주 후, 2주 후에 대하여 측정을 행하였다.
12E10: 10 ㎍/mL, 55℃-1주 후, 2주 후에 대하여 측정을 행하였다.
IgG: 6.84 ㎎/mL, 60℃-1주 후, 3주 후에 대하여 측정을 행하였다.
상기 조건에 있어서, 열가속시험을 실시하였다.
<SEC의 분석조건>
mVB22B, 2D7, 12E10에 관해서는, 분석은 하기의 조건으로 행하였다.
칼럼: TSKgel Super2000SW (TOSOH)
용출액: 50 mM 인산나트륨, 300 mM KCl, pH 7.0
유속: 0.2 ㎖/min
검출파장: 220 ㎚
IgG에 관해서는, 분석은 하기의 조건으로 행하였다.
칼럼: TSKgel G3000SWxl (TOSOH)
용출액: DPBS(-)
유속: 0.5 ㎖/min
검출파장: 220 ㎚
도 2에 상기의 각 용액 가속조건에 있어서 회합체(aggregate)의 경시변화를 나타낸다. 안정성 시험의 결과, sc(Fv)2, IgG에 한하지 않고, 어떤 분자형태에 있어서도 메글루민 첨가에 의해, 회합체의 생성이 억제되었다. 이상의 결과로부터 메글루민을 첨가함으로써, sc(Fv)2뿐 아니라, 전장 항체의 IgG 등, 항체 분자 전반에 있어서 회합화를 억제하는 효과가 있는 것이 명백해졌다. 메글루민은 지금까지 항체 분자의 안정화제로서의 보고가 없어, 본 검토에 의해 처음으로 메글루민이 항체 분자의 안정화제로서 유용하다는 것을 명확히 하였다.
〔실시예 3〕 IgG의 용액 안정화제, 동결건조 제제의 부형제로서의 메글루민의 검토
IgG의 용액 제제의 안정화제로서, 또는 동결건조 제제의 부형제로서 메글루 민의 안정화 효과를 검토하였다. IgG의 안정화제(부형제)의 비교로서, 일반적인 수크로오스를 사용하였다. 수크로오스는 항체의 동결건조 제제로서 매우 유용한 것이 보고되어 있다. 시험에 제공한 시료 및 안정성 시험조건은 이하와 같다.
<시험에 제공한 시료>
시료 1: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 100 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
시료 2: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 70 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
시료 3: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 50 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
시료 4: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 55 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
시료 5: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 40 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
시료 6: IgG 80 ㎎/vial, 수크로오스 30 ㎎/vial, 폴리소르베이트 80 1 ㎎/vial, 인산나트륨염 30 μ㏖/vial, pH 6.0
상기 시료의 동결건조 제제에 대해서는, IgG농도가 40 ㎎/mL가 되도록 조제한 동결건조 전 용액을 바이알에 2 mL씩 충전하고, 선반형 동결건조기를 사용하여 이하의 조건으로 되는 동결건조를 행함으로써 조제하였다.
※ 동결건조 조건
공정명 온도
예비동결 -50℃
1차 건조 -20℃
2차 건조 25→30℃
또한, 상기 시료의 용액 제제에 대해서는, 동결건조 제제 1바이알당 0.6 mL의 주사용수를 첨가함으로써 조제하였다. 이때 IgG농도는 약 120 ㎎/mL가 된다.
<안정성 시험조건>
동결건조 전후: 동결건조 전 용액 및 동결건조 제제에 대하여 측정을 행하였다.
동결건조 제제: 40℃-1개월 보존시료에 대하여 측정을 행하였다.
용액 제제: 25℃-2주간 보존시료에 대하여 측정을 행하였다.
<SEC의 분석조건>
이하의 분석조건으로 측정을 행하였다.
칼럼: TSKgel G3000SWxl (TOSOH)
용출액: pH 7.0의 인산 완충액(300 m㏖/L 염화나트륨 및 0.05% 아지드화 나트륨을 포함하는 pH 7.0의 50 m㏖/L 인산 완충액)
유속: 1 ㎖/min
검출파장: 280 ㎚
도 3에 동결건조 전후(동결건조 전 용액과 동결건조 제제)의 회합체 함유량에 미치는 수크로오스와 메글루민의 비교, 및 동결건조 제제를 제작하여 40℃-1개 월의 가속시험 후의 회합체 함유량에 미치는 수크로오스와 메글루민의 비교, 및 용액 제제에 있어서 25℃-2주간의 가속시험 후의 회합체 함유량에 미치는 수크로오스와 메글루민의 비교를 나타내었다.
어느 비교에 있어서도, 수크로오스와 비교하여 메글루민 쪽이 회합체 함유율이 낮았다. 이로부터 수크로오스에 비하여 메글루민 쪽이 회합체의 생성에 대한 안정화 작용이 크다는 것을 발견하였다. 또한, 그 안정화 작용에는 메글루민의 농도 의존성이 보여져, 메글루민이 고농도일수록 높은 안정화 작용이 보여졌다. 즉, 동결건조공정에 있어서 항체의 건조 스트레스에 대하여, 메글루민을 첨가함으로써, 메글루민의 농도 의존적으로 동결건조에 의한 회합체의 증가를 억제할 수 있었다. 또한, 동결건조 제제의 40℃-1개월 보존에 의한 회합화도 마찬가지로 억제할 수 있었다. 또한, 농도 약 120 ㎎/mL의 용액 제제에 대하여, 25℃-2주간 보존에 의한 회합화도 마찬가지로 억제할 수 있었다. 그리고, 이와 같은 100 ㎎/mL를 초과하는 고농도 용액 제제에 대해서도, 또한 용액상태 또는 동결건조상태의 어느 것을 불문하고, 메글루민은 수크로오스에 비해 높은 안정화 효과가 있는 것을 발견하였다.
〔실시예 4〕 hVB22B u2-wz4의 -20℃ 동결보존시에 있어서 메글루민의 안정화 효과
hVB22B u2-wz4를 본 발명의 참고예 1~3, WO2005/056603 또는 WO2005/056604에 나타내어진 방법으로 발현하고, 단일 사슬 디아바디형 sc(Fv)2를 정제하였다. 정제된 단일 사슬 디아바디형 sc(Fv)2를 사용하여 이하의 용액조건의 처방(F1 및 F2)을 조제하였다.
F1: 10 ㎎/mL 단일 사슬 디아바디형 sc(Fv)2
20 mM 히스티딘 (pH 6.8)+150 mM NaCl+0.5 ㎎/mL 폴리소르베이트 80
F2: 10 ㎎/mL 단일 사슬 디아바디형 sc(Fv)2+150 mM 메글루민
20 mM 히스티딘 (pH 6.8)+150 mM NaCl+0.5 ㎎/mL 폴리소르베이트 80
이들 시료를 -20℃에 있어서 6개월 동결보존하였다. 보존 전 시료(initial)의 회합체 함유율 및 -20℃·6개월 보존 후 시료(-20℃-6M)의 회합체 함유율을 SEC(겔여과 크로마토그래피)를 사용하여 이하의 조건으로 분석하였다.
액체크로마토그래피
칼럼: TSKgel G3000SWXL (도소)
이동상: 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)+300 mM 염화칼륨
유속: 0.5 mL/min
검출: 220 ㎚
시료주입량: 10 μL
칼럼온도: 실온
샘플온도: 5℃
도 4에 SEC에 의해 해석된 보존 전 시료와 -20℃·6개월 후 시료의 회합체 함유율을 나타내었다. -20℃·6개월의 회합체 증가분은 메글루민을 포함하지 않는 F1에 있어서는 4.8% 회합체가 증가한 것에 대해서, 메글루민을 안정화제로서 포함하는 F2에 있어서는 회합체의 증가는 0.4%로 억제할 수 있었다. 본 실시예에 있어서, 메글루민은 동결상태에 있어서도 단백질을 안정화하는 작용을 갖는 것이 나타 내어졌다.
〔실시예 5〕 인간화 이중특이성 항체 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ에 있어서 메글루민의 안정화 효과
정제된 인간화 이중특이성 항체 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ를 사용하여 이하의 용액조건의 처방(AF1, AF2, AF3)을 조제하였다. hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ로 되는 인간화 이중특이성 항체는 IgG4 타입의 항체로, 서열번호: 49로 나타내어지는 제1 H사슬의 가변영역(hA69-KQ), 서열번호: 50으로 나타내어지는 제2 H사슬의 가변영역(hB26-PF), 및 각각의 H사슬에 공통의 서열번호: 51로 나타내어지는 L사슬의 가변영역(hAL-AQ)을 포함하는 항체이다.
AF1: 20 mM 히스티딘-HCl, 50 mM NaCl, pH 5.8, 120 ㎎/mL hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ
AF2: 20 mM 히스티딘-HCl, 50 mM NaCl, 200 mM 메글루민, pH 5.8, 120 ㎎/mL hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ
AF3: 20 mM 히스티딘-HCl, 50 mM NaCl, 200 mM 아르기닌-HCl, pH 5.8, 120 ㎎/mL hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ
이들 시료를 25℃에 있어서 2개월 상온보존하였다. 보존 전 시료(initial)의 회합체 함유율 및 25℃·2개월 보존 후 시료(25℃-2M)의 회합체 함유율을 SEC(겔여과 크로마토그래피)를 사용하여 이하의 조건으로 분석하였다. 측정시에 AF1, AF2, AF3를 SEC의 이동상을 사용하여 1 ㎎/mL로 희석하고, 희석한 시료를 사용하여 분석을 행하였다.
액체크로마토그래피
칼럼: TSKgel G3000SWXL (도소)
이동상: 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)+300 mM 염화칼륨
유속: 0.5 mL/min
검출: 220 ㎚
시료주입량: 10 μL(120 ㎎/mL의 용액을 이동상으로 1 ㎎/mL로 희석한 용액을 주입)
칼럼온도: 실온
샘플온도: 5℃
도 5에 SEC에 의해 해석된 보존 전 시료 및 25℃·2개월 후 시료의 회합체 함유율을 나타내었다. 25℃·6개월의 회합체 증가분은 안정화제를 포함하지 않는 AF1에 있어서는 0.51% 회합체가 증가한 것에 대해서, 메글루민을 안정화제로서 포함하는 AF2에 있어서는 회합체의 증가는 0.26%로 억제할 수 있었고, 아르기닌을 안정화제로서 포함하는 AF3에 있어서는 회합체의 증가는 0.27%였던 점에서, 아르기닌과 비교하여 메글루민은 동등 이상의 안정화 효과를 갖고 있는 것이 나타내어졌다. 또한, 실시예 3과 동일하게 나타내어지는 바와 같이, 120 ㎎/mL로 되는 고농도의 인간화 이중특이성 항체 hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 용액에 있어서도 메글루민은 안정화 효과를 갖는 것이 나타내어졌다. 또한 메글루민은 IgG, sc(Fv)2뿐 아니라, 이중특이성 IgG에 있어서도 안정화 효과를 갖고 있는 것이 나타내어진 점으로부터, 널리 단백질의 안정화제로서 사용하는 것이 가능하다.
이하, 본 발명의 sc(Fv)2 항체(hVB22B, mVB22B, 2D7)의 제작방법에 대하여 참고예를 예시하나, 본 발명은 이들 참고예에 제한되는 것은 아니다.
〔참고예 1〕 항 인간 Mpl 항체의 제작
1.1 Mpl 발현 BaF3 세포주의 수립
TPO 의존증식성 세포주를 얻기 위해, 전장 Mpl 유전자를 발현하는 BaF3 세포주의 수립을 행하였다.
전장 인간 Mpl cDNA(Palacios들, Cell 1985; 41: 727-734)(GenBank #NM_005373)를 PCR에 의해 증폭하고, pCHOI(Hirata들, FEBS Letter 1994; 356: 244-248)의 DHFR 유전자 발현부위를 제거하여, HEF-VH-gγl(Sato들, Mol Immunol. 1994; 31: 371-381)의 네오마이신 내성 유전자 발현부위를 삽입한 발현 벡터 pCOS2에 클로닝하고, pCOS2-hMplfull을 구축하였다.
또한, 게잡이 원숭이 골수세포로부터 추출한 Total RNA로부터 SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사제)를 사용하고, 게잡이 원숭이 Mpl cDNA(서열번호: 7)를 클로닝하였다. 얻어진 게잡이 원숭이 cDNA를 pCOS2에 삽입하고, pCOS2-monkeyMplfull을 구축하였다.
또한, 전장 마우스 Mpl cDNA(GenBank #NM_010823)를 PCR에 의해 증폭하고, pCOS2에 삽입하여, pCOS2-mouseMplfull을 구축하였다.
제작한 각 벡터(20 ㎍)를 PBS에 현탁한 BaF3세포(1×107 cells/mL)에 혼합하고, Gene Pulser 큐벳에 첨가하여, Gene Pulser II(Bio-Rad사제)를 사용하여 0.33 ㎸, 950 μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 일렉트로포레이션 처리에 의해 유전자 도입한 BaF3세포를 1 ng/mL 마우스 인터루킨 3(이하, mIL-3, Peprotech사제), 500 ㎍/mL 제네티신(Geneticin)(Invitrogen사제), 10% FBS(Invitrogen사제)를 포함하는 RPMI1640 배지(Invitrogen사제)에 추가로 선발하고, 인간 Mpl 발현 BaF3 세포주(이하, BaF3-human Mpl), 원숭이 Mpl 발현 BaF3 세포주(이하, BaF3-monkey Mpl) 및 마우스 Mpl 발현 BaF3 세포주(이하, BaF3-mouse Mpl)를 수립하였다. 선발 후는 1 ng/mL rhTPO(R&D사제), 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지를 사용하여 배양, 유지하였다.
1.2 Mpl 발현 CHO 세포주의 수립
플로우 사이토메트리(Flow Cytometry)를 사용한 결합활성 평가용 세포주를 얻기 위해, 전장 Mpl 유전자를 발현하는 CHO 세포주의 수립을 행하였다.
처음으로, pCXN2(Niwa들, Gene 1991; 108: 193-199)의 HindⅢ 부위에 pCHOI의 DHFR 유전자 발현부위를 삽입하고, 발현 벡터 pCXND3를 제작하였다. pCOS2-hMplfull, pCOS2-monkeyMplfull 및 pCOS2-mouseMplfull을 주형으로 하고, His-tag 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 Mpl 유전자를 pCXND3에 클로닝해, pCXND3-hMpl-His, pCXND3-monkey Mpl-His 및 pCXND3-mouse Mpl-His를 구축하였다.
제작한 각 벡터(25 ㎍)를 PBS에 현탁한 CHO-DG44세포(1×107 cells/mL)에 혼합하고, Gene Pulser 큐벳에 첨가하여, Gene Pulser II(Bio-Rad사제)를 사용하여 1.5 ㎸, 25 μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 일렉트로포레이션 처리에 의해 유전자 도입한 CHO 세포를 500 ㎍/mL Geneticin, 1×HT(Invitrogen사제)를 포함하는 CHO-S-SFMII 배지(Invitrogen사제)에 추가로 선발하고, 인간 Mpl 발현 CHO 세포주(이하, CHO-human Mpl) 및 원숭이 Mpl 발현 CHO 세포주(이하, CHO-monkey Mpl) 및 마우스 Mpl 발현 CHO 세포주(이하, CHO-mouse Mpl)를 수립하였다.
1.3 가용형 인간 Mpl 단백질의 조제
가용형 인간 Mpl 단백질을 조제하기 위해, 곤충세포 Sf9세포로 분비생산하는 발현계를 이하와 같이 구축하였다.
인간 Mpl의 세포외 영역(Gln26에서부터 Trp491)의 하류에 FLAG 태그를 부가한 유전자를 제작하고, pBACSurf-1 Transfer Plasmid(Novagen사제)의 PstI-SmaI부위에 삽입하여, pBACSurf1-hMpl-FLAG를 제작하였다. 계속해서, Bac-N-Blue Transfection Kit(Invitrogen)를 사용하고, 4 ㎍의 pBACSurf1-hMpl-FLAG를 Sf9세포에 도입하였다. 배양 3일 후에 배양상청을 회수하고, 플라크 어세이(plaque assay)에 의해 재조합 바이러스를 단리하였다. 바이러스 스톡을 조제 후에 Sf9세포에 감염시켜 배양상청을 회수하였다.
얻어진 배양상청을 사용하고, 이하와 같이 가용형 인간 Mpl 단백질을 정제하였다. 배양상청을 Q Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences사제)에 흡착시킨 후에, 50 mM Na-Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 500 mM NaCl(pH 7.2)을 사용하여 용출하였다. 용출액을 FLAG M2-Agarose(SIGMA-ALDRICH사제)에 흡착시킨 후에, 100 mM Glycine-HCl, 0.01%(v/v) Tween20(pH 3.5)을 사용하여 용출하였다. 용 출 후, 즉시 1 M Tris-Cl(pH 8.0)에 의해 중화하고, PD-10 column(Amersham Biosciences사제)을 사용하여, PBS(-), 0.01%(v/v) Tween20에 치환을 행하였다. 정제한 가용형 Mpl 단백질을 shMpl-FLAG라고 칭한다.
1.4 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질의 조제
인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질 유전자는 Bennett들의 방법(Bennett들, J. Biol. Chem. 1991; 266: 23060-23067)에 따라 제작하였다. 인간 Mpl의 세포외 영역(Gln 26부터 Trp 491)을 코드하는 염기서열을 인간 IgG-γ1의 Fc영역(Asp 216보다 하류의 영역)을 코드하는 염기서열에 연결하고, 연결부에 Fusion Linker로서 BstEII서열(아미노산 Val-Thr)을 부가하였다. 시그널 서열은 인간 IgG H사슬 가변영역의 시그널 펩티드 19 아미노산을 사용하였다. 얻어진 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질 유전자를 pCXND3에 클로닝하고, pCXND3-hMpl-Fc를 구축하였다.
제작한 벡터(25 ㎍)를 PBS에 현탁한 CHO-DG44세포(1×107 cells/mL)에 혼합하고, Gene Pulser 큐벳에 첨가하여, Gene Pulser II(Bio-Rad사제)를 사용하여 1.5 ㎸, 25 μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 일렉트로포레이션 처리에 의해 유전자 도입한 CHO 세포를 500 ㎍/mL Geneticin, 1×HT를 포함하는 CHO-S-SFMII 배지에 추가로 선발하고, shMPL-Fc 발현 CHO 세포주(CHO-hMpl-Fc)를 수립하였다.
얻어진 배양상청을 사용하고, 이하와 같이 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질을 정제하였다.
배양상청을 Q Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences사제)에 흡착시킨 후에, 50 mM Na-Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 1 M NaCl(pH 7.6)을 사용하여 용출하였다. 용출액을 HiTrap ProteinG HP칼럼(Amersham Biosciences사제)에 흡착시킨 후에, 0.1 M Glycine-HCl, 150 mM NaCl, 0.01%(v/v) Tween20(pH 2.7)을 사용하여 용출하였다. 용출 후, 즉시 1 M Tris-Cl(pH 8.0)에 의해 중화하고, PD-10 column(Amersham Biosciences사제)을 사용하여, PBS(-), 0.01%(v/v) Tween20에 치환을 행하였다. 정제한 가용형 Mpl 단백질을 hMpl-Fc라고 칭한다.
1.5 shMpl-FLAG 또는 BaF3-human Mpl의 면역 및 하이브리도마의 선발
MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr 마우스(이하, MRL/lpr 마우스, 일본 찰스·리버로부터 구입)를 사용하여, 8주령부터 면역을 개시하였다. 초회 면역은 100 ㎍/마리의 shMPL-FLAG에 프로인트 완전보조제(Freund's complete adjuvant)(H37 Ra, 벡톤·디킨슨사제)를 첨가하고, 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 추가면역은 50 ㎍/마리의 shMPL-FLAG에 프로인트 불완전보조제(Freund's incomplete adjuvant)(벡톤·디킨슨사제)를 첨가하고, 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 합계 6회 면역을 행한 마우스 3마리에 대해, 50 ㎍/마리의 shMPL-FLAG를 꼬리 정맥 내 투여함으로써 최종면역을 행하였다. 마우스 골수종세포 P3-X63Ag8U1(P3U1, ATCC로부터 구입)과 마우스 비장세포를 혼합하고, Polyethylene Glycol 1500(Roche Diagnostics사제)을 첨가하면서 혼합함으로써 세포 융합을 행하였다. 익일부터 HAT 배지를 사용하여 선발을 행하고, 배양상청을 사용하여 shMpl-FLAG 또는 hMpl-Fc를 고상화한 이뮤노플레이트를 사용한 ELISA 및 BaF3-human Mpl을 사용한 세포증식활성을 지표로 한 스 크리닝을 실시하였다. 또한, BaF3-human Mpl을 Balb/C 마우스에 1.0×107 세포씩 1주에서부터 5개월의 간격으로 복강 내 투여하고, 합계 11회 면역하였다. 동일하게 세포 융합에 의해 하이브리도마를 제작하고, BaF3-human Mpl을 사용한 세포증식활성을 지표로 한 스크리닝을 실시하였다. 양성 클론에 대하여, 한계희석법에 의해 단일클론화한 후에, 확대 배양을 행하고, 배양상청을 회수하였다.
1.6 항 인간 Mpl 항체의 해석
항체농도는 염소 항 마우스 IgG(gamma)(ZYMED사제)와 알칼리 포스파타아제-염소 항 마우스 IgG(gamma)(ZYMED사제)를 사용한 마우스 IgG 샌드위치 ELISA를 행하고, 아이소타이프(Isotype)가 동일한 시판 항체를 표준으로 하여, GraphPad Prism(GraphPad Software, USA)을 사용하여 검량선을 작성하고, 항체농도의 환산을 행하였다.
항체의 아이소타이프는, 아이소타이프 특이적인 2차 항체를 사용한 항원의존적 ELISA로 결정하였다. hMpl-Fc를 1 ㎍/mL가 되도록 coating buffer(0.1 mM NaHCO3(pH 9.6), 0.02%(w/v) NaN3)로 희석한 것을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응하여, 코팅하였다. Diluent buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.1), 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween20, 0.02%(w/v) NaN3, 1%(w/v) BSA)로 블로킹 처리를 행한 후, 하이브리도마의 배양상청을 첨가하고, 실온에서 1시간 방치하였다. Rinse buffer(0.05%(v/v) Tween20, PBS)로 세정한 후, 알칼리 포스파타아제 표지한 아이소타이프 특이적 2차 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 방치하였다. 발색은 SIGMA104(SIGMA-ALDRICH사제)를 1 ㎎/mL가 되도록 Substrate Buffer(50 mM NaHCO3(pH 9.8), 10 mM, MgCl2)로 희석한 것을 사용하고, 405 ㎚의 흡광도를 Benchmark Plus(Bio-Rad사제)로 측정하였다.
shMpl-FLAG 및 hMPL-Fc에 대한 결합활성은 ELISA에 의해 평가하였다. 정제한 shMpl-FLAG 및 hMPL-Fc를 1 ㎍/mL가 되도록 코팅하고, Diluent buffer로 블로킹 처리를 행하였다. 하이브리도마의 배양상청을 첨가하고, 실온에서 1시간 방치한 후, 알칼리 포스파타아제 표지한 항 마우스 IgG 항체(Zymed사제)를 첨가하여, 상기 방법과 동일하게 발색을 행하였다. 실온에서 1시간 발색시킨 후에 405 ㎚의 흡광도를 측정하고, GraphPad Prism을 사용하여 EC50 값을 산출하였다.
CHO-human Mpl 또는 CHO-monkey Mpl을 회수하고, 1×106 cell/mL가 되도록 FACS Buffer(1% FBS/PBS)에 현탁하였다. 100 μL/well이 되도록 Multiscreen(Millipore사제)에 분주하고, 원심조작으로 배양상청을 제거하였다. 5 ㎍/mL가 되도록 희석한 배양상청을 첨가하고, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 세포를 FACS buffer로 1회 세정하고, FITC 표지 항 마우스 IgG 항체(Beckman Coulter사제)를 첨가하고, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 500 rpm으로 1분간 원심하고, 상청을 제거하여, FACS Buffer 400 μL에 현탁하고, EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter)를 사용하여 플로우 사이토메트리를 행하였다. 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter)의 히스토그램으로 생세포 집단에 게이트를 설정하였다.
항체의 아고니스트 활성은 TPO 의존성 증식을 나타내는 BaF3-human Mpl 또는 BaF3-monkey Mpl을 사용하여 평가하였다. 각 세포를 각각 4×105 cells/mL가 되도록 10% 소 태아 혈청(Invitrogen사제)을 포함하는 RPMI1640(Invitrogen사제)에 현탁하고, 60 μL/well로 96 웰 플레이트에 분주하였다. rhTPO(R&D사제) 및 하이브리도마 배양상청의 농도를 달리하여, 각 웰에 40 μL 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 10 μL/well로 Cell Count Reagent SF(나칼라이 테스크사제)를 첨가하고, 2시간 배양 후에, 450 ㎚의 흡광도(대조 655 ㎚)를 Benchmark Plus로 측정하여, GraphPad Prism을 사용하여 EC50 값을 산출하였다.
이들 해석에 의해, 인간 Mpl에 결합하는 마우스 단일클론항체를 합계 163개 취득하였다.
이하에 기재하는 항 인간 Mpl 항체 중에서, TA136은 BaF3-human Mpl 면역 마우스로부터 수립되고, 그 이외의 항체는 shMpl-Flag 면역 마우스로부터 수립하였다.
1.7 항 인간 Mpl 항체의 정제
하이브리도마의 배양상청을 사용하고, 이하와 같이 항 인간 Mpl 항체를 정제하였다.
배양상청을 HiTrap proteinG HP칼럼(Amersham Biosciences사제)에 흡착시킨 후에, 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)을 사용하여 용출하였다. 용출 후, 즉시 1 M Tris-Cl(pH 9.0)에 의해 즉시 중화하고, PBS로 하루 투석을 행하여, 버퍼 치환을 행하였다.
1.8 항 인간 Mpl 항체 VB22B의 에피토프의 결정
항 인간 Mpl 항체 VB22B가 웨스턴 블로팅(western blotting)에 사용 가능한 성질을 이용하고, 인간 Mpl의 부분서열과 GST의 융합 단백질을 구축하여 VB22B의 에피토프 해석을 행하였다. MG1(Gln 26부터 Trp 491), MG2(Gln 26부터 Leu 274)의 영역을 각각 PCR 증폭하고, GST 융합 단백질로서 발현되도록 pGEX-4T-3(Ameesham사)에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 DH5α로 도입하여 형질전환체를 얻고, 대수 증식기에 있는 형질전환체에 1 mM가 되도록 IPTG를 첨가함으로써 GST 융합 단백질의 발현을 유도하여, 2시간 배양 후에 균체를 회수하였다. 초음파(Sonication)에 의해 파쇄 후, XL-80 Ultracentrifuge(Beckman, Rotor 70.1 Ti)를 사용하여 35,000 rpm으로 30분 원심 후의 배양상청을 회수하고, GST Purification Modules(Amersham사)을 사용하여 정제하였다. 10%-SDS-PAGE에 의해 분리 후, PVDF막에 트랜스퍼하고, VB22B 마우스 항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 행하였다. VB22B는 MG-1, MG-2를 인식한 것으로부터, VB22B의 에피토프는 Gln 26부터 Leu 274의 영역에 있는 것이 판명되었다.
다음으로, MG3(Gln 26부터 Ala 189), MG4(Gln 26부터 Pro 106), MG5(Gln 26부터 Glu 259), MG6(Gln 26부터 Gly 245)의 영역과 GST의 융합 단백을 제작하여 동일하게 웨스턴 블로팅을 행한 결과, VB22B는 MG5, MG6를 인식했으나, MG3, MG4를 인식하지 못한 것으로부터, VB22B의 에피토프는 Ala 189부터 Gly 245의 주변에 존재하는 것이 예상되었다. 또한 MG7(Gln 26부터 Ala 231), MG8(Gln 26부터 Pro 217) 과 GST의 융합 단백질을 제작하여 평가한 결과, VB22B는 MG7을 인식했으나, MG8은 인식하지 못한 것으로부터 VB22B의 에피토프는 Gln 217부터 Ala 231의 주변에 존재하는 것이 나타내어졌다. 또한 MG10(Gln 213부터 Ala 231)과 GST의 융합 단백질과의 결합이 확인된 것으로부터, VB22B의 에피토프는 Gln 213부터 Ala 231의 19 아미노산에 한정되었다.
1.9 항 인간 Mpl 항체 VB22B의 항원항체반응의 반응속도론적 해석
항 인간 Mpl 항체 VB22B가 가용형 재조합 Mpl에 결합하는 성질을 이용하여, 실시예 1.4에서 나타낸 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질과 VB22B IgG의 항원항체반응에 있어서 속도론적인 해석을 행하였다. Biacore 2000(Biacore사제)에 Sensor Chip CM5(Biacore사제)를 세팅하고, 아민 커플링법으로 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질을 고정화하였다. 다음으로, HBS-EP Buffer(Biacore사제)를 사용하여 1.25~20 ㎍/mL의 VB22B IgG를 조제하고, VB22B IgG를 2분간 첨가하여, 결합영역을 얻은 후에, HBS-EP Buffer를 2분간 첨가함으로써 해리영역을 얻었다. Sensor Chip 상의 인간 Mpl-IgG Fc 융합 단백질에 결합한 VB22B IgG는 10 mM NaOH를 15초간 첨가하여 제거하고, Sensor Chip을 재생하였다. 런닝 버퍼로서 HBS-EP Buffer를 사용하고, 유속은 20 μL/min으로 하였다. BIAevaluation ver. 3.1 소프트웨어(Biacore사제)를 사용하여, 각 농도에서 얻어진 센서그램으로 반응속도 정수를 산출하였다. 그 결과, VB22B IgG의 해리정수(KD)는 1.67±0.713×10-9 M이었다.
〔참고예 2〕 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 제작
취득한 항 인간 Mpl 항체 중에서 결합활성 및 아고니스트 활성이 높았던 23종류의 항체에 대하여, 유전자공학적 수법에 의해 단일 사슬 항체의 발현계를 구축하였다. 이하에 항 인간 Mpl 항체 VB22B의 단일 사슬 항체 제작예에 대하여 나타낸다.
2.1 항 인간 Mpl 항체 가변영역의 클로닝
항 인간 Mpl 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 추출한 Total RNA를 사용하고, RT-PCR법에 의해 증폭하였다. Total RNA는 RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN사제)를 사용하여 1×107 세포의 하이브리도마로부터 추출하였다.
1 ㎍의 Total RNA를 사용하고, SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH사제)를 사용하여, 마우스 IgG2b 정상영역 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2b(서열번호: 8) 또는 마우스 κ사슬 정상영역 염기서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 kappa(서열번호: 9)를 사용하고, 5′말단측 유전자 단편을 증폭하였다. 역전사반응은 42℃에서 1시간 30분간 반응시켰다.
PCR 반응 용액(50μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×Advantage 2 PCR Buffer,
5 μL의 10×Universal Primer A Mix,
0.2 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
1 μL의 Advantage 2 Polymerase Mix
(이상의 성분은 모두 CLONTECH사제),
2.5 μL의 역전사반응 산물,
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 MHC-IgG2b 또는 kappa
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/5초간, 72℃/3분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/5초간, 70℃/10초간, 72℃/3분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/5초간, 68℃/10초간, 72℃/3분간의 사이클을 25회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 7분간 가열하였다.
PCR 산물은 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, pGEM-T Easy 벡터(Promega사제)로 클로닝하였다. 추가로, ABI 3700 DNA Analyzer(Perkin Elmer사제)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
클로닝한 VB22B H사슬 가변영역(이하, VB22B-VH)의 염기서열을 서열번호: 10, 아미노산 서열을 서열번호: 11, 및 L사슬 가변영역(이하, VB22B-VL)의 염기서열을 서열번호: 12, 아미노산 서열을 서열번호: 13에 나타낸다.
2.2 항 인간 Mpl 항체 디아바디 발현 벡터의 제작
5 아미노산으로 되는 링커 서열을 사용한 VB22B 단일 사슬 Fv(이하, VB22B 디아바디)를 코드하는 유전자는 VB22B-VH를 코드하는 유전자의 3′말단 및 VB22B-VL을 코드하는 유전자의 5′말단에 (Gly4Ser)1으로 되는 링커를 코드하는 염기서열을 부가시킨 유전자에 대해서, 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 구 축하였다.
VB22B-VH의 전방 프라이머 70·115HF(서열번호: 14)는 EcoRI 부위를 갖도록 설계하고, VB22B-VH의 후방 프라이머 33·115HR(서열번호: 15)은 VB22B-VH의 C말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하며, 또한 (Gly4Ser)1으로 되는 링커를 코드하는 염기서열 및 VB22B-VL의 N말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖도록 설계하였다. VB22B-VL의 전방 프라이머 33·115LF(서열번호: 16)는 VB22B-VL의 N말단을 코드하는 염기서열 및 (Gly4Ser)1으로 되는 링커를 코드하는 염기서열, VB22B-VH의 C말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다. VB22B-VL의 후방 프라이머 33·115LR(서열번호: 17)은 VB22B-VL의 C말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하고, 또한 FLAG 태그(AspTyrLysAspAspAspAspLys/서열번호: 18)를 코드하는 염기서열을 갖고, 추가로 NotI 부위를 갖도록 설계하였다.
제1 PCR에 있어서, VB22B-VH 및 링커 서열과 VB22B-VL 및 링커 서열을 포함하는 2개의 PCR 반응물을 이하와 같이 합성하였다.
PCR 반응 용액(50 μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×PCR Buffer,
0.4 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
2.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 TaKaRa Ex Taq
(이상의 성분은 모두 다카라 주조사제),
10 ng의 VB22B-VH 또는 VB22B-VL 유전자를 포함하는 pGEM-T Easy 벡터,
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 70·115HF, 33·115HR 또는 33·115LF, 33·115LR
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/15초간, 72℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 70℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 68℃/2분간의 사이클을 28회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
약 400 bp의 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, 각 PCR 산물의 일부를 사용하여 이하와 같이 제2 PCR을 행하였다.
PCR 반응 용액(50 μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×PCR Buffer,
0.4 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
2.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 TaKaRa Ex Taq
(이상의 성분은 모두 다카라 주조사제),
1 μL의 제1 PCR 산물(2종류),
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 70·115HF, 33·115LR
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/15초간, 72℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 70℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 68℃/2분간의 사이클을 28회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
약 800 bp의 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, 제한효소 EcoRI(다카라 주조사제) 및 제한효소 NotI(다카라 주조사제)로 소화한 후에, QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사제)를 사용하여 정제하고, pCXND3에 클로닝하여, pCXND3-VB22B db를 제작하였다.
2.3 항 인간 Mpl 항체 sc(Fv)2 발현 벡터의 제작
VB22B 유래의 2개의 H사슬 가변영역 및 2개의 L사슬 가변영역을 포함하는 개변 항체[sc(Fv)2]를 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해, 전술의 pCXND3-VB22B db를 사용하여 이하와 같이 PCR법에 의해 수식하였다.
처음으로, VB22B-VH를 코드하는 유전자의 3′말단 및 VB22B-VL을 코드하는 유전자의 5′말단에 15 아미노산으로 되는 링커 (Gly4Ser)3를 코드하는 염기서열을 부가시킨 유전자에 대해서, 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 구축하였다. 이 구축과정에 있어서, 3종류의 프라이머를 새로 설계하였다. VB22B-VH의 전방 프라이머 VB22B-fpvu(프라이머 A, 서열번호: 19)는 5′말단에 EcoRI 부위를 갖고, VB22B db의 Gln 22 및 Leu 23이 PvuII 부위에 변환하도록 설계하였다. VB22B-VH의 후방 프라이머 sc-rL15(프라이머 B, 서열번호: 20)는 VB22B-VH의 C말단을 코 드하는 DNA에 하이브리다이즈하고, 또한 (Gly4Ser)3로 되는 링커를 코드하는 염기서열 및 VB22B-VL의 N말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖도록 설계하였다. VB22B-VL의 전방 프라이머 sc-fL15(프라이머 C, 서열번호: 21)는 VB22B-VL의 N말단을 코드하는 염기서열 및 (Gly4Ser)3로 되는 링커를 코드하는 염기서열, VB22B-VH의 C말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다.
제1 PCR에 있어서, VB22B-VH 및 링커 서열과 VB22B-VL 및 링커 서열을 포함하는 2개의 PCR 반응물을 이하와 같이 합성하였다.
PCR 반응 용액(50 μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×PCR Buffer,
0.4 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
2.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 TaKaRa Ex Taq
(이상의 성분은 모두 다카라 주조사제),
10 ng의 pCXND3-VB22B db,
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 VB22B-fpvu, sc-rL15 또는 sc-fL15, 33·115LR(프라이머 D)
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/15초간, 72℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 70℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 68℃/2분간의 사이클을 28회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
약 400 bp의 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, 각 PCR 산물의 일부를 사용하여 이하와 같이 제2 PCR을 행하였다.
PCR 반응 용액(50 μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×PCR Buffer,
0.4 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
2.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 TaKaRa Ex Taq
(이상의 성분은 모두 다카라 주조사제),
1 μL의 제1 PCR 산물(2종류),
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 70·115HF, 33·115LR
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/15초간, 72℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 70℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 68℃/2분간의 사이클을 28회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
약 800 bp의 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, 제한효소 EcoRI(다카라 주조사제) 및 제한효소 NotI(다카라 주조사제)로 소화한 후에, QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사제)를 사용하여 정제하고, pBacPAK9(CLONTECH사제)에 클로닝하여, pBacPAK9-scVB22B를 제작하였다.
다음으로, pBacPAK9-scVB22B의 PvuII 부위에 삽입하는 단편을 제작하였다. 즉 N말단이 없는 VB22B-VH와 VB22B-VL을 (Gly4Ser)3로 되는 링커로 연결한 아미노산을 코드하는 유전자를 추가로 VB22B-VH의 N말단을 코드하는 유전자와 (Gly4Ser)3로 되는 링커를 코드하는 염기서열로 연결하는 단편으로, 양쪽 말단이 PvuII 인식 서열이 되는 단편이다. 2종류의 프라이머를 새로 설계하고, PCR법을 사용하여, 이 단편을 제작하였다. 목적 단편의 전방 프라이머 Fv2-f(프라이머 E, 서열번호: 22)는 5′말단에 PvuII 부위를 갖고, VB22B-VH의 5′말단측의 서열을 갖도록 설계하였다. 목적 단편의 후방 프라이머 Fv2-r(프라이머 F, 서열번호: 23)은 VB22B-VL의 C말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하고, 또한 (Gly4Ser)3로 되는 링커를 코드하는 염기서열 및 VB22B-VH의 N말단을 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하는 염기서열, 추가로 PvuII 부위를 갖도록 설계하였다. pBacPAK9-scVB22B를 주형으로 하고, 이하와 같이 PCR을 행하였다.
PCR 반응 용액(50 μL)의 조성을 다음에 나타낸다.
5 μL의 10×PCR Buffer,
0.4 mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
2.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 TaKaRa Ex Taq
(이상의 성분은 모두 다카라 주조사제),
10 ㎍의 pBacPAK9-scVB22B,
10 p㏖의 합성 올리고뉴클레오티드 Fv2-f, Fv2-r
또한 반응온도조건은 다음과 같다.
94℃의 초기온도에서 30초간,
94℃/15초간, 72℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 70℃/2분간의 사이클을 5회 반복,
94℃/15초간, 68℃/2분간의 사이클을 28회 반복,
마지막으로 반응 산물을 72℃에서 5분간 가열하였다.
약 800 bp의 PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 아가로스 겔로부터 정제한 후, pGEM-T Easy 벡터(Promega사제)에 클로닝하였다. 염기서열의 결정 후, 제한효소 PvuII(다카라 주조사제)로 소화한 후에, 목적 단편을 회수하였다. pBacPAK9-scVB22B를 제한효소 PvuII(다카라 주조사제)로 소화한 후에, 회수한 단편을 연결하고, pBacPAK9-VB22B sc(Fv)2를 제작하였다. 제작한 벡터를 제한효소 EcoRI(다카라 주조사제) 및 제한효소 NotI(다카라 주조사제)로 소화한 후에, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용하여, 약 1600 bp의 단편을 아가로스 겔로부터 정제하고, 발현 벡터 pCXND3에 클로닝하여, pCXND3-VB22B sc(Fv)2를 제작하였다.
2.4 동물세포를 사용한 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 발현
CHO-DG44세포를 사용한 단일 사슬 항체의 안정 발현 세포주의 제작은 다음과 같이 하여 행하였다. Gene PulserII(BioRad사제)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 유전자를 도입하였다. 발현 벡터(25 ㎍)와 PBS에 현탁한 CHO-DG44세포(1×107 세포/mL)의 0.75 mL를 혼합한 것을 빙상에서 10분간 냉각하고, 큐벳으로 옮긴 후에 1.5 ㎸, 25 μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 500 ㎍/mL Geneticin(Invitrogen사제)을 포함하는 CHO-S-SFMII 배지(Invitrogen사제)에 추가로 선발하고, 발현 CHO 세포주를 수립하였다. VB22B sc(Fv)2는 이 방법으로 안정 발현 세포주 및 그의 배양상청을 조제하였다.
COS7세포를 사용한 단일 사슬 항체의 일과성 발현은 다음과 같이 하여 행하였다. 발현 벡터(10 ㎍)와 PBS에 현탁한 COS7세포(1×107 세포/mL)의 0.75 mL를 혼합한 것을 빙상에서 10분간 냉각하고, 큐벳으로 옮긴 후에 1.5 ㎸, 25 μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지(Invitrogen사제)에 첨가하고, 하룻밤 배양한 후에, PBS로 세정 후에 CHO-S-SFMII 배지를 첨가하여 약 3일간 배양하였다. VB22B 디아바디는 이 방법으로 배양상청을 조제하였다.
2.5 배양상청 중의 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 정량
COS세포에 일과성 발현시킨 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 배양상청 중의 농도는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정하였다. 즉 Biacore 2000(Biacore사제)에 Sensor Chip CM5(Biacore사제)를 세팅하고, ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA-ALDRICH사제)를 결합하였다. 유속 5 mL/sec로 적농도의 샘플을 흘리고, 50 mM 디에틸아민을 흘려 결합한 항체를 해리시켰다. 샘플을 흘렸을 때의 질량변화를 측정하고, 표준품의 질량변화를 토대로 작성한 검량선을 사용하여, 농도를 산출하였다. 디아바디에 대한 표준품은 db12E10(WO02/33073, WO02/33072 참조)을 사용하고, sc(Fv)2에 대한 표준품은 같은 유전자구조를 갖는 12E10 sc(Fv)2를 사용하였다.
2.6 항 인간 Mpl 디아바디 및 단일 사슬 항체의 정제
VB22B 디아바디 발현 COS7세포 또는 CHO 세포의 배양상청을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 평형화한 Anti-Flag M2 Affinity Gel(SIGMA-ALDRICH사제) 칼럼에 흡착시키고, 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)로 용출시켰다. 용출 분획은 즉시 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화를 행하고, HiLoad 26/60 Superdex200pg(Amersham-Bioscience사제) 칼럼을 사용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하였다. 겔여과 크로마토그래피의 버퍼는 PBS, 0.01% Tween20을 사용하였다.
VB22B sc(Fv)2 발현 COS7세포 또는 CHO 세포의 배양상청을 디아바디 정제와 동일 조건에서 정제를 행하였다. 또한, 대량으로 조제하는 경우에는 CHO 세포의 배양상청을 20 mM 인산 완충액(pH 6.8)으로 평형화한 Marco-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I(Bio-Rad사제) 칼럼에 걸어, 250 mM 인산 완충액(pH 6.8)으로 단계적으로 용출하였다. 용출 분획은 한외여과막을 사용하여 농축 후, HiLoad 26/60 Superdex200pg 칼럼을 사용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하고, 분자량이 약 40 kD~70 kD에 상당하는 분획을 분취하였다. 이 분획을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 평형화한 Anti-Flag M2 Affinity Gel 칼럼에 흡착시키고, 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5)로 용출시켰다. 용출 분획은 즉시 1 M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화를 행하고, HiLoad 26/60 Superdex200pg 칼럼을 사용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하였다. 겔여과 크로마토그래피의 버퍼는 20 mM 초산 완충액(pH 6.0), 150 mM NaCl, 0.01% Tween80을 사용하였다. 각 정제 스텝에 있어서 디아바디 및 sc(Fv)2의 확인은 SDS-PAGE 및 항 Flag 항체(SIGMA-ALDLICH사)를 사용한 웨스턴 블로팅을 사용하여 행하였다. 각각, 분취한 피크 분획을 Laemli의 방법에 준하여 전기영동하고, 쿠마쉬 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색한 결과, 디아바디에서는 외관상의 분자량 약 29 kDa에, 또한 sc(Fv)2에서는 외관상의 분자량 약 55 kDa에, 각각 단일 밴드가 검출되었다.
2.7 플로우 사이토메트리에 의한 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 결합활성의 평가
CHO-human Mpl, CHO-monkey Mpl 및 CHO-mouse Mpl을 회수하고, 1×106 cells/mL가 되도록 FACS Buffer(1% FBS/PBS)에 현탁하였다. 100 μL/well이 되도록 Multiscreen-HV Filter Plates(Millipore사제)에 분주하고, 원심조작으로 상청을 제거하였다. 적농도의 디아바디 또는 sc(Fv)2를 첨가하고, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 세포를 200 μL의 FACS buffer로 1회 세정하고, 10 ㎍/mL의 ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody(SIGMA-ALDRICH사제)를 첨가하여, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 다음으로 200 μL의 FACS buffer로 세포를 1회 세정한 후, 100배 희석한 FITC 표지 항 마우스 IgG 항체(Beckman Coulter사제)를 첨가하고, 빙상에서 30분간 반응시켰다. 마지막으로 원심하여 상청을 제거하고, FACS Buffer 400 μL에 현탁하고, EPICS ELITE ESP(Beckman coulter사)를 사용하여 플로우 사이토메트리에 제공하였다. 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter)의 히스토그램으로 생세포 집단에 게이트를 설정하였다.
정제한 VB22B sc(Fv)2를 사용하여, 각종 Mpl을 발현시킨 CHO 세포에 대한 결합활성을 평가하였다. 숙주세포인 CHO 및 CHO-mouse Mpl에 대해서는 결합활성을 나타내지 않고, CHO-human Mpl 및 CHO-monkey Mpl에 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다. 이 결합활성의 경향은 VB22B IgG와 변함없는 점으로부터 저분자화에 의해 항체의 결합부위는 변화하지 않은 것이 추측되었다.
2.8 항 인간 Mpl 단일 사슬 항체의 인간화
VB22B sc(Fv)2의 인간화를 실시하기 위해, 공개되어 있는 가바트 데이터베이스(Kabat Database)(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat)로부터 항체의 서열 데이터를 입수하고, H사슬 가변영역, L사슬 가변영역으로 나누어 호몰로지 검색을 행하였다. 그 결과, H사슬 가변영역은 DN13(Smithson들, Mol Immunol. 1999; 36: 113-124)과 높은 상동성을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, L사슬 가변영역은 ToP027(Hougs들, J. Immunol. 1999; 162: 224-237)과 높은 상동성을 갖는 것을 알 수 있었다. 이들 항체의 프레임워크영역(이하, FR)에 상보성 항원 결정영역(이하, CDR)을 이식한 인간화 항체를 제작하였다. 인간화 항체 sc(Fv)2를 CHO-DG44세포에서 발현시키고, BaF3-human Mpl을 사용한 아고니스트 활성을 평가하였다. 아고니스 트 활성을 지표로, FR 내에 아미노산 치환을 더하여, 마우스형 VB22B sc(Fv)2와 동등한 아고니스트 활성을 갖는 인간화 VB22B sc(Fv)2를 제작하였다.
구체적으로는 50 base 정도의 합성 올리고 DNA를 약 20 base 정도 하이브리다이즈하도록 설계하고, 이들 합성 올리고 DNA를 PCR법에 의해 어셈블리시켜 각 가변영역을 코드하는 유전자를 제작하였다. 이들 유전자를 사용하고, 실시예 2.3의 방법과 동일하게 sc(Fv)2를 제작하여, 발현 벡터 pCXND3에 클로닝하고, 인간화 VB22B sc(Fv)2를 삽입한 각 발현 벡터 pCXND3-hVB22B p-z sc(Fv)2, pCXND3-hVB22B g-e sc(Fv)2, pCXND3-hVB22B e sc(Fv)2, pCXND3-hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2, pCXND3-hVB22B q-wz5 sc(Fv)2를 제작하였다. 본 플라스미드에 포함되는 hVB22B p-z sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 24에, 아미노산 서열을 서열번호: 25에, hVB22B g-e sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 26에, 아미노산 서열을 서열번호: 27에, hVB22B e sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 28에, 아미노산 서열을 서열번호: 29에, hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 30에, 아미노산 서열을 서열번호: 1에, hVB22B q-wz5 sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 31에, 아미노산 서열을 서열번호: 32에 나타낸다. 또한 마우스형 VB22B sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 33에, 아미노산 서열을 서열번호: 2에 나타낸다. 실시예 2.4의 방법과 동일하게 CHO-DG44세포에 발현시키고, 배양상청을 회수하였다. 인간화 VB22B sc(Fv)2는 Flag 태그를 부가하고 있지 않은 점으로부터, 배양상청으로부터의 정제는 실시예 1.8에 기재한 VB22B가 인식하는 에피토프인 MG10(Gln 213부터 Ala 231)과 GST 융합 단백질을 이용하여 행하였다. MG10과 GST 융합 단백질의 정제는 글루타티온 세파로오스 4B(Glutathione Sepharose 4B)(Amersham Biosciences사제)를 사용하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 또한, 정제한 MG10과 GST 융합 단백질을 제조업자의 프로토콜에 따라서, HiTrap NHS-activated HP(Amersham Biosciences사제)에 고정화하고, 어피니티 칼럼을 제작하였다. 인간화 VB22B sc(Fv)2 발현 CHO 세포의 배양상청을 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.01% Tween80으로 평형화한 MG10-GST 융합 단백질 고정화 칼럼에 흘리고, 인간화 VB22B sc(Fv)2를 흡착시켜, 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5), 0.01% Tween80으로 용출시켰다. 용출 분획은 즉시 1 M Tris-HCl(pH 7.4)로 중화를 행하고, HiLoad 16/60 Superdex200pg(Amersham Bioscience사제)를 사용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하였다. 겔여과 크로마토그래피의 완충액은 20 mM 구연산 완충액(pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.01% Tween 80을 사용하였다.
〔참고예 3〕 2D7 sc(Fv)2형 디아바디 발현 벡터의 제작
WO2004/033499에 기재한 바와 같이, HLA 클래스 I에 대한 항체 2D7 단일클론항체를 중쇄 및 경쇄 가변영역을 5 mer의 링커로 접속한 저분자 항체(2D7 디아바디)로 개변함으로써, 골수종세포에 대한 세포사 유도활성이 극적으로 상승한 것을 이미 나타내었다. 이에, 이 2D7 디아바디를 구조적으로 보다 안정하다고 생각되는 sc(Fv)2형으로 개변하고, 세포사 유도활성을 종래형 디아바디(HL5)와 비교 검토하였다.
먼저, 2D7 항체의 중쇄 가변영역 서열(VH)과 경쇄 가변영역 서열(VL)이 VH-VL-VH-VL의 나열이 되도록, 각각을 15 mer의 링커(GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)로 접속한 2D7 sc(Fv)2를 코드 하는 DNA 발현 벡터를 이하의 순서로 제작하였다.
WO2004/033499에 기재의 방법으로 제작한 VH-VL을 5 mer의 링커(GlyGlyGlyGlySer)로 연결한 2D7 디아바디(HL5) 발현 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 2D7DBH1(서열번호: 34), 프라이머 2D7PA2(서열번호: 35)로 PCR 반응을 행하여, 단편 A를 증폭하였다. 마찬가지로 프라이머 2D7PA3(서열번호: 36), 프라이머 2D7PA5(서열번호: 37)로 PCR 반응을 행하여, 단편 B를 증폭하였다. 여기서 얻어진 단편 A 및 단편 B를 같은 튜브 내에서 혼합하고, PCR 재조합(PCR-recombination) 반응을 행함으로써, 단편 A과 단편 B를 연결시켰다. 이에 의해, N말단에 VH의 시그널 서열을 포함하고, VH-VL이 15 mer의 링커로 연결된 DNA 단편 “2D7 디아바디 HL15-1”을 얻었다.
계속해서, 2D7 디아바디(HL5) 발현 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 2D7PA6(서열번호: 38), 프라이머 2D7PA2(서열번호: 35)로 PCR 반응을 행하여, 단편 C를 증폭하였다. 마찬가지로 프라이머 2D7PA3(서열번호: 36), 프라이머 2D7DBL2(서열번호: 39)로 PCR 반응을 행하여, 단편 D를 증폭하였다. 여기서 얻어진 단편 C 및 단편 D를 같은 튜브 내에서 혼합하고, PCR 재조합 반응에 의해, 2개의 단편을 연결시켰다. 이 조작에 의해, VH-VL이 15 mer의 링커로 연결되고, C말단에 Flag-tag 영역을 포함하는 DNA 단편 “2D7 디아바디 HL15-2”를 얻었다.
상기 반응에 의해 얻어진 2개의 DNA 단편, 즉 “2D7 디아바디 HL15-1” DNA 단편, 및 “2D7 디아바디 HL15-2” DNA 단편을 각각 EcoRI-BamHI, 및 BamHI-NotI로 절단하고, 양 DNA 단편을 사전에 EcoRI-NptI로 절단하여 개열한 발현 벡터 pCXND3 에 삽입하였다. 인서트 DNA의 염기서열을 해석하고, 목적대로 signal-VH(15)VL(15)VH(15)VL-Flag를 코드하는 cDNA가 pCXND3의 EcoRI-NotI 사이에 삽입되어 있는 것을 확인하여, 2D7sc(Fv)2 발현 벡터(pCXND3-2D7sc(Fv)2)의 구축을 종료하였다. 2D7sc(Fv)2의 염기서열을 서열번호: 40에, 아미노산 서열을 서열번호: 4에 나타낸다.
〔참고예 4〕 2D7sc(Fv)2 생산 발현 세포주의 수립
PvuI로 절단하여 사슬화한 pCXND3-2D7sc(Fv)2 20 ㎍을 CHO 세포(DG44주)에 이하와 같이 일렉트로포레이션법에 의해 도입하였다.
CHO-S-SFM-II 배지(인비트로젠)에서 배양한 DG44세포를 ice-cold PBS로 2회 세정한 후 1×107 /㎖가 되도록 PBS에 현탁하였다. 여기에 20 ㎍의 상기 플라스미드를 혼합하고, 전기 펄스(1.5 KV, 25 μFD)를 부여하였다. 적당한 비율로 세포를 희석하여 96 웰 플레이트에 세포를 뿌리고, 종농도 500 ㎍/㎖의 G418(인비드로젠)을 첨가한 CHO-S-SFM-II 배지 중에서 배양을 행하였다. 생육한 단일 콜로니를 약 30 클론 정도 픽업하고, 그들 배양상청 중의 2D7sc(Fv)2의 발현량을 항 FLAG 항체(시그마)를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 조사하였다. 가장 발현이 높았던 클론을 5 nM MTX를 포함하는 핵산 프리의 CHO-S-SFM II 배지(인비트로젠)에서 배양을 행하여, 배양 스케일을 확대하였다. 그 결과 얻어진 주(株)를 고생산 세포주로 하였다.
〔참고예 5〕 2D7sc(Fv)2의 대량 정제
T-125 플라스크에 서브 컨플루언트(sub-confluent)의 2D7sc(Fv)2 고생산 CHO 세포주를 1×105 /㎖가 되도록 롤러 보틀(CHO-S-SFM II 배지 250 ㎖/보틀)에 옮겼다. 37℃에서 배양하고, 6일 후에 배양액을 회수하였다. 원심에 의해 사세포를 제거한 후, 0.45 ㎛ 필터를 통과시켜 이를 정제에 사용하였다.
2D7sc(Fv)2의 정제는 이하와 같이 행하였다.
먼저, buffer A(20 mM Na-phosphate pH 6.8)로 평형화한 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite) 칼럼(micro prep ceramic Hydroxyapatite type I, Bio-Rad)에 회수한 배양상청을 apply하였다. buffer A로 칼럼을 세정한 후, buffer C(250 mM Na-phosphate pH 6.8)로 2D7sc(Fv)2를 용출하였다. 2D7sc(Fv)2를 포함하는 분획을 등량의 buffer A로 희석한 후, 이를 Anti-Flag M2 아가로스 어피니티 칼럼(Bio-Rad)에 apply하였다. 이 칼럼을 buffer C(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20)로 세정한 후, buffer D(100 mM Glycine H 3.5, 0.01% Tween 20)로 2D7sc(Fv)2를 용출하였다. 회수한 샘플은 즉시 종농도 25 mM가 되도록 Tris-HCl pH 8.0으로 중화하였다. 그 후, 이 분획을 센트리프렙(centriprep) YM-10(AMICON)으로 농축하고, Superdex200HR(26/60) 칼럼(아머샴 파마시아)에 의한 겔여과크로마토그램 정제에 사용하였다.
0.01% Tween 20을 포함하는 PBS로 겔여과크로마토그램 정제를 행하였다. 2D7sc(Fv)2 고생산 CHO 세포주로부터 생산된 저분자화 항체는, 그 대부분이 분자량 약 52 Kd의 위치에 용출 피크를 갖고, 마찬가지로 52 Kd에서 용출되는 2D7 디아바디의 피크와 완전히 일치하였다.
겔여과크로마토그램 정제에 의해 분리된 52 Kd의 피크만을 회수하고, 이를 2D7sc(Fv)2 단백 샘플로 하였다. 회수한 샘플의 일부를 SDS 전기영동 및 은 염색을 행함으로써, 목적의 단백이 100%의 순도로 정제되어 있는 것을 확인하였다. 회수한 정제 샘플은 센트리프렙 YM-10(AMICON)으로 농축하였다.
본 발명의 메글루민을 함유하는 안정화제를 사용함으로써, 항체 분자의 회합화 반응을 억제하고, 항체 분자를 모노머의 상태로 존재시키는 것이 가능해졌다. 항체를 의약품으로서 개발하기 위해서는, 각각의 항체 분자를 안정하게 존재시켜, 제제 보존 중의 회합화 반응을 최소한으로 억제하는 것이 필요하다. 본 발명의 안정화제는 안정화시키는 항체가 매우 고농도인 상태여도 항체 분자를 안정화시켜 회합화 반응을 억제할 수 있으므로, 항체 제제를 제조할 때에는 매우 유용한 것이 될 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 메글루민을 함유하는 약제는 항체 분자를 용액 제제화, 또는 동결건조제화하는 경우에도 항체 분자를 안정화시키는 효과를 갖는다. 또한 동결건조 제제화시의 동결건조 스트레스에 대해서, 항체 분자를 안정화시키는 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 안정화제는 전장 항체, 단편화 항체, 또는 저분자화 항체 중 어느 항체에 대해서도 안정화 효과를 나타내고, 항체 제제를 제조할 때에는 폭넓게 유용한 것이 된다.
본 발명의 메글루민에 의해 안정화된 항체 분자를 함유하는 의약조성물은, 항체 분자의 변성, 회합이 억제되어 있으므로, 종래의 항체 제제보다도 보존상태가 좋고, 보존시에 있어서 회합화에 의한 활성의 저하가 보다 작아지는 것이 기대된 다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> STABILIZING AGENTS FOR PROTEIN FORMULATIONS COMPRISING MEGLUMINE, AND USES THEREOF <130> C1-A0509P <150> JP 2005-170794 <151> 2005-06-10 <160> 51 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> An artificially synthesized scFv sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 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Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 6 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 20 25 30 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 35 40 45 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asn Ala Leu 50 55 60 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 65 70 75 80 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 85 90 <210> 7 <211> 1924 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <220> <221> CDS <222> (11)..(1918) <400> 7 gaattccacc atg ccc tcc tgg gcc ctc ttc atg gtc acc tcc tgc ctc 49 Met Pro Ser Trp Ala Leu Phe Met Val Thr Ser Cys Leu 1 5 10 ctc ctg gcc cct caa aac ctg gcc caa gtc agc agc caa gat gtc tcc 97 Leu Leu Ala Pro Gln Asn Leu Ala Gln Val Ser Ser Gln Asp Val Ser 15 20 25 ttg ctg gcc tcg gac tca gag ccc ctg aag tgt ttc tcc cga aca ttt 145 Leu Leu Ala Ser Asp Ser Glu Pro Leu Lys Cys Phe Ser Arg Thr Phe 30 35 40 45 gag gac ctc act tgc ttc tgg gat gag gaa gag gca gca ccc agt ggg 193 Glu Asp Leu Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly 50 55 60 aca tac cag ctg ctg tat gcc tac ccg ggg gag aag ccc cgt gcc tgc 241 Thr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Tyr Pro Gly Glu Lys Pro Arg Ala Cys 65 70 75 ccc ctg agt tct cag agc gtg ccc cgc ttt gga acc cga tac gtg tgc 289 Pro Leu Ser Ser Gln Ser Val Pro Arg Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys 80 85 90 cag ttt cca gcc cag gaa gaa gtg cgt ctc ttc tct ccg ctg cac ctc 337 Gln Phe Pro Ala Gln Glu Glu Val Arg Leu Phe Ser Pro Leu His Leu 95 100 105 tgg gtg aag aat gtg ttc cta aac cag act cag att cag cga gtc ctc 385 Trp Val Lys Asn Val Phe Leu Asn Gln Thr Gln Ile Gln Arg Val Leu 110 115 120 125 ttt gtg gac agt gta ggc ctg ccg gct ccc ccc agt atc atc aag gcc 433 Phe Val Asp Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro Pro Ser Ile Ile Lys Ala 130 135 140 atg ggt ggg agc cag cca ggg gaa ctt cag atc agc tgg gag gcc cca 481 Met Gly Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln Ile Ser Trp Glu Ala Pro 145 150 155 gct cca gaa atc agt gat ttc ctg agg tac gaa ctc cgc tat ggc ccc 529 Ala Pro Glu Ile Ser Asp Phe Leu Arg Tyr Glu Leu Arg Tyr Gly Pro 160 165 170 aaa gat ctc aag aac tcc act ggt ccc acg gtc ata cag ttg atc gcc 577 Lys Asp Leu Lys Asn Ser Thr Gly Pro Thr Val Ile Gln Leu Ile Ala 175 180 185 aca gaa acc tgc tgc cct gct ctg cag agg cca cac tca gcc tct gct 625 Thr Glu Thr Cys Cys Pro Ala Leu Gln Arg Pro His Ser Ala Ser Ala 190 195 200 205 ctg gac cag tct cca tgt gct cag ccc aca atg ccc tgg caa gat gga 673 Leu Asp Gln Ser Pro Cys Ala Gln Pro Thr Met Pro Trp Gln Asp Gly 210 215 220 cca aag cag acc tcc cca act aga gaa gct tca gct ctg aca gca gtg 721 Pro Lys Gln Thr Ser Pro Thr Arg Glu Ala Ser Ala Leu Thr Ala Val 225 230 235 ggt gga agc tgc ctc atc tca gga ctc cag cct ggc aac tcc tac tgg 769 Gly Gly Ser Cys Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Gly Asn Ser Tyr Trp 240 245 250 ctg cag ctg cgc agc gaa cct gat ggg atc tcc ctc ggt ggc tcc tgg 817 Leu Gln Leu Arg Ser Glu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Gly Gly Ser Trp 255 260 265 gga tcc tgg tcc ctc cct gtg act gtg gac ctg cct gga gat gca gtg 865 Gly Ser Trp Ser Leu Pro Val Thr Val Asp Leu Pro Gly Asp Ala Val 270 275 280 285 gca att gga ctg caa tgc ttt acc ttg gac ctg aag aat gtt acc tgt 913 Ala Ile Gly Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp Leu Lys Asn Val Thr Cys 290 295 300 caa tgg cag caa gag gac cat gct agt tcc caa ggt ttc ttc tac cac 961 Gln Trp Gln Gln Glu Asp His Ala Ser Ser Gln Gly Phe Phe Tyr His 305 310 315 agc agg gca cgg tgc tgc ccc aga gac agg tac ccc atc tgg gag gac 1009 Ser Arg Ala Arg Cys Cys Pro Arg Asp Arg Tyr Pro Ile Trp Glu Asp 320 325 330 tgt gaa gag gaa gag aaa aca aat cca gga tta cag acc cca cag ttc 1057 Cys Glu Glu Glu Glu Lys Thr Asn Pro Gly Leu Gln Thr Pro Gln Phe 335 340 345 tct cgc tgc cac ttc aag tca cga aat gac agc gtt att cac atc ctt 1105 Ser Arg Cys His Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser Val Ile His Ile Leu 350 355 360 365 gtg gag gtg acc aca gcc ctg ggt gct gtt cac agt tac ctg ggc tcc 1153 Val Glu Val Thr Thr Ala Leu Gly Ala Val His Ser Tyr Leu Gly Ser 370 375 380 cct ttc tgg atc cac cag gct gtg cgc ctc ccc acc cca aac ttg cac 1201 Pro Phe Trp Ile His Gln Ala Val Arg Leu Pro Thr Pro Asn Leu His 385 390 395 tgg agg gag atc tcc agc ggg cat ctg gaa ttg gag tgg cag cac cca 1249 Trp Arg Glu Ile Ser Ser Gly His Leu Glu Leu Glu Trp Gln His Pro 400 405 410 tca tcc tgg gca gcc caa gag acc tgc tat caa ctc cga tac aca gga 1297 Ser Ser Trp Ala Ala Gln Glu Thr Cys Tyr Gln Leu Arg Tyr Thr Gly 415 420 425 gaa ggc cat cag gac tgg aag gtg ctg gag ccg cct ctc ggg gcc cga 1345 Glu Gly His Gln Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro Pro Leu Gly Ala Arg 430 435 440 445 gga ggg acc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 1393 Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu 450 455 460 cgc gcc agg ctc aat ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 1441 Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp 465 470 475 tcg gac cca gct agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg att tcc 1489 Ser Asp Pro Ala Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser 480 485 490 ttg gtg acc gct ctg ctg cta gtg ctg ggc ctc agc gcc gtc ctg ggc 1537 Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly 495 500 505 ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca cac tac agg aga ctg agg 1585 Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg 510 515 520 525 cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gat ctg cac cga gtc cta ggc cag 1633 His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln 530 535 540 tac ctt agg gac act gca gcc ctg agt ccg ccc aag gcc aca gtc tca 1681 Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser 545 550 555 gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc ctt gaa atc ctc ccc aag 1729 Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys 560 565 570 tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt tcc tcc cag tcc cag atg 1777 Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ser Gln Met 575 580 585 gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg ggg acc atg ccc ctg tct 1825 Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser 590 595 600 605 gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc tgc tgt acc acc cac att 1873 Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile 610 615 620 gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat tgg cag cag cct tga 1918 Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro 625 630 635 gtcgac 1924 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 8 caggggccag tggatagact gatg 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 9 gctcactgga tggtgggaag atg 23 <210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcact aactcctgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggaaagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcctg gagatggaga aactatctac 180 aatgggaaat tcagggtcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggatatca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct acttctgtgc aagaggctat 300 gatgattact cgtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 11 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 12 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct atacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgta ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagataggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatat agaatatcct 300 tttacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 14 tagaattcca ccatggaatg gcctttgatc 30 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 15 agcctgagtc atcacaatat ccgatccgcc tccacctgca gagacagtga ccagag 56 <210> 16 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 16 actctggtca ctgtctctgc aggtggaggc ggatcggata ttgtgatgac tcaggc 56 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 17 attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt cttttatttc cagcttggtc 60 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized FLAG tag sequence <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 19 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 19 tagaattcca ccatggaatg gcctttgatc tttctcttcc tcctgtcagg aactgcaggt 60 gtccactccc aggttcagct gcagc 85 <210> 20 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 20 tggtcactgt ctctgcaggt ggtggtggtt cgggtggtgg tggttcgggt ggtggcggat 60 cggatattgt gatgactcag gc 82 <210> 21 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 21 tgagtcatca caatatccga tccgccacca cccgaaccac caccacccga accaccacca 60 cctgcagaga cagtgaccag ag 82 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 22 caggttcagc tgcagcagtc tggac 25 <210> 23 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 23 gctgcagctg aacctgcgat ccaccgcctc ccgaaccacc accacccgat ccaccacctc 60 cttttatttc cagcttggtc c 81 <210> 24 <211> 1572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct 180 ggaaagggtc ttgagtggat gggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat 240 gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat 360 gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt 420 ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctgca 480 ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt 540 ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggttcc agcagaagcc agggcagtct 600 ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt 660 ggcagtggat caggcacagc ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt 720 ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa 780 ctggaaatca aaggaggtgg tggatcgggt ggtggtggtt cgggaggcgg tggatcgcag 840 gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 900 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct 960 ggaaagggtc ttgagtggat gggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat 1020 gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 1080 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat 1140 gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt 1200 ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctgca 1260 ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt 1320 ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggttcc agcagaagcc agggcagtct 1380 ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt 1440 ggcagtggat caggcacagc ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt 1500 ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa 1560 ctggaaatca aa 1572 <210> 25 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 165 170 175 Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp 180 185 190 Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met 195 200 205 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 225 230 235 240 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 275 280 285 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 290 295 300 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro 305 310 315 320 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu 325 330 335 Thr Ile Tyr Asn Gly Lys Phe Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 340 345 350 Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 355 360 365 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe 370 375 380 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 385 390 395 400 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 405 410 415 Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser 420 425 430 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr 435 440 445 Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 450 455 460 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 465 470 475 480 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 485 490 495 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro 500 505 510 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 515 520 <210> 26 <211> 1572 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct 180 ggaaagggtc ttgagtgggt tggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat 240 gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat 360 gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt 420 ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctgca 480 ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt 540 ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggtacc tgcagaagcc agggcagtct 600 ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt 660 ggcagtggat caggcacagc ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt 720 ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa 780 ctggaaatca aaggaggtgg tggatcgggt ggtggtggtt cgggaggcgg tggatcgcag 840 gtgcagctgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 900 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccaac tcctggatga actgggtgag gcagaggcct 960 ggaaagggtc ttgagtgggt tggacggatt tatcctggag atggagaaac tatctacaat 1020 gggaaattca gggtcagagt cacgattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 1080 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggctatgat 1140 gattactcgt ttgcttactg gggccaggga accacggtca ccgtctcttc aggtggtggt 1200 ggatccggag gtggtggatc gggtggtgga ggatcggata ttgtgatgac tcagtctgca 1260 ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg gcctccatct cctgcaggtc tagtaagagt 1320 ctcctgcata gtaatggcaa cacttacttg tattggtacc tgcagaagcc agggcagtct 1380 ccacagctcc tgatctatcg gatgtccaac cttgcctcag gggtccctga caggttcagt 1440 ggcagtggat caggcacagc ttttacactg aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt 1500 ggggtttatt actgcatgca acatatagaa tatcctttta cgttcggcca agggaccaaa 1560 ctggaaatca aa 1572 <210> 27 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Arg Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg 165 170 175 Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp 180 185 190 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met 195 200 205 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val 225 230 235 240 Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro 275 280 285 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 290 295 300 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro 305 310 315 320 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu 325 330 335 Thr Ile Tyr Asn Gly 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Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 15 20 25 gag ctg gtg aag cct ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct 145 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 30 35 40 ggc tac acc ttc aca gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct 193 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro 45 50 55 60 gga cag gga ctt gaa tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act 241 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr 65 70 75 act gat tac aat gag aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac 289 Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp 80 85 90 aaa tcc tcc agc aca gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag 337 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 95 100 105 gac tct gcg atg tat ttc tgt gta agg agt gac gac ttt gac tac tgg 385 Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp 110 115 120 ggc cag ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc 433 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 125 130 135 140 gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga agc caa att gtt ctc acc cag tcg 481 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser 145 150 155 cca gca atc atg tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc ata acc tgc 529 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 160 165 170 agt gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg ttc cag cag aag cca 577 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro 175 180 185 ggc act ttt ccc aaa ctc tgg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct 625 Gly Thr Phe Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 190 195 200 gga gtc cct act cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct 673 Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 205 210 215 220 ctc aca atc agc cga atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc 721 Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 225 230 235 cag caa agg acg agt tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg 769 Gln Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 240 245 250 gag ata aaa gga ggt ggt ggc agt ggt ggc ggc gga tcc ggt ggc ggt 817 Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 255 260 265 ggc tca cag gtc cag ttg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct 865 Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 270 275 280 ggg gct tca gtg aag atg tct tgt aag gct tct ggc tac acc ttc aca 913 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 285 290 295 300 gac tac ttt ata cac tgg gtg aaa cag agg cct gga cag gga ctt gaa 961 Asp Tyr Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 305 310 315 tgg att gga tgg att ttt cct gga gat gat act act gat tac aat gag 1009 Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn Glu 320 325 330 aag ttc agg ggc aag acc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca 1057 Lys Phe Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr 335 340 345 gcc tac att ttg ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg atg tat 1105 Ala 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aca atc agc cga 1441 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 465 470 475 atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg acg agt 1489 Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Ser 480 485 490 tat cca ccc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa gac tac 1537 Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr 495 500 505 aag gat gac gac gat aag tga taa gcggccgcaa t 1572 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 510 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 41 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 42 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 44 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 45 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Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gln Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gln Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Ile Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (21)

  1. 메글루민을 함유하는, 단백질을 장기 안정화하는 약제.
  2. 메글루민을 함유하는, 단백질의 회합화를 억제하는 약제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 항체 분자인 약제.
  4. 제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자 중 어느 하나인 약제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제형이 동결건조 제제인 약제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 약제.
  7. 단백질에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질을 장기 안정화하는 방법.
  8. 단백질에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 단백질의 회합화를 억제하 는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항의 방법으로서, 장기 저온 보존조건에 있어서, 단백질을 장기 안정화, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항의 방법으로서, 장기 상온 보존조건에 있어서, 단백질을 장기 안정화, 또는 단백질의 회합화를 억제하는 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 항체 분자인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자 중 어느 하나인 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 메글루민 첨가하는 공정 후, 단백질을 동결건조하는 공정을 포함하는 방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 방법.
  15. 메글루민을 첨가한 의약조성물.
  16. 제15항에 있어서, 제형이 동결건조 제제인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 의약조성물.
  18. 항체 함유 조성물에 메글루민을 첨가하는 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법.
  19. 이하의 (1) 및 (2)의 공정을 포함하는, 항체 분자를 함유하는 의약조성물의 제조방법.
    (1) 메글루민을 항체 함유 조성물에 첨가하는 공정
    (2) (1)의 혼합물을 동결건조하는 공정
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 항체 분자가 전장 항체, 단편화 항체, 저분자화 항체, 수식 항체, 또는 항체 유사 분자 중 어느 하나인 의약조성물의 제조방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 메글루민이 그의 염 또는 그의 유도체인 제조방법.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
JP4261907B2 (ja) * 2000-10-20 2009-05-13 中外製薬株式会社 低分子化アゴニスト抗体
DE60133479T2 (de) * 2000-10-20 2009-04-16 Chugai Seiyaku K.K. Modifizierter tpo-agonisten antikörper
EP1561759B9 (en) * 2002-10-11 2009-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death-inducing agent
JP2004279086A (ja) * 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
JPWO2004087763A1 (ja) * 2003-03-31 2006-07-27 中外製薬株式会社 Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
WO2004111233A1 (ja) * 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
AU2003271174A1 (en) * 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
AU2003271186A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
AU2004297109A1 (en) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death inducing agent
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
JPWO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
EP1757686A4 (en) * 2004-04-09 2008-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd INDUCER OF CELL DEATH
TW200722518A (en) 2005-03-31 2007-06-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Sc(fv)2 structural isomers
JP5620626B2 (ja) * 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
CA2957144C (en) * 2005-04-08 2020-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
JPWO2006123724A1 (ja) * 2005-05-18 2008-12-25 国立大学法人徳島大学 抗ｈｌａ抗体を利用した新規医薬品
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
EP4342995A3 (en) * 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
CL2007002057A1 (es) * 2006-07-13 2008-01-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Diacuerpo anti-antigeno leucocitario humano (hla), usos del diacuerpo para preparar un medicamento util como inductor de muerte celular, supresor del crecimeinto celular o como agente antitumoral.
CL2008000719A1 (es) * 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
CN102573655B (zh) * 2009-06-17 2016-03-16 吉卢比有限公司 用于在体内和/或体外富集样本材料的探测装置
LT2603232T (lt) * 2010-08-11 2020-01-27 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Stabilios linaklotido vaisto formos
BR112013012213A2 (pt) 2010-11-17 2020-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha moléculas de ligação a antígeno mul tlespecíficas tendo função alternativa à função dos fatores viii, ix e x de coagulação sanguínea, e anticorpo bies- 5 pecífico, seus usos na prevenção ou tratamento de hemorragia, ácido nucleico, vetor, célula, método para produzir as referidas moléculas de ligação, composição farmacêutica e kit
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
ES2634098T3 (es) 2011-01-14 2017-09-26 The Regents Of The University Of California Anticuerpos terapéuticos contra la proteína ROR-1 y procedimientos para el uso de los mismos.
EP2500035A1 (en) * 2011-03-15 2012-09-19 Icon Genetics GmbH Pharmaceutical formulation containing immunglobulin
WO2013012022A1 (ja) * 2011-07-19 2013-01-24 中外製薬株式会社 アルギニンアミドまたはその類似化合物を含む安定なタンパク質含有製剤
WO2013059410A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with xylitol
US10493151B2 (en) 2011-10-18 2019-12-03 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with sodium chloride
EA029193B1 (ru) * 2012-07-09 2018-02-28 Кохерус Байосайенсис, Инк. Составы этанерцепта, отличающиеся заметным уменьшением содержания частиц довидимого диапазона
EP2895188B1 (en) 2012-09-11 2017-11-15 Coherus Biosciences, Inc. Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
SI3122358T1 (sl) 2014-03-26 2021-04-30 Astex Therapeutics Ltd. Kombinacije FGFR- in CMET-inhibitorjev za zdravljenje raka
GB2540694A (en) * 2014-04-29 2017-01-25 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) CCR5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
IS3008B (is) * 2014-05-14 2018-12-15 Calor ehf Stöðgandi lausnir fyrir prótín og peptíð
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
US20180256717A1 (en) * 2014-12-23 2018-09-13 Drug Discovery Laboratory As Protein compositions and use thereof
JOP20200201A1 (ar) 2015-02-10 2017-06-16 Astex Therapeutics Ltd تركيبات صيدلانية تشتمل على n-(3.5- ثنائي ميثوكسي فينيل)-n'-(1-ميثيل إيثيل)-n-[3-(ميثيل-1h-بيرازول-4-يل) كينوكسالين-6-يل]إيثان-1.2-ثنائي الأمين
CN108368166B (zh) 2015-12-28 2023-03-28 中外制药株式会社 提高含fc区多肽纯化效率的方法
US11324829B2 (en) * 2016-03-14 2022-05-10 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Antiseptic agent comprising meglumine or salt thereof
WO2018060212A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Camurus Ab Mixtures and formulations comprising an alkyl ammonium edta salt
KR102471458B1 (ko) 2016-12-28 2022-11-25 제이씨알 파마 가부시키가이샤 동결건조 제제
JP7315461B2 (ja) * 2017-09-07 2023-07-26 天野エンザイム株式会社 安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物
MX2018013070A (es) 2017-12-29 2019-10-15 Gruenenthal Gmbh Combinación farmacéutica que comprende clorhidrato de tramadol de liberación extendida y etoricoxib de liberación inmediata, y su uso para el tratamiento del dolor.
EP3781124A1 (en) * 2018-04-16 2021-02-24 Merck Patent GmbH Method for stabilizing protein comprising formulations by using a meglumine salt
CN111989121A (zh) * 2018-04-16 2020-11-24 默克专利股份有限公司 高浓缩蛋白质制剂的粘度降低
JP2021521231A (ja) * 2018-04-16 2021-08-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 熱安定性を改善するためのタンパク質製剤のための添加剤
EP4058026A4 (en) * 2019-11-12 2023-12-06 American Regent, Inc. TYPE V PHOSPHODIESTERASE INHIBITOR COMPOSITIONS, METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE THEREOF

Family Cites Families (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
JPS6094580U (ja) 1983-12-05 1985-06-27 株式会社　銭屋アルミニウム製作所 扉の装飾枠
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2727112B2 (ja) 1988-04-26 1998-03-11 コニカ株式会社 安定なペルオキシダーゼ組成物及び安定な抗体組成物
US5077216A (en) 1988-07-06 1991-12-31 The Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies specific for a human mononculear phagocyte-specific antigen
JPH0341033A (ja) 1989-07-07 1991-02-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 安定なモチリン類含有製剤
GB9009548D0 (en) 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Chimeric antibody and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2139598T3 (es) 1990-07-10 2000-02-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica.
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5223241A (en) 1990-10-01 1993-06-29 The General Hospital Corporation Method for early detection of allograft rejection
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9120304D0 (en) * 1991-09-24 1991-11-06 Erba Carlo Spa Stable pharmaceutical compositions containing a granulocyte macrophage colony stimulating factor
JPH0597703A (ja) * 1991-10-04 1993-04-20 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 改変型組織プラスミノーゲン活性化因子含有組成物
WO1993006862A1 (fr) * 1991-10-11 1993-04-15 Toray Industries, Inc. Composition a base d'anticorps
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
ZA936260B (en) 1992-09-09 1994-03-18 Smithkline Beecham Corp Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man
CA2126967A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
AU690528B2 (en) 1992-12-04 1998-04-30 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
JP3312357B2 (ja) 1992-12-11 2002-08-05 ザ ダウ ケミカル カンパニー 多価の一本鎖抗体
US5780021A (en) 1993-03-05 1998-07-14 Georgetown University Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CN1046314C (zh) 1993-09-03 1999-11-10 中外制药株式会社 具有引起细胞程序性死亡的特征的单克隆抗体
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JP3554355B2 (ja) 1994-03-03 2004-08-18 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5994524A (en) 1994-07-13 1999-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polynucleotides which encode reshaped IL-8-specific antibodies and methods to produce the same
US5885574A (en) 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
US8771694B2 (en) 1994-08-12 2014-07-08 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for B-cell lymphoma and leukemia cells
DE69534530T2 (de) 1994-08-12 2006-07-06 Immunomedics, Inc. Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US6451523B1 (en) 1994-09-14 2002-09-17 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Detection of a leptin receptor variant and methods for regulating obesity
US5690935A (en) 1995-01-13 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Biotherapy of cancer by targeting TP-3/P80
EP0726075A1 (en) 1995-02-08 1996-08-14 Therapicon Srl Pharmaceutical non-inorganic saline solutions for endonasal administration
DK0812136T3 (da) 1995-02-28 2001-02-19 Procter & Gamble Fremgangsmåde til fremstilling af ikke-kulsyreholdige læskedrikke med bedre mikrobiel stabilitet
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
AU5509296A (en) 1995-05-03 1996-11-21 Colin Henry Self Bispecific antibodies in which the binding capability is rev ersibly inhibited by a photocleavable moiety
CA2218898A1 (en) 1995-05-17 1996-11-21 Duo Wang Immunoconjugates comprising single-chain variable region fragments of anti-cd19 antibodies
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US6013067A (en) 1995-06-07 2000-01-11 Zymogenetics, Inc. Methods for increasing hematopoietic cells
US5977322A (en) 1995-06-14 1999-11-02 The Regents Of The University Of California High affinity human antibodies to tumor antigens
AU708239B2 (en) 1995-06-29 1999-07-29 Immunex Corporation Cytokine that induces apoptosis
ES2233974T3 (es) 1995-09-11 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana.
CA2241564C (en) 1996-01-08 2013-09-03 Genentech, Inc. Wsx receptor and ligands
FR2745008A1 (fr) 1996-02-20 1997-08-22 Ass Pour Le Dev De La Rech En Recepteur nucleaire de glucocorticoides modifie, fragments d'adn codant pour ledit recepteur et procedes dans lesquels ils sont mis en oeuvre
WO1997032601A1 (fr) 1996-03-06 1997-09-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de criblage de substances induisant l'apoptose
CA2249320C (en) 1996-03-20 2008-12-23 Immunomedics, Inc. Glycosylated humanized b-cell specific antibodies
JPH09289892A (ja) 1996-04-25 1997-11-11 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd ｃ−ＭＰＬリガンドアゴニスト抗体
WO1997041884A1 (en) 1996-05-09 1997-11-13 Pharma Pacific Pty. Ltd. Method of treatment
AU744146B2 (en) 1996-09-26 2002-02-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against human parathormone related peptides
JP3416035B2 (ja) 1996-09-26 2003-06-16 中外製薬株式会社 ヒト副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体
EP0852951A1 (de) 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
US6323000B2 (en) 1996-12-20 2001-11-27 Clark A. Briggs Variant human α7 acetylcholine receptor subunit, and methods of production and uses thereof
AU740904B2 (en) 1997-03-20 2001-11-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to CD-22 bearing cells and tumors
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
ES2246069T3 (es) 1997-05-02 2006-02-01 Genentech, Inc. Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US5980893A (en) 1997-07-17 1999-11-09 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Agonist murine monoclonal antibody as a stimulant for megakaryocytopoiesis
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US7531643B2 (en) 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
CA2303072A1 (en) 1997-09-11 1999-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
WO1999017364A1 (en) 1997-09-29 1999-04-08 Raytheon Company Chip-size package using a polyimide pcb interposer
US5998593A (en) 1998-03-10 1999-12-07 Abbott Laboratories Fluorescent enzyme substrates
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7081360B2 (en) 1998-07-28 2006-07-25 Cadus Technologies, Inc. Expression of G protein-coupled receptors with altered ligand binding and/or coupling properties
BR9915543A (pt) 1998-10-16 2001-08-14 Fraunhofer Ges Forschung Resistência a doenças por plantas mediada por patogenicidas moleculares
US20050220787A1 (en) 2002-11-07 2005-10-06 Lobo Peter I Naturally occuring IgM antibodies that bind to lymphocytes
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US7696325B2 (en) 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
AU2940900A (en) 1999-03-10 2000-09-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Single-stranded fv inducing apoptosis
AR030019A1 (es) 1999-05-18 2003-08-13 Smithkline Beecham Corp Anticuerpos monoclonales humanos y fragmentos funcionales del mismo, un procedimiento para su produccion, composiciones farmaceuticas que los comprenden, una molecula aislada de acido nucleico, un plasmido recombinante, una celula hospedante y el uso de dichos anticuerpos para la manufactura de un m
ES2267547T3 (es) 1999-06-09 2007-03-16 Genentech, Inc. Sinergia de antagonista de receptores del ligando apo-2l y de cpt-11.
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
JP2003515323A (ja) 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
EP1238080A2 (en) 1999-12-14 2002-09-11 The Burnham Institute Bcl-g polypeptides, encoding nucleic acids and methods of use
WO2001064713A2 (en) 2000-03-01 2001-09-07 Christoph Gasche Mammalian interleukin-10 (il-10) receptor variants
TWI242043B (en) 2000-03-10 2005-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polypeptide inducing apoptosis
DE60132075T2 (de) 2000-03-22 2009-03-12 Curagen Corp., New Haven Wnt-1 verwandte polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren
CN1981868A (zh) 2000-03-31 2007-06-20 拜奥根Idec公司 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
HUP0300369A2 (hu) 2000-04-11 2003-06-28 Genentech, Inc. Többértékű antitestek és alkalmazásuk
WO2001079494A1 (fr) 2000-04-17 2001-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps agonistes
US20040058393A1 (en) 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
EP1156060B1 (en) 2000-05-12 2007-06-27 GPC Biotech AG Human peptides/proteins causing or leading to the killing of cells including lymphoid tumor cells
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
MXPA03000306A (es) 2000-07-12 2004-04-05 Idec Pharma Corp Tratamiento de malignidades de celulas b que usan una combinacion de anticuerpos supresores de celulas b y aplicaciones relacionadas con anticuerpos moduladores inmunes.
US8632778B2 (en) 2000-08-11 2014-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilized anti-interleukin-6 antibody-containing preparations
CA2419067C (en) 2000-08-18 2008-12-23 Takeda Chemical Industries, Ltd. Injectable composition comprising benzimidazole compound and strong alkali
CA2422076A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Idec Pharmaceutical Corporation Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using b cell depleting/immunoregulatory antibody combination
CA2426621A1 (en) 2000-10-03 2003-04-01 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Drug resistance-associated gene and use thereof
DE60133479T2 (de) 2000-10-20 2009-04-16 Chugai Seiyaku K.K. Modifizierter tpo-agonisten antikörper
AU1091802A (en) 2000-10-20 2002-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Degraded agonist antibody
AU1091702A (en) 2000-10-20 2002-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Degraded tpo agonist antibody
JP4261907B2 (ja) 2000-10-20 2009-05-13 中外製薬株式会社 低分子化アゴニスト抗体
WO2002078612A2 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Euro-Celtique S.A. Thrombopoietin (tpo) synthebody for stimulation of platelet production
IL158418A0 (en) 2001-04-19 2004-05-12 Scripps Research Inst In vivo incorporation of unnatural amino acids
AU2002256895B2 (en) 2001-05-18 2008-09-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-TRAIL-R antibodies
AU2002309647C1 (en) 2001-05-25 2008-09-11 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
GB0113179D0 (en) 2001-05-31 2001-07-25 Novartis Ag Organic compounds
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
AU2002319402B2 (en) 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
JP3665324B2 (ja) 2001-10-15 2005-06-29 麒麟麦酒株式会社 抗ｈｌａ−ｄｒ抗体
CA2463672A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Immunomedics, Inc. Direct targeting binding proteins
JP2005523888A (ja) 2002-01-03 2005-08-11 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 癌関連エピトープ
DK1475101T3 (da) * 2002-02-14 2011-01-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antistof-holdige farmaceutiske opløsninger
WO2003072736A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
US20030232887A1 (en) * 2002-04-10 2003-12-18 Johnson Douglas Giles Preparation and use of a stable formulation of allosteric effector compounds
AU2003227504A1 (en) 2002-04-15 2003-10-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD OF CONSTRUCTING scDb LIBRARY
JP2004086862A (ja) 2002-05-31 2004-03-18 Celestar Lexico-Sciences Inc タンパク質相互作用情報処理装置、タンパク質相互作用情報処理方法、プログラム、および、記録媒体
EP1510943A4 (en) 2002-05-31 2007-05-09 Celestar Lexico Sciences Inc INTERACTION PREDICTION DEVICE
WO2003104425A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Novel stable anti-cd22 antibodies
JP2005530817A (ja) 2002-06-07 2005-10-13 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 嚢胞性繊維症における好中球イメージング法
CA2487321A1 (en) 2002-06-17 2003-12-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
AU2003249340A1 (en) 2002-06-18 2003-12-31 Irm Llc Diagnosis and treatment of chemoresistant tumors
AU2003246102A1 (en) 2002-06-27 2004-01-19 Genox Research, Inc. Method of examining allergic disease and drug for treating the same
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
AU2003257536A1 (en) 2002-08-27 2004-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of stabilizing protein solution preparation
ES2781475T3 (es) 2002-09-18 2020-09-02 Janssen Pharmaceuticals Inc Métodos para aumentar la producción de células madre hematopoyéticas y plaquetas
EP1561759B9 (en) 2002-10-11 2009-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death-inducing agent
AU2003301654A1 (en) 2002-10-22 2004-05-13 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Stabilized composition
WO2004065611A1 (ja) 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
JP2004279086A (ja) 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
EP1616880A4 (en) 2003-03-13 2006-07-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd LIGAND WITH AGONISTIC ACTIVITY AGAINST A MUTED RECEPTOR
JPWO2004087763A1 (ja) 2003-03-31 2006-07-27 中外製薬株式会社 Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
ES2381841T3 (es) 2003-07-11 2012-06-01 Oncotherapy Science, Inc. Método para tratar el sarcoma sinovial
WO2005044857A1 (ja) 2003-11-11 2005-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ヒト化抗cd47抗体
TW200530269A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
TW200530266A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
JPWO2005056605A1 (ja) 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
JPWO2005056602A1 (ja) 2003-12-12 2008-03-06 中外製薬株式会社 アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
AU2004297109A1 (en) 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death inducing agent
KR20070010046A (ko) 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
EP1757686A4 (en) 2004-04-09 2008-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd INDUCER OF CELL DEATH
TW200605906A (en) 2004-05-11 2006-02-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedy for thrombopenia
US20090062184A1 (en) 2005-03-24 2009-03-05 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Fine particulate preparation comprising complex of nucleic acid molecule and collagen
TW200722518A (en) 2005-03-31 2007-06-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Sc(fv)2 structural isomers
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
JPWO2006123724A1 (ja) 2005-05-18 2008-12-25 国立大学法人徳島大学 抗ｈｌａ抗体を利用した新規医薬品
WO2006132352A1 (ja) 2005-06-10 2006-12-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha sc(Fv)2を含有する医薬組成物
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
JP5224580B2 (ja) 2005-06-10 2013-07-03 中外製薬株式会社 ｓｃ（Ｆｖ）２部位特異的変異体
WO2007136892A2 (en) 2006-02-02 2007-11-29 The General Hospital Corporation Engineered antibody-stress protein fusions
KR20090021217A (ko) 2006-06-14 2009-02-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 조혈 줄기세포 증가 촉진제
CL2007002057A1 (es) 2006-07-13 2008-01-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Diacuerpo anti-antigeno leucocitario humano (hla), usos del diacuerpo para preparar un medicamento util como inductor de muerte celular, supresor del crecimeinto celular o como agente antitumoral.
DE102006037703B4 (de) * 2006-08-11 2013-04-18 Eisenmann Ag Heißluftofen
EP3111955B1 (en) 2006-08-14 2019-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
CL2008000719A1 (es) 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a
CN105126099A (zh) * 2007-12-21 2015-12-09 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗体制剂
TW201118166A (en) 2009-09-24 2011-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd HLA class I-recognizing antibodies

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