CN111989121A - 高浓缩蛋白质制剂的粘度降低 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及显示降低的粘度的高浓缩蛋白质制剂的组合物。在所制备的制剂中所含的蛋白质具有抗聚集和变性的稳定性，并因此在给药患者之前具有足够的储存稳定性。

Description

高浓缩蛋白质制剂的粘度降低
本发明涉及显示降低的粘度的高浓缩蛋白质制剂的组合物。在所制备的制剂中所含的蛋白质具有抗聚集和变性的稳定性，并因此在给药患者之前具有足够的储存稳定性。
现有技术
大多数研发中的生物治疗性蛋白质产品为单克隆抗体(mAb)或相关形式，例如双特异性抗体或抗体片段。在广泛的临床重要适应症中，此类产品的治疗剂量通常很高。
但是，肽和蛋白质比传统的有机和无机药物更大和更复杂(即，除了具有复杂的三维结构外，还具有多个官能团)，这种蛋白质制剂存在特殊问题。这些问题之一是蛋白质制剂的粘度增加，尤其是在高浓度下。
然而，后者是一个特殊的问题，因为从患者便利性、依从性和整体医疗保健成本的角度来看，非常需要通过小剂量皮下注射来输送所得产品。
但是，高治疗剂量和高度期望的低注射体积的组合常常导致需要非常高浓度的活性成分制剂。众所周知，在高浓度下获得稳定的生物治疗剂水性制剂可能极具挑战性，通常会导致聚集速率、颗粒形成和粘度显著增加。高粘度是不可接受的，因为它极大地限制了产品的可注射性。
抗体和其他蛋白质治疗剂可以肠胃外给药，例如通过静脉内(IV)，肌内(IM)或皮下(SC)途径。皮下注射由于其简化患者给药(快速，小剂量注射)和降低治疗成本(缩短医疗救助)的潜力，已越来越受到蛋白质治疗剂递送的关注。为了确保患者依从性，期望皮下注射剂型是等渗的并且包括小注射量(每个注射部位<2.0ml)。为了减少注射量，通常在1mg/ml至150mg/ml的范围内施用蛋白质。
因此，用于皮下给药的蛋白质制剂的主要开发通常与粘度挑战相关。体积限制(<2ml)和剂量要求(通常>100mg给药)经常需要高浓缩蛋白质制剂。但是，正如已经说过的，在高浓度下，蛋白质往往会形成高粘度溶液，并且由于形成可溶性和不溶性蛋白质-蛋白质聚集体，稳定性可能会成问题。因此，这样的粘度对于a)制造工艺和b)对患者给药造成严重的挑战。
在制造过程中，高粘度的高浓缩蛋白质制剂在加工中存在困难，特别是在超滤和无菌过滤方面。
基于mAb的疗法通常会在很长一段时间内重复给药，并且需要数mg/kg的剂量。抗体溶液或悬浮液可以经由肠胃外途径施用，例如通过静脉内(IV)输注，以及皮下(SC)或肌内(IM)注射。此处，在注射溶液中，高粘度是一个问题。为了解决该问题并改进溶液的稳定性，通常还添加较高浓度的添加剂和赋形剂。在对于旨在用于肌内或皮下给药的制剂所期望的蛋白质浓度，需要高浓度的稳定剂，例如蔗糖和氯化钠，以实现长期的蛋白质稳定性。由于高的注射力和组织损伤，所得的溶液常常引起注射疼痛。因此，对于高蛋白浓度制剂的稳定性和渗透压而言，平衡所需稳定剂的量至关重要。
结果，归因于粘度的技术障碍常常导致无法开发用于皮下递送的蛋白质制剂。
为了提高皮下制剂开发的成功率，近年来通过化学方法降低和控制粘度已引起相当大的关注。大量出版物和专利申请涉及来自盐(主要是NaCl)家族和特殊氨基酸(优选精氨酸，组氨酸和脯氨酸)的赋形剂，这些赋形剂已显示出可有效降低某些高浓度蛋白质治疗剂的粘度。
不幸的是，这些众所周知的降低粘度的方法并非普遍适用，这可能是因这样一个事实：蛋白质制剂的粘度是各种分子间作用力的结果。取决于蛋白质分子及其配制条件，不同的相互作用可能会影响粘度，例如分子拥挤、或偶极相互作用或疏水或带电基团之间的相互作用。因此，制药行业强烈需要降粘赋形剂，尤其是当上述基于NaCl和氨基酸的标准溶液失效时作为替代选择。
过去已经研究了许多降低粘度的添加剂和赋形剂。如今，除组氨酸、赖氨酸和樟脑-10-磺酸外，最杰出的是精氨酸。在Zheng Guo等的研究论文中("Structure-ActivityRelationship for Hydrophobic Salts as Viscosity-Lowering Excipients forConcentrated Solutions of Monoclonal Antibodies",Pharmaceutical Research,vol.29,no.11,June 13,2012,p.3182-3189)，描述了更多的具有降低粘度特性的独特分子。目前，仍然不是所有的在高浓度下展现出粘度问题的治疗性蛋白质溶液可以通过已知的降粘赋形剂适当地解决。
本发明的目的
旨在用于药物应用的蛋白质制剂(例如单克隆抗体、融合蛋白等)通常需要稳定剂以防止不希望的聚集并防止物理或化学降解。这些问题在高蛋白浓度下恶化，而高蛋白浓度对于这类分子的治疗给药通常是所需的。
在高浓度下，蛋白质趋向于自缔合，从而导致高粘度制剂，并使例如这些蛋白质溶液通过注射给药复杂化，也使得制造过程复杂化，其中切向流过滤通常用于交换缓冲液和增加蛋白质浓度。在注射和过滤过程中，通过增加背压和剪切应力，治疗性蛋白质可能会不稳定或延长处理时间。因此，在生物制药工业中高度需要具有粘度降低特征的制剂添加剂和赋形剂或其组合。但是，配制蛋白质(如单克隆抗体)需要仔细选择配制添加剂和/或赋形剂，以避免蛋白质变性和生物活性丧失。
但是，仍然有大量新兴抗体和抗体形式需要开发合适的、创新的降粘添加剂和/或赋形剂，或特定的添加剂/赋形剂组合或靶向制剂策略。这些添加剂/赋形剂必须是药学上安全的，因为蛋白质制剂是肠胃外给药的，包括静脉内，肌肉内，腹膜内，皮内或皮下途径。因此，可以在这些制剂中使用的添加剂必须在生理上相容，并且必须没有任何不良副作用，并且在任何情况下都不会导致过敏反应，特别地，它们不得引起任何类过敏反应副作用。
本发明的主题
本发明的主题是用于降低药物活性蛋白的液体高浓缩制剂的粘度的方法，其包含以下步骤：将蛋白质溶液与降粘浓度的选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸(琥珀酸盐/酯)或其混合物的赋形剂结合。特别地，本发明涉及其中蛋白质的浓度在至少50mg/ml至高达300mg/ml的范围内并且其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微型抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白的制剂。
特别良好的降粘作用在权利要求1或权利要求2-10任一项的方法中实现，当将葡甲胺与苯磺酸作为平衡离子或与对甲苯磺酸钠作为平衡离子一起添加时，而且如果鸟氨酸和苯磺酸作为平衡离子添加或者鸟氨酸或对甲苯磺酸钠作为平衡离子或者其它合适的组合添加，这也是有效的。当以等摩尔量添加这些组合时，尤其可以实现该效果。尤其是通过添加所述的赋形剂，可以使粘度降低至少12％，并且在最佳条件下最高达80％。
药物活性蛋白或肽与根据权利要求11-21的具体实施方案的浓缩的药物制剂也是本发明的目的。治疗性蛋白质可以选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。此外，权利要求22至29用于由权利要求11至21的组合物制备冻干粉的方法是本发明的目的。然而，含有要求保护的组合物的试剂盒也包含在本发明的范围内，并且含有要求保护的权利要求30-34的组合物的试剂盒和其应用也在本发明的范围内。
发明详述
如上所述，高蛋白质浓度带来了与蛋白质的物理和化学稳定性有关的挑战，以及与蛋白质制剂的生产、储存和给药方面的困难。一个主要问题是蛋白质在加工和/或储存期间趋于聚集并形成微粒的趋势，这使得在进一步加工和/或给药期间的操作变得困难。浓度依赖的降解和/或聚集是开发更高浓度蛋白质制剂的主要挑战。除了潜在的非天然蛋白质聚集和颗粒形成之外，在水溶液中可能会发生可逆的自缔合，这尤其导致粘度增加，使注射递送复杂化。
定义
如本文中通常使用的，术语“蛋白质”是指通过肽键彼此连接以形成多肽的氨基酸的聚合物，该多肽的链长足以产生至少可检测的三级结构。分子量(以kDa表示,“Da”代表“道尔顿”，1kDa＝1,000Da)大于约100kDa的蛋白质可以被称为“高分子量蛋白质”，而分子量小于大约100kDa的蛋白质可以被称为“低分子量蛋白质”。术语“低分子量蛋白质”排除缺乏被认为是蛋白质必须的至少三级结构的小的肽。蛋白质分子量可以使用本领域技术人员已知的标准方法来确定，包括但不限于质谱法(例如，ESI，MALDI)或由已知的氨基酸序列和糖基化来计算。蛋白质可以是天然存在的或非天然存在的，合成的或半合成的。
“几乎纯的蛋白质”和“基本纯的蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指包含至少约90wt％的纯蛋白质，优选至少约95wt％的纯蛋白质的组合物。“几乎均质的”和“基本上均质的”在本文中可互换使用，并且是指其中存在的至少约90重量％，优选至少约95wt％的蛋白质是单体与可逆的二和低聚缔合体(不可逆的聚集体)的组合的组合物。
如本文中通常使用的，术语“抗体”广泛涵盖mAb(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双抗体和单链抗体分子以及抗体片段(例如Fab,Fab′,F(ab′)2和Fv)、单结构域抗体、多价单结构域抗体、Fab融合蛋白及其融合物。
如本文中通常使用的，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外，包含该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个表位具有高度特异性。这些通常例如是通过培养杂交瘤细胞合成的，如Kohler等描述的(Nature 256:495,1975)，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如U.S.Pat.No.4,816,567)，或使用描述于Clackson等(Nature 352:624-628,1991)和Marks等(J.Mol.Biol.222:581-597,1991)的技术从噬菌体抗体库中分离。如本文所用的，“mAb”具体包括衍生的抗体、抗体-药物缀合物和“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体种类或子类的抗体及其这种抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们展现出所需的生物学活性(U.S专利No.4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855,1984).
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，包括完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab,Fab′,F(ab′)2和Fv片段；双体抗体；线性抗体(参见U.S.专利No.5,641,870；Zapata等,Protein Eng.8:1057-1062,1995)；单链抗体分子；多价单域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是大部分人类序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有最少的衍生自非人类免疫球蛋白的序列。(参见，例如Jones等,Nature 321:522-525,1986；Reichmann等,Nature 332:323-329,1988；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992.)
在上下文中，术语“治疗活性蛋白质”应简单地理解为是选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白的蛋白质或肽，并且其定义如上所述。
“流变学”是指物质的变形和流动的研究，而“粘度”是指物质(通常是液体)的流动阻力。粘度与剪切力的概念有关；可以理解为当流体彼此相对运动时，流体的不同层彼此或在其他表面上施加剪切力的效果。有几种粘度度量。粘度单位为N/m2，称为帕斯卡秒(Pa-s)。粘度可以是“运动的”或“绝对的”。运动粘度是通过流体传递动量的速率的量度。它以斯托克斯(St)测量。运动粘度是在重力影响下流体的阻力流的量度。当将两种体积相同且粘度不同的流体放在相同的毛细管粘度计中并通过重力流过时，流过毛细管的粘度较高的流体比粘度较低的流体花费的时间更长。例如，如果一种流体需要200秒(s)才能完成其流动，而另一种流体需要400s，则在运动粘度标度上，第二种流体的粘度是第一种流体的两倍。运动粘度的量度是长度2/时间。通常，运动粘度以厘斯托克斯(cSt)表示。运动粘度的SI单位为mm2/s，其等于1cSt。“绝对粘度”，有时也称为“动态粘度”或“简单粘度”，是运动粘度和流体密度的乘积。绝对粘度以厘泊(cP)为单位表示。绝对粘度的SI单位是毫帕斯卡秒(mPa-s)，其中1cP＝1mPa-s。
粘度可通过使用例如粘度计以给定的剪切速率或多个剪切速率来测量。可以通过在绝对粘度与剪切速率的关系图上创建四个最高剪切点的最佳拟合线，并且将粘度线性外推回零剪切，来确定“外推零剪切”粘度。或者，对于牛顿流体，可以通过在多个剪切速率下取平均粘度值来确定粘度。粘度也可以使用微流体粘度计在单剪切速率或多剪切速率(也称为流速)下进行测量，其中绝对粘度源自液体在流过通道时的压力变化。粘度等于剪切应力除以剪切速率。在一些实施方案中，可以将用微流体粘度计测量的粘度直接与外推的零剪切粘度进行比较，例如从使用锥板粘度计在多个剪切速率下测量的粘度推断的粘度。
“剪切速率”是指一层流体通过相邻层时的速度变化率。速度梯度是速度根据与板之间的距离的速率变化。这种简单的情况显示出以剪切速率(v1-v2)/h的均匀速度梯度，单位为(cm/sec)/(cm)＝1/sec。因此，剪切速率单位是秒的倒数或通常是时间的倒数。对于微流体粘度计，压力和流速的变化与剪切速率有关。“剪切速率”是指材料变形的速度。当使用锥板粘度计和本领域技术人员适当选择的锭子以精确测量在目标样品的粘度范围内的粘度进行测量时，通常在约0.5s-1至约200s-1的剪切速率下测量含有蛋白质和降粘剂的制剂。在目标样品的粘度范围内(即，在固定到DV2T粘度计(Brookfield)的CPE40锭子上最准确地测量20cP的样品)；当使用微流体粘度计测量时，大于约20s-1至约3,000s-1。
对于本文中通常使用的经典“牛顿”流体，粘度基本上与剪切速率无关。然而，对于“非牛顿流体”，粘度随着剪切速率的增加而降低或增加，例如，流体分别为“剪切稀化”或“剪切稠化”。在浓缩(即高浓度)蛋白质溶液的情况下，这可能表现为假塑性剪切稀化行为，即粘度随剪切速率降低。
如本文中通常使用的，术语“化学稳定性”是指制剂中的蛋白质组分抵抗经由化学途径如氧化、脱酰胺或水解的降解的能力。如果在4℃下放置24个月后小于约5％的成分降解，则通常认为蛋白质制剂是化学稳定的。
如本文中通常使用的，术语“物理稳定性”是指蛋白质制剂抵抗物理劣化例如聚集的能力。物理稳定的制剂仅形成可接受百分比的不可逆聚集体(例如，二聚体，三聚体或其他聚集体)的生物活性蛋白试剂。聚集体的存在可以几种方式来评估，包括通过借助动态光散射来测量制剂中蛋白质的平均粒径。如果在4℃下24个月后形成少于约5％的不可逆聚集体，则认为制剂是物理稳定的。聚集污染物的可接受水平理想地将小于约2％。可以达到低至约0.2％的水平，尽管更典型的是约1％。
如本文通常使用的，术语“稳定的制剂”是指制剂在化学上和物理上都是稳定的。稳定的制剂可以是这样一种制剂，其中在4℃下储存24个月或在高温下的等价溶液条件下，例如在40℃下储存一个月后，超过约95％的生物活性蛋白分子在制剂中保留生物活性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，例如在Peptide and ProteinDrug Delivery,247-301,Vincent Lee,Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.(1991)and Jones,A.,Adv.Drug Delivery Revs.10:29-90,1993中回顾。可以在选定的温度下测量特定时间段的稳定性。为了快速筛选，例如，可以将制剂在40℃下保持2周至一个月，此时测量残留的生物活性并将其与初始条件进行比较以评估稳定性。当制剂要在2℃-8℃下储存时，通常制剂应该在30℃或40℃下稳定至少一个月和/或在2℃-8℃下稳定至少2年。当制剂要在约25℃的室温下储存时，通常制剂应在约25℃下稳定至少2年和/或在40℃下稳定至少约6个月。冻干和储存后的聚集程度可以用作蛋白质稳定性的指示。在一些实施方案中，通过测量制剂中蛋白质的粒径来评估稳定性。在一些实施方案中，可以通过使用标准生物学活性或结合测定法来测量制剂的活性来评估稳定性，其完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
如本文中通常使用的，术语蛋白质“粒径”是指通过使用众所周知的粒径测定仪例如动态光散射、SEC(尺寸排阻色谱法)或本领域普通技术人员已知的其他方法测定的制剂中生物活性分子颗粒的主要群体的平均直径或其粒径分布。
如本文中通常使用的，术语“浓缩”或“高浓度”描述了液体蛋白质制剂的最终蛋白质浓度为至少1mg/ml，尤其是大于约10mg/mL，优选大于约50mg/mL，更优选大于约100mg/mL，还更优选大于约200mg/mL，或最优选大于约250mg/mL。
如本文中通常使用的“重构制剂”是指通过将干燥的粉末、冻干的，喷雾干燥的或溶剂沉淀的蛋白质溶解在稀释剂中以使蛋白质溶解或分散在用于给药的水溶液中而制备的制剂。
“冻干保护剂”是当与蛋白质结合时，在冻干和/或随后存储时显著降低蛋白质的化学和/或物理不稳定性的物质。通常将冻干保护剂以“冻干保护量”添加到冻干前的制剂中。这意味着，在冻干保护剂量的冻干保护剂存在下冻干蛋白质之后，蛋白质基本上保留了其物理和化学稳定性和完整性。
如本文通常使用的，“稀释剂”或“载体”是药学上可接受的(即，对人或另一种哺乳动物给药是安全且无毒的)并且制备冻干后重构的液体制剂例如水性制剂有用的成分。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液及其组合。
“防腐剂”是可以添加到本文制剂中以降低细菌、真菌或另一种传染剂的污染和/或作用的化合物。防腐剂的添加可以例如促进多用途(多剂量)制剂的生产。
如本文中通常使用的“填充剂”是这样的化合物，其增加了冻干混合物的质量并且有助于冻干饼的物理结构(例如，促进了保持开口孔结构的基本上均匀的冻干饼的生产)。
“治疗有效量”是实现可测量的改进或预防任何症状或特定病症或障碍，实现可测量的预期寿命提高或总体上改进患者生活质量所需的最小浓度。治疗有效量取决于特定的生物活性分子和要治疗的特定病症或障碍。许多蛋白质例如本文所述的mAb的治疗有效量在本领域中是众所周知的。可以通过标准技术确定待临床应用治疗其他疾病的尚未建立的或用于使用已知蛋白(例如mAb)治疗特定疾病的治疗有效量的蛋白质，该标准技术是在技术人员，例如医师的能力之内。
如本文中通常使用的，术语“可注射性”或“可注射性”是指药物制剂通过配备有18-32号针头，任选地薄壁的针头的注射器的注射性能。可注射性取决于诸如注射所需的压力或力、流动的均匀性、抽吸质量和不被堵塞的因素。液体药物制剂的可注射性可以通过将粘度降低的制剂与不添加降粘剂的标准制剂的注射力进行比较来评估。含有降粘剂的制剂的注射力的降低反映了该制剂的改进的可注射性。当与除了用大约相同浓度的适当缓冲液代替降粘剂外具有相同浓度的蛋白质在相同条件下的标准制剂相比，降低粘度的制剂具有改进的可注射性，注射力降低至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，和最优选至少75％。或者，可以通过比较当用相同的力压下注射器时注射相同体积(例如0.5mL，或更优选约1mL)的不同液体蛋白制剂所需的时间来评估液体药物制剂的可注射性。
如本文中通常使用的，术语“注射力”是指以给定的注射速度将给定的液体制剂推过配备有给定的针号的给定的注射器所需的力。注射力通常以牛顿表示。例如，可以将注射力测量为以250mm/min的注射速度将液体制剂推过装配有0.50英寸27号针头具有0.25英寸内径的1mL塑料注射器所需的力。测试设备可用于测量注射力。在相同条件下进行测量时，粘度较低的制剂通常需要总体上较低的注射力。
如本文中通常使用的，术语“降低粘度的制剂”是指与不包含降低粘度的添加剂或试剂的相应制剂相比，通过存在一种或多种添加剂改性以降低粘度的具有高浓度的大分子量蛋白质，例如mAb，或低分子量蛋白质的液体制剂。
如本文所用的，术语“降粘剂”是指相对于不存在降粘剂的溶液的粘度来降低溶液的粘度的化合物。降粘剂可以是单一化合物或可以是一种或多种化合物的混合物。当降粘剂是两种或更多种化合物的混合物时，除非另有说明，否则所列浓度是指每种单独的试剂。举例来说，含有约0.25M的葡甲胺苯磺酸盐作为降粘剂的制剂是在浓度为0.25M的苯磺酸和浓度为0.25M的葡甲胺的溶液。
某些降粘剂含有酸性或碱性官能团，并且可以显示亲水和疏水区域，它们共同影响与溶液中所含蛋白质的相互作用特性。官能团是否被完全或部分电离取决于它们所在制剂的pH。除非另有说明，否则提及含有具有可电离官能团的降粘剂的制剂包括母体化合物和任何可能的离子态二者。
如本文所用的，术语“液体制剂”是在可接受的药物稀释剂中提供的蛋白质或在施用于患者之前在可接受的药物稀释剂中重构的蛋白质。
生物仿制药可由微生物细胞(原核、真核)、人或动物来源的细胞系(例如哺乳动物、禽类、昆虫)或衍生自动物或植物的组织生产。提出的生物仿制药产品的表达构建体将通常会编码与其参考产品相同的一级氨基酸序列。可能会存在较小的修饰，例如不会影响安全性、纯度或效力的N端或C端截断。
就安全性和功效而言，生物仿制药mAb在物理或生物学上均与参考mAb相似。可以使用一项或多项体外研究相对于参考mAb来评估生物仿制药mAb，包括详细结合靶抗原；结合Fcγ受体(FcγRI,FcγRII和FcγRIII)，FcRn，和补体(C1q)的亚型；与Fab相关功能(例如中和可溶性配体，受体激活或阻断)；或与Fc相关的功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、补体激活)的实验。可以将体外比较与体内数据相结合，以证明药代动力学、药效学和/或安全性的相似性。针对参考mAb的生物仿制药mAb的临床评估可以包括药代动力学特性的比较(例如AUC0-inf、AUC0-t、Cmax、tmax、Ctrough)；药效学终点；或临床疗效的相似性(例如，使用随机、平行组比较临床试验)。可以使用既定程序评估生物仿制药mAb与参考mAb之间的质量比较，包括在“Guideline on similar biological medicinalproducts containing biotechnology-derived proteins as active substance:Quality issues”(EMEA/CHMP/BWP/49348/2005),and the“Guideline on development,production,characterization and specifications for monoclonal antibodies andrelated substances”(EMEA/CHMP/BWP/157653/2007)中描述的那些。生物仿制药mAb和参考mAb之间的差异可以包括翻译后修饰，例如通过将其他生化基团(例如磷酸盐、各种脂质和碳水化合物)与mAb相连；通过翻译后的蛋白水解切割；通过改变氨基酸的化学性质(例如甲酰化)；或通过许多其他机制。其他翻译后修饰可以是生产过程中操作的结果，例如，在产品暴露于还原糖中时可能发生糖基化。在其他情况下，存储条件可能允许某些降解途径(例如氧化、脱酰胺或聚集)，因为所有这些与产品相关的变体都可能包含在生物仿制药mAb中。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒的酸和碱，包括无机酸和碱，以及有机酸和碱制备的盐。
如本文所使用的，术语“烷基”是指直链、支链和环状烃基。除非另有说明，否则术语“烷基”包括包含一个或多个双键或三键的烃基。包含至少一个环体系的烷基是“环烷基”。包含至少一个双键的烷基是“烯基”，并且包含至少一个三键的烷基是“炔基”。
如本文所使用的，术语“芳基”是指芳族碳环体系，包括稠环体系。在“芳基”基团中，形成环的每个原子均为碳原子。
如本文所用的，“杂芳基”是指芳族环体系，包括稠环体系，其中形成该环的原子中的至少一个是杂原子。此外，本文所用的术语“杂环”是指环体系，其包括稠合的环体系，不是芳族的，其中形成环的原子中的至少一个是杂原子。
如本文所用的术语“杂原子”是任何非碳或非氢原子。优选的杂原子包括氧、硫和氮。
制剂
生物相容性、低粘度蛋白质溶液(例如mAb的那些)可用于以皮下(SC)和肌内(IM)注射有用的体积递送治疗有效量的蛋白质，对于SC的注射量通常小于或约2ml，而对于IM小于或等于约5ml，更优选对于SC小于或等于1ml，而对于IM小于或约为3ml。蛋白质通常可以具有任何分子量，尽管在一些实施方案中，高分子量蛋白质是优选的。在其他实施方案中，蛋白质是低分子量蛋白质。
现在，本发明提供了一种方法，该方法通过将治疗性蛋白质和与蛋白质溶液等摩尔量的降低粘度量的选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或它们的混合物的赋形剂相结合，来降低治疗性蛋白质的液体药物制剂的粘度和/或提高其稳定性。取决于溶液的pH值、蛋白质溶液的浓度、蛋白质的性质、所添加赋形剂的所得浓度及其化学性质，降低粘度的效果是变化的。
特别地，当将葡甲胺和鸟氨酸一起与选自甲苯磺酸盐和苯磺酸的一种平衡离子以等摩尔量添加到浓缩蛋白溶液中(例如添加至(mAbA和mAbB的溶液中)时，实现了特别良好的粘度降低。
出乎意料的是，通过实验发现，阳离子氨基糖葡甲胺与氨基酸鸟氨酸一起和选自对甲苯磺酸钠和苯磺酸的带负电荷的平衡离子的混合物作为特定等摩尔混合物显著降低了单克隆抗体或融合蛋白的高浓缩蛋白质液体制剂的粘度。
在示例性的实施方案中，治疗性蛋白质以如上所述的高蛋白质浓度。在一些实施方案中，粘度的降低为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，相比于对照制剂(其中将缓冲剂溶液以相同的量添加至蛋白质溶液中代替降粘剂溶液)。
在示例性实的施方案中，治疗性蛋白质具有如上所述的高蛋白质浓度，为至少50mg/ml，优选大于75mg/ml，更优选大于100mg/ml。本文测试和公开的制剂的蛋白质浓度为150-280mg/ml。在一些实施方案中，粘度降低为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更多，相比与对照制剂。
在另一方面，本发明提供了包含治疗性蛋白质和赋形剂的液体溶液，所述赋形剂选自葡甲胺、鸟氨酸、对甲苯磺酸钠和苯磺酸或其混合物，其中所述制剂表现出相对于对照制剂降低的粘度。在示例性实施方案中，治疗性蛋白质如上所述处于高蛋白质浓度，并且本文所述的赋形剂以降低粘度(重量：体积)的浓度存在。这些赋形剂中的任何一种都可以以高达其溶解度极限的浓度使用。这样的溶液可以进一步包含有效量的其他添加剂，以在不显著增加粘度的情况下进一步改进稳定性、减少聚集和/或使制剂等渗。
在其它实施方案中，选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或它们的混合物的赋形剂的浓度为至少约50mM至约300mM，或至少约100mM至约250mM，或至少约140mM至约200mM。在示例性的实施方案中，赋形剂的浓度为至少约50、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、250或300mM或更大。其他示例性实施方案包括有效使制剂等渗而不显著增加粘度的赋形剂浓度。示例性的浓度包括至少约150mM或更高的浓度，在进一步的实施方案中，所述量为至少约170mM或更高。
在另一个方面，本发明提供了包含治疗性蛋白质和选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或其混合物的赋形剂的冻干蛋白制剂，其中在用推荐量的稀释剂重构后，该制剂相对于对照制剂表现出降低的粘度。在示例性的实施方案中，治疗性蛋白质为如上所述的高蛋白质浓度。在一些实施方案中，赋形剂在用稀释剂重构时以有效降低粘度的量存在(重量：重量浓度)。这样的制剂可以进一步包含其他添加剂，其以有效地进一步改进稳定性、减少聚集和/或使制剂等渗而不会显著增加粘度的量存在。
在示例性的实施方案中，选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或其混合物的赋形剂的浓度为至少约1μg/mg治疗性蛋白质，高至约1.0mg/mg治疗性蛋白质。在一些实施方案中，赋形剂的浓度为至少约1,10,50,100,150,200,250,300,350,400,450,500或550μg/mg治疗性蛋白质。在其他示例性实施方案中，赋形剂的浓度高达约600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/mg治疗性蛋白质。
在另一实施方案中，本发明提供了一种通过以本文描述的任何量或浓度使用葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或其混合物作为赋形剂防止蛋白质在液体制剂中自缔合的方法。还提供了具有改进的稳定性(例如降低的聚集)和保质期的制剂。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明的液体蛋白制剂，和用于其施用的说明书，任选地容器、注射器和/或其它给药设备。本发明进一步提供了一种试剂盒，其包含本发明的冻干蛋白制剂，任选地在容器中，以及用于其重构和施用的说明书，任选地和一安瓶无菌稀释剂，以及任选地注射器或其他给药装置。示例性的容器包括安瓶、试管、瓶子、单腔或多腔预填充注射器或药筒，但还有一个96孔板，其包含位于孔中的即用型冻干或喷雾干燥制剂。示例性的给药装置包括具有或不具有针头的注射器、输液泵、喷射注射器、笔装置、经皮注射器或其他无针注射器。
本发明的另一方面是提供一种用于筛选降低粘度浓度的赋形剂的方法，该方法包含以下步骤：(1)评估包含第一浓度的赋形剂和治疗性蛋白质(例如抗体)的第一溶液的粘度，所述赋形剂选自葡甲胺、鸟氨酸、对甲苯磺酸钠、苯磺酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸、肉碱和琥珀酸盐或其混合物，(2)评估包含不同的第二浓度的赋形剂和治疗性蛋白质的第二溶液的粘度，和(3)如果第一种溶液的粘度较低，则确定第一浓度的赋形剂比第二浓度的赋形剂粘度降低的更多。粘度可以例如使用m-VROCTM Technology流变仪(RheoSense,SanRamon,California,USA)或Aries ARG2流变仪或Brookfield RV-DVIII流变仪测定。
提供了类似的方法来筛选降低聚集或稳定浓度的赋形剂。
可以许多方式来评估稳定性，包括在一定温度范围内(热稳定性)和/或时间段(保质期)和/或在承受压力处理情况(例如物理摇动)后监测构象变化。可以使用多种方法来测量包含变化浓度的制剂组分的制剂的稳定性。例如，可以通过目视观察浊度，通过测量特定波长的吸光度、通过尺寸排阻色谱法(其中蛋白质的聚集体与处于天然活性状态的蛋白质相比，蛋白质的聚集体会以不同的级分洗脱)、HPLC或其他色谱方法来测量蛋白质的聚集量。可以使用其他测量构象变化的方法，包括使用差示扫描量热法(DSC)例如测定变性温度或圆二色性(CD)，其测量蛋白质的摩尔椭圆率。荧光也可以用于分析组成。荧光包括以光或热的形式释放或吸收能量，以及光的极性性质发生变化。荧光发射可以是蛋白质固有的，也可以归因于荧光报告分子，例如与部分未折叠蛋白质的疏水口袋结合。可以通过检测蛋白质样品的荧光信号来监测报告分子结合的增加。可以使用其他测量稳定性的手段，这对于本领域技术人员是众所周知的。
在进行的实验中，首先，葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐单独的粘度降低潜力与六种类型的抗体(mAbA,mAbBmAbC(IgG2),mAbD,mAbE,mAbF)和一种融合蛋白质(FusionA)结合测试。蛋白质的浓度被调节至98mg/ml或99mg/ml或173mg/ml或177mg/ml或200mg/ml或220mg/ml或260mg/ml或270mg/ml以创造高粘度水平。如上所述，这些制剂的pH值对于它们的有效性和相应的药物活性蛋白的可用性特别重要。因此，期望将所研究的蛋白质制剂的pH调节在约4.5至约8.0之间的范围内。根据所含蛋白质或肽的性质，优选将pH值调节在约4.6至约5.4之间或约5.4至约7.9之间。用于调节pH的缓冲液优选为pH值为5的乙酸盐缓冲液(25mM)和pH为7的磷酸盐缓冲盐水(10mM)。然而，如果需要，可以使用与所含药物活性蛋白质相容的另一种缓冲液，并且其是生理上可接受的。
降粘剂的浓度调节在50mM至500mM之间(实施例1A-E)。使用基于芯片的(微机电系统)毛细管流变仪m-VROCTM(RheoSence,San Ramon,CA)来测量动态粘度。通常，动态粘度也称为绝对粘度(绝对粘度系数)是内阻的量度，其可以通过高浓缩溶液中蛋白质分子的自缔合来确定。
确定的粘度清楚地表明，仅在一定浓度下单独使用葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐，再与特异性抗体或融合蛋白一起，可导致高浓度蛋白质溶液的粘度可测量的显著降低。
然而，特别意外的是，实验表明，葡甲胺、鸟氨酸或肉碱与选自甲苯磺酸盐、苯磺酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐的平衡离子的组合加入导致显著更高的粘度降低。
如已经指出的，尤其是当等摩尔地向浓缩的蛋白质溶液(例如至(mAbA和mAbB)的溶液)添加葡甲胺或鸟氨酸与选自甲苯磺酸盐和苯磺酸、葡萄糖酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐的平衡离子之一的混合物时，实现了特别良好的粘度降低。
在进一步的实验中，研究了阳离子氨基糖葡甲胺或氨基酸鸟氨酸或肉碱与对甲苯磺酸钠、苯磺酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸或琥珀酸盐作为负平衡离子的可能的混合物降低高度浓缩抗体溶液(mAbA和mAbB)的粘度。
在进一步的实验中，研究了阳离子氨基糖葡甲胺或氨基酸鸟氨酸与对甲苯磺酸钠或苯磺酸作为带负电的平衡离子的可能的混合物以降低高度浓缩抗体溶液(mAbA和mAbB)的粘度。对于这些研究的每一个，添加了这些赋形剂的等摩尔量的混合物。在此，发现150mM的浓度具有特别良好的结果(实施例2A-C)。
在pH为7的10mM磷酸盐缓冲盐水中以约100mg/ml，某些约150mg/ml，尤其高于200mg/ml，和特别是220mg/ml(mAbB)和270mg/mL(mAbA)相当高的浓度下配制所有模型抗体。采用基于芯片的(微机电系统)毛细管流变仪，m-VROCTM(RheoSence,San Ramon,CA)测量粘度。
在所有案例中，浓度为150mM的阳离子氨基糖葡甲胺或氨基酸鸟氨酸和带负电荷的平衡离子(如对甲苯磺酸钠或苯磺酸)的特定等摩尔混合物显示出在高浓缩抗体溶液中测量的粘度显著降低。
葡甲胺和L-鸟氨酸盐酸盐的粘度降低潜力在包含三种不同类型的抗体(嵌合IgG1，人IgG2，人源化IgG4)的浓缩溶液中测试。这些溶液的平均浓度为99mg/ml,173mg/ml或177mg/ml。
在实验中，当分别以150mM的浓度添加至蛋白质溶液中时，已经发现两种赋形剂可以显著降低抗体制剂的粘度。
还在其中含有mAbD作为蛋白质的溶液中，各自添加150mM对甲苯磺酸钠和苯磺酸引起粘度显著的降低。
此外，将150mM D-葡萄糖酸钠盐添加到含mAbD的溶液中导致粘度降低。L-鸟氨酸盐酸盐或葡甲胺与对甲苯磺酸钠或苯磺酸的等摩尔组合的使用也显著降低了高浓缩抗体溶液(mAbD和mAbE)的粘度。另外，如所进行的实验所示，本文提及的助剂的各种其他组合降低了高浓度抗体溶液的粘度。因此，这里提到的赋形剂的组合不是穷举的，并且还有其他可能导致相应结果的组合。
实验还显示了其它有利的效果，这是由于添加了此处提到的赋形剂而产生的。由于通常在药物制剂中使用以用于可靠的效果，甚至在数周的储存后仍然必须具有它们的活性，所以进行合适的储存实验并且随后检查蛋白质的稳定性。
例如，通过单体的量指示的，mAbD的稳定性可以通过添加150mM葡甲胺、150mM L-鸟氨酸盐酸盐或等摩尔各自75mM的L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的组合在加速稳定性研究期间得以改进。
在这方面，降低各种蛋白质溶液的粘度的尝试表明，取决于特定溶液中所含的蛋白质，不同的添加剂导致最佳的稳定性和粘度降低。
在上下文中，蛋白质mAbD的最佳制剂是溶解在Milli-Q-水中并且调节至pH为7.2的包含5mM磷酸盐缓冲液、146mM蔗糖、0.05g/L Polysorbat 80、75mM L-奥尼汀盐酸盐和75mM对甲苯磺酸钠的组合物。
反过来，对于MAbE，最佳的制剂是溶解在Milli-Q-水中并且调节至pH为5.0的包含20mM乙酸盐缓冲剂、0.1g/L Polysorbat 80、150mM葡甲胺的组合物；对于MAbF，最佳的制剂是溶解在Milli-Q-水中并且调节至pH为5.5的包含20mM乙酸盐缓冲剂、205mM蔗糖、75mM葡甲胺、75mM D-葡萄糖酸钠盐的组合物。
优选的实施方案：
本发明的特别优选的实施方案在于向如上所述的高浓缩蛋白质溶液添加赋形剂以降低粘度，所述赋形剂选自葡甲胺、鸟氨酸、对甲苯磺酸钠、苯磺酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸、肉碱和琥珀酸盐(单独或组合)。特别优选地，将葡甲胺与苯磺酸或与对甲苯磺酸钠作为平衡离子的组合添加导致良好的粘度降低。在本发明的另一个优选实施方案中，鸟氨酸与苯磺酸或与对甲苯磺酸钠作为平衡离子的组合也导致良好的粘度降低。因此，优选通过Meg>Meg-对甲苯磺酸钠>对甲苯磺酸钠>苯磺酸>鸟氨酸>这些赋形剂的所有其他组合来降低浓缩蛋白质溶液中的粘度。
溶液制剂的配制和冷冻干燥可以通过上述方法和以下实施例中公开的方法进行。
本说明书使本领域普通技术人员能够全面地实践本发明。因此，即使没有进一步的评论，也假定本领域普通技术人员将能够在最广泛的范围内利用以上描述。
尽管已经结合优选的实施方案描述了本发明，但是应该理解，本领域的技术人员可以对本发明进行各种修改、增加和变更，而不背离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。
如果不清楚，应理解应参考技术人员引用和已知的出版物和专利文献。因此，所引用的文献被认为是本说明书的公开内容的一部分，并且通过引用并入本文。
为了更好的理解并阐明本发明，下面给出实施例，它们在本发明的保护范围之内。这些示例还用于阐明可能的变体。
此外，对于本领域的普通技术人员不言而喻地是，在给出的实施例以及说明书的其余部分中，组合物中存在的组分的量总是仅合计为100wt％或mol％，基于整个组合物，并且即使该百分比范围内可能出现更高的值，也不能超过该百分比。除非另外指出，否则％数据是wt％或mol％；除了比率，其在体积数据中显示。
实施例
实施例1:葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸在高浓缩蛋白质溶液中的降粘作用
-实施例1A)以260mg/ml的蛋白质浓度的mAbA的粘度显著地被50mM的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠降低，而不是被苯磺酸降低。
-实施例1B)由于缓冲液和pH的环境变化，mAbA的粘度也显著地被作为赋形剂的苯磺酸(150mM)而降低。
-实施例1C)在200mg/ml的蛋白质浓度下，mAbB的粘度显示了被500mM的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠显著降低的粘度。
-实施例1D)对于mAbC，赋形剂苯磺酸在150mM处表现出明显的降粘作用。对于其他研究的赋形剂，也发现了降粘作用。
-实施例1E)对于融合蛋白“融合A(Fusion A)”，所有赋形剂的粘度只有轻微降低。只有浓度为50mM的苯磺酸显示出更强的降低。
实施例1A)在图1中显示的在25mM乙酸盐缓冲液(pH为5.0)配制的高浓缩mAbA溶液(260mg/ml)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的粘度降低作用。
缓冲液制备:
-将25mM乙酸钠三水合物和25mM冰醋酸溶解在Milli-Q-水中并且如果需要使用HCl或NaOH将pH调节至5.0(±0.1)。
样品制备:
-在25mM乙酸盐缓冲液(pH为5.0)中制备了50mM的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的赋形剂溶液。如果需要使用HCl或NaOH调节pH。
-用超速离心过滤器(30kDa MWCO)制备含有相关赋形剂的浓缩mAbA溶液，其通过将缓冲液与上述相关赋形剂溶液交换并通过减少溶液体积来浓缩蛋白质。然后，使用上述合适的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至260mg/ml。
粘度测量：
-m-VROCTM技术(RheoSense,San Ramon,California,USA)用于粘度测量。
使用500μl注射器和5000s-1的剪切速率进行测试。所要求的样品体积为200μl并且将样品进行三次重复测试。
实施例1B)图2显示的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH为7.0)中配制的高度浓缩的mAbA溶液(260mg/mL)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的降粘作用
缓冲液制备:
-该缓冲液含有溶解在Milli-Q-水中的0.01M磷酸盐缓冲液、0.0027M氯化钾和0.137M氯化钠。如果必要，使用HCl或NaOH将pH调节至7.0(±0.1)。
样品制备:
-在PBS(pH为7.0)中制备150mM的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的赋形剂溶液。如果必要，使用HCl或NaOH调节pH。
-用超速离心过滤器(30kDa MWCO)制备含有相关赋形剂的浓缩mAbA溶液，其通过将缓冲液与上述相关赋形剂溶液交换并通过减少溶液体积来浓缩蛋白质。然后，使用上述合适的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至260mg/ml。
如实施例1A)所描述的进行粘度测量。
实施例1C)图3显示的在PBS(pH为7.0)中配制的高度浓缩mAbB溶液(200mg/ml)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的粘度降低作用
缓冲液制备:
-如实施例1B)所描述的进行缓冲液制备。
样品制备:
-在PBS(pH为7.0)中制备500mM的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的赋形剂溶液。如果必要，使用HCl或NaOH调节pH。
-用超速离心过滤器(30kDa MWCO)制备含有相关赋形剂的浓缩mAbB溶液，其通过将缓冲液与上述相关赋形剂溶液交换并通过减少溶液体积来浓缩蛋白质。然后，使用上述合适的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至200mg/ml。
如实施例1A)中描述的进行粘度测量。
实施例1D)图4中显示的磷酸盐缓冲液(pH为7)中以260mg/mL(+/-2.7％)配制的葡甲胺、L-鸟氨酸、对甲苯磺酸钠和苯磺酸对mAbC的降粘作用。
缓冲液制备:
-制备了磷酸盐缓冲液，其含有100mM磷酸钠、2.7mM氯化钾和137mM氯化钠。
样品制备:
-在磷酸盐缓冲液中制备了150mM葡甲胺、L-鸟氨酸、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的赋形剂溶液。检查pH值并且如果需要使用盐酸或氢氧化钠调节至7.0(+/-0.1)。
-洗涤mAbC(大约147kDa)71mg/ml的蛋白质溶液并且在含有150mM相应赋形剂的磷酸盐缓冲液(pH为7)中浓缩。
-使用具有30kDa MWCO的超离心过滤器将mAbC洗涤并浓缩至260mg/ml。
如实施例1A)所描述的进行mVROC方法。
实施例1E)图5中显示的在磷酸盐缓冲液(pH为7)中以200mg/ml(+/-5.0％)配制的葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸对融合A的降粘作用
缓冲液制备:
-制备了磷酸盐缓冲液，其含有100mM磷酸钠、2.7mM氯化钾和137mM氯化钠。
样品制备:
-在磷酸盐缓冲液中制备了50mM葡甲胺、L-鸟氨酸、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的赋形剂溶液。检查pH值并且如果需要使用盐酸或氢氧化钠调节至7.0(+/-0.1)。
-洗涤融合A(大约51kDa)50mg/ml的蛋白质溶液并且在含有300mM相应赋形剂的磷酸盐缓冲液(pH为7)中浓缩。
-使用具有30kDa MWCO的超离心过滤器以2000x g将mAbD洗涤并浓缩至200mg/ml。
如实施例1A)所描述的进行mVROC方法。
实施例2:在高度浓缩的蛋白质溶液中两种赋形剂(葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸)的组合的降粘作用
-实施例2A)显示了使用葡甲胺和苯磺酸或葡甲胺和对甲苯磺酸钠的组合(各自以75mM存在于PBS pH7中)将270mg/ml(+/-2.6％)的浓度的mAbA降粘，
-实施例2 B)展示了使用L-鸟氨酸盐酸盐与苯磺酸的赋形剂组合(二者均以75mM存在于缓冲液中)对mAbA具有更强的降粘作用。L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的组合也具有降低作用。
-实施例2C)显示了在PBS缓冲液中(pH为7)所有研究的赋形剂的组合对以220mg/ml浓度下的mAbB的粘度的明显降低。最大的影响通过葡甲胺和对甲苯磺酸钠(二者均为75mM)的组合引起，将PBS中纯的mAbB的粘度由125mPa*s降低至37.7mPa*s。
实施例2A)在图6中显示的在PBS pH 7.0中配制的高浓缩mAbA溶液(270mg/ml)中以150mM累积浓度的赋形剂葡甲胺和苯磺酸(1:1)，葡甲胺和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
缓冲液制备:
-如实施例1B中所描述的进行缓冲液制备。
样品制备:
-含有75mM葡甲胺和75mM苯磺酸或75mM对甲苯磺酸钠的赋形剂溶液在PBS pH 7.0中制备。如果需要使用盐酸或氢氧化钠调节pH。
-用超速离心过滤器(30kDa MWCO)制备含有相关赋形剂组合的浓缩mAbA溶液，其通过将缓冲液与上述相关赋形剂组合溶液交换并通过减少溶液体积来浓缩蛋白质。然后，使用上述合适的赋形剂组合溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至270mg/ml。
如实施例1A)中描述的进行粘度测量。
实施例2B)在图7中显示的在PBS pH 7.0中配制的高浓缩mAbA溶液(270mg/ml)中以累积浓度150mM的赋形剂L-鸟氨酸盐酸盐和苯磺酸(1:1)，L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
缓冲液制备:
-缓冲液制备如实施例1B)中所描述的进行。
样品制备:
-含有75mM L-鸟氨酸盐酸盐和75mM苯磺酸或75mM对甲苯磺酸钠的赋形剂溶液在PBS pH 7.0中制备。如果需要，使用盐酸或氢氧化钠调节pH。
-剩余的样品制备如在实施例2A)中所描述的进行。
如实施例1A)中描述的进行粘度测量。
实施例2C)图8至10中显示的在PBS pH 7.0中配制的高浓缩mAbB溶液(220mg/ml)中赋形剂L-鸟氨酸盐酸盐和苯磺酸(1:1)、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠(1:1)、葡甲胺和苯磺酸(1:1)、葡甲胺和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
缓冲液制备:
-缓冲液制备如实施例1B)中描述的进行。
样品制备：
-含有75mM L-鸟氨酸盐酸盐和75mM苯磺酸、75mM L-鸟氨酸盐酸盐和75mM对甲苯磺酸钠、75mM葡甲胺和75mM苯磺酸、75mM葡甲胺和75mM对甲苯磺酸钠的赋形剂溶液在PBSpH 7.0中制备。如果需要使用盐酸或氢氧化钠调节pH。
-用超速离心过滤器(30kDa MWCO)制备含有相关赋形剂组合的浓缩mAbB溶液，其通过将缓冲液与上述相关赋形剂组合溶液交换并通过减少溶液体积来浓缩蛋白质。然后，使用上述合适的赋形剂组合溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至220mg/ml。
如实施例1A)中所描述的进行粘度测量。
实施例3
缓冲液制备:
缓冲液含有5mM磷酸盐缓冲液，146mM蔗糖，溶解在Milli-Q-水中0.05g/LPolysorbat 80。如果必要，使用HCl或NaOH将pH调节至7.2(±0.05)。
样品制备:
在上述磷酸盐缓冲液中以150mM的浓度制备赋形剂溶液。
在磷酸盐缓冲液中对于每种赋形剂使用75mM的等摩尔浓度制备两种赋形剂的组合。
使用超速离心过滤器(30kDa MWCO)通过与相应的赋形剂溶液进行缓冲液交换来制备浓缩的MAbD溶液。用上述相应的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至100mg/mL。
如实施例1A)中所描述的进行粘度测量。
实施例4
缓冲液制备:
将含有20mM乙酸盐缓冲液、0.1g/L Polysorbat 80的缓冲溶液通过溶解在Milli-Q-水中制备。如果需要，使用HCl或NaOH将pH调节至pH 5.0(±0.05)。
样品制备:
在上述乙酸盐缓冲液中以150mM的浓度制备赋形剂溶液。
在所述乙酸盐缓冲液中对于每种赋形剂使用75mM的等摩尔浓度制备两种赋形剂的组合。
使用超速离心过滤器(30kDa MWCO)通过与相应的赋形剂溶液进行缓冲液交换来制备浓缩的MAbE溶液。用上述相应的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至170mg/mL。
如实施例1A)中所描述的进行粘度测量。
实施例5
缓冲液制备:
该缓冲液含有20mM乙酸盐缓冲液，205mM溶解在Milli-Q-水中的蔗糖。如果需要，使用HCl或NaOH将pH调节至pH 5.5(±0.05)。
样品制备:
在上述乙酸盐缓冲液中以150mM的浓度制备赋形剂溶液。
在乙酸盐缓冲液中对于每种赋形剂使用75mM的等摩尔浓度制备两种赋形剂的组合。
使用超速离心过滤器(30kDa MWCO)通过与相应的赋形剂溶液进行缓冲液交换来制备浓缩的MAbF溶液。用上述相应的赋形剂溶液将浓缩的蛋白质溶液稀释至180mg/mL。
如实施例1A)中所描述的进行粘度测量。
附图列表：
图1实施例1A)在25mM乙酸盐缓冲液(pH为5.0)中配制的高浓缩mAbA溶液(260mg/ml)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的降粘作用。
图2实施例1B)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH为7.0)中配制的高浓缩mAbA溶液(260mg/mL)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠和苯磺酸的降粘作用。
图3实施例1C)在PBS(pH为7.0)中配制的高浓缩mAbB溶液(200mg/mL)中葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠的降粘作用。
图4实施例1D)在磷酸盐缓冲液(pH为7)中对于以260mg/mL(+/-2.7％)配制的mAbC，葡甲胺、L-鸟氨酸、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的降粘作用。
图5实施例1E)在磷酸盐缓冲液(pH为7)，对于以200mg/ml(+/-5.0％)下配制的融合A，葡甲胺、L-鸟氨酸盐酸盐、对甲苯磺酸钠和苯磺酸的降粘作用。
图6实施例2A)在PBS(pH为7.0)中配制的高度浓缩的mAbA溶液(270mg/ml)中以累积浓度150mM的赋形剂葡甲胺和苯磺酸(1:1)，葡甲胺和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
图7实施例2B)在PBS(pH为7.0)中配制的高度浓缩的mAbA溶液(270mg/ml)中以累积浓度150mM的赋形剂L-鸟氨酸盐酸盐和苯磺酸(1:1)，L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
图8实施例2C)在PBS(pH为7.0)中配制的高度浓缩的mAbB溶液(220mg/ml)中赋形剂L-鸟氨酸盐酸盐和苯磺酸(1:1)，L-鸟氨酸盐酸盐和对甲苯磺酸钠(1:1)，葡甲胺和苯磺酸(1:1)，葡甲胺和对甲苯磺酸钠(1:1)的组合的降粘作用。
图9实施例3)在磷酸盐缓冲液(pH为7.2)中配制的高浓缩mAbD溶液(100mg/ml)中赋形剂葡甲胺和葡萄糖酸(1：1)，葡甲胺葡萄糖醛酸(1：1)，鸟氨酸和葡萄糖酸(1：1)，鸟氨酸葡萄糖醛酸(1：1)的组合的降粘作用。
图10:如实施例4中所描述的在包含Polysorbat 80的乙酸盐缓冲剂(pH为5.0)中使用包含以对于每种赋形剂75mM的等摩尔浓度的两种赋形剂的组合的溶液稀释至170mg/ml的浓度的浓缩的mAbE蛋白质溶液的降粘作用。
图11如实施例3所描述的在包含蔗糖和Polysorbat 80的磷酸盐缓冲液(pH为7.2)中使用包含对于每种赋形剂75mM的等摩尔浓度的两种赋形剂的组合的溶液将浓缩的mAbD蛋白质溶液稀释至100mg/mL的浓度的降粘作用。
图12如实施例4中所描述的在包含Polysorbat 80的乙酸盐缓冲液(pH为5.0)中使用包含对于每种赋形剂75mM的等摩尔浓度的两种赋形剂的组合的溶液将浓缩的mAbE蛋白质溶液稀释至170mg/mL的浓度的降粘作用。
图13如实施例5中所描述的在包含蔗糖的乙酸盐缓冲液(pH为5.5)中使用包含对于每种赋形剂75mM的等摩尔浓度的两种赋形剂的组合的溶液将浓缩的mAbF蛋白质溶液稀释至约180mg/mL的浓度的降粘作用。
图14在存在各种赋形剂的情况下，在25℃和60％RH下对mAbD进行12周的稳定性研究。(缩写:MG＝葡甲胺；OM＝L-鸟氨酸单盐酸盐；NTS＝对甲苯磺酸钠；w/o＝不含，这意味着不含赋形剂的市场制剂)

Claims (33)

1.一种降低包含药物活性蛋白的液体制剂的粘度的方法，所述药物活性蛋白的浓度范围为至少50mg/ml至高达300mg/ml，包含以下步骤：将蛋白质溶液与降低粘度浓度的赋形剂混合，所述赋形剂选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或它们的混合物。
2.权利要求1的方法，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
3.权利要求1或2的方法，其中添加葡甲胺和作为平衡离子的苯磺酸，或葡甲胺和作为平衡离子的对甲苯磺酸钠，作为降粘赋形剂。
4.权利要求1或2的方法，其中添加鸟氨酸和作为平衡离子的苯磺酸，或鸟氨酸和作为平衡离子的对甲苯磺酸钠，作为降粘赋形剂。
5.权利要求1或2的方法，其中添加葡甲胺和鸟氨酸作为降粘赋形剂。
6.权利要求1或2的方法，其中添加葡甲胺或鸟氨酸或肉碱和选自苯磺酸、对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐的平衡离子，作为降粘赋形剂。
7.根据权利要求3-6任一项的方法，其中降粘赋形剂以等摩尔量添加。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中制剂的粘度降低至少12％。
9.根据权利要求1-7任一项的方法，其中制剂的粘度降低至少50％。
10.根据权利要求1-7任一项的方法，其中制剂的粘度降低至少75％。
11.通过权利要求1-10任一项的方法制备的药物制剂，其具有降低的粘度。
12.权利要求11的药物组合物，其包含至少50mg/ml至高达300mg/ml浓度的治疗性蛋白质和选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或其混合物的赋形剂。
13.权利要求11或12的药物组合物，其中包含葡甲胺和作为平衡离子的苯磺酸，作为降粘赋形剂。
14.权利要求11或12的药物组合物，其中添加葡甲胺和作为平衡离子对甲苯磺酸钠，作为降粘赋形剂。
15.权利要求11或12的药物组合物，其中添加鸟氨酸和作为平衡离子的苯磺酸，作为降粘赋形剂。
16.权利要求11或12的药物组合物，其中添加鸟氨酸和作为平衡离子的对甲苯磺酸钠，作为降粘赋形剂。
17.根据权利要求13-16的任一项的药物组合物，其中以等摩尔量添加降粘赋形剂。
18.根据权利要求13-17任一项的药物组合物，其中赋形剂的浓度小于约500mM，尤其小于200mM。
19.根据权利要求11-18任一项的药物组合物，具有约4.5至约8.0范围的pH。
20.根据权利要求11-18任一项的药物组合物，具有约5.4至约7.9范围的pH。
21.根据权利要求11-18任一项的药物组合物，具有约4.6至约5.4范围的pH。
22.一种制备冻干粉的方法，其包含将根据权利要求11至21中任一项所述的药物组合物冻干的步骤。
23.权利要求22的冻干粉，包含治疗性蛋白质和选自葡甲胺、鸟氨酸、肉碱、苯磺酸和对甲苯磺酸钠、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基己酸和琥珀酸盐或它们的混合物的赋形剂，其中赋形剂在用稀释剂重构后以有效降低粘度的重量：重量浓度存在。
24.权利要求22或23的冻干粉，其中赋形剂以约100μg/mg治疗性蛋白质至约1mg/mg治疗性蛋白质的浓度存在。
25.权利要求22、23或24的冻干粉，其中赋形剂以约200μg至约500μg/mg治疗性蛋白质至约1mg/mg治疗性蛋白的浓度存在。
26.重构权利要求22的冻干粉的方法，包含以下步骤：添加无菌水性稀释剂。
27.权利要求1或2、22或26任一项的方法，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
28.根据权利要求11-18任一项的药物制剂或药物组合物，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
29.权利要求23至26中任一项的冻干粉，其中治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、微抗体、修饰的抗体、抗体样分子和融合蛋白。
30.包含权利要求28的药物制剂或权利要求29的冻干粉的试剂盒。
31.根据权利要求30的试剂盒，包含药物组合物的冻干或喷雾干燥制剂，其可通过根据权利要求1-9一项或多项的方法获得，其可以在使用前制成溶液制剂。
32.根据权利要求30的试剂盒，包含置于96孔板中的即用型冻干或喷雾干燥制剂。
33.根据权利要求31或31的用于向患者施用的试剂盒，包括容器、具有或不具有针头的注射器和/或其他给药装置、输液泵、喷射注射器、笔装置、经皮注射器或其他无针注射器和说明书。
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