JPWO2004087763A1 - Ｃｄ２２に対する改変抗体およびその利用 - Google Patents

Abstract

既に公開されている二種類の抗ＣＤ２２抗体の配列情報をもとに、重鎖と軽鎖の可変領域を５ｍｅｒのリンカーで連結させたＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙをそれぞれ作製した。作製した２種のｄｉａｂｏｄｙについて、リンパ腫細胞に対する結合及び細胞死（アポトーシス）誘導活性の検討を行った結果、これらｄｉａｂｏｄｙがいずれもＢリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞に結合し、さらに、いずれもＲａｊｉ細胞および同じくＢリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞にアポトーシスを誘導する活性があることが判明した。以上の結果は、ＣＤ２２を認識する抗体の低分子化抗体がリンパ腫細胞などの腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導剤として利用できることを示している。

Description

本発明は、ＣＤ２２を認識する抗体の低分子化抗体に関する。

ＣＤ２２は、Ｉｇスーパーファミリーに属する分子であり、その発現はＢ細胞に特異的で、Ｂ細胞レセプターからのシグナルを抑制する機能を担っていると考えられている。また、ＣＤ２２は、造血器疾患において、様々なＢ細胞性白血病、悪性リンパ腫細胞に発現していることが知られている。血清中に可溶性のＣＤ２２は検出されていないことから、ＣＤ２２は抗体療法が可能であると考えられている（非特許文献１から５）。
造血器腫瘍におけるＣＤ２２抗体の利用に関しては、ヒト化された抗ＣＤ２２抗体などを利用してＢ細胞悪性疾患の治療が可能である旨の報告がある（特許文献１および２）。しかしながら、これら文献においては、抗ＣＤ２２抗体とアポトーシス誘起活性との関係については、何ら開示されていない。
一方、通常の抗ＣＤ２２抗体では認められなかったリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉに対する増殖抑制効果が、抗ＣＤ２２抗体を架橋剤で化学的にｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋすることで、認められたとの報告がある（非特許文献６）。ただし、アポトーシス誘導に関する記述はなされていない。
実際の治療において種々の利点を有する低分子化された抗体の利用に関しては、ＣＤ２２を含む数種の抗原に対する抗体（ＩｇＧ、Ｆｃ部分を含まないＦａｂ’２）をクロスリンクし、これを用いて腫瘍細胞のアポトーシスを誘起する方法が開示されている（特許文献３）。しかしながら、この文献においては、ＣＤ２２に対する抗体は、実際に作成されておらず、従って、そのアポトーシス誘起活性の検出も行われていない。
このように低分子化された抗ＣＤ２２抗体を利用して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導したとの報告はいまだなされていない。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
西井一浩 ＣＵＲＲＥＮＴ ＲＨＥＲＡＰＹ Ｖｏｌ．２０ Ｎｏ．１ ４７−５０ Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：４８１−５０４（１９９７） Ｃｌａｒｋ ＥＡ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４７１５−４７１８（１９９３ Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：５５１−５６２（１９９６） Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８：８５−９９（１９９３） Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：７５０９−７５１４（１９９７） 特表２００１−５１８９３０ 特表平１０−５０５２３１ ＷＯ９９／０２５６７

そこで、本発明の第一の目的は、ＣＤ２２を認識する抗体の低分子化抗体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、この低分子化抗体を利用した新たな造血器腫瘍の治療法を提供することにある。
本発明者らは、ＣＤ２２に対する低分子化抗体であるｄｉａｂｏｄｙを作製することを目的として、まず、既に公開されている二種類の抗ＣＤ２２抗体の配列情報をもとに、重鎖と軽鎖の可変領域を５ｍｅｒのリンカーで連結させたＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙの塩基配列をそれぞれ設計し、その合成を行った（精製の容易化のためｄｉａｂｏｄｙにはＦｌａｇ−ｔａｇを挿入した）。合成したｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターに挿入し、これをＤＧ４４細胞あるいはＣＯＳ７細胞に導入し、その培養上清から、生産されたｄｉａｂｏｄｙを抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロースを利用してアフィニティー精製した。
本発明者らは、次いで、こうして得られた２種のｄｉａｂｏｄｙについて、リンパ腫細胞に対する結合及び細胞死（アポトーシス）誘導活性の検討を行った。その結果、これらｄｉａｂｏｄｙがいずれもＢリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞に結合し、さらに、いずれもＲａｊｉ細胞および同じくＢリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞にアポトーシスを誘導する活性があることが判明した。以上の結果は、ＣＤ２２を認識する抗体の低分子化抗体がリンパ腫細胞などの腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導剤として利用できることを示している。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供するものである。
（１） ＣＤ２２を認識する低分子化抗体。
（２） Ｄｉａｂｏｄｙである（１）に記載の低分子化抗体。
（３） 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の低分子化抗体。
（ａ） 配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｂ） 配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ａ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
（ｃ） 配列番号：５のＣＤＲおよび配列番号：７のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｄ） 配列番号：５のＣＤＲおよび配列番号：７のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
（ｅ） 配列番号：９のＣＤＲおよび配列番号：１１のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｆ） 配列番号：９のＣＤＲおよび配列番号：１１のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
（４） ＣＤ２２を認識する抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
（５） 低分子化がＤｉａｂｏｄｙ化である、（４）に記載の方法。
（６） 活性がアポトーシス誘導活性である、（４）または（５）に記載の方法。
（７） （１）〜（３）のいずれかに記載の低分子化抗体、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤。
（８） 腫瘍細胞に対するアポトーシスを誘導する、（７）に記載のアポトーシス誘導剤。
（９） 腫瘍細胞がリンパ腫細胞または白血病細胞である、（８）に記載のアポトーシス誘導剤。
（１０） （１）〜（３）のいずれかに記載の低分子化抗体、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
（１１） 腫瘍が血液腫瘍である、（１０）に記載の抗腫瘍剤。
（１２） 抗体がＤｉａｂｏｄｙである、（７）から（９）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
（１３） 抗体がＤｉａｂｏｄｙである、（１０）または（１１）に記載の抗腫瘍剤。
本発明は、ＣＤ２２を認識する低分子化抗体を提供する。本発明における低分子化抗体は、活性が上昇している点で有用である。ここで、活性とは、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。具体的な例としては、アポトーシス誘導作用、抗腫瘍作用である。
アポトーシス誘導作用、抗腫瘍作用などの対象となる細胞は特に限定されないが、腫瘍細胞が好ましい。腫瘍細胞の具体的な例としては、リンパ腫細胞や白血病細胞が最も好ましい。
本発明においては、上記ＣＤ２２を認識する低分子化抗体を投与することにより、例えば、血液腫瘍などの腫瘍（具体的な例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、形質細胞異常症（多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄繊維症）など）や自己免疫疾患（具体的な例として、リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、乾癬、ベーチェット病、など）のような疾患の治療、予防などをおこなうことが可能である。
本発明において、ＣＤ２２とは、Ｉｇスーパーファミリーに属し、７個のＩｇ様ドメインからなり、遺伝子上１９ｑ１３．１に存在する分子（Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：４８１−５０４（１９９７））を意味する。
本発明において低分子化抗体とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｄｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはＶＨとＶＬの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）、などを挙げることができるが、好ましくはｓｃＦｖ（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３、Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｖｏｌ．１１３，Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，（１９９４））である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体のＶＨを２つ以上及びＶＬを２つ以上含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカー等を介して間接的に結合した抗体である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、また、共有結合と非共有結合の両方でよい。さらに好ましい低分子化抗体は、ＶＨとＶＬが非共有結合により結合して形成されるＶＨ−ＶＬ対を２つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体中の一方のＶＨ−ＶＬ対と他方のＶＨ−ＶＬ対との間の距離が、全長抗体における距離よりも短くなる抗体が好ましい。
本発明において特に好ましい低分子化抗体はＤｉａｂｏｄｙである。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でよいが、好ましくは非共有結合である。
また、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士をリンカーなどで結合して、一本鎖Ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｉａｂｏｄｙ）とすることも可能である。その際、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士を２０アミノ酸程度の長いリンカーを用いて結合すると、同一鎖上に存在するＤｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成する。
Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメントは、ＶＬとＶＨを結合したもの、ＶＬとＶＬを結合したもの、ＶＨとＶＨを結合したもの等を挙げることができるが、好ましくはＶＨとＶＬを結合したものである。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカーは特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ましい。そのようなリンカーの長さは当業者が適宜決定することができるが、通常２〜１４アミノ酸、好ましくは３〜９アミノ酸、特に好ましくは４〜６アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため、同一鎖上のＶＬとＶＨの間で非共有結合がおこらず、単鎖Ｖ領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。さらに、Ｄｉａｂｏｄｙ作製と同じ原理で、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメントを３つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。
本発明におけるＤｉａｂｏｄｙとしては、下記のものを例示できるが、これらに限定されるものではない。
１．配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙ
２．配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙであって、配列番号：１または３に記載の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと機能的に同等なＤｉａｂｏｄｙ
３．配列番号：５のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：７のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙ
４．配列番号：５のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：７のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙであって、配列番号：５のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：７のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと機能的に同等なＤｉａｂｏｄｙ
５．配列番号：９のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：１１のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙ
６．配列番号：９のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：１１のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙであって、配列番号：９のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：１１のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと機能的に同等なＤｉａｂｏｄｙ
ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤｉａｂｏｄｙが、配列番号：１または３に記載の配列を有するＤｉａｂｏｄｙ、配列番号：５のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：７のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙ、または、配列番号：９のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：１１のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと同等の活性（例えば、ＣＤ２２への結合活性、アポトーシス誘導活性など）を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
また、配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙ、配列番号：５のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：７のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙ、または配列番号：９のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：１１のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙを、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的としてヒト型化、キメラ化してもよい。
配列番号：５に記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、３１〜３５がＣＤＲ１、５０〜６６がＣＤＲ２、９９〜１０５がＣＤＲ３に相当する。配列番号：７に記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、２４〜４０がＣＤＲ１、５６〜６２がＣＤＲ２、９５〜１０３がＣＤＲ３に相当する。配列番号：９に記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、３１〜３５がＣＤＲ１、５０〜６６がＣＤＲ２、９９〜１１２がＣＤＲ３に相当する。配列番号：１１に記載されている可変領域に相当するアミノ酸配列で、２４〜３４がＣＤＲ１、５０〜５６がＣＤＲ２、８９〜９７がＣＤＲ３に相当する。
本発明においてＣＤ２２を認識する低分子化抗体は、ＣＤ２２に特異的に結合し、生物学的作用を有していれば特に制限されない。本発明の低分子化抗体は、当業者に公知の方法により作製することが可能である。例えば、実施例に記載されているように、ＣＤ２２を認識する抗体の配列（特に可変領域の配列や相補鎖決定領域（ＣＤＲ）の配列）を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可能である。
ＣＤ２２を認識する抗体の配列は、既に公知の抗体の配列を用いることが可能であり、又、ＣＤ２２を抗原として、当業者に公知の方法により抗ＣＤ２２抗体を作製し、その抗体の配列を取得して用いることも可能である。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。ＣＤ２２タンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（ＷＯ９８／４６７７７など）等に準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの配列を公知の方法により解読すればよい。
ＣＤ２２を認識する抗体は、ＣＤ２２と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体なども使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
これらキメラ抗体やヒト型化抗体などについては、低分子化した後にキメラ化やヒト型化等を行ってもよいし、キメラ化やヒト型化等を行った後に低分子化を行ってもよい。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を挿入した適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡを包含する。又、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗原への結合能及び活性を有する抗体をコードするＤＮＡを包含する。ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）は当業者に公知であり、ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のＤＮＡは、本発明の抗体のｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の抗体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の抗体をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体のＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的のＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
本発明において、抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明において、本発明の抗体が腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するか否かは、実施例と同様にしてＤａｕｄｉ細胞又はＲａｊｉ細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定することができる。
また、本発明は、本発明の低分子化抗体を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤または抗腫瘍剤を提供する。本発明の低分子化抗体のこれら活性は、リンパ腫細胞または白血病細胞で特に効果が大きいと考えられるので、癌などの腫瘍（特に血液腫瘍）の治療や予防に特に有効であると考えられる。低分子化されていない抗ＣＤ２２抗体を有効成分として用いる場合には、抗ＩｇＧ抗体などでクロスリンクすることが好ましい。
上記抗体には各種試薬を結合してコンジュゲート抗体として使用することもできる。このような試薬としては、化学療法剤、放射性物質、トキシンなどを挙げることができる。このようなコンジュゲート抗体は公知の方法により作製することができる（ＵＳ５０５７３１３、ＵＳ５１５６８４０）。
上記薬剤は、直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の薬剤の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。

図１は、ＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙの塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図２は、ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙの塩基配列およびアミノ酸配列を示す図である。
図３は、ｄｉａｂｏｄｙの精製を示す写真である。精製した各ｄｉａｂｏｄｙをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＣＢＢ染色、または、抗Ｆｌａｇ抗体でウエスタンブロットを行った。その結果、いずれのｄｉａｂｏｄｙも完全ではないがほぼ精製されていることが確認された。
図４は、各ｄｉａｂｏｄｙのＲａｊｉ細胞への結合能の確認を示す図である。精製した各ｄｉａｂｏｄｙの、Ｒａｊｉ細胞への結合能について解析を行った。その結果、いずれのｄｉａｂｏｄｙもＲａｊｉ細胞へ結合することが確認された。結合活性はＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙよりもＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙの方が強かった。ただしＬＬ２抗体は細胞内へのｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ活性が高いことが報告されているため、多くのＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙは細胞に結合後、細胞内に取り込まれてしまっている可能性が予想される。
図５は、各ｄｉａｂｏｄｙによる細胞傷害活性の解析を示す図である。ＣＤ２２を高度に発現することが知られている２種類のＢリンパ腫細胞株、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉに対するＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性を測定した。それぞれのｄｉａｂｏｄｙを各濃度（図中に示す）で細胞に添加し、２０時間後に細胞をＰＩで染色することで、死細胞の割合を測定した。その結果、いずれのＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙもＢリンパ腫細胞株に対して、細胞死を誘導していることが確認された。この結果より、ｄｉａｂｏｄｙ化した抗ＣＤ２２抗体が、単独でＢリンパ腫細胞株に対して細胞死を誘導できることが証明された。

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
既に公開されている二種類の抗ＣＤ２２抗体、すなわちＬＬ２（特許第３０５３８７３号）、ＲＦＢ４（ＪＰ ２００２５０１４８８−Ａ）の配列情報をもとに、重鎖と軽鎖の可変領域を５ｍｅｒのリンカーで連結させたＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙの塩基配列をそれぞれ設計した。（ＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ、ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙ）。図１（配列番号：１、２）および図２（配列番号：３、４）に、それぞれのｄｉａｂｏｄｙの配列を示す（リンカーをアンダーライン、Ｆｌａｇ−ｔａｇを波線で示す）。
設計したＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ、及び、ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙをコードするｃＤＮＡを合成するため、各ｄｉａｂｏｄｙにつきそれぞれ１２種類ずつオリゴＤＮＡを作製した（エスペックオリゴサービス株式会社）。配列番号：１３から３６に使用した合成ＤＮＡの配列を示す。ＤｉａｂｏｄｙをコードするｃＤＮＡは以下のとおりに合成した。まず、各オリゴＤＮＡ２本ずつを適切な組み合わせで混合しそれぞれをチューブ内でアニール、および伸長反応させることで、１５０ｂｐ程度のＤＮＡ断片を作製した。続いて得られたＤＮＡ断片同士によるｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ反応を数回繰り返すことで、最終的に約８００ｂｐからなるｃＤＮＡの合成を行った。
合成して得られた各ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ切断し、、動物細胞発現ベクターｐＣＸＮＤ３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入した。塩基配列を確認し、ＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクター（ｐＣＸＮＤ３−ＬＬ２ＤＢ）および、ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクター（ｐＣＸＮＤ３−ＲＦＢ４ＤＢ）の構築を終了した。
［実施例２］ＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙの精製
（１）ＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ発現細胞株の樹立と培養上清の回収
ＰｖｕＩで切断し、直鎖化したｐＣＸＮＤ３−ＬＬ２ＤＢ ２０μｇをＤＧ４４細胞に以下のようにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法により導入した。ＤＧ４４細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＰＢＳで２回洗浄した後１Ｘ１０^７／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。これに２０μｇの上記プラスミドを混合し、電気パルス（１．５ＫＶ，２５μＦＤ）を与えた。適当な割合で細胞を希釈し９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに撒きこみ、終濃度５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ）存在下で培養を行った。生育したコロニーを含むｗｅｌｌより〜３０クローンほどピックアップし、それら培養上清中のｄｉａｂｏｄｙの発現をウエスタンブロットにより調べた。発現の認められたクローンを拡大後、これをＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ高産生細胞株とした。Ｔ−１７５フラスコ中でコンフルエントになったＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ高産生細胞株を２本のローラーボトル（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ）２５０ｍｌ）に移し、５日後に培養上清を回収した。遠心によって死細胞を除去した後、０．４５μｍのフィルターを通してこれをＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙの精製に用いた。
（２）ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙのｃｏｓ７での一過性発現と培養上清の回収
ｐＣＸＮＤ３−ＲＦＢ４ＤＢ ２０μｇをＣＯＳ７細胞に以下のようにｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法により導入した。ＣＯＳ７細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＰＢＳで２回洗浄した後１Ｘ１０^７／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。これに２０μｇの上記プラスミドを混合し、電気パルス（２２０Ｖ，９５０μＦＤ）を与えた。その後全細胞をＴ−２２５フラスコ３本に巻き込み（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）、３日後に培養上清を回収した。遠心によって死細胞を除去した後、０．４５μｍのフィルターを通してこれをＲＦＢ４２ｄｉａｂｏｄｙの精製に用いた。
（３）ｄｉａｂｏｄｙの精製
ｄｉａｂｏｄｙの精製は以下のとおり行った。回収した各培養上清にＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）を加え、一晩４℃で混合することによりｄｉａｂｏｄｙを吸着させた。Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅを遠心により回収しＰＢＳで数回洗浄した後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｈ３．５，０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）でｄｉａｂｏｄｙを溶出した。回収したサンプルは直ちに終濃度２５ｍＭになるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。これを濃縮し、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳにバッファー置換した。回収したサンプルの一部をＳＤＳ電気泳動し、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロット、および、クマシー染色を行い、目的の蛋白が精製されていることを確認した。
［実施例３］ＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙのリンパ腫細胞への結合の確認
精製したＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙを２％ＦＣＳ，０．０２％ＮａＮ_３を含むＰＢＳ中でそれぞれ終濃度が２０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌになるようにＢリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞に加え、氷上で１時間反応させた。続いて、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体を加え、さらに氷上で１時間反応させた。細胞を洗浄後、ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧと氷上で３０分反応させた後、細胞表面への結合をｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙを用いて測定した（ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ，ＣＯＵＬＴＥＲ）。
［実施例４］ＣＤ２２ｄｉａｂｏｄｙによるリンパ腫細胞の細胞死誘導活性の解析
Ｂリンパ腫細胞株、Ｒａｊｉ、及び、Ｄａｕｄｉを、２〜５ Ｘ １０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞を撒いた。これに、精製したＬＬ２ｄｉａｂｏｄｙ、またはＲＦＢ４ｄｉａｂｏｄｙを添加し３７℃で培養を続けた。２０時間後細胞を回収し、ＰＩを加え室温で１５分反応させることで死細胞をラベルした。その後、ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙを用いて染色された死細胞の割合を測定した（ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ，ＣＯＵＬＴＥＲ）。

産業上の利用の可能性

本発明によって、高比活性の低分子化抗体を提供できるものと期待される。該低分子化抗体を使用することで、短い半減期でも十分な薬効が期待でき、さらに、薬効と毒性の乖離が可能になるものと期待できる。また、臨床投与量の低減化および生産コストの低減化など、コスト全体の低減化が図れるので抗体医薬品の開発上問題になる経済面問題の改善もまた期待される。

【配列表】

Claims (13)

1. ＣＤ２２を認識する低分子化抗体。
2. Ｄｉａｂｏｄｙである請求項１に記載の低分子化抗体。
3. 以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の低分子化抗体。
   （ａ） 配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
   （ｂ） 配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ａ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
   （ｃ） 配列番号：５のＣＤＲおよび配列番号：７のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
   （ｄ） 配列番号：５のＣＤＲおよび配列番号：７のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
   （ｅ） 配列番号：９のＣＤＲおよび配列番号：１１のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
   （ｆ） 配列番号：９のＣＤＲおよび配列番号：１１のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
4. ＣＤ２２を認識する抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
5. 低分子化がＤｉａｂｏｄｙ化である、請求項４に記載の方法。
6. 活性がアポトーシス誘導活性である、請求項４または５に記載の方法。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項４〜６のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤。
8. 腫瘍細胞に対するアポトーシスを誘導する、請求項７に記載のアポトーシス誘導剤。
9. 腫瘍細胞がリンパ腫細胞または白血病細胞である、請求項８に記載のアポトーシス誘導剤。
10. 請求項１〜３のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項４〜６のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
11. 腫瘍が血液腫瘍である、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
12. 抗体がＤｉａｂｏｄｙである、請求項７から９のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
13. 抗体がＤｉａｂｏｄｙである、請求項１０または１１に記載の抗腫瘍剤。

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