KR20030055274A - 저분자화 트롬보포에틴 아고니스트 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TPO 수용체를 가교함으로써 세포내에 신호를 전달하여 TPO 아고니스트 작용을 이룰 수 있는, 모노크로날 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체에 관한 것이다. 이 개변항체는 TPO에 의한 신호전달의 아고니스트로서 사용할 수 있고, 혈소판 감소가 관여하는 혈액병환, 암이나 백혈병 등의 화학치료 후의 혈소판 감소증 등의 예방 및/또는 치료약 등으로 사용할 수 있다.

Description

저분자화 트롬보포에틴 아고니스트 항체{DEGRADED TPO AGONIST ANTIBODY}

트롬보포에틴(TPO)은 1994년에 발견된 혈소판 생산 조절인자이며, 주로 간장에서 생산되는 분자량 7만∼8만의 당단백질로 이루어지는 것이 알려져 있다. 트롬보포에틴은 골수에 있어서 혈소판 전구체 세포의 생존, 증식, 분화 및 성숙, 즉 거핵구의 분화 및 증식을 촉진하는 사이토카인이다. 한편, 트롬보포에틴(TPO) 수용체는 혈소판 생산을 조절하는 특이적 인자의 수용체 c-Mpl로서 TPO 보다 앞서 동일하게 정해져 있었다(M. Souyri et al., Cell 63: 1137(1990)). c-Mpl은 혈소판 전구체 세포, 거핵구 및 혈소판에 일부 존재하고, c-Mpl 발현의 억제가 거핵구 형성을 선택적으로 저해하는 것이 보고되었다(M. Methia et al., Blood 82: 1395(1993)). 그리고 c-Mpl에 대한 리간드는, c-Mpl 리간드 특이적 세포의 증식 분석 및 정제수단으로서의 c-Mpl을 사용한 그 리간드의 정제로부터 TPO인 것이 보고되고(F. de Sauvage et al., Nature 369:533(1994); TD. Bartley et al., Cell 77:1117(1994)), 현재 Mpl은 TPO 수용체라 불리고 있다. 이 때문에, TPO 및 TPO 수용체의 아고니스트는, 여러 가지 혈소판 감소증의 치료약으로서, 예컨대 암환자에 대한 골수억제 및 척수절단요법에 부수하는 혈소판 감소증을 완화하는 의약으로서의 응용이 기대되고 있다.

한편, 개변항체, 특히 저분자화 항체, 예컨대 단일쇄 Fv는, 그 저분자화에 의해 조직, 종양 등으로의 이행성을 개선하고, 유전자공학적으로 조제할 목적으로 개발된 것이지만, 최근 단일쇄 Fv의 다이머, 특히 이중 특이성[bispecific]의 다이머가 세포끼리의 가교를 목적으로 사용되고 있다. 이와 같은 다이머로서는, 대표적으로는 암세포 항원과 NK세포나 호중구 등 숙주세포 항원을 인식하는 단일쇄 Fv의 헤테로 다이머가 알려져 있다(Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763-9772, 1998). 이들은 세포간 가교를 유도시킴으로써 암을 치료하기 위한 보다 효율적인 개변항체로서, 단일쇄 Fv의 구축기술로부터 작성된 것이다. 이 때문에, 항체 및 그 단편(예컨대, Fab단편 등) 및 이중 특이성의 개변항체, 또는 단일 특이성인 단일쇄 Fv의 다이머라도 세포간의 가교가 유발된다고 생각되고 있다.

또한, 세포표면 분자를 가교하여 신호를 전달할 수 있는 모노크로날 항체로서, 예컨대 세포의 분화·증식에 관여하는 EPO 수용체에 대한 항체(일본특허공개 2000-95800호 공보), MuSK 수용체에 대한 항체(Xie et al., Nature Biotech. 15, 768-771, 1997)등이 알려져 있다. 또한, TPO 수용체에 대한 아고니스트 항체, 그 단편 및 단일쇄 Fv 등도 알려져 있다.

그래서, 우선 본 발명자들은 IAP를 갖는 세포에 대하여 아폽토시스를 유기하는 모노크로날 항체(MABL-1 및 MABL-2 항체)를 취득하고, 그것을 기초로 제작한 단일쇄 Fv의 모노머는 세포에 아폽토시스를 유기하지 않고, 다이머가 세포에 대하여 아폽토시스를 유도하는 것에 주목하고, 이들이 세포표면상의 IAP 수용체를 가교(2량체화)함으로써 상기 세포에 신호가 전달되고, 그 결과 아폽토시스가 유도된 것을 알아냈다. 즉, 이들은 단일 특이성의 단일쇄 Fv 다이머가 세포표면상의 분자(예컨대 수용체)를 가교함으로써, 리간드와 동일하게 신호를 전달하고, 이것에 의해 아고니스트 작용을 나타낼 수 있는 것을 시사하는 것이다.

다음으로 세포간의 가교형성에 주목한 바, 상기 모노크로날 항체는 적혈구 응집을 일으키지만, 상기 단일쇄 Fv의 다이머는 적혈구 응집을 일으키지 않는 것을 발견하였다. 동일한 결과는 단일쇄 2가 항체(2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드)에서도 관찰되었다. 즉, 이것은 모노크로날 항체에서는 세포간에서 가교가 형성될 가능성이 있는데 비하여, 단일쇄 Fv 다이머 또는 단일쇄 2가 항체 등의 개변항체에서는, 세포표면상의 분자를 가교하지만 세포간의 가교를 형성하지 않는 것을 시사하는 것이다.

본 발명자는 이들의 결과로부터, 단일쇄 Fv 다이머나 단일쇄 2가 항체 등의 개변항제가, 종래 알려져 있는 세포간의 가교뿐만 아니라, 동일 세포의 세포표면분자 또는 세포내 분자를 가교하는, 상기 분자에 대한 리간드(특히 천연의 리간드의 작용을 모방하기 위한 리간드)로서 특히 적절하다는 것을 처음으로 발견하였다.

또한, 본 발명자는 항체 분자(whole IgG)를 단일쇄 Fv 다이머 또는 단일쇄 2가 항체 등의 개변항체로 함으로써, 세포간의 가교 등에 의한 부작용을 경감하고,또한 세포표면상의 분자를 가교하여, 세포에 소망하는 작용만을 유기할 수 있는 새로운 의약품을 제공할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다. 또한, 본 발명의 개변항체는, 상기 개변항체와 마찬가지로 V영역을 갖는 Whole의 항체(IgG)와 비교하여 현저하게 높은 활성을 가지고 있고, 또한 항체분자에 비해 분자량이 적고, 정상영역을 갖지 않는다고 하는 특징으로부터, 조직 이행성이 향상하고 있다는 특징을 가지고 있다.

본 발명은 TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체에 관한 것이다. 상기 개변항체는 TPO 수용체를 가교함으로써 세포내에 신호를 전달할 수 있는 TPO 아고니스트 작용을 가지고 있고, 여러 가지 의약으로서 유용하다.

도 1은 인간 IgG 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 결합하지 않는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 2는 키메라 MABL-1 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 특이적으로 결합하는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 3은 키메라 MABL-2 항체가 인간 IAP를 발현하는 L1210세포(hIAP/L1210)에 특이적으로 결합하는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 4는 본 발명에 따른 단일쇄 Fv의 작성방법을 모식적으로 나타내는 도면이다.

도 5는 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 대장균에서 발현시키기 위해 사용가능한 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 6은 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 포유동물 세포에서 발현시키기 위해 사용하는 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 7은 실시예 5.4에서 얻어진 웨스턴블로트의 결과를 나타내는 도면이다. 좌측으로부터, 분자량 지표(위로부터 97.4, 66, 45, 31, 21.5, 및 14.5kDa를 나타냄), pCH01도입 COS7세포 배양상청, pCH0M2도입세포 배양상청. pCH0M2도입세포 배양상청에 재구성 MABL-2 항체 단일쇄 Fv가 명백하게 함유되어 있는 것을 나타낸다.

도 8은 대조로서의 pCHO1/COS7세포 배양상청의 항체는, 대조로서 의 pCOS1/L1210 세포에는 결합하지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 9는 MABL2-scFv/COS7세포 배양상청의 항체는, 대조로서 pCOS1/L1210세포에 결합하지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 10은 대조로서 pCOS1/COS7세포 배양상청의 항체가 hIAP/L1210 세포에 결합하지 않은 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 11은 MABL2-scFv/COS7세포 배양상청의 항체는 hIAP/L1210세포에 특이적으로 결합하는 것을 표시하는 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 실시예 5.6에서 나타내는 경쟁적 효소면역학적 검정법(Competitive ELISA)의 결과를 나타내는 도이고, 본 발명의 단일쇄Fv(MABL2-scFv)의 항원 결합활성을, 대조로서 pCHO1/COS7세포 배양상청과 비교하여, 마우스 모노크로날 항체 MABL-2의 항원결합에 대한 저해를 지표로서 나타내는 도면이다.

도 13은 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, 대조로서 pCHO1/L1210세포에는, 대조로서 pCHO/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.

도 14는 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, 대조로서의 pCOS1/L1210세포에는, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.

도 15는 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210 세포에는, 대조로서 pCH01/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다.

도 16은 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210 세포에 대해, MABL2-scFv/COS7 세포 배양상청 항체가 특이적으로 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다.

도 17은 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, CCRF-CEM 세포에는, 대조로서 pCHO1/COS7세포 배양상청 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 50%).

도 18은 실시예 5.7의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, CCRF-CEM 세포에 대하여, MABL2-scFv/COS7세포 배양상청 항체가 특이적으로 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최후농도 50%).

도 19는 실시예 5.9의 CHO세포 생산의 MABL-2 항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제과정에 있어서, 블루세파로제(Blue-Sepharose) 컬럼에서 얻은 부분을 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 컬럼을 사용하여 정제할 때의 크로마토그램을 나타내는 도면이고, 주요한 피크로서 부분A, 부분B가 얻어진 것을 나타낸다.

도 20은 실시예 5.9의 (2)에서 얻어진 부분A, 부분B에 관해서 겔 여과에 의해 정제된 결과를 나타내는 도면이고, 부분A에서는 외관상의 분자량 36kD, 부분B에는 76kD의 위치에 주요피크가(각각 A1 및 B1) 용출한것을 나타낸다.

도 21은 실시예 5.9의 CHO세포생산의 MABL-2 항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제과정에서 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석한 도면이고, 모두 분자량 약 35kD에 단일결합만있는 것을 나타낸다.

도 22는 CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제에서 얻어진 부분 AI 및 BI을 겔 여과에 의해 분석한 결과를 나타내는 도면이고, 부분AI는 모노머로 이루어지고, 부분BI은 다이머로 이루어지는 것을 나타낸다.

도 23은 본 발명의 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA를 대장균의 균체내에 발현시키기 위해 사용 가능한 발현 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 24는 실시예 5.12의 대장균 세포 생산의 MABL-2 항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 정제에 있어서, 얻어진 조성물을 겔 여과 컬럼을 사용하여 정제한 결과를 나타내는 도면이고, 각 피크는 각각 대장균 세포 생산의 단일쇄 Fv의 모노머, 다이머를 나타낸다.

도 25는 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210 세포에는, 대조로서 마우스 IgG 항체는 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 26은 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210 세포에 대하여, CHO세포 생산의 MABL2-scFv다이머가 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 27은 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210 세포에 대하여, 대장균 세포 생산의 MABL2-scFv 다이머가 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 28은 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210세포에는, CHO세포 생산의 MABL2-scFv 모노머의 아폽토시스 유발작용이 대조와 동일한 정도인 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 29는 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210세포에는, 대장균 세포 생산의 MABL2-scFv 모노머의 아폽토시스 유발작용이 대조와 동일한 정도인 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 30은 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210세포에는, 대조로서의 마우스 IgG 항체는 항 FLAG 항체의 첨가에 의해서도 아폽토시스를 유발하지 않는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 31은 실시예 5.13의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, hIAP/L1210세포에 대하여, CHO세포 생산의 MABL2-scFv 모노머가 항 FLAG 항체의 첨가에 의해 현저하게 아폽토시스를 유발하는 것을 나타낸다(최종농도 3㎍/ml).

도 32는 인간 골수종 세포주 KPMM2를 이식한 마우스의 혈청 속의 인간IgG량을 정량한 것이며, 마우스에 있어서의 인간골수종에 의해 생산되는 인간 IgG의 양을 측정한 결과를 나타내는 도면이며, scFv/CHO 다이머가 KPMM2세포의 증식을 매우 강하게 억제하고 있는 것을 나타내는 도면이다.

도 33은 종양이식 후의 마우스 생존일수를 나타내고 있고, scFv/CHO 다이머 투여군에 있어서, 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내는 도면이다.

도 34는 MABL-2 항체 유래의 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체[sc(Fv)₂]를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 35는 [H쇄]-[L쇄]로 되도록 V영역을 연결하고, 또한 펩티드 링커를 함유하지 않는 scFv(HL타입)를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 36은 HL타입의 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 링커의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

도 37은 [L쇄]-[H쇄]로 되도록 V영역을 연결하고, 또한 펩티드 링커를 함유하지 않는 scFv(LH타입)를 발현하는 플라스미드의 일예의 구조를 나타내는 도면이다.

도 38은 LH타입의 폴리펩티드의 구조 및 펩티드 링커의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.

도 39는 실시예 6.4에 있어서의 웨스턴블로팅(western blotting)의 결과를 나타내는 도면이고, 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 sc(FV)₂및 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2 항체 scFv가 발현하고 있는 것을 나타낸다.

도 40a 및 40b는 실시예 6.3(1)에서 조제한 COS7세포 배양상청을 사용한 유동세포 분석법의 결과를 나타내는 도면이고, 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL2-scFv 및 sc(FV)₂은 인간 IAP에 대한 높은 친화성을 갖는 것을 나타낸다.

도 41a, 도 41b는 실시예 6.6의 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, scFv < HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7 > 및 sc(FV)₂는 hIAP/L1210세포에 대한 현저한 세포사를 유도하는 것을 나타낸다.

도 42는 실시예 6.10의 항원결합 평가결과를 나타내는 도면이고, scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂이 인간 IAP에 대하여 높은 친화성을 갖는 것을 나타낸다.

도 43은 실시예 6.11의 체외(in vitro)에서 아폽토시스 유발효과의 결과를 나타내는 도면이고, MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 MABL2-sc(FV)₂은 hIAP/L1210, CCRF-CEM의 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포사를 유발하는 것을 나타낸다.

도 44는 인간 골수종 세포주 KPMM2를 이식한 마우스에 있어서의 인간 골수종에 의해 생산되는 혈청 중의 M단백질의 양을 측정한 결과를 나타내는 도면이고, scFv<HL-5> 및 sc(FV)₂가 KPMM2세포의 증식을 매우 강하게 억제하고 있는 것을 나타낸다.

도 45는 종양 이식 후 마우스의 생존일수를 나타내는 도면이고, scFv<HL-5> 투여군에 있어서 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내는 있다.

도 46은 종양 이식 후 마우스의 생존일수를 나타내는 도면이고, sc(Fv)₂투여군에 있어서 생존기간이 현저하게 연장되고 있는 것을 나타내고 있다.

도 47은 15아미노산으로 이루어지는 링커서열을 함유하는 재구성 12B5 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편의 구축방법과 그 구조를 개략적으로 나타낸다.

도 48은 실시예 7.5(1)에서 얻어진 각 12B5 단일쇄 Fv를, 겔 여과에 의해 정제한 결과를 나타내는 도면이고, sc12B5에서는 2개의 피크(부분A, B)로 구분된 결과를 나타낸다.

도 49는 실시예 7.5(2)에 있어서 각 부분A 및 B를 SDS-PAGE에 의해 분석한 결과를 나타낸다.

도 50은 실시예 7.5(2)에 있어서 각 부분A 및 B를 Superdex200칼럼에 의해 분석한 결과를 나타내는 도면이고, (a)부분A에서는 외관상의 분자량 약 44kD에, (b)부분B에서는 22kD의 위치에 주요 피크가 검출된 것을 나타낸다.

도 51은 sc12B5 및 12B5항체(IgG, Fab)의 TOP형태 아고니스크 활성의 측정결과를 나타내는 도면이고, 12B5 IgG 및 일가 단일쇄 Fv(sc12B5)는 농도 의존적으로 TOP형태의 아고니스트 활성을 갖는 것을 나타낸다.

도 52는 sc12B5의 모노머 및 다이머의 TOP형태의 아고니스트 활성의 측정결과는 나타내는 도면이고, 2가의 항원결합부위를 갖는 단일쇄 Fv(sc12B5 다이머)는 1가의 sc12B5 보다 약 400배 이상 강한 아고니스트 활성을 나타내고, 그 강도는 인간 TPO와 동등 또는 그 이상인 것을 나타낸다.

도 53은 얻은 sc12E10 단일쇄 항체를 Superdex 200HR칼럼을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타내는 도면이고, sc12E10에서는 2개의 피크(부분A, B)로 나눠진 결과를 나타낸다.

도 54는 얻은 db12E10 단일쇄 항체를 Superdex 200HR칼럼을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 정제한 결과를 나타내는 도면이고, db12E10에서는 2개의 피크(부분C, D)로 나눠진 결과를 나타낸다.

도 55는 부분A, B(sc12E10) 및 부분C, D(db12E10)를 환원, 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 56은 부분A, B를 Superdex 200HR컬럼을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (1) 부분A에서는 외관상의 분자량 42kD에 (2) 부분B에는 20kD의 위치에 주요피크가 용출된 것을 나타낸다.

도 57은 부분 C, D를 Superdex 200HR칼럼을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (1) 부분C에서는 외관상의 분자량 69kD에 (2) 부분D에서는 41kD의 위치에 주요피크가 용출된 것을 나타낸다.

도 58은 각종 12E10항체분자의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 나타내는 그래프이고, 단일쇄 Fv(sc12E10, db12E10)에서는 TOP형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 대하여, 12E10IgG 및 12E10 Fab에서는 전혀 활성이 인지되지 않은 것을 나타낸다.

도 59는 sc12E10모노머 및 다이머, 및 db12E10 다이머 및 트리머의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 나타내는 그래프이고, sc12E10 다이머, db12E10 다이머 및 트리머의 TOP형태의 아고니스트 활성이 TOP 보다 강력한 것을 나타낸다.

본 발명자의 과제는 TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 저분자화 아고니스트 개변항체를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상, 바람직하게는 각각 2∼6, 더욱 바람직하게는 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 개변항체에 관한 것이다.

본 명세서에 있어서 「개변항체」란, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하고, 이들 각 V영역을 직접적 또는 리간드 등을 통하여 공유결합 및/또는 비공유결합에 의해 결합한 임의의 물질을 의미한다. 구체적으로는, 항체의 각 V영역을 펩티드 링커, 화학가교제 등의 링커로 결합한 폴리펩티드 또는 화합물 등이 열거된다. 또한, 본 발명의 개변항체에 있어서, 항체 유래의 2개 이상의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 각각, 동일 또는 다른 항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄V영역이어도 좋다.

본 발명의 개변항체는, TPO 수용체를 특이적으로 인식하여 상기 수용체를 가교하고, 이로써 세포내에 신호를 전달할 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 좋고, 또는 상기 개변항체의 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변한 개변항체도 포함된다.

본 발명의 개변항체는, 바람직하게는 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체이지만, 또는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 본 발명의 개변항체가 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체인 경우, 동일 쇄상의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 서로 연합하여 1개의 항원결합부위를 형성하지 않는 것이 바람직하다.

특히 바람직하게는, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 또는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드이다. 상기 개변항체 중에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 바람직하게는 링커를 통하여 연결되어 있다.

상기 단일쇄 Fv의 다량체는, 비공유결합에 의한 다량체, 가교기를 통한 공유결합에 의한 다량체, 또한 상기 단일쇄 Fv와 결합할 수 있는 가교제(항체, 항체단편, 또는 2가의 개변항체)를 통한 다량체가 포함된다. 다량체를 형성시킨 가교기는 펩티드의 가교에 사용되고 있는 공지의 가교기를 사용할 수 있지만, 예컨대 시스테인 잔기에 의한 디술피드 가교, 그외 가교기, 예컨대 C₄∼C₁₀알킬렌(예컨대 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌 및 옥타메틸렌 등) 또는 C₄∼C₁₀알케닐렌(cis/trans-3-부테닐렌, cis/trans-2-펜테닐렌, cis/trans-3-펜테닐렌 및 cis/trans-3-헥세닐렌 등)이다.

또한, 단일쇄 Fv와 결합할 수 있는 가교제는, 예컨대 Fv 중에 수의(隨意)로 도입할 수 있는 아미노산 서열, 예컨대 FLAG 서열 등에 대한 항체 또는 그 단편, 또는 그 항체 유래의 개변항체, 예컨대 단일쇄 Fv이다.

본 명세서에 있어서 「TPO 아고니스트 작용」이란, TPO 수용체를 가교함으로써 세포내에 신호가 전달되어 상기 세포에서 생기는 생물학적 작용을 말하며, 구체적으로는 거핵구의 증식, 분화 또는 성장의 자극, 혈소판의 생산 등의 작용을 말한다.

본 발명에 있어서, 아고니스트 작용의 ED50값은, 공지의 TPO 아고니스트 작용의 측정법으로부터 구할 수 있다. 구체적으로는 BaF/mpl이나 UT7/TPO 등의 TPO 반응성 세포주(細胞株)를 사용한 세포증식 분석, MPL 단백질의 인산화 측정, 골수세포로부터의 분화에 의한 거핵구 콜로니 분석, 체내(in vivo)에서의 마우스 혈소판 회복합성 분석, 인간 백혈병 거핵아구 세포주(CMK)를 사용한 혈소판 항원 GPIIbIIIa(항 GPIIbIIIa)발현의 유도, 거핵아구 세포주(DAMI)에 있어서의 배수화의 유도 등에 의해 측정할 수 있고, 그 반응용량 곡선의 최대활성을 100%로 하고, 반응률 50%로 되는 용량을 ED50%값으로 한다.

본 발명의 개변항체는, 상기 개변항체와 동일한 항원결합 영역을 갖는 항체, 즉 상기 개변항체의 항원결합 영역을 형성하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍과 동일한 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍을 갖는 IgG 등의 whole의 항체(이하, 친항체라 함)와 비교하여 동등 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, 친항체와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것이 바람직하다. 또한, TPO 수용체에는 결합하지만, TPO 아고니스트 작용을 실질적으로 가지지 않는 친항체와 동일한 항원결합 영역을 형성하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역의 쌍을 갖는 개변항체로서, 상기 개변항체는 아고니스트 작용을 갖는 것도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 화합물이란, 트롬보포에틴(TPO)과 비교하여 동등 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내고, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 화합물이면 어떤 것이어도 좋고, TPO와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 화합물이 바람직하다.

여기서 말하는「화합물」이란, 본 발명의 개변항체에 한정되지 않고, whole의 항체, F(ab')₂등, 2개 이상, 바람직하게는 2∼6, 더욱 바람직하게는 2∼4, 특히 바람직하게는 2개의 항원결합부위를 갖는 것이라면 어떠한 것도 포함된다.

본 발명의 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는개변항체 또는 화합물은, 친항체와 비교하여, 1/10이하의 세포간 접착작용(ED50값)을 나타내는 것이 바람직하고, 세포간 접착작용을 실질적으로 가지지 않는 것이 특히 바람직하다.

여기서 말하는 세포간 접착작용의 ED50값이란, 공지의 세포간 접착작용의 측정법, 예컨대 TPO 수용체를 발현하는 세포의 응집을 지표로 하여 구할 수 있다.

본 발명은 상기 개변항체를 코드하는 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 상기 개변항체를 생산하는 동물세포 또는 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 상기 개변항체의 TPO 아고니스트로서의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 상기 개변항체를 사용하여 TPO 수용체를 가교함으로써 세포내에 신호 전달을 일으키고, 거핵구의 증식, 분화 유도 또는 성장의 자극, 혈소판의 생산, TPO 수용체 단백질의 인산화 등의 TPO 아고니스트 작용을 발생시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 개변항체를 유효성분으로 함유하는 혈소판 감소증 치료 등의 의약에 관한 것이다.

본 발명은 상기 개변항체의 의약으로서의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체의 스크리닝방법(screening method) 또는 측정방법으로서, 1) TPO 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하는 공정; (2) TPO 수용체를 발현하고 있는 세포와 상기 개변항체를 접촉시키는공정; 및 3) TPO 수용체를 가교함으로써 상기 세포에 발생하는 TPO 아고니스트 작용을 측정하는 공정을 함유하는 스크리닝방법 또는 측정방법에 관한 것이다. 본 발명의 측정방법은 본 발명의 개변항체를 의약품으로서 제조하는 경우의 품질관리에 사용할 수 있다.

본 발명의 개변항체는 단일 특이성(mono-specific) 개변항체이어도, 이중 특이성(bi-specific) 개변항체 등의 다중 특이성(multi-specific) 개변항체이어도 좋지만, 바람직하게는 단일 특이성(mono-specific) 개변항체이다.

본 발명은 또한, 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간항체 유래의 H쇄 V영역 및/또는 인간항체 유래의 L쇄 V영역인 개변항체의 관한 것이다. 인간항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 예컨대 WO99/10494호 공보에 기재된 방법과 같이, 인간 모노크로날 항체의 라이브러리를 선별함으로써 얻을 수 있다. 또한, 유전자 도입 마우스(transgenic mouse) 등으로부터 제작된 인간 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역도 포함된다.

또한 본 발명은, 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간형화 H쇄 V영역 및/또는 인간형화 L쇄 V영역인 개변항체에 관한 것이다. 상세하게는 인간 모노크로날 항체 L쇄 V영역의 프레임워크 영역(FR)과 인간 이외의 포유동물(예컨대, 마우스, 생쥐, 소, 양, 원숭이 등)의 모노크로날 항체의 L쇄 V영역의 상보성 결정영역(complementarity determining region: 이하 CDR이라 함)을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역 및/또는 인간 모노크로날 항체 H쇄 V영역의 FR과 인간 이외의 포유동물(예컨대, 마우스, 생쥐, 소, 양, 원숭이 등)의 모노크로날 항체의 H쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 H쇄 V영역으로부터 구성된다. 이 경우 CDR 및 FR의 아미노산 서열을 일부 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)하여도 좋다.

본 발명은 또한, 개변항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이, 인간 이외의 동물(예컨대, 마우스, 생쥐, 소, 양, 원숭이, 닭 등)의 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역도 포함된다. 이 경우 CDR 및 FR의 아미노산 서열을 일부 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)하여도 좋다.

본 발명은 또한, 상기 여러 가지 개변항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터를 제조하는 유전자 공학적 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 숙주는 예컨대 인간세포, 마우스 세포 등의 동물세포, 또는 대장균, 고초균, 효모 등의 미생물을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 숙주를 배양하여, 배양물로부터 개변항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 개변항체의 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 단일쇄 Fv를 생산하는 숙주동물세포를 무혈청 배지에서 배양하여 이 배지 중에 단일쇄 Fv를 분비시키고, 상기 배지 중에서 형성된 단일쇄 Fv의 다이머를 포함하는 상기 배지 상청을 정제하는 것을 특징으로 하는 단일쇄 Fv의 다이머의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 개변항체의 TPO 아고니스트로서의 사용에 관한 것이다. 즉, 상기 얻어진 개변항체를 유효성분으로 함유하는 신호 전달 아고니스트에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 TPO 아고니스트 개변항체를 유효성분으로 함유하는 의약제제는, 혈소판 감소가 관여하는 혈액 병환, 암이나 백혈병 등의 화학치료 후의 혈소판 감소증 등의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 발명의 개변항체는, 항체에 유래하는 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유한다. 상기 개변항체의 구성으로는, 바람직하게는 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머 또는 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드로 할 수 있다. 상기 개변항체 중에서, H쇄 및 L쇄의 V영역은, 1개 이상의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커를 통하여 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이들 개변항체는 모노크로날 항체의 가변영역을 함유하며, 원래의 모노크로날 항체와 동일한 특이성으로 항원에 결합한다.

H쇄 V영역

본 발명에 있어서, 항체에 유래하는 H쇄 V영역에는, TPO 수용체를 인식하고, 또한 상기 분자를 가교하여 올리고머화, 예컨대 2량체화함으로써, 세포내에 신호를 전달할 수 있는 항체의 H쇄 V영역으로서, 포유동물(인간, 마우스, 생쥐, 소, 양, 원숭이 등)에 유래하는 H쇄 V영역 또는 상기 H쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 개변한 H쇄 V영역도 본 발명에 있어서의 H쇄 V영역에 함유되지만, 인간 모노크로날 항체 H쇄 V영역의 FR과 마우스 모노크로날 항체의 H쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 H쇄 V영역이 바람직하다. 또한, 재조합 기술을 사용하여 작성할 수 있는 인간유래의 아미노산 서열을 갖는 H쇄 V영역도 바람직하다. 또한 본 발명의 H쇄 V영역에는, 상기 H쇄 V영역의 단편으로서, 항원결합성을 유지하는 영역도 포함된다.

L쇄 V영역

본 발명에 있어서의 L쇄 V영역에는, TPO 수용체를 인식하고, 또한 상기 분자를 가교하여 올리고머화, 예컨대 2량체화함으로써, 세포내에 신호를 전달할 수 있는 항체의 L쇄 V영역으로서, 포유동물(예컨대, 인간, 마우스, 생쥐, 소, 양, 원숭이 등)에 유래하는 L쇄 V영역 또는 상기 L쇄 V영역의 아미노산 서열을 일부 개변한 L쇄 V영역도 본 발명에 있어서의 L쇄 V영역에 포함되지만, 인가 모노크로날 항체 L쇄 V영역의 FR과 마우스 모노크로날 항체의 L쇄 V영역의 CDR을 함유하는 인간형화 L쇄 V영역이 바람직하다. 또한, 재조합 기술을 사용하여 작성할 수 있는 인간 유래의 아미노산 서열을 갖는 L쇄 V영역도 바람직하다. 또한, 본 발명의 L쇄 V영역에는 상기 L쇄 V영역의 단편으로서, 항원 결합성을 유지하는 영역도 포함된다.

상보성 결정영역(CDR)

L쇄 및 H쇄의 각 V영역은 항원결합부위를 형성하고, L쇄 및 H쇄 상의 가변영역은 공통성이 있는 비교적 보존된 4개의 프레임워크와 3개의 초가변 또는 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다(Kabat, E.A. et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, US Dept. Health and Human Services,1983).

상기 4개의 프레임워크 영역(FR)의 다수의 부분은 β-시트 구조를 형성하고, 그 결과 3개의 CDR은 루프를 형성하고, CDR은 경우에 따라서 β-시트 구조의 일부분을 형성하는 것도 있다. 3개의 CDR은 FR에 의해 서로 입체적으로 대단히 가까운 위치에 유지되고, 그래서 쌍을 이루는 영역의 3개의 CDR과 함께 항원결합부위의 형성에 기여한다.

이들의 CDR 영역은 얻어진 항체의 V영역의 아미노산 서열과 공지의 항체 V영역의 공지의 아미노산 서열을 조합함으로써, Kabat, E.A. et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」의 경험법칙으로부터 알 수 있다.

단일쇄 Fv

단일쇄 Fv는 항체에 유래하는, 연결된 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 폴리펩티드 모노머이고, 얻어진 단일쇄 Fv는 원래의 항체의 가변영역을 함유하고, 상보성 결정영역을 보존하기 위해, 원래의 항체와 동일한 특이성으로 항원에 결합한다(일본특허공개 평11-63557호). 또한, 본 발명의 단일쇄 Fv에 있어서, 상기 가변영역 및/또는 CDR의 일부 또는 그 아미노산 서열의 일부를 개변(예컨대, 결실, 치환 또는 부가)할 수 있다. 본 발명의 단일쇄 Fv를 구성하는 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 상술한 것이고, H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 직접 또는 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통하여 연결할 수 있고, 그 구성으로서는 [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역], [L쇄 V영역]-[H쇄 V영역] 중 어느 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서는, 이들 단일쇄 Fv는 다이머, 트리머 또는 테트라머를 형성시켜, 본 발명의 개변항체로 할 수 있다.

단일쇄 개변항체

본 발명의 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역, 바람직하게는 각각 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 단일쇄 개변항체는, 상술한 바와 같은 2개 이상의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 각각 함유한다. 이 폴리펩티드에 있어서 각 영역은 상기 단일쇄 개변항체가 특정의 입체구조, 구체적으로는 단일쇄 Fv의 다이머가 구성하는 입체구조를 모방할 수 있도록 배치시킬 필요가 있고, 예컨대,

[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]

또는

[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]-[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역]

의 순서로 각 영역이 배치되고, 이들의 영역은 링커를 통하여 연결된다.

링커

본 발명에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 연결하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성화합물 링커, 예컨대 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 사용할 수 있다. 이들의 링커는 동일 분자내에서 동일 또는 다르게 있어도 좋다. 펩티드 링커를 소망하는 경우, 각각의 링커의 예로서는:

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n

[n은 1 이상의 정수이다]를 들 수 있다. 바람직한 링커 펩티드의 길이는 항원으로 되는 수용체에 따라 다르지만, 단일쇄 Fv에서는 통상 1∼20 아미노인 것이 바람직하다. 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 개변항체에 있어서는, [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역](또는 [L쇄 V영역]-[H쇄 V영역])으로 이루어지는 동일한 항원결합부위를 형성하는 것끼리를 연결하기 위한 펩티드 링커의 길이는 1∼30아미노산, 바람직하게는 1∼20아미노산, 더욱 바람직하게는 3∼18아미노산이다. 또한, [H쇄 V영역]-[L쇄 V영역](또는[L쇄 V영역]-[H쇄 V영역])으로 이루어지는 동일한 항원결합부위를 형성하지 않는 것끼리를 연결하기 위한 펩티드 링커의 길이는 1∼40아미노산, 바람직하게는 3∼30아미노산, 더욱 바람직하게는 5∼20아미노산이다. 이들의 링커를 도입하는 방법은 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA의 구축방법의 설명에서 서술한다.

본 발명에 있어서, 화학합성물 링커(화학가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예컨대 N-히드록시 숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜 슈베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)슈베레이트(BS³), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS), 에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜 숙시네이트)(sulfo-EGS), 디숙신이미딜 주석산염(DST), 디술포숙신이미딜 주석산염(sulfo-DST), 비스[2-(숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(BSOCOES), 비스[2-(술포숙신이미도 옥시카르보닐옥시)에틸]술폰(술포-BSOCOES) 등이 있고, 이들의 가교제는 시판되고 있다. 또한, 화학합성물 링커의 길이는, 상술한 펩티드 링커의 길이에 상당하는 길이인 것이 바람직하다.

특히, 단일쇄 Fv의 다이머를 형성시키는 경우, 숙주세포에서 생산된 단일쇄 모노머를 배지 등의 용액 중에서, 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 다이머화하는데 적당한 링커를 선택하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 2∼12아미노산, 보다 바람직하게는 3∼10아미노산, 또는 이것에 상당하는 다른 링커가 바람직하다.

개변항체의 구조

개변항체는, TPO 수용체에 특이적으로 결합하는 공지의 또는 새로운 항체 유래의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 상술한 링커를 통하여 연결함으로써 얻어진다. 단일쇄 Fv의 예로서, WO99/10494에 기재되는 12B5항체, 12E10항체에 유래하는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 갖는 것이 예시된다. 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드의 예로서는, 상기 모노크로날 항체 유래의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 갖는 sc12B5(링커:15아미노산), sc12E10(링커:15아미노산), db12B5다이머(링커:5아미노산), db12E10다이머(링커:5아미노산)이 예시된다.

본 발명의 개변항체를 제작하기 위해서는, 상기 폴리펩티드가 분비성인 것을 소망하는 경우는, 그 N말단에 신호 펩티드를 부가할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드의 효율적 정제 등을 위해 폴리펩티드 정제에서 유용한 공지의 서열, 예컨대 FLAG서열 등을 삽입할 수 있다. 이 경우, 항FLAG 항체를 사용하여 다이머 형성시킬 수도 있다.

본 발명의 개변을 제작하는 위해서는, 이것을 코드하는 DNA, 즉, 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA 또는 재구성 단일쇄 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 필요가 있다. 이들의 DNA는 예컨대 sc12B5, db12B5, sc12E10 및/또는 db12E10의 경우에는 상기 Fv유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 사용하여, 또는 이들의 DNA를 주형으로 하여, 그 서열 내의 소망하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA부분을, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 폴리메라아제 연쇄반응(PCR)법에 의해 증폭함으로써 얻을 수 있다.

각 V영역에 대하서, 아미노산 서열의 일부 개변을 소망하는 경우에는, PCR법을 사용하는 공지의 방법에 의하여 1 또는 여러개의 아미노산이 개변된, 즉 1 또는 여러개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 V영역을 얻을 수 있다. 특정 항원에 대하여 충분하게 활성이 있는 개변항체를 제작하기 위해, PCR법을 사용하는 공지의 방법에 의하여 상기 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것이 바람직하다.

PCR에 사용하는 프라이머를 결정하거나, 모노크로날 항체로부터 출발하는 경우는, 상기 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 상기 상체 유래의 H쇄 및 L쇄의타이핑을 하여 양쇄의 형을 결정한다.

다음으로, PCR법을 사용하여 12B5항체 및 12E10항체의 L쇄 V영역을 증폭하기 위해, 5'말단 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 3'말단 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상술한 바와 같이 결정한다. 동일하게, 12B5항체 및 12E10항체의 H쇄 V영역 및 MABL-2항체의 H쇄 V영역의 증폭을 위해, 각각 5'말단 프라이머 및 3'말단 프라이머를 결정한다.

그 예로서, 본 발명에 있어서는 5'말단 프라이머는 그 5'말단 근방에 제한 효소 HinfI 절단부위를 제공하는 서열 GANTC를 함유하고, 그리고, 3'말단 프라이머는 그 5'말단 근방에 XmaI 절단부위를 제공하는 뉴클레오티드 서열 CCCGGG를 함유하는 것을 사용한다. 이들의 제한 효소 절단부위는 가변영역을 코드할 목적의 DNA단편을 클로닝 벡터에 서브클로닝하기 위해 사용되는 한, 그외 제한 효소 절단부위이어도 좋다.

특히, 설계된 PCR프라이머를 사용하여, 12B5항체, 12E10항체의 각 V영역을 코드하는 cDNA를 그들의 5'- 및 3'말단에 있어서 적당한 염기서열을 도입하여, 그들이 발현벡터로 용이하게 삽입되도록, 또한 그들이 상기 발현벡터 중에서 적절하게 기능하도록 하였다(예컨대, 본 발명에서는 Kozak 서열의 도입에 의해 전사효율을 높이도록 공부되고 있다). 다음으로, 이들의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하여 얻은 12B5항체, 12E10항체의 각 V영역을, 소망하는 인간 C영역을 이전에 함유하는 HEF발현벡터(WO92-19759 참조)에 삽입한다. 클론화된 DNA의 서열결정은 임위의 통상의 방법, 예컨대 자동 DNA분석기(Applied Biosystems사 제작)를 사용하여 행할 수 있다.

본 발명의 개변항체에 있어서, 링커, 예컨대 펩티드 링커는 다음과 같이 도입할 수 있다. 즉, 상술한 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 위한 프라이머와 일부 상보적인 서열을 가지며, 또한 상기 링커의 N말단 또는 C말단을 코드하도록 프라이머를 설계하고, 이것을 이용하여, PCR을 행함으로써 소망하는 아미노산 서열 및 길이를 갖는 펩티드 링커를 코드하는 DNA를 작성할 수 있다. 그리고, 상기 DNA를 통하여 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 연결하면, 소망하는 펩티드 링커를 갖는 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 1개의 개변항체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있으면, 상기 DNA를 주형으로 하고, 그리고 여러 가지의 링커용의 프라이머를 설계하고, 이것을 사용하여 PCR을 실시하면, 소망하는 펩티드 링커를 갖는 개변항체 또는 링커를 갖지 않는 개변항체를 코드하는 DNA를 용이하게 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 개변항체의 각쇄 V영역은, 종래의 기술(예컨대, Sato,K.et al.,Cancer Res., 53, 1-6(1993)을 참조할 것)을 사용함으로써, 인간형화하는 것이 가능하고, 또한 일단 인간형화된 각쇄 V영역을 코드하는 DNA가 제작되면, 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 단일쇄 Fv 단편, 인간형화 모노크로날 항체 또는 인간형화 모노크로날 항체 단편은, 통상의 방법에 따라 용이하게 작출하는 일이 가능하다. 또한, 필요한 경우, 이들 V영역의 아미노산 서열의 일부를 개변하는 것도 가능하다.

또한, 유전자 공학에 있어서의 실용 기술을 사용하여 상술한 마우스 유래의H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 코드하는 DNA와 동일하게, 이들에 상당하는 다른 포유동물 유래의 DNA, 예컨대, 인간항체 유래의 각쇄 V영역을 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 얻어진 DNA를 사용하여, 다른 포유동물, 특히 인간항체 유래의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역, 인간 유래의 단일쇄 Fv 및 그 단편, 및 인간 유래의 모노크로날 항체 및 그 단편을 얻을 수 있다.

본 발명의 개변항체가, 이종 특이성(bi-specific) 개변항체인 경우, 공지의 방법(예컨대, WO9413804호 공보에 기재된 방법)에 의해 제작할 수 있다.

이상과 같이, 목적으로 하는 개변항체의 각쇄 V영역, 인간형화 개변항체의 각쇄 V영역을 코드하는 DNA가 제작되면, 그것을 함유하는 발현벡터 및 상기 발현벡터에 의해, 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라서 숙주를 배양하고, 생산된 재구성 단일쇄 Fv, 재구성 인간형화 단일쇄 Fv, 인간형화 모노크로날 항체 및 인간형화 모노크로날 항체 단편은, 세포내 또는 세포외로부터 분리하여 균일할 때까지 제조할 수 있다. 이 경우, 통상의 단백질에서 사용되는 분리·정제방법, 예컨대 각종 크로마토그래피, 한외여과, 염석, 투석 등을 적의선택하여 조합시켜, 본 발명의 개변항체를 분리·정제할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

재구성 단일쇄 Fv를 동물세포 예컨대 COS7 세포, CHO세포 등의 동물배양 세포, 바람직하게는 CHO세포에서 생산하는 경우, 무혈청 배지에서 상기 재구성 단일쇄 Fv를 생산시키면, 배지 중에서 형성한 상기 단일쇄 Fv의 다이머를 안정적으로 고수율로 회수·정제할 수 있다. 또한, 이와 같이 하여 정제된 상기 다이머는 장시간, 안정하게 다이머의 상태로 보존할 수 있다. 이 경우에 사용할 수 있는 무혈청 배지는, 통상 재조합 단백질의 생산에 사용되고 있는 배지이면 어느 것이어도 좋고, 특히 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 개변항체의 제조를 위해 임의의 발현계, 예컨대 진핵세포, 예컨대 동물세포, 예컨대 수립된 포유류 세포계, 사상균세포 및 효모세포, 및 원핵세포, 예컨대 세균세포, 예컨대 대장균 세포 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 개변항체는 포유류 세포, 예컨대 COS7세포 또는 CHO세포 중에서 발현된다.

이들의 경우, 포유류 세포에서의 발현을 위해 유용한 통상의 프로모터를 사용할 수 있다. 예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus: HCMW)전기(immediate early) 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. HCMV프로모터를 함유하는 발현벡터의 예에는, HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK 등으로서, PSV2neo에 유래하는 플라스미드 벡터(국제공개공보WO92/19759 참조)가 포함된다.

또한, 그외에 본 발명을 위해 사용할 수 있는 포유동물 세포에 있어서의 유전자 발현의 프로모터로서는 레트로 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터나 인간 폴리펩티드 체인 연신률 인자-1α(HEF-1α)등의 포유동물 세포 유래의 프로모터를 사용하면 좋다. 예컨대, SV40의 프로모터를 사용하는 경우는 Mulligan, R. C. et al.의 방법(Nature, 277, 108-114, (1979)), 또는 HEF-1α프로모터를 사용하는 경우에는 Mizushima, S. et al.의 방법(Nucleic Acids Research, 18, 5322, (1990))에 따르면, 용이하게 실시할 수 있다.

복제기원(ori)으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(BPA) 등의 유래의 ori를 사용할 수 있고, 또한 발현벡터는 선택지표로서, 포스포트랜스페라아제 APH(3')II 또는 I(neo)유전자, 티미딘 키나아제(TK)유전자, 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt)유전자, 디히드로폴산 환원효소(DHFR)유전자를 함유할 수 있다.

상술한 바와 같이 작성한 개변항체의 항원결합 활성은, 방사면역측정법 (RIA), 효소표식 고상면역측정법(ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 또한, 원래의 모노크로날 항체의 결합저해능을 지표로 하여, 구체적으로는 상기 모노크로날 항체의 그 항원으로의 농도 위존적 저해작용의 유무를 지표로 하여 평가할 수 있다.

상세하게는, 본 발명의 개변항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 포유동물, 예컨대 COS7세포 또는 CHO세포를 배양하고, 상기 배양항 세포 및/또는 그 배양상청, 또는 이들로부터 정제한 개변항체를 사용하여 항원으로의 결합을 측정한다. 대조로서 발현벡터만으로 형질전환한 세포의 배양상청 등을 사용한다. 항원, 예컨대 12B5항체, 12E10항체의 경우에는 인간 MPL을 강제 발현시킨 Ba/F3세포에, 본 발명의 개변항체 등의 시험시료 또는 대조의 배양상청을 부가하고, 예컨대 유동세포 분석법(flow cytometry)을 실시하여 항원결합 활성을 평가한다.

체외(in vitro)에서의 신호전달 유기작용(거핵구의 증식, 분화 유도 또는 성장의 자극, 혈소판의 생산, TPO 수용체 단백질의 인산화 등)은, 항원을 발현하는세포 또는 상기 항원 유전자를 도입한 세포에, 상술한 개변항체의 시험시료를 첨가하고, 상기 세포에 있어서 신호전달에 따른 변화(예컨대, 인간 MPL항원 특이적인 증식, 단백질의 인산화의 측정, 또는 혈소판 특이적인 항원의 발현 등)를 공지의 측정방법으로 평가할 수 있다.

체내(in vivo)에서의 평가시험은 예컨대 마우스에게 MPL을 인식하는 모노크로날 항체, 본 발명의 개변항체, 대조로서 PBS 등을 투여한다. 그리고, 마우스 혈청 중의 혈소판량의 변화로 활성의 세기를 평가한다.

상술한 바와 같이, TPO 수용체에 특이적으로 결합하는 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하고, 예컨대 상기 체외(In vitro) 또는 체내(In vivo)에서의 평가시험에 의해 본 발명의 개변항체를 스크리닝함으로써 본 발명의 개변항체를 취득할 수 있다.

본 발명의 개변항체는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역, 바람직하게는 각각 2∼4, 특히 바람직하게는 각각 2개 함유하는 것이며, 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다이머, 또는 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상 L쇄 V영역을 연결한 단일쇄 폴리펩티드이다. 이와 같은 구성을 갖는 것으로, 원래의 모노크로날 항체의 항원결합부위의 입체구조를 모방하여, 우수한 항원결합성을 유지하는 것이라 생각된다.

본 발명의 개변항체는 친항체분자(예컨대 IgG)와 비교하여 현저한 저분자화가 달성되기 때문에, 조직, 종양으로의 이행성에 우수하고, 또한 친항체분자 보다 높은 활성을 갖는다. 이 때문에, 본 발명의 개변항체의 사용함으로써, TPO 신호를세포내에 효율적으로 전달할 수 있다. 따라서, 이것을 함유하는 의약제제는 혈소판 감소가 관여하는 혈액증환, 암이나 백혈병 등의 화학치료후의 혈소판 감소증 등의 치료약으로서의 이용이 기대된다. 또한, RI표식에 의한 조영제로서의 이용도 기대되며, RI화합물이나 독소 등의 다른 화합물과 결합시킴으로써, 효력을 증강시키는 것도 가능하다.

다음으로, 본 발명을 하기 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 이것에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 개변항체의 제조방법을, 하기 단일쇄 Fv의 제작을 예로 하여 설명한다. 본 발명의 개변항체의 제조방법에 있어서 사용되는 인간 IAP에 대한 마우스MABL-1, MABL-2항체를 생산하는 하이브리도마, MABL-1 및 MABL-2는 공적 미생물 기탁기관인 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1방 3고)에 1997년 9월 11일 수탁번호 각각 FERM BP-6100, FERM BP-6101로서 국제기탁되어 있다

실시예 1(인간IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체의 V영역을 코드하는 DNA의 클론화)

인간IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체 MABL-1 및 MABL-2의 가변영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 하여 클론화하였다.

1.1 메신저RNA(mRNA)의 조제

하이브리도마 MABL-1 및 MABL-2로부터의 mRNA를, mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech사 제작)를 사용하여 조제하였다.

1.2 이중쇄 cDNA의 합성

약 1㎍의 mRNA에서 Marathon cDNA Amplification Kit(CLONTECH사 제작)를 사용하여 이중쇄 cDNA를 합성하고 어댑터(adapter)를 연결하였다.

1.3 항체 가변영역을 코드하는 유전자의 PCR법에 의한 증폭

Thermal Cycler(PERKIN ELMER사 제작)를 사용하여 PCR법을 행하였다.

(1) MABL-1 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 증폭

PCR법에 사용하는 프라이머는 어댑터의 부분서열과 혼성화하는 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머-1(CLONTECH사 제작) 및 마우스 카파형 L쇄 C영역 서열과 혼성화하는 서열번호: 2에 나타내는 MKC(Mouse Kappa Constant) 프라이머(Bio/Technology, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.

PCR용액 50㎕는 5㎕의 10 ×PCR Buffer II, 2mM MgCl₂, 0.16mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 0.2μM의 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머와 0.2μM의 서열번호: 2로 나타내는 MKC 프라이머 및 MABL-1 유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍을 함유하고, 94℃에서의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 10분간 더 가열하였다.

(2) MABL-1 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭

PCR을 위한 프라이머로서 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열번호: 3에 나타낸 MHC-γ1(Mouse Heavy Constant) 프라이머 (Bio/Technologγ, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.

cDNA의 증폭은 0.2μM의 MKC 프라이머 대신에 0.2μM의 NHC-γ1프라이머를 사용하여 증폭시킨 점을 제외하고, 상기 실시예 1.3(1)에서 L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재한 것과 동일한 방법에 의해 행하였다.

(3) MABL-2 L쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭

PCR을 위한 프라이머로서 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열번호: 2에 나타낸 MKC프라이머를 사용하였다.

cDNA의 증폭은 MABL-1 유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍ 대신에 MABL-2 유래의 이중쇄 cDNA 0.1㎍을 사용하여 증폭시킨 점을 제외하고, 상기 실시예 1.3(1)에서 MABL-1의 L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재한 것과 동일한 방법에 의해 행하였다.

(4) MABL-2 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭

PCR을 위한 프라이머로서 서열번호: 1에 나타내는 어댑터 프라이머-1 및 서열번호: 4에 나타내는 MHC-γ2a프라이머 (Bio/Technologγ, 9, 88-89, 1991)를 사용하였다.

cDNA의 증폭은 0.2μM의 MKC 프라이머 대신에 0.2μM의 MHC-γ2a프라이머를 사용하여 증폭한 점을 제외하고, 상기 1.3(3)에서, L쇄 V영역 유전자의 증폭에 관해서 기재한 것과 동일한 방법에 의해 행하였다.

1.4 PCR생성물의 정제

상기와 같이 하여 PCR법에 의해 증폭한 DNA 단편을 QIAquick PCR. Purification Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 정제하고, 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해시켰다.

1.5 연결 및 형질전환

상기와 같이 하여 조제한 MABL-1유래 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하여 이루어지는 DNA단편 약 140ng을 pGEM-T Easy 벡터(Promega사 제작)50ng과, 30mM Tris-HCl(pH7.8), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오스레이톨, 1mM ATP 및 3유닛 T4 DNA 리가제(Promega사 제작)를 함유하는 반응혼합액 중에서 15℃에서 3시간 반응시켜 연결하였다.

다음으로, 1㎕의 상기 연결혼합액을 대장균 DH5α의 콤피덴트 세포(TOYOBO Inc 제작)의 50㎕에 첨가하고, 그리고 이 세포를 빙상에서 30분간, 42℃에서 1분간 그리고 다시 빙상에서 2분간 정치(靜置)하였다. 계속해서 100㎕의 SOC 배지(GIBCO BRL사 제작)를 가하고, 100㎍/ml의 앰피실린(SIGMA사 제품)을 함유하는 LB(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)한천배지 위에 이 대장균을 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하여 대장균의 형질전환체를 얻었다.

이 형질전환체를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB배지 3ml 중에서 37℃에서 하룻밤 배양시키고, 그리고 이 배양물로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 플라스미드 DNA를 조제하였다.

이렇게 하여 얻어진, 하이브리도마 MABL-1에 유래하는 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pGEM-M1L로 명명하였다.

상기와 동일한 방법에 따라서, 하이브리도마 MABL-1에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA 단편으로부터 제작하고, pGEM-M1H로 명명하였다.

또한, 하이브리도마 MABL-2에 유래하는 마우스 카파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2L로 명명하였다.

또한, 하이브리도마 MABL-2에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 정제 DNA단편으로부터 제작하고, pGEM-M2H로 명명하였다.

실시예 2(DNA 염기서열의 결정)

상기 플라스미드 중의 cDNA코드 영역의 염기서열의 결정은, 자동 DNA 분석기(Applied Biosystem사 제작) 및 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystem사 제작)를 사용하여, 제조업자의 지정의 프로토콜에 따라서 행하였다.

플라스미드 pGEM-M1L에 함유되는 마우스 MABL-1항체의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호: 5에 나타낸다.

또한, 플라스미드 pGEM-M1H에 함유되는 마우스 MABL-1항체의 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호: 6에 나타낸다.

또한, 플라스미드 pGEM-M2L에 함유되는 마우스 MABL-2항체의 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호: 7에 나타낸다.

또한, 플라스미드 pGEM-M2H에 함유되는 마우스 MABL-2항체의 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호: 8에 나타낸다.

실시예 3(CDR의 결정)

L쇄 및 H쇄의 V영역의 전반적 구조는 서로 유사점을 가지고 있으며, 각각 4개의 프레임워크 부분이 3개의 초가변영역, 즉 상보성 결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. 프레임워크의 아미노산 서열은 비교적 잘 보존되어 있지만, 한편 CDR 영역의 아미노산 서열의 변이성은 매우 높다(Kabat, E.A.,et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services,1983).

이와 같은 사실에 기초하여, 인간 IAP에 대한 마우스 모노크로날 항체의 가변영역의 아미노산 서열을 Kabat et al.에 의해 제작된 항체의 아미노산 서열의 데이타베이스에 적용시키고, 상동성을 조사함으로써 CDR의 영역을 표 1에 나타낸 바와 같이 결정하였다.

플라스미드	서열번호	CDR(1)	CDR(2)	CDR(3)
pGEM-M1L	5	43-58	74-80	113-121
pGEM-M1H	6	50-54	69-85	118-125
pGEM-M2L	7	43-58	74-80	113-121
pGEM-M2H	8	50-54	69-85	118-125

실시예 4(클론화 cDNA의 발현의 확인(키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체의 제작))

4.1 키메라 MABL-1항체 발현벡터의 제작

키메라 MABL-1항체를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 각각 마우스 MABL-1 L쇄 및 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA클론 pGEM-M1L 및 pGEM-M1H를 PCR법에 의해 수식하였다. 그리고 HEF 발현벡터(국제공개공보 WO92/19759 참조)에 도입하였다.

L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MLS(서열번호: 9) 및 H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 MHS(서열번호: 10)는, 각각의 V영역의 리더 서열의 최초를 코드하는 DNA에 혼성화하고 또한 Kozak 일치서열(consensus sequence)(J.Mol.Biol.,196, 947-950, 1987) 및 Hind III 제한 효소부위를 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MLAS(서열번호: 11) 및 H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 MHAS(서열번호: 12)는, J영역의 말단을 코드하는 DNA서열에 혼성화하고 또한 스플라이스도너(splice donor) 서열 및 BamHI 제한 효소부위를 갖도록 설계하였다.

PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl₂, 0.16mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold, 0.4μM씩의 각 프라이머 및 8ng의 주형 DNA(pGEM-M1L 또는 pGEM-M1H)를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 10분간 더 가열하였다.

PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 정제하고, HindIII 및 BamHI로 소화하고, 그리고 L쇄 V영역에 관해서는 HEF 발현벡터 HEF-k에, H쇄 V영역에 대해서는 HEF발현벡터 HEF-γ에 각각 클로닝하였다. DNA 서열결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M1L, HEF-M1H로 명명하였다.

4.2 키메라 MABL-2항체 발현벡터의 제작

cDNA의 수식 및 클로닝은 pGEM-M1L 및 pGEM-M1H 대신에 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H를 주형 DNA로 증폭시킨 점을 제외하고 상기 실시예 4.1에서 기재한 것과 동일한 방법에 의해 증폭 및 클로닝을 행하고, DNA 서열결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-M2L, HEF-M2H로 명명하였다.

4.3 COS7세포로의 유전자 도입

키메라 MABL-1항체 및 MABL-2항체의 일과성 발현을 관찰하기 위해, 상기 발현벡터를 COS7세포에서 실험하였다.

(1) 키메라 MABL-1항체의 유전자 도입

HEF-M1L과 HEF-M1H벡터를 Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포로 동시 형질전환시켰다. 각 DNA(10㎍)와 PBS 중 1×10⁷세포/ml의 0.8ml를 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다.

실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로코포레이션 처리된 세포를 10%의 γ-글루블린 프리 소의 태아혈청을 함유하는 DMEM배양액(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하였다. 72시간 배양후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하여 회수 배양상청을 얻었다.

(2) 키메라 MABL-2항체의 유전자 도입

키메라MABL-2항체 유전자의 도입은 HEF-M1L과 HEF-M1H벡터 대신에 HEF-M2L과 HEF-M2H벡터를 사용한 점을 제외하고, 상기 실시예 4.3(1)에 기재한 것과 동일한 방법에 의해 COS7세포에 동시 형질전환하여 회수 배양상청을 얻었다.

4.4 유동세포 분석법(Flow Cytometry)

항원으로의 결합을 측정하기 위해 상기 COS7세포 배양상청을 사용하여 유동세포 분석법을 행하였다. 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포 4×10⁵개에 키메라 MABL-1항체를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 키메라 MABL-2항체를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 대조로서 인간 IgG1항체(SIGMA사 제작)를 가하고, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, FITC 표식 항인간 IgG항체(Cappel사 제작)를 첨가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.

그 결과, 키메라 MABL-1항체 및 키메라 MABL-2항체는 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합함으로써, 이들 키메라 항체가 마우스 모노크로날 항체 MABL-1 및 MABL-2 각각의 V영역의 올바른 구조를 갖는 것이 명백하게 되었다(도 1~도 3).

실시예 5(재구성 MABL-1항체 및 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(scFv)영역의 제작)

5.1 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 제작

재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 다음과 같이 제작하였다. 재구성 MABL-1항체 H쇄 V영역, 링커영역 및 재구성 MABL-1항체 L쇄 V영역을 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 재구성 MABL-1항체 단일쇄Fv를 제작하였다. 이 방법을 도 4에 모식적으로 나타낸다. 재구성 MABL-1항체 단일쇄Fv의 제작을 위해 6개의 PCR 프라이머(A-E)를 사용하였다. 프라이머 A, C 및 E는 센스서열(sense sequence)을 가지며, 프라이머 B, D 및 F는 안티센스서열(antisense sequence)을 갖는다.

H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VHS(프라이머 A, 서열번호: 13)는 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 NcoI제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VHAS(프라이머 B, 서열번호: 14)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 상기 링커와 오버랩되도록설계하였다.

링커를 위한 전방 프라이머 LS(프라이머 C, 서열번호: 15)는, 링커의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA와 오버랩되도록 설계하였다. 링커를 위한 후방 프라이머 LAS(프라이머 D, 서열번호: 16)는, 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA와 오버랩되도록 설계하였다.

L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 VLS(프라이머 E, 서열번호: 17)는 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 오버랩되도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 VLAS-FLAG(프라이머 F, 서열번호: 18)는 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG펩티드를 코드하는 서열(Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), 2개의 전사정지 코돈 및 EcoRI제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다.

제1PCR단계에 있어서 3개의 반응 A-B, C-D 및 E-F를 행하고, 그리고 각 PCR생성물을 정제하였다. 제1PCR로부터 얻어진 3개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 조합시켰다. 다음으로 프라이머 A 및 F를 첨가하고, 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제2PCR법). 또한, 제1PCR에 있어서, 재구성 MABL-1항체 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M1H(실시예 2 참조), Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호: 19)로 이루어지는 링커 영역을 코드하는 DNA 서열(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988)을 함유하여 이루어지는 플라스미드pSC-DP1, 및 재구성 MABL-1항체 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M1L(실시예 2 참조)을 각각 주형(鑄型)으로 사용하였다.

제1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl₂, 0.16mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 0.4μM씩의 각 프라이머 및 5ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 65℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 더 가열하였다.

PCR생성물 A-B(371bp), C-D(63bp) 및 E-F(384bp)를 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 정제하여 제2PCR로 조합하였다. 제2PCR에 있어서, 주형으로서 120ng의 제1PCR 생성물 A-B, 20ng의 PCR 생성물 C-D 및 120ng의 PCR 생성물 E-F, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl₂, 0.16mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)를 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을 94℃의 초기온도에서 8분간 그리고 다음에 94℃에서 2분간, 65℃에서 2분간, 및 72℃에서 2분간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도사이클을 2회 반복한 후, 각각 0.4μM의 프라이머 A 및 F를 첨가하였다. 그리고 94℃의 초기온도에서 1분간 그리고 다음에 94℃에서 1분간, 65℃에서 1분간, 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하여 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 가열하였다.

제2PCR에 의해 발생한 843bp의 DNA 단편을 정제하고, NcoI 및 EcoRI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7 벡터에 클로닝하였다. 또한, 본 발명의 벡터 pSCFVT7은 대장균 페리플라즘 분비 발현계에 적당한 pelB 신호 서열(Lei,S.P.,et al.,J. Bacteriology, 169, 4379-4383, 1987)을 함유하고 있다. DNA 서열결정 후, 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pscM1이라 명명하였다(도 5 참조). 본 플라스미드 pscM1에 함유되는 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 20에 나타낸다.

다음으로, 포유동물 세포로 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, pscM1벡터를 PCR법에 의해 수식하였다. 그래서 얻어진 DNA단편을 pCH01 발현벡터에 도입되었다. 또한, 본 발명 벡터 pCH01은, DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759 참조)로부터 EcoRI 및 SmaI소화에 의해 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamHI어댑터를 연결함으로써 구축한 벡터이다.

PCR에 사용하는 프라이머는, 전방 프라이머로서 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되고 또한 SalI 제한 효소인식부위를 갖는 서열번호: 21에 나타낸 Sal-VHS프라이머 및 후방 프라이머로서 제1프레임워크 서열의 최후를 코드하는 DAN에 혼성하는 서열번호: 22에 나타낸 FRH1 anti 프라이머를 사용하였다.

PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer II, 2mM MgCl₂, 0.16mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold, 0.4μM씩의 각 프라이머 및 8ng의 주형 DNA(pscM1)를 함유하고, 95℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 95℃에서 1분간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 1분 20초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 7분간 더 가열하였다.

PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 정제하고, SalI 및 MboII로 소화하고, N말단측 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편을 얻었다. 또한, pscM1 벡터를 MboII 및 EcoRI로 소화하고, C말단측 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv를 코드하는 DNA단편을 얻었다. 그리고, Sal1-MboII DNA단편 및 MboII-EcoRI DNA단편을 pCH01-Igs벡터에 클로닝하였다. DNA 서열결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHOM1이라 명명하였다(도 6 참조). 또한, 본 발명의 벡터 pCH01-Igs는, 포유동물 세포 분비발현계에 적당한 마우스 IgG1 신호 서열(Nature, 332, 323-327, 1988)을 함유하고 있다. 본 플라스미드 pCHOM1에 함유되는 재구성 MABL-1항체 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 23에 나타낸다.

5.2 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 제작

재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 상기 5.1에 따라서 제작하였다. 제1PCR에 있어서는 pGEM-M1H 대신에 재구성 MABL-2항체 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2H(실시예 2 참조), 및 pGEM-M1L 대신에 재구성 MABL-2항체 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pGEM-M2L(실시예 2 참조)을 사용하고, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드 pscM2를 얻었다. 본 플라스미드 pscM2에 함유되는 재구성 MABL-2 항체 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 24에 나타낸다.

또한, pscM2벡터의 수식에 의해 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을 함유하는 포유동물 세포 발현용 pCHOM2 벡터를 얻었다. 본 플라스미드 pCHOM2에 함유되는 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 25에 나타낸다.

5.3 COS7세포로의 유전자 도입

재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 일과성 발현을 관찰하기 위해, pCHOM2 벡터를 COS7세포에서 시험하였다.

pCHOM2벡터를 Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포에 형질전환하였다. DNA(10㎍)와 PBS 중 1×10⁷세포/ml의 0.8ml를 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다.

실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로코포레이션 처리된 세포를 10% 소의 태아혈청을 함유하는 IMDM배양액(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하였다. 72시간 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하여 회수 배양상청을 얻었다.

5.4 COS7 세포 배양상청 중의 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 검출

pCHOM2벡터를 유전자 도입한 COS7세포 배양상청 중에서의 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 웨스턴블로팅법(Western Blotting Method)에 의해 확인하였다.

pCHOM2벡터를 유전자 도입한 COS7세포 배양상청 및 대조로서 pCHO1벡터를 유전자 도입한 COS7세포 배양상청에 관해서 SDS전기영동을 행하고, REINFORCED NC막(Schleicher&Schuell사 제작)에 전사하였다. 5%탈지우유(모리나가뉴쿄사 제작)로 블로킹을 행하고, 0.05% Tween 20-PBS로 세정 후, 항FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 부가하였다. 실온에서 인큐베이션 및, 세정 후, 알칼리 포스파타제 결합 항마우스IgG항체(Zymed사 제작)을 첨가하고, 실온에서 인큐베이션 및 세정한 후, 기질용액(Kirkegaard Perry Laboraories사 제작)을 첨가하여 발색시켰다(도 7).

그 결과, pCHOM2 벡터 도입 COS7 세포 배양상청 중에만 FLAG펩티드 특이적인 단백질이 검출되고, 이 배향상청 중에 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv가 분비되고 있는 것이 명백하게 되었다.

5.5 유동세포 분석법

항원으로의 결합을 측정하기 위해 상기 COS7 세포 배양상청을 이용하여 유동세포 분석법을 행하였다. 인간 Integrin Associate Protein(IAP)을 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포, 또는 대조로서 pCHO1벡터를 형질전환한 L1210세포 2×10⁵개에, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv를 발현시킨 COS7세포의 배양상청 또는 대조로서 pCHO1 벡터를 형질전환한 COS7세포의 배양상청을 첨가하고, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, 마우스 항 FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 첨가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FITC 표식한 항마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 첨가하였다. 재차 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.

그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv는 인간 IAP를 발현하는 L1210세포에 특이적으로 결합함으로써, 이 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv가 인간 Integrin Associated Protein(IAP)대한 친화성을 갖는 것이 명백하게 되었다(도 8∼도 11 참조).

5.6 경쟁적 효소면역학적 검정법(Competitive ELISA)

마우스 모노크로날 항체의 항원결합에 대한 저해활성을 지표로 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv의 항원결합 활성을 측정하였다.

1㎍/ml로 조정된 항FLAG 항체를 96웰플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트하였다. 세정 후, 1%BSA-PBS로 블로킹을 행하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 분비형 인간 IAP 항원 유전자(서열번호: 26)를 도입한 COS7세포 배양상청을 PBS로 2배 희석한 것을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 100ng/ml로 조정한 비오틴화 MABL-2항체 50㎕ 및 순차희석한 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv 발현 COS7세포 배양상청 50㎕를 혼화한 것을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 알카리 포스파타제 결합 스트렙토아비딘(Zymed사 제작)을 첨가하였다. 실온에서 인큐베이트 및 세정 후, 기질용액(SIGMA 제작)을 첨가하고, 다음에 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 대조의 pCHOI도입 COS7세포 배양상청에 비교하여, 명백하게 농도 의존적으로 마우스 MABL-2항체의 인간 IAP항원으로의 결합을 저해하였다(도 12). 이것으로부터, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv는 마우스 모노크로날 항체 MABL-2의 각각의 V영역의 올바른 구조를 갖는것이 시사되었다.

5.7 체외(in vitro)에서의 아폽토시스 유발효과

인간 IAP를 유전자 도입한 L1210세포, 및 대조로서 pCOS1 벡터를 유전자 도입한 L1210세포, 및 CCRF-CEM세포를 사용하여 재구성 MABL-2항체의 단일쇄 Fv의 아폽토시스 유도작용을 Annexin-V(Boehringer Mannheim사 제작)염색에 의해 검사하였다.

각 세포 1×10⁵개에, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv 발현 COS7세포 배양상청 또는 대조로서 pCHO1벡터 도입 COS7세포 배양상청을 최종 농도 50%로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그후, Annexin-V염색을 행하고, FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다.

Annexin-V염색에 의한 해석의 결과를 도 13∼18에 각각 나타내었다. 여기서, 도면의 왼쪽 아래 영역에 있는 점(dot)은 살아있는 세포, 오른쪽 아래 영역은 아폽토시스 초기의 세포를, 오른쪽 위의 영역은 아폽토시스 후기의 세포를 나타낸다. 그 결과, 재구성 MABL-2항체 단일쇄 Fv(MABL2-scFv)는 L1210세포에 있어서, 인간 IAP항원 특이적으로 현저한 세포사를 유도하였다(도 13∼16). 또한, CCRF-CEM세포에 있어서도 대조에 비교하여 현저한 세포사를 유도하였다(도 17∼18).

5.8 CHO세포에서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현

MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해 pCHOM2벡터를 CHO세포에 유전자 도입 하였다.

pCHOM2벡터를, Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 CHO세포에 형질전환하였다. DNA(10㎍)와 PBS에 현탁한 CHO 세포(1×10⁷세포/ml)의 0.7ml를 혼합한 것을 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로코포레이션 처리된 세포를 10% 소의 태아혈청을 함유하는 핵산을 함유하지 않은 α-MEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 얻어진 클론에 관해서, SDS-PAGE에서 목적으로 하는 단백질의 발현을 확인하고, 발현량이 높은 클론을 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 생산세포주로서 선택하였다. 10nM 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)으로 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하여 회수 배양상청을 얻었다.

5.9 CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 정제

5.8에서 얻은 단일쇄 Fv발현 CHO생산주의 배양상청을 인공투석용 카트리지(PAN130SF, 아사히 메디칼)를 사용하여 약 20배까지 농축하였다. 농축액은 -20℃에서 보존하고, 정제시 해동하여 사용하였다.

CHO세포의 배양상청으로부터 단일쇄 Fv의 정제는, Blue-sepharose, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 및 겔 여과의 3종의 크로마토그래피에 의해 행되었다.

(1) Blue-sepharose 칼럼 크로마토그래피

배양상청의 농축액을 20mM초산 완충액(pH6.0)으로 10배 희석하고,원심분리(10000rpm, 30분)에 의해 불용물을 제거하였다. 상청을 동일한 완충액으로 평형화한 Blue-sepharose 칼럼(20ml)에 첨가하고, 동일한 완충액으로 칼럼을 세정 후, 동일한 완충액 중 NaCl농도를 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 및 1.0M까지 단계적으로 높여, 칼럼에 흡착한 단백질을 용출하였다. SDS-PAGE로 통과부분 및 각 용출부분을 분석하고, 단일쇄 Fv가 확인된 부분(0.1∼0.3M NaCl용출부분)을 채우고, Centriprep-10(AMICON사 제작)을 사용하여 약 20배 농축하였다.

(2) 하이드록시아파타이트

(1)의 농축액을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 10배 희석하고, 하이드록시아파타이트 칼럼(20ml, BIOARD사 제작)에 첨가하였다. 60ml의 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 칼럼을 세정 후, 인산 완충액 농도를 200mM까지 직선적으로 높여, 칼럼에 흡착한 단백질을 용출하였다(도 19 참조). SDS-PAGE에 의해 각 부분을 분석한 결과, 부분A 및 부분B에 단일쇄 Fv가 확인되었다.

(3) 겔 여과

(2)의 부분A 및 B를 각각 Centriprep-10을 사용하여 농축하고, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화한 TSKgelG3000SWG 칼럼(21.5 ×600mm)에 첨가하였다. 크로마토그램을 도 20에 나타낸다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 모든 주요피크(AI, BI)가 목적의 단일쇄 Fv이고, 겔 여과로 분석한 결과, 부분A에서는 외관상의 분자량 약 36kD, 부분B에서는 76kD로 용출되었다. 정제된 단일쇄 Fv(AI, BI)를 15%-SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분석하였다. 샘플을 환원제 첨가, 비첨가로 처리하고, Laemmli의 방법에 따라서 전기영동을 행하고, 영동 후 단백질을 Coomassie Brilliant Blue 염색하였다. 도 21에 나타내는 바와 같이, AI, BI 전부 환원제의 첨가유무에 관계없이, 외관상 분자량 약 35kD로 단일밴드를 부여하였다. 이상의 결과로부터, AI는 단일쇄 Fv의 모노머이고, BI는 단일쇄 Fv의 비공유결합성 다이머라 생각된다. 부분AI 및 BI를 TSKgel G3000SW 칼럼(7.5 ×60mm)을 사용한 겔 여과에 의해 분석한 결과, 부분AI는 모노머의 피크만, 부분B1은 다이머의 피크만 검출되었다(도 22참조). 또한, 다이머 부분(부분BI)은, 전체 단일쇄 Fv의 약 4%이었다. 상기 다이머 부분 중의 다이머는, 그 90%이상이 4℃에서 1개월 이상 안정적으로 유지되었다.

5.10 대장균세포에서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드 발현벡터의 구축

MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv를 대장균 균체내에서 효율적으로 발현하는 벡터를 제작하기 위해 pscM2 벡터를 PCR법에 의해 수식하였다. 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7 발현벡터에 도입하였다.

PCR에 사용하는 프라이머는, 전방 프라이머로서 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고 또한 개시코돈 및 NdeI제한 효소인식부위를 갖는 서열번호 : 27에 나타내는 Nde-VHSm02 프라이머 및 후방 프라이머로서 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 2개의 정지코돈 및 EcoRI제한 효소인식부위를 갖는 서열번호: 28에 나타내는 VLAS프라이머를 사용하였다. 또한, 전방 프라이머의 Nde-VHSm02는 대장균 균체내에서 효율적으로 발현하기 위해 H쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화되는 부분에 5지점 변이를 포함하고 있다.

PCR용액 100㎕는 10㎕의 10×PCR Buffer #1, 1mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs, 5유닛의 KOD DNA 폴리머라제(이상 TOYOBO사 제작), 1μM씩의 각 프라이머 및 100ng의 주형 DNA(pscM2)를 함유하고, 98℃에서 15초간, 65℃에서 2초간 및 74℃에서 30초간, 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 25회 반복하였다.

PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)를 사용하여 정제하고, NdeI 및 EcoRI로 소화시킨 후, 얻어진 DNA단편을 pSCFVT7벡터로 클로닝하였다. 또한, 본 발명 벡터 pSCFVT7은 NdeI 및 EcoRI로 소환함으로써 pelB신호 서열이 삭제되어 있다. DNA 서열결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖은 DNA파편을 함유는 플라스미드를 pscM2DEm02라 명명하였다(도 23 참조). 본 플라스미드 pscM2DEm02에 함유되는 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 29에 나타낸다.

5.11 대장균 세포에서의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현

MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드를 발현하는 대장균을 얻기 위해 pscM2DEm02벡터를 대장균 BL21(DE3)pLysS(STRATAGENE사 제작)로 형질전환하였다. 얻어진 클론에 관해서, SDS-PAGE에서 목적으로 하는 단백질의 발현을 검사하고, 발현량이 높은 클론을 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드의 생산주로서 선택하였다.

5.12 대장균 세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드의 정제

형질전환하여 얻어진 대장균의 단일 콜로니(single colony)를 LB배지 3ml에서 28℃에서 7시간 배양하고, 이것을 70ml의 LB배지에 계속 배양하고, 28℃에서 하룻밤 배양을 행하였다. 이 예비배양(pre-culture)을 7L의 LB배지에 계속 배양하고, 단지 발효기(Jar-fermenter)를 사용하여 28℃, 교반속도 300rpm으로 배양하였다. O.D.=1.5 일때 1mM IPTG로 유발을 시키고, 그후 3시간 배양을 행하였다.

배양액을 원심분리(10000×g, 10분)하고, 침전으로 회수된 균체에 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 1% Triton X-100를 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 초음파(out put:4, duty cycle:70%, 1분×10회)에 의해 균체를 파쇄하였다. 이 현탁액을 원심분리(12000×g, 10분)로 거르고, 침전으로서 회수한 봉입체에 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 4% Triton X-100를 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 재차 초음파처리(out put:4, duty cycle:50%, 30초×2회)를 행하고, 원심분리(12000×g, 10분)에 의해 목적 단백질을 침전시켜 회수하고, 상청에 생기는 협잡단백질을 제거하였다.

목적 단백질을 함유한 봉입체를 6M Urea, 5mM EDTA, 0.1M NaCl을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)에 용해하고, 4M Urea, 5mM EDTA, 0.1M Nacl, 10mM 메르캅토에탄올을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)으로 평형화한 Sephacryl S-300(5×90cm, Amersharm Pharmacia사 제작)겔 여과 컬럼에 유속 5ml/분으로 첨가하고, 회합하고 있는 고분자량의 단일쇄 Fv를 제거하였다. 각 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, 순도가 높은 화분에 대해서, O.D₂₈₀=0.25로 되도록 겔 여과에서 사용한 용매로 희석 후, 5mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.5 M Arg, 2mM 환원형 글루타티온, 0.2mM산화형 글루타티온을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)에 대해 투석을 3회 행함으로써 회복조작을 행하였다. 또한, 0.15 M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)에 대해 3번 투석하여, 용매교환을 행하였다.

조금 함유되는 분자간에서 S-S결합으로 가교된 고분자를 분리제거하기 위해, 0.15M NaCl을 함유하는 20mM 초산 완충액(pH 6.0)으로 평형화된 Superdex 200pg(2.6×60cm, Amersham Pharmacia사 제작)겔 여과 컬럼에 첨가하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 고분자량의 회합체라 생각되는 넓한(broad) 피크일 때, 주요피크와 서브피크의 2개의 피크가 검출되었다. SDS-PAGE에 의한 분석(도 21참조) 및 겔 여과의 용출위치로부터, 주요피크는 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머이고, 서브 피크는 비공유 결합성의 다이머라 생각된다. 또한, 형성된 비공유 결합성의 다이머는, 전체 단일쇄 Fv폴리펩티드의 약 4퍼센트이었다.

5.13 MABL-2항체 유래의 정제 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 체외(in vitro)에서의 아폽토시스 유발 효과

인간 IAP를 유전자 도입한 L1210세포(hIAP/L1210)를 사용하여, CHO세포 및 대장균 세포 생산의 MABL-2항체 유래의 단일쇄 Fv폴리펩티드(MABL-2scFv)의 아폽토시스 유도작용을 다음의 2개의 프로토콜로 Annexin-V(Boehringer Mannheim사 제작)염색에 의해 검사하였다.

제1프로토콜은, hIAP/L1210세포 5×10⁴개에, 항체시료를 최종농도 3㎍/ml로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 항체시험으로서, 실시예 5.9에서 얻은 CHO세포 유래MABL-2 단일쇄 Fv의 모노머 및 다이머, 또한 실시예 5.12에서 얻은 대장균 세포 유래의 동일 모노머 및 다이머, 그리고 대조로서, 마우스 1gG항체에 관해서 검사하였다. 배양 후, Annexin-V염색을 행하고, FACScan장치(BECTON DICKINSON)로 형광강도를 측정하였다.

또한, 제2프로토콜은 hIAP/L1210세포 5×10⁴개에, 항체시료를 최종농도 3㎍/ml으로 첨가하고, 2시간 배양 후에, 항FLAG항체(SOGMA사 제작)을 최종농도 15㎍/ml로 첨가하고, 22시간 더 배양하였다. 항체시료로서, 5.9에서 얻은 CHO세포 유래 MABL-2의 단일쇄 Fv의 모노머 및 대조로서 마우스 IgG항체에 관해서 검사하였다. 배양 후, Annexin-V 염색을 행하고, FACScan장치로 형광강도를 측정하였다.

Annexin-V 염색에 의한 분석의 결과를 도 25∼31에 각각 나타내었다. 그 결과 CHO세포 및 대장균 세포생산의 MABL-2항체 유래 단일쇄 Fv폴리펩티드의 다이머는 대조(도 25)와 비교하여 현저한 세포사를 유도하였지만(도 26, 27), CHO세포 및 대장균 세포 생산의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머의 아폽토시스 유도작용은 확인되지 않았다(도 28, 29). 또한, 항FLAG항체의 첨가에 의해, CHO세포 생산의 MABL-2항체 유래 단일쇄 Fv폴리펩티드의 모노머는 대조(도 30)와 비교하여 현저한 세포사를 유도하였다(도 31).

5.14 scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과

(1) 마우스 혈청 인간 IgG 정량법

마우스 혈청 중에서의 인간 골수종 세포가 생산하는 인간 IgG(M 단백질)의 정량은 이하의 ELISA으로 행하였다. 0.1% 중탄산 완충액(pH 9.6)으로 1㎍/mL에 희석한 염소 항인간 IgG항체(BIOSOURCE사 제작, Lot#7902) 100㎕를 96웰 플레이트(Nunc)에 첨가하고, 4℃에서 하루동안 인큐베이션하고, 항체를 고상화하였다. 블로킹 후, 단계 희석한 마우스 혈청 또는 표품으로서 인간 IgG(CAPPEL사 제작, LoT#00915) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 세정 후, 5000배 희석한 알칼리 포스파타제 표식 항인간 IgG항체(BIOSOURCE사 제작, Lot#6202) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세정 후, 기질용액을 첨가하고, 인큐베이션 후, MICROPLATE READER Model 3550(BioRad사 제작)를 사용하여 405nm의 흡광도를 측정하고, 표품의 인간 IgG의 흡광도에 의해 얻어진 검량선으로부터, 마우스 혈청 중의 인간 IgG(M단백질)농도를 검출하였다.

(2) 투여항체의 조제

scFv/CHO폴리펩티드의 모노머 및 다이머는, 투여당일 여과살균한 PBS(-)를 사용하여 각각 0.4mg/ml, 0.25mg/ml로 되도록 조제하고, 투여시료로 하였다.

(3) 인간 골수종 마우스 모델의 제작

인간 골수종의 마우스 모델은 이하와 같이 제작하였다. SCID 마우스(Japan Clare)를 사용하여 체내에(in vivo) 계대한 KPMM2세포(일본특허공개 평7-236475호 공보)를 10% 소의 태아혈청(GIBCO BRL사 제작)을 함유하는 RPMI1640 배지(GIBCO BRL사 제작)에서 3×10⁷개/ml가 되도록 조제하였다. 하루 전에 항아시아로 GM1항체(WAKO JUNYAKU사 제작, 1바이알을 5ml에서 용해) 100㎕를 피하투여한 SCID마우스(수컷, 6주령)에 상기 KPMM2세포 현택액 200㎕(6×10⁶개/마우스)를 꼬리 정맥에서 주입하였다.

(4) 항체 투여

(3)에서 제작된 인간 골수종 모델 마우스에 대해, KPMM2세포의 이식 후 3일로부터, 1일 2회, 3일간, 상기 (2)에서 조제한 투여시료, 모노머는 250㎕, 다이머는 400㎕를 꼬리정맥에서 투여하였다. 대조로서, 여과살균된 PBS(-)를 동일하게 1일 2회, 3일간, 200㎕, 꼬리정맥에서 투여하였다. 양군 모두 1군은 7마리로 행하였다.

(5) scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 이식 마우스 모델에 대한 항종양 효과의 평가

scFv/CHO 폴리펩티드의 모노머 및 다이머의 인간 골수종 마우스 모델의 항종양 효과에 대해서는, 상기 골수종 세포가 생산하는 인간 IgG(M단백질)의 마우스 혈청 중의 양의 변화 및 생존시간으로 평가하였다. 마우스 혈청 중의 인간 IgG량의 변화에 대해서는, KPMM2세포 이식후 24일째에 혈청을 채취하고, 상기 (1)에 서술한 ELISA를 사용하여 인간 IgG량을 측정하였다. 그 결과 PBS(-)투여군에서는 혈청 인간 IgG(M단백질)량이 약 8500㎍/ml까지 상승하고 있는데 반해, scFv/CHO 다이머 투여군에서는 대조군의 1/10이하로 현저하게 낮은 값이며, scFv/CHO 다이머가 KPMM2세포의 증식을 매우 강하게 억제하고 있는 것을 나타내었다(도 32). 한편, 생존기간에 관해서도, 도 33에 나타낸 바와 같이, scFv/CHO 다이머-투여군에서는 PBS(-) 투여군과 비교하여 현저한 생존기간의 연장이 확인되었다.

이상으로부터, scFv/CHO 다이머가 인간 골수종 마우스 모델에 대해 항종양 효과를 갖는 것이 나타났다. 본 발명의 개변항체인 scFv/CHO 다이머의 항종양 효과는 상기 개변항체가 갖는 아폽토시스 유도작용에 기초한다고 생각된다.

5.15. 적혈구 응집시험

적혈구 응집시험 및 적혈구 응집의 판정법은, 속 생화학 실험강좌의 면역생화학 연구법(일본생화학회편, 도쿄가가쿠 도진 발행)에 기초하여 실시하였다.

건강한 보통사람의 혈액을 헤파린 처리한 주사관에 의해 채혈하고, PBS(-)에 의해 3회 세정한 후, PBS(-)로 최종 농도가 2%의 적혈구 부유액을 제작하였다. 검사샘플은, 대조로서 마우스 IgG(ZYMED사 제작)를 사용하고, MABL-2항체, CHO세포 생산의 단일쇄 Fv폴리펩티드 모노머, 다이머, 대장균 생산의 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 모노머와 다이머를 사용하였다. 적혈구의 응집작용을 검사하기 위해 팔콘사 제작의 U바닥의 96웰플레이트를 사용하고, 상기 항체 샘플을 50㎕/웰 첨가한 중에, 2% 적혈구 부유액을 50㎕ 더 첨가, 혼합하고, 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 4℃에서 하룻밤 보존하고, 응집을 판정하였다. 또한, 대조로서, PBS(-)를 50㎕/웰 첨가하고, 항체 샘플과 동일하게 하여 응집시험을 행하였다. 항체의 최종농도는 마우스 IgG, MABL-2항체는, 0.01, 0.1, 1, 10, 100㎍/ml, 단일쇄 Fv는, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40, 80㎍/ml에서 대장균 생산의 단일쇄 Fv폴리펩티드의 다이머만 160㎍/mL의 용량을 설정하였다. 그 결과는, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, MABL-2항체에서는 0.1㎍/ml이상으로 적혈구 응집이 관찰되는데 반해, 단일쇄 Fv 폴리펩티드에서는 모노머, 다이머 모두에 적혈구 응집은 인지되지 않았다.

적혈구 응집시험
mIgGMABL-2(intact)	대조 0.01 0.1 1 10 100 ㎍/mL- - - - - -- - + +++ +++ ++
scFv/CHO 모노머scFv/CHO 다이머	대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 ㎍/mL- - - - - - -- - - - - - -
scFv/E.coli 모노머scFv/E.coli 다이머	대조 0.004 0.04 0.4 4 40 80 160 ㎍/mL- - - - - - -- - - - - - - -

실시예 6 :2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 sc(Fv)₂및 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2항체 scFv

6.1 MABL-2항체 sc(Fv) ₂ 발현 플라스미드의 구축

MABL-2항체 유래의 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 개변항체 [sc(Fv)₂]를 발현하는 플라스미드를 제조하기 위해, 상술 pCHOM2(MABL-2항체 유래의 scFv를 코드하는 DNA를 함유)를 이하에 나타낸 바와 같이 PCR법에 의해 수식하고, 얻어진 DNA단편을 pCHOM2에 도입하였다.

PCR에 사용하는 프라이머는, 센스 프라이머로서 EFIα를 코드하는 DNA에 혼성화하는 EFI프라이머(서열번호: 30)를 사용하고, 안티센스 프라이머로서 L쇄 V영역의 C단말을 코드하는 DNA에 혼성화하고 또한 링커 영역을 코드하는 DNA서열(서열번호: 19) 및 SalI제한 효소인식부위를 갖는 VLLAS 프라이머(서열번호: 31)를 사용하였다.

PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Buffer #1, 1mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 KOD DNA 폴리머라제(이상 도요보사 제작), 1μM의 각프라이머 및 100ng의 주형 DNA(pCHOM2)를 함유한다. PCR용액을 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간 및 74℃에서 1분간 이 순서로 가열하였다. 이 온도 사이클을 30회 반복하였다.

PCR생성물을 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN사 제작)을 사용하여 정제하고, SalI로 소화시켜, 얻어진 DNA단편을 pBluescript KS⁺벡터(도요보사 제작)에 클로닝하였다. DNA서열결정 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 SalI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 SalI로 소화시킨 pCHOM2에 Rapid DNA Ligation Kit(BOEHERINGER MANNHEIM사 제작)를 사용하여 연결하였다. DNA서열결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHOM2(Fv)₂로 명명하였다(도 34 참조). 본 플라스미드 pCHOM2(Fv)₂에 함유되는 MABL-2항체 sc(Fv)₂영역의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 32에 나타낸다.

6.2 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL-2항체 scFv발현 플라스미드의 제작

다양한 길이의 펩티드 링거를 가지며, 그리고 [H쇄]-[L쇄](이하 HL), [L쇄]-[H쇄](이하 LH)로 되도록 V영역을 연결한 scFv를 MABL-2 유래의 H쇄 및 L쇄 cDNA를 주형으로 하여 이하와 같이 제작하였다.

HL타입의 scFv를 제작하기 위해, 우선 pCHOM2(Fv)₂를 주형으로 하여 CFHL-F1 (서열번호: 33) 및 CFHL-R2(서열번호: 34)프라이머, CFHL-F2(서열번호: 35) 및 CFHL-R1 프라이머(서열번호: 36)에 의해 KOD 폴리머라제로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 행하고, 5'측에 리더서열을 함유하는 H쇄 및 3'측에 FLAG서열을 함유하는 L쇄의 cDNA 유전자를 제작하였다. 얻어진 H쇄 및 L쇄 cDNA를 주형으로서 혼합하고, KOD폴리머라제로 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 반응을 5회 반복하는 PCR반응을 행하고, CFHL-F1 및 CFHL-R1 프라이머를 가하여 30사이클 반응함으로써 링커를 함유하지 않는 HL-O타입의 cDNA를 제작하였다.

LH타입의 scFv를 제작하기 위해, 우선 MABL-2의 L쇄 및 H쇄 V영역의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pGEM-M2L 및 pGEM-M2H(일본특허출원 평11-63557호 참조)를 주형으로서 각각 T7(서열번호: 37) 및 CFLH-R2(서열번호: 38)프라이머, CFLH-F2(서열번호: 39) 및 CFLH-R1(서열번호: 40)프라이머를 사용하여 KOD 폴리머라제(도요보사 제작)로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 행하여, 5'측에 리더서열을 함유하는 L쇄, 및 3'-측에 FLAG서열을 함유하는 H쇄의 cDNA유전자를 제작하였다. 얻어진 L쇄 및 H쇄 cDNA를 주형으로서 혼합하고, KOD폴리머라제로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 반응을 5회 반복하는 PCR반응을 행하고, T7 및 CFLH-R1 프라이머를 가하여 30사이클 반응을 더 행하였다. 이 반응산물을 주형으로 하고, CFLH-F4(서열번호: 41) 및 CFLH-R1프라이머를 사용하여, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 행함으로써, 링커를 함유하지 않는 LH-O타입의 cDNA를 제조하였다.

이와 같이 하여 제작한 LH-O, HL-O타입의 cDNA를 제한 효소 EcoRI, BamHI(다카라 쇼조)처리하고, XhoI제한 효소 절단부위를 함유하지 않는 포유동물 발현 플라스미드 INPEP4에 Ligation High(Toyobo Inc.사 제작)를 사용하여 도입하고, 적격 대장균(Competent E. coli) JM109(니폰 젠사 제품)을 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)으로 플라스미드를 정제하였다. 이리하여 플라스미드 pCF2LH-O 및 pCF2HL-O을 제작하였다.

다음으로, 링커 사이즈가 다른 발현 플라스미드를 제작하기 위해 HL타입에서는 pCF2HL-O을 주형으로서 CFHL-X3(서열번호: 42), CFHL-X4(서열번호: 43), CFHL-X5(서열번호: 44), CFHL-X6(서열번호: 45) 또는 CFHL-X7(서열번호: 46)의 센스프라이머 및 안티센스 프라이머로서, 벡터서열에 상보적인 BGH-1(서열번호: 47) 프라이머를 사용하여, KOD폴리머라제로 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 행하고, 얻어진 반응산물을 제한 효소 Xhol, BamHI(다카라 슈조)로 처리하였다. 얻어진 단편을 pCF2HL-O의 Xhol, BamHI 부위에 Ligation High(도요보)을 사용하여 도입하고, 적격 대장균 JM109를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이렇게 하여, 발현 플라스미드 pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 및 pCF2HL-7을 제작하였다. 또한, COS7세포에서의 일과적 발현에 사용하는 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6, 및 pCF2HL-7을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI(Takark Shuzo)로 처리하고, 약 800bp의 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의한 겔로부터의 회수에 의해 정제하였다. 얻어진 단편을 포유동물 세포발현 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 및 BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, 적격 대장균 DH5α(Toyobo Inc.제작)을 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이리하여 발현 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1, CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1, CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 및 CF2HL-7/pCOS1을 제작하였다. 대표적인 예로서, 플라스미드 CF2HL-0/pCOS1의 구조를 도 35에 나타내고, 이것에 함유되는 MABL2-scFv<HL-0>의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 48에 나타낸다. 또 각 플라스미드의 링커 부분의 염기서열 및 아미노산 서열을 도 36에 나타낸다.

또한, 링커사이즈가 다른 LH타입의 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2LH-0을 주형으로서 CFLH-X3(서열번호: 49), CFLH-X4(서열번호: 50), CFLH-X5(서열번호: 51), CFLH-X6(서열번호: 52) 또는 CFLH-X7(서열번호: 53)의 센스프라미어 및 안티센스 프라이머로서 벡터서열에 상보적인 BGH-1프라이머를 사용하여, KOD폴리머라제로 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 30회 반복하는 PCR반응을 행하고, 얻어진 반응산물을 제한 효소 XhoI, BamHI로 처리하였다. 얻어진 단편을 pCF2LH-0의 Xhol, BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, 적격 대장균 DH5α(도요보)를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이리하여, 발현 플라스미드pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 및 pCF2LH-7을 제작하였다. 또한 COS7세포에서의 일과적 발현에 사용하는 발현 플라스미드를 제작하기 위해, pCF2LH-0, pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6, 및 pCF2LH-7을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI(Takark Shuzo)로 처리하고, 약 800bp의 단편을 아가로스겔 전기영동에 의한 겔로부터 회수에 의해 정제하였다. 얻어진 단편을 포유동물 세포 발현 플라스미드 pCOS1의 EcoRI 및 BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, 적격 대장균 DH5α(도요보사 제작)을 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Maxi Kit로 플라스미드를 정제하였다. 이리하여 발현 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1, CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1, CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 및 CF2LH-7/pCOS1를 제작하였다. 대표적인 예로서, 플라스미드 CF2LH-0/pCOS1의 구조를 도 37에 나타내고, 이것에 함유되는 MABL2-scFv<LH-0>의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 54에 나타낸다. 또한 각 플라스미드의 링커 부분의 염기서열 및 아미노산 서열을 도 38에 나타낸다.

6.3 COS7세포에서의 scFv 및 sc(Fv) ₂ 의 발현

(1) 유혈청 배지에서의 배양상청의 조제

HL타입, LH타입 scFv 및 sc(Fv)₂의 발현을 위해, COS7세포(JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation)에서의 일과적 발현을 행하였다. COS7세포는 10% 소의 태아혈청(HyClone)을 함유하는 DMEM배지(GOBCO BRL사 제작)에서 37℃의 탄산가스 항온조 속에서 연속배양하였다.

6.2에서 구축한 CF2HL-0,3∼7/pCOS1, 또는 CF2LH-0,3∼7/pCOS1 또는 pCHOM2(Fv)₂벡터를 Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 COS7세포에 트렌스펙션하였다.

DNA(10㎍)와 DMEM(10%FBS, 5mM BES(SIGMA사 제작)) 배지 속 2×10⁷세포/ml의 0.25ml를 큐벳에 첨가하고, 10분간 정치 후에 0.17kV, 950μF의 용량으로 펄스를 부여하였다. 10분간 정치 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 DMEM배양액(10%FBS)배지에 혼합하고, 75cm³플라스크에 첨가하였다. 72시간 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해, 세포파편을 제거하고, 또한 0.22㎛보틀탑필터(bottle top filter)(FALCON)로 여과하고, 이것을 배양상청(CM)으로 하였다.

(2) 무혈청 배지에서의 배양상청의 조제

상기 (1)과 동일한 방법으로 트랜스펙션한 세포를 DMEM(10% FBS)배지에 첨가하고 75cm³플라스크에서 하룻밤 배양한 후, 배양상청을 버리고, PBS로 세정한 후, CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하였다. 72시간 배양한 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리하여 세포파편을 제거하고, 0.22㎛ 보틀탑필터로 여과하여 CM을 얻었다.

6.4 COS7 CM 중의 scFv 및 sc(Fv) ₂ 의 검출

상기 6.3(2)에서 조제한 COS7의 CM 중에서의 다양한 MABL2-scFV 및 sc(Fv)₂의 폴리펩티드를 하기와 같이 웨스턴블로팅법에 의해 검출하였다.

각 COS7 CM에 대해서 SDS-PAGE를 행하고, REINFORCED NC막(Schleicher & Schuell사 제작)에 전사하였다. 5%탈지우유(모리나가뉴쿄사 제작)로 블로킹을 행하고, TBS로 세정 후, 항-FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 첨가하였다. 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 퍼옥시다제 표식 항마우스 IgG항체(Jackson Immuno Research사 제작)를 첨가하고, 실온에서 인큐베이션 및 세정 후, 기질용액을 첨가하여 발색시켰다(도 39).

6.5 유동세포 분석법

MABL2-scFVs 및 sc(Fv)₂의 인간 Integrin Associated Protein(IAP)항원으로의 결합을 측정하기 위해, 상기 실시예 6.3(1)에서 조제한 COS7세포 배양상청을 사용하여유동세포 분석법을 행하였다. 인간IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포 2×10⁵개에, 실시예 6.3(1)에서 얻은 배양상청 또는 대조로서 COS7세포의 배양상청을 첨가하고, 빙상에서 인큐베이션 및 세정 후, 10㎍/mL의 마우스 항-FLAG 항체(SIGMA사 제작)를 첨가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FITC 표식 항마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 첨가하였다. 재차 인큐베이션 및 세정 후, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, 각 COS7배양상청 중의 다양한 길이의 펩티드 링커를 갖는 MABL2-scFv 및 sc(Fv)₂은 인간 IAP에 대하여 높은 친화성을 갖는 것이 나타났다(도 40a 및 40b 참조).

6.6 체외(in vitro)에서의 아폽토시스 유발효과

상기 실시예 1.3(1)에서 조제한 COS7세포 배양상청에 대해서, 인간 IAP를 유전자도입한 L1210세포(hIAP/L1210)에 대한 아폽토시스 유도작용을 Annexin-V(BOEHRINGER MANNHEIM사 제작)염색에 의해 검사하였다.

hIAP/L1210세포 5×10⁴개에 각 벡터를 형질전환한 COS7세포 배양상청 또는 대조로서 COS7세포 배양상청을 최종농도 10%로 첨가하여 24시간 배양하였다. 그후, Annexin-V/PI 염색을 행하고, FACScan장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, COS7 CM 중의 scFvs<HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> 및 sc(Fv)₂는 hIAP/L1210세포에 대하여 현저한 세포사를 유도하였다. 얻어진 결과를 도 41a, 도 41b에 각각 나타낸다.

6.7 MABL2-scFv 및 sc(Fv) ₂ 의 CHO세포용 발현벡터의 구축

상기 MABL2-scFv 및 sc(FV)₂을 배양상청으로부터 정제하는 것을 목적으로, 이들을 CHO세포로 발현시키기 위한 발현벡터를 이하와 같이 구축하였다.

상기 1.2에서 조제한 pCF2HL-0, 3∼7, 및 pCF2LH-0, 3∼7의 EcoRI-BamHI단편을 CHO세포용 발현벡터 pCH01의 EcoRI 및 BamHI 부위에 Ligation High를 사용하여 도입하고, 적격 대장균 DH5α을 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN)으로 플라스미드를 정제하였다. 이와 같이 하여, 발현 플라스미드 pCHOM2HL-0, 3∼7 및 pCHOM2LH-0, 3∼7을 제작하였다.

6.8 MABL2-scFv<HL-0, 3∼7>, MABL2-scFv<LH-0, 3∼7> 및 sc(Fv) ₂ 발현 CHO세포의 제작 및 그 배양상청의 조제

상기 1.7에서 구축한 발현 플라스미드 pCHOM2HL-0, 3∼7 및 pCHOM2LH-0, 3∼7 및 pCHOM2(Fv)₂벡터를 이하와 같이 CHO세포에 형질전환하고, 각 개변항체를 항상적으로 발현하는 CHO세포를 제작하였다. 그 대표적인 예로서 MABL2-scFv<HL-5>, sc(Fv)₂를 항상적으로 발현하는 CHO세포의 제작을 하기에 나타낸다.

발현 플라스미드 pCHOM2HL-5 및 pCHOM2(Fv)₂를 제한 효소 PvuI로 소화하여 직쇄상으로 하고, 이들을 Gene Pulser 장치(BioRad사 제작)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 CHO세포에 트랜스펙션하였다. DNA(10㎍)와, PBS 중 1×10⁷세포/ml의 0.75ml를 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μF의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% 소의 태아혈청을 함유하는 핵산함유 α-MEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 배양상청을 제거하고, PBS로 린스한 후, 10% 소의 태아혈청을 함유하는 핵산을 함유하지 않은 α-MEM배양 배지(GIBCO BRL사 제작)를 첨가하여 배양하였다. 약 2주간 배양한 후, 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 최종농도10nM(최종농도)으로 함유하는 배지로 더 배양하고, 그후 50nM, 그리고 100nM농도로 순차 높여서, 배양을 계속하였다. 이리하여 얻은 세포를 롤러보틀(roller bottle) 속에서 무혈청배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하고, 또한 0.20㎛ 필터로 여과하여 각각의 CM을 얻었다.

동일하게 하여, MABL2-scFvs<HL-0, 3, 4, 6, 7> 및 <LH-0, 3, 4, 5, 6, 7>을 항상적으로 발현하는 CHO세포 및 그들의 CM을 얻었다.

6.9 MABL2-scFv<HL-5> 다이머 및 sc(Fv) ₂ 의 정제

하기 2종류의 정제법에 의해 상기 6.8에서 얻은 CM으로부터 MABL2-scFv<HL-5> 및 sc(Fv)₂의 정제를 행하였다.

<정제법1> HL-5 및 sc(Fv)₂을, 그 폴리펩티드의 C말단에 Flag서열을 이용한 항Flag 항체 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 겔 여과를 사용하여 정제하였다. 150mM NaCl을 함유하는 50mM Tris 염산완충액, pH7.5(TBS)으로 평형화된 항Flag M2 친화성 겔(SIGMA)로 작성한 컬럼(7.9ml)에 상기 6.8에서 얻은 CM(1리터)을 첨가하고, TBS로 컬럼을 세정 후, 0.1M 글리신 염산완충액으로 pH 3.5에서 scFv를 칼럼으로부터 용출시켰다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, scFv의 용출을 확인하였다. scFv부분을 최종농도가 0.01%로 되도록 Tween 20을 가하고, Centricon-10(MILIPORE)으로 농축하였다. 농축액을 150mM NaCl 및 0.01% Tween20을 함유하는 20mM 초산완충액, pH 6.0으로 평형화시킨 TSKgel G3000SW컬럼(7.5×600mm)에 첨가하였다. 유속 0.4mL/분으로 scFv는 280nm의 흡수로 검출하였다. HL-5는 주요 피크로서 다이머의 위치에, sc(Fv)₂는 모노머의 위치에서 각각 용출되었다.

<정제법2> HL-5 및 sc(Fv)₂를 이온교환크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 및 겔 여과의 3공정으로 정제하였다. 이온크로마토그래피에서는, HL-5에서는 Q sepharose fast flow컬럼(Pharmacia)을, sc(FV)₂에서는 SP-sepharose fast flow컬럼을 사용하고, 제2공정 이후는 HL-5와 sc(Fv)₂에서 동일한 조건을 사용하였다.

(제1공정) HL-5

HL-5의 CM은, 0.02% Tween 20을 함유하는 20mM Tris 염산완충액, pH 9.0으로 2배 희석한 후에, 1M Tris로 pH를 9.0으로 조정하였다. 이 후, 0.02% Tween20을 함유하는 20mM Tris염산완충액, pH8.5로 평형화된 Q sepharose fast flow컬럼에 첨가하고, 동일한 완충액 속의 0.1∼0.55M까지의 NaCl의 직선농도구배로 컬럼에 흡착한 폴리펩티드를 용출하였다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, HL-5를 함유하는 부분을 수집하고, 제2공정의 하이드록시아파타이트를 실시하였다.

(제1공정) sc(Fv)₂

sc(Fv)₂의 CM은, 0.02% Tween 20을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH 5.5으로 2배 희석한 후에, 1M초산으로 pH를 5.5로 조정하였다. 0.02% Tween20을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH5.5로 평형화한 SP-sepharose fast flow컬럼에 첨가하고, 동일 완충액 속, NaCl농도를 0∼0.5M까지 직선적으로 높이고, 컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 용출하였다. 얻어진 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, sc(Fv)₂를 함유하는 부분을 수집하고, 제2공정의 하이드록시아파타이트를 실시하였다.

(제2공정) HL-5 및 sc(Fv)₂의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피

제1공정에서 얻어진 HL-5부분 및 sc(Fv)₂부분을 각각 0.02% Tween20을 함유하는 10mM 인산 완충액, pH 7.0으로 평형화된 하이드록시아파타이트 컬럼(BioRad, 타입I)에 첨가하고, 동일 완충액으로 컬럼을 세정 후, 인산 완충액 농도를 0.5M까지 직선적으로 높이고, 컬럼에 흡착된 폴리펩티드를 용출하였다. 각 부분을 SDS-PAGE로 분석하고, 소망하는 폴리펩티드가 함유되는 부분을 수집하였다.

(제3공정) HL-5 및 sc(Fv)₂의 겔 여과

제2공정에서 얻어진 각 부분을 각각 Centriprep-10(MILLIPORE사 제작)로 농축하고, 0.02% Tween 20 및 0.15M Nacl을 함유하는 20mM 초산 완충액, pH 6.0로 평형화된 Superdex 200 컬럼(2.6×60cm, 파마시아)에 첨가하였다. HL-5는 다이머의 위치에, sc(Fv)HL-5 및 sc(Fv)₂는 모노머의 위치에 각각 주요 피크로서 용출되었다.

어느 정제법에서도, HL-5의 모노머는 거의 검출되지 않기 때문에, 단일쇄 Fv의 링커의 아미노산 잔기수가 5개 정도이면, 효율적으로 단일쇄 Fv의 다이머를 형성할 수 있는 것이 판명되었다. HL-5다이머 및 sc(Fv)₂는 모두 정제된 후에도 4℃에서 1개월간 안정적으로 유지되었다.

6.10 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(FV) ₂ 의 항원결합 활성평가

정제된 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂의 인간 Integrin Associated Protein(IAP)항원으로의 결합을 측정하기 위해 유동세포 분석법을 행하였다. 인간 IAP를 발현하는 마우스 백혈병 세포주 L1210세포(hIAP/L1210) 또는 대조로서 pCOS1벡터를 트랜스펙션한 L1210세포(pCOS1/L1210) 2×10⁵개에, 10㎍/ml의 정제 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머, MABL2-sc(Fv)₂, 양성 대조로서 모노크로날 항체 MABL-2, 음성 대조로서 마우스 IgG(Zymed사 제작)을 첨가하여, 빙상에서 인큐베이션 및 세정후, 10㎍/ml의 마우스 항FLAG항체(SIGM사 제작)을 첨가하였다. 인큐베이션 및 세정 후, FITC 표식 항 마우스 IgG항체(BECTON DICKINSON사 제작)를 첨가하였다. 재차 인큐베이션 및 세정 후, FACScan 장치(BECTON DICKINSO사 제작)로 형광강도를 측정하였다.

그 결과, 정제 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)₂는 hIAP/L1210세포에 특이적으로 결합함으로써, scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂가 인간 IAP에 대해 높은 친화성을 갖는 것이 나타났다(도 42).

6.11 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) ₂ 의 체외(in vitro) 아폽토시스 유발효과

정제된 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂에 관해서, 인간 IAP를 유전자 도입시킨 L1210세포(hIAP/L1210) 및 인간 백혈병 세포주CCRF-CEM에 대한 아폽토시스 유도작용을 Annexin-V(BOEHRINGER MANNHEIM사 제작)염색에 의해 검사하였다.

hIAP/L1210세포 5×10⁴개 또는 CCRF-CEM 세포 1×10⁵개에, 정제 MABL2-scFv<HL-5>의 다이머, MABL2-sc(Fv)₂, 양성 대조로서 모노크로날 항체 MABL-2, 음성 대조로서 마우스 IgG를 다양한 농도로 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 Annexin-V염색을 행하고, FACScan 장치(BECTON DICKINSON사 제작)로 형광강도를 측정하였다. 그 결과, MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)₂는 hHIAP/L1210, CCRF-CEM의 두 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포사를 유도하였다(도 43). 이 결과, MABL2-scFv<HL-5>의 다이머 및 MABL2-sc(Fv)₂은, 원래의 모노크로날 항체 MABL-2와 비교하여 개선된 아폽토시스 유도작용을 갖는 것이 나타났다.

6.12 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) ₂ 의 적혈구 응집시험

실시예 5.15에 따라서, 다양한 농도로 정제한 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂의 혈액 응집시험을 실시하였다.

모노크로날 항체 MABL-2에(양성대조)에서는 혈액응집이 일어나는데 반해, 단일쇄 항체의 MABL2-sc(Fv)₂및 MABL2-scFv<HL-5>는 응집하지 않았다. 또한, MABL-2항체를 사용한 완충액의 차도 거의 나타나지 않았다. 그 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

6.13 정제 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv) ₂ 의 인간 골수종 마우스 모델에 대한 항종양 효과

실시예 6.8 및 6.9에서 제작, 정제한 scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂에 대해서, 그 항종양 효과를 시험하였다. 구체적으로는 실시예 5.14(3)에서 제작한 인간 골수종 마우스 모델을 사용하여, 마우스 혈청 중에서의 인간 골수종 세포가 생산하는 M단백질을 ELISA에 의해 정량하고, 아울러 마우스의 생존일수를 기록하였다. 그리고, 혈청 중의 M단백질 양의 변화 및 생존일수에 의해, scFv<HL-5>의 다이머 및 sc(Fv)₂의 항종양 효과를 평가하였다.

또한, 본 시험에 있어서 HL-5 및 sc(Fv)₂는 vehicle(150mM NaCl, 0.02% Tween 및 20mM 초산 완충액, pH 6.0) 속의 0.01, 0.1 또는 1mg/mL의 용액으로서, 투여량이 0.1, 1 또는 10mg/kg으로 되도록 마우스에게 투여하였다. 또한, 대조는 vehicle만을 투여하였다.

인간 골수종 세포 이식 후 26일째에 혈청을 채취하고, 혈청 중의 M단백질 양을 ELISA에 의해 실시예 5.14에 따라서 측정하였다. 그 결과, HL-5투여군 및 다이머 및 sc(Fv)₂투여군 모두, 혈청 속의 M단백질량이 투여량 의존적으로 감소하고 있었다(도 44 참조). 또한, 그 생존시간에 대해서는, HL-5투여군(도 45) 및 sc(Fv)₂투여군(도 46)과 함께 대조(vehicle 투여군)와 비교하여 의미있는 생존시간의 연장이 관찰되었다. 이들의 결과는 본 발명의 HL-5 및 sc(Fv)₂가 체내(in vivo)에서도 우수한 항종양 작용을 갖는 것을 나타내고 있다.

실시예 7인간 MPL에 대한 인간항체 12B5의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv

인간 MPL에 대한 인간 모노크로날 항체 12B5의 V영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 하여 구축하였다.

7.1 12B5H형 V영역을 코드하는 유전자의 구축

인간 MPL에 결합하는 인간항체 12B5 H형 V영역을 코드하는 유전자는 상기 유전자의 염기서열(서열번호: 55)을 사용하여, 그 5'말단에 인간항체 유전자 유래의 리더서열(서열번호: 56)(Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63-69)을 연결시키는 것으로 설계되었다. 설계된 염기서열은 각각 15bp의 오버랩 서열을 가지도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12B5VH-1, 12B5VH-2, 12B5VH-3, 12B5VH-4)로 분할하고, 12B5VH-1(서열번호: 57) 및 12B5VH-3(서열번호: 59)는 센스방향으로, 12B5VH-2(서열번호: 58) 및 12B5VH-4(서열번호: 60)은 안티센스 방향으로 각각 합성되었다. 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 조합시킨 후, 외측 프라이머(12B5VH-S 및 12B5VH-A)를 첨가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또한 12B5VH-S(서열번호: 61)은 전방 프라이머 리더서열의 5'말단에 혼성화하고, 또한 Hind III제한 효소 인식서열 및 코자크서열(Kozaks sequence)을 가지도록, 또한 12B5VH-A(서열번호: 62)는 후방프라이머로 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기서열에 혼성화하고, 또한 스플라이스 도너 서열 및 BamHI제한 효소 인식서열을 가지도록 각각 설계하였다.

PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 2.5피코몰(pmole)씩의 합성 올리고뉴클레오티드 12E10VH-1∼4를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간, 그리고 다음에 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 100pmole씩의 외측 프라이머-12B5VH-S 및 12B5VH-A를 첨가하고, 또한 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.

PCR생성물은 1.5%저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한 효소 BamHI 및 Hind III으로 소화하고, 인간 H쇄 발현벡터 HEF-gγ1에 클로닝하였다. DNA서열결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12B5H-gγ1이라 명명하였다.

또한, HEF-12B5H-gγ1을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 12B5VH를 코드하는 유전자를 조제한 후, 인간 Fab H쇄 발현벡터 pCOS-Fd에 삽입하고, pFd-12B5H를 얻었다. 또한, 인간 Fab H쇄 발현벡터는 인간항체 H쇄 V영역과 정상영역을 코드하는 유전자간에 존재하는 인트론 영역 및 인간 H쇄 정상영역의 일부를 코드하는 유전자를 함유하는 DNA(서열번호: 63)을 PCR법을 사용하여 증폭한 후, 동물세포 발현벡터 pCOS1에 삽입하는 것으로 구축한 벡터이다. 인간 H쇄 정상영역은 HEF-gγ1을 주형으로 하고, 상기와 동일한 조건 하에서 유전자의 증폭을 수행하고,전방 프라이머로서 인트론1의 5'단의 서열과 혼성화하고, 또한 EcoRI 및 BamHI제한 효소 인식서열을 갖도록 설계한 G1CH1-S(서열번호: 64)를, 후방프라이머로서 인간 H쇄 정상영역 CH1 도메인의 3'단의 DNA에 혼성화하고, 또한 힌즈영역(hinge region)의 일부를 코드하는 서열, 2개의 정지코톤 및 Bg1 II제한 효소인식부위를 갖도록 설계한 G1CH1-A(서열번호: 65)를 사용하였다.

플라스미드 HEF-12B5H-gγ1 및 pFd-12B5H에 함유되는 재구성 12B5 H쇄 가변영역의 염기서열 및 아미노산 서영을 서열번호: 66에 나타낸다.

7.2 12B5 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 구축

인간 MPL에 결합하는 인간항체12B5 L쇄 V영역을 코드하는 유전자는, 상기 유전자의 염기서열(서열번호: 67)을 사용하여, 그 5'말단에 인간항체 유전자 3D6(Nuc, Acid Res. 1990: 18; 4927)유래의 리더서열(서열번호: 68)을 연결시키는 것으로 설계하였다. 설계된 염기서열은 상기와 동일하게 각각 15bp의 오버랩 서열을 가지도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12B5VL-1, 12B5VL-2, 12B5VL-3, 12B5VL-4)로 분할하여 각각 합성하였다. 12B5VL-1(서열번호: 69) 및 12B5VL-3(서열번호: 71)은 센스서열, 12B5VL-2(서열번호: 70) 및 12B5VL-4(서열번호: 72)는 안티센스 서열을 가지며, 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 어샘블시킨 후, 외측 프라이머(12B5VL-S 및 12B5VL-A)를 첨가하고, 전체길이의 유전자를 증폭하였다. 또한, 12B5VL-S(서열번호: 73)는 전방 프라이머에서 리더서열의 5'말단에 혼성화하고, 또한 Hind III제한 효소인식서열 및 코자크서열을 가지도록, 또한 12B5VL-A(서열번호: 74)는 후방프라이머로 L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기서열에 혼성화하고, 또한 스플라이스 도너 서열 및 BamHI제한 효소 인식서열을 가지도록 각각 설계하였다.

PCR반응은 상기와 동일하게 행하고, PCR생성물은 1.5%저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한 효소 BamHI 및 Hind III로 소화하고, 인간 L쇄 발현벡터 HEF-gκ에 클로닝하였다. DNA서열결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12B5L-gκ라 명명하였다. 본 플라스미드 HEF-12B5L-gκ에 함유되는 재구성 12B5 L쇄 V영역의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 75에 나타낸다.

7.3 재구성 12B5 단일쇄 Fv(scFv)의 제작

재구성 12B5 항체 단일쇄 Fv는 12B5VH-링커-12B5VL의 순서로 하여, 그 C말단에는 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해, FLAG서열(서열번호: 76)을 부가함으로써 설계되었다, 또한, 링커서열은(Gly₄Ser)₃의 15아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용하고, 재구성 12B5 단일쇄Fv(sc12B5)를 구축하였다.

(1) 15아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용한 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 제작

15아미드산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12B5 항체 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자 12B5H H쇄 V영역, 링커영역, 및 12B5 L쇄 V영역을 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 구축하였다. 이 방법을 도 47에 모식적으로 나타낸다. 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 제작을 위해 6개의 PCR 프라이머(A∼E)를 사용하였다. 프라이머 A, C 및 E는 센스서열을 가지며, 프라이머 B, D 및 F는 안티센스서열을 갖는다.

H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 12B5-S(프라이머 A, 서열번호: 77)는 H쇄 리더 서열의 5'말단에 혼성화하고, 또한 EcoRI제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다. H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 HuVHJ3(프라이머 B, 서열번호: 78)은, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하도록 설계하였다.

링커를 위한 전방 프라이머 RHuJH3(프라이머 C, 서열번호: 79)는, 링커의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA와 오버랩되도록 설계하였다. 링커를 위한 후방 프라이머 RHuVK1(프라이머 D, 서열번호: 80)은, 링커의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA와 오버랩하도록 설계하였다.

L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 HuVK1.2(프라이머 E, 서열번호: 81)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 12B5F-A(프라이머F, 서열번호: 82)는, L쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG펩티드를 코드하는 서열(Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204-1210, 1988), 2개의 전사정지코돈 및 NotI제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다.

제1PCR단계에 있어서 3개의 반응 A-B, C-D 및 E-F를 행하고, 제1PCR로부터 얻은 3개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 조합시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 F를 첨가하고, 15아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12B5 단일쇄Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제2PCR). 또한, 제1PCR에 있어서는, 재구성 12B5 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12B5H-gγ1(실시예 7.1 참조), Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser로 이루어지는 링커 영역을 코드하는 DNA 서열(서열번호: 83)(Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883, 1988)을 함유하여 이루어지는 플라스미드 pSCFVT7-hM21(인간형화 ONS-M21항체)(Ohtome, T. et al,. Anticancer Res. 18(1998), 4311-4316), 및 재구성 12B5 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12B5L-gκ(실시예 7.2 참조)을 각각 주형으로서 사용하였다.

제1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 100pmole씩의 각 프라이머 및 100ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.

PCR생성물 A-B, C-D 및 E-F는 제2PCR로 조합하였다. 제2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕의 PCR 반응물 A-B, 0.5㎕의 PCR 반응물 C-D 및 1㎕의 PCR 반응물 E-F, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)를 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고, 다음에 94℃에서 2분간, 65℃에서 2분간, 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 각각 100pmole씩의 프라이머 A 및 F를 첨가하였다. 그리고 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 5분간 가열하였다.

제2PCR에 의해 생산된 DNA 단편을 1.5%저융점 아가로스젤을 사용하여 정제하고, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 및 pCOS1벡터(일본특허출원 평8-255196)에 클로닝하였다. 또한, 본 발명 벡터 pCHO1은 DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO 92/19759참조)로부터, EcoRI 및 SmaI소화에 의해, 항체 유전자를 삭제하고, EcoRI-NotI-BamHI Adaptor를 제조함으로써 구축한 벡터이다. DNA서열결정 후, 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHO-sc12B5 및 pCOS-sc12B5라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-sc12B5 및 pCOS-sc12B5에 함유되는 재구성 12B5 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 84에 나타낸다.

7.4 포유동물을 사용한 각 12B5항체(IgG, Fab) 및 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현

12B5항체(IgG, Fab) 및 12B5항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)는 COS-7세포 또는 CHO세포를 사용하여 발현시켰다.

COS-7세포를 사용한 일과적인 발현은 다음과 같이 하여 행하였다. 즉, Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 유전자 도입하였다. 12B5항체(IgG)의 발현에는 상술한 발현벡터 HEF-12B5H-gγ1 및 HEF-12B5L-gκ각 10㎍씩을, 12B5Fab단편의 발현에는 pFd-12B5H와 HEF-12B5L-gκ각 10㎍씩을, 단일쇄 Fv의 발현에는 pCOS-sc12B5(10㎍)을 PBS에 현탁한 COS-7세포(1×10⁷세포/ml) 0.8ml에 혼합하여 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소의 태아혈청을 함유하는 DMEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 세포를 PBS로 일회 세정하고, 또한 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지를 첨가하고, 또한 2일간 더 배양하였다. 배양상청을 원심분리에 의해 세포파편을 제거한 후, 0.22㎛의 필터를 통과시킴으로써 조제하였다.

또한, 12B5항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해, pCHO-sc12B5발현벡터를 하기와 같이 CHO세포에 유전자 도입하였다.

즉, Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 발현벡터를 CHO세포에 도입하였다. 제한 효소 PvuI로 소화하고 직쇄상으로 한 DNA(100㎍)와 PBS에 현탁한 CHO세포(1×10⁷세포/ml)의 0.8ml를 혼합한 것을 큐벳에 가해 얼음 중에서 10분간 정치한 후, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 소의 태아혈청을 함유하는 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 배양 2일 후에 5nm 메토트렉사이트(SIGMA사 제작) 및 10%의 소의 태아혈청을 함유하는 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양하였다. 얻어진 클론에 대해서, 발현량이 높은 클론을 12B5 단일쇄 Fv의 생산세포주로서 선택하였다. 5nM 메토트렉사이트(SIGMA사 제작)를 함유하는 무혈청 배지 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하여 배양상청을 얻었다.

7.5 CHO 세포생산의 12B5유래의 단일쇄 Fv의 정제

7.4에서 얻어진 12B5 단일쇄 Fv 발현 CHO생산주의 배양상청으로부터의 정제는, 항 FLAG항체 컬럼 및 겔 여과 컬럼에 의해 행하였다.

(1) 항 FLAG항체 컬럼

배양상청은 PBS로 평형화된 항 FLAG M2 친화성 겔(SIGMA사 제작)에 첨가하였다. 동일 완충액으로 컬럼을 세정 후, 완충액을 0.1M 글리신 염산완충액(pH3.5)으로 컬럼에 흡착한 단백질을 용출하였다. 용출부분은, 용출 후 즉시 1M트리스 염산완충액(pH8.0)을 첨가하여 중화하였다. SDS-PAGE로 용출부분을 분석하고, 단일쇄Fv가 확인된 부분을 Centricon-10(MILLIPORE사 제작)을 사용하여 농축하였다.

(2) 겔 여과

(1)의 농축액은 0.01% Tween20을 함유하는 PBS로 평형화된 Superdex 200컬럼(10×300mm, AMERSHAM PHARMACIA사 제작)에 첨가하였다.

sc12B5는 2개의 피크(A, B)로 나눠져서 용출하였다(도 48 참조). 부분 A, B를 14%-SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분석하였다. 샘플을 환원제 첨가, 미첨가로 처리하고, Laemmli의 방법에 준하여 전기영동을 행하고, 영동 후 단백질을 크마시브릴리언트블루(Coomassie brilliant blue)염색하였다. 도 49에 나타낸 바와 같이, 부분A, B 모두 환원제의 첨가유무에 관계없이 외관 상의 분자량 약 31KD로 단일밴드를 부여하였다. 부분A 및 B를 Superdex 200 PC 3.2/30(3.2×300mm,AMERSHAM PHARMACIA사 제작)을 사용한 겔 여과에 의해 분석한 결과, 부분A에서는 외관상의 분자량 약44KD, 부분B에서는 동일한 22kD로 용출되었다(도 50의 (a) 및 (b) 참조). 이상의 결과로부터 부분A는 sc12B5 단일쇄 Fv의 비공유결합성 다이머이며, B는 모노머이다.

7.6 각종 단일쇄 Fv의 TPO형태 아고니스트 활성의 측정

인간 TPO수용체(MPL)을 발현하는 Ba/F3세포(BaF/mpl)에 대한 증식활성을 측정함으로써, 항 MPL 단일쇄 항체의 TPO형태 활성을 평가하였다. BaF/Mpl세포를 1%소의 태아혈청(GIBCO사 제작)을 함유하는 RPMI1640배지(GIBCO사 제작)로 2회 세정한 후, 5×10⁵세포/ml의 세포밀도로 되도록 배지에 현탁하였다. 항 MPL 단일쇄 항체 또는 인간 TPO(R&D Systems사 제작)를 배지로 적당하게 희석하고, 세포현탁액 50㎕에 항체 또는 인간 TPO희석액 50㎕를 첨가하여 96구멍 마이크로웰 평저 플레이트(Falcon사 제작)에 분주하고, CO₂인큐베이터(CO농도: 5%)에서 24시간 배양하였다. 배양 후, WST-8시약(살아있는 세포수 측정시약 SF: 나카라이테스크사 제작)을 10㎕ 첨가하고, 직후에 형광흡광 광도계 SPECTRA Fluor(TECAN사 제작)을 사용하여 측정파장 450nm, 대조파장 620nm의 흡광도를 측정하였다. CO₂인큐베이터(CO농도: 5%)에서 2시간 인큐베이트한 후, SPECTRA Fluor을 사용하여 재차 측정파장 450nm, 대조파장 620nm의 흡광도를 측정하였다. WST-8시약은 살아있는 세포수에 따라서 파장 450nm의 발색반응을 나타내기 때문에, 2시간의 흡광도 변화를 지표로 BaF/Mpl 증식활성을 다음과 같이 산출한 ED50값에 의해 평가하였다. 우선, 종축을흡광도, 횡축을 항체농도로 하고, 그 증식 반응곡선이 평평하게 달한 흡광도를 반응율 100%로 하였다. 반응율 50% 부근의 수치에 기초한 직선근사에 의해 근사식을 얻어서, 이것으로부터 반응율 50%로 되는 항체 농도를 산출하고 이것을 ED50값으로 하였다.

각종 12B5항체분자를 발현시킨 COS-7세포의 배양상청을 사용하고, MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과, 도 51에 나타낸 바와 같이 항원결합부위가 이가인 12B51 IgG에서는 농도 의존적으로 흡광도의 상승이 인지되는 TPO형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 비해(ED50; 29nm), 항원결합부위가 일가인 12B5Fab의 아고니스트 항체는 매우 약한 것이었다(ED50; 34, 724nM). 그것에 비해, Fab와 동일하게 항원결합부위가 일가인 단일쇄 Fv(sc12B5)에 있어서는 ED50값이 75nM과 강한 아고니스트 활성이 확인되었다. 그러나, 단일쇄 Fv에서는 H쇄, L쇄 각 가변영역은 비공유결합으로 결합하고 있기 때문에, 용액 중에서 각 가변영역이 해리하는 것 외의 분자의 가변영역을 결합하는 이량체 등의 다량체를 형성하는 것이 알려져 있다. 그래서, 겔 여과를 사용하여 정제 sc12B5의 분자량을 측정한 결과, 확실하게 단량체(모노머)와 이량체(다이머)라 생각되는 분자가 인지되었다(도 48 참조). 이어서, 모노머와 다이머의 sc12B5를 각각 단리(單利)하고(도 50 참조), 그들의 MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과, 도 51 및 도 52에 나타낸 바와 같이 sc12B5 모노머에서는 ED50값이 4438.7nM과 COS-7세포의 배양상청을 사용한 결과에 비해, 아고니스트 활성이 감소되고 약해지는 것이 확인되었다. 그것에 비해, 이가의 항원결합부위를 가진 단일쇄 Fv(sc12B5 다이머)에서는 일가의 sc12B5에 대해 약400배 강한 아고니스트 활성을 나타내었다(ED50; 10.1nM). 또한, 이가의 단일쇄 Fv에서는 인간 TOP 및 12B5 IgG의 아고니스트 활성과 동등 또는 그 이상의 아고니스트 활성을 나타내었다.

실시예 8(인간 MPL에 대한 인간항체 12E10 가변영역을 코드하는 유전자의 구축)

인간 MPL에 대한 인간 모노크로날 항체 12E10의 가변영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 하여 구축하였다.

8.1 12E10 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자의 구축

인간 MPL에 결합하는 인간항체 12E10 H쇄 가변영역을 코드하는 유전자는 WO99/10409에 기재된 아미노산 서열(서열번호: 85)을 기초로 서열번호: 86에 나타내는 염기서열을 설계하였다. 또한 그 5'말단에 인간항체전자 유래의 리더서열(서열번호: 87)(GenBank accession NO. AF062252)을 연결시킴으로써 전체 길이의 염기서열을 설계하였다. 설계된 염기서열은 각각 15bp의 오버랩 서열을 가지도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12E10VH1, 12E10VH2, 12E10VH3, 12E10VH4)로 분할하고, 12E10VH1(염기서열: 88) 및 12E10VH3(염기서열: 90)은 센스방향으로, 12E10VH2(서열번호: 89) 및 12E10VH4(서열번호: 91)은 안티센스 방향으로 각각 합성하였다. 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 조합시킨 후, 외측 프라이머(12E10VHS 및 12E10VHA)를 첨가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또한 12E10VHS(서열번호: 92)는 전방프라이머 리더서열의 5'말단에 혼성화하고, 또한 Hind III제한 효소인식서열 및 코자크서열을 가지도록, 또한 12E10VHA(서열번호: 93)는 후방프라이머로 H쇄 가변영역의 C말단을 코드하는 염기서열에 혼성화하고, 또한 스플라이스 도너 서열 및 BamHI 제한 효소인식서열을 가지도록 각각 설계하였다.

PCR용액 100㎕는, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5유닛의 DNA폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 2.5피코몰씩의 합성 올리고뉴클레오티드 12B5VH-1∼4를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간의 사이클을 2회 반복한 후, 100pmole씩의 외측 프라이머 12E10VHS 및 12E10VHA를 첨가하고, 또한 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.

PCR생성물은 1.5% 저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한 효소 BamHI 및 Hind III으로 소화하고, 인간 H쇄 발현벡터 HEF-gγ1에 클로닝하였다. DNA 서열결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-12E10H-gγ1이라 명명하였다.

또한, HEF-12E10H-gγ1을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 소화하고, 12E10VH를 코드하는 유전자를 조제한 후, 인간 Fab H쇄 발현벡터 pCOS-Fd에 삽입하고 pFd-12E10H를 얻었다. 또한 인간 Fab H쇄 발현벡터는 인간항체 H쇄 V영역과 정상영역을 코드하는 유전자 간에 존재하는 인트론 영역 및 인간 H쇄 정상영역의 일부를 코드하는 유전자를 함유하는 DNA(서열번호: 63)에 대해서 PCR법을 사용하여 증폭한 후, 동물세포 발현용 벡터 pCOS1에 삽입함으로써 구축한 벡터이다. 인간 H쇄 정상영역은 HEF-gγ1을 주형으로 하고, 상기와 동일한 조건 하에서 유전자의 증폭을 행하고, 전방 프라이머로서 인트론1의 5'단의 서열과 혼성화하고, 또한 EcoRI 및 BamHI제한 효소인식서열을 갖도록 설계한 G1CH1-S(서열번호: 64)를, 후방프라이머로서 인간 H쇄 정상영역 CH1 도메인의 3'단의 DNA에 혼성화하고, 또한 힌즈영역의 일부를 코드하는 서열,,2개의 정지코톤 및 Bg1 II제한 효소인식부위를 갖도록 설계한 G1CH1-A(서열번호: 65)를 사용하였다.

플라스미드 HEF-12E10H-gγ1 및 pFd-12E10H에 함유되는 재구성 12E10 H쇄 가변영역의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 94에 나타낸다.

8.2 12E10 L쇄 가변영역을 코드하는 유전자의 구축

인간 MPL에 결합하는 인간항체 12E10 L쇄 가변영역을 코드하는 유전자는 WO99/10409에 기재된 아미노산 서열(염기서열: 95)를 기초로 서열번호: 96에 나타내는 염기서열을 설계하였다. 또한, 그 5'단에 인간항체 유전자 유래의 리더서열(서열번호: 97)(Mol. Immunol. 1992; 29: 1515-1518)을 연결시킴으로써 설계되었다. 설계된 염기서열은 상기와 동일하게 각각 15bp의 오버랩 서열을 가지도록 4개의 올리고뉴클레오티드(12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3, 12E10VL4)로 분할하고, 각각 합성하였다. 12E10VL1(서열번호: 98) 및 12E10VL3(서열번호: 100)은 센스서열, 12E10VL2(서열번호: 99) 및 12E10VL4(서열번호: 101)는 안티센스 서열을 가지며, 각 합성 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보성에 의해 조합시킨 후, 외측프라이머(12E10VLS 및 12E10VLA)를 첨가하고, 전체 길이의 유전자를 증폭하였다. 또한 12E10LS(서열번호: 102)는 전방 프라이머에서 리더 서열의 5'단에 혼성화하고, 또한 EcoRI 제한 효소인식서열 및 코자크서열을 가지도록, 또한, 12E10VLA(서열번호: 103)는 후방프라이머로 L쇄 가변영역의 C말단을 코드하는 염기서열에 혼성화하고, 또한 BlnI 제한 효소인식서열을 가지도록 각각 설계하였다.

PCR반응은 상기와 동일하게 행하고, PCR 생성물은 1.5% 저융점 아가로스겔(Sigma사 제작)을 사용하여 정제한 후, 제한 효소 EcoRI 및 BlnI로 소화(消化)하고, 인간 람다쇄 정상영역 유전자를 함유하는 pUC19벡터에 클로닝하였다. DNA 서열결정 후, 올바른 DNA서열을 갖는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI로 소화하고, 12E10L쇄 가변영역 및 람다쇄 정상영역을 코드하는 유전자를 조제하고, 또한 발현벡터 pCOS1에 삽입하고, 12E10L쇄 유전자(서열번호: 104)를 가지는 플라스미드를 pCOS-12E101이라 명명하였다.

8.3 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작

재구성 12E10항체 단일쇄 Fv는 12E10VH-링커-12E10VL의 순서로 하여, 그 C말단에는 검출 및 정제를 용이하게 하기 위해 FLAG서열(서열번호: 105)을 부가하는 것으로 설계되었다, 또한, 링커서열은(Gly₄Ser)₃의 15아미드산으로 이루어지는 링커서열 또는 (Gly₄Ser)₁의 5아미노산으로 이루어지는 링커서열을 사용하고, 재구성 12E10쇄 Fv(sc12E10)을 구축하였다.

(1) 5아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용한 재구성 12105 단일쇄 Fv의제작

5아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자 12E10H H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 3'단, 및 12E10L쇄 V영역을 코드하는 5'단에 (G1y₄Ser)₁으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열을 부가시킨 유전자에 관해서 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 구축하였다. 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작을 위해 4개의 PCR 프라이머(A∼D)를 사용하였다. 프라이머A 및 C는 센스서열을 가지며, 프라이머B 및 D는 안티센스서열을 갖는다.

H쇄 V영역을 위한 전방프라이머 12E10S(프라이머A, 서열번호: 106)를 사용하고, H쇄 V영역을 위한 후방프라이머 DB2(프라이머B, 서열번호: 107)는 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y₄Ser)₁으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열 및 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다.

L쇄 V영역을 위한 전방프라이머 DB1(프라이머C, 서열번호: 108)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y₄Ser)₁으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열 및 H쇄 V영역을 C말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방프라이머는 12E10FA(프라이머D, 서열번호: 109)는 L쇄 가변영역 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG를 코드하는 염기서열을 가지며, 또한 NotI제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다.

제1PCR단계에 있어서 2개의 반응 A-B 및 C-D를 수행하고, 그리고 제1PCR로부터 얻은 2개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 조합시켰다. 다음에, 프라이머A 및 D를 첨가하고, 5아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제2PCR). 또한, 제1PCR에 있어서는, 재구성 12E10 H쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 HEF-12E10H-gγ1(실시예 8.1 참조), 및 재구성 12E10 L쇄 V영역을 코드하는 플라스미드 pCOS-12E10L(실시예 8.2 참조)을 각각 주형으로서 사용하였다.

제1PCR단계의 용액 50㎕는, 5㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작), 100pmole씩의 각 프라이머 및 100ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 9분간 그리고 다음에 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간의 사이클을 35회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.

PCR생성물 A-B(429bp) 및 C-D(395bp)는 제2PCR로 조합하였다. 제2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕씩의 제1PCR 반응물 A-B 및 PCR 반응물 C-D, 100피코몰씩의 각 프라이머, 10㎕의 10×PCR Gold Buffer II, 1.5mM MgCl₂, 0.08mM dNTPs, 5유닛의 DNA 폴리머라제 AmpliTaq Gold(이상 PERKIN ELMER사 제작)을 함유하는 98㎕의 PCR혼합액을 상기와 동일한 조건으로 반응시켰다.

제2PCR에 의해 생산된 795bp의 DNA단편에 관해서 1.5% 저융점 아가로스젤을 사용하여 정제한 후, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 또는 pCOS1벡터에 클로닝하였다. 또한, 본 발명 벡터 pCHO1은 DHFR-ΔE-RVH-PM1-f(WO92/19759 참조)로부터, EcoRI 및 SmaI소화에 의해, 항체 유전자를 삭제하고,EcoRI-NotI-BamHI 어댑터를 제조함으로써 구축한 벡터이다. DNA 서열결정 후, 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHO-db12E10 및 pCOS-db12E10이라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-db12E10 및 pCOS-db12E10에 함유되는 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 110에 나타낸다.

(2) 15아미드산으로 이루어지는 링커서열을 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작

15아미드산으로 이루어지는 링커서열를 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 유전자 12E10H H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 3'단, 및 12E10 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 5'단에 각각(G1y₄Ser)₃로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열을 부가시킨 유전자에 관해서, 각각 PCR법을 사용하여 증폭하고, 연결함으로써 구축하였다. 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 제작을 위해 4개의 PCR 프라이머(A∼D)를 사용하였다. 프라이머A 및 C는 센스서열을 가지며, 프라이머B 및 D는 안티센스서열을 갖는다.

H쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 12E10S(프라이머A, 서열번호: 106)를 사용하고, H쇄 V영역을 위한 후방 프라이머 sc4.3(프라이머B, 서열번호: 111)는, H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (Gly₄Ser)₃으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열 및 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다.

L쇄 V영역을 위한 전방 프라이머 sc1.3(프라이머C, 서열번호: 112)는 L쇄 V영역의 N말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 (G1y₄Ser)₃으로 이루어지는 링커를 코드하는 염기서열 및 H쇄 V영역의 C말단을 코드하는 염기서열을 갖도록 설계하였다. L쇄 V영역을 위한 후방프라이머는 12E10FA(프라이머D, 서열번호: 109)는 L쇄 가변영역 C말단을 코드하는 DNA에 혼성화하고, 또한 FLAG를 코드하는 염기서열을 가지며, 또한 NotI 제한 효소인식부위를 갖도록 설계하였다.

제1PCR단계에 있어서 2개의 반응A-B 및 C-D를 행하고, 그리고 제1PCR로부터 얻은 2개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 조합시켰다. 다음에, 프라이머 A 및 D를 첨가하고, 15아미노산으로 이루어지는 링커를 사용한 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 전체 길이 DNA를 증폭하였다(제2PCR). 또한, 제1PCR에 있어서는, 재구성 12E10 단일쇄 Fv를 코드하는 플라스미드 pCOS-db12E10(실시예 8.3(1) 참조)을 주형으로서 사용하였다.

제1PCR단계의 용액 50㎕는 5㎕의 10×ExTaq Buffer, 0.4mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 TaKaRa ExTaq(이상 타카라슈조사 제작), 100pmole씩의 각 프라이머 및 10ng의 각 주형 DNA를 함유하고, 94℃의 초기온도에서 30초간 그리고 다음에 94℃에서 15초간 및 72℃에서 2분간의 사이클을 5회, 94℃에서 15초간 및 70℃에서 2분간의 사이클을 5회, 94℃에서 15초간 및 68℃에서 2분간의 사이클을 28회 반복한 후, 반응 혼합물을 72℃에서 5분간 더 가열하였다.

PCR생성물 A-B(477bp) 및 C-D(447bp)는 제2PCR로 조합하였다. 제2PCR에 있어서, 주형으로서 1㎕씩의 제1PCR 반응물A-B 및 PCR 반응물 C-D, 100피코몰씩의 프라이머A 및 D, 5㎕의 10×ExTaq Buffer, 0.4mM dNTPs, 2.5유닛의 DNA 폴리머라제 ATakaRa ExTaq(이상, 타카라슈조사 제작)을 함유하고, 상기와 동일한 조건하에서 반응시켰다.

제2PCR에 의해 생산된 825bp의 DNA단편에 관해서, 1.0% 저융점 아가로스겔을 사용하여 정제하고, EcoRI 및 NotI로 소화하고, 얻어진 DNA단편을 pCHO1벡터 또는 pCOS1벡터에 클로닝하였다. DNA 서열결정 후, 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 올바른 아미노산 서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 pCHO-sc12E10 및 pCOS-sc-12E10이라 명명하였다. 본 플라스미드 pCHO-sc12E10 및 pCOS-sc12E10에 함유되는 재구성 12E10 단일쇄 Fv의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열번호: 113에 나타낸다.

8.4 포유동물을 사용한 각 12E10항체(IgG, Fab) 및 단일쇄 Fv 폴리펩티드의 발현

12E10항체(IgG, Fab) 및 12E10항체 유래의 단일쇄 Fv(링커서열 5아미노산, 15아미노산)는 COS-7세포 또는 CHO세포를 사용하여 발현시켰다.

COS-7세포를 사용한 일과적인 발현은 다음과 같이 하여 수행되었다. 즉, Gene Pulser장치(BioRad사 제작)를 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 유전자 도입하였다. 12E10항체(IgG)의 발현에는 상술한 발현벡터 HEF-12E10H-gγ1 및 pCOS-12E10L 각 10㎍씩을, 12E10Fab단편의 발현에는 pFd-12E10H와 pCOS-12E10L 각 10㎍씩을, 단일쇄 Fv의 발현에는 pCOS-sc12E10(10㎍) 또는 pCOS-db12E10(10㎍)을 PBS에현탁한 COS-7세포(1×10⁷세포/ml)0.8ml에 혼합한 것을 큐벳에 첨가하고, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를, 10%의 소의 태아혈청을 함유하는 DMEM배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 세포를 PBS로 일회 세정하고, 또한 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)를 첨가하고, 또한 3일간 배양하였다. 배양상청을 원심분리하여 세포파편을 제거한 후, 0.22㎛의 필터를 통과시킴으로써 조제하였다.

또한, 12E10항체 유래의 단일쇄 Fv(폴리펩티드)의 항상적 발현 CHO세포주를 수립하기 위해, pCHO-sc12E10 또는 pCHO-db12E10 발현벡터를 각각 CHO세포에 유전자 도입하였다.

각 발현벡터를, Gene Pulser사 제작(BioRad사 제작)을 사용한 일렉트로포레이션법에 의해 CHO세포에 유전자 도입하였다. PvuI소화에 의해 직쇄상으로 한 DNA(100㎍)와 PBS에 현탁한 CHO세포(1×10⁷세포/ml)의 0.8ml를 혼합한 것을 큐벳에 첨가하고 얼음 중에서 10분간 정치한 후, 1.5kV, 25μFD의 용량으로 펄스를 부여하였다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 투석 소의 태아혈청 및 헥산을 함유하는 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 첨가하여 배양하였다. 배양 2일 후에 10%의 투석 소의 태아혈청 및 핵산을 함유하지 않은 CHO-S-SFM II(GIBCO BRL사 제작)에서 배양하였다. 얻어진 클론에 대해서 발현량이 높은 클론을 12E10 단일쇄 Fv의 생산세포주로서 선택하였다. 이 세포주를 무혈청 배지 CHO-S-SFM II배지(GIBCO BRL사 제작)에 배양 후, 배양상청을 수집하고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거 후, 0.22㎛의 필터를 통과시킴으로써 배양상청을 조제하였다.

8.5 CHO세포생산의 12E10유래의 단일쇄 Fv의 정제

실시예 8.4에서 얻은 단일쇄 Fv발현 CHO생산주(sc12E10, db12E10)를 각각의 배양상청으로부터 항 FLAG항체 컬럼 및 겔 여과 컬럼을 사용하여 단일쇄Fv를 정제하였다.

(1) 항 FLAG항체 컬럼을 사용한 정제

배양상청(sc12E10, db12E10)을 각각 150mM Nacl을 함유하는 50mM 트리스 염산완충액(pH7.4)으로 평형화된 항FLAG M2 친화성 겔(SIGMA사 제작) 컬럼에 첨가하고, 동일 완충액으로 컬럼을 세정 후, 100mM 글리신 완충액(pH3.5)으로 컬럼에 흡착된 단백질을 용출하였다. 용출부분은 즉시 1M 트리스 염산완충액(pH8.0)을 첨가하여 중화하였다. SDS-PAGE로 용출부분을 분석하고, 단일쇄Fv가 확인된 부분을 각각 채우고, Centricon-10(아미콘)을 사용하여 약 20배 농축하였다.

(2) 겔 여과

(1)의 부분을 0.01% Tween 20을 함유하는 PBS로 평형화된 Superdex 200HR컬럼(10×300mm, AMERSHAM PHARMACIA사 제작)에 첨가하였다. 크로마토그램를 도 53 및 54에 나타낸다. 그 결과, sc12E10에 있어서는 2개의 피크(A, B)가 검출되었다(도 53). 또한 db12E10에서는 2개의 피크(C, D)가 검출되었다(도 54). 각각의 피크 부분을 분취하고, 환원제 첨가, 비첨가로 처리하고, Laemmli의 방법에 준하여 전기영동을 행하고, 영동 후 단백질을 크마시브릴리언트블루 염색하였다. 도 55에 나타낸 바와 같이, 부분A, 부분B, 부분C, 부분D 모두 환원제의 첨가유무에 관계없이 외관 상의 분자량 약 31kD에 단일밴드를 부여하였다. 이들 부분을 상술한 Superdex 200 HR컬럼을 사용한 겔 여과로 분석한 결과, 부분A는 외관 상의 분자량 약 42kD, 부분B는 동일한 20kD로 용출되었다(도 56 참조). 한편, 부분C는 외관상의 분자량 약 69kD, 부분D는 41kD로 용출되었다(도 57 참조). 이상의 결과로부터 sc12E10유래의 부분A는 단일쇄 Fv의 비공유 결합성 다이머이며, 부분B는 단일쇄 Fv의 모노머이며, 또한 db12E10유래의 부분C는 단일쇄 Fv의 비공유결합성 트리머, 부분D는 단일쇄 Fv의 비공유결합성 다이머인 것이 시사되었다.

8.6 각종 단일쇄 Fv의 TPO형태 아고니스트 활성의 측정

인간 TPO 수용체(MPL)을 발현하는 Ba/F3세포(BaF/mpl)에 대한 증식활성을 측정함으로써 항 mpl 단일쇄 항체의 TPO형태 활성의 평가를 행하였다.

BaF/Mpl세포를 1% 소의 태아혈청(GIBCO사 제작)을 함유하는 RPMI1640배지 (GIBCO사 제작)로 2회 세정한 후, 5×10⁵세포/ml의 세포밀도로 되도록 배지에 현탁하였다. 항 MPL 단일쇄 항체 또는 인간 TPO(R&D Systems사 제작)를 배지로 적당히 희석하고, 세포현탁액 50㎕에 항체 또는 인간 TPO희석액 50㎕를 첨가하여, 96구멍 마이크로웰 평저 플레이트(Corning사 제작)에 분주하고, CO₂인큐베이터(CO₂농도: 5%)로 24시간 배양하였다. 배양 후, WST-8시약(살아있는 세포수 측정시약 SF: 나카라이테스크사 제작)을 10㎕첨가하고, 직후에 흡광 광도계 Benchmark Plus(BioRad사제작)를 사용하여, 측정파장 450nm, 대조파장 655nm의 흡광도를 측정하였다. CO₂인큐베이터(CO₂농도: 5%)에서 2시간 인큐베이트한 후, Benchmark Plus를 사용하여 재차 측정파장 450nm, 대조파장 655nm의 흡광도를 측정하였다. WST-8시약은 살아있는 세포수에 따라서 파장 450nm의 발색반응을 나타내기 때문에, 2시간의 흡광도 변화를 지표로 BaF/mpl세포 증식활성을 평가하였다.

각종 12E10항체분자를 발현시킨 COS-7세포의 배양상청을 사용하여 MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정한 결과를 도 58에 나타낸다. 링커 서열 5아미노산(db12E10) 및 15아미노산(sc12E10)의 단일쇄 Fv에서는 농도 의존적으로 흡광도의 상승이 인지되고, TPO형태의 아고니스트 활성을 나타낸 것에 대해(ED50; 각각 9pM 및 51pM), 12E10IaG 및 12E10Fab에서는 전혀 활성이 인지되지 않았다.

단일쇄 Fv는 링커서열의 길이에 의해서는 H와 L쇄가 분자내뿐만 아니라, 분자간에도 결합함으로써 이량체 등의 다량체를 형성하는 것이 알려져 있다. 그리고, 12E10 단일쇄 Fv를 발현시킨 CHO세포의 배양상청을 겔 여과 부분으로 하여 MPL에 대한 아고니스트 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 59에 나타낸다. sc12E10 중에 조금 함유되는 이량체(sc12E10다이머, ED50; 1.9pM)은 단량체(sc12E10모노머, ED50;〉10nM)에 비하여, 500배 이상 강한 TPO아고니스트 활성을 나타내고, 그 활성은 TPO(ED; 27pM) 보다 강했다. 또한 db12E10의 이량체(db12E10다이머, ED50; 2.0pM)은 sc12E10다이머와 거의 동등의 강한 활성을 나타내었다. 겔 여과 분자량으로부터 이량체로 추정된 db12E10 트리머(ED50; 7.4pM)도 db12E10다이머에는 떨어지지만 높은 활성을 나타냈었다. 이상의 결과로부터 아고니스트 항체 12E10의 활성에는, 항원결합부위가 이가(다이머)인 것이 중요하다고 생각되지만, 12E10 IgG에는 활성이 나타나지 않기 때문에, 오직 2가뿐만 아니라 항원결합부위간의 거리나 각도라는 요소도 중요하다고 추측된다.

본 발명의 개변항체는, 세포표면상의 분자를 가교함으로써 상기 세포내에 신호를 전달할 수 있는 아고니스트 작용을 가지고 있고, 또한 항체분자(whole IgG)와 비교하여 저분자화가 달성되고 있기 때문에, 조직, 종양으로의 이행성이 우수하게 있다는 특징을 갖고 있다. 또한 본 발명에 의하면, TOP나 친항체(whole IgG) 보다 현저하게 높은 아고니스트 활성을 갖는 개변항체가 제공된다. 특히, 친항체 분자에서 아고니스트 활성이 인지되지 않는 경우에 있어서도 TPO 보다 높은 아고니스트 활성을 갖는 개변항체를 제공할 수 있다. 따라서, 상기 개변항체는 신호 전달 아고니스트로서 사용할 수 있고, 그리고 항체분자를 본 발명의 개변항체로 함으로써, 세포간의 가교 등에 의해 부작용을 경감하며, 또한 세포표면상의 분자를 가교하여 소망하는 작용만을 유발할 수 있는 새로운 의약품이 제공된다. 본 발명의 개변항체를 유효성분으로 하는 의약제제는, 혈소판 감소가 관여하는 혈액병환, 암이나 백혈병 등의 화학치료 후의 혈소판 감소증 등의 예방 및/또는 치료약으로서 유용하다.

Claims (40)

1. TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 개변항체.
2. 제1항에 있어서, H쇄 V영역 및 L쇄 V영역이 링커를 통하여 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 개변항체.
3. 제2항에 있어서, 링커가 1개 이상의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 개변항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 1개의 H쇄 V영역 및 1개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 Fv의 다량체로 구성되는 것을 특징으로 하는 개변항체.
5. 제4항에 있어서, 개변항체가 단일쇄 Fv의 테트라머, 트리머 또는 다이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 개변항체.
6. 제5항에 있어서, 개변항체가 단일쇄 Fv의 다이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 개변항체.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 동일 쇄상의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 서로 연합하여 1개의 항원결합부위를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 개변항체.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 2개 이상의 H쇄 V영역 및 2개 이상의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 개변항체.
9. 제8항에 있어서, 개변항체가 2개의 H쇄 V영역 및 2개의 L쇄 V영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 개변항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 폴리펩티드 정제를 위한 아미노산 서열을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 개변항체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 정제된 것임을 특징으로 하는 개변항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이 인간항체의 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역인 것을 특징으로 하는 개변항체.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역이 인간형화된 H쇄 V영역 및/또는 L쇄 V영역인 것을 특징으로 하는 개변항체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 단일 특이성(mono-specific)의 개변항체인 것을 특징으로 하는 개변항체.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 개변항체가 다가 특이성(multi-specific)의 개변항체인 것을 특징으로 하는 개변항체.
16. 제15항에 있어서, 개변항체가 이중 특이성(bi-specific)의 개변항체인 것을 특징으로 하는 개변항체.
17. 제14항에 있어서, L쇄 V영역 및 H쇄 V영역이 동일한 모노크로날 항체 유래인 것을 특징으로 하는 개변항체.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 친항체와 비교하여 동등 이상의 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것을 특징으로 하는 개변항체.
19. 제18항에 있어서, 친항체와 비교하여 2배 이상의 아고니스트 작용(ED50값)을나타내는 것을 특징으로 하는 개변항체.
20. 제19항에 있어서, 친항체와 비교하여 10배 이상의 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것을 특징으로 하는 개변항체.
21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 친항체가 아고니스트 작용을 실질적으로 갖지 않는 것을 특징으로 하는 개변항체.
22. 트롬보포에틴(TPO)과 비교하여 동등 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 화합물.
23. 제22항에 있어서, TPO와 비교하여 2배 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
24. 제23항에 있어서, TPO와 비교하여 10배 이상의 TPO 아고니스트 작용(ED50값)을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, TPO 아고니스트 작용의 ED50값이 20pM이하인 것을 특징으로 하는 개변항체 또는 화합물.
26. 제25항에 있어서, TPO 아고니스트 작용의 ED50값이 약 10pM이하인 것을 특징으로 하는 개변항체 또는 화합물.
27. 제26항에 있어서, TPO 아고니스트 작용의 ED50값이 약 2pM이하인 것을 특징으로 하는 개변항체 또는 화합물.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 친항체와 비교하여, 1/10이하의 세포간 접착작용(ED50값)을 나타내는 것을 특징으로 하는 개변항체 또는 화합물.
29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포간 접착작용을 실질적으로 갖지 않는 것을 특징으로 하는 개변항체 또는 화합물.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물을 코드하는 것을 특징으로 하는 DNA.
31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 동물세포.
32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물의 TPO 아고니스트로서의 용도.
34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물을 사용하여 TPO 수용체를 가교함으로써 세포내에 신호 전달을 일으키고, 상기 세포에 아고니스트 작용을 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제34항에 있어서, TPO 아고니스트 작용이 거핵구의 증식, 분화 유도 또는 성장의 자극, 혈소판의 생산 또는 TPO 수용체 단백질의 인산화인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
37. 제36항에 있어서, 의약은 혈소판 감소증의 치료제인 것을 특징으로 하는 의약.
38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 개변항체 또는 화합물의 의약으로서의 용도.
39. TPO 수용체를 가교함으로써 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체의 스크리닝방법으로서,

    (1) TPO 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하는 공정;

    (2) TPO 수용체를 발현하고 있는 세포와 상기 개변항체를 접촉시키는 공정; 및

    (3) TPO 수용체를 가교함으로써 상기 세포에 발생하는 TPO 아고니스트 작용을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 개변항체의 스크리닝방법.
40. TPO 수용체를 가교함으로써 TPO 아고니스트 작용을 나타내는, 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체의 TPO 아고니스트 활성의 측정방법으로서,

    (1) TPO 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 H쇄 V영역을 2개 이상 및 L쇄 V영역을 2개 이상 함유하는 개변항체를 제작하는 공정;

    (2) TPO 수용체를 발현하고 있는 세포와 상기 개변항체를 접촉시키는 공정; 및

    (3) TPO 수용체를 가교함으로써 상기 세포에 발생하는 TPO 아고니스트 작용을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 개변항체의 TPO 아고니스트 활성의 측정방법.