DE60133479T2

DE60133479T2 - Modifizierter tpo-agonisten antikörper

Info

Publication number: DE60133479T2
Application number: DE60133479T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Gotemba-shi TSUCHIYA; Toshihiko Gotemba-shi OHTOMO; Naohiro Niihari-gun YABUTA; Hiroyuki Niihari-gun TSUNODA; Tetsuro Niihari-gun ORITA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2021-10-23
Also published as: US8586039B2; CN1308448C; DE60133479D1; JPWO2002033072A1; RU2408606C2; ES2304235T3; US8034903B2; CN1469925A; US20120015436A1; RU2006120454A; US20040091475A1; KR20030055274A; ATE391174T1; RU2287534C2

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft modifizierte Antikörper, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen eines Antikörpers enthalten, welcher TPO-agonistische Aktivität durch Vernetzung des TPO-Rezeptors zeigt. Die modifizierten Antikörper haben TPO-angonistische Aktivität bei der Transduktion eines Signals in Zellen durch Vernetzung des TPO-Rezeptors und sind als Medikament für zahlreiche Zwecke nützlich.
Technischer Hintergrund
Thrombopoietin (TPO) ist ein Plättchenproduktions-Regulationsfaktor, der 1994 gefunden wurde und bekanntermaßen aus einem Glycoprotein mit einem Molekulargewicht aus 70–80.000 zusammengesetzt ist, welches hauptsächlich in der Leber hergestellt wird. Thrombopoietin ist ein Zytokin, welches im Knochenmark Plättchen-Vorläuferzellen unterstützt zu überleben, zu proliferieren, zu differenzieren und zu reifen, d. h. dass er Megakaryozyten beim Differenzieren und Proliferieren unterstützt. Thrombopoietin(TPO)-Rezeptor wurde früher als TPO als c-Mpl identifiziert, ein Rezeptor eines spezifischen Faktors, der die Plättchenproduktion reguliert (M. Souyri et al., Cell 63: 1137 (1990)). Es wurde berichtet, dass c-Mpl hauptsächlich in Plättchen-Vorläuferzellen, Megakaryozyten und Plättchenzellen verteilt ist, und dass die Unterdrückung der c-Mpl-Expression selektiv die Megakaryozytenbildung inhibiert (M. Methia et al., Blood 82: 1395 (1993)). Es wurde berichtet, auf Grundlage der Ergebnisse eines Proliferationstests an Zellen, der spezifisch für den c-Mpl-Liganden ist, und durch die Reinigung des Liganden unter Verwendung von c-Mpl (F. de Sauvage et al., Nature 369: 533 (1994); TD. Bartley et al., Cell 77: 1117 (1994)), dass der Ligand für c-Mpl TPO ist. Gegenwärtig wird Mpl als TPO-Rezeptor bezeichnet. Daher wurde von TPO und von TPO-Rezeptoragonisten erwartet, dass sie als therapeutisches Mittel für Thrombozytopenie wirken, z. B. als Medikament, welches Thrombozytopenie lindert, die durch eine Knochenmarksinhibierung oder eine Knochenmarksresektionstherapie bei Krebspatienten verursacht ist.
Andererseits wurden modifizierte Antikörper, insbesondere Antikörper mit niedrigerer molekularer Größe, beispielsweise einzelkettige Fvs, entwickelt, um die Permeabilität im Gewebe und Tumoren durch Absenkung der molekularen Größe zu verbessern, und um sie durch ein rekombinantes Verfahren herzustellen. Kürzlich wurden die Dimere einzelkettiger Fvs, insbesondere bispezifische Dimere, für die Vernetzung von Zellen verwendet. Typische Beispiele solcher Dimere sind Heterodimere einzelkettiger Fvs, die Antigene auf Krebszellen erkennen und Antigene auf Wirtszellen, wie NK-Zellen und Neutrophilen (Kipriyanov et al., Int. J. Cancer, 77, 9763–9772, 1998). Sie wurden durch eine Konstruktionstechnik für Einzelketten-Fv als modifizierte Antikörper hergestellt, welche wirksamer bei der Behandlung von Krebs sind, indem sie interzelluläre Vernetzung induzieren. Es ist gedacht worden, dass die interzelluläre Vernetzung durch Antikörper und deren Fragmente (z. B. Fab-Fragmente) durch bispezifische modifizierte Antikörper und sogar durch dimere einzelkettige Fvs, welche monospezifisch sind, induziert wird.
Als Antikörper, die in der Lage sind, ein Signal durch Vernetzung eines Zelloberflächen-Moleküls zu transduzieren, sind ein Antikörper gegen den EPO-Rezeptor, welche an der Zelldifferenzierung und Proliferation beteiligt ist ( JP-A 2000-95800 ), ein Antikörper gegen den MuSK-Rezeptor (Xie et al., Nature Biotechn. 15, 768–771, 1997) und andere bekannt. Ebenfalls bekannt ist ein agonistischer Antikörper des TPO- Rezeptors, dessen Fragmente und einzelkettige Fvs ( WO 99/10494 ). Jedoch gab es keine Berichte über einzelkettige Fv-Dimere und modifizierte Antikörper, wie einzelkettige bivalente Antikörper mit agonistischer Wirkung.
Unter Berücksichtigung, dass einzelkettige Fv-Dimere, die von monoklonalen Antikörpern stammen (Antikörper MABL-1 und Antikörper MABL-2, welche von den Erfindern hergestellt werden), welche Apoptose von IAP-haltigen Zellen induzieren, nicht Apoptose von Zellen induzieren und dass Dimere Apoptose induzieren, haben die Erfinder herausgefunden, dass Dimere den IAP-Rezeptor auf der Zelloberfläche vernetzen (dimerisieren), wodurch ein Signal in die Zellen transduziert wird, und infolgedessen die Apoptose induziert wird. Dieses lässt vermuten, dass monospezifische einzelkettige Fv-Dimere ein Zelloberflächenmolekül/Zelloberflächenmoleküle (z. B. Rezeptor) vernetzen und ein Signal 50 wie ein Ligand transduzieren, wodurch sie als Agonisten wirken.
Bei der Fokussierung auf die interzelluläre Vernetzung wurde entdeckt, dass die oben erwähnten einzelkettigen Fv-Dimere keine Hämagglutinierung verursachen, während die oben erwähnten monoklonalen Antikörper dies tun. Das gleiche Ergebnis wurde ebenfalls mit einzelkettigen bivalenten Antikörpern (einzelkettige Polypeptide, die zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen enthalten) beobachtet. Dies lässt vermuten, dass monoklonale Antikörper interzelluläre Vernetzungen bilden können, während modifizierte Antikörper, wie einzelkettige Fv-Dimere und einzelkettige bivalente Antikörper, Zelloberflächenmoleküle vernetzen, hingegen keine interzelluläre Vernetzung verursachen.
Aufgrund dieser Beobachtung haben die Erfinder neu herausgefunden, dass modifizierte Antikörper, wie beispielsweise einzelkettige Fv-Dimere und einzelkettige bivalente Antikörper ein Zelloberflächenmolekül/Zelloberflächenmoleküle oder intrazelluläre Molekül/Moleküle auf der gleichen Zelle vernetzen, zusätzlich zu bekannten interzellulären Vernetzungen, und dass sie als Ligand für das Molekül/die Moleküle geeignet sind (insbesondere als Ligand, welcher die Wirkung der natürlichen Liganden nachahmt).
Durch die zusätzliche Entdeckung, dass ein Antikörpermolekül (Gesamt-IgG) in einzelkettige Fv-Dimere, in einzelkettige bivalente Antikörper und ähnliche modifiziert werden kann, welche Zelloberflächenmolküle vernetzen, wodurch Nebenwirkungen reduziert werden, die durch interzelluläre Vernetzungen verursacht werden, und indem neue Medikamente bereitgestellt werden, die nur die gewünschte Wirkung auf die Zelle ausüben, haben die Erfinder die Erfindung erbracht. Die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper haben eine bemerkenswert hohe Aktivität verglichen mit vollständigen Antikörpern (IgG), welche die gleiche V-Region haben wie die modifizierten Antikörper. Sie habenaufgrund der niedrigeren molekularen Größe verglichen mit Antikörpermolekülen eine verbesserte Permeabilität in Gewebe, und ihnen fehlen die konstanten Bereiche.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel dieser Erfindung liegt darin, agonistische modifizierte Antikörper mit geringer molekularer Größe bereitzustellen, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen eines monoklonalen Antikörpers enthalten, und die TPO-agonistische Wirkung haben, indem sie den TPO-Rezeptor vernetzen.
Daher betrifft diese Erfindung die modifizierten Antikörper, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen enthalten, vorzugsweise jeweils zwei bis sechs, besonders bevorzugt jeweils zwei bis vier, am meisten bevorzugt jeweils zwei, und die TPO-agonistische Wirkung durch Vernetzung des TPO-Rezeptors zeigen.
Die „modifizierten Antikörper" in der Beschreibung bedeuten jede Substanz, welche zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen enthalten, wobei diese V-Regionen direkt oder über einen Linker durch eine kovalente Bindung oder nicht-kovalente Bindung kombiniert werden. Beispielsweise sind dies Polypeptide und Verbindungen, die durch Kombinieren jeder V-Region eines Antikörpers durch einen Peptidlinker oder ein chemisches Vernetzungsmittel und ähnliche kombiniert werden. Zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen, die in der Erfindung verwendet werden, können von dem gleichen Antikörper oder von verschiedenen Antikörpern stammen.
Modifizierte Antikörper der Erfindung können alles sein, sofern sie spezifisch TPO-Rezeptor erkennen und vernetzen, und dadurch ein Signal in Zellen transduzieren. Sie schließen modifizierte Antikörper ein, die so hergestellt wurden, dass ein Teil der Aminosäuresequenz der V-Region der modifizierten Antikörpers weiter modifiziert wurde.
Bevorzugte Beispiele der modifizierten Antikörper der Erfindung sind Multimere, beispielsweise Dimere, Trimere oder Tetramere einzelkettiger Fv, die eine H-Ketten-V-Region und eine L-Ketten-V-Region enthalten, oder einzelkettige Polypeptide, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen enthalten. Wenn die modifizierten Antikörper der Erfindung Multimere einzelkettiger Fvs sind wie Dimere, Trimere, Tetramere und ähnliche, welche eine H-Ketten-V-Region enthalten und eine L-Ketten-V-Region, ist es bevorzugt, dass die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region, die auf der gleichen Kette vorhanden sind, nicht verbunden sind, um eine Antigen-Bindungsstelle zu bilden.
Bevorzugtere Beispiele sind Dimere der einzelkettigen Fv, welche eine H-Ketten-V-Region und eine L-Ketten-V-Region enthält, oder ein einzelkettiges Polypeptid, das zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen enthält. Die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region sind vorzugsweise durch einen Linker in den modifizierten Antikörpern verbunden.
Das oben erwähnte einzelkettige Fv-Multimer schließt ein Multimer durch nicht kovalente Bindung, ein Mulitmer durch eine kovalente Bindung durch einen vernetzenden Rest und ein Multimer durch ein Vernetzungsmittel ein (ein Antikörper, ein Antikörper-Fragment oder einen bivalenten modifizierten Antikörper). Konventionelle Vernetzungsreste, die für die Vernetzung von Peptiden verwendet werden, können als Vernetzungsreste zur Ausbildung von Multimeren verwendet werden. Beispiele sind Disulfidvernetzungen durch Cysteinreste, andere Vernetzungsreste wie C₄-C₁₀-Alkylen (z. B. Tetramethylen, Pentamethylen, Hexamethylen, Heptamethylen und Octamehtylen etc.) oder C₄-C₁₀-Alkenylen (cis-/trans-3-Butenylen, cis-/trans-2-Pentylen, cis-/trans-3-Pentenylen, cis-/trans-3-Hexenylen etc.).
Außerdem ist das Vernetzungsmittel, welches mit einem einzelkettigen Fv kombiniert werden kann, beispielsweise eine Aminosäuresequenz, die gegebenenfalls in Fv eingeschleust werden kann, beispielsweise ein Antikörper gegen eine FLAG-Sequenz und ähnliche oder ein Fragment davon, oder ein modifizierter Antikörper, welcher von dem Antikörper abstammt, z. B. ein einzelkettiger Fv.
„TPO-agonistische Wirkung" in der Beschreibung bedeutet eine biologische Wirkung, die in der Zelle/den Zellen auftritt, in die ein Signal durch Vernetzung des TPO-Rezeptors transduziert wird, z. B. die Proliferation, Differenzierung oder Wachstumsstimulierung von Megakaryozyten oder die Plättchenproduktion.
Die ED50 der TPO-agonistischen Wirkung der Erfindung wird durch bekannte Verfahren zur Messung agonistischer Wirkungen bestimmt. Beispiele zur Messung sind ein Zell-Proliferations-Test unter Verwendung TPO-empfindlicher Zelllinien wie beispielsweise BaF/mpl oder UT7/TPO, die Messung der Phosphorylierung des MPL-Proteins, der Megakaryozytenkolonien-Test durch Differenzierung aus Knochenmarkszellen, der in vivo-Maus-Plättchen-Erholungs-Synthesetest, die Messung der Expressionsinduzierung von Plättchen-Antigen GPIIbIIIa (Anti-GPIIbIIIa) unter Verwendung der menschlichen Leukämie-Megakaryoblasten-Zelllinie (CMK) oder die Messung der Polyploidie-Induzierung einer megakaryoblastischen Zelllinie (DAMI). Die ED50 ist eine Dosis, die zur Erzielung einer 50%igen Reaktion der maximalen Aktivität, die als 100% in einer Dosis-Reaktionskurve festgelegt wird, benötigt wird.
Bevorzugte modifizierte Antikörper der Erfindung haben eine TPO-agonistische Wirkung (ED50), welche äquivalent oder besser ist als die eines Antikörpers, welcher die gleiche Antigen-Bindungsstelle hat wie der modifizierte Antikörper, d. h. der gesamte Antikörper (nachfolgend bezeichnet als „Eltern-Antikörper"), wie beispielsweise IgG mit dem gleichen Paar aus H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region wie das Paar aus H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region, welche die Antigen-Bindungsstelle des modifizierten Antikörpers bildet. Mehr bevorzugt sind solche mit TPO-agonistischer Wirkung (ED50), die mehr als zweimal höher ist als die des Eltern-Antikörpers, weiter bevorzugt mehr als fünf Mal, am meisten bevorzugt mehr als zehn Mal. Die Erfindung schließt modifizierte Antikörper mit TPO-agonistischer Wirkung ein, welche eine H-Ketten-V-Region und eine L-Ketten-V-Region enthalten, welche den gleichen Antigen-Bindungsbereich bilden wie der Eltern-Antikörper, welcher an den TPO-Rezeptor bindet, aber keine TPO-agonistische Wirkung gegen das Molekül ausübt.
Die Verbindungen, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen der Erfindung einschließen, können alle Verbindungen sein, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen eines Antikörpers einschließen und eine TPO-agonistische Wirkung (ED50) zeigen, die äquivalent ist oder besser als die von Thrombopoietin (TPO). Vorzugsweise sind es solche mit TPO-agonistischer Wirkung (ED50), die mehr als zweimal höher ist als die von TPO, mehr bevorzugt mehr als fünf Mal, am meisten bevorzugt mehr als zehn Mal.
Die „Verbindungen", die hier erwähnt werden, schließen nicht nur modifizierte Antikörper der Erfindung ein, sondern auch alle Verbindungen, die zwei oder mehr, bevorzugt von zwei bis sechs, mehr bevorzugt von zwei bis vier, am meisten bevorzugt zwei Antigen-Bindungsbereiche haben, als vollständige Antikörper oder F(ab')₂.
Bevorzugte modifizierte Antikörper oder Verbindungen der Erfindung enthalten zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen eines Antikörpers mit einer interzellulären Adhäsionswirkung (ED50), die nicht mehr als 1/10 der ist, wenn sie mit dem Eltern-Antikörper verglichen wird, mehr bevorzugt haben sie keine wesentliche interzelluläre Adhäsionswirkung.
Die ED50 der interzellulären Adhäsionswirkung, die oben erwähnt worden ist, wird durch bekannte Verfahren zur Messung der interzellulären Adhäsionswirkung bestimmt, z. B. durch Messung der Agglomerierung von Zellen, die den TPO-Rezeptor exprimieren.
Die Erfindung betrifft DNAs, die für die modifizierten Antikörper kodieren.
Die Erfindung betrifft tierische Zellen oder Mikroorganismen, welche die modifizierten Antikörper produzieren.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des modifizierten Antikörpers als TPO-Agonist.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transduzierung eines Signals in Zellen durch Vernetzung des TPO-Rezeptors unter Verwendung des modifizierten Antikörpers und dadurch die Induzierung der TPO-agonistischen Wirkung, wie beispielsweise Proliferation, Differenzierungsinduzierung oder Wachstumsstimulierung von Megakaryozyten, Plättchenproduktion, Phosphorylierung des TPO-Rezeptorproteins und ähnliche.
Die Erfindung betrifft ein Medikament zur Behandlung von Thrombozytopenie etc., welches den modifizierten Antikörper als wirksamen Bestandteil enthält.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des modifizierten Antikörpers als Medikament.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchmustern oder Messen des modifizierten Antikörpers, welcher zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen des Antikörpers enthält und TPO-agonistische Wirkung durch Vernetzung des TPO-Rezeptors zeigt, welches umfasst 1) Herstellen eines modifizierten Antikörpers, welcher zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen eines Antikörpers enthält und spezifisch an TPO-Rezeptor bindet, 2) Kontaktieren des modifizierten Antikörpers mit Zellen, die den TPO-Rezeptor exprimieren, und 3) Messen der TPO-agonistischen Wirkung, welche in Zellen durch Vernetzung des TPO-Rezeptors auftritt. Das Messverfahren ist nützlich für die Qualitätskontrolle bei der Herstellung der modifizierten Antikörper der Erfindung als Medikament oder für andere Zwecke.
Die modifizierten Antikörper können mono-spezifische modifizierte Antikörper oder multi-spezifische modifizierte Antikörper wie bi-spezifische modifizierte Antikörper sein. Bevorzugt sind es mono-spezifische modifizierte Antikörper.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch modifizierte Antikörper, deren H-Ketten-V-Regionen und/oder L-Ketten-V-Regionen eine H-Ketten-V-Region ist, die von einem menschlichen Antikörper und/oder L-Ketten-V-Region, die von einem menschlichen Antikörper stammt. Die H-Ketten-V-Region und/oder L-Ketten-V-Region, die von einem menschlichen Antikörper stammt, kann durch das Durchmustern einer menschlichen monoklonalen Antikörper-Bibliothek, wie in WO 99/10494 beschrieben, gewonnen werden. Die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region, welche von menschlichen monoklonalen Antikörpern stammt, die von transgenen Mäusen hergestellt werden und ähnliche sind ebenfalls eingeschlossen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner modifizierte Antikörper, deren H-Ketten-V-Region und/oder L-Ketten-V-Region humanisierte H-Ketten-V-Regionen und/oder humanisierte L-Ketten-V-Regionen sind. Genauer gesagt bestehen die humanisierten modifizierten Antikörper aus der humanisierten H-Ketten-V-Region, welche Rahmenbereiche (FR) umfasst, die von einer L-Ketten-V-Region eines menschlichen monoklonalen Antikörpers stammt und Komplementaritäts-bestimmende Bereiche (nachfolgend „CDR"), welche von einer L-Ketten-V-Region eines nicht-menschlichen Säuger (z. B. Maus, Ratte, Rind, Schaf, Affe)-monoklonalen Antikörper stammen und/oder die humanisierte H-Ketten-V-Region, welche FR umfasst, welche von einer H-Ketten-V-Region eines menschlichen monoklonalen Antikörpers und CDR, welche von einer H-Ketten-V-Region eines nicht-menschlichen Säuger (z. B. Maus, Ratte, Rind, Schaf, Affe)-monoklonalen Antikörpers stammen, umfasst. In diesem Fall können die Aminosäuresequenzen der CDR und FR teilweise verändert werden, z. B. deletiert, ersetzt oder zugefügt.
H-Ketten-V-Regionen und/oder L-Ketten-V-Regionen der modifizierten Antikörper der Erfindung können H-Ketten-V-Regionen und/oder L-Ketten-V-Regionen sein, die von monoklonalen Antikörpern von Tieren stammen, die nicht der Mensch sind (wie beispielsweise Maus, Ratte, Rind, Schaf, Affe, Huhn und ähnliche). In diesem Fall können die Aminosäuresequenzen des CDR und FR teilweise geändert sein, z. B. deletiert, ersetzt oder zugefügt.
Die Erfindung betrifft auch DNAs, welche die verschiedenen modifizierten Antikörper, die oben erwähnt worden sind, kodieren und genetische Rekombinationstechniken zur Herstellung rekombinanter Vektoren, die die DNAs umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren transformiert sind. Beispiele für Wirtszellen sind Tierzellen, wie beispielsweise menschliche Zellen, Mauszellen oder ähnliche und Mikroorganismen wie beispielsweise E. coli, Bacillus subtilis, Hefe oder ähnliche.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der modifizierten Antikörper, welches das Kultivieren der oben erwähnten Wirte und das Extrahieren der modifizierten Antikörper aus der Kultur davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Dimers des einzelkettigen Fv, welches das Kultivieren von Wirtstierzellen umfasst, die den einzelkettigen Fv in einem Serum-freien Medium herstellen, um den einzelkettigen Fv in das Medium zu sezernieren, und das Isolieren des Dimers des einzelkettigen Fv, welcher im Medium gebildet worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der modifizierten Antikörper als TPO-Agonisten. Das heißt, dass es einen Signal-Transduktions-Agonisten betrifft, welcher als wirksamen Inhaltsstoff den modifizierten Antikörper umfasst, der, wie oben erwähnt, gewonnen wird.
Daher sind die pharmazeutischen Präparate, die den TPO-agonistischen modifizierten Antikörper der Erfindung als wirksamen Inhaltsstoff enthalten, nützlich als Präventionsmittel und/oder Mittel zur Heilung von Bluterkrankungen, die mit einer Plättchenreduzierung zusammenhängen, für Thrombozytopenie, welche durch Chemotherapie von Krebs oder Leukämie verursacht wird und ähnliche.
Die modifizierten Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen, welche von Antikörpern stammen. Die Struktur der modifizierten Antikörper kann ein Dimer aus einzelkettigen Fv sein, welche eine H-Ketten-V-Region umfasst und eine L-Ketten-V-Region oder ein Polypeptid, welches zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen umfasst. In den modifizierten Antikörpern der Erfindung werden die V-Regionen der H-Kette und L-Kette vorzugsweise durch einen Peptidlinker verbunden, welcher aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht. Die daraus resultierenden modifizierten Antikörper enthalten variable Bereiche von Antikörpern und binden an das Antigen mit der gleichen Spezifizität wie die ursprünglichen monoklonalen Antikörper.
H-Ketten-V-Regionen
In der vorliegenden Erfindung dimerisiert die H-Ketten-V-Region, die von einem Antikörper stammt, welcher den TPO-Rezeptor erkennt und oligomerisiert, beispielsweise durch Vernetzung dieses Moleküls und transduziert dadurch ein Signal in die Zellen. Die H-Ketten-V-Region der Erfindung schließt H-Ketten-V-Regionen ein, die von einem Säuger stammen (z. B. Mensch, Maus, Ratte, Rind, Schaf, Affe etc.) und H-Ketten-V-Regionen mit teilweise modifizierter Aminosäuresequenz der H-Ketten-V-Regionen. Mehr bevorzugt ist eine menschliche H-Ketten-V-Region, die FR der H-Ketten-V-Region eines menschlichen monoklonalen Antikörpers und CDR einer H-Ketten-V-Region eines Maus-monoklonalen Antikörpers enthält. Ebenfalls bevorzugt ist eine H-Ketten-V-Region mit einer Aminosäuresequenz, die von einem Menschen stammt, welche durch Rekombinationstechnik hergestellt werden kann. Die H-Ketten-V-Region der Erfindung kann ein Fragment der oben erwähnten H-Ketten-V-Region sein, wobei das Fragment die Antigen-Bindungsfähigkeit bewahrt.
L-Ketten-V-Regionen
Erfindungsgemäß erkennt die L-Ketten-V-Region den TPO-Rezeptor und oligomerisiert, beispielsweise dimerisiert durch Vernetzung dieses Moleküls, und dadurch wird ein Signal in die Zellen transduziert. Die L-Ketten-V-Region schließt L-Ketten-V-Regionen ein, die von einem Säuger stammen (z. B. aus Mensch, Maus, Ratte, Rind, Schaf, Affe etc.) und L-Ketten-V-Regionen mit teilweise modifizierter Aminosäuresequenz der L-Ketten-V-Regionen. Mehr bevorzugt ist eine humanisierte L-Ketten-V-Region, die den FR einer L-Ketten-V-Region eines menschlichen monoklonalen Antikörpers und den CDR einer L-Ketten-V-Region von Maus-monoklonalen Antikörpern enthält. Ebenfalls bevorzugt ist eine L-Ketten-V-Region mit einer Aminosäuresequenz, die von einem Menschen stammt, welche durch eine Rekombinationstechnik hergestellt werden kann. Die L-Ketten-V-Region der Erfindung können Fragmente der L-Ketten-V-Regionen sein, wobei die Fragmente die Antigen-Bindungsfähigkeit bewahren.
Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR)
Jede V-Region einer L-Kette und H-Kette bildet eine Antigen-Bindungsstelle. Die variable Region der L- und H-Ketten setzt sich aus vergleichsweise konservierten vier gemeinsamen Rahmenbereichen zusammen, die durch drei hypervariable Bereiche oder Komplementaritäts-bestimmende Bereiche (CDR) (Kabat, E. A. et al., „Sequences of Protein of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983) verbunden sind.
Größere Teile in den vier Rahmenbereichen (FRs) bilden β-Faltblatt-artige Strukturen und daher bilden 3 CDRs eine Schlaufe. CDRs können in einigen Fällen einen Teil der β-Faltblatt-Struktur bilden. Die 3 CDRs werden sterisch durch die FRs in enger Lage zueinander gehalten, welche an der Ausbildung der Antigen-Bindungsstelle zusammen mit den drei CDRs teilhaben.
Diese CDRs können durch Vergleichen der Aminosäuresequenz der V-Region des erhaltenen Antikörpers mit bekannten Aminosäuresequenzen von V-Regionen bekannter Antikörper nach der empirischen Regel in Kabat, E. A. et al., „Sequences of Protein of Immunological Interest", identifiziert werden.
Einzelketten-Fv
Ein Einzelketten-Fv ist ein Polypeptidmonomer, das eine H-Ketten-V-Region und eine L-Ketten-V-Region umfasst, welche von Antikörpern abstammen, die miteinander verbunden sind. Die daraus hervorgehenden Einzelketten-Fvs enthalten variable Bereiche der ursprünglichen Antikörper und bewahren die Komplementaritäts-bestimmende Region davon, und daher binden die Einzelketten-Fvs an das Antigen mit der gleichen Spezifität wie die ursprünglichen Antikörper (JP-Appl. 11-63557). Ein Teil der variablen Region und/oder CDR des Einzelketten-Fv der Erfindung oder eines Teils der Aminosäuresequenz davon kann teilweise geändert sein, beispielsweise deletiert, ersetzt oder hinzugefügt. Die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region, die den Einzelketten-Fv der Erfindung bilden, sind zuvor erwähnt worden und können direkt oder durch einen Linker verbunden sein, vorzugsweise durch einen Peptidlinker. Die Zusammensetzung des Einzelketten-Fv kann sein [H-Kette-V-Region]-[L-Kette-V-Region] oder [L-Kette-V-Region]-[H-Kette-V-Region]. In der vorliegenden Erfindung ist es möglich, den Einzelketten-Fv dazu zu bringen, ein Dimer, ein Trimer oder ein Tetramer zu bilden, von dem der modifizierte Antikörper der Erfindung gebildet werden kann.
Einzelkettiger modifizierter Antikörper
Die einzelkettigen modifizierten Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen, vorzugsweise jeweils zwei bis vier, insbesondere vorzugsweise jeweils zwei, umfassend zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionenund L-Ketten-V-Regionen, wie oben erwähnt wurde. Jede Region des Peptids sollte so angeordnet sein, dass der modifizierte Einzelketten-Antikörper eine spezifische sterische Struktur ausbildet, die konkret eine sterische Struktur nachahmt, die durch den Dimer eines einzelkettigen Fv gebildet wird. Beispielsweise sind die V-Regionen in der Reihenfolge der folgenden Weise angeordnet:
[H-Ketten-V-Region]-[L-Ketten-V-Region]-[H-Ketten-V-Region]-[L-Ketten-V-Region]; oder
[L-Ketten-V-Region]-[H-Ketten-V-Region]-[L-Ketten-V-Region]-[H-Ketten-V-Region],
wobei diese Regionen jeweils durch einen Peptidlinker verbunden sind.
In dieser Erfindung können die Linker zur Verbindung zwischen der H-Ketten-V-Region und der L-Ketten-V-Region jeder Peptidlinker sein, welcher durch gentechnische Verfahren eingeschleust werden kann oder jeder Linker, welcher chemisch synthetisiert werden kann. Beispielsweise können Linker, die in der Literatur offenbart sind, z. B. Protein Engineering, 9 (3), 299–305, 1996, erfindungsgemäß verwendet werden. Diese Linker können im gleichen Molekül gleich oder verschieden sein. Wenn Peptidlinker benötigt werden, werden die folgenden als exemplarische Linker zitiert:
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n und
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_n,
worin n eine ganze Zahl von nicht weniger als eins ist. Vorzugsweise variiert die Länge des Linkerpeptids abhängig von dem Rezeptor, der das Antigen sein soll, im Falle von einzelkettigen Fvs ist der Bereich von 1 bis 20 Aminosäuren normalerweise vorzuziehen. Im Falle von einzelkettigen modifizierten Antikörpern, die zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen umfassen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Bereiche, haben die Peptidlinker, die diese verbinden, die gleiche Antigen-Bindungsstelle, die [H-Kette-V-Region]-[L-Ketten-V-Region] oder ([L-Kette-V-Region]-[H-Kette-V-Region]) umfassen, Längen von 1 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt 3 bis 18 Aminosäuren. Die Peptidlinker, die diese verbinden, die nicht die gleiche Antigen-Bindungsstelle ausbilden, umfassen [H-Kette-V-Region]-[L-Kette-V-Region] oder ([L-Kette-V-Region]-[H-Kette-V-Region]) mit Längen von 1 bis 40 Aminosäuren, vorzugsweise 3 bis 30 Amionsäuren, mehr bevorzugt 5 bis 20 Aminosäuren. Das Verfahren zum Einschleusen dieser Linker wird in der Erklärung der DNA-Konstruktion beschrieben, welche die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper kodieren.
Die chemisch synthetisierten Linker, d. h. die chemischen Vernetzungsmittel der vorliegenden Erfindung können irgendwelche Linker sein, die konventionell zur Verbindung von Peptiden verwendet werden. Beispiele der Linker können N-Hydroxysuccinimid (NHS), Disuccinimidylsuberat (DSS), bis(Sulfosuccinimidyl)suberat (BS³), Dithiobis(Succinimidylpropionat) (DSP), Dithiobis(Sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP), Ethylenglycolbis(succinimidylsuccinat (EGS); Ethylenglycolbis(sulfosuccinimidylsuccinat (sulfo-EGS), Disuccinimidyltartrat (DST), Disulfosuccinimidyltartrat (sulfo-DST), bis[2-(Succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES), bis[2-(Sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (sulfo-BSOCOES) oder ähnliche. Diese sind kommerziell erhältlich. Es ist bevorzugt, dass die chemisch synthetisiserten Linker Längen haben, die äquivalent denen der Peptidlinker sind.
Um ein Dimer aus dem einzelkettigen Fv zu bilden, ist es bevorzugt, einen Linker zu wählen, der geeignet ist, in der Lösung zu dimerisieren, wie beispielsweise in einem Kulturmedium von mehr als 20%, mehr bevorzugt mehr als 50%, mehr bevorzugt mehr als 80%, mehr bevorzugt mehr als 90% des einzelkettigen Fv, der in den Wirtszellen hergestellt wird. Genauer setzt sich ein Linker vorzugsweise aus 2 bis 12 Aminosäuren, vorzugsweise 3 bis 10 Aminosäuren oder anderen Linkern, die dem entsprechen, zusammen.
Herstellung modifizierter Antikörper
Die modifizierten Antikörper können durch Verbinden durch die oben erwähnten Linker einer H-Ketten-V-Region und einer L-Ketten-V-Region hergestellt werden, welche von bekannten oder neuen Antikörpern stammen, die spezifisch an den TPO-Rezeptor binden. Als Beispiele der einzelkettigen Fvs werden solche genannt, die eine H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des Antikörpers 12B5 und des Antikörpers 12E10 haben, welche in WO 99/10494 beschrieben sind. Als Beispiele der modifizierten Antikörper der Erfindung mit zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen werden sc12B5 Dimer (Linker: 15 Aminosäuren), sc12E10 Dimer (Linker: 15 Aminosäuren), db12B5 Dimer (Linker. 5 Aminosäuren), db12E10 Dimer (Linker: 5 Aminosäuren), sc12B5sc(FV)₂ und sc12E10sc(FV)₂ genannt, welche H-Ketten-V-Regionen und L-Ketten-V-Regionen haben, die von den oben erwähnten monoklonalen Antikörpern stammen.
Zur Herstellung der modifizierten Antikörper kann ein Signalpeptid an dessen N-Terminus angeheftet werden, wenn das Polypeptid ein sezerniertes Peptid sein soll. Eine gut bekannte Aminosäuresequenz, die für die Reinigung des Polypeptids nützlich ist, wie beispielsweise die FLAG-Sequenz, kann für die effiziente Reinigung des Polypeptids angehängt werden. In diesem Fall kann durch die Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörpers ein Dimer gebildet werden.
Zur Herstellung des modifizierten Antikörpers der Erfindung ist es notwendig, DNA zu gewinnen, d. h. eine DNA, welche die einzelkettigen Fv oder eine DNA, welche die rekonstituierten einzelkettigen Polypeptide kodiert. Diese DNAs, insbesondere für sc12B5, db12B5, sc12E10 und/oder db12E10 sind von den DNAs erhältlich, welche die H-Ketten-V-Region und die L-Ketten-V-Region kodieren, die von diesen Fvs stammen. Sie sind ebenfalls erhältlich durch Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Verfahren unter Verwendung solcher DNAs als Matrize, und durch das Amplifizieren des Teils der DNA, die darin enthalten ist, welche die gewünschte Aminosäuresequenz kodiert, mit Hilfe eines Primerpaars, das den beiden Enden hiervon entspricht.
Im Falle, dass jede V-Region mit teilweise modifizierten Aminosäuresequenz gewünscht ist, werden die V-Regionen, in denen eine oder einige Aminosäuren modifiziert sind, d. h. deletiert, ersetzt oder hinzugefügt, durch ein Verfahren unter Verwendung von PCR gewonnen, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Ein Teil der Aminosäuresequenz in der V-Region ist vorzugsweise durch PCR modifiziert, welche im Fachgebiet bekannt ist, um einen modifizierten Antikörper herzustellen, welcher ausreichend aktiv gegenüber einem spezifischen Antigen ist.
Zur Bestimmung der Primer für die PCR-Amplifizierung werden die Arten an H-Ketten und L-Ketten, falls ein monoklonaler Antikörper als Ausgangsmaterial verwendet wird, durch ein Typisierungsverfahren bestimmt, das im technischen Gebiet bekannt ist.
Zur Amplifizierung der L-Ketten-V-Region des Antikörpers 12B5 und des Antikörpers 12E10 durch PCR, werden die 5'-Enden- und 3'-Enden-Oligonucleotidprimer, wie oben erwähnt, bestimmt. In gleicher Weise werden die 5'-Enden- und 3'-Enden-Oligonucleotidprimer für die Amplifizierung der H-Ketten-V-Region des Antikörpers 12B5 und Antikörpers 12E10 bestimmt.
In erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden die 5'-Endprimer, die eine Sequenz „GANTC" enthalten, welche die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Hinf I bereitstellen, in der Nähe des 5'-Terminus davon verwendet und die 3'-Endprimer, welche die Nucleotidsequenz „CCCGGG" enthalten, welche eine Erkennungsstelle für XmaI in der Nähe des 5'-Terminus davon bereitstellen, verwendet. Andere Restriktionsenzym-Erkennungsstellen können statt dieser Stellen verwendet werden, sofern sie zur Subklonierung eines gewünschten DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor verwendet werden.
Spezifisch entworfene PCR-Primer werden benutzt, um geeignete Nucleotidsequenzen am 5'-Ende und 3'-Ende der cDNAs bereitzustellen, welche die V-Region der Antikörper 121B5 und 12B10 kodieren, so dass die cDNAs schnell in einen Expressionsvektor inseriert werden und in dem Expressionsvektor angemessen funktionieren (z. B. ermöglicht diese Erfindung die Transkriptionseffizienz durch Inserieren einer Kozak-Sequenz zu erhöhen). Die V-Bereiche der Antikörper 121B5 und 12B10, welche durch Amplifizierung durch PCR unter Verwendung dieser Primer gewonnen werden, werden in den HEF-Expressionsvektor inseriert, welcher den gewünschten menschlichen C-Bereich enthält (siehe WO 92/19759 ). Die klonierten DNAs können unter Verwendung irgendeines konventionellen Verfahrens sequenziert werden, beispielsweise durch einen automatisches DNA-Sequenziergerät (Applied Biosystems).
Ein Linker, beispielsweise ein Peptidlinker, kann in dem modifizierten Antikörper der Erfindung in folgender Weise eingeschleust werden. Primer mit einer teilweise komplementären Sequenz mit Primern für die H-Ketten-V-Regionen und den L-Ketten-V-Regionen sind oben beschrieben und welche für den N-Terminus oder den C-Terminus des Linkers kodieren, werden entworfen. Dann kann das PCR-Verfahren unter Verwendung dieser Primer durchgeführt werden, um eine DNA herzustellen, die den Peptidlinker mit der gewünschten Aminosäuresequenz und Länge kodiert. Die DNAs, welche die H-Ketten-V-Region und die L-Ketten-V-Region kodieren, können durch die erhaltene DNA verbunden werden, um die DNA herzustellen, welche den modifzierten Antikörper der Erfindung kodiert, welcher den gewünschten Peptidlinker hat. Sobald die DNA, welche einen der modifizierten Antikörper kodiert, hergestellt ist, können die DNAs, die den modifizierten Antikörper mit oder ohne den gewünschten Peptidlinker kodieren, leicht durch Entwerfen zahlreicher Primer für den Linker hergestellt werden und dann durch Durchführen der PCR unter Verwendung von Primern und der oben erwähnten DNA als Matrize.
Jede V-Region des modifizierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung konventioneller Verfahren humanisiert werden (z. B. Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 1–6 (1993)). Sobald eine DNA, welche irgendeinen der humanisierten Fvs kodiert, hergestellt worden ist, kann ein humanisiertes einzelkettiges Fv, ein Fragment des humanisierten einzelkettigen Fv, ein humanisierter monoklonaler Antikörper oder ein Fragment des humanisierten monoklonalen Antikörpers leicht nach konventionellen Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise können die Aminosäuresequenzen ihrer V-Regionen teilweise modifiziert sein, falls dies notwendig ist.
Außerdem kann eine DNA, die von einem anderen Säugerursprung stammt, beispielsweise eine DNA, welche die V-Region eines menschlichen Antikörpers kodiert, in gleicher Weise hergestellt werden, wie die, die verwendet worden ist, um DNA herzustellen, welche die H-Ketten-V-Region und die L-Ketten-V-Region kodiert, die von der Maus stammt, indem konventionelle Verfahren, die oben erwähnt worden sind, verwendet werden. Die daraus hervorgehende DNA kann verwendet werden, um eine H-Ketten-V-Region und eine L-Ketten-V-Region eines anderen Säugers herzustellen, insbesondere die von einem menschlichen Antikörper stammende, einen einzelkettigen Fv, welcher von einem Menschen stammt, und ein Fragment davon, und einen monoklonalen Antikörper menschlichen Ursprungs und ein Fragment davon.
Wenn die modifizierten Antikörper der Erfindung bispezifische modifizierte Antikörper sind, können sie nach bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. das Verfahren, das in WO 94/13804 beschrieben ist).
Wie oben erwähnt wurde, können, wenn die gewünschten DNAs, welche die V-Region der modifizierten Antikörper und die V-Regionen der humanisierten modifizierten Antikörper kodieren, hergestellt werden, die Expressionsvektoren, die diese enthalten, und die Wirte, die mit diesen Vektoren transformiert sind, gemäß konventionellen Verfahren gewonnen werden. Des Weiteren können die Wirte gemäß konventionellen Verfahren kultiviert werden, um die rekonstruierten einzelkettigen Fv herzustellen, die rekonstruierten menschlichen einzelkettigen Fv, die humanisierten monoklonalen Antikörper und Fragmente davon. Sie können aus Zellen oder einem Medium isoliert werden und können in einer homogenen Masse gereinigt werden. Für diesen Zweck können jegliche Isolierungs- und Reinigungsverfahren, die konventionell für Proteine verwendet werden, z. B. Chromatographie, Ultrafiltration, Aussalzen und Dialyse, falls notwendig in Kombination, ohne darauf beschränkt zu sein, benutzt werden.
Wenn der rekonstruierte einzelkettige Fv der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren einer Tierzelle hergestellt wird, beispielsweise einer COS7-Zelle oder CHO-Zelle, vorzugsweise in CHO-Zellen, in einem Serum-freien Medium, kann der Dimer dieses einzelkettigen Fv, welcher in dem Medium gebildet wird, in hoher Ausbeute stabil gewonnen und gereinigt werden. Ein derart gereinigter Dimer kann über einen langen Zeitraum stabil konserviert werden. Das Serum-freie Medium, das in der Erfindung verwendet wird, kann ohne Beschränkung irgendein Medium sein, das konventionell zur Herstellung eines rekombinanten Proteins benutzt wird.
Zur Herstellung der modifizierten Antikörper der vorliegenden Erfindung kann jedes Expressionssystem verwendet werden, beispielsweise eukaryontische Zellen, wie Tierzellen, z. B. etablierte Säugerzelllinien, filamentöse Pilze und Hefe, und prokaryontische Zellen, wie bakterielle Zellen, z. B. E. coli. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper in Säugerzellen, beispielsweise COS7-Zellen oder CHO-Zellen exprimiert.
In diesen Fällen können konventionelle Promotoren, die für die Expression in Säugerzellen nützlich sind, verwendet werden. Vorzugsweise wird der menschliche Cytomegalievirus(HCMV)-„immediate early"-Promotor verwendet. Expressionsvektoren, die den HCMV-Promotor enthalten, schließen HCMV-VH-HCγ 1, HCMV-VL-HCK und ähnliche ein, die von pSV2neo abstammen ( WO 92/19759 ).
Zusätzlich schließen andere Promotoren für die Genexpression in Säugerzellen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, Viruspromotoren ein, die von einem Retrovirus, von einem Polyomavirus, von einem Adenovirus und einem Affenvirus 40 (SV40) stammen und Promotoren, die von Säugern stammen, wie beispielsweise den menschlichen Polypeptidketten-Verlängerungsfaktor 1α (HEF-1α). SV40-Promotor kann unter Verwendung des Verfahrens von Mulligan, R. C. et al. (Nature 277, 108–114 (1979)) einfach verwendet werden und der HEF-1α-Promotor kann ebenfalls gemäß dem Verfahren von Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research, 18, 5322 (1990)) verwendet werden.
Der Replikationsursprung (Ori), welcher erfindungsgemäß verwendet werden kann, schließt Ori ein, die von SV40, Polyomavirus, Adenovirus, Rinderpapillomavirus (BPV) und ähnlichen stammen. Ein Expressionsvektor kann als Selektionsmarker das Phosphotransferase APH (3') II oder I (Neo)-Gen, Thymidinkinase(TK)-Gen, E. coli Xanthinguaninphosphoribosyltransferase(Ecogpt)-Gen oder Dihydrofolatreductase(DHFR)-Gen enthalten.
Die Antigen-Bindungsfunktion des modifizierten Antikörpers, der oben hergestellt worden ist, kann durch ein konventionelles Verfahren evaluiert werden, beispielsweise durch ein Radio-Immun-Assay (RIA), durch einen Enzym- gebundenen Immunoabsorptions-Assay (ELISA) oder durch Oberflächenplasmonresonanz. Er kann ebenfalls unter Verwendung der Eindungs-inhibierenden Fähigkeit des ursprünglichen Antikörpers als Index untersucht werden, beispielsweise im Hinblick auf die Abwesenheit oder das Vorhandensein einer konzentrationsabhängigen Inhibierung der Bindung dieses monoklonalen Antikörpers an das Antigen.
Genauer gesagt, werden Tierzellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, welcher eine DNA enthält, die den erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper kodiert, z. B. COS7-Zellen oder CHO-Zellen, kultiviert. Die kultivierten Zellen und/oder der Überstand des Mediums oder der modifizierte Antikörper, der daraus gereinigt wurde, kann verwendet werden, um die Bindung an das Antigen zu bestimmen. Als Kontrolle wird Überstand des Kulturmediums verwendet, in dem Zellen, die nur mit dem Expressionsvektor transformiert wurden, kultiviert wurden, verwendet. Im Falle eines Antigens wird beispielsweise der Antikörper 12B5 und der Antikörper 12E10, eine Testprobe des modifizierten erfindungsgemäßen Antikörpers oder ein Überstand der Kontrolle zu Ba/F3-Zellen gegeben, welche menschliches MPL exprimieren, und dann wird ein Test, wie beispielsweise eine Durchflusscytometrie, durchgeführt, um die Antigen-Bindungsaktivität zu untersuchen.
Die Untersuchung der Signaltransduktionswirkung in vitro (beispielsweise Proliferation, Differenzierung, Induzierung oder Wachstumsstimulierung von Megakaryozyten, Plättchenproduktion, oder Phosphorylierung des TPO-Rezeptorproteins) wird in folgender Weise durchgeführt. Eine Testprobe des oben erwähnten modifizierten Antikörpers wird zu den Zellen zugegeben, welche den Antikörper exprimieren oder zu Zellen, in die das Gen des Antikörpers eingeschleust worden ist, und wird untersucht auf die Änderung, die durch die Signaltransduktion verursacht wird (beispielsweise eine menschliche MPL-Antigen-spezifische Proliferation, die Messung der Proteinphosphorylierung oder die Expression des Plättchen-spezifischen Antigens), indem konventionelle Verfahren verwendet werden. Eine Untersuchung in vivo wird durch die Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers, welcher MPL erkennt, eines modifizierten Antikörpers der Erfindung und PBS als Kontrolle an Mäuse durchgeführt, und dann wird die Stärke der Aktivität durch Änderung der Plättchenzahl im Mausserum untersucht.
Wie oben erwähnt wurde, können die modifizierten erfindungsgemäßen Antikörper durch Herstellen modifizierter Antikörper hergestellt werden, welche zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen enthalten, und spezifisch an den TPO-Rezeptor binden und durch das Screening der modifizierten Antikörper durch in vivo oder in vitro Untersuchungen, die oben aufgeführt wurden.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper, welche zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen umfassen, vorzugsweise jeweils zwei bis vier, mehr bevorzugt jeweils zwei, können ein Dimer des einzelkettigen Fv sein, welcher eine H-Ketten-V-Region umfasst und eine L-Ketten-V-Region, oder ein einzelkettiges Polypeptid, in dem zwei oder mehr H-Ketten-V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten-V-Regionen verbunden sind. Es wird in Erwägung gezogen, dass das Peptid aufgrund einer derartigen Konstruktion die dreidimensionale Struktur von TPO imitiert und daher eine herausragende Antigen-Bindungsfähigkeit und TPO-agonistische Wirkung bewahrt.
Die erfindungsgemäßen modifizierten Antikörper haben eine bemerkenswert niedrige molekulare Größe, verglichen mit dem Eltern-Antikörper-Molekül (z. B. IgG), und daher haben sie eine verbesserte Permeabilität in Gewebe und Tumoren und eine höhere Aktivität als das parentale monoklonale Antikörper-Molekül. Daher können die modifizierten Antikörper der Erfindung effizient das TPO-Signal in Zellen transduzieren. Die pharmazeutischen Präparate, die diese enthalten, sind nützlich zur Behandlung von Bluterkrankungen, die von Plättchen-Reduzierung abhängen und von Thrombozytopenie, welche durch eine Chemotherapie bei Krebs oder Leukämie verursacht wird. Es wird weiter erwartet, dass der Antikörper der Erfindung als Kontrastmittel mit RI-Markierung verwendet werden kann. Die Wirkung kann durch Anhängen einer RI-Verbindung oder eines Toxins verstärkt werden.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird konkret unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele dargestellt, welche in keiner Weise den Schutzbereich der Erfindung beschränken.
Zur Darstellung des Produktionsprozesses der modifizierten Antikörper der Erfindung, werden unten Beispiele zur Herstellung einzelkettiger Fvs gezeigt. Maus-Antikörper gegen menschliches IAP, MABL-1 und MABL-2 wurden in den Beispielen zur Herstellung modifizierter Antikörper verwendet. Die Hybridome MABL-1 und MABL-2, welche diese jeweils herstellen, wurden international als FERN BP-6100 und FERN BP-6101 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Minister of International Trade and Industry (1–3 Higasi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), einer anerkannten Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, am 11. September 1997 hinterlegt.
Beispiele
Vergleichsbeispiel 1 (Klonierung von DNAs, welche die V-Region von Maus-monoklonalen Antikörpern gegen menschliches IAP kodieren)
DNA, welche variable Bereiche der Maus-monoklonalen Antikörper gegen menschliches IAP kodieren, MABL-1 und MABL-2, wurden wie folgt kloniert.
1.1 Herstellung von Messenger-RNA (mRNA)
mRNAs der Hybridome MABL-1 und MABL-2 wurden unter Verwendung des mRNA-Reinigungs-Kits (Pharmacia Biotech) gewonnen.
1.2 Synthese doppelsträngiger cDNA
Doppelsträngige cDNA wurde aus ungefähr 1 μg der mRNA unter Verwendung des Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) synthetisiert, und ein Adapter wurde daran gebunden.
1.3 PCR-Amplifizierung von Genen, welche variable Bereiche eines Antikörpers kodieren
Eine PCR wurde unter Verwendung eines Thermal Cyclers (Perkin Elmer) durchgeführt.
(1) Amplifizierung eines Gens, welches die L-Ketten-V-Region von MABL-1 kodiert.
Die für das PCR-Verfahren verwendeten Primer sind der Adapterprimer-1 (Clontech), welcher in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, welcher an eine Teilsequenz des Adapters bindet, und der MKC(Mouse Kappa Constant)-Primer (Bio/Technology, 9, 88–89, 1991), welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, welcher mit der Maus-kappa-artigen L-Ketten-V-Region hybridisiert.
50 μl der PCR-Lösung enthält 5 μl 10 × PCR-Puffer II, 2 mM MgCl₂, 0,16 mM dNTPS (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 2,5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), 0,2 μM des Adapterprimers in SEQ ID Nr. 1, 0,2 μM des MKC-Primers der SEQ ID Nr. 2 und 0,1 μg der doppelsträngigen cDNA, welche von MABL-1 stammt. Die Lösung wurde auf die Anfangstemperatur von 94°C für 9 Minuten vorgewärmt und dann für 1 Minute auf 94°C, auf 60°C für 1 Minute und auf 72°C für 1 Minute 20 Sekunden, in dieser Reihenfolge erwärmt. Dieser Temperaturzyklus wurde 35 Mal wiederholt und dann wurde das Reaktionsgemisch weiter für 10 Minuten auf 72°C erwärmt.
(2) Amplifizierung von cDNA, welche die H-Ketten-V-Region von MABL-1 kodiert
Der Adapterprimer-1, welcher in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, und der MHC-γ1(Mouse Heavy Constant)-Primer (Bio/Technology, 9, 88–89, 1991), welcher in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, wurden als Primer für die PCR verwendet.
Die Amplifizierung von cDNA wurde gemäß dem Verfahren zur Amplifizierung des L-Ketten-V-Region-Gens durchgeführt, welches in Beispiel 1.3-(1) beschrieben wurde, außer dass 0,2 μM des MHC-γ1-Primers anstelle von 0,2 μM des MKC-Primers verwendet wurden.
(3) Amplifizierung von cDNA, welche die L-Ketten-V-Region von MABL-2 kodiert
Der Adapterprimer-1 nach SEQ ID Nr. 1 und der MKC-Primer der SEQ ID Nr. 2 wurden als Primer für die PCR verwendet.
Die Amplifzierung der cDNA wurde gemäß dem Verfahren zur Amplifizierung des L-Ketten-V-Region-Gens von MABL-1 durchgeführt, welches in Beispiel 1.3-(1) beschrieben wurde, außer dass 0,1 μg der doppelsträngigen cDNA, die von MABL-2 stammt, verwendet wurde, statt 0,1 μg der doppelsträngigen cDNA von MABL-1.
(4) Amplifzierung von cDNA, welche die H-Ketten-V-Region von MABL-2 kodiert
Der Adapterprimer-1 in SEQ ID Nr. 1 und der MHC-γ2a-Primer (Bio/Technology, 9, 88–89, 1991), welcher in SEQ ID Nr. 4 gezeigt ist, wurden als Primer für PCR verwendet.
Die Amplifizierung der cDNA wurde gemäß dem Verfahren der Amplifizierung des L-Ketten-V-Region-Gens durchgeführt, welches in Beispiel 1.3-(3) beschrieben wurde, außer dass 0,2 μM des MHC-γ2a-Primers statt 0,2 μM des MKC-Primers verwendet wurden.
1.4 Reinigung der PCR-Produkte
Das DNA-Fragment, welches durch PCR amplifiziert wurde, wie oben beschrieben wurde, wurde unter Verwendung des QIAquick PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen) gereinigt und in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), welches 1 mM EDTA enthält, gelöst.
1.5 Ligierung und Transformation
Ungefähr 140 ng des DNA-Fragmentes, das das Gen umfasst, welches die Maus-kappa-Typ L-Ketten-V-Region kodiert, welche von MABL-1 stammt, welches wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde mit 50 ng pGEM-T Easy vector (Promega) in dem Reaktionspuffer, welcher 30 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und 3 Einheiten T4 DNA-Ligase (Promega) bei 15°C für 3 Stunden ligiert.
Dann wurde 1 μl der Reaktionsmischung zu 50 μl kompetenten E. coli DH5α-Zellen (Toyobo Inc.) gegeben und die Zellen wurden für 30 Minuten auf Eis gelagert, bei 42°C für 1 Minute inkubiert und für 2 Minuten erneut auf Eis gelagert. 100 μl SOC-Medium (Gibco BRL) wurde zugegeben. Die Zellen der E. coli wurden auf LB (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Agarmedium ausplattiert, welches 100 μg/ml Ampicillin (Sigma) enthält und bei 37°C über Nacht kultiviert, um die von E. coli-Transformante zu gewinnen.
Die Transformante wurde in 3 ml LB-Medium, welches 50 μg/ml Ampicillin enthält bei 37°C über Nacht kultiviert und dann wurde die Plasmid-DNA aus der Kultur unter Verwendung des QIAprep-Spin-Miniprep-Kit (Qiagen) hergestellt.
Das erhaltene Plasmid, welches das Gen umfasst, welches die Maus-L-Ketten-V-Region vom kappa-Typ kodiert, die vom Hybridom MABL-1 stammt, wurde als pGEM-M1L bezeichnet.
Nach dem gleichen Verfahren, das oben beschrieben wurde, wurde ein Plasmid aus dem gereinigten DNA-Fragment hergestellt, welches das Gen umfasst, welches die Maus-H-Ketten-V-Region kodiert, welches vom Hybridom MABL-1 stammt, und als pGEM-M1H bezeichnet.
Ein Plasmid, welches das Gen umfasst, das die Maus-L-Ketten-V-Region vom kappa-Typ kodiert, welche vom Hybridom MABL-2 stammt, wurde aus dem gereinigten DNA-Fragment hergestellt und als pGEM-M2L bezeichnet.
Ein Plasmid, welches das Gen umfasst, das die Maus-H-Ketten-V-Region kodiert, die vom Hybridom MABL-2 stammt, wurde aus dem gereinigten DNA-Fragment hergestellt und als pGEM-M2H bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 2 (DNA-Sequenzierung)
Die Nucleotidsequenz der cDNA, welche die Region der oben erwähnten Plasmide kodiert, wurde unter Verwendung eines Auto-DNA-Sequenziergeräts (Applied Biosystem) und des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Die Nucleotidsequenz des Gens, welches die L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers MABL-1 kodiert, welche im Plasmid pGEM-M1L eingeschlossen ist, ist in SEQ ID Nr. 5 gezeigt.
Die Nucleotidsequenz des Gens, welches die H-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers MABL-1 kodiert, welche in dem Plasmid pGEM-M1H enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 6 gezeigt.
Die Nucleotidsequenz des Gens, welches die L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers MABL-2 kodiert, welche in dem Plasmid pGEM-M2L enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 7 gezeigt.
Die Nucleotidsequenz des Gens, welches die H-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers MABL-2 kodiert, welche in dem Plasmid pGEM-M2H enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 8 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3 (Bestimmung der CDR)
Die V-Regionen der L-Kette und H-Kette haben generell eine Ähnlichkeit in ihren Strukturen und alle vier Rahmenbereiche darin sind durch drei hypervariable Bereiche verbunden, d. h. Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDR). Eine Aminosäuresequenz des Rahmenbereichs ist relativ gut konserviert, während die Aminosäuresequenz des CDRs einen extrem hohen Variationsgrad hat (Kabat, E. A. et al., „Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Auf Grundlage dieser Tatsachen wurden die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche der Maus-monoklonalen Antikörper gegen menschliches IAP auf eine Datenbank aus Aminosäuresequenzen der Antikörper angewandt, die von Kabat et al. erstellt wurde, um deren Homologie zu untersuchen. Die CDR-Regionen wurden aufgrund der Homologie bestimmt, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Tabelle 1

Plasmid	SEQ ID Nr.	CDR (1)	CDR (2)	CDR (3)
pGEM-M1L	5	43–58	74–80	113–121
pGEM-M1H	6	50–54	69–85	118–125
pGEM-M2L	7	43–58	74–80	113–121
pGEM-M2H	8	50–54	69–85	118–125

Vergleichsbeispiel 4 (Identifizierung der klonierten cDNA-Expression (Herstellung eines chimären MABL-1-Antikörpers und eines chimären MABL-2-Antikörpers)
4.1 Herstellung von Vektoren, die den chimären MABL-1-Antikörper exprimieren
cDNA-Klone, pGEM-M1L und pGEM-M1H, welche die V-Region der L-Kette bzw. der H-Kette des Maus-Antikörpers MABL-1 kodieren, wurden durch das PCR-Verfahren modifiziert und in den HEF-Expressionsvektor ( WO 92/19759 ) eingeschleust, um Vektoren herzustellen, die den chimären MABL-1-Antikörper exprimieren.
Der Vorwärtsprimer MLS (SEQ ID Nr. 9) für die L-Ketten-V-Region und der Vorwärtsprimer MHS (SEQ ID Nr. 10) für den H-Ketten-V-Bereich wurden entworfen, um an eine DNA zu hybridisieren, welche den Beginn der Leadersequenz jeder V-Region kodiert, und die Kozak-Konsens-Sequenz (J. Mol. Biol., 196, 947–950, 1987), und eine HindIII-Restriktionsenzym-Schnittstelle enthält. Der Umkehrprimer MLAS (SEQ ID Nr. 11) für den L-Ketten-V-Bereich und der Umkehrprimer MHAS (SEQ ID Nr. 12) für den H-Ketten-V-Bereich wurden so entworfen, dass sie mit einer DNA hybridisieren, welche das Ende der J-Region kodiert und die Splice-Donor-Sequenz und eine BamHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle enthält.
100 μl einer PCR-Lösung umfassend 10 μl 10 × PCR-Puffer II, 2 mM MgCl₂, 0,16 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold, 0,4 μM jedes dieser Primer und 8 ng der Matrizen-DNA (pGEM-M1L oder pGEM-M1H) wurden auf die Anfangstemperatur für 9 Minuten auf 94°C vorgewärmt und dann für 1 Minute auf 94°C, für 1 Minute auf 60°C und für 1 Minute 20 Sekunden auf 72°C, in dieser Reihenfolge. Dieser Temperaturzyklus wurde 35 Mal wiederholt und dann wurde die Reaktionsmischung weiter für 10 Minuten auf 72°C erwärmt.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick-PCR-Purification Kit (Quiagen) gereinigt und dann mit HindIII und BamBI verdaut. Das Produkt aus der L-Ketten-V-Region wurde in den HEF-Expressionsvektor, HEF-κ, kloniert und das Produkt der H-Ketten-V-Region wurde in den HEF-Expressionsvektor HEF-γ kloniert. Nach der DNA-Sequenzierung werden Plasmide, die ein DNA-Fragment mit einer korrekten DNA-Sequenz enthalten, als HEF-M1L bzw. HEF-M1H bezeichnet.
4.2 Herstellung von Vektoren, welche die chimären MABL-1-Antikörper exprimieren
Die Modifizierung und Klonierung von cDNA wurde in gleicher Weise durchgeführt wie in Beispiel 4.1 beschrieben, außer dass pGEM-M2L und pGEM-M2H als Matrizen-DNA verwendet wurden statt pGEM-M1L und pGEM-M1H. Nach der DNA-Sequenzierung werden Plasmide, welche DNA-Fragmente mit korrekten DNA-Sequenzen enthalten, als HEF-M2L bzw. HEF-M2H bezeichnet.
4.3 Transfektion von COS7-Zellen
Die oben erwähnten Expressionsvektoren wurden in COS7-Zellen getestet, um die transiente Expression der chimären MABL-1- und MABL-2-Antikörper zu untersuchen.
(1) Transfektion mit Genen für den chimären MABL-1-Antikörper
COS7-Zellen wurden mit den HEF-MIL- und dem HEF-M1H-Vektoren durch Elektroporation unter Verwendung des Gene-Pulser-Apparats (BioRad) co-transformiert. Jede DNA (10 μg) und 0,8 ml PBS mit 1 × 10⁷ Zellen/ml wurden in eine Cuvette gegeben. Die Mischung wurde mit einem Puls bei 1,5 kV, 25 μF elektrischer Kapazität behandelt.
Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in DMEM Kulturmedium (Gibco BRL) überführt, welches 10% γ-Globulin-freies fötales Rinderserum enthält. Nach der Kultivierung für 72 Stunden wurde der Überstand eingesammelt, zentrifugiert, um alle Zellfragmente zu entfernen, und gewonnen.
(2) Transfektion mit Genen, welche den chimären MABL-2-Antikörper kodieren
Die Co-Transfektion mit den Genen, welche den chimären MABL-2-Antikörper kodieren, in COS7-Zellen wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4.3-(1) beschrieben durchgeführt, außer dass HEF-M2L- und HEF-M2H-Vektoren statt der HEF-MIL- und HEF-M1H-Vektoren verwendet wurden. Der Überstand wurde in gleicher Weise gewonnen.
4.4 Durchflusscytometrie
Die Durchflusscytometrie wurde unter Verwendung des oben erwähnten Kulturüberstandes der COS7-Zellen durchgeführt, um die Bindung an das Antigen zu messen. Der Kulturüberstand der COS7-Zellen, welche den chimären MABL-1-Antikörper exprimieren, oder der COS7-Zellen, welche den chimären MABL-2-Antikörper exprimieren, oder menschlicher IgG-Antikörper (Sigma) als Kontrolle wurde zu 4 × 10⁵ Zellen der Maus-Leukämie-Zelllinie L1210 gegeben, welche menschliches IAP exprimiert und auf Eis inkubiert. Nach dem Waschen wurde der FITC-markierte anti-Mensch-IgG-Antikörper (Cappel) hierzu gegeben. Nach der Inkubation und dem Waschen wurde die Fluoreszenzintensität davon unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen.
Da die chimären MABL-1- und MABL-2-Antikörper spezifisch an L1210-Zellen banden, welche menschliches IAP exprimieren, wird bestätigt, dass diese chimären Antikörper die richtigen Strukturen der V-Regionen der Maus-monoklonalen Antikörper MABL-1 bzw. MABL-2 haben (1–3).
Vergleichsbeispiel 5 (Herstellung des rekonstruierten einzelkettigen Fv (scFv) des Antikörpers MABL-1 und des Antikörpers MABL-2
5.1 Herstellung des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1
Der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-1 wurde wie folgt hergestellt. Die H-Ketten-V-Region und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers MABL-1, und ein Linker wurden jeweils durch das PCR-Verfahren amplifiziert und wurden verbunden, um den rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 herzustellen. Das Produktionsverfahren ist in 4 dargestellt. Sechs Primer (A-F) wurden für die Herstellung des einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 benutzt. Die Primer A, C, und E haben die Sinn-Sequenzen und die Primer B, E und F haben die Gegensinn-Sequenz.
Der Vorwärtsprimer VHS für die H-Ketten-V-Region (Primer A, SEQ ID Nr. 13) wurde so entworfen, dass er an eine DNA hybridisiert, welche den N-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert und eine NcoI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthält. Der Umkehrprimer VHAS für die H-Ketten-V-Region (Primer B, SEQ ID Nr. 14) wurde entworfen, damit er an die DNA hybridisiert, welche den C-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert und mit dem Linker überlappt.
Der Vorwärtsprimer LS für den Linker (Primer C, SEQ ID Nr. 15) wurde so entworfen, dass er mit einer DNA hybridisiert, welche den N-Terminus des Linkers kodiert und mit einer DNA überlappt, welche den C-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert. Der Umkehrprimer LAS für den Linker (Primer D, SEQ ID Nr. 16) wurde so entworfen, dass er mit einer DNA hybridisiert, welche den C-Terminus des Linkers kodiert und mit einer DNA überlappt, welche den N-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert.
Der Vorwärtsprimer VLS für die L-Ketten-V-Region (Primer E, SEQ ID Nr. 17) wurde so entworfen, dass er mit einer DNA hybridisiert, die den C-Terminus des Linkers kodiert und mit einer DNA, welche den N-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert, überlappt. Der Umkehrprimer VLAS-FLAG für die L-Ketten-V-Region (Primer F, SEQ ID Nr. 18) wurde so entworfen, dass er mit einer DNA hybridisiert, welche den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert und eine Sequenz hat, welche das FLAG-Peptid (Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204–1210, 1988), zwei Stop-Kodons und eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle kodiert.
In dem ersten PCR-Schritt wurden drei Reaktionen, A-B, C-D und E-F, durchgeführt und die PCR-Produkte daraus wurden gereinigt. Drei PCR-Produkte, die in dem ersten PCR-Schritt gewonnen wurden, wurden aufgrund ihrer Komplementarität zusammengebaut. Dann wurden die Primer A und F hinzugegeben und die DNA vollständiger Länge, welche den rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 kodiert, wurde amplifiziert (zweite PCR). In der ersten PCR wurden das Plasmid pGEM-M1H, welches die H-Ketten-V-Region des Antikörpers MABL-1 kodiert (siehe Beispiel 2), das Plasmid pSC-DP1, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welches einen Linkerbereich kodiert, der umfasst: Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID Nr. 19) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879–5883, 1988) und das Plasmid pGEM-M1L, welches die L-Ketten-V-Region des Antikörpers MABL-1 kodiert (siehe Beispiel 2) jeweils als Matrize verwendet.
50 μl der Lösung des ersten PCR-Schrittes umfasst 5 μl 10 × PCR-Puffer II, 2 mM MgCl₂, 0,16 mM dNTPs, 2,5 Einheiten DNA-Polymerase, AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), 0,4 μM jedes der Primer und 5 ng jeder Matrizen-DNA. Die PCR-Lösung wurde bei 94°C Anfangstemperatur für 9 Minuten vorgewärmt und dann in dieser Reihenfolge für 1 Minute auf 94°C erwärmt, für 1 Minute auf 65°C und für 1 Minute und 20 Sekunden auf 72°C. Dieser Temperaturzyklus wurde 35 Mal wiederholt und dann wurde die Reaktionsmischung weiter für 7 Minuten bei 72°C erwärmt.
Die PCR-Produkte A-B (371 bp), C-D (63 bp) und E-F (384 bp) wurden unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen) gereinigt und wurden in der zweiten PCR zusammengebaut. In der zweiten PCR wurden 98 μl der PCR-Lösung, welche 120 ng des ersten PCR-Produktes A-B umfasst, 20 ng des PCR-Produktes C-D und 120 ng des PCR-Produktes E-F, 10 μl des 10 × PCR-Puffers II, 2 mM MgCl₂, 0,16 mM dNTPs, 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) auf 94°C für 8 Minuten auf die Anfangstemperatur vorgewärmt und dann für 2 Minuten auf 94°C, für 2 Minuten auf 65°C und für 2 Minuten auf 72°C, in dieser Reihenfolge erwärmt. Dieser Temperaturzyklus wurde zweimal wiederholt und dann wurden jeweils 0,4 μM der Primer A und F zur Reaktion gegeben. Die Mischung wurde auf 94°C der Anfangstemperatur für 1 Minute vorgewärmt und dann für 1 Minute bei 94°C, bei 65°C für 1 Minute und bei 72°C für 1 Minute und 20 Sekunden erwärmt, wobei diese Reihenfolge beachtet wurde. Dieser Temperaturzyklus wurde 35 Mal wiederholt und dann wurde die Reaktionsmischung weiter für 7 Minuten auf 72°C erwärmt.
Ein DNA-Fragment aus 842 bp, welches in der ersten PCR produziert wurde, wurde gereinigt und mit NcoI und EcoRI verdaut. Das daraus hervorgehende DNA-Fragment wurde in den pSCFVT7-Vektor kloniert. Der Expressionsvektor pSCFVT7 enthält eine pelB-Signalsequenz, welche für das periplasmatische Expressionssystem in E. coli (Lei, S. P. et al., J. Bacteriology, 169, 4379–4383, 1987) geeignet ist. Nach der DNA-Sequenzierung wurde ein Plasmid, welches das DNA-Fragment enthält, welches die korrekte Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 kodiert, als „pscM1" (siehe 5) bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1, welcher in dem Plasmid pscM1 enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 20 gezeigt.
Der pscM1-Vektor wurde durch das PCR-Verfahren modifiziert, um einen Vektor herzustellen, welcher die rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-1 in Säugerzellen exprimiert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den pCHO1-Expressionsvektor eingeschleust. Dieser Expressionsvektor, pCHO1, wurde durch den Verdau von DHFR-ΔE-rvH-PM1-f ( WO 92/19759 ) mit EcoRI und SmaI hergestellt, um das Antikörpergen zu eliminieren und den EcoRI-NotI-BamHI-Adapter (Takara Shuzo) damit zu verbinden.
Als Vorwärtsprimer für die PCR wurde der Sal-VHS-Primer, welcher in SEQ ID Nr. 22 gezeigt ist, so entworfen, dass er mit einer DNA hybridisiert, welche den N-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert und eine SalI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthält. Als Umkehrprimer für die PCR wurde der FRH1-Antiprimer, welcher in SEQ ID Nr. 22 gezeigt ist, entworfen, um mit einer DNA zu hybridisieren, welche das Ende der ersten Rahmenbereichssequenz kodiert.
100 μl der PCR-Lösung, umfassend 10 μl 10 × PCR-Puffer II, 2 mM MgCl₂, 0,16 mM dNTPs, 5 Einheiten DNA-Polymerase, AmpliTaq Gold, 0,4 μl jedes der Primer und 8 ng der Matrizen-DNA (pscM1), wurden auf 95°C Anfangstemperatur für 9 Minuten vorgewärmt und dann für 1 Minute auf 95°C, für 1 Minute auf 60°C und für 1 Minute und 20 Sekunden auf 72°C erwärmt, wobei diese Reihenfolge beachtet wurde. Dieser Temperaturzyklus wurde 35 Mal wiederholt und dann wurde die Reaktionsmischung für 7 Minuten weiter bei 72°C erwärmt.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick PCR-Purification-Kit (Quiagen) gereinigt und mit SalI und MboII verdaut, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, welches den N-Terminus des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 kodiert. Der pscM1-Vektor wurde mit MboII und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, welches den C-Terminus des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1 kodiert. Das SalI-MboII-DNA-Fragment und das MboII-EcoRI-DNA-Fragment wurden dann in den pCHO1-Igs-Vektor kloniert. Nach der Sequenzierung der DNA wurde ein Plasmid, welches die gewünschte DNA-Sequenz umfasst, als „pCHOM1" bezeichnet (siehe 6). Der Expressionsvektor pCHO1-Igs enthält eine Maus-IgGl-Signalsequenz, welche für das Sekretions-Expressionssystem in Säugerzellen geeignet ist (Nature, 322, 323–327, 1988). Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-1, welches in dem Plasmid pCHOM1 enthalten ist, wird in SEQ ID Nr. 23 gezeigt.
5.2 Herstellung eines rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2
Der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 wurde gemäß dem oben erwähnten Beispiel 5.1 hergestellt. In dem ersten PCR-Schritt wurde das Plasmid pGEM-M2H, das die H-Ketten-V-Region des MABL-2 kodiert (siehe Beispiel 2) statt pGEM-M1H sowie das Plasmid pGEM-M2L, das die L-Ketten-V-Region des MABL-2 (siehe Beispiel 2) kodiert, statt pGEM-M1L benutzt, um das Plasmid pscM2 zu gewinnen, welches ein DNA-Fragment umfasst, das die gewünschte Aminosäuresequenz des einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 kodiert. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2, das in dem Plasmid pscM2 enthalten ist, sind in SEQ ID Nr. 24 gezeigt.
Der pscM2-Vektor wurde durch das PCR-Verfahren modifiziert, um den Vektor pCHOM2 für die Expression in Säugerzellen herzustellen, welcher das DNA-Fragment enthält, welches die korrekte Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 kodiert. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2, welcher im Plasmid pCHOM2 enthalten ist, sind in SEQ ID Nr. 25 gezeigt.
5.3 Transfektion in COS7-Zellen
Der pCHOM2-Vektor wurde in COS7-Zellen darauf getestet, die transiente Expression des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 zu beobachten.
Die COS7-Zellen wurden mit dem pCHOM2-Vektor durch Elektroporation unter Verwendung des Gene-Pulser-Apparats (BioRad) transformiert. Die DNA (10 μg) und 0,8 ml PBS mit 1 × 10⁷ Zellen/ml wurden in eine Cuvette gegeben. Das Gemisch wurde mit einem Puls von 1,5 kV, 25 μF elektrischer Kapazität behandelt.
Nach einer Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in IMDM-Kulturmedium (Gibco BRL) überführt, welches 10% fötales Rinderserum enthält. Nach dem Kultivieren für 72 Stunden wurde der Überstand eingesammelt und zentrifugiert, um die Zellfragmente zu entfernen und gewonnen.
5.4 Nachweis des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 in Kulturüberstand der COS7-Zellen
Das Vorhandensein des einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 im Kulturüberstand von COS7-Zellen, welche mit dem pCHOM2-Vektor transfiziert worden waren, wurde durch das Western-Blot-Verfahren bestätigt.
Der Kulturüberstand der COS7-Zellen, welche mit dem pCHOM2-Vektor transfiziert waren, und der Kulturüberstand von COS7-Zellen, die mit dem pCHO1 als Kontrolle transfiziert wurden, wurde einer SDS-Elektrophorese unterworfen und auf eine Reinforced-NC-Membran (Schleicher & Schuell) transferiert. Die Membran wurde mit 5% Magermilch (Morinaga Nyu-gyo) blockiert, mit 0,05% Tween 20-PBS gewaschen und mit einem Anti-FLAG-Antikörper (Sigma) gemischt. Die Membran wurde bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und mit alkalischer Phosphatase konjugierten Maus-IgG-Antikörpern (Zymed) gemischt. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde die Substratlösung (Kirkegaard Perry Laboratories) hinzugegeben, um die Farbe zu entwickeln (7).
Ein FLAG-Peptid-spezifisches Protein wurde nur in dem Kulturüberstand der COS7-Zellen, in die der pCHOM2-Vektor eingeschleust worden war, nachgewiesen, und dadurch wurde bestätigt, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 in diesen Kulturüberstand sezerniert wurde.
5.5 Durchflusscytometrie
Die Durchflusscytometrie wurde unter Verwendung der oben erwähnten COS7-Zellkultur-Überstände durchgeführt, um das Binden an das Antigen zu messen. Der Kulturüberstand der COS7-Zellen, welche den rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 exprimieren, oder der Kulturüberstand der COS7-Zellen, welche mit dem pCHO1-Vektor als Kontrolle transformiert worden waren, wurde zu 2 × 10⁵ Zellen der Maus-Leukämie-Zelllinie L1210 gegeben, welche das menschliche Integrin assoziierte Protein (IAP) exprimieren, oder zur Zelllinie L1210, welche mit pCOS1 als Kontrolle transformiert worden war. Nach dem Inkubieren auf Eis und dem Waschen wurde der Maus-Anti-FLAG-Antikörper (Sigma) hinzugegeben. Dann wurden die Zellen inkubiert und gewaschen. Dann wurde ein FITC-markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (Becton Dickinson) hinzugegeben, und die Zellen wurden erneut inkubiert und gewaschen. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität unter Verwendung des FACScan-Apparts (Becton Dickinson) gemessen.
Da der einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 spezifisch an L1210-Zellen gebunden war, welche menschliches IAP exprimieren, wurde bestätigt, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 eine Affinität für menschliches Integrin-assoziiertes Protein (IAP) hat (siehe 8–11).
5.6 Kompetitions-ELISA
Die Bindungsaktivität des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 wurde auf Grundlage der inhibierenden Aktivität gegenüber der Bindung des Maus-monoklonalen Antikörpers für dieses Antigen gemessen.
Der auf 1 μg/ml eingestellte Anti-FLAG-Antikörper wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wurde eine Blockierung mit 1% BSA-PBS durchgeführt. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde der Kulturüberstand von COS7-Zellen, in die das menschliche IAP-Antigen-Gen vom sezernierten Typ (SEQ ID Nr. 26) eingeschleust worden war, mit PBS in einem zweifachen Volumen verdünnt und in jede Vertiefung gegeben. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde eine Mischung aus 50 μl des biotinylierten MABL-2-Antikörpers, welcher auf 100 ng/ml eingestellt worden war, und 50 μl eines sequenziell verdünnten Überstandes der COS7-Zellen, welche den rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 exprimieren, in jede Vertiefung gegeben. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde alkalische Phosphatase-konjugiertes Streptavidin (Zymed) in jede Vertiefung gegeben. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde die Substratlösung (Sigma) zugegeben und die Absorption der Reaktionsmischung in jeder Vertiefung wurde bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse zeigten, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 (MABL2-scFv) tatsächlich konzentrationsabhängig die Bindung des Maus-Antikörpers MABL-2 an menschliches IAP-Antigen inhibierte, verglichen mit dem Kulturüberstand der pCHO1-behandelten COS7-Zellen als Kontrolle (12). Daher wird vermutet, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 die korrekte Struktur jeder der V-Regionen des Maus-monoklonalen Antikörpers MABL-2 besitzt.
5.7 Apoptose-induzierende Wirkung in vitro
Die Apoptose-induzierende Wirkung des rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 wurde durch eine Annexin-V-Färbung (Boehringer Mannheim) unter Verwendung von L1210-Zellen untersucht, welche mit dem menschlichen IAP-Gen transfiziert sind, wobei die L1210-Zellen mit dem pCOS1-Vektor als Kontrolle transfiziert waren und CCRF-CEM-Zellen verwendet wurden.
Zu jeder der 1 × 10⁵-Zellen der oben erwähnten Zellen wurde der Kulturüberstand der COS7-Zellen gegeben, welche den rekonstruierten einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 exprimieren, oder der Kulturüberstand von COS7-Zellen, welche als Kontrolle mit dem pCHO1-Vektor transfiziert worden waren, in einer 50%igen finalen Konzentration, und die Mischungen wurden für 24 Stunden kultiviert. Dann wurde eine Annexin-V-Färbung durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen.
Die Ergebnisse der Annexin-V-Färbung werden in 13–18 gezeigt. Die Punkte in dem unteren linken Bereich stellen lebende Zellen dar und die Punkte in dem rechten unteren Bereich stellen Zellen dar, die sich im Frühstadium der Apoptose befinden, und die Punkte in der rechten oberen Region stellen Zellen im späten Stadium der Apoptose dar. Die Ergebnisse zeigen, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 (MABS2-scFv) Zelltod von L1210-Zellen spezifisch gegen menschliches IAP-Antigen nachweisbar induzierte (13–16), und dass der rekonstruierte einzelkettige Fv verglichen mit der Kontrolle ebenfalls einen nachweisbaren Zelltod in CCRF-CEM-Zellen induzierte (17–18).
5.8 Expression von einzelkettigen Fv, die von MABL-2 abstammen in CHO-Zellen
CHO-Zellen wurden mit dem pCHOM2-Vektor transfiziert, um eine CHO-Zelllinie zu etablieren, welche konstant den einzelkettigen Fv (Polypeptid) exprimiert, der vom Antikörper MABL-2 stammt.
CHO-Zellen wurden mit dem pCHOM2-Vektor durch Elektroporation unter Verwendung des Gene-Pulser-Apparats (BioRad) transformiert. Eine Mischung aus DNA (10 μg) und 0,7 ml PBS mit CHO-Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml) wurden in eine Cuvette gegeben. Die Mischung wurde mit einem Puls bei 1,5 kV, 25 μF elektrischer Kapazität behandelt. Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in Nucleinsäure-freies α-MEM-Medium (Gibco BRL) gegeben, welches 10% fötales Rinderserum enthält und kultiviert. Die Expression des gewünschten Proteins in den erhaltenen Klonen wurde durch SDS-PAGE bestätigt und ein Klon mit hohem Expressionsniveau wurde als Zelllinie ausgewählt, welche einen einzelkettigen Fv produziert, der vom Antikörper MABL-2 abstammt. Die Zelllinie wurde in Serum-freiem Medium CHO-S-SFM II (Gibco BRL) kultiviert, welches 10 nM Methotrexat (Sigma) enthält. Dann wurde der Kulturüberstand eingesammelt, zentrifugiert, um die Zellfragmente zu entfernen und zurückgewonnen.
5.9 Reinigung von einzelkettigen Fv, die von MABL-2 stammen, welche in CHO-Zellen produziert werden
Der Kulturüberstand der CHO-Zelllinie, welche den einzelkettigen Fv exprimiert, welcher in Beispiel 5.8 gewonnen wurde, wurde unter Verwendung einer Patrone zur künstlichen Dialyse (PAN130SF, Asahi Medicals) 20-fach aufkonzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde bei –20°C gelagert und für die Reinigung aufgetaut.
Die Reinigung des einzelkettigen Fv und des Kulturüberstands der CHO-Zellen wurde unter Verwendung von drei Arten von Chromatographie durchgeführt, d. h. mit Blue-Sepharose, Hydroxyapatit und Gelfiltration.
(1) Blue-Sepharose-Säulenchromatographie
Der konzentrierte Überstand wurde 10-fach mit 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) verdünnt und zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen (10.000 UpM, 30 Minuten). Der Überstand wurde auf eine Blue-Sepharose-Säule (20 ml) gegeben, welche mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurden an der Säule adsorbierte Proteine in einen schrittweisen Gradienten aus NaCl im gleichen Puffer bei 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 bis zu 1,0 M eluiert. Die Durchflussfraktion jeder eluierten Fraktion wurde mittels SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, in denen eine einzelkettige Fv nachgewiesen wurde (Fraktion, die bei 0,1 bis 0,3 M NaCl eluierten) wurden zusammengegeben und unter Verwendung von CentriPrep-10 (Amicon) ungefähr 20-fach aufkonzentriert.
(2) Hydroxyapatit
Die konzentrierte Lösung, die in (1) gewonnen worden war, wurde 10-fach mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt und auf eine Hydroxyapaptit-Säule (20 ml, BioRad) gegeben. Die Säule wurde mit 60 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Dann wurden Proteine, die an die Säule adsorbierten, durch einen linearen Gradienten eines Natriumphosphatpuffers bis zu 200 mM (siehe 19) eluiert. Die Analyse jeder Fraktion mittels SDS-PAGE zeigte den einzelkettigen Fv in Fraktion A und Fraktion B.
(3) Gelfiltration
Jede der Fraktionen A und B in (2) wurde separat mit CentriPrep-10 aufkonzentriert und auf eine TSKgel-G300SWG-Säule (21,5 × 600 mm) aufgetragen, welche mit 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) äquilibriert worden war, welcher 0,15 m NaCl enthält. Die Chromatogramme sind in 20 gezeigt. Die Analyse der Fraktion mittels SDS-PAGE zeigte, dass beide Haupt-Peaks (AI und BI) vom gewünschten einzelkettigen Fv stammen. In der Gelfiltrations-Analyse wurde die Fraktion A bei 36 kDa mit einem scheinbaren Molekulargewicht eluiert und die Fraktion B wurde bei 76 kDa eluiert. Die gereinigten einzelkettigen Fvs (AI, BI) wurden mit einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Die Proben wurden in Gegenwart oder Abwesenheit eines Reduktionsmittels behandelt und die Elektrophorese wurde gemäß dem Laemmli-Verfahren durchgeführt. Dann wurde das Protein mit Coomassie-Brilliant-Blue gefärbt. Wie in 21 gezeigt ist, ergaben sowohl AI und BI eine einzelne Bande bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 35 kDA, unabhängig von der Abwesenheit oder des Vorhandenseins des Reduktionsmittels. Daher wird geschlossen, dass AI ein Monomer des einzelkettigen Fv ist und BI das nicht kovalent gebundene Dimer des einzelkettigen Fv. Die Gelfiltrations-Analyse der Fraktionen AI und BI mit TSKgel-G300SW-Säule (7,5 × 60 mm) zeigte, dass ein Peak des Monomers nur in der Fraktion AI nachgewiesen wird und ein Peak des Dimers nur in der Fraktion BI nachgewiesen wird (22). Die Dimerfraktion (Fraktion BI) machte ungefähr 4 Prozent (%) der gesamten einzelkettigen Fvs aus. Mehr als 90% des Dieners in der Dimerfraktion wurden für mehr als einen Monat bei 4°C stabil konserviert.
5.10 Konstruktion eines Vektors, welcher einen einzelkettigen Fv, der vom Antikörper MABL-2 stammt in einer Escherichia coli-Zelle exprimiert
Der pscM2-Vektor wurde durch das PCR-Verfahren modifiziert, um einen Vektor herzustellen, welcher effizient den einzelkettigen Fv des Antikörpers MABL-2 in E. coli-Zellen exprimiert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den pSCFVT7-Expressionsvektor eingeschleust.
Als Vorwärtsprimer für die PCR wurde der Nde-VHSm02-Primer, welcher in SEQ ID Nr. 27 gezeigt ist, entworfen, um an eine DNA zu hybridisieren, welche den N-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert und einen Startkodon und die NdeI-Restriktionsenzym-Erkennungsschnittstelle enthält. Als Umkehrprimer für die PCR wurde der VLAS-Primer, welcher in SEQ ID Nr. 28 gezeigt ist, entworfen, um an eine DNA zu hybridisieren, welche den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert und zwei Stopkodons und eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthält. Der Vorwärtsprimer, Nde-VHSm02, umfasst fünf Punktmutationen in dem Teil, welcher mit der DNA hybridisiert, welche den N-Terminus der H-Ketten-V-Region für die wirksame Expression in E. coli kodiert.
100 μl einer PCR-Lösung, umfassend 10 μl 10 × PCR-Puffer #1, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 5 Einheiten KOD-DNA-Polymerase (alle von Toyobo), 1 μM jedes Primers und 100 ng der Matrizen-DNA (pscM2) wurden in dieser Reihenfolge für 15 Sekunden auf 98°C erwärmt, für 2 Sekunden auf 65°C und für 30 Sekunden auf 74°C. Dieser Temperaturzyklus wurde 25 Mal wiederholt.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick-PCR-Reinigungs-Kit (Qiagen) gereinigt und mit NdeI und EcoRI verdaut, und dann wurde das erhaltene DNA-Fragment in den pSCFVT7-Vektor kloniert, von dem die pelB-Signalsequenz durch den Verdau mit NdeI und EcoRI eliminiert worden war. Nach der DNA-Sequenzierung wird das Plasmid, welches ein DNA-Fragment mit der gewünschten DNA-Sequenz umfasst, als „pscM2Dem02" bezeichnet (siehe 23). Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des einzelkettigen Fv, welcher vom Antikörper MABL-2 abstammt, der im Plasmid pscM2Dem02 enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 29 gezeigt.
5.11 Expression des einzelkettigen Fv, der vom Antikörper MABL-2 abstammt in E. coli-Zellen
E. coli BL21 (DE3)pLysS (Stratagene) wurden mit pscM2Dem02-Vektor transformiert, um einen E. coli-Stamm zu gewinnen, welcher die einzelkettigen Fv exprimiert, die vom Antikörper MABL-2 stammen. Die erhaltenen Klone wurden hinsichtlich der Expression des gewünschten Proteins unter Verwendung von SDS-PAGE untersucht, und ein Klon mit einem hohen Expressionsniveau wurde als ein Stamm ausgewählt, welcher den einzelkettigen Fv produziert, der vom Antikörper MABL-2 stammt.
5.12 Reinigung des einzelkettigen Fv, der vom MABL-2-Antikörper stammt, welcher in E. coli hergestellt wird
Eine einzelne Kolonie der E. coli, welche durch die Transformation gewonnen wurden, wurde in 3 ml LB-Medium bei 28°C für 7 Stunden kultiviert und dann in 70 ml LB-Medium bei 28°C über Nacht.
Diese Präkultur wurde in 7 l LB-Medium überführt und bei 28°C unter Rühren bei 300 UpM unter Verwendung des Fassfermenters kultiviert. Wenn die Absorption des Mediums eine O.D. von = 1,5 erreichte, wurden die Bakterien mit 1 mM IPTG induziert und dann für 3 Stunden kultiviert.
Das Kulturmedium wurde zentrifugiert (10.000 × g, 10 Minuten) und die präzipitierten Bakterien wurden gewonnen. Zu den Bakterien wurden 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben, welcher 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl und 1% Triton X-100 enthält, und die Bakterien wurden durch Ultraschall aufgeschlossen (Output: 4, Dutycyle: 70%, 1 Minute × 10 Mal). Die Suspension der aufgeschlossenen Bakterien wurde zentrifugiert (12.000 × g, 10 Minuten), um die Einschlusskörperchen zu präzipitieren. Die isolierten Einschlusskörperchen wurden mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gemischt, der 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl und 4% Triton X-100 enthält, mit Ultraschall behandelt (Output: 4, Dutycycle: 50%, 30 Sekunden × 2 Mal) wieder und zentrifugiert (12.000 × g, 10 Minuten), um das gewünschte Protein als Präzipitat zu isolieren, und um die kontaminierenden Proteine, die im Überstand eingeschlossen sind, zu entfernen.
Die Einschlusskörperchen umfassen das gewünschte Protein und wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) lysiert, der 6 M Harnstoff, 5 mM EDTA und 0,1 M NaCl enthält, und auf eine Sephacryl S-300-Gelfiltrations-Säule (5 × 90 cm, Amersham Pharmacia) aufgetragen, welche mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (ph 8,0) äquilibriert war, der 4 M Harnstoff, 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl und 10 mM Mercaptoethanol enthält bei einer Fließrate von 5 ml/Minute, um assoziierte einzelkettige Fvs mit hohem Molekulargewicht zu entfernen. Die gewonnenen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Fraktionen mit hoher Reinheit des Proteins wurden mit dem Puffer, der in der Gelfiltration verwendet wurde, bis zu einer O.D.₂₈₀ = 0,25 verdünnt. Dann wurden die Fraktionen dreimal gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert, der 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 0,5 M Arg, 2 mM Glutathion in der reduzierten Form und 0,2 mM Glutathion in oxidierter Form enthält, um das Protein rückzufalten. Des Weiteren wurde die Fraktion dreimal gegen 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) dialysiert, der 0,15 M NaCl enthält, um den Puffer auszutauschen.
Das Dialysat-Produkt wurde auf eine Superdex 200 pg Gelfiltrations-Säule (2,6 × 60 cm, Amersham Pharmacia) aufgetragen, die mit 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) äquilibriert war, der 0,15 M NaCl enthält, um eine geringe Menge an Protein mit hohem Moleklulargewicht zu entfernen, welches intramolekular durch S-S-Bindungen vernetzt war. Wie in 24 gezeigt ist, wurden zwei Peaks, Haupt- und Neben-Peaks, nach den breiten Peaks eluiert, welche erwartungsgemäß einem Aggregat mit einem hohen Molekulargewicht zugeordnet wurden. Die Analyse mittels SDS-PAGE (siehe 21) und die Eluierunsposition der zwei Peaks in der Gelfiltrations-Analyse lässt vermuten, dass der Hauptpeak dem Monomer des einzelkettigen Fv entspricht und der Nebenpeak dem des nicht kovalenten kovalent gebundenen Dimers des einzelkettigen Fv entspricht. Das nicht kovalent gebundene Dimer machte 4% der gesamten einzelkettigen Fvs aus.
5.13 Apoptose-induzierende Aktivität in vitro durch den einzelkettigen Fv, welcher vom Antikörper MABL-2 stammt
Die Apoptose-induzierende Wirkung des einzelkettigen Fv, der vom Antikörper MABL-2 (MABL2-scFv) stammt, welcher durch CHO-Zellen und E. coli hergestellt wird, wurde nach zwei Protokollen mit der Annexin-V-Färbung (Boehringer Mannheim) unter Verwendung der L1210-Zellen untersucht, in die das menschliche IAP-Gen eingeschleust worden ist.
In der ersten Protokollprobe wurden Antikörper in einer Endkonzentration von 3 μg/ml zu 5 × 10⁴ Zellen der hIAP/L1210-Zelllinie gegeben und für 24 Stunden kultiviert.
Die Proben-Antikörper, d. h. das Monomer und das Dimer des einzelkettigen Fv des MABL-2 der CHO-Zellen, welche in Beispiel 5.9 gewonnen wurden, das Monomer und das Dimer des einzelkettigen Fv, das MABL-2 von E. coli, welches in Beispiel 5.12 gewonnen wurde, und der Maus-IgG-Antikörper als Kontrolle wurden analysiert. Nach dem Kultivieren wurde eine Annexin-V-Färbung durchgeführt und die Fluoreszenzintensität davon wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen.
In dem zweiten Protokoll wurden die Proben-Antikörper in einer Endkonzentration von 3 μg/ml zu 5 × 10⁴ Zellen der hIAP/L1210-Zelllinie gegeben, für 2 Stunden kultiviert und mit dem Anti-FLAG-Antikörper (Sigma) in einer Endkonzentration von 15 μg/ml gemischt und weiter für 22 Stunden kultiviert. Die Proben-Antikörper des Monomers des einzelkettigen Fv von MABL-2 der CHO-Zellen, welche in Beispiel 5.9 gewonnen wurden und der Maus-IgG-Antikörper als Kontrolle wurden analysiert. Nach der Kultivierung wurde die Annexin-V-Färbung durchgeführt und die Fluoreszenzintensität davon wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats gemessen.
Die Ergebnisse der Analysen der Annexin-V-Färbung sind in den 25–31 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dimere des einzelkettigen Fv-Polypeptids von MABL-2, welche in den CHO-Zellen und in E. coli hergestellt wurden, in beachtlicher Form Zelltod induzierten (26, 27), verglichen mit der Kontrolle (25), während keine Apoptose-induzierende Wirkung bei den Monomeren des einzelkettigen Fv-Polypeptids von MABL-2 beobachtet wurde, welche in CHO-Zellen und E. coli-Zellen produziert wurden (28, 29). Wenn der Anti-FLAG-Antikörper zusammen verwendet wurde, induzierte das Monomer des einzelkettigen Fv-Polypeptids, das vom Antikörper MABL-2 stammt, und welches in den CHO-Zellen hergestellt wurde, merklichen Zelltod (31), verglichen mit der Kontrolle (30).
5.14 Antitumorwirkung des Monomers und des Dimers von scFv/CHO Polypeptid mit einer Modellmaus für das menschliche Myelom
(1) Quantitative Messung an menschlichem IgG-Maus-Serum
Die Messung von humanem IgG (M-Protein), welches von einer menschlichen Myelomzelle hergestellt wird und in Maus-Serum enthalten ist, wurde durch den folgenden ELISA durchgeführt. 100 μl des Ziege-Anti-Mensch-IgG-Antikörpers (Biosource, Lot#7902), welche auf 1 μg/ml mit 0,1% Bicarbonatpuffer (pH 9,6) verdünnt war, wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte (Nunc) gegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert, so dass der Antikörper immobilisiert wurde. Nach der Blockierung wurden 100 μl des schrittweise verdünnten Maus-Serums oder menschliches IgG (Cappel, Lot#00915) als Standard in jede Vertiefung gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde mit alkalischer Phosphatase markierter anti-Mensch-IgG-Antikörper (Biosource, Lot#6202), welcher 5.000-fach verdünnt worden war, zugegeben, und die Inkubation wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach dem Waschen wurde eine Substratlösung zugegeben. Nach der Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm unter Verwendung des Microplate-Reader-Modells 3550 (BioRad) gemessen. Die Konzentration an menschlichem IgG im Maus-Serum wurde auf Grundlage der Calibrierungskurve berechnet, die aus den Absorptionswerten des menschlichen IgG als Standard gewonnen wurde.
(2) Herstellung von Antikörpern zur Verabreichung
Das Monomer und das Dimer des scFv/CHO-Polypeptids wurde am Tag der Verabreichung jeweils auf 0,4 mg/ml oder 0,25 mg/ml mit steril filtriertem PBS(–) verdünnt, um Proben zur Verabreichung herzustellen.
(3) Herstellung eines Mausmodells für menschliche Myelome
Ein Mausmodell für menschliche Myelome wurde wie folgt hergestellt. KPMM2-Zellen, die in vivo (JP-Appl. 7-236475) in einer SCID-Maus (Japan Clare) passagiert wurden, wurden in RPMI1640-Medium (Gibco-BRL) suspendiert, welches 10% fötales Rinderserum (Gibco-BRL) enthält und auf 3 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt. 200 μl der KPMM2-Zellsuspension (6 × 10⁶ Zellen/Maus) wurden über die Caudalvene in eine SCID-Maus (männlich, 6 Wochen alt) transplantiert, welcher subkutan der Asialo-GMI-Antikörper (Wako Junyaku, 1 Gefäß wurde in 5 ml gelöst) am Tag vor der Transplantation injiziert wurde.
(4) Verabreichung von Antikörpern
Die Proben der Antikörper, die in (2) hergestellt wurden, das Monomer (250 μl) und das Dimer (400 μl) wurden in die Modellmaus des menschlichen Myeloms, welche in (3) hergestellt worden war, über die Caudalvene verabreicht. Die Verabreichung wurde drei Tage nach der Transplantation von KPMM2-Zellen begonnen und wurde zweimal täglich für drei Tage durchgeführt. Als Kontrolle wurde 200 μl steril filtriertes PBS(–) ebenfalls zweimal am Tag für drei Tage über die Kaudalvene verabreicht. Jede Gruppe bestand aus sieben Mäusen.
(5) Untersuchung der Anti-Tumor-Wirkung des Monomers und des Dimers von scFv/CHO-Polypeptid mit der Modellmaus für das menschliche Myelom
Die Antitumorwirkung des Monomers und des Dimers des scFv/CHO-Polypeptids in der Modellmaus für ein menschliches Myelom wurde in Bezug auf die Änderung des menschlichen IgG (M-Protein) Konzentration im Maus-Serum und der Überlebensrate der Mäuse beurteilt. Die Änderung der menschlichen IgG-Konzentration wurde durch Messen mittels ELISA, wie oben beschrieben in (1), im Maus-Serum bestimmt, welches 24 Tage nach der Transplantation von KPMM2-Zellen gesammelt wurde. Die Menge an humanem IgG (M-Protein) im Serum der mit PBS(–)-verabreichten Gruppe (Kontrolle) stieg auf ungefähr 8.500 μg/ml, während die Menge an humanem IgG der mit scFv/CHO-Dimer-verabreichten Gruppe merklich niedriger war, d. h., nur ein Zehntel oder weniger als in der Kontrollgruppe. So zeigen die Ergebnisse, dass der Dimer von scFv/CHO das Wachstum der KPMM2-Zellen stark inhibierte (32). Wie in 33 gezeigt ist, wurde eine merkliche Verlängerung der Überlebensdauer in der mit scFv/CHO-Dimer-verabreichten Gruppe im Vergleich mit der PBS(–)-verabreichten Gruppe beobachtet.
Auf Grundlage des oben gesagten wird bestätigt, dass das Dimer aus scFv/CHO eine Anti-Tumor-Wirkung in menschlichen Myelom-Modellmäusen hat. Es wird davon ausgegangen, dass die Anti-Tumor-Wirkung des Dimers von scFv/CHO, des modifizierten Antikörpers der Erfindung, aus der Apoptose-induzierenden Wirkung des modifizierten Antikörpers hervorgeht.
5.15 Hämagglutinierungstest
Der Hämagglutinierungstest und die Bestimmung der Hämagglutinierung wurde in Übereinstimmung mit „Immuno-Biochemical Investigation", Zoku-Seikagaku Jikken Koza, herausgegeben von der Biochemical Society von Japan, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, durchgeführt.

Einem gesunden Donor wurde unter Verwendung von Heparin-behandelten Spritzen Blut abgenommen und dreimal mit PBS(–) gewaschen, und dann wurde eine Erythrocyten-Suspension mit einer Endkonzentration von 2% in PBS(–) hergestellt. Testproben waren der Antikörper MABL-2, das Monomer und das Dimer des einzelkettigen Fv-Polypeptids, welches durch CHO-Zellen hergestellt wurde, und das Monomer und das Dimer des einzelkettigen Fv-Polypeptids, welches von E. coli hergestellt wurde, und die Kontrolle war Maus-IgG (Zymed). Für die Untersuchung des Hämagglutinierungseffekts wurden 96- Well-Rundbodenplatten, die von Falcon erhältlich sind, verwendet. 50 μl pro Well der zuvor erwähnten Antikörper-Proben und 50 μl der 2% Erythrozyten-Suspension wurden zugegeben und in dem Well gemischt. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei 37°C wurden die Reaktionsgemische bei 4°C über Nacht gelagert und die Hämagglutinierung davon wurde bestimmt. Als Kontrolle wurden 50 μl/Well an PBS(–) verwendet und der Hämagglutinierungstest wurde in gleicher Weise durchgeführt. Der Maus-IgG und Antikörper MABL-2 wurden zu 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 oder 100,0 μg/ml der Endkonzentration der Antikörper benutzt. Die einzelkettigen Fvs wurden zu 0,004, 0,04, 0,4, 4,0, 40,0 oder 80,0 μg/ml der Endkonzentration und des Weiteren bei 160,0 μg/ml allein im Fall des Dimers des Polypeptids, welches von E. coli hergestellt worden war, benutzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Im Falle des Antikörpers MABL-2 wurde die Hämagglutinierung bei einer Konzentration von mehr als 0,1 μg/ml beobachtet, während sowohl beim Monomer als auch dem Dimer des einzelkettigen Fv keine Hämagglutinierung beobachtet wurde. Tabelle 2: Hämagglutinierungs-Test

	Kontrolle	0,01	0,1	1	10	100	μg/ml
mlgG MABL-2	–	–	–	–	–	–
(intakt)	–	–	+	+++	+++	++
	Kontrolle	0,004	0,04	0,4	4	40	80	μg/ml
scFv/CHO Monomer	–	–	–	–	–	–	–
scFv/CHO Dimer	–	–	–	–	–	–	–
	Kontrolle	0,004	0,04	0,4	4	40	80	160	μg/ml
scFv/E.coli Monomer	–	–	–	–	–	–	–
scFv/E.coli Dimer	–	–	–	–	–	–	–	–

Vergleichsbeispiel 6: Modifizierte Antikörper sc(Fv)₂ umfassend zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen der Antikörper MABL-2 scFvs mit Linkern mit verschiedener Länge
6.1 Konstruktion eines Plasmids, welches den Antikörper MABL-2 sc(Fv)₂ exprimiert
Zur Herstellung eines Plasmids, welches den modifizierten Antikörper [sc(Fv)₂] exprimiert, welcher zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen umfasst, die vom Antikörper MABL-2 stammen, wurde das zuvor erwähnte pCHOM2, welches die DNA umfasst, die scFv kodiert, welche von MABL-2 stammt, welche oben beschrieben wurde, mittels PCR-Verfahren wie unten erwähnt modifiziert und das daraus hervorgehende DNA-Fragment wurde in pCHOM2 eingeschleust.
Die für die PCR verwendeten Primer waren der EF1-Primer (SEQ ID Nr. 30) als Sense-Primer, welcher so entworfen wurde, dass er mit einer DNA hybridisieren kann, die EF1α kodiert, und ein Anti-Sense-Primer (SEQ ID Nr. 19), welcher so entworfen wurde, dass er mit der DNA hybridisieren kann, welche den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert, und eine DNA-Sequenz enthält, die für einen Linkerbereich kodiert, und der VLLAS-Primer, welcher die SalI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthält (SEQ ID Nr. 31).
100 μl der PCR-Lösung umfasst 10 μl des 10 × PCR-Puffers #1, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGT, dCTP und dTTO), 5 Einheiten KOD-DNA-Polymerase (Toyobo Inc.), 1 μM jedes Primers und 100 ng der Matrizen-DNA (pCHOM2). Die PCR-Lösung wurde in dieser Reihenfolge für 30 Sekunden auf 94°C erwärmt, für 30 Sekunden auf 50°C und für 1 Minute auf 74°C. Dieser Temperaturzyklus wurde 30 Mal wiederholt.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick PCR-Purification-Kit (Qiagen) gereinigt und mit SalI verdaut. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in den pBluescript KS⁺-Vektor (Toyobo Inc.) kloniert. Nach der DNA-Sequenzierung wurde ein Plasmid, das die gewünschte DNA-Sequenz umfasst, mit SalI verdaut und das gewonnene DNA-Fragment wurde unter Verwendung des Rapid-DNA-Ligation-Kit (Boerhinger Mannheim) mit pCHOM2 verbunden, welches durch SalI geschnitten wurde. Nach der DNA-Sequenzierung wurde ein Plasmid, das die gewünschte DNA-Sequenz umfasst, als „pCHOM2(Fv)₂" (siehe 34) bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Antikörpers MABL-2 sc(Fv)₂-Bereichs, welcher in dem Plasmid pCHOM2(Fv)₂ enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 32 gezeigt.
6.2 Herstellung eines Plasmids, welches den Antikörper MABL-2 scFvs mit Linkern verschiedener Länge exprimiert
Die scFvs, die Linker verschiedener Länge und V-Regionen enthalten, welche in der Reihenfolge [H-Kette]-[L-Kette] entworfen wurden (nachfolgend als „HL") oder [L-Kette]-[H-Kette] (nachfolgend „LH") wurden unter Verwendung von cDNAs als Matrize hergestellt, welche die H-Kette bzw. die L-Kette kodieren, die vom MABL-2 stammt, wie unten erwähnt wird.
Um den HL-Typ-scFv zu konstruieren, wurde das PCR-Verfahren, das unter Verwendung von pCHOM2(Fv)₂ als Matrize durchgeführt wurde, benutzt. In dem PCR-Schritt wurde ein Paar aus CFHL-F1-Primer (SEQ ID Nr. 33) und CFHL-R2-Primer (SEQ ID Nr. 34) oder ein Paar aus CFHL-F2-Primer (SEQ ID Nr. 35) und CFHL-R1-Primer (SEQ ID Nr. 36) und KOD-Polymerase benutzt. Das PCR-Verfahren wurde durch 30-maliges Wiederholen eines Temperaturzyklus durchgeführt, der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge bestand, um eine cDNA für die H-Kette herzustellen, welche eine Leadersequenz am 5'-Ende enthält oder eine cDNA für die L-Kette, die eine FLAG-Sequenz am 3'- Ende enthält. Die erhaltenen cDNAs für die H-Kette und die L-Kette wurden gemischt und die PCR wurde durch 5-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus, bestehend aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge durchgeführt, indem die Mischung als Matrize und die KOD-Polymerase verwendet wurden. Zu der Reaktionsmischung wurden CFHL-F1- und CFHL-R1-Primer gegeben, und dann wurde die PCR-Reaktion durch 30-maliges Wiederholen des oben erwähnten Temperaturzyklus durchgeführt, um eine cDNA für HL-0 Typ ohne einen Linker herzustellen.
Um den scFv vom LH-Typ herzustellen, wurde die PCR-Reaktion unter Verwendung von pGEM-M2L und pGEM-M2H als Matrize durchgeführt, welche cDNAs enthalten, die die L-Ketten-V-Region bzw. die H-Ketten-V-Region des Antikörpers MABL-2 kodieren (siehe JP-Appl. 11-63557). Ein Paar aus dem T7-Primer (SEQ ID Nr. 37) und dem CFLH-R2-Primer (SEQ ID Nr. 38) oder ein Paar aus dem CFLH-F2-Primer (SEQ ID Nr. 39) und CFLH-R1 (SEQ ID Nr. 40) und die KOD-Polymerase (Toyobo Inc.) wurden benutzt. Die PCR-Reaktion wurde durch 30-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute in abfolgender Reihenfolge bestand, durchgeführt, um eine cDNA der L-Kette, die eine Leader-Sequenz am 5'-Ende oder eine H-Kette, die eine FLAG-Sequenz am 3'-Ende davon enthält, herzustellen. Die erhaltenen cDNAs der L-Kette und der H-Kette wurden gemischt und die PCR wurde unter Verwendung dieser Mischung als Matrizen und der KOD-Polymerase durch 5-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus, der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge bestand, durchgeführt. Zu der Reaktionsmischung wurden die T7- und CFLH-R1-Primer gegeben und die Reaktion wurde 30-maliges Wiederholen des oben erwähnten Temperaturzyklus durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde als Matrize benutzt und die PCR wurde unter Verwendung eines Paars aus CFLH-F4-Primer (SEQ ID Nr. 41) und CFLH-R1-Primer durch 30-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus durchgeführt, der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute bestand, um eine cDNA vom LH-0-Typ ohne einen Linker herzustellen.
Die erhaltenen cDNAs der LH-0- und HL-0-Typen wurden mit EcoRI und BamHI-Restriktionsenzymen (Takara Shuzo) verdaut und die verdauten cDNAs wurden in das Expressionsplasmid INPEP4 für Säugerzellen unter Verwendung des Ligation High (Toyobo Inc.) eingeschleust. Kompetente E. coli JM109 (Nippon Gene) wurden mit jedem Plasmid transformiert und die gewünschten Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen) isoliert. Auf diese Weise wurden die Plasmide pCF2LH-0 und pCF2HL-0 hergestellt.
Um die Expressionsplasmide vom HL-Typ zu konstruieren, welche Linker mit verschiedener Größe enthalten, wurden pCF2HL-0 als Matrize und CFHL-X3 (SEQ ID Nr. 42), CFHL-X4 (SEQ ID Nr. 43), CFHL-X5 (SEQ ID Nr. 44), CFHL-X6 (SEQ ID Nr. 45) oder CFHL-X7 (SEQ ID Nr. 46) als Sense-Primer und BGH-1(SEQ ID Nr. 47)-Primer als Anti-Sense-Primer, welcher komplementär zur Vektorsequenz ist, benutzt. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der KOD-Polymerase durch 30-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus, der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge bestand, durchgeführt, und die Reaktionsprodukte wurden durch die Restriktionsenzyme XhoI und BamHI (Takara Shuzo) verdaut. Die verdauten Fragmente wurden zwischen die XhoI- und BamHI-Schnittstellen in pCF2HL-0 unter Verwendung des Ligation High (Toyobo Inc.) eingeschleust. Kompetente E. coli JM109 wurden mit jedem Plasmid transformiert und die gewünschten Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kit isoliert. Auf diese Weise wurden die Expressionsplasmide pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 und pCF2HL-7 hergestellt.
Um ein Expressionsplasmid für die transiente Expression in COS-Zellen zu konstruieren, wurden die Plasmide pCF2HL-0, pCF2HL-3, pCF2HL-4, pCF2HL-5, pCF2HL-6 und pCF2HL-7 durch die Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI (Takara Shuzo) verdaut, und die erhaltenen Fragmente von ungefähr 800 bp wurden durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Die gewonnenen Fragmente wurden zwischen die EcoRI- und BamHI-Schnittstellen in einem Expressionsplasmid pCOS1 zur Expression in Säugerzellen unter Verwendung von Ligation High (Toyobo Inc.) eingeschleust. Kompetente E. coli DH5α (Toyobo Inc.) wurden mit jedem Plasmid transformiert und die gewünschten Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kit isoliert. Auf diese Weise wurden die Expressionsplasmide CF2HL-0/pCOS1, CF2HL-3/pCOS1, CF2HL-4/pCOS1, CF2HL-5/pCOS1, CF2HL-6/pCOS1 und CF2HL-7/pCOS1 hergestellt.
Als typisches Beispiel für diese Plasmide ist die Konstruktion des Plasmids CF2HL-0/pCOS1 in 35 dargestellt und die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von MABL2-scFv <HL-0>, welche in dem Plasmid enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 48 gezeigt. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz der Linkerbereiche in diesen Plasmiden sind ebenfalls in 36 gezeigt.
Um die Expressionsplasmide vom LH-Typ zu konstruieren, welche die Linker mit verschiedener Größe enthalten, wurden pCF2LH-0 als Matrize und CFLH-X3 (SEQ ID Nr. 49), CFLH-X4 (SEQ ID Nr. 50), CFLH-X5 (SEQ ID Nr. 51), CFLH-X6 (SEQ ID Nr. 52) oder CFLH-X7 (SEQ ID Nr. 53) als Sense-Primer und BGH-1-Primer als Anti-Sense-Primer verwendet, welcher komplementär zur Vektorsequenz ist. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der KOD-Polymerase durch 30-maliges Wiederholen des Temperaturzyklus, der aus 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute in dieser Reihenfolge bestand, durchgeführt und die Reaktionsprodukte wurden durch die Restriktionsenzyme XhoI und BamHI verdaut. Die verdauten Fragmente wurden in pCF2LH-0 zwischen die XhoI- und BamHI-Schnittstellen unter Verwendung von Ligation High eingeschleust. Kompetente E. coli DH5α (Toyobo Inc.) wurden mit jedem Plasmid transformiert und die gewünschten Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kit isoliert. Auf diese Weise wurden die Expressionsplasmide pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 und pCF2LH-7 hergestellt.
Um das Expressionsplasmid für die transiente Expression in COS7-Zellen zu konstruieren, wurden die Plasmide pCF2LH-0, pCF2LH-3, pCF2LH-4, pCF2LH-5, pCF2LH-6 und pCF2LH-7 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI (Takara Shuzo) verdaut und die erhaltenen Fragmente von ungefähr 800 bp wurden durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Die gewonnenen Fragmente wurden zwischen die XhoI- bzw. BamHI-Schnittstellen in einem Expressionsplasmid pCOS1 für die Expression in Säugerzellen unter Verwendung des Ligation High eingeschleust. Kompetente E. coli DH5α (Toyobo Inc.) wurden mit jedem Plasmid transformiert und die gewünschten Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kit isoliert. So wurden die Expressionsplasmide CF2LH-0/pCOS1, CF2LH-3/pCOS1, CF2LH-4/pCOS1, CF2LH-5/pCOS1, CF2LH-6/pCOS1 und CF2LH-7/pCOS1 hergestellt.
Als typisches Beispiel dieser Plasmide wird die Konstruktion des Plasmids CF2LH-0/pCOS1 in 37 dargestellt und die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von MABL2-scFv <LH-0>, welche in dem Plasmid enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 54 gezeigt. Die Nucleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen der Linkerbereiche dieser Plasmide sind ebenfalls in 38 gezeigt.
6.3 Expression von scFvs und sc(Fv)₂ in COS7-Zellen
(1) Herstellung eines Kulturüberstandes unter Verwendung eines Serum-haltigen Kulturmediums
Der HL-Typ und LH-Typ der scFvs und sc(Fv)₂ wurde transient in COS7-Zellen (JCRB9127, Japan Health Sciences Foundation) exprimiert. COS7-Zellen wurden in DMEM-Medium (Gibco BRL), das 10% fötales Rinderserum enthält, bei 37°C in einem Inkubator mit Kohlendioxidatmosphäre subkultiviert. Die COS7-Zellen wurden mit CF2HL-0, 3∼7/pCOS1 oder CF2LH-0, 3∼7/pCOS1, welche in Beispiel 6.2 hergestellt wurden oder mit den pCHOM2(Fv)₂-Vektoren durch Elektroporation unter Verwendung eines Gene-Pulser-Apparats (BioRad) transfiziert. Die DNA (10 μg) und 0,25 ml mit 2 × 10⁷ Zellen/ml in DMEM-Kulturmedium, welches 10% FBS enthält und 5 mM BES (Sigma) wurden in eine Cuvette gegeben. Nach dem Stehenlassen für 10 Minuten wurden die Mischungen mit einem Puls von 0,17 kV, 950 μF elektrischer Kapazität behandelt. Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in DMEM-Kulturmedium (10% FBS) in 75 cm³ Flaschen transferiert. Nach dem Kultivieren für 72 Stunden wurden die Kulturüberstände eingesammelt und zentrifugiert, um Zellfragmente zu entfernen. Der Kulturüberstand wurde einer Filtration unter Verwendung eines 0,22 μm Flaschenhalsfilters (Falcon) unterworfen, um den Kulturüberstand (nachfolgend „CM") zu gewinnen.
(2) Herstellung eines Kulturüberstandes unter Verwendung von Serum-freiem Kulturmedium
Zellen, die in gleicher Weise wie in (1) transfiziert wurden, wurden in DMEM-Medium (10% FBS) in eine 75 cm³ Flasche überführt und über Nacht kultiviert. Nach der Kultur wurde der Überstand verworfen und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann zu CHO-S-SFM II-Medium (Gibco BRL) gegeben. Nach dem Kultivieren für 72 Stunden wurde der Kulturüberstand eingesammelt, zentrifugiert, um Zellfragmente zu entfernen und unter Verwendung eines 0,22 μm Flaschenhalsfilters (Falcon) filtriert, um CM zu gewinnen.
6.4 Nachweis von scFvs und sc(Fv)₂ in CM aus COS7
Die verschiedenen MABL2-scFvs und sc(Fv)2 in CM der COS7, welche im oben erwähnten Beispiel 6.3 (2) hergestellt wurden, wurden mittels Western-Blot-Verfahren nachgewiesen.
Jeder CM der COS7 wurde einer SDS-PAGE-Elektrophorese unterworfen und auf Reinforced-NC-Membran (Schleicher & Schuell) überführt. Die Membran wurde mit 5% Magermilch (Morinaga Nyu-gyo) blockiert und mit TBS gewaschen. Dann wurde ein Anti-FLAG-Antikörper (Sigma) hinzugegeben. Die Membran wurde bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Ein Peroxidase-markierter Maus-IgG-Antikörper (Jackson Immuno Research) wurde zugegeben. Nach dem Inkubieren und Waschen bei Raumtemperatur wurde die Substratlösung (Kirkegaard Perry Laboratories) zugegeben, um die Farbe zu entwickeln (39).
6.5 Durchflusscytometrie
Die Durchflusscytometrie wurde durchgeführt, indem Kulturüberstände der COS7-Zellen verwendet wurden, die in Beispiel 6.3 (1) hergestellt wurden, um die Bindung der MABL2-scFvs und sc(Fv)₂ an menschliches Integrin-assoziiertes Protein(IAP)-Antigen zu messen. Die Kulturüberstände, die getestet werden sollten, oder ein Kulturüberstand von COS7-Zellen als Kontrolle wurde zu 2 × 10⁵ Zellen der Maus-Leukämie-Zelllinie L1210 gegeben, welche menschliches IAP exprimiert. Nach dem Inkubieren auf Eis und Waschen wurden 10 μg/ml des Maus-Anti-FLAG-Antikörpers (Sigma) zugegeben und dann wurden die Zellen inkubiert und gewaschen. Dann wurde der FITC-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Becton Dickinson) zugegeben und die Zellen wurden inkubiert und wieder gewaschen. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen. Die Ergebnisse der Durchflusscytometrie zeigen, dass die MABL2-scFvs mit Linkern verschiedener Länge und die sc(Fv)₂ in den Kulturüberständen der COS7 eine hohe Affinität für menschliches IAP haben (siehe 40a und 40b).
6.6 Apoptose-induzierende Wirkung in vitro
Die Apoptose-induzierende Wirkung der Kulturüberstände der COS7, welche in Beispiel 6.3 (1) hergestellt wurden, wurde durch Annexin-V-Färbung untersucht (Boehringer Mannheim), indem die L1210-Zellen verwendet wurden, die mit dem menschlichen IAP-Gen transfiziert sind (hIAP/L1210).
Zu 5 × 10⁴ Zellen der hIAP/L1210-Zellen wurden die Kulturüberstände der COS7-Zellen gegeben, die mit den jeweiligen Vektoren transfiziert waren oder einen Kulturüberstand von COS7-Zellen als Kontrolle bei 10% der endgültigen Konzentration, und die Mischungen wurden für 24 Stunden kultiviert. Dann wurde die Annexin-V/PI-Färbung durchgeführt und die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass scFvs <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6, 7> und sc(Fv)₂ in CM von COS7 beachtlichen Zelltod in hIAP/L1210-Zellen induzierten. Die Ergebnisse sind in 41 gezeigt.
6.7 Konstruktion von Vektoren zur Expression von scFvs und sc(Fv)₂ in CHO-Zellen
Um MABL2-scFvs und sc(Fv)₂ aus Kulturüberstand zu isolieren und zu reinigen, wurden die Expressionsvektoren zur Exprimierung in CHO-Zellen wie unten gezeigt konstruiert. Die EcoRI-BamHI-Fragmente von pCF2HL-0, 3∼7, und pCF2LH-0, 3∼7, welche in Beispiel 6.2 hergestellt wurden, wurden zwischen die EcoRI- und BamHI-Schnittstellen in einem Expressionsvektor pCHO1 für CHO-Zellen unter Verwendung von Ligation High eingeschleust. Kompetente E. coli DH5α wurden hiermit transformiert. Die Plasmide wurden aus den transformierten E. coli unter Verwendung des Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen) isoliert, um die Expressionsplasmide pCHOM2HL-0, 3∼7 und pCHOM2LH-0, 3∼7 herzustellen.
6.8 Herstellung von CHO-Zellen, die MABL2-scFvs <HL-0, 3∼7>, MABL2-scFvs <LH-0, 3∼7> und sc(Fv)₂ exprimieren und Herstellung des Kulturüberstandes davon
CHO-Zellen wurden mit jedem der Expressionsplasmide pCHOM2HL-0, 3∼7 und pCHOM2LH-0, 3∼7, welche in Beispiel 6.7 hergestellt wurden und mit dem pCHOM2(Fv)₂-Vektor transformiert, um die CHO-Zellen herzustellen, die jeden modifizierten Antikörper konstant exprimieren. Als typisches Beispiel hierfür ist die Produktion der CHO-Zellen, die MABL2-scFv <HL-5> oder sc(Fv)₂ konstant exprimieren, wie folgt dargestellt.
Die Expressionsplasmide pCHOM2HL-5 und pCHOM2(Fv)₂ wurden durch Verdauen mit dem Restriktionsenzym PvuI linearisiert und eine Transfektion in CHO-Zellen mittels Elektroporation unter Verwendung des Gene-Pulser-Apparats (BioRad) unterworfen. Die DNA (10 μg) und 0,75 ml PBS mit 1 × 10⁷ Zellen/ml wurden in eine Cuvette gegeben und mit einem Puls von 1,5 kV, 25 μF elektrischer Kapazität behandelt. Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen in Nucleinsäure-haltiges α-MEM-Kulturmedium (Gibco BRL) überführt, das 10% fötales Rinderserum enthält und kultiviert. Nach dem Kultivieren über Nacht wurde der Überstand verworfen. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und zu Nucleinsäure-freiem α-MEM-Kulturmedium (Gibco BRL) gegeben, das 10% fötales Rinderserum enthält. Nach dem Kultivieren für 2 Wochen wurden die Zellen in ein Medium kultiviert, das 10 nM (Endkonzentration) Methotrexat (Sigma) enthält und dann 50 nM und 100 nM Methotrexat. Die erhaltenen Zellen wurden in Serum-freiem CHO-S-SFM II-Medium (Gibco BRL) in einer Rollflasche kultiviert. Der Kulturüberstand wurde eingesammelt, zentrifugiert, um die Zellfragmente zu entfernen und unter Verwendung eines Filters mit einer 0,22 μm Porengröße filtriert, um CM zu gewinnen.
Nach der obigen Beschreibung wurden CHO-Zellen, die konstant MABL2-scFvs <HL-0, -3, -4, -6, -7> und <LH-0, -3, -4, -5, -6, -7> und CMs davon exprimieren, gewonnen.
6.9 Reinigung des Dimers aus MABL2-scFv <HL-5> und sc(Fv)₂
Die MABL2-scFv <HL-5> und die sc(Fv)₂ wurden aus CMs, welche in Beispiel 6.8 hergestellt wurden durch zwei Arten von Reinigungsverfahren, wie unten gezeigt, gereinigt.
<Reinigungsverfahren 1>
HL-5 und sc(Fv)₂ wurden durch die Anti-FLAG-Antikörper-Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung der FLAG-Sequenz, die am C-Terminus der Polypeptide vorhanden ist und durch Gelfiltration gereinigt. Ein Liter CM, welcher in 6.8 gewonnen wurde, wurde auf eine Säule aufgetragen (7,9 ml), welche mit einem Anti-FLAG M2-Affinitäts-Gel (Sigma) hergestellt wurde und mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (TBS, pH 7,5) äquilibriert wurde, der 150 mM NaCl enthält. Nach dem Waschen der Säule mit TBS wurde der scFv mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer, pH 3,5, eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Elution des scFv wurde bestätigt. Die scFv-Fraktion wurde mit Tween 20 bis zu 0,01% der Endkonzentration gemischt und unter Verwendung von Centricon-10 (Milipore) aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde auf TSKgel G3000SWG-Säulen (7,5 × 600 mm), welche mit 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) äquilibriert waren, welche 150 mM NaCl und 0,01% Tween 20 enthält, aufgetragen. Bei 0,4 ml/Minute Fließrate wurde der scFv durch Absorption bei 280 nm nachgewiesen. HL-5 wurde als Hauptfraktion an der Position des Dimers eluiert und der sc(Fv)₂ wurde an der Position des Monomers eluiert.
<Reinigungsverfahren 2>
HL-5 und sc(Fv)₂ wurden unter Verwendung von drei Schritten gereinigt, welche Ionenaustausch-Chromatographie, Hydroxyapatit und Gelfiltration umfassen. In der Ionenaustausch-Chromatographie wurde eine Q-Sepharose Fast-Flow-Säule (Pharmacia) für HL-5 benutzt und SP-Sepharose Fast-Flow-Säule wurde für sc(Fv)₂ benutzt. Während und nach dem zweiten Schritt wurden HL-5 und sc(Fv)₂ in gleicher Weise verarbeitet.
Erster Schritt für HL-5
CM von HL-5 wurde zweimal mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) verdünnt, der 0,02% Tween 20 enthält und dann wurde der pH-Wert mit 1 M Tris auf 9,0 eingestellt. Die Lösung wurde auf eine Q-Sepharose Fast-Flow-Säule aufgetragen, welche mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) äquilibriert wurde, welche 0,02% Tween 20 enthält. Ein Polypeptid, das an die Säule adsorbiert war, wurde mittels eines linearen NaCl-Gradienten von 0,1 bis 0,55 M im gleichen Puffer eluiert. Die Überwachung der eluierten Fraktion mittels SDS-PAGE, führte dazu, dass Fraktionen, die HL-5 enthalten, gesammelt wurden und dem Hydroxyapatit des zweiten Schritts unterworfen wurden.
Erster Schritt der sc(Fv)₂
CM des sc(Fv)₂ wurden zweimal mit 20 mM Acetatpuffer (pH 5,5) verdünnt, der 0,02% Tween 20 enthält und dessen pH-Wert wurde auf 5,5 mit 1 M Essigsäure eingestellt. Die Lösung wurde auf eine SP-Sepharose Fast-Flow-Column aufgetragen, die mit 20 mM Acetatpuffer (pH 5,5) äquilibriert wurde, welcher 0,02% Tween 20 enthält. Das an die Säule adsorbierte Polypeptid wurde durch einen linearen NaCl-Gradienten in einem Puffer von 0 bis 0,5 M eluiert. Die Überwachung der eluierten Fraktionen mittels SDS-PAGE führte zu Fraktionen, die den sc(Fv)₂ enthalten und diese wurden eingesammelt und in dem zweiten Schritt Hydroxyapatit unterworfen.
Zweiter Schritt: Hydroxyapatit-Chromatographie von HL-5 und sc(Fv)₂
Die Fraktionen der HL-5 und sc(Fv)₂, welche im ersten Schritt gewonnen wurden, wurden separat auf die Hydroxyapaptit-Säule (Typ I, BioRad) aufgetragen, welche mit 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert wurde, welcher 0,02% Tween 20 enthält, pH 7,0. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurden an die Säule adsorbierte Polypeptide mit einem linearen Gradienten des Phosphatpuffers bis zu 0,5 M eluiert. Durch Überwachen der eluierten Fraktionen mittels SDS-PAGE wurden Fraktionen, die die gewünschten Polypeptide enthalten, gesammelt.
Dritter Schritt: Gelfiltration von HL-5 und sc(Fv)₂
Jede Fraktion, die in dem zweiten Schritt gewonnen wurde, wurde separat mittels CentriPrep-10 (Milipore) aufkonzentriert und auf eine Superdex 200-Säule (2,6 × 60 cm, Pharmacia) aufgetragen, welche mit 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) äquilibriert wurde, welcher 0,02% Tween 20 enthält und 0,15 M NaCl. HL-5 wurde an Position des Dimers eluiert und sc(Fv)HL-5 und sc(Fv)₂ wurden an Position des Monomers als Haupt-Peak eluiert.
Da das Monomer des HL-5 durch beide Reinigungsverfahren kaum nachzuweisen war, bewies dies, dass die Dimere der einzelkettigen Fvs in hoher Ausbeute gebildet werden, wenn der Linker für die einzelkettigen Fv um 5 Aminosäuren enthält. Außerdem wurden das Dimer von HL-5 und der sc(Fv)₂ für einen Monat bei 4°C nach der Reinigung stabil konserviert.
6.10 Untersuchung der Bindungsaktivität des gereinigten Dimers von scFv <HL-5> und sc(Fv)₂ gegenüber dem Antigen
Durchflusscytometrie wurde unter Verwendung des gereinigten Dimers von MABL2-scFv <HL-5> und des gereinigten sc(Fv)₂ durchgeführt, um die Bindung an menschliches Integrin-assoziiertes Protein(IAP)-Antigen zu untersuchen. 10 μg/ml des gereinigten Dimers des MABL2-scFV <HL-5>, des gereinigten sc(Fv)₂, des Antikörpers MABL-2 als Positivkontrolle oder eines Maus-IgG (Zymed) als Negativkontrolle wurden zu 2 × 10⁵ Zellen der Maus-Leukämie-Zelllinie L1210 gegeben, welche menschliche IAP exprimiert (hIAP/L1210), oder zur Zelllinie L1210, welche mit pCOS1 (pCOS1/L1210) transformiert ist, als Kontrolle. Nach dem Inkubieren auf Eis und Waschen wurden 10 μg/ml des Maus-Anti-FLAG-Antikörpers (Sigma) hinzugegeben und dann wurden die Zellen inkubiert und gewaschen. FITC-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Becton Dickinson) wurden hinzugegeben und die Zellen wurden inkubiert und erneut gewaschen. Dann wurde die Fluoreszenzintensität unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen.
Da das gereinigte Dimer des MABL2-scFV <HL-5> und des gereinigten sc(Fv)₂ spezifisch an hIAP/L1210-Zellen band, wurde bestätigt, dass das Dimer von scFv <HL-5> und der sc(Fv)₂ hohe Affinität für menschliches IAP besitzen (siehe 42).
6.11 Apoptose-induzierende Wirkung des gereinigten Dimers von scFV <HL-5> und sc(Fv)₂ in vitro
Die Apoptose-induzierende Wirkung des gereinigten Dimers des MABL2-scFv <HL-5> und des gereinigten sc(Fv)₂ wurde durch Annexin-V-Färbung (Boehringer Mannheim) unter Verwendung der L1210-Zellen (hIAP/L1210), in die das menschliche IAP-Gen eingeschleust worden war und mit Zellen der menschlichen Leukämie-Zelllinie CCRF-CEM gemessen.
Verschiedene Konzentrationen des gereinigten Dimers von MABL2-scFv <HL-5>, des gereinigten MABL2-sc(Fv)₂, des Antikörpers MABL-2 als Positivkontrolle oder eines Maus-IgG als Negativkontrolle wurden zu 5 × 10⁴ Zellen der hIAP/L1210-Zelllinie oder zu 1 × 10⁵ Zellen der CCRF-CEM-Zelllinie gegeben. Nach dem Kultivieren für 24 Stunden wurde die Annexin-V-Färbung durchgeführt, und die Fluoreszenzintensität davon wurde unter Verwendung des FACScan-Apparats (Becton Dickinson) gemessen. Im Ergebnis induzierte das Dimer von MABL2-scFv <HL-5> und MABL2-sc(Fv)₂ merklich den Zelltod von hHIAP/L1210 und CCRF-CEM in Konzentrations-abhängiger Weise (siehe 43). Im Ergebnis wurde gezeigt, dass das Dimer des MABL2-scFv <HL-5> und MABL2-sc(Fv)₂ verbesserte Wirksamkeit bei der Induzierung von Apoptose verglichen mit dem ursprünglichen Antikörper MABL-2 besitzt.
6.12 Hämagglutinierungstest des gereinigten Dimers von scFv <HL-5> und des sc(Fv)₂
Der Hämagglutinierungstest wurde durchgeführt, indem verschiedene Konzentrationen des gereinigten Dimers von scFv <HL-5> und des gereinigten sc(Fv)₂ gemäß Beispiel 5.15 verwendet wurden.
Die Hämagglutinierung wurde beim Antikörper MABL-2 als Positivkontrolle beobachtet, während sowohl mit dem einzelkettigen Antikörper MABL-sc(Fv)₂ und dem MABL2-scFv <HL-5> keine Hämagglutinierung beobachtet wurde. Des Weiteren gab es keinen wesentlichen Unterschied bei der Hämagglutinierung zwischen den zwei Puffern, die mit dem Antikörper MABL-2 benutzt wurden. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
6.13 Antitumor-Wirkung des gereinigten Dimers von scFv <HL-5> und des sc(Fv)₂ in einer Modellmaus für das menschliche Myelom
Die Antitumor-Wirkungen wurden für das Dimer von scFv <HL-5> und sc(Fv)₂ getestet, welche in den Beispielen 6.8 und 6.9 hergestellt und gereinigt wurden. Der Test wurde unter Verwendung des Maus-Modells für menschliches Myleom, das in Beispiel 5.1 hergestellt wurde, unter Verwendung eines ELISA durchgeführt, und durch Bestimmung der Menge an M-Protein, welche durch die menschlichen Myelomzellen in dem Maus-Serum hergestellt wurden sowie das Überwachen der Lebensdauer der Mäuse. Dann wurden die Antitumor-Wirkungen des Dimers von scFv <HL-5> und des sc(Fv)₂ in Bezug auf die Änderung der Menge an M-Protein in dem Maus-Serum und der Überlebensrate der Mäuse untersucht.
In dem Test wurden HL-5 und sc(Fv)₂ als Lösung von 0,01, 0,1 oder 1 mg/ml im Träger, der aus 150 mM NaCl, 0,02% Tween und 20 mM Acetatpuffer, pH 6,0, bestand, benutzt und an Mäuse zu 0,1, 1 oder 10 mg/kg Dosierung verabreicht. Einer Kontrollgruppe der Mäuse wurde nur der Träger verabreicht.
Das Maus-Serum wurde 26 Tage nach der Transplantation der menschlichen Myelomzellen gewonnen und die Menge an M-Protein im Serum wurde unter Verwendung eines ELISA nach Beispiel 5.14 gemessen. Im Ergebnis nahm die Menge an M-Protein im Serum beider Mausgruppen, die HL-5, das Dimer und der sc(Fv)₂ verabreicht wurde, in Dosis-abhängiger Weise ab (siehe 44). Des Weiteren wurde eine signifikante Verlängerung der Überlebensdauer in beiden Gruppen beobachtet, denen HL-5 (45) und sc(Fv)₂ (46) verabreicht wurde, verglichen mit der Kontrollgruppe, der der Träger verabreicht wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass HL-5 und der sc(Fv)₂ der Erfindung heraushagende Antitumor-Wirkungen in vivo besitzen.
Beispiel 7
Einzelkettige Fv, umfassend die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des menschlichen Antikörpers 12B5 gegen menschliches MPL
Eine DNA, die die V-Region des menschlichen monoklonalen Antikörpers 12B5 gegen menschliches MPL kodiert, wurde wie folgt konstruiert:
7.1 Konstruktion eines Gens, welches die H-Ketten-V-Region von 12B5 kodiert
Das Gen, welches die H-Ketten-V-Region des menschlichen Antikörpers 12B5 kodiert, das menschliches MPL bindet, wurde durch Verbinden der Nucleotidsequenz des Gens dafür (SEQ ID Nr. 55) am 5'-Ende der Leadersequenz (SEQ ID Nr. 56), die vom menschlichen Antikörper-Gen stammt (Eur. J. Immunol. 1996; 26: 63–69) entworfen. Die entworfene Nucleotidsequenz wurde in vier Oligonucleotide mit überlappenden Sequenzen von jeweils 15 bp unterteilt (12B5VH-1, 12B5VH-2, 12B5VH-3, 12B5VH-4). 12B5VH-1 (SEQ ID Nr. 57) und 12B5VH-3 (SEQ ID Nr. 59) wurden in Sense-Richtung synthetisiert und 12B5VH-2 (SEQ ID Nr. 60) und 12B5VH-4 (SEQ ID Nr. 58) in Anti-Sense-Richtung. Nach dem Zusammenbau der jeweils synthetisierten Oligonucleotide durch entsprechende Komplementarität, wurden die außen liegenden Primer (12B5VH-s und 12B5VH-A) hinzugegeben, um die Gesamtlänge des Gens zu amplifizieren. 12B5VH-S (SEQ ID Nr. 61) wurde entworfen, um mit dem 5'-Ende der Leadersequenz mittels des Vorwärtsprimers zu hybridisieren, und hatte eine HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und eine Kozak-Sequenz, und 12B5VH-A (SEQ ID Nr. 62) wurde durch den Umkehrprimer erzeugt, damit es mit der Nucleotidsequenz hybridisiert, die den C-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert, und eine Splice-Donor-Sequenz und eine BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsschnittstelle besitzt.
100 μl der PCR-Lösung, welche 10 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (alle von Perkin Elmer), und jeweils 2,5 pmol jedes synthetisierten Oligonucleotids (12B5VH-1 bis -4) wurden bei 94°C der Anfangstemperatur für 9 Minuten erwärmt, bei 94°C für 2 Minuten, bei 55°C für 2 Minuten und bei 72°C für 2 Minuten. Nach zweimaligem Wiederholen des Zyklus wurden jeweils 100 pmol der äußeren Primer 12B5VH-S und 12B5VH-A hinzugegeben. Die Mischung wurde einem Zyklus, der aus 24°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute besteht, 35 Mal unterworfen und für weitere 5 Minuten auf 72°C erwärmt.
Das PCR-Produkt wurde durch ein 1,5%iges bei niedriger Temperatur schmelzendes Agarosegel (Sigma) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut und in den Expresssionsvektor HEF-gγ1 für die menschliche H-Kette kloniert. Nach dem Bestimmen der DNA-Sequenz wurde das Plasmid, welches die korrekte DNA-Sequenz enthält, als HEF-12B5H-gγ1 bezeichnet.
HEF-12B5H-gγ1 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut, um das Gen herzustellen, welches 12B5VH kodiert, welches dann in den Expressionsvektor pCOS-Fd für die menschliche Fab-H-Kette kloniert wurde, um pFd-12B5H herzustellen. Der Expressionsvektor für die menschliche Fab-H-Kette wurde durch Amplifizieren der DNA (SEQ ID Nr. 63) hergestellt, die die Intronregion enthält, welche zwischen den Genen vorhanden ist, welche die menschliche Antikörper H-Ketten-V-Region kodiert und die konstante Region, und das Gen, das einen Teil der konstanten Region der menschlichen H-Kette kodiert, durch PCR und Inserieren des PCR-Produktes in den Tierzell-Expressionsvektor pCOS1. Die konstante Region der menschlichen H-Kette wurde für dieses Gen unter den gleichen Bedingungen, die oben erwähnt wurden, unter Verwendung von HEF-gγ1 als Matrize amplifiziert, mit dem Vorwärtsprimer G1CH1-S (SEQ ID Nr. 64), welcher entworfen wurde, um an die 5'-Endsequenz des Intron 1 zu hybridisieren und eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle EcoRI und BamHI hat, und dem Umkehrprimer G1CH1-A (SEQ ID Nr. 65), welcher entworfen wurde, um an das 3'-Ende der DNA der konstanten Region CH1-Domäne der menschlichen H-Kette zu hybridisieren und eine Sequenz hat, die einen Teil der Scharnierregion, zwei Stop-Kodons und die Restriktionsenzym-Erkennungsstelle Bgl II kodiert.
Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz der rekonstruierten variablen Region der 12B5H-Ketten, welche in den Plasmiden HEF-12B5H-gγ1 und pFD-12B5H eingeschlossen ist, wird in SEQ ID Nr. 66 gezeigt.
7.2 Herstellung des Gens, welches die 12B5L-Ketten-V-Region kodiert
Das Gen, welches die V-Region der L-Kette des menschlichen Antikörpers 12B5 kodiert, welcher an menschliches MPL bindet, wurde durch Verbinden der Nucleotidsequenz des Gens (SEQ ID Nr. 67) am 5'-Ende mit der Leader-Sequenz (SEQ ID Nr. 68) entworfen, welche vom menschlichen Antikörper-Gen 3D6 (Nuc. Acid Res. 1990: 18, 4927) stammt. In gleicher Weise wie oben erwähnt, wurde die entworfene Nucleotidsequenz in vier Oligonucleotide unterteilt, die überlappende Sequenzen aus jeweils 15 bp haben (12B5VL-1, 12B5VL-2, 12B5VL-3, 12B5VL-4), und entsprechend synthetisiert. 12B5VL-1 (SEQ ID Nr. 69) und 12B5VL-3 (SEQ ID Nr. 71) hatten Sense-Sequenzen, und 12B5VL-2 (SEQ ID Nr. 70) und 12B5VL-4 (SEQ ID Nr. 72) hatten Anti-Sense-Sequenzen. Jedes der synthetisierten Oligonucleotide wurde durch entsprechende Komplementarität zusammengebaut und mit dem externen Primer (12B5VL-S und 12B5VL-s) gemischt, um das Gen vollständiger Länge zu amplifizieren. 12B5VL-S (SEQ ID Nr. 73) wurde so entworfen, dass es durch den Vorwärtsprimer an das 5'-Ende der Leadersequenz hybridisiert, und eine HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und eine Kozak-Sequenz hat. 12B5VL-A (SEQ ID Nr. 74) wurde so entworfen, dass es durch den Umkehrprimer an die Nucleotidsequenz hybridisiert, welche den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert, und eine Splice-Donor-Stelle und die BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle hat.
Die PCR wurde durchgeführt wie oben erwähnt, und das PCR-Produkt wurde mit Hilfe eines 1,5%igen bei niedrigen Temperaturen schmelzenden Agarosegels gereinigt (Sigma), durch die Restriktionsenzyme BamHI und HindIII verdaut und in den Expressionsvektor HEF-gκ für die menschliche L-Kette kloniert. Nach der Bestimmung der DNA-Sequenz wurde das Plasmid, welches die korrekte DNA-Sequenz enthält, als HEF-12B5L-gκ bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz der rekonstruierten 12B5-L-Ketten-V-Region, welche in dem Plasmid HEF-12B5L-gκ enthalten sind, sind in SEQ ID Nr. 75 gezeigt.
7.3 Herstellung der rekonstruktierten 12B5 einzelkettigen Fv (scFv)
Das rekonstruierte 12B5-Anitkörper-Einzelketten-Fv wurde entworfen, dass es die Reihenfolge 12B5VH-Linker-12B5VL und eine FLAG-Sequenz (SEQ ID Nr. 76) am C-Terminus hat, um den Nachweis und die Reinigung zu erleichtern. Die rekonstruierte 12B5-Einzelketten-Fv (sc12B5) wurde unter Verwendung einer Linkersequenz konstruiert, die aus 15 Aminosäuren besteht, welche durch (Gly₄Ser)₃ dargestellt wird.
(1) Herstellung des rekonstruierten einzelkettigen 12B5 Fv unter Verwendung der Linkersequenz, die aus 15 Aminosäuren besteht
Das Gen, welches den rekonstruierten 12B5-Antikörper-Einzelketten-Fv kodiert, welcher die Linkersequenz enthält, die aus 15 Aminosäuren besteht, wurde durch Verbinden der 12B5 H-Ketten-V-Region, der Linkerregion und der 12B5- L-Ketten-V-Region hergestellt, welche jeweils durch PCR amplifiziert wurden. Dieses Verfahren ist schematisch in 47 gezeigt. Sechs PCR-Primer (A-F) wurden für die Herstellung des rekonstruierten 12B5-Einzelketten-Fv verwendet. Die Primer A, C und E haben Sense-Sequenzen und die Primer B, D und F haben Antisense-Sequenzen.
Der Vorwärtsprimer 12B5-S (Primer A, SEQ ID Nr. 77) für die H-Ketten-V-Region wurde so entworfen, dass er an das 5'-Ende der H--Ketten-Leadersequenz hybridisiert und eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle hat. Der Umkehrprimer HuVHJ3 (Primer B, SEQ ID Nr. 78) für die H-Ketten-V-Region wurde so entworfen, dass er an die DNA hybridisiert, die den C-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert.
Der Vorwärtsprimer RHuJH3 (Primer C, SEQ ID Nr. 79) für den Linker wurde so entworfen, dass er mit der DNA hybridisiert, welche den N-Terminus des Linkers kodiert und mit DNA überlappt, welche den C-Terminus der H-Ketten-V-Region kodiert. Der Umkehrprimer RHuVK1 (Primer D, SEQ ID Nr. 80) für den Linker wurde so entworfen, dass er mit DNA hybridisiert, welche den C-Terminus des Linkers kodiert und mit DNA überlappt, die den N-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert.
Der Vorwärtsprimer HuVK1.2 (Primer E, SEQ ID Nr. 81) für die L-Ketten-V-Region wurde entworfen, um an die DNA zu hybridisieren, welche den N-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert. Der Umkehrprimer 12B5F-A für die L-Ketten-V-Region (Primer F, SEQ ID Nr. 82) wurde entworfen, um mit der DNA zu hybridisieren, welche den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert, und eine Sequenz hat, die das FLAG-Peptid kodiert (Hopp, T. P. et al., Bio/Technology, 6, 1204–1210, 1988), zwei Transkriptions-Stop-Kodons, und eine NotI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle.
In dem ersten PCR-Schritt wurden drei Reaktionen A-B, C-D und E-F durchgeführt, und die drei PCR-Produkte, die aus der PCR des ersten Schrittes gewonnen wurden, wurden aufgrund der entsprechenden Komplementarität zusammengebaut. Nach der Zugabe der Primer A und F wurde der rekonstruierte 12B3-Einzelketten-Fv mit dem Linker, der aus 15 Aminosäuren besteht, amplifiziert (zweite PCR). In dem ersten PCR-Schritt wurden das Plasmid HEF-12B5H-gγ1 (siehe Beispiel 7.1), welches die rekonstruierte V-Region der H-Kette von 12B5 kodiert, pSCFVT7-hM21 (humanisierter ONS-M21-Antikörper) (Ohtomo et al., Anticancer Res. 18 (1998), 4311–4316), welcher DNA (SEQ ID Nr. 83) enthält, die die Linkerregion kodiert, die aus Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879–5883, 1988) besteht und das Plasmid HEF-12B5L-gκ (siehe Beispiel 7.2), welches das rekonstruierte 12B5-L-Ketten-V-Region kodiert als Matrizen verwendet.
50 μl der PCR-Lösung des ersten Schrittes enthielten 5 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs, 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (alle von Perkin Elmer), jeweils 100 pmol jedes Primers und 100 ng jeder Matrizen-DNA. Die PCR-Lösung wurde bei 94°C Anfangstemperatur für 9 Minuten erwärmt, bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, Nach 35-maligem Wiederholen des Zyklus wurde das Reaktionsgemisch ferner für 5 Minuten auf 72°C erwärmt.
Die PCR-Produkte A-B, C-D und E-F wurden in der zweiten PCR zusammengebaut. Die PCR-Mischungsösung des zweiten Schrittes aus 98 μl enthielten als Matrize 1 μl des ersten PCR-Produktes A-B, 0,5 μl des PCR-Produktes C-D und 1 μl des PCR-Produktes E-F, 10 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs, 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (alle von Perkin Elmer) und wurden für 9 Minuten auf 94°C Anfangstemperatur erwärmt, für 2 Minuten bei 94°C, für 2 Minuten bei 65°C und für zwei Minuten bei 72°C. Nach zweimaligem Wiederholen des Zyklus wurden jeweils 100 pmol jedes der Primer A-F hinzugegeben. Nach 35-maligem Wiederholen des Zyklus, der aus 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minuten bestand, wurde die Reaktionsmischung für 5 Minuten auf 72°C erwärmt.
Die DNA-Fragmente, die in der zweiten PCR hergestellt wurden, wurden unter Verwendung eines 1,5%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegels gereinigt, mit EcoRI und NotI verdaut und in pCHO1-Vektor und pCOS1-Vektor kloniert ( Japanische Patentanmeldung Nr. 8-255196 ). Der Expressionsvektor pCHO1 war ein Vektor, der durch Deletieren des Antikörper-Genes von DHFR-ΔE-rvH-PM1-f (siehe WO 92/19759 ) durch EcoRI- und SmaI-Verdau, und durch Verbinden des EcoRI-NotI-BamHI-Adapters (Takara Shuzo) entfernt wurde. Nach Bestimmen der DNA-Sequenz der Plasmide, die das DNA-Fragment enthalten, welches die korrekte Aminosäuresequenz des rekonstruierten 12B5-Einzelketten-Fv kodiert, wurden diese als pCHO-sc12B5 und pCOS-sc12B5 bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz der rekonstruierten 12B5-Einzelketten-Fvs, die in den Plasmiden pCHO-sc12B5 und pCOS-sc12B5 enthalten sind, sind in SEQ ID Nr. 84 gezeigt.
7.4 Expression des Antikörpers 12B5 (IgG, Fab) und des einzelkettigen Fv-Polypeptids in Tierzellen
Der Antikörper 12B5 (IgG, Fab) und der einzelkettige Fv, die vom Antikörper 12B5 stammen, wurden unter Verwendung von COS7-Zellen oder CHO-Zellen exprimiert.
Die transiente Expression unter Verwendung von COS7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt. Die Transfektion wurde durch Elektroporationsverfahren unter Verwendung der Gene-Pool-Pulser-Ausrüstung (BioRad) durchgeführt. Zur Expression des Antikörpers 12B5 (IgG) wurden jeweils 10 μg des oben erwähnten Expressionsvektors HEF-12B5H-gγ1 und HEF-12B5L-gκ hinzugegeben, zur Expression des 12B5Fab-Fragmentes jeweils 10 μg pFd-12B5H und HEF-12B5L-gκ wurden hinzugegeben und für die Expression des einzelkettigen Fv wurden 10 μg pCOS-sc21B5 zu COS7-Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml) hinzugegeben, welche in 0,8 ml PBS suspendiert waren. Die Mischung wurde in einer Cuvette gegeben und durch einen Puls mit einer Kapazität von 1,5 kV, 25 μF behandelt. Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden elektroporierte Zellen zu DMEM-Kulturmedium (Gibco BRL) gegeben, welches 10% fötales Rinderserum enthält, und kultiviert. Nach dem Kultivieren über Nacht wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, zu Serum-freien Medium CHO-S-SFM II gegeben und für 2 Tage kultiviert. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und mit einem 0,22 μm Filter filtriert, um den Kulturüberstand herzustellen.
Um eine stabile Expression in einer CHO-Zelllinie für den einzelkettigen Fv (Polypeptid) zu etablieren, welcher vom Antikörper 12B5 stammt, wurde der Expressionsvektor pCHO-sc12B5 wie folgt in CHO-Zellen eingeschleust.
Der Expressionsvektor wurde durch das Elektroporationsverfahren unter Verwendung der Gene-Pulser-Ausrüstung (BioRad) in CHO-Zellen eingeschleust. Linearisierte DNA (100 μg), die durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym PvuI gewonnen wurde und CHO-Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml), die in 0,8 ml PBS suspendiert waren, wurden in einer Cuvette gemischt, für 10 Minuten auf Eis stehen gelassen und mit einem Puls bei einer Kapazität von 1,5 kV, 25 μF behandelt. Nach einer Erholungsphase für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu CHO-S-SFM II (Gibco. BRL) gegeben, welches 10% fötales Rinderserum enthält, und kultiviert. Nach dem Kultivieren für 2 Tage wurde die Kultivierung in CHO-S-SFM II (Gibco BRL) fortgesetzt, das 5 nm Methotrexat (Sigma) und 10% fötales Rinderserum enthält. Aus den so gewonnenen Klonen wurde ein Klon mit hoher Expressionsrate als Produktionszelllinie für den 12B5-einzelkettigen Fv ausgewählt. Nach der Kultivierung in Serum-freien Medium CHO-S-SFM II (Gibco BRL), das 5 nM Methotrexat (Sigma) enthält, wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugalabtrennung der Zelltrümmer gewonnen.
7.5 Reinigung des einzelkettigen Fv, der von 12B5 abstammt, welcher durch CHO-Zellen hergestellt wird
Der Kulturüberstand der CHO-Zelllinie, welche den einzelkettigen 12B5 Fv exprimiert, welcher in 7.4 gewonnen wurde, wurde mittels Anti-FLAG-Antikörper-Säule und Gelfiltrations-Säule gereinigt.
(1) Anti-FLAG-Antikörper-Säule
Der Kulturüberstand wurde zu Anti-FLAG M2-Affinitätsgel (Sigma) gegeben, welches mit PBS äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wurden die an die Säule adsorbierten Proteine mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 3,5) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden sofort durch Zugabe von 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert. Die eluierten Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und die Fraktion, von der bestätigt wurde, dass sie einzelkettigen Fv enthält, wurde unter Verwendung von Centricon-10 (Milipore) aufkonzentriert.
(2) Gelfiltration
Die konzentrierte Lösung, die in (1) gewonnen wurde, wurde auf eine Superdex-200-Säule (10 × 300 mm, Amersham Pharmacia) gegeben, welche mit PBS äquilibriert wurde, das 0,01% Tween 20 enthält. Das Produkt sc12B5 wurde in zwei Peaks (A, B) eluiert (siehe 48). Die Fraktionen A und B wurden unter Verwendung eines 14%igen SDS-Polyacrylamid-Gels analysiert. Die Probe wurde mittels Elektrophorese in Gegenwart und Abwesenheit eines Reduktionsmittels gemäß dem Laemmlie-Verfahren verarbeitet und mittels Coomassie- Brilliant-Blue nach der Elektrophorese gefärbt. Wie in 49 gezeigt ist, erzeugten die Fraktionen A und B unabhängig vom Vorhandensein des Reduktionsmittels oder dessen Abwesenheit eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 31 kD. Wenn die Fraktionen A und B mittels Gelfiltration unter Verwendung von Superdex-200 PC 3,2/30 (3,2 × 300 mm, Amersham Pharmacia) analysiert wurden, ergab die Fraktion A ein eluiertes Produkt eines offensichtlichen Molekulargewichts von ungefähr 44 kD und die Fraktion B ergab dies bei 22 kD (siehe 50a und b). Die Ergebnisse zeigen, dass die Fraktion A das nicht kovalent gebundene Dimer des einzelkettigen Fv sc12B5 ist, und B dessen Monomer ist.
7.6 Messung der TPO-artigen agonistischen Wirkung verschiedener einzelkettiger Fvs
Die TPO-artige Aktivität des einzelkettigen Anti-MPL-Antikörpers wurde durch Messung der Proliferations-Aktivität bei Ba/F3-Zellen (BaF/mpl) gemessen, die den menschlichen TPO-Rezeptor exprimieren (MPL). Nach zweimaligem Waschen der BaF/Mpl-Zellen mit RPMI1640-Kulturmedium (Gibco), das 10% fötales Rinderserum enthält (Gibco), wurden die Zellen in dem Kulturmedium bei einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Der einzelkettige Anti-MPL-Antikörper und menschliches TPO (R&D Systems) wurden mit dem Kulturmedium verdünnt. 50 μl der Zellsuspension und 50 μl des verdünnten Antikörpers oder des menschlichen TPO wurden in 96 Well Mikroplatten (Flachboden) (Falcon) gegeben und in einem CO₂-Inkubator (Co₂-Konzentration: 5%) für 24 Stunden kultiviert. Nach der Inkubation wurden 10 μl des WST-8-Reagens (Reagens zur Messung der Anzahl an unbehandelten Zellen SF: Nacalai Tesque) hinzugegeben und die Absorption wurde direkt bei einer Messwellenlänge von 450 nm, und bei einer Referenzwellenlänge von 620 nm unter Verwendung des Fluoreszenz-Absorptions-Photometers Spectra Fluor (Tecan) gemessen. Nach dem Inkubieren in einem CO₂-Inkubator (Co₂- Konzentration: 5%) für 2 Stunden wurden die Absorption bei 450 nm Messwellenlänge und 620 nm Referenzwellenlänge wieder unter Verwendung des Spectra Fluor gemessen. Da das WST-8-Reagens in Abhängigkeit von der Anzahl an lebenden Zellen bei einer Wellenlänge von 450 nm eine Farbreaktion entwickelt, wurde die Proliferationsaktivität von BaF/Mpl auf Grundlage der Absorption in 2 Stunden mittels ED 50, die wie folgt berechnet wurde, beurteilt. In der Proliferationsreaktionskurve, in der die Absorption auf der Ordinate aufgetragen wurde, gegenüber der Antikörper-Konzentration auf der Abzisse, wurde die Absorption auf ein Plateau einer 100%igen Reaktionsrate festgelegt. Das Gewinnen einer Annäherungsformel durch einen geradliniges Annäherungsverfahren, das auf den aufgetragenen Werten beruht, die nahe 50% der Reaktionsrate liegen, wurde die Antikörper-Konzentration der 50%igen Reaktionsrate berechnet und als ED 50 angeführt.
Die Ergebnisse der agonistischen Wirkung gegenüber MPL, welche unter Verwendung der Kulturüberstände von COS7-Zellen gemessen wurden, die verschiedene 12B5-Antikörpermoleküle exprimieren, zeigte sich wie in 51 dargestellt, so dass 12B5IgG mit einer bivalenten Antigen-Bindungsstelle die Absorption in Konzentrations-abhängiger Weise erhöhte und TPO-artige agonistische Wirkung hatte (ED50; 29 nH), während die agonistische Aktivität von 12B5Fab mit einer monovalenten Antigen-Bindungsstelle sehr schwach war (ED50; 34,724 nM). Im Gegensatz dazu zeigte der einzelkettige Fv (sc12B5) mit einer monovalenten Antigen-Bindungsstelle wie Fab stark agonistische Wirkung bei einem Niveau, bei dem die ED50 75 nM war. Jedoch ist bekannt gewesen, dass variable Bereiche der H-Kette und L-Kette des einzelkettigen Fv durch eine nicht kovalente Bindung verbunden sind, und daher ist jeder variable Bereich in einer Lösung dissoziiert und kann mit einem variablen Bereich eines anderen Moleküls assoziiert werden, um Multimere, wie beispielsweise Dimere, zu bilden. Wenn das Molekulargewicht des sc12B5, welches mittels Gelfiltration gereinigt wurde, gemessen wurde, wurde festgestellt, dass es Moleküle gab, die als Monomer und Dimer erkannt wurden (siehe 48). Das Monomer sc12B5 und das Dimer sc12B5 wurden isoliert (siehe 50) und hinsichtlich ihrer agonistischen Wirkung gegenüber MPL gemessen. Wie in den 51 und 52 gezeigt, war die ED50 des sc12B5 Monomers 4.438,7 nM, was bestätigte, dass die agonistische Aktivität im Vergleich mit dem Ergebnis unter Verwendung des Kulturüberstandes der COS7-Zellen reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigten einzelkettige Fv (sc12B5 Dimer) mit bivalenter Antigen-Bindungsstelle eine ungefähr 400-fach stärkere agonistische Aktivität (ED50; 10,1 nM) verglichen mit dem monovalenten sc12B5. Des Weiteren zeigte der bivalente einzelkettige Fv agonistische Aktivität, die äquivalent oder höher war als die agonistische Aktivität von menschlichem TPO und 12B5IgG.
Beispiel 8
Herstellung eines Gens, das den variablen Bereich des menschlichen Antikörpers 12E10 gegen menschliches MPL kodiert
Eine DNA, die den variablen Bereich eines menschlichen monoklonalen Antikörpers 12E10 gegen menschliches MPL kodiert, wurde wie folgt konstruiert:
8.1 Konstruktion eines Gens, das die 12E10-H-Ketten-V-Region kodiert
Die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 86 wurde auf Grundlage der Aminosäuresequenz, die in WO 99/10494 (SEQ ID Nr. 85) beschrieben ist, als Gen entworfen, das die H-Ketten-V-Region des menschlichen Antikörpers 12E10 kodiert, welcher an menschliches MPL bindet. Die Nucleotidsequenz vollständiger Länge wurde durch Verbinden der Leadersequenz mit dem 5'-Ende (SEQ ID Nr. 87) entworfen, welche vom menschlichen Antikörper-Gen stammt (GenBank Zugangs-Nr. AF062252). Die entworfene Nucleotidsequenz wurde in vier Oligonucleotide mit überlappenden Sequenzen von jeweils 15 bp unterteilt (12E10VH1, 12E10VH2, 12E10VH3, 12E10VH4). 12E10VH1 (SEQ ID Nr. 88) und 12E10VH3 (SEQ ID Nr. 90) wurden in Sense-Richtung synthetisiert; und 12E10VH2 (SEQ ID Nr. 89) und 12E10VH4 (SEQ ID Nr. 91) in Anti-Sense-Richtung. Nach dem Zusammenbau der jeweiligen synthetisierten Oligonucleotide durch die entsprechende Komplementariatät wurden die externen Primer (12E10VHS und 12E10VHA) hinzugegeben, um die Gesamtlänge des Gens zu amplifizieren. 12E10VHS (SEQ ID Nr. 92) wurde entworfen, um an das 5'-Ende der Leader-Sequenz durch den Vorwärtsprimer zu hybridisieren und so, dass er eine HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und eine Kozak-Sequenz hat, und 12E10VHA (SEQ ID Nr. 93) wurde entworfen, damit er mit der Nucleotidsequenz hybridisiert, die den C-Terminus der H-Ketten-V-Region durch den Umkehrprimer hybridisiert und eine Splice-Donor-Sequenz und eine BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle hat.
100 μl der PCR-Lösung, die 10 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (alle von Perkin Elmer) enthält und jeweils 2,5 pmol jedes synthetisierten Oligonucleotids (12E10VH1 bis –4) wurden für 9 Minuten auf eine Anfangstemperatur von 94°C erwärmt, für 2 Minuten auf 94°C, für 2 Minuten auf 55°C, und für 2 Minuten auf 72°C. Durch zweimaliges Wiederholen des Zyklus wurden jeweils 100 pmol der externen Primer 12E10VHS und 12E10VHA hinzugegeben. Die Mischung wurde 35 Mal einem Zyklus unterworfen, der aus 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute besteht und weiter für 5 Minuten bei 72°C erwärmt.
Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe eines 1,5%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegels (Sigma) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut und in den Menschen-H-Ketten-Expressionsvektor HEF-gγ1 kloniert. Nach der Bestimmung der DNA-Sequenz wurde das Plasmid, das die korrekte DNA-Sequenz enthält, als HEF-12E10H-gγ1 bezeichnet.
Das HEF-12E10H-gγ1 wurde durch die Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI verdaut, um das Gen zu produzieren, das 12E10VH kodiert, und dann in den Menschen-Fab-H-Ketten-Expressionsvektor pCOS-Fd kloniert, um pFd-12E10H herzustellen. Der menschliche Fab-H-Ketten-Expressionsvektor wurde durch Amplifizieren der DNA (SEQ ID Nr. 63) mittels PCR und durch Inserieren des PCR-Produktes in den Tierzell-Expressionsvektor pCOS1 konstruiert, die den Intronbereich enthält, welcher zwischen den Genen vorhanden ist, die den V-Bereich der H-Kette eines menschlichen Antikörpers kodieren und den konstanten Bereich, und das Gen, welches einen Teil der konstanten Region der H-Kette des Menschen kodiert. Der konstante Bereich der H-Kette des Menschen wurde für das Gen unter den gleichen Bedingungen, die oben erwähnt wurden, unter Verwendung von HEF-gγ1 als Matrize, G1CH1-S (SEQ ID Nr. 64) als Vorwärtsprimer, welcher so entworfen wurde, dass er an die 5'-Endsequenz des Introns 1 hybridisiert und eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle für EcoRI und BamHI hat und als Umkehrprimer G1CH-A (SEQ ID Nr. 65), welcher so entworfen wurde, dass er an das 3'-Ende der CH1-Domäne der konstanten Region der H-Kette des Menschen bindet, und eine Sequenz hat, die einen Teil des Scharnierbereichs, zwei Stop-Kodons und die Restriktionsenzym-Erkennungsstellt BglII kodiert, amplifiziert.
Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz der variablen Region der H-Kette des rekonstruierten 12E10, welche in den Plasmiden HEF-12E10H-gγ1 und pFd-12E10H eingeschlossen sind, sind in SEQ ID Nr. 94 gezeigt.
8.2 Konstruktion eines Gens, das 12E10 L-Ketten-V-Region kodiert
Die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 96 wurde auf Grundlage der Aminosäuresequenz, die in WO 99/10494 beschrieben ist (SEQ ID Nr. 95) als Gen entworfen, das die V-Region der L-Kette des menschlichen Antikörpers 12E10 kodiert, welcher an menschliches MPL bindet. Sie wurde weiter so gestaltet, dass an dessen 5'-Ende die Leadersequenz (SEQ ID Nr. 97) gebunden wurde, die vom menschlichen Antikörper-Gen stammt (Mol. Immunol. 1992; 29: 1515–1518). In gleicher Weise wie oben erwähnt, wurde die Nucleotidsequenz, die entworfen wurde, in vier Oligonucleotide unterteilt, die überlappende Sequenzen von jeweils 15 bp haben (12E10VL1, 12E10VL2, 12E10VL3, 12E10VL4) und jeweils synthetisiert. 12E10VL1 (SEQ ID Nr. 98) und 12E10VL3 (SEQ ID Nr. 100) haben Sense-Sequenzen, und 12E10VL2 (SEQ ID Nr. 99) und 12E10VL4 (SEQ ID Nr. 101) haben Anti-Sense-Sequenzen. Jedes der synthetisierten Oligonucleotide wurde durch entsprechende Komplementarität zusammengebaut und mit den externen Primern (12E10VLS und 12E10VLA) gemischt, um die vollständige Länge des Gens zu amplifizieren. 12E10VLS (SEQ ID Nr. 102) wurde entworfen, um durch den Vorwärtsprimer an das 5'-Ende der Leadersequenz zu hybridisieren und hat eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und eine Kozak-Sequenz. 12E10VLA (SEQ ID Nr. 103) wurde so entworfen, dass es durch den Umkehrprimer mit der Nucleotidsequenz hybridisiert, die den C-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert, und eine BlnI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle hat.
Nach Durchführung der PCR, wie oben erwähnt, wurde das PCR-Produkt durch ein 1,5%iges bei niedriger Temperatur schmelzendes Agarosegel (Sigma) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BlnI verdaut, und in pUC19 kloniert, welcher ein Gen der konstanten Region der menschlichen lambda-Kette enthält. Nach der Bestimmung der DNA-Sequenz wurde das Plasmid, das die korrekte DNA-Sequenz enthält, mittels EcoRI verdaut, um ein Gen herzustellen, das die V-Region der L-Kette von 12E10 und einen konstanten Bereich der lambda-Kette des Menschen kodiert, und dann in den Expressionsvektor pCOS1 inseriert. Das Plasmid mit dem 12E10-L-Ketten-Gen (SEQ ID Nr. 104) wurde als pCOS-12E10L bezeichnet.
8.3 Herstellung des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv
Der rekonstruierte einzelkettige Fv des 12E10-Antikörpers wurde so entworfen, dass er die Reihenfolge 12E10VH-Linker12-E10VL und eine FLAG-Sequenz (SEQ ID Nr. 105) am C-Terminus hat, um den Nachweis und die Reinigung zu erleichtern. Die rekonstruierten 12E10 Ketten-Fvs (sc12E10 und db12E10) wurden unter Verwendung einer Linkersequenz konstruiert, die aus 15 Aminosäuren besteht, die durch (Gly₄Ser)₃ oder 5 Aminosäuren, die durch (Gly₄Ser)₁ dargestellt werden, besteht.
(1) Herstellung des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fvs unter Verwendung der Linkersequenz, die aus 5 Aminosäuren besteht
Das Gen, welches den rekonstruierten 12E10 einzelkettigen Fv kodiert, welcher die Linkersequenz enthält, die aus 5 Aminosäuren besteht, wurde durch Einbau der Nucleotidsequenz des Linkers (Gly₄Ser)₁ am 3'-Ende des Gens, welches 12E10 H-Ketten-V-Region kodiert und am 5'-Ende des Gens, das den V-Bereich der L-Kette von 12E109 kodiert, durch Amplifizieren des so gewonnenen jeweiligen Gens mittels PCR und durch Verbinden der amplifizierten Bereiche gewonnen. Vier PCR-Primer (A-D) wurden verwendet, um die rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fvs herzustellen. Die Primer A und C hatten Sense-Sequenzen und die Primer B und D hatten Anti-Sense-Sequenzen.
Der Vorwärtsprimer für den V-Bereich der H-Kette war 12E10S (Primer A, SEQ ID Nr. 106). Der Umkehrprimer DB2 (Primer B, SEQ ID Nr. 107) für den V-Bereich der H-Kette wurde so entworfen, dass er an DNA hybridisiert, die den C-Terminus der V-Region der H-Kette kodiert und eine Nucleotidsequenz hat, die den Linker (Gly₄Ser)₁ kodiert, und die Nucleotidsequenz, die den N-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert.
Der Vorwärtsprimer DB1 (Primer C, SEQ ID Nr. 108) für den V-Bereich der L-Kette wurde so entworfen, dass er mit der DNA hybridisiert, die den N-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert und eine Nucleotidsequenz hat, die den Linker (Gly₄Ser)₁ kodiert und die Nucleotidsequenz, die den C-Terminus der V-Region der H-Kette kodiert. Der Umkehrprimer 12E10FA (Primer D, SEQ ID Nr. 109) für den V-Bereich der L-Kette wurde so entworfen, dass er mit der DNA hybridisiert, die den C-Terminus der L-Ketten-V-Region kodiert, und eine Nucleotidsequenz hat, die FLAG und die NotI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle kodiert.
In dem ersten PCR-Schritt wurden zwei Reaktionen A-B und C-D durchgeführt, und die zwei PCR-Produkte, die in dem ersten Schritt der PCR gewonnen wurden, wurden jeweils durch die entsprechende Komplementarität zusammengebaut. Nach dem Zugeben der Primer A und D wurde die DNA vollständiger Länge, die den rekonstruierten 12E10 einzelkettigen Fv mit dem Linker, der aus 5 Aminosäuren besteht, amplifiziert (zweite PCR). In der PCR des ersten Schritts wurde das Plasmid HEF-12E10H-gγ1 (siehe Beispiel 8.2), welches die rekonstruierte V-Region der H-Kette von 12E10 kodiert, und pCOS-12E10L (siehe Beispiel 8.1), welches die V-Region der L-Kette des rekonstruierten 12E10 kodiert, als Matrize verwendet.
50 μl der PCR-Lösung des ersten Schrittes enthielten 5 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs, 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (von Perkin Elmer), jeweils 100 pmol jedes Primers und 100 ng jeder Template-DNA. Die PCR-Lösung wurde für 9 Minuten auf 94°C Anfangstemperatur erwärmt, für 30 Sekunden auf 94°C, für 30 Sekunden auf 55°C und für 1 Minute auf 72°C. Nach 35-maligem Wiederholen des Zyklus wurde die Reaktionsmischung weiter für 5 Minuten auf 72°C erwärmt.
Die PCR-Produkte A-B (429 bp) und C-D (395 bp) wurden durch die zweite PCR zusammengebaut. Die Lösung des PCR-Gemischs des zweiten Schritts (98 μl), die jeweils 1 μl des ersten PCR-Produktes A-B bzw. C-D als Matrizen enthält, 100 pmol jedes Primers, 10 μl 10 × PCR Gold-Puffer II, 1,5 mM MgCl₂, 0,08 mM dNTPs und 5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq Gold (von Perkin Elmer) wurde unter den gleichen Bedingungen, wie oben erwähnt, umgesetzt.
Das DNA-Fragment von 795 bp, das durch die zweite PCR hergestellt wurde, wurde unter Verwendung eines 1,5%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegels gereinigt, mit EcoRI und NotI verdaut und in den pCHO1-Vektor oder pCOS1-Vektor kloniert. Der Expressionsvektor pCHO1 war ein Vektor, der durch Deletieren des Antikörper-Gens von DHFR-ΔE-RVH-PM1-f (siehe WO 92/19759 ) durch EcoRI- und SamI-Verdau und Verbinden mit dem EcoRI-NotI-BamHI-Adapter (Takara Shuzo) konstruiert wurde. Nach der Bestimmung der DNA-Sequenz wurden die Plasmide, die das DNA-Fragment enthalten, welches die korrekte Aminosäuresequenz des rekontruierten 12E10 Einzelketten-Fv kodieren, als pCHO-db12E10 bzw. pCOS-db12E10 bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv, die in den Plasmiden pCHO-db12E10 und pCOS-db12E10 eingeschlossen ist, ist in SEQ ID Nr. 110 gezeigt.
(2) Produktion des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv unter Verwendung der Linkersequenz, die aus 15 Aminosäuren besteht
Das Gen, welches den rekonstruierten 12E10 Antikörper-Einzelketten-Fv kodiert, welcher die Linkersequenz enthält, die aus 15 Aminosäuren besteht, wurde durch Einschleusen der Nucleotidsequenz für den Linker (Gly₄Ser)₃ am 3'-Ende des Gens konstruiert, das die 12E10 V-Region der H-Kette kodiert, und an das 5'-Ende des Gens, das die V-Region der L-Kette von 12E10 kodiert, durch Amplifizieren der so gewonnenen jeweiligen Gene durch PCR und das Verbinden der amplifizierten Gene. Vier PCR-Primer (A-D) wurden für die Produktion des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fvs verwendet. Die Primer A und C hatten Sense-Sequenzen und die Primer B und D hatten Anti-Sense-Sequenzen.
Der Vorwärtsprimer für die V-Region der H-Kette war 12E10S (Primer A, SEQ ID Nr. 106). Der Umkehrprimer sc4.3 (Primer B, SEQ ID Nr. 111) für die V-Region der H-Kette wurde so entworfen, dass er an DNA hybridisiert, die den C-Terminus der V-Region der H-Kette kodiert und die Nucleotidsequenz hat, die den Linker (Gly₄Ser)3 und die Nucleotidsequenz, die den N-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert.
Der Vorwärtsprimer sc1.3 (Primer C, SEQ ID Nr. 112) für die V-Region der L-Kette wurde so entworfen, dass er an die DNA zu hybridisiert, die den N-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert und eine Nucleotidsequenz hat, die den Linker (Gly₄Ser)₃ kodiert und mit der Nucleotidsequenz, die den C-Terminus der V-Region der H-Kette kodiert, hybridisiert. Der Umkehrprimer 12E10FA (Primer D, SEQ ID Nr. 109) für die V-Region der L-Kette wurde so entworfen, dass er an die DNA hybridisiert, die den C-Terminus der V-Region der L-Kette kodiert und eine Nucleotidsequenz hat, die FLAG und eine NotI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle kodiert.
Im ersten PCR-Schritt wurden zwei Reaktionen A-B und C-D durchgeführt, und die zwei PCR-Produkte, die aus dem ersten Schritt der PCR gewonnen wurden, wurden durch die jeweilige Komplementarität zusammengebaut. Nach dem Zugeben der Primer A und D wurde die vollständige Länge der DNA, die den rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv kodiert, mit dem Linker, der aus 15 Aminosäuren besteht, amplifiziert (zweite PCR). In dem ersten PCR-Schritt wurde das Plasmid pCOS- db12E10 (siehe Beispiel 8.3 (1)), welches den rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv kodiert als Matrize verwendet.
50 μl der PCR-Lösung des ersten Schritts enthielt 5 μl 10 × ExTaq-Puffer, 0,4 mM dNTPs, 2,5 Einheiten DNA-Polymerase TaKaRa ExTaq (von Takara), jeweils 100 pmol jedes Primers und 10 ng jeder DNA-Matrize. Die PCR-Lösung wurde für 30 Sekunden auf eine Anfangstemperatur von 94°C erwärmt, für 15 Sekunden auf 94°C, und für 2 Minuten auf 72°C, und der Zyklus wurde 5 Mal wiederholt. Nach 28-maligem Wiederholen des Zyklus aus 15 Sekunden bei 94°C und 2 Minuten bei 70°C wurde die Reaktionsmischung für 5 Minuten bei 72°C weiter erwärmt.
Die PCR-Produkte A-B (477 bp) und C-D (447 bp) wurden durch die zweite PCR zusammengebaut. Die Lösung der PCR-Mischung des zweiten Schritts (98 μl), die jeweils 1 μl der ersten PCR-Produkte A-B und C-D als Matrizen enthielt, 100 pmol jedes der jeweiligen Primer A und D, 5 μl 10 × ExTaq-Puffer, 0,4 mM dNTPs, 2,5 Einheiten DNA-Polymerase TaKaRa ExTaq (von Takara) wurde unter gleichen Bedingungen wie oben erwähnt umgesetzt.
Das DNA-Fragment von 825 bp, das durch die zweite PCR hergestellt wurde, wurde unter Verwendung eines 1,0%igen bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegels gereinigt und mit EcoRI und NotI verdaut. Das so gewonnene DNA-Fragment wurde in den pCHO1-Vektor oder pCOS1-Vektor kloniert. Nach der Bestimmung der DNA-Sequenz wurden die Plasmide, die das DNA-Fragment enthalten, welches die korrekte Aminosäuresequenz des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fvs kodiert, als pCHO-sc12E10 und pCOS-sc12E10 bezeichnet. Die Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz des rekonstruierten 12E10 Einzelketten-Fv, die in den Plasmiden pCHO-sc12E10 und pCOS-sc12E10 enthalten sind, sind in SEQ ID Nr. 113 gezeigt.
8.4 Expression des Antikörpers 12E10 (IgG, Fab) und des einzelkettigen Fv-Polypeptids durch Tierzellen
Der Antikörper 12E10 (IgG, Fab) und einzelkettige Fv, die vom Antikörper 12E10 stammen (Linkersequenz 5 Aminosäuren, 15 Aminosäuren) wurden unter Verwendung von COS7-Zellen oder CHO-Zellen exprimiert.
Die transiente Expression unter Verwendung von COS7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt. Die Transfektion wurde durch Elektroporationsverfahren unter Verwendung der Ausrüstung des Gene-Pulser II (BioRad) durchgeführt. Für die Expression des Antikörpers 12E10 (IgG) wurden jeweils 10 μg des oben erwähnten Expressionsvektors HEF-12E10H-gγ1 und pCOS-12E10L hinzugegeben, und für die Expression des 12E10Fab-Fragments jeweils 10 μg pFd-12E10H und pCOS-12E10L hinzugegeben und für die Expression des einzelkettigen Fv von pCOS-sc12E10 (10 μg) oder pCOS-db12E10 (10 μg) wurden COS7-Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml) hinzugegeben, welche in 0,8 ml PBS suspendiert waren. Die Mischung wurde in einer Cuvette gelassen und durch einen Puls mit einer Kapazität von 1,5 kV, 25 μF behandelt. Nach der Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu DMEM-Medium (Gibco BRL) gegeben, das 10% fötales Rinderserum enthält und kultiviert. Nach der Kultivierung über Nacht wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in Serum-freies Medium CHO-S-SFM II (Gibco BRL) gegeben und für 3 Tage kultiviert. Der Kulturüberstand wurde zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und mit einem 0,22 μm Filter filtriert.
Um eine stabile Expression durch eine CHO-Zelllinie für den einzelkettigen Fv (Polypeptid) zu etablieren, der vom Antikörper 12E10 stammt, wurde der Expressionsvektor pCHO-sc12E10 oder pCHO-ds12E10 in CHO-Zellen eingeschleust.
Jeder Expressionsvektor wurde durch Elektroporationsverfahren unter Verwendung der Ausrüstung des Gene-Pulser II (BioRad) in CHO-Zellen eingeschleust. Linearisierte DNA (100 μg), welche durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym PvuI gewonnen wurde und CHO-Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml), die in 0,8 ml PBS suspendiert waren, wurden in einer Cuvette gemischt, für 10 Minuten auf Eis stehen gelassen und mit einem Puls bei einer Kapazität von 1,5 kV, 25 μF behandelt. Nach einer Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die elektroporierten Zellen zu CHO-S-SFM II-Medium (Gibco BRL) gegeben, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum und Nucleinsäure enthält, und kultiviert. Nach der Kultivierung für zwei Tage wurde die Kultivierung in Nucleinsäure-freiem CHO-S-SFM II-Medium (Gibco BRL) fortgesetzt, das 10% dialysiertes fötales Rinderserum enthält. Aus den so gewonnenen Klonen wurde ein Klon mit hoher Expressionsrate als Produktionszelllinie für 12E10 Einzelketten-Fv ausgewählt. Nach Kultivierung in Serum-freiem CHO-S-SFM II-Medium (Gibco BRL) wurde der Kulturüberstand zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und mit einem 0,22 μm Filter filtriert.
8.5 Reinigung des einzelkettigen Fv, der von 12E10 stammt, welcher von CHO-Zellen hergestellt wird
Die Kulturüberstände, die durch CHO-Zelllinien hergestellt wurden, welche 12E10 Einzelketten-Fvs (sc12E10, db12E10) exprimieren, die in Beispiel 8.4 gewonnen wurden, wurden mittels Anti-FLAG-Antikörper-Säule bzw. Gelfiltrations-Säule gereinigt, um die gereinigten einzelkettigen Fvs herzustellen.
(1) Reinigung mittels Anti-FLAG-Antikörper-Säule
Jeder Kulturüberstand (sc1wE10, db12E10) wurde zu einer Anti-FLAG M2-Affinitäts-Gel-Säule (Sigma) gegeben, die mit 50 mM Tris-HC1-Puffer (pH 7,4) äquilibriert war, der 150 mM NaCl enthält. Nach dem Waschen der Säule durch den gleichen Puffer wurden die an die Säule adsorbierten Proteine mit 100 mM Glycinpuffer (pH 3,5) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden direkt durch Zugabe von 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die Fraktion, von der bestätigt wurde, dass sie den einzelkettigen Fv enthält, wurde zusammengegeben und ungefähr 20-fach unter Verwendung einer Centricon-10 (Amicon) aufkonzentriert.
(2) Gelfiltration
Die konzentrierte Lösung, die in (1) gewonnen wurde, wurde zu einer Superdex 200-Säulen-HR (10 × 300 mm, Amersham Pharmacia) gegeben, die mit PBS äquilibriert war, das 0,01% Tween 20 enthält. Chromatogramme sind in den 53 und 54 gezeigt. Das Produkt sc12E10 wurde in zwei Peaks (A, B) (siehe 53) eluiert. Das Produkt db12E10 wurde in zwei Peaks (C, D) (siehe 54) eluiert. Jede Peak-Fraktion wurde eingesammelt, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Reduktionsmittels behandelt, durch Elektrophorese gemäß dem Laemmli-Verfahren verarbeitet und mit Coomassie-Blue nach der Elektrophorese gefärbt. Wie in 55 gezeigt ist, erzeugten alle Fraktionen A, B, C und D unabhängig von dem Vorhandensein oder der Abwesenheit des Reduktionsmittels einer Einzelbande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr 31 kd. Wenn diese Fraktion mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Superdex 200-HR analysiert wurden, erzeugte die Fraktion A ein Produkt, das bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 42 kD eluierte, die Fraktion B bei 20 kD (siehe 56), die Fraktion C bei 69 kD und die Fraktion D bei 41 kD (siehe 57). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die von sc12E10 stammende Fraktion A das nicht kovalent gebundene Dimer des einzelkettigen Fv ist und die Fraktion B das Monomer des einzelkettigen Fv, und die von db12E10 stammende Fraktion C das nicht kovalent gebundene Trimer des einzelkettigen Fv und D das nicht kovalent gebundene Dimer des einzelkettigen Fv.
8.6 Messung der TPO-artigen agonistischen Wirkung verschiedener einzelkettiger Fvs
Die TPO-artige Aktivität von einzelkettigem anti-mpl-Antikörper wurde durch Messung der Proliferationsaktivität gegenüber Ba/F3-Zellen (BaF/mpl) gemessen, die den menschlichen TPO-Rezeptor exprimieren (MPL).
Durch zweimaliges Waschen von BaF/mpl-Zellen mittels RPMI1640-Medium (Gibco), welches 1% fötales Rinderserum (Gibco) enthält, wurden die Zellen in dem Medium mit einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Der einzelkettige Anti-MPL-Antikörper oder menschliches TPO (R&D Systems) wurden mit dem Medium verdünnt. 50 μl der Zellsuspension und 50 μl des verdünnten Antikörpers oder menschlichen TPOs wurden in eine 96 Well-Mikroplatte gegeben (Flachboden) (Corning), und in einem CO₂-Inkubator (CO₂-Konzentration: 5%) für 24 Stunden kultiviert. Nach der Inkubation wurden 10 μl des WST-8-Reagens (Reagens zur Messung der Anzahl an unbehandelten Zellen SF: Nacalai Tesque) hinzugegeben und die Absorption wurde direkt bei einer Messwellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 655 nm unter Verwendung des Absorptions-Photometers Benchmark Plus (BioRad) gemessen. Nach dem Inkubieren in einem CO₂-Inkubator (CO₂-Konzentration: 5%) für 2 Stunden wurde die Absorption bei einer Messwellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 655 nm wiederum unter Verwendung des Benchmark Plus gemessen. Da das WST-8-Reagens die Farbreaktion abhängig von der Anzahl an lebenden Zellen bei einer Wellenlänge von 450 nm entwickelte, wurde die Proliferationsaktivität von BaF/mpl auf Grundlage der Änderung der Absorption in den 2 Stunden untersucht.
Die agonistische Wirkung von MPL, welche unter Verwendung von Kulturüberständen von COS7-Zellen gemessen wurde, die verschiedene 12E10-Antikörper-Moleküle exprimieren, ist in 58 gezeigt. Einzelkettige Fvs mit dem 5-Aminosäure-Linker (ds12E10) und dem 15-Aminosäure-Linker (sc12E10) erhöhten die Absorption in einer Konzentrations-abhängigen Weise, was TPO-artige agonistische Aktivität (ED50; 9 pM bzw. 51 pM) zeigte, während 12E10IgG und 12E10Fab keine Aktivität besaßen.
Es ist gezeigt worden, dass die H-Kette und L-Kette des einzelkettigen Fv nicht nur innerhalb eines Moleküls assoziieren, sondern auch zwischen Molekülen, so dass Multimere sich bilden, wie beispielsweise Dimere. Wenn die Kulturüberstände von CHO-Zellen, die einzelkettige Fvs von 12E10 exprimieren, durch Gelfiltration behandelt wurden und auf agonistische Aktivität auf MPL getestet wurden. Diese Ergebnisse sind in 59 gezeigt. Das Dimer, welches sc12E10 in einer geringen Menge enthielt, zeigte ungefähr 5.000-fach stärkere TPO-artige agonistische Aktivität (sc12E10 Dimer, ED50; 1,9 pM) verglichen mit dem Monomer (sc12E10 Monomer, ED50; > 10 nM). Die Aktivität war höher als die von TPO (ED50; 27 pM). Das Dimer von db12E10 (db12E10-Dimer, ED50; 2,0 pM) zeigte starke Aktivität vergleichbar mit der des sc12E10-Dimers. db12E10-Trimer (ED50; 7,4 pM), welches vermutlich ein Trimer mit einem Molekulargewicht war, das durch Gelfiltration gewonnen wurde, zeigte eine hohe Aktivität, die niedriger ist als die vom db12E10-Dimer. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass es wichtig für die Aktivität des agonistischen Antikörpers 12E10 ist, dass die Antigen-Bindungsstelle bivalent ist (Dimer). In Anbetracht der Tatsache, dass 12E10 IgG keine Aktivität hat, sind andere Faktoren als die bivalent vorliegen, vermutlich wichtig, beispielsweise die Lokalisierung der Antigen-Bindungsstelle, der Abstand oder der Winkel.
Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welche darstellt, dass der menschliche IgG-Antikörper L1210-Zellen nicht bindet, die menschliches IAP exprimieren (hIAP/L1210).
2 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches darstellt, dass der chimärische MABL-1-Antikörper spezifisch an L1210-Zellen bindet, die menschliches IAP exprimieren (hIAP/L1210).
3 stellt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches dar und zeigt, dass der chimäre MABL-2-Antikörper spezifisch an L1210-Zellen, die menschliches IAP exprimieren (hIAP/L1210) bindet.
4 stellt schematisch das Verfahren zur Herstellung des einzelkettigen Fv gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
5 stellt die Struktur eines Expressionsplasmids dar, welches verwendet werden kann, um eine DNA, die den einzelkettigen Fv der Erfindung in E. coli zu exprimieren.
6 stellt eine Struktur des Expressionsplasmids dar, welches verwendet wird, um eine DNA, die den einzelkettigen Fv der Erfindung in Säugerzellen zu exprimieren.
7 zeigt das Ergebnis eines Western-Blots in Beispiel 5.4. Von links ein Molekulargewichtsmarker (welcher von oben 97,4, 66, 45, 31, 21,5 und 14,5 kDa angibt), den Kulturüberstand von pCHO1-eingeschleusten COS7-Zellen und den Kulturüberstand von mit pCHOM2-eingeschleusten COS7-Zellen. Es wird dargestellt, dass der rekonstruierte einzelkettige Fv des Antikörpers MABL-2 (Pfeil) in dem Kulturüberstand der Zellen enthalten ist, in die pCHOM2 eingeschleust ist.
8 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches zeigt, dass ein Antikörper im Kulturüberstand von pCHO1/COS7-Zellen als Kontrolle nicht an pCOS1/L1210-Zellen als Kontrolle bindet.
9 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches darstellt, dass ein Antikörper in den Kulturüberstand von MABL2-scFv/COS7-Zellen nicht an pCOS1/L1210-Zellen als Kontrolle bindet.
10 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches anzeigt, dass ein Antikörper in dem Kulturüberstand von pCOS1/COS7-Zellen als Kontrolle nicht an hIAP/L1210-Zellen bindet.
11 zeigt das Ergebnis der Durchflusscytometrie, welches darstellt, dass ein Antikörper im Kulturüberstand von MABL2-scFv/COS7-Zellen spezifisch an hIAP/L1210-Zellen bindet.
12 zeigt das Ergebnis des kompetitiven ELISA in Beispiel 5.6, wobei die Bindungsaktivität des einzelkettigen Fv der Erfindung (MABL2-scFv) das Antigen im Hinblick auf die Inhibierung der Bindung des Maus-monoklonalen Antikörpers MABL-2 an das Antigen als Index demonstriert wird, verglichen mit dem Kulturüberstand von pCHO1/COS7-Zellen als Kontrolle.
13 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.7, was darstellt, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von pCHO1/COS7-Zellen nicht die Apoptose von pCOS1/L1210-Zellen als Kontrolle induziert.
14 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkungen in Beispiel 5.7, und stellt dar, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von MABL2-scFv/COS7-Zellen keine Apoptose in pCOS1/L1210-Zellen als Kontrolle induziert.
15 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkugnen in Beispiel 5.7, was darstellt, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von pCHO1/COS7-Zellen als Kontrolle nicht die Apoptose in hIAP/L1210-Zellen induziert.
16 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.7, was darstellt, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von MABL2-scFv/COS7-Zellen spezifisch Apoptose von hIAP/L1210-Zellen induziert.
17 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.7, und stellt dar, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von pCHO1/COS7-Zellen als Kontrolle keine Apoptose in CCRF-CEM-Zellen induziert (bei einer 50%igen finalen Konzentration).
18 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.7, und stellt dar, dass der Antikörper in dem Kulturüberstand von MABL2-scFv/COS7-Zellen spezifisch Apoptose von CCRF-CEM-Zellen induziert (bei 50% der Endkonzentration).
19 zeigt das Chromatogramm, das bei der Reinigung des einzelkettigen Fv gewonnen wurde, welcher vom Antikörper MABL-2 abstammt, welcher von CHO-Zellen in Beispiel 5.9 hergestellt wird, und stellt dar, dass Fraktion A und Fraktion B als Hauptgipfel gewonnen wurden, wenn die Fraktion von der Blue-Sepharose-Säule mit einer Hydroxyapatit-Säule gereinigt wurde.
20 zeigt die Ergebnisse der Reinigung mittels Gelfiltration der Fraktion A und Fraktion B, welche in Beispiel 5.9-(2) gewonnen wurde, und stellt dar, dass die Haupt-Peaks (AI bzw. BI) der Fraktion A bei einem ungefähren Molekulargewicht von 36 kD und von der Fraktion B bei ungefähr 76 kD eluiert wurden.
21 ist die Analyse der Fraktionen auf SDS-PAGE, die bei der Reinigung des einzelkettigen Fvs gewonnen wurden, der vom Antikörper MABL-2 abstammt, welcher von CHO-Zellen in Beispiel 5.9 hergestellt wird, und stellt dar, dass in beiden Fraktionen eine einzelne Bande von ungefähr 35 kD Molekulargewicht beobachtet wurde.
22 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Fraktionen AI und BI, welche aus der Gelfiltration der Reinigung des einzelkettigen Fv, der vom Antikörper MABL-2 abstammt und welcher von CHO-Zellen hergestellt wird, wobei die Fraktion AI ein Monomer umfasst und die Fraktion BI ein Dimer umfasst.
23 stellt die Struktur eines Expressionsplasmids dar, welches verwendet werden kann, um DNA zu exprimieren, die den einzelkettigen Fv der Erfindung in E. coli exprimiert.
24 zeigt die Ergebnisse der Reinigung von Ausgangsprodukten des einzelkettigen Fv-Polypeptid auf einer Gel-Filtrations-Säule, welches vom Antikörper MABL-2 stammt und welches in E. coli hergestellt wurde, in Beispiel 5.12 gewonnen wurde, wobei jeder Peak ein Monomer bzw. Dimer des einzelkettigen Fv zeigt, welches in E. coli hergestellt wird.
25 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkungen in Beispiel 5.13, und stellt dar, dass der Maus-IgG-Antikörper als Kontrolle keine Apoptose von hIAP/L1210-Zellen induziert (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
26 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.13, und zeigt, dass das Dimer des MABL2-scFv, welches von CHO-Zellen hergestellt wird, Apoptose von hIAP/L1210-Zellen merklich induziert (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
27 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung im Beispiel 5.13, und stellt dar, dass das Dimer des MABL2-scFv, welches von E. coli hergestellt wird, die Apoptose von hIAP/L1210-Zellen in beachtlicher Weise induziert (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
28 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.13, und stellt dar, dass die Apoptose-Induzierung von hIAP/L1210-Zellen durch das MABL2-scFv- Monomer, welches durch CHO-Zellen hergestellt wurde, auf dem gleichen Niveau liegt wie das der Kontrolle (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
29 zeigt die Ergebnisse der Apopotose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.13, und zeigt, dass die Apoptose-Induzierung in hIAP/L1210-Zellen durch das MABL2-scFv-Monomer, das von E. coli hergestellt wurde, auf dem gleichen Niveau liegt wie das der Kontrolle (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
30 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.13, und stellt dar, dass der Maus-IgG-Antikörper, welcher als Kontrolle verwendet wird, keine Apoptose in hIAP/L1210-Zellen induziert, selbst wenn ein Anti-FLAG-Antikörper zugegeben wird (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
31 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 5.13, und zeigt, dass das MABL2-scFv-Monomer, das durch CHO-Zellen hergestellt wird, Apoptose von hIAP/L1210-Zellen in beachtlicher Weise induziert, wenn ein Anti-FLAG-Antikörper hinzugegeben wird (die Endkonzentration beträgt 3 μg/ml).
32 zeigt die Ergebnisse einer quantitativen Messung des menschlichen IgG im Serum einer mit der menschlichen Myelom-Zelllinie KPMM2-transplantierten Maus, und stellt die Mengen an menschlichem IgG dar, die von den menschlichen Myelomzellen in der Maus hergestellt werden. Sie stellt dar, dass das Dimer aus scFv/CHO das Wachstum der KPMM2-Zellen in beachtlicher Weise inhibierte.
33 zeigt die Überlebensdauer der Maus nach der Transplantation des Tumors, und zeigt, dass die scFv/CHO-Dimer-verabreichte Gruppe die Überlebensdauer in beachtlicher Weise verlängerte.
34 zeigt die Struktur eines Expressionsplasmids, welches einen modifizierten Antikörper [sc(Fv)₂] exprimiert, der zwei H-Ketten-V-Regionen und zwei L-Ketten-V-Regionen umfasst, die vom Antikörper MABL-2 stammen.
35 stellt eine Struktur eines Plasmids dar, welches ein scFv (HL-Typ) exprimiert, wobei die V-Regionen in folgender Weise verbunden sind [H-Kette]-[L-Kette] ohne Peptidlinker.
36 stellt die Struktur des HL-artigen Polypeptids und die Aminosäuresequenzen der Peptidlinker dar.
37 zeigt die Struktur eines Plasmids, welches einen scFV (LH-Typ) exprimiert, wobei die V-Regionen in folgender Weise verbunden sind [L-Kette]-[H-Kette] ohne Peptidlinker.
38 stellt eine Struktur des LH-artigen Polypeptids und die Aminosäuresequenz der Peptidlinker dar.
39 stellt die Ergebnisse des Western-Blots in Beispiel 6.4 dar und zeigt, dass der modifzierte Antikörper sc(Fv)₂, welcher zwei V-Regionen der H-Kette und zwei V-Regionen der L-Kette umfasst, und der MABL2-scFv mit Peptidlinkern mit verschiedener Länge exprimiert werden.
40a und 40b zeigen die Ergebnisse einer Durchflusscytometrie unter Verwendung des Kulturüberstandes von COS7-Zellen, welche in Beispiel 6.3 (1) hergestellt wurden, und zeigt, dass der MABL2-scFv und sc(Fv)₂ mit Peptidlinkern mit verschiedener Länge hohe Affinität für menschliches IAP besitzen.
41a und 41b zeigen die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in Beispiel 6.6, und stellen dar, dass der scFv <HL3, 4, 6, 7, LH3, 4, 6 und 7> und der sc(Fv)₂ von hIAP/L1210-Zellen in beachtlicher Weise Zelltod induzierten.
42 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Antigen-Bindungsfähgikeit in Beispiel 6.10, und zeigt, dass das Dimer des scFv <HL5> und sc(Fv)₂ hohe Affinität für menschliches IAP besitzt.
43 zeigt die Ergebnisse der Apoptose-induzierenden Wirkung in vitro in Beispiel 6.11, und zeigt, dass das Dimer des scFv <HL5> und das sc(Fv)₂ die Apoptose von hIAP/L1210-Zellen und CCRF-CEM-Zellen in Konzentrations-abhängiger Weise induzieren.
44 zeigt die Ergebnisse einer quantitativen Messung des M-Proteins, welches von der menschlichen Myelom-Zelllinie KPMM2 im Serum der mit dem menschlichen Myelomzelle transplantierten Maus hergestellt wird. Es zeigt, dass das Dimer des scFv <HL5> und des sc(Fv)₂ in beachtlicher Weise das Wachstum der KPMM2-Zellen inhibierte.
45 zeigt die Überlebensdauer (Tage) der Mäuse nach der Transplantation des Tumors, und zeigt, dass die Überlebensdauer der scFV <HL5> verabreichten Gruppe in beachtlicher Weise verlängert war.
46 zeigt die Überlebensdauer (Tage) der Mäuse nach der Transplantations des Tumors, und zeigt, dass die Überlebensdauer der sc(Fv)₂ verabreichten Gruppe in beachtlicher Weise verlängert war.
47 ist ein Schema, welches das Verfahren zur Konstruierung eines DNA-Fragmentes zeigt, das den rekonstruierten 12B5 Einzelketten-Fv kodiert, welcher die Linkersequenz enthält, die aus 15 Aminosäuren besteht sowie dessen Struktur.
48 zeigt die Reinigungsergebnisse jedes 12B5 einzelkettigen Fv durch Gelfiltration, welche in Beispiel 7.5 (1) gewonnen wurde, und zeigt, dass sc12B5 in zwei Peaks (Fraktion A und B) unterteilt war.
49 zeigt das Analyse-Ergebnis von jeder Fraktion A und B mittels SDS-PAGE, welche in Beispiel 7.5 (2) durchgeführt wurde.
50 zeigt das Analyseergebnis von jeder Fraktion A und B mittels Superdex 200-Säule, welche in Beispiel 7.5 (2) durchgeführt wurde, und zeigt, dass der Haupt-Peak der Fraktion A bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 44 kD eluierte, wie in (a) gezeigt ist, und dass der Haupt-Peak der Fraktion B bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 22 kD eluierte, wie in (b) gezeigt ist.
51 zeigt die Messergebnisse der TPO-artigen agonistischen Wirkung von sc12B5 und des Antikörpers 12B5 (IgG, Fab), und zeigt, dass 12B5IgG und monovalenter einzelkettiger Fv (sc12B5) TPO-artige agonistische Wirkung in Konzentrations-abhängiger Weise zeigten.
52 zeigt die Messergebnisse der TPO-artigen agonistischen Wirkung des sc12B5-Monomers und Dimers, und zeigt, dass der einzelkettige Fv (sc12B5 Dimer) mit bivalenter Antigenbindungsstelle eine ungefähr 400-fach höhere agonistische Wirkung hat als der monovalente sc12B5 und dass sie äquivalent oder höher als menschliches TPO ist.
53 zeigt das Reinigungsergebnis des gewonnenen sc12E10 einzelkettigen Antikörpers mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Superdex 200-HR-Säule, und zeigt, dass sc12E10 in zwei Peaks unterteilt war (Fraktionen A und B).
54 zeigt das Reinigungsergebnis mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Superdex 200-HR-Säule gewonnenen db12E10 einzelkettigen Antikörpers, und zeigt, das db12E10 in zwei Peaks unterteilt war (Fraktionen C und D).
55 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen A und B (sc12E10) und der Fraktionen C und D (db12E10) unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen.
56 zeigt das Analyseergebnise der Fraktionen A und B mittels Gelfiltration-Chromatographie unter Verwendung von Superdex 200-HR-Säule, und zeigt, dass in (1) der Haupt-Peak der Fraktion A bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 42 kD eluierte und (2) der Haupt-Peak der Fraktion B bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 20 kD eluierte.
57 zeigt das Analyseergebnis der Fraktionen C und D mittels Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Superdex 200-HR-Säule, und stellt in (1) dar, dass der Haupt-Peak der Fraktion C bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 69 kD eluierte und (2) der Haupt-Peak der Fraktion D bei einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 41 kD eluierte.
58 ist eine Kurve, die die agonistische Wirkung verschiedener 12E10-Antikörper-Moleküle auf MPL zeigt, und darstellt, dass einzelkettige Fvs (sc12E10, db12E10) TPO-artige agonistische Wirkung zeigten, während 12E10IgG und 12E10Fab das nicht bewirken.
59 ist eine Kurve, die die agonistische Wirkung des Monomers und Dimers von sc12E10 und des Dimers und Trimers von db12E10 auf MPL darstellt, und zeigt, dass das Dimer des sc12E10 und Trimer von db12E10 höhere TPO-artige agonistische Wirkung als TPO hatten.
Industrielle Anwendbarkeit
Die modifizierten Antikörper der Erfindung haben eine agonistische Wirkung, die in der Lage ist, durch Vernetzung von Zelloberflächenmolekülen ein Signal in Zellen zu transduzieren und die vorteilhaft sind, da sie eine Permabilität gegenüber Geweben und Tumoren haben, die aufgrund der verringerten molekularen Größe verglichen mit dem Antikörper-Molekül (Gesamt-IgG) hoch ist. Diese Erfindung stellt modifizierte Antikörper mit einer agonistischen Aktivität bereit, die merklich höher ist als die von TPO oder Parental-Antikörpern (Gesamt-IgG). Insbesondere können selbst Parental-Antikörper ohne agonistische Aktivität in modifizierte Antikörper geändert werden, die eine agonistische Aktivität haben, die höher ist als TPO. Daher können die modifizierten Antikörper als Signaltransduzierende Agonisten verwendet werden. Die Modifizierung des Antikörper-Moleküls führt zu einer Reduzierung von Nebenwirkungen, welche durch interzelluläre Vernetzung verursacht wird und stellt neue Medikamente bereit, die durch Vernetzung eines Zelloberflächen-Moleküls/Zelloberflächen-Molekülen nur die benötigte Wirkung induziert. Medizinische Präparate, die als wirksame Inhaltsstoffe die modifizierten Antikörper der Erfindung enthalten, sind als Präventionsmittel und/oder Heilmittel für Plättchen-bedingte Bluterkrankungen, Thrombozytopenie, die durch Chemotherapie für Krebs und Leukämie verursacht wird und ähnliche nützlich. SEQUENZLISTE

Claims

Modifizierter Antikörper, welcher TPO-Agonistenaktivität durch Quervernetzen von TPO-Rezeptoren zeigt, umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen eines Antikörpers, worin der modifizierte Antikörper (i) ein Multimer eines single chain Fv umfassend eine H-Ketten V-Region und eine L-Ketten V-Region oder (ii) ein einzelkettiges Polypeptid umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen oder zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen ist.
Modifizierter Antikörper gemäß Anspruch 1, worin die H-Ketten V-Region und die L-Ketten V-Region durch einen Linker verbunden sind.
Modifizierter Antikörper gemäß Anspruch 2 oder 3, worin der Linker ein Peptidlinker, umfassend zumindest eine Aminosäure, ist.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der modifizierte Antikörper zusammengesetzt ist aus einem Tetramer, Trimer oder Dimer aus single chain Fv.
Modifizierter Antikörper gemäß Anspruch 4, worin der modifizierte Antikörper zusammengesetzt ist aus einem Dimer aus single chain Fv.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der modifizierte Antikörper ein einzelkettiges Polypeptid umfassend zwei H-Ketten V-Regionen und zwei L-Ketten V-Regionen ist.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der modifizierte Antikörper des weiteren Aminosäuresequenz(en) zur Peptidreinigung enthält.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der modifizierte Antikörper aufgereinigt wurde.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die H-Ketten V-Region und/oder L-Ketten V-Region eine H-Ketten V-Region und/oder L-Ketten V-Region abgeleitet von einem menschlichen Antikörper ist.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die H-Ketten V-Region und/oder L-Ketten V-Region eine humanisierte H-Ketten V-Region und/oder L-Ketten V-Region ist.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der modifizierte Antikörper ein monospezifischer modifizierter Antikörper ist.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der modifizierte Antikörper ein multispezifischer modifizierter Antikörper ist.
Modifizierter Antikörper gemäß Anspruch 12, worin der modifizierte Antikörper ein bispezifischer modifizierter Antikörper ist.
Modifizierter Antikörper gemäß Anspruch 11, worin die L-Ketten V-Region und die H-Ketten V-Region von demselben monoklonalen Antikörper sind.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, welcher abgeleitet ist von einem Stammantikörper, der im wesentlichen keine agonistische Aktivität aufweist.
DNA, die den modifizierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 codiert.
Tierische Zelle, welche den modifizierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 produziert.
Mikroorganismus, welcher den modifizierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 produziert.
Medikament, umfassend den modifizierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 als aktiven Inhaltsstoff.
Verwendung des modifizierten Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombocytopenie.
Verfahren zum Screenen eines modifizierten Antikörpers, welcher agonistische Aktivität durch Quervernetzen des TPO-Rezeptors zeigt, umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen eines Antikörpers, worin der modifizierte Antikörper (i) ein Multimer eines single chain Fv umfassend eine H-Ketten V-Region und eine L-Ketten V-Region oder (ii) ein einzelkettiges Polypeptid umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen oder zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen ist, umfassend die Schritte (1) Herstellen eines modifizierten Antikörpers, welcher spezifisch an TPO-Rezeptoren bindet, umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen eines Antikörpers, (2) Reagierenlassen der modifizierten Antikörper und Zellen, die besagten TPO-Rezeptor exprimieren, und (3) Messen der TPO-Agonistenaktivität in den Zellen, verursacht durch Quervernetzen des TPO-Rezeptors.
Verfahren zur Messung der agonistischen Aktivität eines modifizierten Antikörpers, welcher agonistische Aktivität durch Quervernetzen des TPO-Rezeptors zeigt, umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen eines Antikörpers, worin der modifizierte Antikörper (i) ein Multimer eines single chain Fv umfassend eine H-Ketten V-Region und eine L-Ketten V-Region oder (ii) ein einzelkettiges Polypeptid umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen oder zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen ist, umfassend die Schritte (1) Herstellen eines modifizierten Antikörpers, welcher spezifisch an TPO-Rezeptoren bindet, umfassend zwei oder mehr H-Ketten V-Regionen und zwei oder mehr L-Ketten V-Regionen eines Antikörpers, (2) Reagierenlassen der modifizierten Antikörper und Zellen, die besagten TPO-Rezeptor exprimieren, und (3) Messen der TPO-Agonistenaktivität in den Zellen, verursacht durch Quervernetzen des TPO-Rezeptors.
Modifizierter Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Thrombocytopenie.