KR102471458B1 - 동결건조 제제 - Google Patents

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신지 오카베
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Abstract

[과제] 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로 안정된 의약 조성물을 제공하는 것.
[해결 수단] 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하고, 추가로, 중성염, 2당류, 비이온성 계면활성제, 및 완충제를 함유하여 이루어지는, 동결건조 제제. 이러한 동결건조 제제로서는, 예를 들어, 항트랜스페린 수용체 항체와 인간 이두론산-2-설파타제의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하고, 추가로, 중성염으로서 염화 나트륨, 2당류로서 수크로스, 비이온성 계면활성제로서 폴록사머, 및 완충제로서 인산 완충제를 함유하여 이루어지는 것을 들 수 있다.

Description

동결건조 제제
본 발명은, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로 하는 의약의, 저장 안정적인 동결건조 제제에 관한 것이고, 상세하게는, 안정화제로서 수크로스와 비이온성 계면활성제를 함유하는 동결건조 제제에 관한 것이다.
항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질로서, 항인슐린 수용체 항체와 α-L-이두로니다제의 융합 단백질(특허문헌 1), 항인슐린 수용체 항체와 이두론산-2-설파타제의 융합 단백질(특허문헌 2)이 제작되었던 것이 보고되어 있다. 이와 같이 인공적으로 구축된 신규 단백질의 제제화에 있어서, 어떤 형태가 그들의 제제 처방으로서 적절한지는 미지이다.
항체의 제제화에 관해서 보면, 항IL-13 항체를 유효성 성분으로서 포함하는 동결건조 제제(특허문헌 3), 아르기닌, 히스티딘, 리신 등의 아미노산 또는 그의 염을 포함하는 항체의 동결건조 제제(특허문헌 4), 메글루민을 포함하는 항체의 동결건조 제제(특허문헌 5), 락토비온산을 포함하는 항EGF 수용체 항체의 동결건조 제제(특허문헌 6), 시트르산, 폴리소르베이트 80 및 자당을 포함하는 항인간 IL-23 p19 항체의 동결건조 제제(특허문헌 7) 등, 많은 보고가 되어 있다. 즉, 항체만을 들어도, 그 제제화를 함에 있어서는, 시행 착오가 필요해지고 있음이 실정이다.
일본 특허공표 2010-534723호 공보 일본 특허공표 2012-521194호 공보 일본 특허공표 2016-519124호 공보 WO2007/074880 WO2006/132363 일본 특허공표 2009-540015호 공보 일본 특허공표 2012-501332호 공보
본 발명의 목적은, 안정화제로서 수크로스와 비이온성 계면활성제를 함유하여 이루어지고, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로 안정된, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 동결건조 제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 항체와 인간 리소좀 효소의 일종인 인간 이두론산-2-설파타제를 결합시킨 단백질이, 수크로스와 비이온성 계면활성제를 부형제로서 함유하는 동결건조 제제의 형태로 함으로써 안정되게 보존할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 포함하는 것이다.
1. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 동결건조 제제로서, 중성염, 2당류, 비이온성 계면활성제, 및 완충제를 추가로 함유하여 이루어지는, 동결건조 제제.
2. 해당 중성염이 염화 나트륨인, 상기 1에 기재된 동결건조 제제.
3. 해당 2당류가 트레할로스, 수크로스, 말토스, 및 유당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 또는 2에 기재된 동결건조 제제.
4. 해당 비이온성 계면활성제가, 폴리소르베이트 또는 폴록사머인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
5. 해당 비이온성 계면활성제가, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
6. 해당 완충제가 인산 완충제인, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
7. 해당 2당류가 수크로스이고, 해당 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜이며, 및 해당 완충제가 인산 완충제인, 상기 1 또는 2에 기재된 동결건조 제제.
8. 해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.015∼2.5(w/ww/w), 2.5∼200(w/ww/w), 및 0.005∼6(w/ww/w)인, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
9. 해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.05∼0.5(w/ww/w), 5∼50(w/ww/w), 및 0.02∼0.2(w/ww/w)인, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
10. 해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.1∼0.25(w/ww/w), 10∼25(w/ww/w), 및 0.04∼0.1(w/ww/w)인, 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
11. 순수(純水)로 용해했을 때의 pH가 5.5∼7.5인, 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
12. 해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 어느 하나의 C말단측 또는 N말단측의 어느 하나에 펩티드 결합에 의해 결합한 것인, 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
13. 해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 중쇄의 C말단측에 펩티드 결합에 의해 결합한 것인, 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
14. 해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 어느 하나의 C말단측 또는 N말단측의 어느 하나에, 적어도 1개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
15. 해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 중쇄의 C말단측에 적어도 1개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
16. 해당 링커가, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 14 또는 15에 기재된 동결건조 제제.
17. 해당 리소좀 효소가, 인간 리소좀 효소인, 상기 1 내지 16 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
18. 해당 리소좀 효소가, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 아스파틸글루코사미니다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1, 트라이펩티딜펩티다제-1, 히알루로니다제-1, CLN1, 및 CLN2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1 내지 17 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
19. 해당 인간 리소좀 효소가, 인간 이두론산-2-설파타제인, 상기 17에 기재된 동결건조 제제.
20. 해당 항체가, 인간 항체 또는 인간화 항체인, 상기 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
21. 해당 항체가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로서 인식하는 것인, 상기 1 내지 20 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
22. 해당 혈관 내피 세포가, 인간의 혈관 내피 세포인, 상기 21에 기재된 동결건조 제제.
23. 해당 혈관 내피 세포가, 뇌혈관 내피 세포인, 상기 21 또는 22에 기재된 동결건조 제제.
24. 해당 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자가, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F, 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 및 모노카복실산 트랜스포터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 23에 기재된 동결건조 제제.
25. 해당 항체가, 인간화 항인간 트랜스페린 수용체(hTfR) 항체인, 상기 20에 기재된 동결건조 제제.
26. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제이며, 해당 융합 단백질이 인간화 항hTfR 항체와 인간 이두론산-2-설파타제의 융합 단백질인 것이고, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 20에 기재된 동결건조 제제:
(a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
융합 단백질;
(b) 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
융합 단백질;
(c) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
융합 단백질.
27. 해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 인간 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제이며, 해당 융합 단백질이 인간화 항hTfR 항체와 인간 이두론산-2-설파타제의 융합 단백질인 것이고, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 20에 기재된 동결건조 제제:
(a) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질;
(b) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질;
(c) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질.
28. 붕규산 유리 또는 소수성 수지에 의해 형성된 용기에 봉입된 것인, 상기 1 내지 27 중 어느 하나에 기재된 동결건조 제제.
29. 해당 용기가, 사이클로올레핀 코폴리머, 사이클로올레핀류 개환 중합체, 또는 사이클로올레핀류 개환 중합체에 수소 첨가한 것을 이용하여 형성된 것인, 상기 28에 기재된 동결건조 제제.
본 발명에 의하면, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 융합 단백질을, 시장에 유통시키는 것이 가능할 정도로, 동결건조 제제로서 안정화시킬 수 있다.
본 발명은, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로 하는 의약의, 동결건조 상태에서 저장 안정적인 의약 조성물에 관한 것이다. 여기에서, 리소좀 효소와 결합되는 항체는, 바람직하게는 인간 항체 또는 인간화 항체이지만, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 항체의 동물종 등에 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 항체는, 인간 이외의 포유동물의 항체여도 되고, 또한 인간 항체와 인간 이외의 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체여도 된다.
인간 항체는, 그 전체가 인간 유래의 유전자로 코딩되는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 인간의 유전자에 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 인간 항체이다. 또한, 인간 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 하나의 인간 항체의 일부를, 다른 인간 항체의 일부로 치환한 항체도, 인간 항체이다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
인간 항체는, 원칙으로서, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역에 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 가변 영역에 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 어느 하나의 인간 항체의 CDR을, 그 외의 인간 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 인간 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 인간 항체이다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
인간 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 모두, 원칙으로서, 4개의 프레임워크 영역 1∼4(FR1∼4)를 포함한다. FR1은, CDR1에 그 N말단측에서 인접하는 영역이며, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, 그 N말단으로부터 CDR1의 N말단에 인접하는 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어진다. FR2는, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR1과 CDR2 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR3은, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR2와 CDR3 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR4는, CDR3의 C말단에 인접하는 아미노산으로부터 가변 영역의 C말단까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 단, 이것에 한정하지 않고, 본 발명에 있어서는, 상기의 각 FR 영역에 있어서, 그 N말단측의 1∼5개의 아미노산 및/또는 C말단측의 1∼5개의 아미노산을 제외한 영역을, 프레임워크 영역으로 할 수도 있다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명에 있어서, 원래의 인간 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 인간 항체라고 한다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 아미노산을 부가시키는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 또는 N말단측 혹은 C말단측에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타내는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서 「인간 유래의 유전자」라고 할 때는, 인간 유래의 원래의 유전자에 더하여, 인간 유래의 원래의 유전자에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
예를 들어, 서열 번호 2로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄, 서열 번호 4로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄, 및 서열 번호 6으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 변이를 가하는 경우는, 상기의 룰이 적용된다. 또한, 서열 번호 8로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄, 서열 번호 9로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄, 및 서열 번호 10으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 변이를 가하는 경우에도, 상기의 룰이 적용된다.
원래의 인간 항체의 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 변이 도입 후의 항체가 항원에 대한 특이적 친화성을 갖는 한, 상동성에 특별히 제한은 없다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 경쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가시키는 경우, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이며, 보다 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
예를 들어, 서열 번호 23으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 가변 영역, 서열 번호 25로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 가변 영역, 및 서열 번호 27로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역에 변이를 가하는 경우는, 상기의 룰이 적용된다.
서열 번호 23으로 나타나는 경쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 31 또는 32의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 25로 나타나는 경쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 40 또는 41의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 42또는 43의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 27로 나타나는 경쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 53 또는 54의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 CDR에 변이를 가하는 경우는, 상기의 룰이 적용된다.
원래의 인간 항체의 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 변이 도입 후의 항체가 항원에 대한 특이적 친화성을 갖는 한, 상동성에 특별히 제한은 없다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 중쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가시키는 경우, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이며, 보다 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이며, 보다 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 후술하는 인간화 항체에 대해서도 마찬가지이다.
예를 들어, 서열 번호 24로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 가변 영역, 서열 번호 26으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 가변 영역, 및 서열 번호 28로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역에 변이를 가하는 경우는, 상기의 룰이 적용된다.
서열 번호 24로 나타나는 중쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 26으로 나타나는 중쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 45 또는 46의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 47 또는 48의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 49 또는 50의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 28로 나타나는 중쇄의 가변 영역은 CDR1에 서열 번호 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하고, CDR2에 서열 번호 58 또는 59의 아미노산 서열을 포함하고, CDR3에 서열 번호 60 또는 61의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 CDR에 변이를 가하는 경우는, 상기의 룰이 적용된다.
본 발명에 있어서 「상동성」이란, 상동성 계산 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 서열을 비교했을 경우의, 최적인 얼라인먼트에 있어서의, 전 아미노산 잔기에 대한 상동인 아미노산 잔기의 비율(%)을 의미한다. 2개의 아미노산 서열을 이러한 비율로 나타나는 상동성으로 비교하는 것은, 본 발명의 기술적 분야에 있어서 주지이며, 당업자에게 있어 용이하게 이해되는 것이다.
한편, 상기의 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환으로서는, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr), 측쇄가 작은 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은, 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다. 보존적 아미노산 치환의 구체예는 당해 기술 분야에서 주지이며, 여러 가지 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, Bowie 등, Science, 247:1306-1310(1990)을 참조).
한편, 본 발명에 있어서, 원래의 단백질(항체를 포함한다)의 아미노산 서열과 변이를 가한 단백질의 아미노산 서열과의 상동성을 산출하기 위한 상동성 계산 알고리즘으로서, BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981)) 등이 주지이다. 또한, 미국국립위생연구소가 인터넷상에서 제공하는 BLAST 프로그램의 하나인 blastp는, 2개의 아미노산 서열의 상동성을 산출하기 위한 수단으로서 주지이다.
본 발명에 있어서, 「인간화 항체」란 말은, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 인간 이외의 포유동물 유래이며, 그 이외의 영역이 인간 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체로서 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR에 의해 치환하는 것에 의해 제작된 항체를 들 수 있다. 인간 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 예를 들어 마우스이다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란 말은, 2개 이상의 상이한 종에서 유래하는, 2개 이상의 상이한 항체의 단편이 연결되어 이루어지는 항체를 말한다.
인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 인간 항체의 일부가 인간 이외의 포유동물의 항체의 일부에 의해 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 하나에서 유래한다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 하나에서 유래해도 된다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상 영역으로 이루어진다고 할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스이다.
인간 항체와 마우스 항체의 키메라 항체는, 특히, 「인간/마우스 키메라 항체」라고 한다. 인간/마우스 키메라 항체에는, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 마우스 항체의 어느 하나에서 유래한다. 인간/마우스 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 마우스 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역글로불린 경쇄와 1개의 면역글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 것이나, 이하에 상술하듯이,
(2) 면역글로불린 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체, 및
(3) 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체도 포함된다. 또한,
(4) 본래의 의미에서의 항체의 기본 구조로부터 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 포함한다)도, 본 발명에 있어서의 「항체」에 포함된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다.
여기에서 Fab란, 가변 영역과 CL영역(경쇄의 정상 영역)을 포함하는 1개의 경쇄와, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)을 포함하는 1개의 중쇄가, 각각 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. Fab에 있어서, 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)에 더하여, 추가로 힌지부의 일부를 포함해도 되지만, 이 경우의 힌지부는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하는 것이다. Fab에 있어서, 경쇄와 중쇄는, 경쇄의 정상 영역(CL 영역)에 존재하는 시스테인 잔기와, 중쇄의 정상 영역(CH1 영역) 또는 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성되는 다이설파이드 결합에 의해 결합한다. Fab를 형성하는 중쇄를 Fab 중쇄라고 한다. Fab는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하고 있으므로, 1개의 경쇄와 1개의 중쇄로 이루어진다. Fab를 구성하는 경쇄는, 가변 영역과 CL 영역을 포함한다. Fab를 구성하는 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역으로 이루어지는 것이어도 되고, 가변 영역, CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부를 포함하는 것이어도 된다. 단 이 경우, 힌지부에서 2개의 중쇄의 사이에 다이설파이드 결합이 형성되지 않도록, 힌지부는 중쇄 사이를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하지 않게 선택된다. F(ab')에 있어서는, 그 중쇄는 가변 영역과 CH1 영역에 더하여, 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하는 힌지부의 전부 또는 일부를 포함한다. F(ab')2는 2개의 F(ab')가 서로의 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. F(ab') 또는 F(ab')2를 형성하는 중쇄를 Fab' 중쇄라고 한다. 또한, 복수의 항체가 직접 또는 링커를 개재시켜 결합하여 이루어지는 2량체, 3량체 등의 중합체도, 항체이다. 더욱이, 이들에 한정하지 않고, 면역글로불린 분자의 일부를 포함하고, 또한, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것은 어느 것도, 본 발명에서 말하는 「항체」에 포함된다. 즉, 본 발명에 있어서 면역글로불린 경쇄라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄라고 할 때는, 면역글로불린 중쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 따라서, 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 한, 예를 들어, Fc 영역이 결실된 것도, 면역글로불린 중쇄이다.
또한, 여기에서 Fc 또는 Fc 영역이란, 항체 분자중의, CH2 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 2), 및 CH3 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 3)으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 말한다.
더욱이, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는,
(5) 상기 (4)에서 나타낸 Fab, F(ab') 또는 F(ab')2를 구성하는 경쇄와 중쇄를, 링커 서열을 개재시켜 결합시켜, 각각 1본쇄 항체로 한 scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2도 포함된다. 여기에서, scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2에 있어서는, 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다. scFv에 있어서는, 경쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다.
본 발명에 있어서, 「1본쇄 항체」라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 예를 들어, 상기 (2), (3) 및 (5)에 나타나는 것은 1본쇄 항체에 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에 있어서의 「1본쇄 항체」이다. 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄가 결합한 1본쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실되어 있다. 면역글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이들 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 1본쇄 항체에는, 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR의 모두와 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 모두가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실 시킨 1본쇄 항체로 할 수도 있다.
1본쇄 항체에 있어서, 면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로부터 구성되는 펩티드쇄이다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 20), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 21), 또는 이들의 아미노산 서열이 2∼10회, 혹은 2∼5회 반복된 서열을 갖는 것이다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 ScFv로 하는 경우, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19)의 3개가 연속한 것에 상당하는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열이 적합하다.
본 발명에 있어서, 항체가 특이적으로 인식하는 항원은, 예를 들어, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)이다. 이러한 표면 항원으로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터, Fc 수용체를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 항원은, 바람직하게는 인간 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 이들 분자(표면 항원)이다.
상기의 표면 항원 중에서도, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 리포단백질 수용체, IGF 수용체, OATP-F 등의 유기 음이온 트랜스포터, MCT-8 등의 모노카복실산 트랜스포터는, 혈액뇌관문(Blood Brain Barrier)을 형성하는 뇌모세혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 것이다. 이들 항원을 인식할 수 있는 항체는, 항원을 개재시켜 뇌모세혈관 내피 세포(뇌혈관 내피 세포)에 결합할 수 있다. 그리고 뇌모세혈관 내피 세포에 결합한 항체는, 혈액뇌관문을 통과하여 중추 신경계에 도달할 수 있다. 따라서, 목적하는 단백질을, 이와 같은 항체와 결합시키는 것에 의해, 중추 신경계에까지 도달시킬 수 있다. 목적하는 단백질로서는, 중추 신경계에서 약효를 발휘해야 할 기능을 갖는 단백질을 들 수 있다. 예를 들어, 중추 신경 장애를 수반하는 리소좀병 환자에 있어서 결손하고 있거나 또는 기능 부전인 리소좀 효소를, 목적하는 단백질로서 들 수 있다. 이러한 리소좀 효소는, 그대로는 중추 신경계에 도달할 수 없어, 환자의 중추 신경 장애에 대해서 약효를 나타내지 않지만, 이들 항체와 결합시키는 것에 의해 혈액뇌관문을 통과할 수 있게 되므로, 리소좀병 환자에 있어서 나타나는 중추 신경 장애를 개선할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」이란 말은, 서열 번호 22에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 막단백질을 말한다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열 중 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대해서 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다.
항체의 제작 방법을 hTfR에 대한 항체를 예로 들어 이하에 설명한다. hTfR에 대한 항체의 제작 방법으로서는, hTfR 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 세포를 이용하여, 재조합 인간 트랜스페린 수용체(rhTfR)를 제작하고, 이 rhTfR을 이용하여 마우스 등의 동물을 이용하여 면역하여 얻는 방법이 일반적이다. 면역 후의 동물로부터 hTfR에 대한 항체 산생 세포를 취출하고, 이것과 미엘로마 세포를 유합시키는 것에 의해, hTfR에 대한 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다.
또한, 마우스 등의 동물로부터 얻은 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 rhTfR로 면역하는 것에 의해서도 hTfR에 대한 항체를 산생하는 세포를 취득할 수 있다. 체외 면역법에 의해 면역하는 경우, 그 면역계 세포가 유래하는 동물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트, 개, 고양이, 말 및 인간을 포함하는 영장류이고, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트 및 인간이며, 더욱 바람직하게는 마우스 및 인간이다. 마우스의 면역계 세포로서는, 예를 들어, 마우스의 비장으로부터 조제한 비세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포로서는, 인간의 말초혈, 골수, 비장 등으로부터 조제한 세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 면역했을 경우, hTfR에 대한 인간 항체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체와 결합시켜야 할 인간 리소좀 효소에 특별히 한정은 없지만, α-L-이두로니다제(IDUA), 이두론산-2-설파타제(IDS 또는 I2S), 글루코세레브로시다제(GBA), β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제(LAMAN), β-만노시다제, 갈락토실세라미다제(GALC), 사포신 C, 아릴설파타제 A(ARSA), α-L-푸코시다제(FUCA1), 아스파틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제(ASM), α-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제(GUSB), 헤파란 N-설파타제(SGSH), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제, 산성 세라미다제(AC), 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 아스파틸글루코사미니다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(PPT-1), 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1), 히알루로니다제-1, 산성 α-글루코시다제(GAA), CLN1, 및 CLN2 등의 리소좀 효소를 들 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것인 경우, 항체와 결합시킨 인간 리소좀 효소는 각각, α-L-이두로니다제(IDUA)는 할러 증후군 또는 할러-샤이에 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 이두론산-2-설파타제(IDS)는 헌터 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 글루코세레브로시다제(GBA)는 고셔병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β갈락토시다제는 GM1-강글리오시도시스 1∼3형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, GM2 활성화 단백질은 GM2-강글리오시도시스 AB이형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 A는 샌드호프병 및 테이삭스병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 B는 샌드호프병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제는 I-세포병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-만노시다제(LAMAN)는 α-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-만노시다제는 β-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 갈락토실세라미다제(GALC)는 크라베병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 사포신 C는 고셔병양 축적증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아릴설파타제 A(ARSA)는 이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-L-푸코시다제(FUCA1)는 푸코시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파틸글루코사미니다제는 아스파틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-N-아세틸갈락토사미니다제는 쉰들러병 및 가와사키병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 스핑고미엘리나제(ASM)는 니만-픽병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-갈락토시다제는 파브리병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-글루쿠로니다제(GUSB)는 슬라이 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 헤파란 N-설파타제(SGSH), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제 및 N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제는 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 세라미다제(AC)는 파버병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아밀로-1,6-글루코시다제는 코리병(포브스-코리병)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 시알리다제는 시알리다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파틸글루코사미니다제는 아스파틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(PPT-1)은, 신경 세로이드리포푸신증 또는 Santavuori-Haltia병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1)은, 신경 세로이드리포푸신증 또는 Jansky-Bielschowsky병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 히알루로니다제-1은 히알루로니다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 α-글루코시다제(GAA)는 폼페병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, CLN1 및 CLN2는 바텐병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것인 경우에, 항체와 결합시켜야 할 리소좀 효소로서 적합한 것으로서, 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)를 들 수 있다. I2S는, 헤파란 황산이나 데르마탄 황산과 같은 글리코사미노글리칸(GAG) 분자 내에 존재하는 황산 에스터 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 라이소솜 효소의 일종이다. 헌터 증후군은 이 효소가 선천적으로 결실되는 유전자 질환이다. 헌터 증후군의 환자는, 헤파란 황산, 데르마탄 황산이 조직 내에 축적되는 결과, 각막 혼탁, 정신 발달 지체 등의 제 증상을 나타낸다. 단, 경증의 경우는 정신 발달 지연은 관찰되지 않는 경우도 있다. 따라서, 당해 항체와 hI2S의 융합 단백질은, BBB를 통과하는 것에 의해 뇌조직 내에 축적된 GAG를 분해할 수가 있으므로, 정신 발달 지체를 나타내는 헌터 증후군의 환자에게 투여하는 것에 의해, 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 더욱이, 정신 발달 지체를 나타내지 않는 헌터 증후군의 환자에게, 예방적으로 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 I2S」 또는 「hI2S」란 말은, 특히 야생형의 hI2S와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 말한다. 야생형의 hI2S는, 서열 번호 1로 나타나는 525개의 아미노산으로부터 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 단, 이것에 한정하지 않고, I2S 활성을 갖는 것인 한, 야생형의 hI2S의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hI2S에 포함된다. hI2S의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hI2S의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hI2S에 아미노산을 부가시키는 경우, hI2S의 아미노산 서열 중 또는 N말단측 혹은 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hI2S의 아미노산 서열은, 원래의 hI2S의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 본 발명에 있어서, hI2S가 I2S 활성을 갖는다고 할 때는, hI2S를 항체와 융합시켜 융합 단백질로 했을 때에, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항체와 융합시킨 hI2S가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다. 항체는, 예를 들어 항hTfR 항체이다.
본 발명에 있어서 「융합 단백질」이라고 할 때는, 항체와 인간 리소좀 효소를, 비펩티드 링커 혹은 펩티드 링커를 개재시켜, 또는 직접 결합시킨 물질을 말한다. 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 방법은, 이하에 상술한다.
항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 방법으로서는, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재시켜 결합시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로서는, 비오틴-스트렙트아비딘, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄 혹은 그의 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 항체 또는 인간 리소좀 효소의 어느 것과 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 것이다.
비펩티드 링커로서 비오틴-스트렙트아비딘을 이용하는 경우, 항체가 비오틴을 결합시킨 것이고, 인간 리소좀 효소가 스트렙트아비딘을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 개재시켜, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜도 되고, 반대로, 항체가 스트렙트아비딘을 결합시킨 것이고, 인간 리소좀 효소가 비오틴을 결합시킨 것이고, 이 비오틴과 스트렙트아비딘의 결합을 개재시켜, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜도 된다. 비오틴 및 스트렙트아비딘은, 주지의 수법에 의해 단백질에 결합시킬 수 있다.
비펩티드 링커로서 PEG를 이용하여 본 발명의 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시킨 것은, 특히, 항체-PEG-인간 리소좀 효소라고 한다. 항체-PEG-인간 리소좀 효소는, 항체와 PEG를 결합시켜 항체-PEG를 제작하고, 그 다음에 항체-PEG와 인간 리소좀 효소를 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 항체-PEG-인간 리소좀 효소는, 인간 리소좀 효소와 PEG를 결합시켜 인간 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 그 다음에 인간 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 항체 및 인간 리소좀 효소와 결합시키려면, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 항체 및 인간 리소좀 효소 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 항체 및 인간 리소좀 효소가 공유 결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=300∼60000이고, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체-PEG는, 항체와 알데하이드기를 작용기로서 갖는 폴리에틸렌 글리콜(ALD-PEG-ALD)을, 해당 항체에 대한 ALD-PEG-ALD의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 항체-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 인간 리소좀 효소와 반응시키는 것에 의해, 항체-PEG-인간 리소좀 효소가 얻어진다. 반대로, 먼저 인간 리소좀 효소와 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 인간 리소좀 효소-PEG를 제작하고, 그 다음에 인간 리소좀 효소-PEG와 항체를 결합시키는 것에 의해서도, 항체-PEG-인간 리소좀 효소를 얻을 수 있다.
항체와 인간 리소좀 효소는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 각각 인간 리소좀 효소의 N말단 또는 C말단을 펩티드 결합에 의해 결합시킬 수도 있다. 이와 같이 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시켜 이루어지는 융합 단백질은, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 cDNA가 인프레임으로 배치된 DNA 단편을, 포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해, 얻을 수 있다. 이 포유동물 세포에는, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 경쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일 호스트 세포에 도입되고, 또한, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항체의 중쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일 호스트 세포에 도입된다. 항체가 1본쇄 항체인 경우, 항체와 인간 리소좀 효소를 결합시킨 융합 단백질은, 인간 리소좀 효소를 코딩하는 cDNA의 5'말단측 또는 3'말단측에, 직접, 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워, 1본쇄 항체를 코딩하는 cDNA를 연결한 DNA 단편을, 포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 이들 세포 중에서 발현시키는 것에 의해, 얻을 수 있다.
항체의 경쇄의 C말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 경쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항체의 중쇄의 C말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 중쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항체의 경쇄의 N말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 경쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 경쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항체의 중쇄의 N말단측에 인간 리소좀 효소를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 인간 리소좀 효소가, 이 항체의 중쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항체의 중쇄와 인간 리소좀 효소는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
이 때 항체와 인간 리소좀 효소 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 그 서열은, 바람직하게는 1∼50개, 보다 바람직하게는 1∼17개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼5개의 아미노산으로부터 구성되는 것이지만, 항체에 결합시켜야 할 인간 리소좀 효소에 따라, 링커 서열을 구성하는 아미노산의 개수는, 1개, 2개, 3개, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개 등으로 적절히 조정할 수 있다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항체가 hTfR과의 친화성을 유지하고, 또한 당해 링커 서열에 의해 연결된 인간 리소좀 효소가, 생리적 조건하에서 당해 단백질의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 것인가 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 19), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 20), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 21), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 1∼50개의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 갖는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser을 갖는 것은 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
한편, 본 발명에 있어서, 1개의 펩티드쇄에 복수의 링커 서열이 포함되는 경우, 편의상, 각 링커 서열은 N말단측으로부터 순차로, 제 1 링커 서열, 제 2 링커 서열과 같이 명명한다.
항체가 인간화 항체이며 또한 항인간 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태로서, 이하의 (x)∼(z)를 들 수 있다. 즉,
(x) 경쇄가 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
(y) 경쇄가 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것;
(z) 경쇄가 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 중쇄가 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것의 어느 것이다.
한편, 여기에서, (x), (y) 및 (z)는, 실시예 중에 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 1, 인간화 항hTfR 항체 번호 2, 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3에 각각 상당한다.
단, 항체가 인간화 항체이며 또한 항인간 트랜스페린 수용체 항체인 경우의, 항체의 바람직한 형태는, 상기의 (x)∼(z)에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 또한, 항체의 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 해당 항체의 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 것인 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다.
또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼10개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 및/또는 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼10개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다. 또한, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼5개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 및/또는 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼5개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다. 더욱이, 경쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼3개가 치환, 결실 또는 부가를 한 것이고, 및/또는 중쇄의 아미노산 서열이, 상기의 (x)∼(z)에 있어서의 각각의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중 1∼3개가 치환, 결실 또는 부가를 한 항체도, hTfR에 대해서 친화성을 갖는 한, 본 발명에 있어서의 항체로서 이용할 수 있다.
상기의 항체의 바람직한 형태의 (x)에 있어서, 서열 번호 2로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 8로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (y)에 있어서, 서열 번호 4로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 25로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 9로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 26으로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 또한, 상기의 항체의 바람직한 형태의 (z)에 있어서, 서열 번호 6으로 나타나는 경쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 27로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이며, 서열 번호 10으로 나타나는 중쇄의 아미노산 서열 중, 서열 번호 28로 나타나는 아미노산 서열이 가변 영역이다. 이들 항체의 바람직한 형태의 (x)∼(z)에 있어서, 중쇄 또는/및 경쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 서열 중으로의 치환, 결실 또는 부가는, 특히, 이들의 가변 영역에 도입된다.
본 발명에 있어서의, 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 바람직한 한 형태로서, 인간화 항인간 트랜스페린 수용체 항체(인간화 항hTfR 항체)와 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)의 융합 단백질을 들 수 있다. 이 융합 단백질에 있어서, 인간 트랜스페린 수용체에 대한 친화성과 인간 리소좀 효소의 효소 활성의 어느 것도 유지시킬 수 있는 한, hI2S는, 인간화 항hTfR 항체를 구성하는 중쇄와 경쇄의 어느 것에 융합시켜도 된다. 또한, hI2S를 중쇄에 결합시키는 경우에 있어서, 중쇄의 N말단측의 C말단측의 어느 것에 hI2S를 융합시켜도 되고, hI2S를 경쇄에 결합시키는 경우에 있어서, 경쇄의 N말단측의 C말단측의 어느 것에 hI2S를 융합시켜도 된다.
이러한 인간화 항hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 한 형태로서, 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 인간화 항hTfR 항체를 결합시킨 융합 단백질을 들 수 있다. 이러한 융합 단백질의 적합한 것으로서 이하의 (1)∼(3)에 나타나는 것을 예시할 수 있다.
(1) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것
으로 이루어지는 융합 단백질.
(2) 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것
으로 이루어지는 융합 단백질.
(3) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 링커 서열을 개재시켜 결합한 것
으로 이루어지는 융합 단백질.
이들 (1)∼(3)의 융합 단백질에 있어서, 인간 이두론산-2-설파타제는, 바람직하게는 서열 번호 1로 나타나는 아미노산을 가지는 것이고, 링커 서열은, 바람직하게는 (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한 이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 인간 이두론산-2-설파타제와 결합한 중쇄로부터 구성된다.
또한, 이러한 인간화 항hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 한 형태로서,
(1) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체적으로 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질,
(2) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체적으로 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질,
(3) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 전체적으로 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질, 을 들 수 있다.
이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 인간 이두론산-2-설파타제와 결합한 중쇄로부터 구성된다.
본 발명에 있어서의 동결건조 제제는, 유효 성분으로서 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질을 함유하고, 추가로, 중성염, 2당류, 비이온성 계면활성제, 및 완충제를 함유하여 이루어지는 것이다.
동결건조 제제에 포함되는 중성염에는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 이러한 중성염으로서는, 염화 나트륨, 염화 마그네슘이 적합하고, 특히 염화 나트륨이 적합하다.
동결건조 제제에 있어서의 중성염의 함량은, 융합 단백질의 함량에 대해서, 바람직하게는 0.015∼2.5(w/ww/w), 보다 바람직하게는 0.05∼0.5(w/ww/w), 더욱 바람직하게는 0.1∼0.25(w/ww/w)이며, 예를 들어, 0.16(w/ww/w)이다.
동결건조 제제에 포함되는 2당류에는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 이러한 2당류로서는, 트레할로스, 수크로스, 말토스, 유당 또는 이들을 조합한 것이 적합하고, 특히 수크로스가 적합하다.
동결건조 제제에 있어서의 2당류의 함량은, 융합 단백질의 함량에 대해서, 바람직하게는 2.5∼200(w/ww/w), 보다 바람직하게는 5∼50(w/ww/w), 더욱 바람직하게는 10∼25(w/ww/w)이며, 예를 들어, 15(w/ww/w)이다.
동결건조 제제에 포함되는 비이온성 계면활성제로는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 이러한 비이온성 계면활성제로서 폴리소르베이트 또는 폴록사머가 적합하다. 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜은, 비이온성 계면활성제로서 적합하다. 특히, 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜이 적합하다. 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜은 폴록사머 188과 동의이다.
동결건조 제제에 있어서의 비이온성 계면활성제의 함량은, 융합 단백질의 함량에 대해서, 바람직하게는 0.005∼6(w/ww/w)이고, 보다 바람직하게는 0.02∼0.2(w/ww/w)이며, 더욱 바람직하게는 0.04∼0.1(w/ww/w)이고, 예를 들어, 0.065(w/ww/w)이다.
동결건조 제제에 포함되는 완충제로는, 의약품의 부형제로서 이용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 인산 완충제이다. 인산 완충제는, 동결건조 제제를 순수로 용해했을 때에, 바람직하게는 pH가 5.5∼7.5가 되도록, 보다 바람직하게는 pH가 6.0∼7.0이 되도록, 예를 들어 pH 6.5가 되도록 동결건조 제제에 첨가된다.
본 발명의 동결건조 제제의 적합한 조성의 예로서,
(A) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 중성염, 2당류, 및 이온성 계면활성제의 함량이, 각각, 0.015∼2.5(w/ww/w), 2.5∼200(w/ww/w), 및 0.005∼6(w/ww/w)인 것,
(B) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 중성염, 2당류, 및 이온성 계면활성제의 함량이, 각각, 0.05∼0.5(w/w), 5∼50(w/w), 및 0.02∼0.2(w/w)인 것,
(C) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 중성염, 2당류, 및 이온성 계면활성제의 함량이, 각각, 0.1∼0.25(w/w), 10∼25(w/w), 및 0.04∼0.1(w/w)인 것을 들 수 있다.
상기 (A)∼(C)에 있어서, 인산 완충제는, 동결건조 제제를 순수로 용해했을 때에, pH가 5.5∼7.5 또는 6.0∼7.0이 되도록, 예를 들어 pH 6.5가 되도록 동결건조 제제에 첨가된다.
본 발명의 동결건조 제제의 보다 적합한 조성의 예로서,
(D) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.015∼2.5(w/w), 2.5∼200(w/w), 및 0.005∼6(w/w)인 것,
(E) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.05∼0.5(w/w), 5∼50(w/w), 및 0.02∼0.2(w/w)인 것,
(F) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.1∼0.25(w/w), 10∼25(w/w), 및 0.04∼0.1(w/w)인 것을 들 수 있다.
상기 (D)∼(F)에 있어서, 인산 완충제는, 동결건조 제제를 순수로 용해했을 때에, pH가 5.5∼7.5 또는 6.0∼7.0이 되도록, 특히 pH가 6.5가 되도록 첨가된다.
본 발명의 동결건조 제제의 더욱 구체적인 조성의 예로서,
(G) 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질의 함량이 10mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.16(w/w), 15(w/w), 및 0.65(w/w)이고, 순수로 용해했을 때에 pH가 6.0∼7.0이 되도록 인산 완충제가 첨가된 것을 들 수 있다.
상기 (A)∼(G)로 나타나는 동결건조 제제에 있어서, 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질은, 예를 들어, 인간화 항hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질이다. 이러한 인간화 항hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 바람직한 형태로서,
(1) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이며, 중쇄의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제가 결합한 것인 융합 단백질,
(2) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이며, 중쇄의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제가 결합한 것인 융합 단백질,
(3) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고, 해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이며, 중쇄의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제가 결합한 것인 융합 단백질을 들 수 있다.
상기 (1)∼(3)의 융합 단백질에 있어서, 인간 이두론산-2-설파타제는, 바람직하게는 서열 번호 1로 나타나는 아미노산을 갖는 것이고, 링커 서열은, 바람직하게는(Gly-Ser)으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한 이들 융합 단백질은, 통상, 2개의 경쇄와 2개의 인간 이두론산-2-설파타제와 결합한 중쇄로부터 구성된다.
상기 (A)∼(G)로 나타나는 동결건조 제제에 있어서의, 인간화 항hTfR 항체와 hI2S의 융합 단백질의 더욱 바람직한 형태로서,
(4) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것,
(5) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것,
(6) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고 있고, 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것을 들 수 있다.
상기 (A) 또는 (F)로 나타나는 동결건조 제제에 있어서, 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질이 상기 (1)∼(6)로 나타나는 것인 경우에 있어서, 당해 융합 단백질의 함량은, 바람직하게는 0.5∼20mg이고, 예를 들어, 2.0∼10mg, 2.0∼6.0mg 등이며, 적절히, 2.5mg, 5.0mg 등으로 조정된다. 당해 융합 단백질의 적합한 동결건조 제제의 조성의 예로서,
(H) 당해 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.015∼2.5(w/w), 2.5∼200(w/w), 및 0.005∼6(w/w)인 것,
(I) 당해 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.05∼0.5(w/w), 5∼50(w/w), 및 0.02∼0.2(w/w)인 것,
(J) 당해 융합 단백질의 함량이 0.5∼20mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.1∼0.25(w/w), 10∼25(w/w), 및 0.04∼0.1(w/w)인 것을 들 수 있다.
보다 구체적으로는,
(K) 당해 융합 단백질의 함량이 10mg이며, 융합 단백질의 함량에 대한 염화 나트륨, 수크로스, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜의 함량이, 각각, 0.16(w/w), 15(w/w), 및 0.65(w/w)이고, 순수로 용해했을 때에 pH가 6.0∼7.0이 되도록 인산 완충제가 첨가된 것이 있다.
항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로 하는 본 발명의 동결건조 제제는, 예를 들어, 더블 챔버 타입의 시린지 또는 바이알 등의 용기에 봉입, 충전 등이 된 형태로 공급할 수 있다. 또한, 본 발명의 동결건조 제제는, 이것을 용해하기 위한 전용의 용액과 함께 키트로서 공급할 수도 있다. 동결건조 제제는, 예를 들어, 사용 전에 전용의 용액, 순수, 링거액 등으로 용해한 후에, 생리 식염수로 희석하여 수주액(輸注液)으로 하고, 이 수주액을 점적 정주한다. 그 외, 동결건조 제제는, 환자의 근육내, 복강내 또는 피하 등에 투여할 수도 있다. 동결건조 제제를 봉입, 충전 등을 하기 위한 시린지 및 바이알 등의 용기의 재질에 특별히 한정은 없지만, 붕규산 유리제의 것이 적합하고, 이 외, 환상 올레핀과 올레핀의 공중합체인 사이클로올레핀 코폴리머, 사이클로올레핀류 개환 중합체 또는, 사이클로올레핀류 개환 중합체에 수소 첨가한 것 등의 소수성 수지제의 것도 적합하다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예로 한정되는 것은 의도하지 않는다.
〔실시예 1〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질 발현용 벡터의 구축
hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질 발현용 벡터는, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 1, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 2, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 이루어지는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 3종류의 인간화 항hTfR 항체(번호 1∼3)를 코딩하는 유전자를 이용하여 구축했다.
pEF/myc/nuc 벡터(Invitrogen사)를, KpnI와 NcoI로 소화하여, EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 T4 DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo(Invitrogen사)를, BglII 및 EcoRI로 소화하여, CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4 DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다. pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1 kbp의 영역을 절제했다. pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen사)를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5'(서열 번호 11) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(서열 번호 12)를 이용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다. 증폭한 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 상기의 네오마이신 내성 유전자를 절제한 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축했다.
서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 전장을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 3)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC1)로 했다.
서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 전장을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 5)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC2)로 했다.
서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 전장을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 7)을 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는 MluI 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 짜넣었다. 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 발현용 벡터인 pE-hygr(LC3)로 했다.
서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 C말단측에(Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 14로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-1)를 구축했다.
서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 C말단측에(Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 16으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-2)를 구축했다.
서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 C말단측에(Gly-Ser)의 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 18로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩한다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하여, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-3)를 구축했다.
〔실시예 2〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주의 제작
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, 하기의 방법에 의해, GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC1)과 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합, 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC2)과 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, 및 실시예 1에서 구축한 pE-hygr(LC3)과 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로, 각각 형질 전환했다. 세포의 형질 전환은 대체로 이하의 방법으로 행했다.
5X105개의 CHO-K1 세포를 CD OptiCHOTM 배지(Thermo Fisher Scientific사)를 첨가한 3.5cm 배양 디쉬에 파종하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 세포를 5X106개/mL의 밀도가 되도록 Opti-MEMTM I 배지(Thermo Fisher Scientific사)로 현탁했다. 세포 현탁액 100μL를 채취하고, 이것에 CD OptiCHOTM 배지로 100μg/mL로 희석한 pE-hygr(LC1) 및 pE-neo(HC-I2S-1) 플라스미드 DNA 용액을 5μL씩 첨가했다. GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 일렉트로포레이션을 실시하여, 세포에 플라스미드를 도입했다. 37℃,5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포를, 0.5mg/mL의 하이그로마이신 및 0.8mg/mL의 G418을 함유하는 CD OptiCHOTM 배지로 선택 배양했다. pE-hygr(LC2) 및 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합, pE-hygr(LC2) 및 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합에서도 마찬가지로 하여 세포를 형질 전환시켰다.
그 다음에, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96웰 플레이트 상에 선택 배양으로 선택된 세포를 파종하고, 각 세포가 단클론 콜로니를 형성하도록 약 10일간 배양했다. 단클론 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 채취하고, 인간화 항체 함량을 ELISA법으로 조사하여 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를 선택했다.
이 때의 ELISA법은 대체로 이하의 방법으로 실시했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc사)의 각 웰에, 염소 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을 0.05M 탄산 수소염 완충액(pH 9.6)으로 4μg/mL로 희석한 것을 100μL씩 가하고 실온에서 적어도 1시간 정치하여 항체를 플레이트에 흡착시켰다. 그 다음에, 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)에 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-T)으로 각 웰을 3회 세정 후, Starting Block(PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 각 웰에 200μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 30분 정치했다. 그 다음에, 각 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4)에 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-BT)으로 적당한 농도로 희석한 배양 상청 또는 인간 IgG 표준품을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. 그 다음에, 플레이트를 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS-BT로 희석한 HRP 표지 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, 0.4mg/mL o-페닐렌다이아민을 포함하는 인산-시트르산 완충액(pH 5.0)을 100μL씩 각 웰에 가하고, 실온에서 8∼20분간 정치 했다. 그 다음에, 1mol/L 황산을 100μL씩 각 웰에 가하여 반응을 정지시키고, 96웰 플레이트 리더를 이용하여, 각 웰에 대해 490nm에서의 흡광도를 측정했다. 높은 측정치를 나타낸 웰에 대응하는 세포를, hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주로서 선택했다.
pE-hygr(LC1)과 pE-neo(HC-I2S-1)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 1로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 1로 했다.
pE-hygr(LC2)과 pE-neo(HC-I2S-2)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 2로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 2로 했다.
pE-hygr(LC3)과 pE-neo(HC-I2S-3)의 조합으로 형질 전환시켜 얻어진 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 고발현 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 3으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 3으로 했다.
I2S-항hTfR 항체 1, I2S-항hTfR 항체 2 및 I2S-항hTfR 항체 3에 포함되는, 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열, 그들 경쇄 및 중쇄에 포함되는 가변 영역의 아미노산 서열, 및, 그들 가변 영역에 포함되는 CDR1∼3의 아미노산 서열의 서열 번호를, 표 1에 정리해 나타낸다.
Figure 112019074228175-pct00001
〔실시예 3〕 hI2S-항hTfR 항체 발현주의 배양
I2S-항hTfR 항체를, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 2에서 얻은 hI2S-항hTfR 항체 발현주 3을, 세포 밀도가 약 2X105개/mL가 되도록, 4mM L-알라닐-L-글루타민, 100μmol/L 하이포잔틴 및 16μmol/L 티미딘을 함유하는, 약 200L의 무혈청 배지(EX-CELL Advanced CHO Fed-batch Medium, Sigma Aldrich사)에 현탁시켰다. 이 세포 현탁액의 140L를 배양조로 옮겼다. 배지를 임펠러로 89rpm의 속도로 교반하여, 배지의 용존 산소 농도를 약 40%로 유지하고, 34∼37℃의 온도 범위에서, 약 11일간 세포를 배양했다. 배양 기간 중, 세포수, 세포의 생존률, 배지의 글루코스 농도 및 락트산 농도를 감시했다. 배지의 글루코스 농도가 15mmol/L 미만이 되었을 경우에는, 즉시 글루코스 농도가 37.89mmol/L가 되도록, 글루코스 용액을 배지에 첨가했다. 배양 종료 후에 배지를 회수했다. 회수한 배지를, Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck사)로 여과하고, 추가로 Millistak+ HCgrade X0HC(Merck사)로 여과하여, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청을, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 1.14m2, Merck사)를 이용하여 한외 여과하여, 액량이 약 17분의 1이 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22μm, Merck사)을 이용하여 여과했다. 얻어진 액을 농축 배양 상청으로 했다.
〔실시예 4〕 바이러스의 비활화
실시예 3에서 얻은 농축 배양 상청에, 트라이n-뷰틸인산(TNBP) 및 폴리소르베이트 80을, 종농도가 각각 0.3%(v/v) 및 1%(w/v)가 되도록 첨가하고, 실온에서 4시간 온화하게 교반했다. 이 공정은 배양 상청 중에 혼입되는 바이러스를 비활화시키기 위한 것이다. 단, 생물 유래의 성분을 포함하지 않는 무혈청 배지를 이용하여 세포를 하는 한, 바이러스의 비활화 공정이 없더라도 배양 상청 중에 인체에 유해한 바이러스가 혼입될 가능성은 거의 없다.
〔실시예 5〕 hI2S-항hTfR 항체의 정제
바이러스 비활화 후의 농축 배양 상청을, 0.5배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 첨가한 후에, Millipak-200 Filter Unit(공경: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, 프로테인 A 어피니티 컬럼인 MabSelect SuRe LX 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, GE Healthcare사)에, 200cm/시의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 프로테인 A에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 500mM NaCl 및 450mM 아르기닌을 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에 컬럼 체적의 2.5배용의 140mM NaCl을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 추가로 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 140mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.5)으로, 프로테인 A에 흡착된 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 넣어둔 용기에 받아, 즉시 중화했다.
상기의 프로테인 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액에, 200mM 인산 완충액(pH 7.0)과, 4M NaCl 및 2mM 인산 완충액을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)과, 1M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 순차적으로 첨가하여, 용출액에 포함되는 인산 나트륨 및 NaCl의 농도를, 각각 2mM 및 215mM로 조정함과 함께, 용출액의 pH를 7.3으로 조정했다. 그 다음에, 이 용출액을, Opticap XL600(공경: 0.22μm, Merck사)으로 여과했다. 이 여과 후의 용액을, 컬럼 체적의 4배용의 215mM NaCl 및 2mM 인산 나트륨을 함유하는 10mM MES 완충액(pH 7.3)으로 평형화한, 하이드록시아파타이트 컬럼인 CHT TypeII 40μm 컬럼(컬럼 체적: 약 3.2L, 베드 높이: 약 20cm, Bio-Rad사)에, 200cm/시의 일정 유속으로 부하하여, I2S-항hTfR 항체 3을 하이드록시아파타이트에 흡착시켰다.
그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 동 유속으로 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 215mM NaCl을 함유하는 35mM 인산 완충액(pH 7.3)으로, 하이드록시아파타이트에 흡착된 I2S-항hTfR 항체 3을 용출시켰다. 한편, 하이드록시아파타이트 컬럼으로의 정제는, 프로테인 A 어피니티 컬럼으로부터의 용출액을 반량씩 이용하여, 2회로 나누어 실시했다.
상기의 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액에, 묽은 염산을 가하여 pH를 6.5로 조정했다. 그 다음에, PelliconTM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(공경: 30kDa, 막 면적: 1.14m2, Merck사)를 이용하여 한외 여과하여, 용액 중의 I2S-항hTfR 항체 3의 농도가 약 2mg/mL가 될 때까지 농축했다. 그 다음에, 이 농축액을 Opticap XL600(0.22 μm, Merck사)을 이용하여 여과했다.
상기의 농축액을, 컬럼 체적의 5배용의 0.8mg/mL NaCl 및 75mg/mL 수크로스를 함유하는 20mM 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화한, 사이즈 배제 컬럼인 Superdex 200 컬럼(컬럼 체적: 약 12.6L, 베드 높이: 40cm, GE Healthcare사)에, 19cm/시의 일정 유속으로 부하하고, 추가로, 동 완충액을 동 유속으로 공급했다. 이 때, 사이즈 배제 컬럼으로부터의 용출액의 유로에, 용출액의 흡광도를 연속적으로 측정하기 위한 흡광 광도계를 배치하고, 280nm의 흡광도를 모니터하여, 280nm에서 흡수 피크를 나타낸 획분을, I2S-항hTfR 항체 3을 포함하는 획분으로서 회수하여, 이것을 I2S-항hTfR 항체 정제품으로 했다. 한편, 사이즈 배제 컬럼으로의 정제는, 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터의 용출액을 반량씩 이용하여, 2회로 나누어 실시했다.
〔실시예 6〕 I2S-항hTfR 항체를 함유하는 동결건조품의 제조
실시예 5에서 얻은 I2S-항hTfR 항체 정제품을 이용하여, 표 2에 나타내는 조성의 수용액을 조제했다. 이 수용액을 Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22μm(Corning사)를 이용하여 제균 여과했다. 여과 후의 용액을 시험약으로 했다. 시험약의 pH가 약 6.5가 되도록, 필요에 따라서 수산화 나트륨 용액 또는 묽은 염산을 첨가했다.
Figure 112019074228175-pct00002
시험약을 2.5mL씩, 붕규산 유리제 바이알에 충전하고, 고무마개(염소화 뷰틸제)를 반타전(半打栓)하여 동결건조했다. 동결건조 공정에 있어서, 바이알 내의 기상을 질소로 치환하고 나서 고무마개를 전타전(全打栓)하고, 바이알을 밀봉했다. 얻어진 동결건조품은, 바이알 중에서 백색의 덩어리를 형성했다.
〔실시예 7〕 I2S-항hTfR 항체를 함유하는 동결건조 제제의 안정성의 검토
실시예 6에서 제조한 동결건조품을, 암소(暗所), 5℃ 또는 25℃의 환경하에서 6개월간 정치했다. 정치 개시 시, 1개월 후, 3개월 후, 및 6개월 후에, 바이알 중의 동결건조품을 2.5mL의 순수로 용해하여, 이것을 샘플 용액으로 했다. 각 샘플 용액의 pH를 측정함과 함께, 백색광원 아래, 2000∼3750lx의 명도에서 육안에 의해 이물의 유무를 검사했다. 또한, 각 샘플 용액 중에 포함되는 1∼100μm의 입경의 미립자수를, 실시예 8에 나타내는 방법으로 측정했다. 또한, 각 샘플 용액에 있어서의 I2S-항hTfR 항체의 중합체의 비율을, 실시예 9에 나타내는 방법으로 측정했다. 더욱이, 각 샘플 용액에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR와의 친화성을 실시예 10에 나타내는 방법으로 측정했다. 더욱이 또한, 각 샘플 용액에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 효소 활성을 실시예 11에 나타내는 방법으로 측정했다.
암소, 5℃의 환경하에서 6개월간 정치했을 때의 I2S-항hTfR 항체를 함유하는 동결건조 제제의 안정성의 측정 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타나듯이, 샘플 용액의 pH는, 동결건조품을 6개월 정치한 기간 중, 거의 pH 6.5로 유지되었다. 또한, 동 기간 중의 샘플 용액 중에 육안에 의해 분명하게 확인되는 불용성 이물은 없었다. 또한, 동 기간 중의 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체에서 차지하는 중합체 비율은 거의 일정했다. 또한, 샘플 용액 중에 포함되는 1∼100μm의 입경의 미립자의 수도, 동 기간 중에 현저하게 증가하지는 않았다. 정치 후 6개월의 샘플 용액에서 미립자수의 증가가 관찰되었지만, 그것은, 동결건조 제제의 보존 기간을 냉소에서 2년간으로 설정했을 때에, 허용 가능한 범위의 것이었다. 또한, 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 효소 활성은, 동 기간 중 거의 일정하게 유지되었다. 또한, 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성이, 동 기간 중에 현저하게 저하되지도 않았다(데이터는 나타내지 않음).
Figure 112019074228175-pct00003
암소, 25℃의 환경하에서 6개월간 정치했을 때의 I2S-항hTfR 항체를 함유하는 동결건조 제제의 안정성의 측정 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타나듯이, 샘플 용액의 pH는 동결건조품을 6개월 정치한 기간 중, 거의 pH 6.5로 유지되었다. 또한, 동 기간 중에 육안에 의해 분명하게 확인되는 불용성 이물은 생기지 않았다. 또한, 동 기간 중의 중합체 비율은 거의 일정했다. 또한, 샘플 용액에 포함되는 1∼100μm의 입경의 미립자의 수도, 동 기간 중에 현저하게 증가하지는 않았다. 6개월 후에 미립자수의 증가가 관찰되었지만, 그것은, 동결건조 제제의 보존 기간을 냉소에서 2년간으로 설정했을 때에, 허용 가능한 범위의 것이었다. 또한, 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 효소 활성은, 동 기간 중 거의 일정하게 유지되었다. 또한, 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성이, 동 기간 중에 현저하게 저하되지도 않았다(데이터는 나타내지 않음).
Figure 112019074228175-pct00004
이상의 결과는, 유통 과정 및 보관고에 있어서, 약제가 냉소 하에 놓여지는 것을 전제로 하여, I2S-항hTfR 항체를 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 약제를, 표 2에 나타나는 조성의 동결건조 제제로 함으로써, 약리학적으로 안정된 상태로 시장에 제공할 수 있음을 나타내는 것이다.
〔실시예 8〕 샘플 용액 중에 포함되는 입자수(입경: 1∼100μm)의 측정
샘플 용액 중에 포함되는 입자수의 측정은, 플로 이미징 입자 해석 장치인 FlowCAMTM(플루이드 이미징 테크놀로지즈사)를 이용하여 행했다. 플로 이미징 입자 해석 장치는, 샘플 용액을 시린지 펌프에 의해 광학계와 직교하는 플로 셀로 끌어들여, 플로 셀 중을 통과하는 입자를 리얼타임으로 촬영하는 것에 의해, 샘플 용액 중에 포함되는 입자수를 측정할 수 있는 장치이다. 측정은, 검출해야 할 입자 사이즈를 1∼100μm로 설정하여 행했다.
〔실시예 9〕 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 중합체의 함유율의 측정
시마즈 HPLC 시스템 LC-20A(시마즈제작소)에, 사이즈 배제 컬럼 크로마토그래피 컬럼인 TSKgel UltraSW Aggregate 3μm 컬럼(7.8mm 직경 X 30cm 길이, TOSOH사)을 세팅했다. 또한, 컬럼의 하류에 흡광 광도계를 설치하여, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 연속하여 측정할 수 있도록 했다. 0.2M 인산 나트륨 완충 수용액을 0.5mL/분의 유속으로 흐르게 하여 컬럼을 평형화시킨 후, 3∼20μg의 I2S-항hTfR 항체를 함유하는 샘플 용액을 컬럼에 부하하고, 추가로 0.2M 인산 나트륨 완충 수용액을 동 유속으로 흐르게 했다. 이 동안, 컬럼으로부터의 유출액의 흡광도(측정 파장 215nm)를 측정하는 것에 의해, 용출 프로필을 얻었다. 얻어진 용출 프로필로부터, I2S-항hTfR 항체의 단량체의 피크 면적(단량체 피크 면적)과, 이 단량체 피크보다 먼저 나타나는 I2S-항hTfR 항체의 중합체의 피크 면적(중합체 피크 면적)을 구했다. 중합체의 함유율(%)을 다음 식으로 구했다.
중합체의 함유율(%)={중합체 피크 면적/(단량체 피크 면적＋중합체 피크 면적)}X100
〔실시예 10〕 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정
I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정은, 바이오레이어 간섭법(BioLayer Interferometry: BLI)을 이용한 생체 분자 상호작용 해석 시스템인 OctetRED96(ForteBio사, a division of Pall Corporation)을 이용하여 실시했다. 바이오레이어 간섭법의 기본 원리에 대해, 간단하게 설명한다. 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자의 층(레이어)에 특정 파장의 광을 투사했을 때, 생체 분자의 레이어와 내부의 참조가 되는 레이어의 2개의 표면에서 광이 반사되어 광의 간섭파가 생긴다. 측정 시료 중의 분자가 센서 칩 표면의 생체 분자에 결합하는 것에 의해, 센서 첨단의 층의 두께가 증가하여, 간섭파에 파장 시프트가 생긴다. 이 파장 시프트의 변화를 측정하는 것에 의해, 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자에 결합하는 분자수의 정량 및 속도론적 해석을 리얼타임으로 행할 수 있다. 측정은, 대체로 OctetRED96에 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 실시했다. 인간 TfR로서는, N말단에 히스티딘 태그가 부가된, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열 중에서 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의, hTfR의 세포외 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 TfR(r인간 TfR: Sino Biological사)을 이용했다.
실시예 6에서 조제한 샘플 용액을, 각각 HBS-P+(150mM NaCl, 50μM EDTA 및 0.05% Surfactant P20을 포함하는 10mM HEPES)로 2단계 희석하여, 0.78125∼50nM(0.117∼7.5μg/mL)의 7단계의 농도의 샘플 용액 희석액을 조제했다. r인간 TfR을, HBS-P＋로 희석하여, 25μg/mL의 용액을 조제하여, r인간 TfR-ECD(Histag) 용액으로 했다.
상기 2단계 희석하여 조제한 샘플 용액 희석액을, 96 well plate, black(greiner bio-one사)에 200μL/웰씩 첨가했다. 또한, 상기 조제한 r인간 TfR-ECD(Histag) 용액을, 소정의 웰에 각각 200μL/웰씩 첨가했다. 베이스라인, 해리용 및 세정용의 웰에는, HBS-P+를 200μL/웰씩 첨가했다. 재생용의 웰에는, 10mM Glycine-HCl(pH 1.7)을 200μL/웰씩 첨가했다. 활성화용의 웰에는, 0.5mM NiCl2 용액을 200μL/웰씩 첨가했다. 이 플레이트와 바이오센서(Biosensor/Ni-NTA: ForteBio사, a division of Pall Corporation)를, OctetRED96의 소정의 위치에 설치했다.
OctetRED96을 하기의 표 5에 나타내는 조건에서 작동시켜 데이터를 취득 후, OctetRED96 부속의 해석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응 곡선을 1:1 결합 모델 혹은 2:1 결합 모델에 피팅하여, 항hTfR 항체의 r인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 측정하고, 해리 상수(KD)를 산출했다. 한편, 측정은 25∼30℃의 온도하에서 실시했다.
Figure 112019074228175-pct00005
〔실시예 11〕 샘플 용액 중에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 효소 활성 측정
샘플 용액을, 수직 폴리에터설폰막(VIVASPIN2 5,000 MWCO PES, 자르토리우스사)을 한외 여과막으로서 이용한 막 여과에 의해 탈염하고, 그 다음에, 탈염된 시료를 반응 완충액(5mM 아세트산 나트륨, 0.5mg/L BSA, 0.1% Triton X-100, pH 4.45)으로 약 100ng/mL로 희석했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰(FluoroNunc Plate, Nunc사)에 희석한 샘플 용액을 10μL씩 첨가하고, 37℃에서 15분간 프리인큐베이트했다. 기질 용액은, 기질 완충액(0.5mg/mL BSA를 포함하는 5mM 아세트산 나트륨, pH 4.45)을 이용하여 4-메틸움벨리페릴설페이트(SIGMA사)를 최종 농도 1.5mg/mL가 되도록 용해하는 것에 의해 조제했다. 기질 용액을, 희석한 샘플 용액을 포함하는 각 웰에 100μL씩 첨가하고, 플레이트를 암소에 37℃에서 1시간 정치했다. 인큐베이션 후, 정지 완충액(0.33M 글리신, 0.21M 탄산나트륨 완충액, pH 10.7)을 190μL씩, 샘플을 포함하는 각 웰에 가했다. 대조로서 150μL의 0.4μmol/L 4-메틸움벨리페론(4-MUF, Sigma사) 용액과 150μL의 정지 완충액을, 웰에 가했다. 그 다음에, 여기 파장 330nm, 형광 검출 파장 440nm에서 플레이트를 측정했다.
여러 가지 농도의 4-MUF 용액의 형광 강도를 측정하는 것에 의해 표준 곡선을 작성했다. 각 시료의 형광 강도를 표준 곡선에 외삽했다. 한편, 결과는, 37℃에서 1분당에 1μ몰의 4-MUF가 생성되는 것과 동등한 활성을 1단위(Unit)로 하여, Unit/mg 단백질량으로 표시되는 활성으로서 계산했다. 공개된 미국 특허 출원(공개 번호 2004-0229250)은, 이 측정을 실시하는데 있어서 참조되었다.
본 발명에 의하면, 항체와 리소좀 효소를 결합시킨 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 동결건조 제제를, 약리학적으로 안정된 상태로 시장에 제공할 수 있다.
서열 번호 2: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 3: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 4: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 5: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 6: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 7: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 8: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 9: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 10: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 11: 프라이머 Hyg-Sfi5', 합성 서열
서열 번호 12: 프라이머 Hyg-BstX3', 합성 서열
서열 번호 13: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 I2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 14: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄와 I2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 15: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 I2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 16: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄와 I2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 17: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 18: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 19: 링커의 아미노산 서열의 예 1
서열 번호 20: 링커의 아미노산 서열의 예 2
서열 번호 21: 링커의 아미노산 서열의 예 3
서열 번호 23: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 24: 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 25: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 26: 인간화 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 27: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 28: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 29: 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 30: 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 31: 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 32: 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 33: 항hTfR 항체 번호 1의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 34: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 35: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 36: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 37: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 38: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 39: 항hTfR 항체 번호 1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
서열 번호 40: 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 41: 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 42: 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 43: 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 44: 항hTfR 항체 번호 2의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 45: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 46: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 47: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 48: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 49: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 50: 항hTfR 항체 번호 2의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
서열 번호 51: 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 52: 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 53: 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 54: 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 55: 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 56: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 57: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 58: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 59: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 60: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 61: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Lyophilized Preparation <130> 1215JP <150> P2016-257060 <151> 2016-12-28 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro 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Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr 370 375 380 Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro 385 390 395 400 Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His 405 410 415 Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro 420 425 430 Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro 435 440 445 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 450 455 460 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 465 470 475 480 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 485 490 495 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 500 505 510 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 515 520 525 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light-chain of humanized anti-hTfR antibody No. 1 <400> 2 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 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the light chain of humanized anti-hTfR antibody No. 1, synthetic sequence <400> 3 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcca ggtcacacag tcaccaagtt ttctgagcgc aagcgtgggc 120 gacagggtca ctatcacatg caaggcaagc caggacgtga actccgcagt ggcctggttc 180 cagcagaagc cagggaaagc acccaagctg ctgatctatt ggacctctac aaggcacacc 240 ggtgtcccag atcggttctc aggttccggc agcggaacag tgtatactct gaccatttcc 300 agcctgcagc ctgaagactt cgctacttac tattgccagc agcattactc caccccaaga 360 acatttggcg gagggactaa agtggagatc aagaggaccg tggccgctcc ctccgtcttc 420 atttttcccc ctagcgacga acagctgaag agtggcacag cctcagtggt ctgtctgctg 480 aacaatttct accctaggga ggctaaagtg cagtggaagg tcgataacgc actgcagtct 540 ggaaatagtc aggagtcagt gacagaacag gactccaaag atagcactta ttctctgtct 600 agtacactga ctctgagcaa ggccgattac gaaaagcaca aagtgtatgc ttgcgaagtc 660 acccatcagg ggctgtcatc accagtcacc aagtcattca atagaggcga gtgctaagcg 720 gccgc 725 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No. 2 <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No. 2, synthetic sequence <400> 5 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaaattgt gctgacccag tctcccgatt tccagtccgt gacccccaag 120 gagaaagtca ccatcacatg cagagcatca cagtccatta gcaacaatct gcagtggtac 180 cagcagaagc cagaccagag ccccaagctg ctgatcaaat atgcctctca gagtatttca 240 ggcatacctt ctaggttctc cggtagcggc tctggaaccg actttactct gaccatcaac 300 agtctggagg ctgaagatgc cgctacatac ttgtgccagc agagtaattc atggcctagg 360 acctttggcc aggggacaaa ggtggagatc aaaaggactg tggcagcccc aagtgtcttc 420 atttttcccc cttcagacga acagctgaag agcggcacag catctgtggt ctgtctgctg 480 aacaatttct acccacggga ggctaaggtg cagtggaaag tcgataacgc actgcagtcc 540 ggaaatagcc aggagtctgt gactgaacag gacagtaagg attcaaccta ttccctgtcc 600 agcacactga ctctgagcaa agccgattac gagaagcaca aagtgtatgc ttgcgaagtc 660 acacatcagg ggctgtctag tcccgtgact aagtctttta ataggggtga atgttaagcg 720 gccgc 725 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 7 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3, synthetic sequence <400> 7 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 8 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 1 <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 9 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 2 <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg 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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 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Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser 435 440 445 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 450 455 460 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp 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Pro 885 890 895 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 900 905 910 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 915 920 925 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 930 935 940 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 945 950 955 960 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 965 970 <210> 14 <211> 3002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of fused protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.1 and hI2S, synthetic sequence <400> 14 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaagtgca gctggtcgaa tcaggggggg ggctggtgca gcctggaggc 120 agcctgagac tgtcctgcgc cgcttctggc ttgaccttta gcaactacgg gatgtcctgg 180 gtgcggcagg ctcctggcaa gggactggag ttggtggcca acatcaatac caacggcgga 240 agtacatact atcccgattc agtgaagggc cggttcacca tcagcaggga caacgccaag 300 aacagcctgt atctgcagat gaactctctg agggccgagg atacagccgt gtactattgc 360 actaacaacc ggtacgacga ggactattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtctagc 420 gcctctacca agggcccaag cgtgtttcct ctggctccat cctctaaatc cacctctggc 480 ggcacagccg ctctgggctg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gacagtgtct 540 tggaacagcg gcgccctgac ctccggcgtg cacacatttc ctgctgtgct gcagagctcc 600 ggcctgtaca gcctgtctag cgtggtgacc gtgccatcct ctagcctggg cacccagaca 660 tatatctgca acgtgaatca caagcccagc aatacaaagg tggataagaa ggtggagcca 720 aagtcctgtg acaagaccca cacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 780 ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagccc aaggataccc tgatgatctc tcggacccca 840 gaggtgacat gcgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 900 tatgtggacg gcgtggaggt gcacaatgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 960 tccacctata gagtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020 gagtataagt gcaaggtgtc caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 1080 aaggccaagg gccagcccag agagcctcag gtgtacacac tgcctccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtcaagg gcttctatcc ctctgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tggccagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260 ctggattccg acggctcttt ctttctgtat agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320 cagcagggca acgtgttcag ctgttccgtg atgcacgaag ctctgcataa tcactatact 1380 cagaaatccc tgtcactgtc acctggtaaa ggatcttccg aaacgcaggc caactcgacc 1440 acagatgctc tgaacgttct tctcatcatc gtggatgacc tgcgcccctc cctgggctgt 1500 tatggggata agctggtgag gtccccaaat attgaccaac tggcatccca cagcctcctc 1560 ttccagaatg cctttgcgca gcaagcagtg tgcgccccga gccgcgtttc tttcctcact 1620 ggcaggagac ctgacaccac ccgcctgtac gacttcaact cctactggag ggtgcacgct 1680 ggaaacttct ccaccatccc ccagtacttc aaggagaatg gctatgtgac catgtcggtg 1740 ggaaaagtct ttcaccctgg gatatcttct aaccataccg atgattctcc gtatagctgg 1800 tcttttccac cttatcatcc ttcctctgag aagtatgaaa acactaagac atgtcgaggg 1860 ccagatggag aactccatgc caacctgctt tgccctgtgg atgtgctgga tgttcccgag 1920 ggcaccttgc ctgacaaaca gagcactgag caagccatac agttgttgga aaagatgaaa 1980 acgtcagcca gtcctttctt cctggccgtt gggtatcata agccacacat ccccttcaga 2040 taccccaagg aatttcagaa gttgtatccc ttggagaaca tcaccctggc ccccgatccc 2100 gaggtccctg atggcctacc ccctgtggcc tacaacccct ggatggacat caggcaacgg 2160 gaagacgtcc aagccttaaa catcagtgtg ccgtatggtc caattcctgt ggactttcag 2220 cggaaaatcc gccagagcta ctttgcctct gtgtcatatt tggatacaca ggtcggccgc 2280 ctcttgagtg ctttggacga tcttcagctg gccaacagca ccatcattgc atttacctcg 2340 gatcatgggt gggctctagg tgaacatgga gaatgggcca aatacagcaa ttttgatgtt 2400 gctacccatg ttcccctgat attctatgtt cctggaagga cggcttcact tccggaggca 2460 ggcgagaagc ttttccctta cctcgaccct tttgattccg cctcacagtt gatggagcca 2520 ggcaggcaat ccatggacct tgtggaactt gtgtctcttt ttcccacgct ggctggactt 2580 gcaggactgc aggttccacc tcgctgcccc gttccttcat ttcacgttga gctgtgcaga 2640 gaaggcaaga accttctgaa gcattttcga ttccgtgact tggaagaaga tccgtacctc 2700 cctggtaatc cccgtgaact gattgcctat agccagtatc cccggccttc agacatccct 2760 cagtggaatt ctgacaagcc gagtttaaaa gatataaaga tcatgggcta ttccatacgc 2820 accatagact ataggtatac tgtgtgggtt ggcttcaatc ctgatgaatt tctagctaac 2880 ttttctgaca tccatgcagg ggaactgtat tttgtggatt ctgacccatt gcaggatcac 2940 aatatgtata atgattccca aggtggagac cttttccagt tgttgatgcc ttaagcggcc 3000 gc 3002 <210> 15 <211> 980 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fused protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.2 and hI2S <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 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tccctgtcat ccgtggtcac tgtccccagc 660 tctagtctgg gtacccagac atatatctgc aacgtgaatc acaagccatc taataccaaa 720 gtcgacaaga aagtggaacc caagtcctgt gataaaactc atacctgccc cccttgtcct 780 gcaccagagc tgctgggagg accatccgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacacc 840 ctgatgatta gccgaactcc cgaagtcacc tgcgtggtcg tggacgtgtc tcacgaggac 900 cctgaagtca agtttaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc taagacaaaa 960 ccccgagagg aacagtacaa cagtacatat cgtgtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcat 1020 caggactggc tgaacgggaa ggaatataag tgcaaagtgt ccaataaggc actgcccgcc 1080 cctatcgaga aaaccattag caaggccaaa ggacagccta gggaaccaca ggtgtacaca 1140 ctgcctccat cccgggacga gctgactaag aaccaggtca gcctgacctg tctggtgaaa 1200 ggcttctatc cttcagatat cgctgtggag tgggaaagta atggacagcc agagaacaat 1260 tacaagacta ccccccctgt gctggactct gatgggagtt tctttctgta ttctaagctg 1320 accgtggata aaagtcggtg gcagcagggt aatgtcttta gttgttcagt gatgcacgaa 1380 gcactgcaca accactacac ccagaaatca ctgtcactgt caccagggaa aggatcttcc 1440 gaaacgcagg ccaactcgac cacagatgct ctgaacgttc ttctcatcat cgtggatgac 1500 ctgcgcccct ccctgggctg ttatggggat aagctggtga ggtccccaaa tattgaccaa 1560 ctggcatccc acagcctcct cttccagaat gcctttgcgc agcaagcagt gtgcgccccg 1620 agccgcgttt ctttcctcac tggcaggaga cctgacacca cccgcctgta cgacttcaac 1680 tcctactgga gggtgcacgc tggaaacttc tccaccatcc cccagtactt caaggagaat 1740 ggctatgtga ccatgtcggt gggaaaagtc tttcaccctg ggatatcttc taaccatacc 1800 gatgattctc cgtatagctg gtcttttcca ccttatcatc cttcctctga gaagtatgaa 1860 aacactaaga catgtcgagg gccagatgga gaactccatg ccaacctgct ttgccctgtg 1920 gatgtgctgg atgttcccga gggcaccttg cctgacaaac agagcactga gcaagccata 1980 cagttgttgg aaaagatgaa aacgtcagcc agtcctttct tcctggccgt tgggtatcat 2040 aagccacaca tccccttcag ataccccaag gaatttcaga agttgtatcc cttggagaac 2100 atcaccctgg cccccgatcc cgaggtccct gatggcctac cccctgtggc ctacaacccc 2160 tggatggaca tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt 2220 ccaattcctg tggactttca gcggaaaatc cgccagagct actttgcctc tgtgtcatat 2280 ttggatacac aggtcggccg cctcttgagt gctttggacg atcttcagct ggccaacagc 2340 accatcattg catttacctc ggatcatggg tgggctctag gtgaacatgg agaatgggcc 2400 aaatacagca attttgatgt tgctacccat gttcccctga tattctatgt tcctggaagg 2460 acggcttcac ttccggaggc aggcgagaag cttttccctt acctcgaccc ttttgattcc 2520 gcctcacagt tgatggagcc aggcaggcaa tccatggacc ttgtggaact tgtgtctctt 2580 tttcccacgc tggctggact tgcaggactg caggttccac ctcgctgccc cgttccttca 2640 tttcacgttg agctgtgcag agaaggcaag aaccttctga agcattttcg attccgtgac 2700 ttggaagaag atccgtacct ccctggtaat ccccgtgaac tgattgccta tagccagtat 2760 ccccggcctt cagacatccc tcagtggaat tctgacaagc cgagtttaaa agatataaag 2820 atcatgggct attccatacg caccatagac tataggtata ctgtgtgggt tggcttcaat 2880 cctgatgaat ttctagctaa cttttctgac atccatgcag gggaactgta ttttgtggat 2940 tctgacccat tgcaggatca caatatgtat aatgattccc aaggtggaga ccttttccag 3000 ttgttgatgc cttaagcggc cgc 3023 <210> 17 <211> 975 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fused protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 and hI2S <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn 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Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro 835 840 845 Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu 850 855 860 Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly 865 870 875 880 Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp 885 890 895 Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile 900 905 910 Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val 915 920 925 Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala 930 935 940 Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met 945 950 955 960 Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 965 970 975 <210> 18 <211> 3008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding amino acid sequence of fused protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 and hI2S, synthetic sequence <400> 18 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tcagctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggattgggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc aaggccatca tctcagccga cacgtccatc 300 agcaccgtct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtatttctgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 gggggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440 tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500 ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560 ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620 ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680 cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740 tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800 agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860 cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920 cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980 atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040 ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100 gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160 caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220 tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280 ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340 acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400 gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460 gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520 gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580 ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640 tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700 tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760 atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820 atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880 gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940 gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000 gcggccgc 3008 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 1 <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 2 <400> 20 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 3 <400> 21 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 22 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 23 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.1 <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.2 <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Val Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 115 120 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain variable region of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 29 Gln Asp Val Asn Ser Ala 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 30 Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala Val Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 31 Trp Thr Ser Thr Arg His 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 32 Trp Thr Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 33 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 34 Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 35 Gly Leu Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 36 Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 37 Asn Ile Asn Thr Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 38 Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 1 <400> 39 Thr Asn Asn Arg Tyr Asp Glu Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 40 Gln Ser Ile Ser Asn Asn 1 5 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 41 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu Gln 1 5 10 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 42 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 43 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 44 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 45 Asp Tyr Val Met His 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 46 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 47 Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly 1 5 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 48 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly His Gly Ser Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 49 Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 1 5 10 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 2 <400> 50 Val Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Ala Gly Asn Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 51 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 52 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 53 Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 54 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR3 in the light chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 55 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 56 Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 57 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 58 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro 1 5 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 59 Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 60 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody No. 3 <400> 61 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 10

Claims (29)

  1. 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 동결건조 제제로서, 중성염, 2당류, 비이온성 계면활성제, 및 완충제를 추가로 함유하여 이루어지고,
    해당 항체가 인간 트랜스페린 수용체(hTfR) 또는 인간 인슐린 수용체를 항원으로 인식하는 것인 인간 항체 또는 인간화 항체이고,
    해당 리소좀 효소가 인간 이두론산-2-설파타제이고,
    해당 중성염이 염화 나트륨이고,
    해당 2당류가 트레할로스, 수크로스, 말토스, 및 유당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고,
    해당 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고,
    해당 완충제가 인산 완충제인, 동결건조 제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    해당 비이온성 계면활성제가, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 및 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 동결건조 제제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    해당 2당류가 수크로스이며, 해당 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜인, 동결건조 제제.
  4. 제 3 항에 있어서,
    해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 비이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.015∼2.5(w/w), 2.5∼200(w/w), 및 0.005∼6(w/w)인, 동결건조 제제.
  5. 제 3 항에 있어서,
    해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 비이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.05∼0.5(w/w), 5∼50(w/w), 및 0.02∼0.2(w/w)인, 동결건조 제제.
  6. 제 3 항에 있어서,
    해당 중성염, 해당 2당류, 및 해당 비이온성 계면활성제의 함량이, 해당 융합 단백질의 함량에 대해서, 각각, 0.1∼0.25(w/w), 10∼25(w/w), 및 0.04∼0.1(w/w)인, 동결건조 제제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    순수(純水)로 용해했을 때의 pH가 5.5∼7.5인, 동결건조 제제.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 어느 하나의 C말단측 또는 N말단측의 어느 하나에 펩티드 결합에 의해 결합한 것인, 동결건조 제제.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 중쇄의 C말단측에 펩티드 결합에 의해 결합한 것인, 동결건조 제제.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소가 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 어느 하나의 C말단측 또는 N말단측의 어느 하나에, 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 동결건조 제제.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 융합 단백질이, 해당 인간 리소좀 효소를 해당 항체의 중쇄의 C말단측에 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 동결건조 제제.
  12. 제 10 항에 있어서,
    해당 링커가, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인, 동결건조 제제.
  13. 제 1 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 동결건조 제제:
    (a) 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 8로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
    융합 단백질;
    (b) 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 9로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
    융합 단백질;
    (c) 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와,
    서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 인간 이두론산-2-설파타제가 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 결합한 것으로 이루어지는,
    융합 단백질.
  14. 제 1 항에 있어서,
    해당 항체가 인간화 항hTfR 항체이고, 해당 융합 단백질이, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 동결건조 제제:
    (a) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
    융합 단백질;
    (b) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 4로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
    융합 단백질;
    (c) 해당 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 6으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이고,
    해당 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, (Gly-Ser)로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 링커를 개재시켜, 인간 이두론산-2-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
    융합 단백질.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    붕규산 유리 또는 소수성 수지에 의해 형성된 용기에 봉입된 것인, 동결건조 제제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    해당 용기가, 사이클로올레핀 코폴리머, 사이클로올레핀류 개환 중합체, 또는 사이클로올레핀류 개환 중합체에 수소 첨가한 것을 이용하여 형성된 것인, 동결건조 제제.
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