JP2013530988A - ヘパランｎ−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物 - Google Patents

ヘパランｎ−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、特に、リソソーム蓄積症の有効な治療のためのリソソーム酵素のＣＮＳ送達のための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、サンフィリッポ症候群Ａ型を治療するための、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質、塩、およびポリソルベート界面活性剤を含む、直接ＣＮＳ髄腔内投与用の安定な製剤を含む。本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の直接送達のための有効且つ低侵襲性のアプローチを提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許仮出願第６１／３５８，８５７号（２０１０年６月２５日出願）；第６１／３６０，７８６号（２０１０年７月１日出願）；６１／３８７，８６２（２０１０年９月２９日出願）；第６１／４３５，７１０（２０１１年１月２４日出願）；第６１／４４２，１１５（２０１１年２月１１日出願）；第６１／４７６，２１０号（２０１１年４月１５日出願）；および第６１／４９５，２６８号（２０１１年６月９日出願）に対する優先権を主張し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。本願は、米国特許出願 表題「治療薬のＣＮＳ送達」（同日出願）；「イズロン酸スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「β−ガラクトセレブロシダーゼのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「アリールスルファターゼＡのＣＮＳ送達のための方法および組成物」（同日出願）；「サンフィリッポ症候群Ｂ型の治療」（同日出願）に関連し、これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される。
技術分野
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、対象への天然または組換え的に得られるタンパク質および／または酵素の全身投与を伴う。認可療法は、典型的には、対象に静脈内投与され、一般的には、根元的酵素欠乏の身体症候を処置するのに有効である。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および組織中への静脈内投与タンパク質および／または酵素の限定的分布の結果として、静脈内投与タンパク質および／または酵素は血液−脳関門（ＢＢＢ）を適切に横断しないため、ＣＮＳ病因を有する疾患の処置は特に挑戦的であった。
血液−脳関門（ＢＢＢ）は、ＢＢＢを横切って、根元的脳脊髄液（ＣＳＦ）およびＣＮＳ中に、血流中の有害物質、例えば細菌、高分子物質（例えばタンパク質）およびその他の親水性分子が分散するのを制限することにより、このような物質から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するよう機能する内皮細胞からなる構造系である。
直接脳内注射、ＢＢＢの一過性透過処理ならびに組織分布を変更するための活性作用物質の改質を含めて、治療薬の脳送達を増強するためにＢＢＢを迂回するいくつかの方法がある。脳組織中への治療薬の直接注射は血管系を完全に迂回するが、しかし、頭蓋内注射により背負い込まれる合併症（感染、組織損傷、免疫応答性）、ならびに投与部位からの活性作用物質の不十分な拡散の危険を主に蒙る。今までのところ、脳物質中へのタンパク質の直接投与は、拡散バリアおよび投与され得る治療薬の用量限定のため、有意の治療効果を達成していない。緩徐長期注入を用いた脳実質中に配置されるカテーテルによる対流拡散（非特許文献１；非特許文献２）が研究されてきたが、しかし長期療法のためにこのアプローチを一般に用いる認可療法はない。さらに、脳内カテーテルの配置は、非常に侵襲性であり、臨床的代替法として余り望ましくない。
髄腔内（ＩＴ）注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）へのタンパク質の投与も試みられてきたが、しかし未だに治療的成功を見ていない。この処置における大きな挑戦は、脳室の上衣内張りを非常に堅く結合する活性作用物質の傾向であって、これがその後の拡散を妨げた。一般に、ＣＳＦへの直接的投与による脳遺伝子疾患の処置のための認可物質はない。

実際、脳の表面での拡散に対するバリア、ならびに有効且つ便利な送達方法の欠如は、任意の疾患に関する脳における適切な治療効果を達成するには大きすぎる障害物である、と多くの人々が考えた。
Ｂｏｂｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９１， ２０７６−２０８０ （１９９４） Ｎｇｕｙｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ９８， ５８４−５９０ （２００３）
多数のリソソーム蓄積障害は神経系に影響を及ぼし、したがって伝統的療法でこれらの疾患を処置するに際して独特の挑戦を実証する。罹患個体のニューロンおよび髄膜において、グリコサミノグリカン（ＧＡＣ）の大きな蓄積がしばしば認められ、種々の型のＣＮＳ症候を生じさせる。今までのところ、リソソーム障害に起因するＣＮＳ症候は、利用可能な任意の手段により首尾よく処置されてきた。
したがって、脳に治療薬を有効に送達する必要性が依然として大いに存在する。さらに特定的には、リソソーム蓄積障害の処置のために中枢神経系に活性作用物質をより有効に送達することが大いに必要とされている。
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の直接送達のための有効且つ低侵襲性のアプローチを提供する。本発明は、一部は、酵素が種々の表面を横断して有効に且つ広範に拡散して、深部脳領域を含めて脳を横断する種々の領域に浸透するよう、リソソーム蓄積症（例えば、サンフィリッポＡ症候群）のための補充酵素（例えば、ヘパランＮ−スルファターゼ）が高濃度（例えば、約３ｍｇ／ｍｇ以上、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ以上）での治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接的に導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、単なる生理食塩水または緩衝液ベースの製剤を用いて、そして対象において実質的副作用、例えば重篤な免疫応答を誘導することなく、このような高タンパク質濃度送達が達成され得る、ということを本発明人等は実証した。したがって、本発明は、ＣＮＳ構成成分を有する種々の疾患および障害、特にリソソーム蓄積症の治療のための直接ＣＮＳ送達のための非常に効率的な、臨床的に望ましい、且つ患者に優しいアプローチを提供する。本発明は、ＣＮＳターゲッティングおよび酵素補充療法の分野における有意の進歩を示す。
以下に詳細に記載するように、本発明者らは、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質の効果的な髄腔内（ＩＴ）投与のための安定な製剤を首尾よく開発した。しかしながら、本明細書に記載する種々の安定な製剤は、一般的に、種々の他のリソソーム酵素を含む治療薬のＣＮＳ送達にしていると考えられる。実際、本発明による安定な製剤は、それだけに限らないが、実質内、脳内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（例えば、ＩＴ−腰椎、ＩＴ−大槽）投与ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦへの直接または間接注射のための任意の他の技術および経路を含む、種々の技術および経路を介してＣＮＳ送達のために使用することができる。
本明細書に記載する種々の安定な製剤は、一般的に、リソソーム蓄積症のための種々の補充酵素を含む治療用タンパク質などの他の治療薬のＣＮＳ送達に適しているとも考えられる。いくつかの実施形態では、補充酵素は、合成、組換え、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。
一態様では、本発明は、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質、塩、緩衝剤およびポリソルベート界面活性剤を含む髄腔内投与用の安定な製剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、約１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（例えば、１〜２５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２００ｍｇ／ｍｌ、１〜１５０ｍｇ／ｍｌ、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、１〜５０ｍｇ／ｍｌ）で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌまたは３００ｍｇ／ｍｌから選択される濃度でまたは最大この濃度までで存在する。
種々の実施形態では、本発明は、ＨＮＳタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤は、塩を含む。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、約０〜３００ｍＭの範囲の濃度（例えば、０〜２５０ｍＭ、０〜２００ｍＭ、０〜１５０ｍＭ、０〜１００ｍＭ、０〜７５ｍＭ、０〜５０ｍＭまたは０〜３０ｍＭ）として存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、約１３５〜１５５ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、約１４５ｍＭの濃度で存在する。
種々の実施形態では、本発明は、ポリソルベート界面活性剤がポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリソルベート界面活性剤はポリソルベート２０である。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０〜０．０２％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０．００５％の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０．０２％の濃度で存在する。
種々の実施形態では、本発明は、緩衝剤をさらに含む、本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、トリスおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、緩衝剤はリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、５０ｍＭ以下の濃度（例えば、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭまたは５ｍＭ以下）で存在する。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度で存在する。特定の実施形態では、リン酸塩は、約５ｍＭの濃度で存在する。種々の態様では、本発明は、約３〜８（例えば、約４〜７．５、５〜８、５〜７．５、５〜６．５、５〜７．５、５．５〜８．０、５．５〜７．７、５．５〜６．５、６〜７．５、６〜７．０または６．５〜７．５）のｐＨを有する、本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６．５〜７．５（例えば、６．５、６．７、６．９、７．０、７．２、７．３または７．５）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、約７．０のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、製剤は、安定化剤をさらに含む。特定の実施形態では、安定化剤は、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ＰＥＧ４０００、ヒスチジン、アルギニン、リジン、リン脂質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、安定化剤はスクロースである。いくつかの実施形態では、スクロースは、約０〜１０％の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、スクロースは、約０．５〜２．０％の範囲の濃度で存在する。特定の実施形態では、安定化剤はグルコースである。いくつかの実施形態では、グルコースは、約０．５〜１．０％の範囲の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、本発明は、液体製剤である本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。種々の実施形態では、本発明は、凍結乾燥した乾燥粉末として製剤化された本明細書に記載する実施形態のいずれかの安定な製剤を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１００〜２００ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩とを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は約１５ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、約３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌまたは３００ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは約１４５ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態では、製剤は、約０〜１０％（例えば、約０〜５％、１〜７％、１〜２．５％、１〜１．５％または０．５〜１．５％）の濃度のスクロースをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１４５ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩と、約０．５〜２％の濃度のスクロースとを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１４５ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩と、約０．５〜１．０％の濃度のグルコースとを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤を含む。
種々の態様では、本発明は、本明細書に記載する種々の実施形態の安定な製剤の単一剤形を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、容器は、アンプル、バイアル、ビン、薬包、レザバー、Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔまたは充填済み注射器から選択される。いくつかの実施形態では、容器は充填済み注射器である。いくつかの実施形態では、充填済み注射器は、焼シリコーンコーティングしたホウケイ酸ガラス注射器、シリコーン噴霧したホウケイ酸ガラス注射器またはシリコーンを含まないプラスチック樹脂注射器から選択される。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約５０ｍｌ未満（例えば、約４５ｍｌ、４０ｍｌ、３５ｍｌ、３０ｍｌ、２５ｍｌ、２０ｍｌ、１５ｍｌ、１０ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌ未満）の容積で存在する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約３．０ｍｌ未満の容積で存在する。
種々の態様では、本発明は、本明細書に記載する実施形態のいずれかによる製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む、サンフィリッポＡ症候群の治療方法を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、約１〜３００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＨＮＳタンパク質と、約１４５ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０とを含み、約７のｐＨを有する製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む、サンフィリッポＡ症候群の治療方法を含む。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、対象に実質的な有害作用（例えば、重度の免疫応答）を生じさせない。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、対象に実質的な適応Ｔ細胞媒介免疫応答を生じさせない。
いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、脳、脊髄および／または末梢器官の種々の標的組織へのＨＮＳタンパク質の送達を生じさせる。いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、標的脳組織へのＨＮＳタンパク質の送達を生じさせる。特定の実施形態では、１種または複数の標的脳組織は、灰白質、白質、室周囲領域、軟膜クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状／被殻領域、中脳、脳橋もしくは髄質の深部領域、およびこれらの組み合わせの組織からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳタンパク質は、脊髄のニューロンにさらに送達される。
いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、末梢標的組織へのＨＮＳタンパク質の全身送達を生じさせる。いくつかの実施形態では、末梢標的組織は、肝臓、腎臓、脾臓および／または心臓から選択される。
いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるリソソーム局在化を生じる。いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるＧＡＧ貯蔵の低減を生じる。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ貯蔵は、対照（例えば、対象の前処置ＧＡＧ貯蔵）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍または２倍低減される。いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、ニューロンの空胞形成の低減を生じる（例えば、対照と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍または２倍）。いくつかの実施形態では、ニューロンはプルキンエ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるＨＮＳ酵素活性増大を生じる。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性は、対照（例えば、対象の前処置内因性酵素）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性増大は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。
いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性は、腰部領域で増大される。いくつかの実施形態では、腰部領域におけるＨＮＳ酵素活性増大は、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである。
いくつかの実施形態では、製剤の髄腔内投与は、サンフィリッポＡ症候群の少なくとも１つの症状もしくは特徴の強度、重症度または頻度の低下あるいは発症遅延を生じさせる。いくつかの実施形態では、サンフィリッポＡ症候群の少なくとも１つの症状もしくは特徴は、聴力損失、言語発達遅延、運動技能の欠乏、多動性障害、精神遅滞、攻撃性および／または睡眠障害である。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は２週間に１回実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は１か月に１回実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は２ヶ月に１回実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は静脈内投与と併せて使用される。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、１週間に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２週間に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、１か月に１回以下の頻度である。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、２ヶ月に１回以下の頻度である。特定の実施形態では、静脈内投与は、毎月投与より頻回であり、例えば週２回、週１回、２週間に１回、または月２回実施される。
いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、同日に実施される。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、互いに一定時間内、例えば少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内または少なくとも１週間以内には実施されない。いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、交互スケジュールで、例えば週１回、隔週、月２回または月１回、交互投与で実施される。いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、例えば週１回、隔週、月２回または月１回の静脈内投与のスケジュールで、そのスケジュールの第３または第４または第５投与毎に、静脈内投与の代わりに髄腔内投与に取り替えられ得る。
いくつかの実施形態では、静脈内および髄腔内投与は、逐次的に実施され、例えば先ず、静脈内投与を実施し（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）、その後、ＩＴ投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）を実施する。いくつかの実施形態では、髄腔内投与を先ず実施し（例えば週１回、隔週、月２回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回の用量投与を、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）、その後、静脈内投与（例えば週１回、隔週、月２回または月１回用量投与を、２週間より長い間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上の間）を実施する。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、静脈内投与の非存在下で使用される。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、同時免疫抑制薬療法の非存在下で使用される。
図面は例証に過ぎず、本発明を限定するものではない。
ＨＮＳについてのＳＥＣ−ＨＰＣＬ溶出プロファイルの例示的クロマトグラムを示す図である。（Ａ）２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０のプロファイル；（Ｂ）２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０、ベースライン（ｉｌｃ）の拡大クロマトグラム；（Ｃ）５０℃で７日後の２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０の拡大クロマトグラム；（Ｄ）５０℃で７日後の２ｍｇ／ｍｌ クエン酸塩、ｐＨ７．０の１６分ピークおよび２６分二量体ピークの波長走査の重ね合わせ。 ＨＮＳについてのＳＥＣ−ＨＰＣＬ溶出プロファイルの例示的クロマトグラムを示す図である。（Ａ）２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０のプロファイル；（Ｂ）２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０、ベースライン（ｉｌｃ）の拡大クロマトグラム；（Ｃ）５０℃で７日後の２ｍｇ／ｍｌ ｒｈＨＮＳ ２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．０の拡大クロマトグラム；（Ｄ）５０℃で７日後の２ｍｇ／ｍｌ クエン酸塩、ｐＨ７．０の１６分ピークおよび２６分二量体ピークの波長走査の重ね合わせ。 種々の緩衝液および種々のｐＨでのｒｈＨＮＳについてのｐＨ試験からの例示的還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である（Ａ〜Ｃ）。 種々の緩衝液および種々のｐＨでのｒｈＨＮＳについてのｐＨ試験からの例示的還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である（Ａ〜Ｃ）。 種々の緩衝液および種々のｐＨでのｒｈＨＮＳについてのｐＨ試験からの例示的非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である（Ａ〜Ｃ）。 種々の緩衝液および種々のｐＨでのｒｈＨＮＳについてのｐＨ試験からの例示的非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である（Ａ〜Ｃ）。 ＤＳＣにより決定されるクエン酸塩中の例示的ｐＨ依存性熱安定性を示す図である。クエン酸塩中のｒｈＨＮＳの最高融解温度は、ｐＨ６．０で９０℃であった。試験したｐＨ毎のｒｈＨＮＳの融解温度は７０℃を超える。 ＤＳＣにより決定されるリン酸塩中の例示的ｐＨ依存性熱安定性を示す図である。リン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、ｐＨ６〜７で最大の熱安定性を示した。試験したｐＨ毎のｒｈＨＮＳの融解温度は７０℃を超える。 ５０℃で７日後のイオン影響試験からのｒｈＨＮＳ製剤の例示的銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。１０分間沸騰させた試料を使用してゲルを流した（Ａ〜Ｂ）。 例示的ｒｈＨＮＳ溶解度試験を示す図である。（Ａ）ｐＨのｒｈＨＮＳ溶解度への影響；（Ｂ）塩濃度のｒｈＨＮＳ溶解度への影響。ｐＨおよび塩化ナトリウムの増加は、ｒｈＨＮＳ溶解度を増加させるように見える。 ＡＵＣを使用した、ｒｈＨＮＳの天然状態への塩の影響の例示的試験を示す図である。（Ａ）１４５ｍＭ塩の影響；（Ｂ）３００ｍＭ塩の影響。 凍結乾燥ｒｈＨＮＳ製剤のケーク外観へのスクロース濃度および凍結乾燥装置の影響の例示的試験を示す図である。（Ａ）ＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥装置；上のパネル、１％スクロース；下のパネル、１．５％スクロース；（Ｂ）１．５％スクロース；上のパネル、ＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥装置；下のパネル、ＬｙｏＳｔａｒ凍結乾燥装置。 凍結乾燥ｒｈＨＮＳ製剤のケーク外観へのスクロース濃度および凍結乾燥装置の影響の例示的試験を示す図である。（Ａ）ＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥装置；上のパネル、１％スクロース；下のパネル、１．５％スクロース；（Ｂ）１．５％スクロース；上のパネル、ＶｉｒＴｉｓ凍結乾燥装置；下のパネル、ＬｙｏＳｔａｒ凍結乾燥装置。 凍結乾燥ｒｈＨＮＳ試料についてのＭｉｃｒｏ−Ｆｌｏｗ Ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＦＩ）による例示的粒子画像を示す図である。 ０．２２μｍ濾過後の１．５％スクロースを含む凍結乾燥前ｒｈＨＮＳ試料についてのＭＦＩにより検出される粒子へのポリソルベート２０の影響の試験の例示的画像を示す図である。 ６ヶ月の用量投与後の１．５、４．５および８．３ｍｇ用量での時間の一関数としてのｒｈＨＮＳのＣＳＦ濃度を示す例示的結果を示す図である。 サルにおける１．５、４．５および８．３ｍｇ用量のＩＴ投与の６ヵ月後のＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体濃度を示す例示的結果を詳細に示す図である。データは、雌雄を併合して示されている。 ６ヶ月の用量投与後のサルにおける１．５、４．５および８．３ｍｇ用量のＩＴ投与の６ヵ月後のＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体を示す例示的結果を詳細に示す図である。データは、雌雄合わせて示されている。８．３ｍｇのｒｈＨＮＳでの後ＩＴ用量投与６での２つの最高濃度（３２，２０５ｎｇ／ｍＬおよび１５，４６７ｎｇ／ｍＬ）は、ＣＳＦ試料が前用量投与６に採取されなかったため、プロットから除外された。 ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された脳の髄膜および実質からの組織切片の例示的代表的画像を示す図である。図１３Ａは、ＤＣサルにおけるＩＴカテーテルに限局的な好中球浸潤物の低出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｂは、高用量（８．３ｍｇ／用量投与）サルの髄膜における好酸性浸潤物の高出力図を示す例示的結果を表す；浸潤物の全体的重症度は、中用量（４．５ｍｇ／用量投与）群と同様であった（示されていない）。図１３Ｃは、血管周囲空隙（脳実質）中に好酸球を示す低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルの高出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｄは、血管周囲空隙および隣接実質組織中に好酸球を示す低用量サル（１．５ｍｇ／用量投与）を示す例示的結果を表す。図１３Ｅは、低用量群動物の脊髄実質中の好酸球（矢印で示す）を示す例示的結果を表す；当該領域中のニューロンは正常である。図１３Ｆは、低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルにおける好酸球および小グリア細胞症の領域（矢印は好酸球を示す；矩形は、小グリア細胞症の領域を示す）を示す例示的結果を表す。当該領域にいくつかの大型ニューロンが認められるが、これらはすべて正常である。スケールバー：２００ｕｍ。 ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された脳の髄膜および実質からの組織切片の例示的代表的画像を示す図である。図１３Ａは、ＤＣサルにおけるＩＴカテーテルに限局的な好中球浸潤物の低出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｂは、高用量（８．３ｍｇ／用量投与）サルの髄膜における好酸性浸潤物の高出力図を示す例示的結果を表す；浸潤物の全体的重症度は、中用量（４．５ｍｇ／用量投与）群と同様であった（示されていない）。図１３Ｃは、血管周囲空隙（脳実質）中に好酸球を示す低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルの高出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｄは、血管周囲空隙および隣接実質組織中に好酸球を示す低用量サル（１．５ｍｇ／用量投与）を示す例示的結果を表す。図１３Ｅは、低用量群動物の脊髄実質中の好酸球（矢印で示す）を示す例示的結果を表す；当該領域中のニューロンは正常である。図１３Ｆは、低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルにおける好酸球および小グリア細胞症の領域（矢印は好酸球を示す；矩形は、小グリア細胞症の領域を示す）を示す例示的結果を表す。当該領域にいくつかの大型ニューロンが認められるが、これらはすべて正常である。スケールバー：２００ｕｍ。 ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された脳の髄膜および実質からの組織切片の例示的代表的画像を示す図である。図１３Ａは、ＤＣサルにおけるＩＴカテーテルに限局的な好中球浸潤物の低出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｂは、高用量（８．３ｍｇ／用量投与）サルの髄膜における好酸性浸潤物の高出力図を示す例示的結果を表す；浸潤物の全体的重症度は、中用量（４．５ｍｇ／用量投与）群と同様であった（示されていない）。図１３Ｃは、血管周囲空隙（脳実質）中に好酸球を示す低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルの高出力図を示す例示的結果を表す。図１３Ｄは、血管周囲空隙および隣接実質組織中に好酸球を示す低用量サル（１．５ｍｇ／用量投与）を示す例示的結果を表す。図１３Ｅは、低用量群動物の脊髄実質中の好酸球（矢印で示す）を示す例示的結果を表す；当該領域中のニューロンは正常である。図１３Ｆは、低用量（１．５ｍｇ／用量投与）サルにおける好酸球および小グリア細胞症の領域（矢印は好酸球を示す；矩形は、小グリア細胞症の領域を示す）を示す例示的結果を表す。当該領域にいくつかの大型ニューロンが認められるが、これらはすべて正常である。スケールバー：２００ｕｍ。 サル脊髄および脳におけるｒｈＨＮＳ酵素活性を示す例示的結果を示す図である。図１４Ａおよび１４Ｂは、（Ａ）雄および（Ｂ）雌サルの脊髄における活性を示す例示的結果を表す。切片−３＝腰椎、切片３、６＝胸椎および切片９＝頚椎；０＝カテーテル先端。図１４Ｃおよび１４Ｄは、（Ｃ）雄および（Ｄ）雌サルの脳におけるｒｈＨＮＳ活性を示す例示的結果を表す。切片は、頭側から尾側に向けて番号付けされている（３〜１５）。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。ＤＣ：デバイス対照。データは、ｎ＝４匹のサル／処置群に関する平均±ＳＥＭを表す。 サル脊髄および脳におけるｒｈＨＮＳ酵素活性を示す例示的結果を示す図である。図１４Ａおよび１４Ｂは、（Ａ）雄および（Ｂ）雌サルの脊髄における活性を示す例示的結果を表す。切片−３＝腰椎、切片３、６＝胸椎および切片９＝頚椎；０＝カテーテル先端。図１４Ｃおよび１４Ｄは、（Ｃ）雄および（Ｄ）雌サルの脳におけるｒｈＨＮＳ活性を示す例示的結果を表す。切片は、頭側から尾側に向けて番号付けされている（３〜１５）。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。ＤＣ：デバイス対照。データは、ｎ＝４匹のサル／処置群に関する平均±ＳＥＭを表す。 サル脳および肝臓における酵素活性を示す例示的結果を表す図である。図１５Ａは、高用量（８．３ｍｇ／用量投与）群サルにおけるｒｈＨＮＳ活性分布を示す例示的結果を表す。内因性レベル（ＤＣ群）と比較した場合の脳の表面、深部および極深部（脳室周囲）域における倍率変化が示されている。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。データは、ｎ＝６匹のサル（雌雄）、脳切片６および９に関する平均±ＳＥＭを表す。２匹のサルに関するデータは含まれていない：剖検時に、カテーテルが特許品であることは判明しなかった。図１５Ｂは、サル肝臓におけるｒｈＨＮＳ活性を示す。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。ＤＣ：デバイス対照。Ｒｅｃ：回復。データは、ｎ＝４匹のサル／処置群に関する平均±ＳＥＭを表すが、但し、低用量（４．５ｍｇ／用量投与）雌群（ｎ＝３）は除く。 サル脳および肝臓における酵素活性を示す例示的結果を表す図である。図１５Ａは、高用量（８．３ｍｇ／用量投与）群サルにおけるｒｈＨＮＳ活性分布を示す例示的結果を表す。内因性レベル（ＤＣ群）と比較した場合の脳の表面、深部および極深部（脳室周囲）域における倍率変化が示されている。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。データは、ｎ＝６匹のサル（雌雄）、脳切片６および９に関する平均±ＳＥＭを表す。２匹のサルに関するデータは含まれていない：剖検時に、カテーテルが特許品であることは判明しなかった。図１５Ｂは、サル肝臓におけるｒｈＨＮＳ活性を示す。組織試料はすべて、最終用量投与の約２４時間後に、または回復動物に関する最終用量投与の４週間後に収集された。ＤＣ：デバイス対照。Ｒｅｃ：回復。データは、ｎ＝４匹のサル／処置群に関する平均±ＳＥＭを表すが、但し、低用量（４．５ｍｇ／用量投与）雌群（ｎ＝３）は除く。 若年カニクイザル小脳：３ヶ月暫定同齢集団におけるｒｈＨＮＳ局在化を示す例示的結果を示す図である。図１６Ａは、ｒｈＨＮＳ免疫染色に関して陰性のビヒクル対照動物（０ｍｇ／用量投与）の小脳を示す例示的結果を表す；倍率２０倍。図１６Ｂは、分子層に限定される最小陽性染色を示す低用量（１．５ｍｇ／用量投与）動物の小脳を示す例示的結果を表す；倍率２０倍。図１６Ｃは、外側顆粒層における最小染色を示す中用量（４．５ｍｇ／用量投与）動物の小脳を示す例示的結果を表す；倍率２０倍。図１６Ｄは、分子層、外側顆粒層およびプルキンエ細胞を含めた高用量（８．３ｍｇ／用量投与）動物の小脳における中等度の染色を示す例示的結果を表す；倍率２０倍。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の最初の２０分において経時的にプロットした頭部領域におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした脳におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした脳領域におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした頭部領域におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした近位脊椎におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした脊椎中央部におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした遠位脊椎におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした肝臓におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットした脳におけるｒｈＨＮＳの濃度の例示的試験を示す図である。個別（上）および平均±ＳＤ（下）。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの肝臓濃度の例示的試験を示す図である。個別（上）および平均±ＳＤ（下）。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの腎臓濃度の例示的試験を示す図である。個別（上）および平均±ＳＤ（下）。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの心臓濃度の例示的試験を示す図である。個別（上）および平均±ＳＤ（下）。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの皮膚濃度の例示的試験を示す図である。個別（上）および平均±ＳＤ（下）。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの脳濃度の例示的試験（上）、ならびに脳における非区画ＰＫパラメータの比較（下）を示す図である。 １および１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ用量投与後の経時的にプロットしたｒｈＨＮＳの肝臓濃度の例示的試験（上）、ならびに肝臓における非区画ＰＫパラメータの比較（下）を示す図である。 例示的髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す図である。 例示的ＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）低プロフィール髄腔内埋込み可能アクセス系を示す図である。 例示的髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す図である。 ＣＮＳ酵素補充療法（ＥＲＴ）のための在宅投与を可能にする、髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）を示す図である。 安全機構を備える髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）の例示的図を説明する図である。 ＩＤＤＤを配置することができる患者の体内の例示的位置を示す図である。 髄腔内薬剤送達装置（ＩＤＤＤ）の種々の部品を示す図である。 ＩＴ−腰椎注射のための患者の体内の例示的挿入位置を示す図である。
定義
本発明をより容易に理解するために、一定の用語を先ず以下で定義する。以下の用語および他の用語に関する付加的な定義は、本明細書全体を通して記述されている。
「およそまたは約」は、本明細書中で用いる場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の当該値に適用される場合、記述参照値と類似する値を指す。ある実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別記しない限り、あるいはそうでない場合は本文から明らかな記述参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下内にある一連の値を指す（このような数が考え得る値の１００％を超える場合を除く）。
「改善」：本明細書中で用いる場合、「改善」という用語は、ある状態の防止、低減または緩和、あるいは対象の状態の改善を意味する。改善は、疾患状態の完全回復または完全防止を包含するが、しかし必要とするわけではない。いくつかの実施形態では、改善は、関連疾患組織中に欠けている漸増レベルの関連タンパク質またはその活性を包含する。
「生物学的に活性な」：本明細書中で用いる場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物学的系において、特に生物体において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物体に投与された場合、その生物体に及ぼす生物学的作用を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的には、「生物学的活性」部分として言及される。
「バルク剤」：本明細書中で用いる場合、「バルク剤」という用語は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する（例えば、開口構造を保持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの生産を促す）化合物を指す。バルク剤の例としては、マンニトール、グリシン、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、スクロース、トレハロース、ポリエチレングリコールおよびデキストランが挙げられる。
「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」：本明細書中で用いる場合、「陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を定められているゴルジ装置における酸加水分解酵素上のマンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）タグを結合する細胞受容体を指す。マンノース−６−ホスフェートのほかに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩも結合する。ＣＩ−ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても既知である。これらの用語およびその略語は、本明細書中で互換的に用いられる。
「同時免疫抑制薬療法」：本明細書中で用いる場合、「同時免疫抑制薬療法」という用語は、前処置、前状態調節として、またはある処置方法と平行して用いられる任意の免疫抑制薬両方を包含する。
「希釈剤」：本明細書中で用いる場合、「希釈剤」という用語は、再構成処方物の調整のために有用な製薬上許容可能な（例えば、ヒトへの投与のために安全且つ非毒性の）希釈物質を指す。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（後、リン酸塩緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩溶液、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
「剤形」：本明細書中で用いる場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、処置されるべき患者のための治療用タンパク質の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるよう算定された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、信頼できる医学的判断の範囲内で、担当医により決定される、と理解される。
「酵素補充療法（ＥＲＴ）」：本明細書中で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、失われている酵素を提供することにより酵素欠乏症を矯正する任意の治療戦略を指す。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、髄腔内腔内投与により提供される。いくつかの実施形態では、失われている酵素は、血流中への注入により提供される。一旦投与されると、酵素は細胞に取り込まれ、リソソームに運ばれて、そこで酵素は、酵素欠乏のためにリソソーム中に蓄積された物質を除去するよう作用する。典型的には、有効であるべきリソソーム酵素補充療法に関して、治療用酵素は、貯蔵欠陥が顕在性である標的組織中の適切な細胞中のリソソームに送達される。
「改善する、増大するまたは低減する」：本明細書中で用いる場合、「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語、あるいは文法的等価物は、基線測定値、例えば本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される処置の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値と比較した場合の値を示す。「対照個体」は、処置されている個体と同一型のリソソーム貯蔵疾患に罹患している個体であって、処置されている個体とほぼ同年齢である（処置個体と対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。
「個体、対象、患者」：本明細書中で用いる場合、「対象」、「個体」または「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象を指す。処置されている個体（「患者」または「対象」としても言及される）は、疾患に罹患している個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。
「髄腔内投与」：本明細書中で用いる場合、「髄腔内投与」または「髄腔内注射」という用語は、脊柱管（脊髄周囲の髄腔内空隙）への注射を指す。種々の技法、例えば穿頭孔あるいは槽または腰椎穿刺等を通した外側脳室注射が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、腰椎域または領域を介したＩＴ投与または送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本明細書中で用いる場合、「腰部領域」または「腰椎域」という用語は、第三および第四腰椎（背中下部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。
「リンカー」：本明細書中で用いる場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質中の特定位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般的に、柔軟性であるよう、または２つのタンパク質部分の間の構造物、例えばらせんを間に置くよう意図される。リンカーは、スペーサーとしても言及される。
「リオプロテクタント」：本明細書中で用いる場合、「リオプロテクタント」という用語は、凍結乾燥およびその後の貯蔵時に、タンパク質または他の物質の化学的および／または物理的不安定性を防止するかまたは低減する分子を指す。リオプロテクタントの例としては、糖、例えばスクロースまたはトレハロース；アミノ酸、例えばグルタミン酸またはヒスチジン一ナトリウム；メチルアミン、例えばベタイン；リオトロピック塩、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ならびにその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、リオプロテクタントは、非還元糖、例えばトレハロースまたはスクロースである。
「リソソーム酵素」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を還元し得るか、あるいは１つ以上のリソソーム貯蔵疾患症候を救出するかまたは改善し得る任意の酵素を指す。本発明に適しているリソソーム酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成され得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。リソソーム酵素の例は、表１に列挙されている。
「リソソーム酵素欠乏症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム酵素欠乏症」は、高分子物質（例えば酵素基質）をリソソーム中でペプチド、アミノ酸、単糖、拡散および脂肪酸に分解するために必要とされる酵素のうちの少なくとも１つにおける欠乏に起因する遺伝子障害の一群を指す。その結果、リソソーム酵素欠乏症に罹患している個体は、種々の組織（例えば、ＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁およびその他の器官）中に物質を蓄積している。
「リソソーム蓄積症」：本明細書中で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、天然高分子物質を退社するために必要な１つ以上のリソソーム酵素の欠乏に起因する任意の疾患を指す。これらの疾患は、典型的には、リソソーム中に非分解分子の蓄積を生じて、貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも呼ばれる）の数を増大する。これらの疾患および種々の例は、以下で詳細に記載される。
「ポリペプチド」：本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」は、概して、ペプチド結合により互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の紐である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも１つのペプチド結合により他のものと結合される少なくとも３〜５つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、時として、「非天然」アミノ酸、あるいはそれでも任意にポリペプチド鎖に一体化し得る他の実体を包含する、と当業者は理解する。
「補充酵素」：本明細書中で用いる場合、「補充酵素」という用語は、処置されるべき疾患において欠乏しているかまたは失われている酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、「補充酵素」という用語は、処置されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素に少なくとも一部は取って替わるよう作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素は、哺乳動物リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。本発明に適している補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を包含し、組換えおよび合成方法を用いて生成し得るし、あるいは天然供給源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化または天然酵素であり得る。
「可溶性の」：本明細書中で用いる場合、「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成する治療薬の能力を指す。いくつかの実施形態では、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう処方される。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する薬学的組成物中で可溶性である。非経口投与薬のためには等張溶液が一般的に好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および／または酵素に関する適切な溶解度を制限し得る、と理解される。わずかに高張性の溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に２％までのスクロース）は、サルにおいて良好に耐容されることが実証されている。例えば、最も一般に認可されたＣＮＳボーラス処方物組成物は、生理食塩水（水中１５０ｍＭのＮａＣｌ）である。
「安定性」：本明細書中で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を保持する治療薬（例えば、組換え酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間に亘って査定され得る（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）。概して、本明細書中に記載される薬学的組成物は、それらが、一緒に処方される１つ以上の治療薬（例えば、組換えタンパク質）を安定化し、あるいはそれらの分解を遅くするかまたは防止し得るよう、処方されている。一処方物の状況では、安定処方物は、貯蔵時、および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）中に、その中の治療薬が本質的にその物理的および／または化学的完全性および生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成および電荷プロフィールの移動により測定され得る。
「対象」：本明細書中で用いる場合、「対象」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施形態では、対象は、成人、若者または幼児である。薬学的組成物の投与、および／または子宮内治療を必要とする対象方法の実施も、本発明により意図される。
「実質的相同性」：「実質的相同」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に相同な残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であり得る。代替的には、相同残基は、ほぼ同様の構造的および／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、あるアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するとして分類される。一アミノ酸の、別の同一型のアミノ酸への置換は、しばしば、「相同」置換とみなされ得る。
当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３−４１０， １９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， “Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ， １９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載されている。相同配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。
「実質的同一性」：「実質的同一性」という語句は、アミノ酸または核酸配列間の比較に言及するために本明細書中で用いられる。当業者に理解されるように、２つの配列は、それらが、対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般的に「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、種々のアルゴリズム、例えば市販のコンピュータープログラム、例えばヌクレオチド配列に関するＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰ、ギャップ化ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて比較され得る。このようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３−４１０， １９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ， １９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載されている。同一配列を同定することのほかに、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指示を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が関連残基鎖上で同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連鎖は完全配列である。いくつかの実施形態では、関連鎖は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００残基またはそれ以上の残基である。
「合成ＣＳＦ」：本明細書中で用いる場合、「合成ＣＳＦ」という用語は、脳脊髄液と一致するｐＨ、電解質組成、グルコース含量および浸透圧を有する溶液を指す。合成ＣＳＦは、人工ＣＳＦとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、合成ＣＳＦはエリオットＢ溶液である。
「ＣＮＳ送達に適している」：本明細書中で用いる場合、「ＣＮＳ送達に適している」または「髄腔内送達に適している」という語句は、それが本発明の薬学的組成物に関する場合、一般的に、このような組成物の安定性、耐容性および溶解度特性、ならびに標的送達部位（例えば、ＣＳＦまたは脳）にその中に含有される有効量の治療薬を送達するこのような組成物の能力を指す。
「標的組織」：本明細書中で用いる場合、「標的組織」は、治療を必要とする対象されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠乏リソソーム酵素が正常に発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹患し易い患者において、検出可能な、または以上に高量の酵素基質が存在する、例えば当該組織の細胞リソソーム中に貯蔵される組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織を包含する。いくつかの実施形態では、標的組織は、欠乏リソソーム酵素が高レベルで正常に発現される組織を包含する。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。
「治療的部分」：本明細書中で用いる場合、「治療的部分」という用語は、分子の治療作用を果たす分子の一部分を指す。いくつかの実施形態では、治療的部分は、治療活性を有するポリペプチドである。
「治療的有効量」：本明細書中で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な合理的利益／危険比で、処置対象に治療効果を付与する治療用タンパク質（例えば、補充酵素）の量を指す。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象は、作用の指示を与えるかまたは作用を感じる）であり得る。特に、「治療的有効量」は、例えば疾患に伴う症候を改善し、疾患の開始もしくは進行を防止するかまたは遅延し、および／または疾患の症候の重症度または頻度を下げることにより、所望の疾患または症状を処置し、改善し、または防止するために、あるいは検出可能な治療的または予防的作用を示すために有効な治療用タンパク質または組成物の量を指す。治療的有効量は、一般に、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで投与される。任意の特定治療用タンパク質に関して、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者に関する具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば処置されている障害、および障害の重症度；用いられる具体的な薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝の速度；処置の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような同様の因子によって決まる。
「耐容可能な」：本明細書中で用いる場合、「耐容可能な」および「耐容性」という用語は、このような組成物が投与される対象において悪反応を引き出さないか、代替的には、このような組成物が投与される対象において重篤な悪反応を引き出さない本発明の薬学的組成物の能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、このような組成物が投与される対象により良好に耐容される。
「処置」：本明細書中で用いる場合、「処置」（さらにまた「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害および／または症状（例えば、ハンター症候群、サンフィリッポＡ症候群、サンフィリッポＢ症候群）の１つ以上の症候または特徴を、部分的にまたは完全に、緩和し、改善し、軽減し、抑制し、その開始を遅延し、その重症度を低減し、および／またはその発生率を低減する治療用タンパク質（例えば、リソソーム酵素）の任意の投与を指す。このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の徴候を示さない対象の、および／または疾患、障害および／または症状の早期徴候のみを示す対象のものであり得る。代替的にまたは付加的に、このような処置は、関連疾患、障害および／または症状の１つ以上の確立された徴候を示す対象のものであり得る。
本発明は、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の有効な直接送達のための改良された方法および組成物を提供する。上記のように、本発明は、リソソーム蓄積症（例えば、サンフィリッポＡ症候群）に関する補充酵素（例えば、ＨＮＳタンパク質）が、被験者における実質的副作用を誘導することなく、高濃度で治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接導入され得る、という予期せぬ発見に基づいている。さらに意外なことに、合成ＣＳＦを用いることなく、補充酵素が単なる生理食塩水または緩衝液ベースの処方物中で送達され得る、ということを本発明人等は見出した。さらに予期せぬことに、本発明による髄腔内送達は、対象における実質的副作用、例えば重症免疫応答を生じない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、同時免疫抑制薬療法の非存在下で（例えば、前処置または前状態調節による免疫寛容の誘導なしで）、用いられ得る。
いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、種々の脳組織を通した効率的拡散を可能にして、表面、浅在および／または深部脳領域における種々の標的脳組織における補充酵素の効果的送達を生じる。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、末梢循環に進入するのに十分な量の補充酵素を生じた。その結果、いくつかの場合には、本発明による髄腔内送達は、肝臓、心臓、脾臓および腎臓のような末梢組織における補充酵素の送達を生じた。この発見は予期せぬものであり、典型的には定期的髄腔内投与および静脈内投与を必要とするＣＮＳおよび末梢構成成分の両方を有するリソソーム蓄積症の処置のために特に有用であり得る。本発明による髄腔内送達は、末梢症候を処置するに際して治療効果を危うくすることなく、静脈内注射の用量投与および／または頻度低減を可能にし得る、ということが意図される。
本発明は、種々の脳標的組織への補充酵素の効率的且つ便利な送達を可能にして、ＣＮＳ指標を有するリソソーム蓄積症の有効な処置を生じる種々の予期せぬ且つ有益な特徴を提供する。
本発明の種々の態様は、以下の節で詳細に記載される。節の記載内容は、本発明を限定するものではない。各説は、本発明の任意の態様に適用し得る。この出願において、「または」は、別記しない限り「および／または」を意味する。
補充酵素
ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明により提供される発明の方法および組成物は、サンフィリッポＡを治療するためにヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質をＣＮＳに送達するために使用される。適当なＨＮＳタンパク質は、天然ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質活性に代わるあるいはＨＮＳ欠乏に関連する１種もしくは複数の表現型または症状を救うことができる任意の分子または分子の一部であり得る。いくつかの実施形態では、本発明に適した補充酵素は、Ｎ末端およびＣ末端、ならびに成熟ヒトＨＮＳタンパク質と実質的に類似または同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
典型的には、ヒトＨＮＳは、成熟型にプロセシングされる前駆体分子として産生される。このプロセスは、一般的に、２０個のアミノ酸シグナルペプチドを除去することにより起こる。典型的には、前駆体型は、５０２個のアミノ酸を含む全長前駆体または全長ＨＮＳタンパク質とも呼ばれる。Ｎ末端の２０個のアミノ酸を切断することにより、長さ４８２個のアミノ酸の成熟型が生じる。したがって、Ｎ末端の２０個のアミノ酸は、一般的に、ＨＮＳタンパク質活性に必要でないと考えられる。典型的な野生型もしくは天然ヒトＨＮＳタンパク質の成熟型（配列番号１）および全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、適当な治療的部分は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＨＮＳタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然ＨＮＳタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１個または複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む修飾された成熟ヒトＨＮＳタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、成熟ヒトＨＮＳタンパク質の断片または部分を含む。
あるいは、本発明に適した治療的部分は、全長ＨＮＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、適当な治療的部分は、全長ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、全長ヒトＨＮＳタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＨＮＳタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然全長ＨＮＳタンパク質（例えば、配列番号２）と比較して、１個または複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む修飾された全長ヒトＨＮＳタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、全長ヒトＨＮＳタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適した治療的部分は、全長ヒトＨＮＳタンパク質の断片または部分を含む。本明細書で使用する場合、全長ＨＮＳタンパク質は、典型的にはシグナルペプチド配列を含む。
他のリソソーム蓄積症および補充酵素
本発明による発明の方法および組成物は、他のリソソーム蓄積症、特にＣＮＳ病因および／または症候を有するリソソーム蓄積症、例えば、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病 Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、グロボイド細胞白質ジストロフィー症、クラッベ病、糖原病 ＩＩ型、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシス Ｉ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス ＩＩ型、サンドホッフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノーシドーシス Ｉ／ＩＩ型、β−マンノーシドーシス、異染性白質ジストロフィー症、ムコリピドーシス Ｉ型、シアリドーシス Ｉ／ＩＩ型、ムコリピドーシス ＩＩ／ＩＩＩ型、ムコリピドーシス ＩＶ型、Ｉ−細胞病、ムコリピドーシス ＩＩＩＣ型、偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖症 Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症 ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型）、ムコ多糖症 ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症 ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症 ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症 ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症 ＩＶＢ型、ムコ多糖症 ＶＩ型、ムコ多糖症 ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症 ＩＸ型、多重スルファターゼ欠乏症、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、ＣＬＮ１バッテン病、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病 Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病 Ｃ１型、ニーマン・ピック病 Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病 Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病およびシアル酸蓄積症（これらに限定されない）を治療するために用いられ得る。
リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症候発現および分子生物学知見は、Ｓｃｒｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄ．， Ｖｏｌ． ＩＩ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， （１９９５）に詳述されている。したがって、上記疾患における酵素欠乏は当業者に既知であり、これらのいくつかは、以下の表に例示されている：
本発明の方法は、種々の他の補充酵素を送達するために用いられ得る。本明細書中で用いる場合、本発明に適した補充酵素は、治療されるべきリソソーム蓄積症において欠乏しているかまたは失われているリソソーム酵素の少なくとも一部の活性に取って替わるよう作用し得る任意の酵素を包含し得る。いくつかの実施形態では、補充酵素は、リソソーム中の蓄積物質を低減し得るし、あるいは１つ以上のリソソーム蓄積症症候を救出するかまたは改善し得る。
いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、治療されるべきリソソーム蓄積症に関連づけられることが既知の任意のリソソーム酵素であり得る。いくつかの実施形態では、適切な補充酵素は、上記の表２に列挙された酵素から選択される酵素である。
いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、野生型または天然配列と実質的相同性または同一性を有する（例えば、野生型または天然配列との少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の配列同一性を有する）修飾配列を有し得る。
本発明に適している補充酵素は、任意の利用可能な手段により産生され得る。例えば、補充酵素は、補充酵素コード核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞系を利用することにより、組換え的に産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、内因性遺伝子を活性化することにより産生され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、化学合成により、部分的にまたは完全に、調製され得る。代替的または付加的には、補充酵素は、天然供給源からも精製され得る。
酵素が組換え的に産生される場合、任意の発現系が用いられ得る。２〜３ではあるが例を挙げると、既知の発現系としては、例えば卵細胞、バキュロウイルス、植物細胞、酵母または哺乳動物細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明に適している酵素は、哺乳動物中で産生される。本発明にしたがって用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例としては、以下のものが挙げられる：
ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ， Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または２９３細胞（懸濁液培養中での増殖のためにサブクローン化）、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９，１９７７）；ヒト繊維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ハムスター幼仔腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６， １９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１， １９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ３８３：４４−６８， １９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＨＯ細胞から産生される補充酵素を送達するために用いられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて送達される補充酵素は、細胞取込みおよび／またはリソソームターゲッティングを助長するために脳細胞の表面の受容体と結合する部分を含有する。例えば、このような受容体は、マンノース−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）残基を結合する陽イオン非依存性マンノース−６−ホスフェート受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。さらに、ＣＩ−ＭＰＲは、他のタンパク質、例えばＩＧＦ−ＩＩとも結合する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、タンパク質の表面にＭ６Ｐ残基を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＣＩ−ＭＰＲに対するより高い結合親和性を有するビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、酵素当たりおよそ少なくとも２０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖のほぼ平均まで含有する。他の実施形態では、適切な酵素は、酵素当たり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビス−ホスホリル化オリゴ糖を含有し得る。このようなビス−ホスホリル化オリゴ糖は酵素上に天然に存在し得るが、酵素はこのようなオリゴ糖を保有するよう修飾され得る、ということに留意すべきである。例えば、適切な補充酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからリソソーム酵素上のα−１，２−連結マンノースの６’位置へのＮ−アセチルグルコサミン−Ｌ−ホスフェートの移動を触媒し得るある種の酵素により修飾され得る。このような酵素を産生し、使用するための方法および組成物は、例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ等により米国特許第６，５３７，７８５号および米国特許第６，５３４，３００号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明に用いるための補充酵素は、脳細胞の表面の受容体と結合し得るリソソームターゲッティング部分と共役されるかまたは融合され得る。適切なリソソームターゲッティング部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、ならびにその変異体、相同体または断片（例えば、野生型成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一な配列を有するペプチド）であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明に適している補充酵素は、ＢＢＢを横断し、ＣＮＳ中にこのような作用物質を送達するかまたは輸送するのを増強するよう修飾されていない。
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ターゲッティング部分（例えば、リソソームターゲッティング配列）および／または膜貫通ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング配列および／または膜貫通ペプチドは、治療的部分の固有の部分である（例えば、化学結合を介して、融合タンパク質を介して）。いくつかの実施形態では、ターゲッティング配列は、マンノース−６−リン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング配列は、ＩＧＦ−Ｉ部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング配列は、ＩＧＦ−ＩＩ部分を含む。
製剤
いくつかの実施形態では、所望の酵素は、髄腔内送達のために安定な製剤中で送達される。本発明のある実施形態は、少なくとも一部は、本明細書中に開示される種々の製剤が、ＣＮＳの標的化組織、細胞および／または細胞小器官への１つ以上の治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）の有効な送達および分布を促す、という発見に基づいている。特に、本明細書中に記載される製剤は、高濃度の治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）を可溶化し得るし、ＣＮＳ構成成分および／または病因を有する疾患（例えば、サンフィリッポＡ症候群）の治療のために対象のＣＮＳにこのような治療薬を送達するのに適している。本明細書中に記載される組成物は、それを必要とする対象のＣＮＳに（例えば髄腔内に）投与される場合、安定性改善および耐容性改善によりさらに特性化される。
本発明の前に、伝統的非緩衝化等張生理食塩水およびエリオットのＢ溶液（人工ＣＳＦ）が、典型的には髄腔内送達のために用いられた。エリオットのＢ溶液に対するＣＳＦの組成を表す比較は、以下の表３に含まれている。表３に示されているように、エリオットＢ溶液の濃度は、ＣＳＦの濃度と密接に類似している。しかしながら、エリオットのＢ溶液は、極度に低い緩衝剤濃度を含有し、したがって、特に長期間に亘って（例えば、貯蔵状態の間）、治療薬（例えばタンパク質）を安定化するために必要とされる適切な緩衝能力を提供し得ない。さらに、エリオットのＢ溶液は、いくつかの治療薬、特にタンパク質または酵素を送達するよう意図された製剤と非相溶性であり得るある種の塩を含有する。例えば、エリオットのＢ溶液中に存在するカルシウム塩は、タンパク質沈降を媒介し、それにより製剤の安定性を低減し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明によるＣＮＳ送達に適した製剤は、合成または人工ＣＳＦではない。
いくつかの実施形態では、ＣＮＳ送達のための製剤は、それらが、それとともに製剤化される治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）を安定化し、あるいはその分解を遅くするかまたは防止し得るよう、製剤化されている。本明細書中で用いる場合、「安定な」という用語は、長期間に亘ってその治療効力（例えば、その意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のうちのすべてまたは大多数）を保持する治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）の能力を指す。治療薬の安定性、ならびにこのような治療薬の安定性を保持する薬学的組成物の能力は、長期間（例えば、好ましくは少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）に亘って査定され得る。製剤の状況では、安定な製剤は、貯蔵時および加工処理（例えば、凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥）の間、その中の治療薬が本質的にはその物理的および／または化学的完全性ならびに生物学的活性を保持するものである。タンパク質安定性に関しては、それは、高分子量（ＨＭＷ）集合体の形成、酵素活性の損失、ペプチド断片の生成、および電荷プロフィールの移動により測定され得る。
治療薬の安定性は、特別な重要性を有する。治療薬の安定性は、長期間に亘る治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性に関してさらに査定され得る。例えば、所定の時点での安定性は、早期時点（例えば、処方０日目）での安定性に対して、あるいは非製剤化治療薬に対して比較され得る。この比較の結果は、パーセンテージとして表される。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、長期間に亘って（例えば、室温で、または加速貯蔵条件下で、少なくとも６〜１２ヶ月間に亘って測定）、治療薬の生物学的活性または物理化学的完全性の少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％または少なくとも５０％を保持する。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、所望の酵素）は、本発明の製剤中で可溶性である。「可溶性の」という用語は、均質溶液を生成するこのような治療薬の能力を指す。好ましくは、それが投与されそれが標的作用部位（例えば、脳の細胞および組織）に輸送される溶液中の治療薬の溶解度は、標的作用部位への治療的有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの因子が、治療薬の溶解度に影響を及ぼし得る。例えば、タンパク質溶解度に影響し得る関連因子としては、イオン強度、アミノ酸配列および他の同時可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、カルシウム塩がこのような組成物から除去されるよう製剤化される。
水性、凍結乾燥前、凍結乾燥または再構成型のいずれかの適当な製剤は、種々の濃度で対象となる治療薬を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌまたは約５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で対象となるタンパク質または治療薬を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明による製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌの濃度で治療剤を含み得る。
本発明の製剤は、水溶液または再構成凍結乾燥溶液のいずれかとしてのその耐容性を特徴とする。本明細書で使用する場合、用語「耐容可能な」および「耐容性」とは、本発明の医薬組成物が、このような組成物を投与する対象の有害反応を誘発しない、あるいはこのような組成物を投与する対象の重篤な有害反応を誘発しない能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、このような組成物を投与する対象がよく耐容性を示す。
多数の治療薬、特に本発明のタンパク質および酵素は、本発明の薬学的組成物中でそれらの溶解性および安定性を保持するために、制御されたｐＨおよび特定の賦形剤を要する。以下の表４は、本発明のタンパク質治療薬の溶解性および安定性を保持するとみなされるタンパク質製剤の典型的な例示的態様を確認するのに役立つ。
緩衝剤
製剤のｐＨは、水性製剤または凍結乾燥前製剤中の治療薬（例えば、酵素またはタンパク質）の溶解度を変えることができる追加の因子である。したがって、本発明の製剤は、好ましくは１種または複数の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、水性製剤は、約４．０〜８．０の間（例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．２、６．４、６．５、６．６、６．８、７．０、７．５または８．０）の前記組成物の最適ｐＨを維持するのに十分な量の緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約５．０〜７．５の間、約５．５〜７．０の間、約６．０〜７．０の間、約５．５〜６．０の間、約５．５〜６．５の間、約５．０〜６．０の間、約５．０〜６．５の間および約６．０〜７．５の間である。適当な緩衝剤には、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）および他の有機酸が含まれる。本発明の医薬組成物の緩衝剤濃度およびｐＨ範囲は、製剤の耐容性の制御または調整の因子である。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭの間、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間、または約１５ｍＭ〜約５０ｍＭの間、または約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの間、または約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、適当な緩衝剤は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭまたは１５０ｍＭの濃度で存在する。
張性
いくつかの実施形態では、水性、凍結乾燥前、凍結乾燥または再構成型のいずれかの製剤は、製剤を等張に保つ等張化剤を含む。典型的には、「等張」により、当該製剤が、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することが意味される。等張製剤は、一般的に、約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有するだろう。等張性は、例えば、蒸気圧または凝固点型浸透圧計を使用して測定することができる。代表的な等張化剤には、それだけに限らないが、グリシン、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウムおよびアルギニンが含まれる。いくつかの実施形態では、適当な等張化剤は、約０．０１〜５重量％（例えば、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０または５．０重量％）の濃度で水性および／または凍結乾燥前製剤中に存在し得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥用の製剤は、凍結乾燥前製剤または再構成製剤を等張に保つ等張化剤を含む。
一般的に非経口投与薬剤には等張溶液が好ましいが、等張溶液の使用は、いくつかの治療薬、特にいくつかのタンパク質および／または酵素の溶解度を変化させ得る。わずかに高張性の溶液（例えば、ｐＨ７．０の５ｍＭリン酸ナトリウム中最大１７５ｍＭまでの塩化ナトリウム）および糖含有溶液（例えば、ｐＨ７．０の５ｍＭリン酸ナトリウム中最大２％までのスクロース）は、耐容性が高いことが示された。最も一般的な認可されたＣＮＳボーラス製剤組成物は、生理食塩水（水中約１５０ｍＭ ＮａＣｌ）である。
安定化剤
いくつかの実施形態では、製剤は、タンパク質を保護するための安定化剤またはリオプロテクタントを含み得る。典型的には、適当な安定化剤は、糖、非還元糖および／またはアミノ酸である。代表的な糖には、それだけに限らないが、デキストラン、ラクトース、マンニトール、マンノース、ソルビトール、ラフィノース、スクロースおよびトレハロースが含まれる。代表的なアミノ酸には、それだけに限らないが、アルギニン、グリシンおよびメチオニンが含まれる。別の安定化剤には、塩化ナトリウム、ヒドロキシエチルデンプンおよびポリビニルピロリドンが含まれ得る。凍結乾燥製剤中の安定化剤の量は、一般的には製剤が等張であるような量である。しかしながら、高張再構成製剤も適当であり得る。さらに、安定化剤の量は、治療薬の許容できない量の分解／凝集が起こるほど低すぎてはならない。代表的な製剤中の安定化剤濃度は、約１ｍＭ〜約４００ｍＭ（例えば、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭおよび約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、あるいは０．１重量％〜１５重量％（例えば、１重量％〜１０重量％、５重量％〜１５重量％、５重量％〜１０重量％）に及び得る。いくつかの実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は約１：１である。他の実施形態では、安定化剤と治療薬の質量比は、約０．１：１、０．２：１、０．２５：１、０．４：１、０．５：１、１：１、２：１、２．６：１、３：１、４：１、５：１、１０：１または２０：１であり得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥に適した安定化剤はリオプロテクタントでもある。
いくつかの実施形態では、本発明に適した液体製剤は、非晶物質を含む。いくつかの実施形態では、本発明に適した液体製剤は、相当な量の非晶物質（例えば、スクロースベースの製剤）を含む。いくつかの実施形態では、本発明に適した液体製剤は、部分的に結晶性の／部分的に非晶質の物質を含む。
バルク剤
いくつかの実施形態では、凍結乾燥に適した製剤は、１種または複数のバルク剤をさらに含み得る。「バルク剤」とは、凍結乾燥混合物にかさを付加し、凍結乾燥ケークの物理的構造に寄与する化合物である。例えば、バルク剤は、凍結乾燥ケークの外観を改善することができる（例えば、本質的に均一な凍結乾燥ケーク）。適当なバルク剤には、それだけに限らないが、塩化ナトリウム、ラクトース、マンニトール、グリシン、スクロース、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが含まれる。バルク剤の代表的な濃度は、約１％〜約１０％（例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％および１０．０％）である。
界面活性剤
いくつかの実施形態では、製剤に界面活性剤を付加することが望ましい。界面活性剤の例としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタルニドプロピル−、パルミドプロピル−またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−または二ナトリウムメチルオフェイル−タウレート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８等）が挙げられる。典型的には、付加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を低減し、粒子の形成または泡立ちを最小限にするような量である。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％または０．００５〜０．０１％）の濃度で製剤中に存在し得る。特に、界面活性剤は、約０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％等の濃度で製剤中に存在し得る。あるいはまたはさらに、界面活性剤を凍結乾燥製剤、凍結乾燥前製剤および／または再構成製剤に添加することができる。
製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に記載されているものなどの他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を製剤（および／または凍結乾燥製剤および／または再構成製剤）に含ませてよい。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量および濃度でレシピエントに無毒性で、これらには、それだけに限らないが、別の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ならびに／あるいはナトリウムなどの塩形成対イオンが含まれる。
本発明による水性、凍結乾燥前、凍結乾燥または再構成型のいずれかの製剤は、品質分析、再構成時間（凍結乾燥された場合）、再構成の質（凍結乾燥された場合）、高分子量、水分およびガラス転移温度に基づいて査定され得る。典型的には、タンパク質の質および生成物分析は、例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換−ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回析（ＸＲＤ）、変調型示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、ネフェロメトリー、毛細管電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその組合せ（これらに限定されない）を含めた方法を用いる生成物分解率分析を包含する。いくつかの実施形態では、本発明による生成物の評価は、外観（液体またはケーク外観）を評価するステップを包含する。
一般的に、製剤（凍結乾燥化または水性）は、室温で長期間保存され得る。貯蔵温度は、典型的には、０℃〜４５℃（例えば、４℃、２０℃、２５℃、４５℃等）の範囲であり得る。製剤は、数ヶ月〜数年の間貯蔵され得る。貯蔵時間は、一般的に、２４ヶ月、１２ヶ月、６ヶ月、４．５ヶ月、３ヶ月、２ヶ月または１ヶ月である。製剤は、投与のために用いられる容器中に直接貯蔵されて、移送ステップを排除し得る。
製剤は、凍結乾燥容器（凍結乾燥される場合）中に直接貯蔵され得るが、これは、再構成容器としても機能して、移送ステップを排除し得る。代替的には、凍結乾燥物質製剤は、貯蔵のためにより小さい増分で測定され得る。貯蔵は、一般的に、タンパク質の分解を生じさせる環境、例えば日光、紫外線他の形態の電磁放射線、過剰な熱または寒冷、休息な熱ショック、ならびに機械的衝撃への曝露（これらに限定されない）を避けるべきである。
凍結乾燥
本発明による発明の方法は、任意の物質、特に治療薬を凍結乾燥するために利用することができる。典型的には、凍結乾燥前製剤は、適当な種々の賦形剤、あるいは凍結乾燥および貯蔵中に分解（例えば、タンパク質凝集、脱アミノ化および／または酸化）から対象とする化合物を保護するための安定化剤、緩衝剤、バルク剤および界面活性剤などの他の成分をさらに含む。凍結乾燥のための製剤は、リオプロテクタントもしくは安定化剤、緩衝剤、バルク剤、等張剤および界面活性剤を含む１種または複数の追加の成分を含むことができる。
当該物質および任意の他の成分を混合した後、製剤を凍結乾燥する。凍結乾燥は、一般的に、３つの主要な段階：凍結、一次乾燥および二次乾燥を含む。凍結は、水を氷にまたはある非晶質製剤成分を結晶型に転換するために必要である。一次乾燥は、低圧および低温での直接昇華により凍結生成物から氷を除去するプロセスステップである。二次乾燥は、残留水の蒸発表面への拡散を利用して生成物基質から結合水を除去するプロセスステップである。二次乾燥中の生成物温度は、通常は一次乾燥中よりも高い。Ｔａｎｇ Ｘ等（２００４）「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｄｖｉｃｅ」、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２１：１９１〜２００；Ｎａｉｌ Ｓ．Ｌ．等（２００２）「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ中、Ｎａｉｌ Ｓ．Ｌ．編者 ニューヨーク：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２８１〜３５３頁；Ｗａｎｇ等（２０００）「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、２０３：１〜６０；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｎ．Ａ．等（１９８４）「Ｔｈｅ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３８：４８〜５９を参照されたい。一般的に、任意の凍結乾燥プロセスを本発明に関連して使用することができる。
いくつかの実施形態では、生成物の最初の凍結中にアニーリングステップを導入してもよい。アニーリングステップは、全体的なサイクル時間を減少させることができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、アニーリングステップは、賦形剤結晶化および過冷却中に形成される小結晶の再結晶化によるより大きな氷結晶の形成を促進することができ、これが次に、再構成を改善すると考えられる。典型的には、アニーリングステップは、凍結中の温度の間隔または振動を含む。例えば、凍結温度は、−４０℃であってよく、アニーリングステップは、この温度を例えば、−１０℃に増加させ、一定期間この温度を維持するだろう。アニーリングステップ時間は、０．５時間〜８時間（例えば、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、６および８時間）に及び得る。アニーリング温度は、凍結温度と０℃との間であり得る。
凍結乾燥は、容器、例えば、チューブ、バッグ、ビン、トレー、バイアル（例えば、ガラスバイアル）、注射器または任意の他の適当な容器中で行うことができる。容器は、使い捨てであり得る。凍結乾燥は、大規模で行っても小規模で行なってもよい。いくつかの例では、移送ステップを避けるために、タンパク質の再構成を行う容器中でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましいだろう。この例の容器は、例えば、３、４、５、１０、２０、５０または１００ｃｃバイアルであり得る。
Ｈｕｌｌパイロットスケール乾燥機（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＵＳＡ）、Ｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＰ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）実験室凍結乾燥機または所与の凍結乾燥プロセスパラメータを制御することができる任意の凍結乾燥機などの多くの異なる凍結乾燥機をこの目的のために利用することができる。製剤を凍結し、その後一次乾燥に適した温度で凍結内容物から氷を昇華させることにより凍結乾燥を行う。最初の凍結は、典型的には約４時間以下（例えば、約３時間以下、約２．５時間以下、約２時間以下）で製剤を約−２０℃未満の温度（例えば、−５０℃、−４５℃、−４０℃、−３５℃、−３０℃、−２５℃等）にする。この条件下、生成物温度は、典型的には製剤の共晶点または崩壊温度未満である。典型的には、一次乾燥のための棚温度は、典型的には約２０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲の適当な圧力で約−３０〜２５℃の範囲のだろう（一次乾燥中に生成物が融点未満のままであるという条件で）。製剤、試料を収容している容器（例えば、ガラスバイアル）の大きさおよび種類、ならびに液体の容積は、乾燥に必要とされる時間を主に指示し、これは数時間〜数日に及び得る。二次乾燥段階は、主に使用する容器の種類および大きさならびに治療薬の種類に応じて約０〜６０℃で行われる。また、液体の容積は、乾燥に必要とされる時間を主に指示し、これは数時間〜数日に及び得る。
一般的な提案として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満および約０．５％未満である凍結乾燥製剤を生じさせるだろう。
再構成
本発明の医薬組成物は、一般的に、対象に投与する際、水性形態であるが、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は凍結乾燥される。このような組成物は、対象に投与する前に１種または複数の希釈剤を添加することにより再構成しなければならない。所望の段階、典型的には、患者に投与する前の適当な時点で、再構成製剤中のタンパク質濃度が望ましくなるように希釈剤により凍結乾燥製剤を再構成することができる。
本発明にしたがって種々の希釈剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、再構成に適した希釈剤は水である。希釈剤として使用する水は、逆浸透、蒸留、脱イオン化、濾過（例えば、活性炭、精密濾過、ナノ濾過）およびこれらの処理法の組み合わせを含む種々の方法で処理することができる。一般に、水は、それだけに限らないが、注射用の滅菌水または静菌水を含む注射に適したものであるべきである。
他の代表的な希釈剤には、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌生理食塩水、エリオット液、リンガー液またはブドウ糖溶液が含まれる。適当な希釈剤は、任意選択により保存剤を含むことができる。代表的な保存剤には、ベンジルまたはフェノールアルコールなどの芳香族アルコールが含まれる。使用する保存剤の量は、タンパク質との適合性について異なる保存剤濃度を評価することおよび保存剤効果を試験することにより決定される。例えば、保存剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、これは約０．１〜２．０％、約０．５〜１．５％、または約１．０〜１．２％の量で存在することができる。
本発明に適した希釈剤は、それだけに限らないが、ｐＨ緩衝剤（例えば、トリス、ヒスチジン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）および上記のもの（例えば、安定化剤、等張剤）を含む他の添加剤（例えば、スクロース）を含む種々の添加剤を含むことができる。
本発明によると、凍結乾燥物質（例えば、タンパク質）は、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）およびその間の任意の範囲の濃度に再構成することができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥物質（例えば、タンパク質）を、約１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（例えば、約１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ）に再構成することができる。いくつかの実施形態では、再構成製剤中のタンパク質の濃度は、凍結乾燥前製剤中の濃度よりも高くなり得る。再構成製剤中の高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下または筋肉内送達を意図する場合に特に有用であると考えられる。いくつかの実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の約２〜５０倍（例えば、約２〜２０倍、約２〜１０倍または約２〜５倍）であり得る。いくつかの実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３、４、５、１０、２０、４０倍）であり得る。
本発明による再構成は、任意の容器中で行うことができる。本発明に適した代表的な容器には、それだけに限らないが、例えば、チューブ、バイアル、注射器（例えば、一室型もしくは二室型）、バッグ、ビンおよびトレーが含まれる。適当な容器は、ガラス、プラスチック、金属などの任意の材料でできていてよい。容器は、使い捨てでも再利用型でもよい。再構成は、大規模で行っても小規模でも行ってよい。
いくつかの例では、移送ステップを避けるためにタンパク質の再構成を行う容器中でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましいだろう。この例の容器は、例えば、３、４、５、１０、２０、５０または１００ｃｃバイアルであり得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥および再構成に適した容器は、二室型注射器（例えば、Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔ（登録商標）、（Ｖｅｔｔｅｒ）注射器）である。例えば、二室型注射器は、それぞれ、栓により分離された別々の室中にある凍結乾燥物質および希釈剤の両者を含むことができる（実施例５参照）。再構成するために、プランジャーを希釈剤側の栓に取り付けて、希釈剤を生成物室中に動かし、希釈剤が凍結乾燥物質に接触して、本明細書に記載するように再構成が起こるようにすることができる（実施例５参照）。
本発明の医薬組成物、製剤および関連する方法は、種々の治療薬を対象のＣＮＳに送達する（例えば、髄腔内に、脳室内にもしくは大槽内に）、および関連する疾患を治療するのに有用である。本発明の医薬組成物は、タンパク質および酵素を、リソソーム貯蔵障害を患っている患者に送達する（例えば、酵素補充療法）のに特に有用である。リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠損から生じる比較的まれな先天性代謝障害の群を表す。リソソーム症は、リソソーム中への未消化の巨大分子の蓄積を特徴とし、このようなリソソームの大きさおよび数の増大、ならびに最終的には細胞機能障害および臨床的異常を生じさせる。
ＣＮＳ送達
本明細書に記載する種々の安定な製剤は、一般的に治療薬のＣＮＳ送達に適していると考えられる。本発明による安定な製剤は、それだけに限らないが、実質内、脳内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（例えば、ＩＴ腰椎、ＩＴ大槽）投与ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦに直接的または間接的に注射するための任意の他の技術および経路を含む種々の技術および経路を介したＣＮＳ送達に使用することができる。
髄腔内送達
いくつかの実施形態では、補充酵素は、本明細書に記載する製剤でＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、補充酵素は、治療を必要とする対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に投与することによりＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、所望の補充酵素（例えば、ＨＮＳタンパク質）をＣＳＦ中に送達するために髄腔内投与が使用される。本明細書で使用する場合、髄腔内投与（髄腔内注射とも呼ぶ）とは、脊柱管（脊髄を囲む髄腔内空間）への注射を指す。それだけに限らないが、穿頭孔または大槽もしくは腰椎穿刺などを通した脳室側部注射を含む種々の技術を使用することができる。代表的な方法は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓ等、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、１４３〜１９２およびＯｍａｙａ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、１：１６９〜１７９に記載されている。
本発明によると、脊柱管を囲む任意の領域で酵素を注射することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、腰部領域もしくは大槽に注射、または脳室空間に脳室内注射される。本明細書で使用する場合、用語「腰部領域」または「腰椎域」とは、第三および第四腰椎（背中下部）間の区域、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を指す。典型的には、腰部領域または腰椎域を介した髄腔内注射を、「腰椎ＩＴ送達」または「腰椎ＩＴ投与」とも呼ぶ。用語「大槽」とは、頭蓋骨と脊椎上部との間の開口部を通した小脳の周囲および下の空間を指す。典型的には、大槽を介した髄腔内注射を、「大槽送達」とも呼ぶ。用語「脳室」とは、脊髄の中心管と連続した脳内の腔を指す。典型的には、脳室腔を介した注射を、脳室内（ＩＣＶ）送達とも呼ぶ。
いくつかの実施形態では、本発明による「髄腔内投与」または「髄腔内送達」とは、例えば、第三および第四腰椎（背中下部）間、さらに包括的には、脊椎のＬ２〜Ｓ１領域に送達される腰椎ＩＴ投与または送達を指す。本発明による腰椎ＩＴ投与または送達が遠位脊髄管によりうまくより効果的に送達する一方で、大槽送達が特に典型的には遠位脊髄管にうまく送達しないという点で、腰椎ＩＴ投与または送達が大槽送達と識別されると考えられる。
髄腔内送達のための装置
本発明による髄腔内送達のために、種々の装置が用いられ得る。いくつかの実施形態では、髄腔内投与のための装置は、流体アクセスポート（例えば注射用口）；流体アクセスポートと流体連絡する第一流出口、および脊髄中への挿入のために設計された第二流出口；ならびに脊髄における中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。図３６に示した非限定例として、適切な固定機構は、中空体の表面に載せられる１つ以上のノブ、および１つ以上のノブを覆って、中空体が脊髄から滑り落ちないようにする調整可能な縫合環を含有する。種々の実施形態では、流体アクセスポートはレザバーを含む。いくつかの実施形態では、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を含む。いくつかの実施形態では、埋込みカテーテルは、レザバー（例えば、ボーラス送達のため）または注入ポンプと連結される。流体アクセスポートは、埋め込まれるかまたは外側に存在し得る。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、緩徐ボーラス投与）により、またはポート・カテーテル送達系（すなわち注入またはボーラス投与）を介して実施され得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは腰椎の薄板間に挿入され、尖端は、包膜空隙に所望のレベル（一般的にＬ３〜Ｌ４）に装填される（図３７Ａ〜Ｃ）。
静脈内投与に比して、髄腔内投与に適した単回用量投与容積は典型的に小さい。典型的には、本発明による髄腔内腔内送達は、ＣＳＦの組成の平衡、ならびに対象の頭蓋内圧を保持する。いくつかの実施形態では、髄腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去がない時に実施される。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、例えば約１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１．５ｍｌ、１ｍｌまたは０．５ｍｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回用量投与容積は、約０．５〜５ｍｌ、０．５〜４ｍｌ、０．５〜３ｍｌ、０．５〜２ｍｌ、０．５〜１ｍｌ、１〜３ｍｌ、１〜５ｍｌ、１．５〜３ｍｌ、１〜４ｍｌまたは０．５〜１．５ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、本発明による髄腔内送達は、所望量のＣＳＦを除去するステップを最初に包含する。いくつかの実施形態では、約１０ｍｌ未満（例えば、約９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ未満）のＣＳＦが先ず除去された後、ＩＴ投与がなされる。それらの場合、適切な単回用量投与容積は、例えば約３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌまたは２０ｍｌより大きい。
治療用組成物の髄腔内投与を実行するために、種々の他の装置が用いられ得る。例えば、所望の酵素を含有する処方物は、髄膜癌腫症のための薬剤を髄腔内投与するために一般に用いられるオンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）レザバーを用いて投与され得る（Ｌａｎｃｅｔ ２： ９８３−８４， １９６３）。さらに具体的には、この方法では、脳室チューブは前角中に形成される穴を通して挿入され、頭皮下に設置されるオンマヤレザバーに連結され、レザバーは皮下穿刺されて、レザバー中に注入される補充されるべき特定酵素を髄腔内送達する。個体への治療用組成物または製剤の髄腔内投与のための他の装置は、米国特許第６，２１７，５５２号（この記載内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている。代替的には、薬剤は、例えば単回注射または連続注入により、髄腔内投与され得る。投薬治療は、単回用量投与または多数回用量投与の一形態であり得る、と理解されるべきである。
注射のためには、本発明の製剤は、液体溶液中に製剤化され得る。さらに、酵素は固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も包含される。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを用いる）の形態であり得る。
本発明の一実施形態では、酵素は、対象の脳への外側脳室注射により投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に作られる穿頭孔を通してなされ得る。別の実施形態では、酵素および／または他の薬学的製剤は、対象の脳室中に外科的に挿入されるシャントを通して投与される。例えば、注射は、より大きい外側脳室中になされ得る。いくつかの実施形態では、より小さい第三および第四脳室への注射もなされ得る。
さらに別の実施形態では、本発明に用いられる薬学的組成物は、対象の大槽または腰椎区域への注射により投与される。
本発明の方法の別の実施形態では製薬上許容可能な製剤は、製薬上許容可能な製剤が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間またはそれ以上の間、対象に、本発明で用いられる酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば「緩徐放出」を提供する。
本明細書中で用いる場合、「持続性送達」という用語は、投与後、長期間に亘って、好ましくは少なくとも数日間、１週間または数週間、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明の薬学的製剤を連続送達することを指す。組成物の持続性送達は、例えば、長時間に亘る酵素の連続治療効果により実証され得る（例えば、酵素の持続性送達は、対象における貯蔵顆粒の量の連続的低減により実証され得る）。代替的には、酵素の持続性送達は、長時間に亘るｉｎ ｖｉｖｏでの酵素の存在を検出することにより実証され得る。
標的組織への送達
上記のように、本発明の意外な且つ重要な特徴の１つは、本発明の方法を用いて投与される治療薬、特に補充酵素、ならびに本発明の組成物は、脳表面全体に効果的に且つ広範囲に拡散し、脳の種々の層または領域、例えば深部脳領域に浸透し得る、という点である。さらに、本発明の方法および本発明の組成物は、現存するＣＮＳ送達方法、例えばＩＣＶ注射では標的化するのが困難である脊髄の出の組織、ニューロンまたは細胞、例えば腰部領域に治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）を効果的に送達する。さらに、本発明の方法および組成物は、血流ならびに種々の末梢器官および組織への十分量の治療薬（例えば、ＨＮＳ酵素）を送達する。
したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、ＨＮＳ酵素）は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、ＨＮＳ酵素）は、脳、脊髄および／または末梢期間の標的組織のうちの１つ以上に送達される。本明細書中で用いる場合、「標的組織」という用語は、治療されるべきリソソーム蓄積症により影響を及ぼされる任意の組織、あるいは欠損リソソーム酵素が正常では発現される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織としては、リソソーム蓄積症に罹患しているかまたは罹り易い患者において、例えば組織の細胞リソソーム中に貯蔵される酵素基質が検出可能量でまたは異常に高い量で存在する組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、疾患関連病態、症候または特徴を示す組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的組織としては、欠損リソソーム酵素が高レベルで正常では発現される組織が挙げられる。本明細書中で用いる場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。標的組織の例は、以下で詳細に記載される。
脳標的組織
概して、脳は、異なる領域、層および組織に分けられ得る。例えば、髄膜組織は、脳を含めた中枢神経系を包む膜系である。髄膜は、３つの層、例えば硬膜、くも膜および軟膜を含有する。概して、髄膜の、ならびに脳脊髄液の主な機能は、脳神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の１つ以上の層に送達される。
脳は、大脳、小脳および脳幹を含めた３つの主な細区画を有する。大脳半球は、ほとんどの他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている。大脳の下層には脳幹が横たわり、これは茎に似ており、その上に大脳が取り付けられている。脳の後部、大脳の下および脳幹の背後には、小脳が存在する。
脳の正中線近くおよび中脳の上に位置する間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋腹部を含有する。中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、ｍｉｄｂｒａｉｎとも呼ばれ、視蓋、外被、ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｅｓｏｃｏｅｌｉａ、ならびに大脳脚、赤核および第三脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、警戒および温度調節に関連する。
脳を含めた中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特性化され得る。ＣＮＳ（例えば脳）組織は、表面または浅在組織、中深部組織および／または深部組織として特性化され得る。
本発明によれば、治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、対象において治療されるべき特定疾患に関連した任意の適切な脳標的組織（単数または複数）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、表面および浅在脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅在脳標的組織、中深部脳標的組織および／または深部脳標的組織の組合せに送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍまたはそれより下（または内側）の深部脳組織に送達される。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、フィルヒョー・ロバン腔隙、ＶＲ腔隙内の血管、海馬、脳の下面の視床下部の部分、視神経および視索、嗅球および嗅突起ならびにその組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅在組織は、大脳の表面から４ｍｍより下（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍ）に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、大脳皮質リボンを包含する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化深部組織は、間脳（例えば、視床下部、視床、腹側視床および視床腹部等）、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被核、扁桃、淡蒼球およびその組合せのうちの１つ以上を包含する。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の組織に送達される。ある実施形態では、小脳の１つ以上の標的化組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚およびその組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の１つ以上の深部組織、例えばプルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に比して深部）および深部小脳核組織（これらに限定されない）に送達される。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳幹の１つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の１つ以上の標的化組織は、脳幹白質組織および／または脳幹核組織を包含する。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、種々の脳組織、例えば灰白質、白質、脳室周囲域、軟膜−くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または延髄の深部領域、およびその組合せ（これらに限定されない）に送達される。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脳中の種々の細胞、例えばニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞（これらに限定されない）に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、深部白質の乏突起グリア細胞に送達される。
脊髄
概して、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特性化され得る。例えば、脊髄組織は、表面または浅在組織、中深部組織、および／または深部組織として特性化され得る。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の表面または浅在組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅在組織は、軟膜および／または白質路を含有する。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内部に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化深部組織は、脊髄灰白質および／または上衣細胞を含有する。
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば酵素）は、脊髄のニューロンに送達される。
末梢標的組織
本明細書中で用いる場合、末梢器官または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部ではない任意の器官または組織を指す。末梢標的組織としては、血管系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば補充酵素）は、末梢標的組織のうちの１つ以上に送達される。
生体分布および生物学的利用能
種々の態様において、標的組織に一旦送達されると、治療薬（例えばＨＮＳ酵素）は、細胞内に局在化される。例えば、治療薬（例えば酵素）は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞のようなニューロン）のエキソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは空胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、髄腔内投与酵素は、酵素が血管周囲腔隙内に移動するよう（例えば、拍動補助対流機構により）、移動力学を実証する。さらに、投与タンパク質または酵素と神経細繊維との会合に関する活性軸索輸送機構も、中枢神経系の深部組織中への、髄腔内腔内投与タンパク質または酵素の分布に寄与し得るし、そうでなければそれを助長し得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えばＨＮＳ酵素）は、本明細書中に記載される種々の標的組織において、治療的または臨床的有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書中で用いる場合、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織において治療作用を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療作用は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定）または主観的（すなわち、対象が作用の指標または感覚を提示する）であり得る。例えば、治療的または臨床的有効レベルまたは活性は、標的組織における疾患に伴う症候（例えば、ＧＡＧ貯蔵）を改善するのに十分である酵素レベルまたは活性であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織における対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％である酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対照（例えば、治療を伴わない内因性レベルまたは活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増大される酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、標的組織中で、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腰部領域を標的化するために特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇの腰部領域における酵素レベルまたは活性増大を達成し得る。
概して、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、ＣＳＦならびに脳、脊髄および末梢器官の標的組織中で十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、少なくとも約３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、３日まで、７日まで、１４日まで、２１日まで、または１ヶ月までの半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間または１週間後に、ＣＳＦまたは血流中に検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて決定され得る。
ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、投与後（例えば、対象への薬学的組成物の髄腔内腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、対象のＣＮＳ組織および細胞中で、少なくとも３０μｇ／ｍｌの濃度を達成する。ある実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば補充酵素）は、対象の標的化組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）中で、このような対象への投与後（例えば、対象へのこのような薬学的組成物の髄腔内腔内投与の、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分後、またはそれ未満の後）、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌまたは少なくとも０．５μｇ／ｍｌの濃度を達成する。
サンフィリッポＡ症候群および他のリソソーム蓄積症の治療
リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠陥に起因するかなり稀な遺伝性代謝障害の一群を表す。リソソーム症は、リソソーム内の酵素基質を含めた未消化高分子物質の蓄積（表１参照）により特性化され、これが、このようなリソソームのサイズおよび数の増大を、そして最終的には細胞機能不全および臨床的異常を生じる。
本明細書中に記載される本発明の方法は、標的化細胞小器官への１つ以上の治療薬（例えば、１つ以上の補充酵素）の送達を有益に助長し得る。例えば、サンフィリッポ症候群Ａ型のようなリソソーム蓄積症は罹患細胞のリソソーム中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積により特性化されるため、リソソームは、リソソーム蓄積障害の治療のための所望の標的細胞小器官を表す。
本発明の方法および組成物は、ＣＮＳ病因または構成成分を有する疾患を治療するために特に有用である。ＣＮＳ病因または構成成分を有するリソソーム蓄積症としては、例えばサンフィリッポ症候群Ａ型、サンフィリッポ症候群Ｂ型、ハンター症候群、異染性白質ジストロフィー症およびグロボイド細胞白質ジストロフィー症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の前に、伝統的療法は、対象に静脈内投与されることに限定されており、一般的には、根元的酵素欠乏症の体細胞性症候を治療するに際して有効であるに過ぎない。本発明の組成物および方法は、このようなＣＮＳ病因を有する疾患に罹患している対象のＣＮＳ中に直接、有益に投与され、それによりＣＮＳ（例えば脳）の罹患細胞および組織内の治療的濃度を達成し、したがって、このような治療薬の伝統的全身投与に伴う制限を克服し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、リソソーム蓄積障害の神経学的および体細胞性後遺症または症候群の両方を治療するために有用である。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、ＣＮＳまたは神経学的後遺症ならびにリソソーム蓄積症の書状発現の治療のために、対象のＣＮＳに１つ以上の治療薬を送達する（例えば、髄腔内腔内、静脈内または槽内に）組成物および方法に関するが、一方、そのリソソーム蓄積症の全身性または体細胞性症状発現も治療するためでもある。例えば、本発明のいくつかの組成物は、対象に髄腔内投与され、それにより、対象のＣＮＳに１つ以上の治療薬を送達して、神経学的後遺症を治療し、それと対になって、全身循環の細胞および組織（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓またはリンパ節の細胞および組織）の両方にこのような治療薬を送達するために１つ以上の治療薬を静脈内投与し、それにより体細胞性後遺症を治療する。例えば、リソソーム蓄積症（例えばサンフィリッポ症候群Ａ型）を有するか、そうでなければ影響を及ぼされる対象は、１つ以上の治療薬（例えば、ＨＮＳ）を含む薬学的組成物を、神経学的後遺症を治療するために、少なくとも週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回またはそれ以上、髄腔内投与され得るが、一方、異なる治療薬は、当該疾患の全身性または体細胞性症状発現を治療するために、より高頻度ベースで（例えば、１日１回、隔日に１回、週３回または週１回）、対象に静脈内投与され得る。
サンフィリッポ症候群またはムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する酵素の欠損を特徴とするまれな遺伝子疾患である。酵素が存在しないと、部分的に分解されたＧＡＧ分子は体から排出されず、種々の組織のリソソームに蓄積し、進行性の広範な身体機能障害を生じさせる（ＮｅｕｆｅｌｄおよびＭｕｅｎｚｅｒ、２００１）。
ＭＰＳ ＩＩＩＡ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ばれる４種の異なる型のＭＰＳ ＩＩＩが同定された。各々がＧＡＧへパラン硫酸の分解に関与する４種の酵素の１種の欠損を示す。全ての型が、粗野な顔の特徴、肝脾腫、角膜混濁および骨格奇形を含む異なる程度の同一の臨床症状を有する。しかしながら、最も著しくは、ニューロン中のへパラン硫酸の蓄積だけでなく、一次ＧＡＧ蓄積により引き起こされるガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３およびＧＤ２のその後の上昇にも結び付けられる認知能力の重度のおよび進行性の喪失である（Ｗａｌｋｅｙ １９９８）。
ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ；サンフィリッポ症候群Ａ型）は、最も重篤な型のサンフィリッポ症候群であって、世界中で約１００，０００人に一人が罹患している。サンフィリッポ症候群Ａ型（サンフィリッポＡ）は、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパランスルフェートのリソソーム異化に関与するエキソスルファターゼである酵素ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の欠乏により特性化される（Ｎｅｕｆｅｌｄ ＥＦ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ （２００１） ｐｐ． ３４２１−３４５２）。この酵素の非存在下では、ＧＡＧヘパランスルフェートはニューロンおよびグリア細胞のリソソーム中に蓄積するが、脳の外側には余り蓄積しない。
この障害の限定性臨床的特徴は中枢神経系（ＣＮＳ）変性であって、これにより、主要な発達里程標石を失い、あるいはそれを達成できなくなる。進行性認知低下は、痴呆および若年死亡率を最高度に高める。当該疾患は、典型的には、それ自体、幼児において、症状発現し、罹患した個体の寿命は、一般的には、１０代後期〜２０代前半を超えることはない。
本発明の組成物および方法を使用して、サンフィリッポ症候群Ａ型に罹患しているまたは罹患しやすい個体を有効に治療することができる。「治療する」または「治療」という用語は、当該疾患に伴う１つ以上の症候の改善、当該疾患の１つ以上の症候の開始もしくは進行の防止または遅延、および／または当該疾患の１つ以上の症候の重症度または頻度の低下を指す。
いくつかの実施形態では、治療は、サンフィリッポＡ患者における神経学的障害の重症度および／または発生率を部分的にまたは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、開始を遅延し、重症度および／または発生率を低減することを指す。本明細書中で用いる場合、「神経学的障害」という用語は、中枢神経系（例えば、脳および脊髄）の機能障害に伴う種々の症候を包含する。神経学的障害の症候としては、例えば、発育遅延、進行性認知障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠乏、多動性障害、攻撃性および／または睡眠障害等が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、治療は、種々の組織におけるリソソーム貯蔵（例えば、ＧＡＧの）低減を指す。いくつかの実施形態では、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織におけるリソソーム貯蔵低減を指す。ある実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低減される。いくつかの実施形態では、リソソーム貯蔵は、リソソーム貯蔵顆粒の存在により測定される（例えば、ゼブラストライプ形態）。
いくつかの実施形態では、治療は、ニューロン（例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロン）における空胞形成低減を指す。ある実施形態では、ニューロンにおける空胞形成は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、空胞形成は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低減される。
いくつかの実施形態では、治療は、種々の組織中のＨＮＳ酵素活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織中のＨＮＳ酵素活性の増大を指す。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上増大する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増大する。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性の増大は、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＨＮＳ酵素活性は、腰部領域で増大する。いくつかの実施形態では、腰部領域のＨＮＳ酵素活性の増大は、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、治療は、認知能力の喪失の進行低減を指す。ある実施形態では、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。いくつかの実施形態では、治療は、発育遅延低減を指す。ある実施形態では、発育遅延は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態では、治療は、生存（例えば、生存時間）増大を指す。例えば、治療は、患者の平均余命増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、治療を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％より多く、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％、約２００％またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、治療を伴わない同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約６ヵ月より長く、約７ヵ月、約８ヵ月、約９ヵ月、約１０ヵ月、約１１ヵ月、約１２ヵ月、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年またはそれ以上、患者の平均余命を増大する。いくつかの実施形態では、本発明による治療は、患者の長期間生存を生じる。本明細書中で用いる場合、「長期間生存」という用語は、約４０年、４５年、５０年、５５年、６０年またはそれより以上の生存時間または平均余命を指す。
「改善する」、「増大する」または「低減する」という用語は、本明細書中で用いる場合、対照と対比する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な対照は、基線測定値、例えば、本明細書中に記載される治療の開始前の同一個体における測定値、あるいは本明細書中に記載される治療の非存在下での一対照個体（または多数の対照個体）における測定値である。「対照個体」は、治療されている個体とほぼ同一年齢および／または性別である、サンフィリポ症候群Ａ型に苦しむ個体である（治療個体および対照個体（単数または複数）における疾患の段階が比較可能であることを保証するため）。
治療されている個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、サンフィリッポ症候群Ａ型を有するかまたはサンフィリッポ症候群Ａ型疾患を発症する可能性を有する個体（胎児、幼児、小児、若者または成人）である。個体は、残留内因性ＨＮＳ酵素発現および／または活性を有し得るし、あるいは測定可能な活性を有さない。例えば、サンフィリッポ症候群Ａ型を有する個体は、正常ＨＮＳ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＨＮＳ発現レベルを有し得る。
いくつかの実施形態では、個体は、当該疾患であると最近診断された個体である。典型的には、疾患の効果を最小化し、治療の利点を最大化するためには、早期の治療（診断後可能な限り早期の治療開始）が重要である。
免疫寛容
一般的に、本発明による治療薬（例えば補充酵素）の髄腔内投与は、対象において重篤な副作用を生じない。本明細書中で用いる場合、重症副作用は、実質的免疫応答、毒性または死（これらに限定されない）を誘導する。本明細書中で用いる場合、「実質的免疫応答」という用語は、重症または重篤免疫応答、例えば適応Ｔ細胞免疫応答を指す。
したがって、多くの実施形態において、本発明の方法は、同時免疫抑制剤療法（すなわち、前処置／前状態調節として、あるいは当該方法と平行して用いられる任意の免疫抑制剤療法）を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療されている対象における免疫寛容誘導を包含しない。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を用いる対象の前処置または前状態調節を包含しない。
いくつかの実施形態では、治療薬の髄腔内投与は、これらの作用物質に対する免疫応答を高め得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素補助療法に対して寛容な補助酵素を患者に接種させることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて誘導され得る。例えば、Ｔ細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および抗増殖剤、例えばアザチオプリン（Ａｚａ）を、低用量の所望の補充酵素の毎週髄腔内腔内注入と組合せた初期３０〜６０日レジメンが、用いられ得る。
当業者に既知の任意の免疫抑制剤は、本発明の組合せ療法と一緒に用いられ得る。このような免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗ＴＮＦ剤、例えばエタネルセプト（例えば、Ｍｏｄｅｒ， ２０００， Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８４， ２８０−２８４；Ｎｅｖｉｎｓ， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １２， １４６−１５０；Ｋｕｒｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１， ２２４−２３０；Ｉｄｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９５， ２１７−２２６；Ｐｏｔｔｅｒｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７５， １５９−１７４；Ｓｌａｖｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． １９， １−２４； Ｇａｚｉｅｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２５， ６８９−６９６；Ｈｅｎｒｙ， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １３， ２０９−２２０； Ｇｕｍｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０， １３６６−１３８０；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９， １２７５−１２８３参照）が挙げられるが、これらに限定されない。抗ＩＬ２受容体（アルファ−サブユニット）抗体ダクリズマブ（例えば、ゼナパックス ＴＭ）（これは、移植患者において有効であることが実証されている）も、免疫抑制剤として用いられ得る （例えば、Ｗｉｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｄｒｕｇｓ ５８， １０２９−１０４２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ３４２， ６１３−６１９；Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｄｒｕｇｓ Ｒ． Ｄ． １， ５５−６０；Ｂｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １９， １１２７−１１３７；Ｅｃｋｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９， １８６７−１８７２；Ｅｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌ． Ｉｎｔ． １３， １５１−１５９参照）。付加的免疫抑制剤としては、抗ＣＤ２（Ｂｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８， １５８８−１５９６；Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｌｏｏｄ ９２， ４０６６−４０７１）、抗ＣＤ４（Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４３， ６３８−６４４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９２， １３８−１５２）および抗ＣＤ４０リガンド（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ２０， １０８−１２５；Ｃｈｉｒｍｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４， ３３４５−３３５２；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４， １２３０−１２３５）が挙げられるが、これらに限定されない。
投与
本発明の方法は、治療的有効量の本明細書中に記載される治療薬（例えば補充酵素）の単回ならびに多数回投与を意図する。治療薬（例えば補充酵素）は、対象の症状（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度および程度によって、一定間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療的有効量の治療薬（例えば補充酵素）は、一定間隔で（例えば、年１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週）、定期的に髄腔内投与され得る。
いくつかの実施形態では、髄腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腸管外、経皮的、または経筋肉的に（例えば、経口的または鼻に））と共同で用いられ得る。いくつかの実施形態では、他の投与経路（例えば、静脈内投与）は、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年投与以下の頻度で実施され得る。
本明細書中で用いる場合、「治療的有効量」という用語は、主として、本発明の薬学的組成物中に含有される治療薬の総量に基づいて確定される。一般的に、治療的有効量は、対象に対して意義のある利益（例えば、根元的疾患または症状を治療し、調整し、治癒し、防止し、および／または改善すること）を達成するのに十分である。例えば、治療的有効量は、所望の治療的および／または予防的作用を達成するのに十分な量、例えばリソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによりこのようなリソソーム蓄積症またはその症候を治療する（例えば、対象への本発明の組成物の投与後の、「ゼブラ体」の存在または出現の、あるいは細胞空胞形成の低減または排除）ために十分な量であり得る。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特質によって決まる。このような特質としては、対象の症状、疾患重症度、全身健康状態、年齢、性別および体重が挙げられる。これらのおよびその他の関連因子によって、適切な投与量を、当業者は容易に決定し得る。さらに、最適投与量範囲を同定するために、客観的および主観的検定がともに任意に用いられ得る。
治療的有効量は、多重単位用量を含み得る用量投与レジメンで一般に投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関しては、治療的有効量（および／または有効用量投与レジメン内の適切な単位用量）は、例えば投与経路、他の薬学的作用物質との組合せによって変わり得る。さらにまた、任意の特定患者のための具体的治療的有効量（および／または単位用量）は、種々の因子、例えば治療されている障害および障害の重症度；用いられる具体的薬学的作用物質の活性；用いられる具体的組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路、および／または用いられる具体的融合タンパク質の排出または代謝速度；治療の持続期間；ならびに医療業界で周知であるような因子によって決まり得る。
いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５００ｍｇ／脳１ｋｇ、例えば、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１００ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜９０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜８０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜７０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜６０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜５０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜４０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜３０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜２０ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１５ｍｇ／脳１ｋｇ、約０．００５ｍｇ／脳１ｋｇ〜１０ｍｇ／脳１ｋｇの範囲である。
いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、約０．１ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約０．５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１．０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約６０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約７０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約８０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約９０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約１５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約２５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約３５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４００ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約４５０ｍｇ／脳１ｋｇより多く、約５００ｍｇ／脳１ｋｇより多い。
いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／体重１ｋｇによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重は相関し得る（Ｄｅｋａｂａｎ ＡＳ． “Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ： ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｔｏ ｂｏｄｙ ｈｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ，” Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９７８； ４：３４５−５６）。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表５に示されるように換算され得る。
いくつかの実施形態では、治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃによっても定義され得る。当業者が理解するように、脳重量および体重に基づいた治療的有効用量は、ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃに換算され得る。例えば、成人におけるＣＳＦの容積は約１５０ｍＬである（Ｊｏｈａｎｓｏｎ ＣＥ， ｅｔ ａｌ． “Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ： Ｎｅｗ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｒｅｓ． ２００８ Ｍａｙ １４；５：１０）。したがって、成人への０．１ｍｇ〜５０ｍｇの単一用量注射は、成人では約０．０１ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（５０ｍｇ）用量である。
任意の特定の対象に関して、具体的投与量レジメンは、個体の必要性、ならびに酵素補充療法の投与を施すかまたは指図する専門家の判断によって経時的に調整されるべきであり、そして本明細書中に記述される投与量範囲は単なる例であって、本発明の範囲または実行を限定するものではない、とさらに理解されるべきである。
キット
本発明はさらに、本発明の製剤を含有するキットまたは他の製品を提供し、そしてその再構成（凍結乾燥された場合）および／または使用のための機器を提供する。キットまたはその他の製品としては、容器、ＩＤＤＤ、カテーテル、ならびに髄腔内投与および関連外科手術に有用な任意のその他の物質、装置または設備が挙げられ得る。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、注射器（薬剤充填済み注射器）、アンプル、カートリッジ、レザバーまたはｌｙｏ−ｊｅｃｔｓが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られ得る。いくつかの実施形態では、容器は薬剤充填済み注射器である。適切な薬剤充填済み注射器としては、ベイクドシリコン被覆膜を有するホウケイ酸ガラス注射器、噴霧シリコンを有するホウケイ酸ガラス注射器またはシリコンを含有しないプラスチック樹脂注射器が挙げられるが、これらに限定されない。
典型的には、容器は、製剤、ならびに再構成および／または使用に関する指示を示し得る容器上の、または容器に付随したラベルを保持し得る。例えば、ラベルは、製剤が上記のようなタンパク質濃度に再構成される、ということを示し得る。ラベルはさらに、製剤が、例えばＩＴ投与のために有用であるかまたは意図される、ということを示し得る。いくつかの実施形態では、容器は、治療薬（例えば補充酵素）を含有する単一用量の安定な製剤を含有し得る。種々の実施形態において、単一用量の安定な製剤は、約１５ｍｌ未満、１０ｍｌ、５．０ｍｌ、４．０ｍｌ、３．５ｍｌ、３．０ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌまたは０．５ｍｌの容量で存在する。代替的には、製剤を保持するよう器は、多数回使用バイアルであって、これは、製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にし得る。キットまたは他の製品はさらに、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水）を含む第二容器を包含し得る。希釈剤および製剤の混合時に、再構成化製剤中の最終タンパク質濃度は、一般的に、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）である。キットまたは他の製品はさらに、商業的および使用者の見地から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、ＩＤＤＤ、カテーテル、注射器および使用説明書を伴う添付文書を包含し得る。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。引用文献はすべて、参照により本明細書に援用される。
実施例
実施例１：ＨＮＳ製剤
本実施例の実験は、髄腔内送達を意図したｐＨ、イオン強度および緩衝剤型を含む種々の製剤条件におけるヘパラン−Ｎ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の安定性を試験するための予備処方試験の一部として設計した。
ＨＮＳは、一般的にその天然状態で二量体であることが分かっている（Ｂｉｅｌｉｃｋｉ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、３２９、１４５〜１５０）。ＨＮＳ二量体の分子量は１１５ｋＤａである。ＨＮＳは、典型的にはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）中に二量体として溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流すと、ゲルに充填する前に試料を１００℃に加熱しない限り（その場合、ＨＮＳは単量体（６２ｋＤａ）として現れる）ＨＮＳは二量体として現れる。ＨＮＳの全長および成熟配列を表６および表７のそれぞれで以下に示す。成熟ＨＮＳ配列は、５個のシステイン残基（下線部）を含み、これらは２つの内部ジスルフィド結合および１つの遊離システインを可能にするだろう。
この実施例では、以下の製剤パラメータを試験した：（１）ｐＨ３〜８のクエン酸塩製剤およびｐＨ５〜８のリン酸塩製剤中のｐＨ；（２）緩衝剤：クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０〜８．０）およびリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、全て２０ｍＭの濃度；ならびに（３）イオン強度：ＮａＣｌ（０〜３００ｍＭ）。
本実施例に記載する全ての予備処方試験は、１〜２ｍｇ／ｍｌの低タンパク質濃度で行った。
種々のストレス下で生成する製剤生成物および分解生成物を分析するために、ＳＥＣ−ＨＰＣＬ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、濁度（ＯＤ３２０）および酵素活性アッセイを使用した。
一般的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、低ｐＨ（ｐＨ３）で製剤の断片化を示した一方で、高ｐＨ製剤は、ほとんど断片化を示さなかった。ＤＳＣによる融解温度の評価は、クエン酸塩およびリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤が６〜７のｐＨ範囲で最大の熱安定性を有することを示した。酵素活性結果は、評価した全ｐＨ値で、クエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤が、５０℃で７日間の貯蔵後に不活性になることを示した。ｐＨ６〜７でリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、５０℃で７日間の貯蔵後に有意な活性を保持した。しかしながら、同じ製剤の別の調製品では一貫して観察されなかったが、高分子量ピーク（「ＳＥＣにより見られる「１６分ピーク」」は、ｐＨ７〜８で最大である。
イオン強度０〜３００ｍＭ ＮａＣｌのｒｈＨＮＳ製剤安定性への影響も評価した。５０℃で７日間の加速安定性条件で貯蔵した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、内部ロット対照よりも大きな断片化を示さなかった。クエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、イオン強度にかかわらず５０℃で７日後に活性の完全な喪失を示した。リン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌで有意な活性を保持した。しかしながら、１６分ピーク（ＳＥＣによる）は、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ範囲で最大である。
方法
ｐＨのｒｈＨＮＳ安定性への影響
透析（Ｐｉｅｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、ＰＮ番号６６３８３、ロット番号ＨＫ１０７５３７）を使用して、ｒｈＨＮＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３８ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中９．２ｍｇ／ｍｌ）を３．０〜８．０のｐＨ範囲を有する２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび６．０〜８．０のｐＨ範囲を有する２０ｍＭリン酸ナトリウムに緩衝液交換した。各交換した緩衝液中の最終タンパク質濃度を２．０ｍｇ／ｍｌに標的化した。これらの溶液を、それぞれ０．５ｍｌで２．０ｍｌガラスバイアル中（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号：６８００−０３１４、ロット番号：３０８０９Ａ２００１）に分取し、次いで、５０℃、２５℃および２〜８℃チャンバー中でインキュベートした。７、１４および２８日後、凝集（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、断片化（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、濁度（ＯＤ３２０）および酵素活性の分析のために試料を引き出した。
リン酸塩緩衝液中でのその後のｐＨ試験を上記と同じ手順にしたがって反復したが、ｒｈＨＮＳロット番号ＳＳ１０を使用した。最初のリン酸塩試験についてのｐＨ範囲は狭かったので、より広範なｐＨ範囲を組み込むよう試験を反復した。
ＯＤ３２０
ＯＤ３２０測定を行うことにより、ｒｈＨＮＳ試料の濁度を決定した。試料を、０．２ｃｍ経路長セル中２ｍｇ／ｍｌでＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４で測定した。各試験について総量は３０μｌとした。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
ｒｈＨＮＳのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析のために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｃｏｌｕｍｎ ２００（１０／３００ＧＬ、ＰＮ：１７−５１７５−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。移動相は、０．５ｍｌ／分の流速で流れるリン酸緩衝食塩水（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６）とした。注入量は、１ｍｇ／ｍｌ（それぞれの緩衝液中２ｍｇ／ｍｌから希釈した）の３０μｌとした。各注入の実行時間は５０分とし、２１４ｎｍの検出波長とした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
この方法は、還元および変性条件下でのｒｈＨＮＳの断片化および凝集を評価する。ｒｈＨＮＳ試料をＳＤＳ緩衝液と混合し（最終濃度＝０．５ｍｇ／ｍｌ）、ＤＴＴを添加した（還元試料のみ）。試料を１００℃に５分間加熱した。５分より長い間試料を沸騰させると、ｒｈＨＮＳの断片化が生じた。各レーンに８〜１６％勾配アクリルアミドゲル（カタログ番号：ＥＣ６０４５ＢＯＸ）上ｒｈＨＮＳ試料１０μｇをロードした。ゲルを１５０Ｖで流し、次いで、Ｇｅｌ Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料と共に一晩インキュベートした（震盪しながら）。スキャンの１時間前にゲルを水で脱染した。
活性アッセイ
ｒｈＨＮＳについての活性アッセイは２ステップ反応である。第１反応では、へパラン−Ｎ−スルファアーゼが基質を脱硫酸化する。第２反応で、α−グルコシダーゼ酵素の添加によりさらなる加水分解が起こり、４−ＭＵを放出し、次いでこれを測定することができる。ｒｈＨＮＳを１０μｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度にするために１：２１０希釈した。リン酸塩緩衝液ｐＨ試験のために、アッセイを修正し、約１００μｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度にするためにｒｈＨＮＳを１：２４希釈した。
ＤＳＣ
示差走査熱量（ＤＳＣ）測定をＭｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−ＤＳＣ）で行った。試験するｒｈＨＮＳ試料は０．５ｍｇ／ｍｌとした。温度を１０℃に平衡化し、次いで、１分当たり１℃で１００℃まで勾配を与えた。
ＨＮＳ安定性へのイオン強度の影響
透析（Ｐｉｅｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒロット番号ＨＫ１０７５３７）を使用して、ｒｈＨＮＳを０〜３００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムを含むｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸塩緩衝液および０〜３００ｍＭの範囲の塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸塩緩衝液に緩衝液交換した。各交換した緩衝液中の最終タンパク質濃度を２．０ｍｇ／ｍｌに標的化した。これらの溶液を、それぞれ０．５ｍｌで２．０ｍｌガラスバイアル中（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号：６８００−０３１４、ロット番号：３０８０９Ａ２００１）に分取し、次いで、５０℃、２５℃および２〜８℃チャンバー中でインキュベートした。７、１４および２８日後、凝集（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、断片化（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、濁度（ＯＤ３２０）および酵素活性の分析のために試料を引き出した。
結果
ＨＮＳ安定性へのｐＨの影響
ＯＤ３２０および外観
濁度を測定するためのＯＤ３２０値の結果を表８で以下に示す。ｐＨ７のリン酸塩またはｐＨ３〜６のクエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤の加速安定性条件下で濁度の有意な変化はなかった。しかしながら、ｐＨ８．０のリン酸塩およびクエン酸塩製剤の両者ならびにｐＨ７．０のクエン酸塩製剤中の試料は、５０℃で７日後に濁度の増加を示した。外観チェックを、ライトボックス（Ｍ．Ｗ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＮＣ、モデル番号：ＭＩＨ−ＤＸ）下で行ったところ、全製剤は無色透明で目に見える粒子がないままのように見えた。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
ｒｈＨＮＳのＳＥＣ溶出プロファイルの例示的クロマトグラムを図１Ａ〜１Ｃに示す。ベースライン試料は主としてそれぞれ約２２分、約２６分および約３２分の保持時間を有する３つのピークを含む。時折、これはまた、約３４分にもピークを有する。ＳＥＣ−ＬＳにより、約２６分の主ピークが二量体として確認された。他のピークの性質は不明である。
第１ｐＨ試験からのＳＥＣデータを表９で以下に概説する。全体的に、全製剤は、ストレス条件（５０℃）ならびに加速（２５℃）およびリアルタイム貯蔵条件（２〜８℃）下で本質的にほとんど変化を有さなかった。しかしながら、５０℃で７日後、ｐＨ６〜８のクエン酸塩およびリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、１６分の保持時間を有する高分子量ピークを生成した。ｐＨ７．０のリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤では、１６分ピークは、総面積の約２％を占める。しかしながら、イオン強度試験で調製した同じ製剤は、約０．１％しか含まなかった。
この現象を検証するために、リン酸塩緩衝液でのｐＨ試験をより広範囲のｐＨにわたって反復し、ＳＥＣデータを表１０で以下に概説する。この試験では、５０℃で７日後にｐＨ５緩衝液には１６分ピークは存在しなかったが、実際、ｐＨ６〜８の製剤には存在し、これはｐＨが増加するにつれて増加した。ポリソルベート２０（０．０５％）の添加は、１６分ピークの大きさに有意に影響しなかった。興味深いことに、ｐＨ５製剤は安定性試料中にこのピークを含まなかったが、ｐＨ５への生理食塩水からの透析の調製中、有意な量のｒｈＨＮＳが沈殿した。
予備的特性評価結果は、１６分ピークが、スケール変更すると、ｒｈＨＮＳ二量体ピークのスペクトルとうまく重ね合わせられるタンパク質を示すスペクトルを有することを確認している（図１Ｄ）。ＳＥＣ−ＬＳにより試験すると、１６分ピークは、１ＭＤａを超える見かけの分子量を示す。このピークの性質を理解するためにはさらなる特性評価が必要となり得る。
酵素活性
第１ｐＨ試験からの活性データ概要を表５で以下に示す。５０℃で７日間の加速安定性条件下で、ｒｈＨＮＳは、ｐＨ３〜８の製剤を含む全クエン酸塩中で酵素活性の大半を喪失した一方で、ｐＨ７〜８のリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、活性を保持している。２５℃および５℃では、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝液の両者中の全ｒｈＨＮＳ製剤が活性の大半を保持した。ｐＨ３．０のクエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、より低い全体的活性値を有するように見える。リン酸塩における反復ｐＨ試験からの活性データを表１１および１２に概説する。ｐＨ８．０のｒｈＨＮＳ製剤が６５％活性を喪失したことを除いては、ｐＨ５〜７の全ｒｈＨＮＳ製剤が、５０℃で７日後に酵素活性の８４〜１００％を保持している。
例示的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図２および図３に示す。ｐＨ試験からの還元ゲルを図２に示すが、これはｐＨ３のクエン酸塩を含む製剤の断片化バンドを示している。４０℃で７日後のｐＨ８．０クエン酸塩緩衝液でいくらかの高ＭＷ凝集が示されたことを除いては、ｐＨ４〜８の全ての他の製剤は類似であり、約６０ｋＤａで主（単量体）バンドを示すのみである。図３は、ｐＨ試験からの非還元ゲルを示している。ここでもまたｐＨ３のクエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤で断片化を見ることができた。
これらの結果に基づいて、還元剤の存在または非存在は主バンドの位置に影響を及ぼさないので、ｒｈＨＮＳ天然二量体は主に非共有結合していることが明らかであった。しかしながら、かすかな１２５ｋＤａ二量体バンドが主に非還元試料で存在し、このバンドが共有結合した非天然二量体であることを示唆している。非天然二量体バンドは、４０℃試料よりもＩＬＣおよび２５℃試料で明白であった。
ｐＨ試験からのＤＳＣデータ
図４は、ＤＳＣにより決定されるクエン酸塩のｐＨ依存性熱安定性を示している。クエン酸塩中のｒｈＨＮＳの最高融解温度は、ｐＨ６．０で９０℃であった。リン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、ｐＨ６〜７で最大の熱安定性を示した。試験したｐＨ毎でｒｈＨＮＳの融解温度は、７０℃を超えた。
ｒｈＨＮＳ安定性へのイオン強度の影響
濁度および外観
ＯＤ３２０値の概要を表１３で以下に示す。経時的な試料の濁度の変化および値の温度依存性変化は観察されなかった。各時点で試料の外観は変化しないままであった。全試料は無色透明で目に見える粒子はないように見えた。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
表１４は、イオン影響試験からのＳＥＣ−ＨＰＬＣデータ概要を示している。５０℃で７日後、全製剤は、１６分ピークを除いてはほとんど変化しなかった。クエン酸塩緩衝液では、１６分ピーク面積割合は、０．１〜０．３％の間であり、ＮａＣｌレベルによる具体的な増加または減少傾向を有さなかった。しかしながら、リン酸塩緩衝液では、５０〜１５０ｍＭのイオン強度について約０．５％までの１６分ピーク割合の増加があった。より低いおよびより高いイオン強度で、１６分ピークは約０．１％まで下がった。
酵素活性
表１５は、５０℃で７日の加速条件下でのｒｈＨＮＳ安定性へのイオンの影響の活性データ概要を示している。クエン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は、加速条件下でイオン強度にかかわらず８〜３０％の活性しか保持しなかった。０〜３００ｍＭ ＮａＣｌと共にリン酸塩を含むｒｈＨＮＳ製剤は全て、加速条件下でより高い全体活性、４５〜７０％を示した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図６は、５０℃で７日後のイオン影響試験からのｒｈＨＮＳ製剤の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。その後の試験で、ｒｈＨＮＳを５分間沸騰させた場合に断片化は観察されなかったので、１０分間沸騰させた試料を使用してこれらのゲルを泳動させたところゲル上に見られる断片化は１０分の沸騰によるものであり得る。
０〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むクエン酸塩製剤および０〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸塩製剤は全て、６０ｋＤａに主モノマーバンドを示した。ｒｈＨＮＳ製剤の内部ロット標準（−８０℃で貯蔵）は、７日間５０℃で維持した試料よりも明白な断片バンドを示すように見えた。全体的には、イオン強度はＳＤＳゲル上のバンドパターンに影響を及ぼさなかった。
結論
この試験の結果は、製剤スクリーニングについての主要な安定性を示す分析法が酵素活性およびＨＰＬＣ−ＳＥＣであることを示している。ＤＳＣデータは、ｒｈＨＮＳがｐＨ６〜７で約９０℃のＴｍ値の最大熱安定性を有することを示した。クエン酸塩緩衝液中のｒｈＨＮＳは、全てのｐＨおよびイオン強度の加速条件下で有意な活性喪失を示し、クエン酸塩が許容できない製剤緩衝液であることを示唆した。リン酸塩についての結果は、かなり良く、ｐＨ６〜７の加速条件下で最大活性を保持した。さらに、１００〜１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸塩製剤は、加速条件下で最大の活性保持を示した。しかしながら、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの高分子量（１６分）ピークは、加速条件下、ｐＨ６〜８および５０〜１５０ｍＭのイオン強度で最大である。
１６分ピークの原因をより理解するための追加の製剤実験が進行中である。さらに、非緩衝食塩水製剤を含むリン酸塩製剤の安定性と、低タンパク質濃度対高タンパク質濃度の安定性を比較するための試験が進行中である。
実施例２：ＲＨＨＮＳのための液体製剤
この実施例の実験は、髄腔内送達を意図したｒｈＨＮＳ製剤の溶解度を最適化するよう設計した。本明細書に記載するように、髄腔内薬剤送達は、少量の注射液体量を要し、結果として、高濃縮タンパク質溶液が必要とされる。しかしながら、ｒｈＨＮＳは、典型的にはその溶解度に影響する、５．１〜６．５の範囲の等電点範囲を有する不均一電荷プロファイルを有する。本実施例の試験は、ｒｈＨＮＳ製品の溶解度へのｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の影響についての情報を提供する。
図７で分かるように、ｐＨおよび塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）の増加は、ｒｈＨＮＳ溶解度の増加をもたらした。ｒｈＨＮＳ天然状態を、変化する塩濃度（１４５ｍＭまたは３００ｍＭ）で製剤化したｒｈＨＮＳの分析用超遠心法（ＡＵＣ）により分析した。図８で分かるように、ｒｈＨＮＳは同種の分子を含み、ｐＨ７で１４５ｍＭ〜３００ｍＭの塩濃度で同じ構造を維持する。まとめると、これらの結果は、ＮａＣｌ濃度の増加がｒｈＨＮＳの溶解度を増加させることを示した。
高塩液体製剤（１５ｍｇ／ｍＬ ｒｈＨＮＳ、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭリン酸塩、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．０）およびスクロース含有製剤（１５ｍｇ／ｍＬ ｒｈＨＮＳ、２％スクロース、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭリン酸塩、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．０）を含む２種の液体製剤を同定してさらに試験した。
実施例３：ＲＨＨＮＳのための凍結乾燥製剤
この実施例の実験は、ｒｈＨＮＳのための凍結乾燥製剤および条件を最適化するよう設計した。特に、これらの試験は、凍結乾燥ケークの外観、ｒｈＨＮＳ酵素活性および凍結乾燥製品の化学的完全性を含む、製品の安定性への製剤の影響についての情報を提供する。
ｒｈＨＮＳを種々のリン酸塩ベースの凍結乾燥製剤に製剤化した。以下の製剤パラメータを試験した：（１）安定化剤：グルコース（０．５〜１％）もしくはスクロース（１〜１．５％）；および界面活性剤：ポリソルベート２０（０．０２〜０．００５％）。試験した全製剤に以下のパラメータを使用した：（３）１５ｍｇ／ｍＬ ｒｈＨＮＳ；（４）１４５ｍＭ ＮａＣｌ；（５）５ｍＭリン酸塩；（６）ｐＨ７．０。
例示的製剤を表１６の条件にしたがって凍結乾燥した。
グルコース含有製剤は、化学安定性が維持されるが（データ不掲載）、長い再構成時間（３０分超）を有することが認められた。
１％スクロースを含むｒｈＨＮＳ凍結乾燥製剤は、２〜８℃の１５ヶ月データおよび２５℃／４０℃の３ヶ月データ（表１７で以下に示す）を有し、ＳＥＣ、ＲＰおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで１％以下の変化を示した。
１．５％スクロースを含むｒｈＨＮＳ凍結乾燥製剤は、２〜８℃の１４ヶ月データおよび２５℃の３月ヶ月データ（表１８で以下に示す）を有し、ＳＥＣ、ＲＰおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで０．２％以下の変化を示した。
ケーク外観および完全性（例えば、メルトバック）について凍結乾燥ケークを観察した。図９Ａで分かるように、１．５％スクロースと共に製剤化した凍結乾燥ケークは、１．０％スクロースと共に製剤化したものよりもケーク収縮が大きかった。１．５％スクロースと共に製剤化した凍結乾燥ケークはまた、ＶｉｒＴｉｓ装置対ＬｙｏＳｔａｒ装置などの異なる凍結乾燥装置により敏感であった（図９Ｂ）。
以下の表１９に示すように、別の一連の実験により、スクロースの増加がケーク収縮の増大を生じさせることが確認される。
まとめると、これらのデータは、ｒｈＨＮＳ凍結乾燥製剤中のスクロース濃度の増加が、安定性増大ならびに凍結乾燥ケーク収縮増大と相関したことを示している。
再構成した凍結乾燥製剤を、Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｏｗ Ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＦＩ）により粒子の存在について観察した。例示的粒子画像を図１０に示す。図１０で分かるように、貯蔵後、１％および１．５％スクロースのいずれかを含む凍結乾燥製剤の再構成後に大きな粒子が観察された。
凍結乾燥前製剤を、０．２２μｍ濾過後の粒子の存在について観察した。図１１で分かるように、ポリソルベート２０（Ｐ２０）の存在が、０．２２μｍ濾過時にＰ２０がない場合に産生されるタンパク質様凝集剤を妨げた。したがって、Ｐ２０は、濾過中に粒子形成を妨げるおよび／またはｒｈＨＮＳタンパク質を保護するのに有効である。さらなる試験は、Ｐ２０の存在が、ｒｈＨＮＳ製剤中の凍結融解誘発粒子ならびに凍結乾燥誘発粒子の存在を減少させるのに有効であることを示した（データ不掲載）。
凍結乾燥条件
凍結乾燥サイクル条件を試験して、ｒｈＨＮＳ凍結乾燥製剤への影響を決定した。例えば、一次乾燥温度を−３８℃から−２０℃まで変化させ、酵素活性、ＳＥＣ、ＲＰおよびケーク外観によりｒｈＨＮＳ凍結乾燥製剤の安定性を決定した。これらの分析の例示的結果を以下の表２０に示す。
分かるように、−３８℃〜−２０℃の一次乾燥温度の範囲内で安定性プロファイルの有意な差異は観察されなかった。凍結乾燥ケーク外観は、−２０℃の一次乾燥温度でケーク収縮増大を示した。同様の結果が、１．２５％および１．０％スクロースを含む凍結乾燥製剤でも観察された（データ不掲載）。
実施例４．ヘパランＮ−スルファターゼの慢性髄腔内投与
本実施例は、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ；サンフィリッポ症候群）に特徴的な臨床像である神経症状を治療するために、髄腔内投与を用いて、組換えヒトヘパランＮ−スルファターゼ（ｒｈＨＮＳ）のようなリソソーム酵素を脳組織内に効率的に送達することができることを示すものである。本実施例に記載されている実験は、ｒｈＨＮＳの慢性ＩＴ投与において高い忍容性が認められ、脳、脊髄および肝臓で用量依存的な酵素活性が検出されたことを示している。
簡潔に述べれば、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ ＩＩＩＡ；サンフィリッポ症候群）に特徴的な臨床像である神経症状を治療するための、組換えヒトヘパランＮ−スルファターゼ（ｒｈＨＮＳ）の髄腔内（ＩＴ）製剤を開発した。ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者の平均年齢が４．５歳であることから、発達中の脳に対する影響を評価するためのｒｈＨＮＳに関するピボタルな毒性学試験を幼若カニクイザルにおいて行った。サルに髄腔内（ＩＴ）腰椎薬物送達装置を埋入し、隔週で短時間注入により投与し（１．５、４．５または８．３ｍｇ／投与のｒｈＨＮＳを６か月間；１２用量）、装置対照および溶媒対照には、ぞれぞれリン酸緩衝生理食塩水または溶媒を投与した。最後のＩＴ投与の３か月および６か月後に１群当たり８個体（雌雄それぞれ４個体）の剖検を行い（装置対照群は３か月後に剖検）、溶媒群および３つのｒｈＨＮＳ用量群の８個体を最後のＩＴ投与の１か月後に剖検した。ｒｈＨＮＳに関連する臨床兆候または肉眼的な中枢神経系の病変は観察されなかった。対照群に比べ、脳／脊髄を取り囲む髄膜／神経周膜において、脳脊髄液（ＣＳＦ）白血球、主として好酸球の一過性の増加と相関する極めて軽度のものから最小限の平均重症度の細胞浸潤が見られたが、最終投与の１か月後に大部分が消散した。これらの変化は、脳または脊髄の有害な形態学的変化を伴わなかった。脳、脊髄および肝臓において、平均ＣＳＦ中ｒｈＨＮＳレベルおよび組織中ｒｈＨＮＳ活性レベルが高くなるという用量依存的な傾向があるようであった。無毒性量は最高用量である隔週投与の８．３ｍｇ／投与であったが、このことは、ｒｈＨＮＳが８．３ｍｇ／投与よりも高い濃度を含めた各種濃度で髄腔内に安全に投与され得ることを示している。
サンフィリッポＡ疾患
ムコ多糖症ＩＩＩＡ型（ＭＰＳ ＩＩＩＡ；サンフィリッポＡ疾患）は、世界の約１００，０００に１人が罹患する稀なリソソーム蓄積症であり、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソーム異化作用に関与する外部スルファターゼであるヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）の機能の欠如または不全が原因で生じる（Ｎｅｕｆｅｌｄ ＥＦら，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２００１）ｐｐ．３４２１−３４５２）。この酵素がなければ、ニューロンおよびグリア細胞のリソソーム内にヘパラン硫酸ＧＡＧが蓄積するが、脳以外での蓄積は少ない。この疾患に特徴的な臨床像は中枢神経系（ＣＮＳ）の変性であり、この変性により、主要な発達段階がなくなるか、またはこれに達することができなくなる。進行性の認知低下から認知症および早期死亡に至る。
ｒｈＨＮＳのＩＴ送達
ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者の平均年齢が４．５歳であることから、発達中の脳に対する影響を評価するためのｒｈＨＮＳに関するピボタルな毒性学試験を幼若カニクイザル（種の選択はヒトとの遺伝的および解剖的類似性に基づいた）において行った。文献によると、ヒトに対応するサルの年齢は、３０〜４０か月の小児に対して７．６か月〜１２．１か月の範囲である（Ｈｏｏｄ ＲＤ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（２００６）ｐ．２７６）。この取組みの一部として、ｒｈＨＮＳのＩＴ腰椎投与を評価するために、幼若カニクイザルにおいて６か月間の毒性学試験を行った。以前の１か月齢幼若カニクイザルでの毒性試験から得られたデータを、６か月間反復投与による幼若サルでの試験の用量レベルの選択および計画の指針とした。今までに知られているデータに基づいて、これが幼若非ヒト霊長類でのＥＲＴの慢性ＩＴ投与に関する最初の試験である。
本試験では、約６〜９か月齢、体重０．８２〜１．８１ｋｇの５６匹の雄および５６匹の雌幼若カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を用いた。サルにＰＭＩ−Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＩＮ）のビスケットを毎日１５個与えた。水は、ろ過された自動給水システムによる自由摂取とし、採尿期間は水を与えなかった。到着時からサルをステンレス製ケージ内で２〜４週間、グループ（１ケージ当たり２匹）で飼育したが、３か月齢の個体はステンレス製ケージ内で１匹ずつ飼育した。試験期間中は、全個体を、温度と湿度が管理された、明期１２時間と暗期１２時間のサイクルの部屋で、ステンレス製ケージ内で１匹ずつ飼育した。
試験開始前に、全個体にＳＣポートおよびＩＴカテーテルを外科的に埋入した。手術前にコハク酸プレドニゾロンナトリウム（ＩＶ、３０ｍｇ／ｋｇ）およびフルニキシンメグルミン（筋肉内［ＩＭ］、２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。個体をＳＣ硫酸アトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）で前処置し、ＩＭケタミンＨＣｌ；８ｍｇ／ｋｇで鎮静させて挿管し、約１Ｌ／分の酸素および２．０％イソフルランで維持した。腰椎（Ｌ４、Ｌ５またはＬ６）の背側突起の上で切開を行い、先細ポリウレタンカテーテル（長さ２５ｃｍ、外径０．９ｍｍ×内径０．５ｍｍ、６個の側孔の直径が０．３３ｍｍ）を挿入するために、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５で半側椎弓切除術を行った。硬膜を小さく切開してカテーテルを挿入し、胸腰椎接合部の領域に向かって順方向に約１０ｃｍ進めた。チタン製ＳＣポートをＩＴカテーテルに装着し、ＳＣ組織に埋入した。Ｉｓｏｖｕｅ−３００（０．８ｍｌ；Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を用いた脊髄造影像により、適切なカテーテル留置を確認した。手術から回復させた後、個体に酒石酸ブトルファノール（ＩＭ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）およびセフチオフルナトリウム（ＩＭ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１日２回を２日間）を投与した。
本試験では、ｒｈＨＮＳを５ｍＭリン酸ナトリウム、１４５ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．００５％ポリソルベート２０を含むＩＴ製剤溶媒（ｐＨ７．０）に溶かして調製した。ｒｈＨＮＳのＥＯＷ投与を、約１１分間にわたる短時間注入、すなわち、６ｍＬ（４分）、次いで０．５ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による洗い流し（７分）で行った。溶媒対照群の個体には、ＩＴ製剤のみを投与し、ＤＣ個体にはＰＢＳ（ｐＨ７．２）をＩＴで投与した。
病的状態および死亡
ｒｈＨＮＳに関連する死亡または早期の屠殺はなかった。投与時または毎日の観察時に、ｒｈＨＮＳに関連する臨床兆候は見られなかった。投与時または投与後に観察された誤留置、掻痒、振戦および運動失調は、投与の数分後〜約４時間後までに消散し、これらはｒｈＨＮＳまたは溶媒に対する反応ではなく、容積に関連する反応であると考えらた。投与時および投与直後に観察された臨床兆候は、対照群（ＤＣおよび／または溶媒投与群）において同等の発生率で見られたが、用量反応の証拠は見られなかった。一般に、投与時の臨床兆候の発生率は、後の投与ごとに減少していった。ｒｈＨＮＳに関連する、体重、摂餌量、身体所見および神経所見の変化、またはＥＣＧもしくは眼科検査における変化は見られなかった。
臨床病理学
どのインターバル期間においても、ｒｈＨＮＳに関連すると考えられる血液学、血清化学、凝固または尿検査のパラメータの変化は見られなかった。
ＣＳＦの細胞計数および化学
投与の２４時間後に、ＤＣおよび０ｍｇ／投与群を含めた全群の平均ＣＳＦ白血球数に用量依存的な増加が見られた。投与した各用量で白血球数の全般的な増加が見られた。投与前に約半数の個体からＣＳＦを採取したところ、これらの影響は、前回の投与から２週間で軽減されることが示された。投与５の後に、４．５ｍｇ／投与および８．３ｍｇ／投与群のｒｈＨＮＳ投与雄において、白血球の増加に加え、投与前の平均に比べて群の平均ＣＳＦ中総タンパク質およびアルブミンの上昇（４〜５倍以下）が観察された（ＤＣおよび０ｍｇ／投与群に対してＰ≦０．０５）が、雌のｒｈＨＮＳ投与群ではそれほど明らかな傾向が見られなかった。
ｒｈＨＮＳ濃度および抗体解析
一般的に、血清中の平均ｒｈＨＮＳレベルは、全群の全時点において検出限界（ＬＯＤ）未満であった。ＤＣ対照および溶媒投与対照群の個体のＣＳＦ中ｒｈＨＮＳ濃度は、一般的に定量下限（ＬＯＱ）を下回っていた。統計解析は行わなかったが、ＣＳＦ中の平均ｒｈＨＮＳレベルが１．５、４．５および８．３ｍｇ／投与群において高くなるという用量依存的傾向があるようであった。投与前のＣＳＦの平均ｒｈＨＮＳレベルは、投与後のＣＳＦ中レベルよりも有意に低かった。試験終了時（主要剖検および回復後剖検）の６か月コホート（雌雄）における平均ＨＮＳ濃度を表２１にまとめる。所与の用量レベルにおいて、血清およびＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体レベルが試験を通して上昇し続けたにもかかわらず、ＣＳＦ中のｒｈＨＮＳの平均濃度は同じ範囲に維持されるようであった（図１２Ａ）。
６か月／回復コホートでは、試験したどの時点でも、装置対照群（ＰＢＳのみ）または溶媒群で血清またはＣＳＦ中に抗ＨＮＳ抗体が生じた個体はいなかった。１．５、４．５および８．３ｍｇ／投与群の全個体が、試験前（ＣＳＦ）および投与２の前に採取した血清およびＣＳＦ試料中の抗ＨＮＳ抗体に関して陰性（ＬＯＤ未満）の試験結果であった。試験の終わりまでに、全個体が血清中の抗ＨＮＳ抗体に関して陽性の試験結果となった。
１．５ｍｇ／投与および８．３ｍｇ／投与群の全個体、ならびに４．５ｍｇ／投与群の８個体中６個体が、１つ以上の時点でＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体に関して陽性の試験結果であった。４．５ｍｇ群の２個体で、剖検を含めたどの時点でも試料が採取されなかったため、これらの結果は、ｒｈＨＮＳを投与した全個体が抗体反応を生じたことを示すと思われる。
３つのすべての用量レベルにおいて、投与２の後に血清中の抗ＨＮＳ抗体濃度が検出され、投与４の後にレベルが顕著に増加した。統計解析は行わなかったが、血清中の抗体濃度が高くなるという用量依存的傾向があると思われ、試験終了までに、３つのｒｈＨＮＳ投与群間でレベルが同等になった（図１２Ｂ）。本試験期間を通して、血清中の抗ＨＮＳ抗体レベルは常にＣＳＦ中のレベルよりも高く（９〜２３６倍の血清中／ＣＳＦ中抗体濃度）、ＣＳＦ中濃度に対する血清中濃度で最も高い比（９８および２３６倍）は、投与の比較的初期（６および１０週目）に８．３ｍｇの用量レベルで見られた。
血清中の抗ＨＮＳ抗体濃度は、投与の初期（６週目〜１４週目）に、１．５ｍｇ、４．５ｍｇおよび８．３ｍｇ／投与レベルにおいて、それぞれ９倍、１６倍および１６倍に増加した。同じ期間でのＣＳＦ中抗体濃度は、１．５ｍｇ、４．５ｍｇおよび８．３ｍｇ／投与レベルにおいて、それぞれ３０倍、４１倍および５２倍に増加し（図１２Ｂ）、１か月間の無投与回復相の後でもかなりのレベルが維持されていた（表２２）。
抗ＨＮＳ抗体が現れたのは、血清中よりもＣＳＦ中の方が遅かった（図１２Ｃ）。血清中またはＣＳＦ中の抗体濃度の明らかな用量依存的な差は観察されず（試料数が少ないため統計解析は行わなかった）、雌雄間での抗体反応の差は見られなかった。
ＣＳＦ中に抗ＨＮＳ抗体が存在しても、ＣＳＦ中のｒｈＨＮＳの平均濃度は維持されるようであったが、このことは、血清およびＣＳＦ中に抗ＨＮＳ抗体が存在しても、ＩＴ投与されたｒｈＨＮＳの濃度レベルが変化しなかったことを示している。６か月間のｒｈＨＮＳ反復投与の６か月／回復コホートの解析は、３か月中間および６か月コホートの屠殺個体の抗ＨＮＳ抗体濃度が同等であることを示していた（図１２Ｃ）。
肉眼的および病理組織学的所見
全用量レベルにおいて（全屠殺間隔で、性別特異的に、または用量依存的であるというわけでないが）、脳（主として灰白質）、脊髄（灰白質および白質）、脊髄神経後根／神経節および三叉神経節（中用量雄のみ）の実質に好酸球浸潤（図１３）が見られた（図１３Ａ〜１３Ｅ）。浸潤は、髄膜／神経周膜の浸潤および／または組織実質内でのｒｈＨＮＳの存在（透過）に続発するものであるように見えた。炎症型の変化が多数見られたが、カニクイザルはｒｈＨＮＳの投与に対して忍容性があると思われ、どの浸潤も神経系実質の有害な形態学的変化に関連する、またはこれを引き起こすとは考えられなかった。具体的には、ｒｈＨＮＳ投与に関連するニューロン壊死／変性の証拠およびグリア反応が見られなかった。
脳および脊髄の灰白質における、主として好酸球による細胞浸潤に関連した小膠細胞症は、以前に行った１か月間の幼若サル毒性試験において比較的よく見られた。このような変化は、６か月間の試験の３か月目中間の屠殺ではあまり見られなかったが、このような反応の残存した証拠が６か月のコホートで見られた（図１３Ｆ）。ミクログリア細胞の反応は、一部の（通常、タンパク質ベースの）中枢に投与された（または中枢で反応する）被検試料に対する反応の比較的初期の事象であることが多い。好酸球浸潤は、ｒｈＨＮＳ投与個体のＣＳＦにおける好酸球数の増加と確かに相関していたが、有害反応を誘発するのに十分な数の細胞は存在しなかった。
全用量レベルにおいて、雌雄に関係なく、ほとんどのｒｈＨＮＳ投与群の脊髄神経後根／神経節で好酸球浸潤が観察された。各種神経系組織における浸潤は、髄膜／神経周膜の浸潤および／または組織実質内でのｒｈＨＮＳの存在（透過）により生じたものであるように見えた。回復後に屠殺した個体では、ｒｈＨＮＳに関連する影響は、一般に見られなかったか、または対照レベルまで減少していた。脊髄の小膠細胞症のような一部の変化は、回復期間の後に完全に消散していた。ｒｈＨＮＳに関連する変化は、脳または脊髄における有害な構造上の顕微鏡的変化を全く伴わないようであった。脳、脊髄または神経節のニューロン壊死は認められなかった。
脊髄中の神経線維変性および神経膠症は、ＩＴカテーテルの配置および／または存在に続発性であるように見えた。これらの変化は、対照とｒｈＨＮＳ投与群との間で比較的類似であった。脊髄神経根、シュワン細胞（末梢神経系のミエリン形成細胞）過形成および神経線維変性は、対照およびｒｈＨＮＳ投与サルの両方で存在した。これらの変化は、カテーテル配置時の１つまたは複数の脊髄神経根への損傷が原因であった。
ＨＮＳ酵素活性
６か月／回復コホートでは、溶媒投与群の脊髄および脳におけるｒｈＨＮＳ酵素活性（０．０〜０．１５４ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ）は、３か月中間コホートの組織で見られたレベル（０．０〜０．０１５４ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ）と同程度であった。脊椎での酵素活性レベルは、脳または肝臓で測定されたレベルよりも高く（腰椎では１桁分高かった）、４．５ｍｇおよび８．３ｍｇ／投与群が同等のレベルであった。脊髄スライスのｒｈＨＮＳ酵素活性は、１．５、４．５および８．３ｍｇ／投与群において、雄（図１４Ａ）でそれぞれ３．９〜１８．６、１３．１〜６７．１および３．６〜６９．２ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ、雌（図１４Ｂ）でそれぞれ１．８〜１６．２、４．５〜６１．２および２１．１〜６６．０ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇの範囲であった。１か月の回復期間後の脊髄組織では、酵素活性レベルが溶媒対照の数値と同じレベルまで戻っていた。
脳スライスでのｒｈＨＮＳ酵素活性は、１．５、４．５および８．３ｍｇ／投与群において、雄（図１４Ｃ）でそれぞれ０．０３〜１６．０、０．３０〜５５．７および０．１５〜２１．２ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ、雌（図１４Ｄ）でそれぞれ０．０４〜５．１、０．０〜１４．４および０．９〜３３．２ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇの範囲であった。回復後の脳組織では、酵素活性レベルが溶媒対照の数値と同じレベルまで戻っていた。
内因性のレベル（ＤＣ群）と比較した、脳の異なる領域における活性の変化倍数を図１５Ａに示す。表面の試料において分布が増加する傾向が認められたが、腰椎ＩＴ投与したｒｈＨＮＳが脳室周囲領域まで透過することが示された。
６か月／回復コホートでは、１．５、４．５および８．３ｍｇ／投与群において、肝臓における平均活性レベルが、雄でそれぞれ０．５０、２．４１および６．６５ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ、雌でそれぞれ１．０４、４．１５および７．６２ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇであった（図１５Ｂ）。溶媒対照個体のレベルは、雄で０．０８９ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇ、雌で０．０８３ｎｍｏｌ／時・タンパク質ｍｇであった。回復期間後、肝臓におけるｒｈＨＮＳ活性レベルは、全用量群でベースラインの対照レベルと同等であった。
免疫組織化学
３か月中間コホートおよび６か月／回復コホートにおけるボーラスＩＴ注射によるＣＮＳへのｒｈＨＮＳ送達の結果、免疫反応性の被検試料が脊髄および脳の軟膜クモ膜組織まで送達された。ｒｈＨＮＳでＩＴを投与した個体では、免疫反応性物質が、髄膜マクロファージおよび血管周囲マクロファージ内（脳／脊髄）に一貫してに存在し、隣接するグリア細胞および神経細胞集団内にばらつきながら存在していた。溶媒投与対照の個体（図１６Ａ）では染色が見られなかったことにより、ヒトＨＮＳに対する抗体の特異性が示された。一般的に、免疫反応性は用量依存的であった（すなわち、半定量的な段階付けスケールを用いて、免疫組織化学染色の一般的な用量依存的増加が認められた）。ボーラスＩＴによるＣＮＳへのｒｈＨＮＳ送達により、大脳皮質および小脳において陽性の免疫染色が生じた（図１６Ｂ〜１６Ｄ）が、免疫反応性は、尾状核／被殻領域、中脳、または脳橋もしくは髄質の深部領域で一貫して明らかというわけではなかった。ｒｈＨＮＳを投与した全個体の肝臓において（肝細胞ではなく、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞を含めた類洞壁細胞において）、免疫反応性が明らかであった。修理不可能なカテーテル漏れのため早期に屠殺した１匹の雌（４．５ｍｇ／投与群）では、免疫反応性が明らかではなかった。
１．５ｍｇ／投与群では、一部の残存した免疫反応性が明らかな肝臓および脳と脊髄の髄膜を除き、基本的に完全な回復が明らかであった。高用量（４．５および８．３ｍｇ／投与）では、免疫反応性強度および発生率が投与終了時よりも低かった。全用量レベルにおいて、１か月間の回復後に、脊髄、脳および肝臓のｒｈＨＮＳレベルが、溶媒投与対照で見られたレベルに近かった。
議論
本試験では、ＩＴで行った６か月間のｒｈＨＮＳのＥＯＷ送達では、一般に高い忍容性が認められた。体重、臨床状態、眼科検査／神経学検査／身体検査、ＥＣＧ、器官重量または器官の肉眼的外観の顕著な変化は観察されなかった。所見は、ごくわずかなものから軽度までの髄膜浸潤および硬膜外炎症を伴った、ＣＳＦの臨床病理における一過性の変化に限られていたが、これらは、回復期間後には、最高用量群を除く全群でほぼ完全に回復した。脳および脊髄全体にわたるｒｈＨＮＳの広範な分布が観察された。
ｒｈＨＮＳのＥＯＷでのＩＴ投与により、残存性の白血球浸潤およびアルブミン浸出を特徴とする炎症性応答が誘発され、これが投与の２４時間後および剖検時に認められた。特定の理論に拘束されることを望むわけではないが、これはおそらく、カテーテル先端付近のタイトジャンクションの変化に関連した、局所的な一過性のＢＢＢの不完全な開口により、白血球および血漿タンパク質がＣＳＦ内に侵入したことによるものであろう （Ｓｉｍａｒｄ ＪＭら，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００７）６，２５８−２６８；Ｓｔａｍａｔｏｖｉｃ ＳＭら，Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）６，１７９−１９２）。これは２つの要素、すなわち、１つは投与の方法または量に関連する要素、もう１つはタンパク質のＩＴ投与に関連する要素の結果であり得る。
ＢＢＢ透過性の一過性の変化（投与の２４時間後の剖検時の各用量群および対照の間に有意な差はなかった）は、いかなる臨床兆候も伴わなかった。
平均ＣＳＦ中ｒｈＨＮＳレベルが高くなるという用量依存的傾向があると思われたが、所与の用量レベルにおいて、血清中およびＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体レベルの増加にもかかわらず、ＣＳＦ中のｒｈＨＮＳの平均濃度は同じ範囲で維持されるようであった。
ｒｈＨＮＳを投与した幼若ザルの脳および脊髄において、ごくわずかなものから最小限までの平均重症度の髄膜の細胞浸潤が観察された。この顕微鏡的変化は溶媒投与対照でも認められ、一部の反応がＩＴカテーテル留置および外来タンパク質に対する非特異的炎症性応答に関連していたことを示している。特にＣＮＳに浸透する生物製剤／タンパク質をＩＴ内に導入すると、ほとんどの場合、ある程度の炎症性応答を誘発し（Ｈｏｖｌａｎｄ ＤＮら，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）３５，１０１３−１０２９；Ｂｕｔｔ ＭＴ，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１）３９，２１３−２１９）、隣接する組織に損傷を与えるだけの数が存在すれば、有害作用を示し得る。しかし、本試験では、これらの細胞（主として好酸球）は、組織の反応／組織への浸透のマーカーになると思われ、有害反応と見なすのに十分な量では見られなかった。ｒｈＨＮＳに関連する変化は、脳または脊髄における有害な構造上の顕微鏡的変化を伴わないようであった。脳、脊髄または神経節のニューロン壊死は認められなかった。
神経線維変性、カテーテル管線維症および脊髄の圧縮を含む、いくつかのサルにおける薬剤送達装置に関連した脊髄の後脊髄路の変化があった。これらの変化のいずれも、ＩＴカテーテルの近くに生じたという点でｒｈＨＮＳに関連するとみなされなかった。ＩＴ腰椎薬剤送達装置は、ヒトより小さいＩＴ空間を有する幼若サルでのＩＴ埋め込み用に特別に設計されなかった。ＩＴ試験における対照（装置および／または生理食塩水投与）動物からの顕微鏡評価データのレトロスペクティブ分析は、いくらかの最小限の髄膜浸潤、ならびにカテーテル管関連炎症、線維症および神経膠症、ならびに脊髄神経線維変性が見られると結論づけた（Ｂｕｔｔ ＭＴ、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１）３９、２１３〜２１９）。
抗被検試料抗体の評価は、被検試料のクリアランスまたは生体内分布に対する中和抗体または結合抗体による潜在的な影響を理由に、毒性試験の重要な側面である（Ｐｏｎｃｅ ＲＰら，Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００９）５４，１６４−１８２）。本試験では、３か月中間コホートおよび６か月コホートの脳および脊髄において、用量依存的なおよび定量的に同様のレベルのｒｈＨＮＳ酵素活性が認められ、また血清およびＣＳＦ中の抗ＨＮＳ抗体レベルの増加にもかかわらずＣＳＦ中のｒｈＨＮＳ平均濃度が同じ範囲に維持されるようであったが、本発明者らは、中和活性が見られないと結論づけた。
脊髄、脳および肝臓において、ｒｈＨＮＳ酵素活性のレベルが高くなるという用量依存的傾向が見られるようであったが、そのレベルは、脊髄の腰部領域では注射部位付近が最も高く、脳では均一であり、また吻側から尾側にかけて、および右半球と左半球の間で有意差はなかった。６か月コホートの脳および脊髄組織では、３か月中間コホートに比べて、ｒｈＨＮＳ蓄積の証拠が認められなかった。表面試料では分布が増加する傾向が認められたが、腰椎ＩＴ投与したｒｈＨＮＳは深部の脳室周囲領域まで浸透した。肝臓でのｒｈＨＮＳ酵素活性は、ｒｈＨＮＳがＩＴ送達後に全身に再分布することを示していたが、肝臓では、ピボタルな毒性試験における臨床病理パラメータおよび解剖病理パラメータの評価により、ｒｈＨＮＳに関連する有害作用は観察されなかった。
全般的に、免疫組織化学の結果は、脊髄および脳の軟膜クモ膜髄膜、ならびに髄膜に隣接する神経組織（ニューロン、グリア細胞）において用量依存的な免疫反応性が観察されたという点で、組織酵素活性を裏付けるものであった。ボーラスＩＴ注射または短時間ＩＴ注入後に、大脳および小脳の灰白質への良好な浸透が見られた。視床／視床下部の大脳基底核もしくは中心領域、中脳または脳橋／髄質のような深部構造では、免疫反応性は明らかではなかったが、酵素活性の結果は、腰椎ＩＴ投与したｒｈＨＮＳが深部の脳室周囲領域に浸透したことを示している。したがって、免疫組織化学は、被検試料の生体内分布の検出に関しては感度の低い手法であるのかもしれない。免疫反応性は、肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞および内皮細胞（食作用が可能な細胞）では明らかであったが、実質細胞（肝細胞）では明らかではなかった。
幼若ザルにおける６か月間のＩＴ反復投与の毒性試験に関する６か月／回復コホートの解析は、脊髄、脳および肝臓における生存中パラメータ、臨床病理および解剖病理、ＣＳＦおよび血清中のｒｈＨＮＳおよび抗ＨＮＳ抗体の濃度ならびにｒｈＨＮＳの分布／細胞内局在を含めたｒｈＨＮＳに関連する変化が、３か月中間屠殺および６か月屠殺の個体において同等であることを示していた。回復後屠殺の個体では、ｒｈＨＮＳの影響が見られなかったか、または有意に減少していた。したがって、６か月幼若ザルにおける試験の無毒性量は、最高投与量の８．３ｍｇ／投与であった。
ＣＳＦの細胞充実度およびタンパク質濃度の変化をモニターすることは、病理組織学的評価で認められる形態学的変化の信頼できる関連要素であると考えられ、ｒｈＨＮＳによりＩＴで治療した患者において有用であり得る。これらの変化は、ＩＴ投与したタンパク質に対する予想された反応であると考えられ、回復期間後に大部分が消散した。動物モデルによるこれらのデータは、リソソーム蓄積症の神経症状の治療ストラテジーとしてＩＴ療法を追求するための確信を与えるものである。この幼若非ヒト霊長類での毒性学試験は、ＩＴ腰椎薬物送達装置によりｒｈＨＮＳを小児患者に投与することの実現可能性および忍容性を示している。有害なＣＮＳ病理および有害な臨床兆候が見られなかったことは、最近の試験医薬品の書類承認を支持し、また、ＩＴ投与したｒｈＨＮＳがサンフィリッポＡ症候群のＣＮＳ症状を安全かつ効果的に治療し得ることを示すものであった。
本実施例に記載されている各種実験で使用された材料および方法の例を以下に記載する。
試験計画およびｒｈＨＮＳ投与
サルを無作為に５つの処置群に分けた。群１には処置を施さず（埋植物装置対照［ＤＣ］、ポートおよびカテーテル）、溶媒も被検試料も投与しなかった。群２〜５には、０、２．５、７．５または１３．８ｍｇ／ｍｌのｒｈＨＮＳを０．６ｍＬ（すなわち、０、１．５、４．５または８．３ｍｇの総用量）を、ＥＯＷでＩＴにより投与した。３か月目に４個体／性別／群の剖検行い（中間剖検；６回目の投与の２４時間後）、投与６か月目に４個体／性別／群（３か月目に剖検するＤＣ群を除く）の剖検を行い（主要剖検：１２回目の投与の２４時間後）、１か月間の回復期間終了時に残りの４個体／性別／群の剖検を行った。剖検時に、選択した組織を採取し、処理して、顕微鏡で観察した。
ｒｈＨＮＳを５ｍＭリン酸ナトリウム、１４５ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．００５％ポリソルベート２０（ｐＨ７．０）からなるＩＴ製剤溶媒に溶かして準備した。ｒｈＨＮＳの隔週投与を、約１１分間にわたる短時間注入、すなわち、６ｍＬ（４分）、次いで０．５ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による洗い流し（７分）で行った。溶媒対照群の個体には、ＩＴ製剤のみを投与し、ＤＣ個体にはＰＢＳ（ｐＨ７．２）をＩＴで投与した。
臨床評価
臨床兆候および病的状態および死亡の観察を、最初の投与から始めて少なくとも１日２回記録した。手術前、手術当日、試験期間中の週１回および剖検時に体重を測定した。摂餌量を、手術前から始めて毎日モニターした。試験開始前、試験期間中の毎月および剖検前に身体検査（心拍数、呼吸、体温、聴診、歩行運動、気性、腹部触診、リンパ節および全般的な外観）および神経学的検査（意識のレベル、追跡検査）を行った。運動機能、大脳反射（瞳孔反射、瞬目反射および角膜反射）および脊髄反射（足感覚反射、膝蓋腱反射、皮膚反射、固有感覚反射および尾部反射）も評価した。最初のｒｈＨＮＳ投与前および中間剖検（３か月）または主要剖検（６か月）の前の週に、心電図検査（ＥＣＧ；リードＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）および眼科検査を行った。サルをケタミンＨＣｌ（ＩＭ、８ｍｇ／ｋｇ）で鎮静させ、眼を１％トロピカミドで散大させて、倒像検眼鏡による眼科検査を行った。
臨床病理学
血液試料を、試験開始前、ＩＴ投与１、３、５、７、９および１１の後、回復期中間および剖検時に、血液学および血清化学用に絶食個体から採取した。尿試料を、投与前、投与期間および回復期間の月１回、ならびに剖検前に受け皿から採取した。全細胞計数および化学分析用のＣＳＦ試料を、手術時、およびＩＴ投与１、３、５、７、９、１１の２４時間後、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取したが、カテーテルの部分的な閉塞により試料が採取されない場合もあった。予想を上回るＣＳＦ白血球数が認められたため、３か月投与の５つのＣＳＦ試料は、投与前に各群の半数の個体から、また投与の２４時間後に残りの個体から採取した。投与直前にＣＳＦの量をあまり変化させないように、投与前の試料採取を投与の少なくとも１日前に行った。６か月個体および回復個体では、全細胞計数および化学分析用に、ＣＳＦを投与前に各群の半数の個体から、また投与の２４時間後に残りの個体から採取した。閉塞によりカテーテルから試料が採取されない個体では、剖検時に脊椎穿刺（大槽）を行った。
ｒｈＨＮＳ解析
ｒｈＨＮＳ解析用の血液試料を、ＩＴ投与２、４、６、８、１０、１２の前および２４時間後、回復期中間、および剖検時に末梢静脈から採取した。ＣＳＦ試料を、ＩＴ投与２、４、６、８、１０、１２の前および２４時間後、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取した。ｒｈＨＮＳ濃度を酵素結合免疫吸着測定により決定した。捕捉抗体はポリクローナルウサギ抗ＨＮＳ ＩｇＧ、検出抗体は同じウサギ抗ＨＮＳ ＩｇＧの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートであった。ＬＯＤは０．２２ｎｇ／ｍＬであったため、ＬＯＱは０．６６ｎｇ／ｍＬと算出された。血清およびＣＳＦ試料を１：１００および１：５希釈で二重反復によりスクリーニングし、検量曲線の上限を超えた試料はさらに希釈して再試験した。
抗ＨＮＳ抗体解析
抗体解析用の血液を、ＩＴ投与２、４、６、８、１０、１２の約１週間前、回復期中間、および剖検時に末梢静脈から採取した。抗体解析用のＣＳＦ試料を、手術時に、およびＩＴ投与２、４、６、８、１０、１２の約１週間前、回復期中間、および剖検時に腰椎カテーテルから採取した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））技術の電気化学発光ブリッジ試験を抗ＨＮＳ抗体の検出に用いた。このアッセイは、任意の種の抗ＨＮＳ抗体およびすべての免疫グロブリンアイソタイプのための一般的な高感度のスクリーニング方法である。ＬＯＤは５ｎｇ／ｍＬであり、試料を１：２０希釈で二重反復によりスクリーニングし、有効な１００ｎｇ／ｍＬのアッセイ感度が得られた。検量曲線の上限を上回った試料はさらに希釈して再試験した。
剖検および組織標本作成
最後のＩＴ投与の２４時間後（主要剖検）または１か月間の回復期間の終了時（回復後剖検）に完全剖検を行った。全個体をケタミンＨＣｌ（ＩＭ、８ｍｇ／ｋｇ）で鎮静させ、イソフルラン／酸素混合物下で維持し、ヘパリンナトリウム（２００ＩＵ／ｋｇ）のＩＶボーラス投与を行った。生理食塩水に溶かした室温の０．００１％亜硝酸ナトリウムにより、２００ｍｌ／分の速度で１２分間（約２４００ｍｌ）、左心室から還流を行った。採取後、組織試料を、病理組織学検査／免疫組織化学解析用には１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、ｒｈＨＮＳ活性の解析用には、ドライアイス上で凍結させて−６０℃以下で保管した。
脳マトリックス（ＭＢＭ−２０００Ｃ、ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｅｎ、ＭＩ）で脳を３ｍｍの冠状スライス厚に切った。最も吻側のスライスをスライス１として、スライスに番号を付した。スライス１、４、７、１０、１３および１６を組織病理用に処理し、スライス２、５、８、１１、１４および１７（入手できれば）を免疫組織化学用に処理した。スライス３、６、９、１２および１５をｒｈＨＮＳ活性の解析用に凍結させた。脊髄（頸部、胸部および腰部）を１ｃｍの切片に切った。最初のスライスと、そこから２枚おきのスライスを病理組織学的評価用に処理し、２番目のスライスと、そこから２枚おきのスライスを免疫組織化学解析用に処理した。３番目のスライスと、そこから２枚おきのスライスをｒｈＨＮＳ解析用に凍結させた。髄腔内カテーテルの先端部を含むスライス（スライス０）がホルマリンで固定され、組織病理に関して解析されるように、スライスの配分を調節した。約５ｇの肝臓の重複試料を２つの別々の葉から採取してｒｈＨＮＳ解析用に凍結させ、約５ｇの追加の試料を免疫組織化学解析用に固定した。
組織病理学
脳、脊髄、脊髄神経後根／神経節、坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経、全組織リスト（この種でのこの期間の前臨床薬物安全性試験に典型的なもの）およびあらゆる肉眼的病変を、剖検時に全個体から採取した。全体的な顕微鏡評価用に、組織切片をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（以下に記す特殊なすべての染色／包埋法に加えて）で染色した。
パラフィンブロックで作成した装置対照群、溶媒対照群および高用量群個体の脳切片を、フルオロ−Ｊａｄｅ Ｂ（神経変性の評価の感度を増強する染色）およびＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ銀（軸索、樹状突起および神経フィラメントを直接可視化することができる処理）で染色した。フルオロ−Ｊａｄｅ Ｂで染色したスライドを、フルオレセインイソチオシアネートフィルターキューブを用いて、蛍光下で調べた。
脊髄を連続的に薄切し、カテーテル先端の位置の切片を含めた頸部、胸部および腰部で横断切片および斜位切片を切り（各レベルで１枚のスライスを調べた）、馬尾領域からさらに横断切片を切った。脊髄神経後根および神経節（中頸部、中胸部および中腰部）を処理して調べた。末梢神経（坐骨神経、脛骨神経および腓腹神経）を縦方向に薄切してパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。横断切片をオスミウムで前固定してＳｐｕｒｒ樹脂に包埋し、薄切して（２μｍ）、トルイジンブルーで染色した。装置対照群、溶媒対照群および高用量群の脊髄の連続切片、ならびに脊髄神経後根および神経節をＢｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ銀で染色した。また、これらの群の脊髄切片を、アストロサイトとその突起を直接可視化することができる免疫組織化学染色である抗グリア線維性酸性タンパク質でも染色した。
定量分析用の組織抽出物の調製
凍結させた脳スライス３、６、９、１２および１５を、左半球と右半球に分割して分けた。各半球の表面から４ｍｍを測って表面組織を採取し、残りの組織を深部組織とした。存在すれば（例えば、スライス６および９が）、さらに脳室周囲の試料を冠状スライスから切り取った。脳の半分（右側）だけを処理した（左側は凍結させたままであった）ため、薄切により得られたのは、スライス１枚当たり２つ〜３つの試料、すなわち、右側表面、右側深部および存在すれば右側脳室周囲（すなわち、脳室深部；Ｖｄｅｅｐ）であった。小脳および脳幹組織が存在すれば、半球を分割する前に分離して別に処理した。これと同様に脊髄切片を処理し、重量を量り、ホモジナイズした。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１％ ＩｇｅｐａｌにＡｌｐｈａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤微小錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を加えて調製した溶解緩衝液（１ｍｌ／０．２５組織ｇ）中、ＴｅｅｎＡ Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ａチューブまたはポリプロピレン製コニカルチューブを用いて組織試料をホモジナイズした。Ｆａｓｔｐｒｅｐ−２４自動ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）またはＰｏｗｅｒＧｅｎ Ｍｏｄｅｌ １２５動力付きホモジナイザー（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋｅｎｎｅｓａｗ、ＧＡ）で試料を４０秒間処理した。ホモジナイズした後、試料をエタノール／乾燥氷浴および３７℃の水浴を用いた５回の凍結融解サイクルに供し、次いで、４℃での遠心分離により組織破片を沈殿させ、上清をアッセイまで−８０℃で保管した。特異的基質（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−スルホグルコサミニド）を用いて、２段階の蛍光定量アッセイによりｒｈＨＮＳ活性を決定した。
免疫組織化学のための組織の処理および染色
ホルマリン固定した厚さ３ｍｍの各個体の冠状脳スライス（スライス番号２、５、８、１１、１４および１７）６枚に、吻側から尾側に向かって１〜６までの番号を付した。一般に、スライス１〜４には基底核／視床／中脳および大脳が、尾側の２枚のスライスには小脳および脳幹（延髄）組織が含まれていた。脳、脊髄および肝臓の切片（Ｈ＆Ｅ染色および各種特殊な染色で用いたものと同じパラフィンブロックのもの）を、ｒｈＨＮＳに対して免疫組織化学的に染色した。特異的マウスモノクローナル抗体（クローン２Ｃ７；Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）を用いて、ＩＴ投与したｒｈＨＮＳの細胞内への取込みを検出し、この試薬により、内因性のカニクイザルｒｈＨＮＳとの交差反応性がないことが示された。陰性対照は無関係なマウスＩｇＧを用いて行った。脱パラフィンしたスライドを、一次マウス抗ＨＮＳ抗体とともに２〜８℃で一晩インキュベートした。二次ヤギ抗マウスビオチン化免疫グロブリンＧを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。アビジン／ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を加えて、３０分間インキュベートした。スライドをペルオキシダーゼ基質のジアミノベンジジン溶液中、所望の染色強度になるまでインキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色した。
統計解析
体重、体重変化、摂餌量、呼吸数、体温、心拍数、ＣＳＦ細胞計数、ＣＳＦ化学、臨床病理学データ、尿データ、ならびに絶対および相対器官重量を、一元配置分散分析、ならびにＤｕｎｎｅｔｔ検定による装置対照および溶媒対照群と各ｒｈＨＮＳ投与群との比較により解析した。さらに、２つの対照群を統計解析により相互に比較した。解析は、両側５％および１％の有意性レベルであった。全データを平均±標準偏差で表す。
実施例５：ヘパランＮ−スルファターゼの生体内分布および薬物動態試験
本実施例の実験は、ラットにおけるｒｈＨＮＳの静脈内または髄腔内単回投与（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）後のｒｈＨＮＳの組織分布を決定するために計画された。中でも例えば、これらの実験の目的は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）を用いてラットにおけるｒｈＨＮＳの生体内分布（ＢＤ）特性を特徴付けること；異なる経路（ＩＶまたはＩＴ）および異なる用量（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）で投与したときのｒｈＨＮＳの分布パターンを比較すること；ならびに上記投与レジメンでの各対象器官におけるｒｈＨＮＳの薬物動態特性を決定することであった。
ラットにおける１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの１２４Ｉ−ＨＮＳ静脈内（ＩＶ）または髄腔内（ＩＴ）単回投与後の１２４Ｉ−スルファミダーゼ（ｒｈＨＮＳ）の薬物動態（ＰＫ）および生体内分布（ＢＤ）プロファイルを組織ＰＥＴ画像法により調べた。最初の２０分間の動態像ならびにＩＶまたはＩＴ投与の０．０５（ＩＴ投与のみ）、１、２、４、８、２４、４８、９６および１９２時間後の静態像から、対象領域における放射活性−時間のデータ得た。
４つの各群（１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ ＩＴ、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶおよび１０ｍｇ／ｋｇ ＩＴ）の４匹のラットを本試験に用いた。ＩＴ投与後に頭部、脳（脳脊髄液、ＣＳＦを含む）、脊椎および肝臓領域における放射活性−時間のデータを、またＩＶ投与後に血液、脳（ＣＳＦを含む）、肝臓、腎臓、心臓（肺を含む）および皮膚における放射活性−時間のデータを測定した。データをヨウ素１２４の崩壊半減期（１００．２時間）により補正し、対象領域における注射量（％ＩＤ）または画像化した組織１グラム当たりの％ＩＤ（％ＩＤ／ｇ）の百分率として表した後、体重２００グラムに対して正規化した。対象領域における投与されたタンパク質総量（ｕｇ）または濃度（μｇ／ｇ）を、対応する％ＩＤまたは％ＩＤ／ｇのデータから計算した。
ＩＴ投与後の最初の２０分間は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいて、頭部領域のｒｈＨＮＳの総量が０．００２／分〜０．０１１／分（λｚ）の一定速度で減少した。本報告では、２つの用量間および２つの投与経路間での薬物動態の比較にクリアランス速度および分布容積を用いなかった（詳細な情報に関しては結果の節を参照されたい）。脳の一定の消失速度は、２つの試験用量で基本的に同じ（λｚ：１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ０．０１６／時と０．０１４／時）あり、ＩＴ投与の１９２時間後までの静態像による決定された半減期は、同じ約２日であった。ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−ｌａｓｔまたは０−ｉｎｆｉｎｉｔ）の値は、投与量に比例していた。これらのＩＴ単回投与レジメンで投与した１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲において、直線的なＰＫ挙動が示された。脊椎の近位部分から遠位部分にかけて、濃度勾配が両用量レベルで観察された。
ＩＴ投与後、肝臓のｒｈＨＮＳタンパク質は、１ｍｇ／ｋｇのｒｈＨＮＳでは９６時間後まで、１０ｍｇ／ｋｇのｒｈＨＮＳでは１９２時間後まで測定可能であった。肝臓中の濃度は、１ｍｇ／ｋｇでは２時間後に、１０ｍｇ／ｋｇでは７時間後にピークに達した。１ｍｇ／ｋｇにおける消失は０．０３０±０．０１１／時（平均λｚ）であり、１０ｍｇ／ｋｇにおける消失（λｚ：０．０１７±０／時）との間に有意差はなく（ｐ＝０．１０）、対応するｔ１／２（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ２８時間と４２時間）を有していた。
ＩＶ投与後の肝臓、腎臓、心臓および皮膚における消失半減期は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ、肝臓が４７±１０時間および３８±１３時間、腎臓が５４±２５時間および２９±１６時間、心臓が３６±１５時間および４２±１９時間、皮膚が４０±２１時間および３１±１３時間であったのに対し、脳における半減期は７１±２３時間および６０±５３時間であった。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＣｍａｘの平均値は、１ｍｇ／ｋｇでは９．６μｇ／ｇ、０．３０μｇ／ｇ、０．２５μｇ／ｇ、０．２２μｇ／ｇおよび０．０８μｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｋｇでは１３２μｇ／ｇ、７．９μｇ／ｇ、３．９μｇ／ｇ、３．７μｇ／ｇおよび１．８μｇ／であった。各個体のＣｍａｘ値を用量に対して正規化すると、１０ｍｇ／ｋｇのＣｍａｘ／投与の値は、上記すべての器官で１ｍｇ／ｋｇの値よりも有意に高かった（ｐ値のほとんどが０．０５未満、肝臓ではｐ＝０．０６）。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＡＵＣｌａｓｔの値は、１ｍｇ／ｋｇでは５２５時間・μｇ／ｇ、１６時間・μｇ／ｇ、１４時間・μｇ／ｇ、９時間・μｇ／ｇおよび７時間・μｇ／ｇであり、１０ｍｇ／ｋｇでは６７４７時間・μｇ／ｇ、２７６時間・μｇ／ｇ、１８３時間・μｇ／ｇ、２０１時間・μｇ／ｇおよび８６時間・μｇ／ｇであった。正規化後の１０ｍｇ／ｋｇにおけるＡＵＣｌａｓｔ／投与の値は、皮膚では１ｍｇ／ｋｇの値よりも有意に高く（ｐ＜０．０１）、心臓ではわずかな差が見られ（ｐ＝０．０６）、肝臓、脳および腎臓では有意な差がなかった（ｐ値はすべて０．３４を上回った）。
同じ用量のｒｈＨＮＳを注射した場合、髄腔内投与では静脈内投与よりも３ｌｏｇだけ大きい脳曝露量が得られた。脳における消失半減期は、ＩＴでは２日、ＩＶ投与では３日であった。しかし、ＩＴ投与後の肝臓の曝露量は、同じ用量のｒｈＨＮＳでＩＶ投与後の曝露量と同程度であった。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＩＴ／ＩＶによる肝臓での曝露量（ＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔ）は、０．４〜１．２の範囲であった。
実験計画
中枢神経系（ＣＮＳ）は大部分のリソソーム蓄積症に対して弱く、サンフィリッポ（ムコ多糖症ＩＩＩ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）およびハンター症候群のようないくつかのタイプの上記疾患では重度の損傷を受ける。本明細書に記載されているように、末梢投与した場合は血液脳関門を透過しにくいため、酵素タンパク質をＣＮＳ内への直接投与することにより、中枢神経組織での酵素タンパク質の濃度が増加し、さらにその治療効果が増強され得るということが考慮される。本試験では、異なる用量レベルで髄腔内（ＩＴまたは大槽）投与を調べてＩＶ投与と比較した。
ＰＥＴは非侵襲性の反復可能な定量技術であり、対象器官における薬物濃度の経時的な動的変化がわかる。標的器官（血液循環中以外の活性部位）における動的な濃度−時間のデータは有用であり、投与薬物の生物活性に直接関連するものである。さらに、動物でのＰＥＴ試験から得られた組織曝露量に関する情報を、ヒトでの初回投与量の選択の指針として利用することができる。
材料および方法
被検試料
ｒｈＨＮＳ濃度が２０ｍｇ／ｍｌのヘパリンＮ−スルファターゼ（ｒｈＨＮＳ）を、１４５ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で調製した。この材料をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、９９．９％が二量体であるヘパリンＮ−スルファターゼを９８．７％含有させた。ｒｈＨＮＳをヨウ素１２４で標識した。
試料入手源
放射活性画像を、１２４Ｉ−Ｈ−Ｎ−スルファターゼを１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでＩＶおよびＩＴ投与した後のラットから得た。
動物
１６匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入し（１９０±６０ｇ、ｎ＝１６）、４群（ｎ＝４）に分けた。上記の各ラット群（全４群）に対し、異なる用量（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）で単回のＩＶまたはＩＴ注射を行った。用量および注射量を、各個体の体重に基づき個々に調節した。２つのＩＶ処置群では、３５ｍｇ／ｋｇの用量のペントバルビタールナトリウムのＩＶ注射により鎮静化を行った。静脈内投与を、尾静脈からボーラス注射で行った。２つのＩＴ処置群では、５０ｍｇ／ｋｇの用量でペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与してマウスを麻酔した。髄腔内投与を、大槽レベルで環椎後頭膜から１分間にわたって行った。実際に投与された放射活性をＰＥＴにより測定し、注射量として用いた。
実験方法および／またはアッセイ方法
ＩＶ注射後に心臓（肺を含む）、肝臓および腎臓の領域において、ＩＴ投与後に頭部領域において、最初の２０分間の動態像（２分ごと）を２つ用量で得た。投与の０．０５（ＩＴ群のみで入手）、１、２、４、８、２４、４８、９６および１９２時間後に、ＩＶ処置群では脳（脳脊髄液ＣＳＦを含む）、肝臓、腎臓、心臓（肺を含む）、筋肉、皮膚および骨を含む領域において、ＩＴ処置個体では頭部、脳（ＣＳＦを含む）および肝臓の領域において静態像を得た。画像を再構築して、３つの身体断面を１つの画像に融合した。
データ解析
ＰＥＴデータを１ｍＬ当たり（液体）または１ｇ当たり（組織）のナノキュリー（ｎＣｉ）数で表した。静態像での脳、肝臓、腎臓、骨格筋、胃、心臓（肺を含む）および皮膚領域の相対活性を得た。ＩＴ注射した個体の頭部または脳領域全体の絶対活性を得た。ＩＴ注射した個体の脊柱１ミリメートル当たりの放射活性を、３つの選択した断面；近位（頸部）、中位（肝臓上端の背部）および遠位（タンパク質を含む区画の遠位端から１ｃｍのところ）の脊椎において決定した。
全データを１２４Ｉの崩壊半減期（１００．２時間）により補正し、外部で測定された活性による１２４Ｉ源の較正に基づく有効な位置合せ対して正規化した。次いで、データを全領域（頭部および脳）の注射量（％ＩＤ）または組織１グラム当たりの％ＩＤ（％ＩＤ／ｇ）の百分率として表した後、体重２００グラムに対して正規化した［データの正規化：（％ＩＤまたは％ＩＤ／ｇ）／個体体重×２００］。各群４個体しか使用しなかったため、正規化を導入してデータのばらつきを低減した。
本試験では、各個体に注射したタンパク質投与量を用いて、ｒｈＨＮＳタンパク質の濃度または量を以下のように計算した：タンパク質濃度（μｇ／ｇ）＝（％ＩＤ／ｇ）×（注射量のｍｇ／ｋｇ×１０００×０．２）；対象領域における投与タンパク質の総投与量（μｇ）＝％ＩＤ×（注射量のｍｇ／ｋｇ×１０００×０．２）、ここで、注射量は１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇであり、０．２は体重に対する正規化係数である。４つの各群の個々の非コンパートメントデータに基づき、群の各ＰＫパラメータの平均および標準偏差を計算した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行って、λｚ、ｔ１／２、ＣｍａｘおよびＡＵＣの値を２つの試験用量間および２つの投与経路間で比較した。統計的有意性は、ｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）であることと定めた。
結果
下の表、図およびＰＫ解析中のｒｈＨＮＳの量（μｇ）または濃度（μｇ／ｇ）を、注射したタンパク質投与量（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）と、対応する％ＩＤまたは％ＩＤ／ｇの値とを乗じることにより計算した。
１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での１２４Ｉ−ＨＮＳによる髄腔内処置
動態像から得られた頭部領域での投与タンパク質の量（μｇ）を、時間の関数として図１７にプロットした。静態像から得られた脳領域での濃度（μｇ／ｇ）を、時間の関数として図１８にプロットした。静態像から得られた、脳および脳領域内の注射したタンパク質の総量（μｇ）を、時間とともにそれぞれ図１９および図２０にプロットした。近位、中位および遠位脊椎の濃度−時間曲線（μｇ／ｍｍ）を図２１〜図２３に示した。図２４は、肝臓中のｒｈＨＮＳ濃度（μｇ／ｇ）の変化を、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでの１２４Ｉ−ＨＮＳのＩＴ投与後の時間とともに示したものである。
総量−時間（μｇ）または濃度−時間（μｇ／ｇ）のデータを非コンパートメントモデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により解析した。一定の消失速度（λｚ）、ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（ｔ１／２）、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣ０−ｉｎｆ）などのＰＫパラメータを、各個体のデータから推定した。
クリアランス速度および分布容積を推定したが（付属書類３参照）、本報告では、以下のような２つの理由で、２つの用量間および２つの投与経路間でのＰＫ比較には使用しなかった：（１）本試験は、血中ＰＫではなく固体組織中のｒｈＨＮＳの生体内分布に焦点を当てたものであった；（２）脳領域の放射活性は脳組織（固体）とＣＳＦ（液体）の放射活性の合計であり、本試験では両者を互いに分離することができなかった。λｚは単位時間当たりに消失した注射量の百分率を示すものであったため、これを評価して比較に用いた。
群の平均および標準偏差（ＳＤ）を計算し、２つの用量間で比較した。これらのＰＫパラメータを下の表２３にまとめる。
投与後の最初の２０分間に、頭部領域のｒｈＨＮＳの総量（ｕｇ）が、１ｍｇ／ｋｇでは１分当たり０．００２〜０．０１１（λｚ、０．００５±０．００４／分）、１０ｍｇ／ｋｇでは１分当たり０．００３〜０．０１０（０．００７±０．００３／分）の一定速度で減少した。これら２つの用量レベルの一定の消失速度の間に有意な差は見られなかった（ｐ＝０．５７、図１７）。
脳の濃度−時間曲線（μｇ／ｇ、０．０５〜１９２時間）は、二相性のプロファイルを示した（図１８）。初期相は約２時間続く。一次速度過程の後に終末相が続く。脳の一定の消失速度は、２つの試験した用量において非常に類似し（１時間当たり０．００１６±０．００３および０．０１４±０．００１）、約２日という半減期も類似していた（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ４５±７および４９±４時間）。ピーク濃度の値（２５７±９０および２６２８±２６５μｇ／ｇ）およびＡＵＣｌａｓｔ（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ８３９３±２４５７および８３９６２±１００８３時）は、用量を１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに増加させると約１０倍増加する。上記の観察は、これらのＩＴ単回投与レジメンでの１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量における直線的なＰＫ挙動を示していた。脳ではピーク濃度がＩＴ投与の３分後（Ｔｍａｘ）に現れた。
脳および頭部領域の総量−時間曲線（μｇ、０．０５〜１９２時間）は、脳の濃度−時間曲線（μｇ／ｇ）で見られたものと同じ二相性のパターンに従っていた（図１９および図２０）。脳領域のＣｍａｘの値は、頭部領域の値よりも有意に低かった（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇでは６９±８と２００±０、ｐ＜０．０１；１０ｍｇ／ｋｇでは８３６±１１７と１８４４±３１４ｕｇ、ｐ＜０．０１）。一定の消失速度は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ、脳では０．０１７±０．００２／時と０．０１４±０．００１／時、頭部領域では０．０１６±０．００２／時と０．０１０±０．００１／時であった。平均残留時間の値は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ、脳では４２±５時間と５１±５時間（ｐ＝０．０４８）、頭部では４５±７時間と７０±９時間（ｐ＜０．０１）であった。これらの観察は、投与タンパク質が、低用量において高用量よりも速く両領域から消失することを示していた。ｒｈＨＮＳの１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＩＴ投与後のこれらの領域における平均半減期は、４２〜７０時間の範囲であった。
脊椎の近位部分から中位部分および遠位部分にかけての濃度勾配が両用量レベルで観察された（データ不掲載）。ＩＴ投与後に、ピーク濃度（μｇ／脊柱ｍｍ）が、近位部分では３０分前後（０〜１時間）、中位部分では１〜４時間（２４時間である１匹のラットを除く）、遠位部分では１〜８時間で見られた。これらの部位における半減期には、ばらつきが見られた（平均ｔ１／２：１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ、脊椎の近位部分では３２±１３時間と４５±１８時間、中位部分では３９±１６時間と約５０時間、遠位部分では３０±１２時間と約１２３時間）。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの１２４Ｉ−ＨＮＳでのピーク濃度の平均値は、これら３つの各部位においてほぼ用量に比例していた（脊椎の近位部分、中位部分および遠位部分において、それぞれ０．５μｇ／ｍｍと６．０μｇ／ｍｍ、０．２μｇ／ｍｍと０．９μｇ／ｍｍ、０．１μｇ／ｍｍと０．５μμｇ／ｍｍ）。ＡＵＣｌａｓｔの平均値は、ピーク濃度で見られたものと同じ比例パターンに従っていた（近位部位、中位部位および遠位部位において、それぞれ９．５時間・μｇ／ｍｍと８３時間・μｇ／ｍｍ、６．８時間・μｇ／ｍｍと３５時間・μｇ／ｍｍ、２時間・μｇ／ｍｍと３８時間・μｇ／ｍｍ）。
ほとんどの末梢器官ではｒｈＨＮＳが検出不可能であったが、肝臓においては、ＩＴ投与後の早くて１時間後（投与後の最初の画像化時点）から、１ｍｇ／ｋｇでは９６時間後（４個体のうち３個体）まで、１０ｍｇ／ｋｇでは１９２時間後（全４個体）まで測定可能であった（図２４）。肝臓での濃度は、１ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与の２時間後、１０ｍｇ／ｋｇのＩＴ投与の７時間後にピークに達し、この後に一次速度過程を伴う消失相が続いた。一定の消失速度は１ｍｇ／ｋｇ（λｚ：０．０３０±０．０１１／時）の方が１０ｍｇ／ｋｇ（λｚ：０．０１７±０／時）よりも速く（ｐ＝０．１０）、これは１ｍｇ／ｋｇの方がｔ１／２が短い（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ２８±１６時間と４２±１時間、ｐ＝０．７６）ことに対応していた。１ｍｇ／ｋｇのＡＵＣｌａｓｔ値は、１０ｍｇ／ｋｇの値と比べて約４０倍減少していた（それぞれ２０４±５０μｇ／ｇと７９８７±３２７６μｇ／ｇ）。
１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量での１２４Ｉ−ＨＮＳによる静脈内処置
脳、肝臓、腎臓、心臓（肺組織を含む）および皮膚における濃度を、ぞれぞれ図２５〜図２９に示されるように、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのｒｈＨＮＳのＩＶ投与後の時間の関数としてプロットした。本試験では、これらの器官の最初の静態像の時点が投与の１時間後であったため、これらの濃度−時間曲線の初期相を観察することはできない。肝臓、腎臓、心臓および皮膚の濃度−時間曲線は、ＩＶ投与後の１〜８時間では平坦相を示した。脳では、この平坦相が投与後２４時間続いたが、このことは、脳が末梢器官よりも時間をかけてＩＶ投与タンパク質を吸収したことを示している。残りのデータは、ほぼ一次速度過程を伴う終末消失相を示していた。
肝臓、腎臓、心臓および皮膚における消失半減期は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ、肝臓では４７±１０時間と３８±１３時間、腎臓では５４±２５時間と２９±１６時間、心臓では３６±１５時間と４２±１９時間、皮膚では４０±２１時間と３１±１３時間であったのに対し、脳での半減期は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいて、それぞれ７１±２３時間と６０±５３時間であった（１０ｍｇ／ｋｇ群のラット３は、ｔ１／２を決定するためのデータが不十分なため除外した）。ｐ値＜０．０３の腎臓を除くこれらの器官では、１ｍｇ／ｋｇの半減期と１０ｍｇ／ｋｇの半減期との間に統計的な差は見られなかった。
肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＣｍａｘの平均値は、１ｍｇ／ｋｇでは９．６μｇ／ｇ、０．３μｇ／ｇ、０．２５μｇ／ｇ、０．２２μｇ／ｇおよび０．０８μｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｋｇでは１３２μｇ／ｇ、７．９μｇ／ｇ、３．９μｇ／ｇ、３．７μｇ／ｇおよび１．８μｇ／ｇであった。上記器官における１０ｍｇ／ｋｇでのＣｍａｘ値の１ｍｇ／ｋｇでの対応する値に対する比は、１４、２６、１６、１７および２３であった。各個体のＣｍａｘ値を用量に対して正規化すると、上記の全器官において、１０ｍｇ／ｋｇにおけるＣｍａｘ／投与の値は、１ｍｇ／ｋｇにおける値よりも有意に高かった（ｐ値のほとんどが０．０５未満、肝臓ではｐ＝０．０６）。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＡＵＣｌａｓｔの値は、１ｍｇ／ｋｇでは５２５時間・μｇ／ｇ、１６時間・μｇ／ｇ、１４時間・μｇ／ｇ、９．３時間・μｇ／ｇおよび７時間・μｇ／ｇ；１０ｍｇ／ｋｇでは６７４７時間・μｇ／ｇ、２７６時間・μｇ／ｇ、１８３時間・μｇ／ｇ、２０１時間・μｇ／ｇおよび８６時間・μｇ／ｇであった。上記器官における１０ｍｇ／ｋｇでのＡＵＣｌａｓｔの１ｍｇ／ｋｇでの対応するＡＵＣｌａｓｔ値に対する比はそれぞれ、１３、１７、１３、２２および１２であった。正規化すると、皮膚では１０ｍｇ／ｋｇにおけるＡＵＣｌａｓｔ／投与が１ｍｇ／ｋｇにおける値よりも有意に高く（ｐ＜０．０１）、心臓ではわずかな差が見られ（ｐ＝０．０６）、肝臓、脳および腎臓では有意な差が見られなかった（ｐ値はすべて０．３４を上回った）。
これらの観察により、以下のことが示された：（１）ほとんどの器官における半減期は、脳（約３日）を除き約２日であった；（２）肝臓における１グラム当たりの曝露量は皮膚、心臓および腎臓よりも高く、これら３つの曝露量は脳よりも高いかった；（３）用量が１０倍増加すると（１０／１ｍｇ／ｋｇ）、全試験器官の１０ｍｇ／ｋｇでのＣｍａｘ値が１ｍｇ／ｋｇでの値よりも１０倍増加した。
脳では、ＩＶ投与の１〜２４時間後（Ｔｍａｘ）にピーク濃度に達した。
ＩＶ処置とＩＴ処置の比較
１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶおよびＩＴ投与後の脳および肝臓における濃度−時間曲線を、ぞれぞれ図３０および図３１で比較する。脳におけるＩＴ／ＩＶのＣｍａｘの比は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいて、それぞれ３２１２および１５０１であった。ＡＵＣ０−１９２時間のこの比は１１３６および９７８であった。これらの観察は、同じ用量のｒｈＨＮＳを注射した場合、髄腔内投与により、脳での曝露量が静脈内投与よりも約３ｌｏｇ高い曝露量となることを示していた。脳における消失半減期は、両用量レベルにおいて、ＩＴ投与では２日（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで４５時間および４９時間）、ＩＶ投与では３日（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで７１時間および６０時間）であった。
しかし、ＩＴ投与後の肝臓における曝露量は、同じ用量のｒｈＨＮＳでＩＶ投与後の曝露量と同等であった。肝臓における１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＩＴ／ＩＶのＣｍａｘの比は、それぞれ０．５と０．８、ＡＵＣｌａｓｔの比は、それぞれ０．４と１．２であった。
結論
１２４Ｉ−スルファミダーゼ（ｒｈＨＮＳ）の薬物動態および生体内分布プロファイルを、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの１２４Ｉ−スルファミダーゼの静脈内または髄腔内単回投与後のラットにおける組織ＰＥＴ画像により調べた。対象領域における、投与の０．０５、１、２、４、８、２４、４８、９６および１９２時間後の動的（最初の２０分）および静的な濃度−時間データが得られた。ＩＴ投与後の動態像では、頭部領域のｒｈＨＮＳの総量が、最初の２０分間に０．００５／分〜０．００７／分（平均λｚ）の類似した一定速度で減少していた。静態像では、脳からの消失速度は、試験した２つの用量で基本的に同じであり（λｚ：１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ０．０１６／時と０．０１４／時）、半減期も約２日で同様であった。
上記ＩＴ単回投与レジメンで投与された１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲において、ＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔの値は投与量に比例し、直線的ＰＫ挙動が示された。
両用量レベルにおいて、近位脊椎から遠位脊椎にかけて濃度勾配が観察された。
ＩＴ投与後、近位部分では２０分前後で、中位部分では１〜４時間で、遠位部分では１〜８時間でピーク濃度が見られた。脊椎の異なる部分において、直線的ＰＫ挙動も示された。
ＩＴ投与後、肝臓においては、ｒｈＨＮＳタンパク質が１ｍｇ／ｋｇでは非常に早期から９６時間後にかけて、１０ｍｇ／ｋｇでは非常に早期から１９２時間後にかけて測定可能であった。消失速度は１ｍｇ／ｋｇ（λｚ：０．０３０／時）の方が１０ｍｇ／ｋｇ（λｚ：０．０１７／時）よりも速く、これは低用量の方がｔ１／２が短いことに対応していた（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ２８±１６時間および４２±１時間）。
肝臓、腎臓、心臓および皮膚におけるＩＶ投与後の消失半減期は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいてそれぞれ、肝臓では４７±１０時間と３８±１３時間、腎臓では５４±２５時間と２９±１６時間、心臓では３６±１５時間と４２±１９時間、皮膚では４０±２１時間と３１±１３時間であったのに対し、脳での半減期は、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいて、それぞれ７１±２３時間と６０±５３時間であった。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＣｍａｘの平均値は、１ｍｇ／ｋｇでは９．６μｇ／ｇ、０．３μｇ／ｇ、０．２５μｇ／ｇ、０．２２μｇ／ｇおよび０．０８μｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｋｇでは１３２μｇ／ｇ、７．９μｇ／ｇ、３．９μｇ／ｇ、３．７μｇ／ｇおよび１．８μｇ／ｇであった。各個体のＣｍａｘ値を用量に対して正規化すると、上記の全器官において、１０ｍｇ／ｋｇにおけるＣｍａｘ／投与の値は、１ｍｇ／ｋｇにおける値よりも有意に高かった（ｐ値のほとんどが０．０５未満、肝臓ではｐ＝０．０６）。肝臓、皮膚、腎臓、心臓および脳のＡＵＣｌａｓｔの値は、１ｍｇ／ｋｇでは５２５時間・μｇ／ｇ、１６時間・μｇ／ｇ、１４時間・μｇ／ｇ、９．３時間・μｇ／ｇおよび７時間・μｇ／ｇ；１０ｍｇ／ｋｇでは６７４７時間・μｇ／ｇ、２７６時間・μｇ／ｇ、１８３時間・μｇ／ｇ、２０１時間・μｇ／ｇおよび８６時間・μｇ／ｇであった。正規化すると、皮膚では１０ｍｇ／ｋｇにおけるＡＵＣｌａｓｔ／投与が１ｍｇ／ｋｇでの値よりも有意に高く（ｐ＜０．０１）、心臓ではわずかな差が見られ（ｐ＝０．０６）、肝臓、脳および腎臓では有意な差が見られなかった（ｐ値はすべて０．３４を上回った）。
実施例６：ＲＨＨＮＳによるサンフィリッポＡ（ＳＡＮ Ａ）患者の処置
例えばＩＴ送達による、ＣＮＳへの直接投与を用いて、サンフィリッポＡ患者を効果的に治療することができる。本実施例は、サンフィリッポＡの患者に対して、隔週（ＥＯＷ）、全４０週で、髄腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）により投与する、３用量レベルまでのｒｈＨＮＳの安全性を評価するために計画された、多施設用量漸増試験を示すものである。ヒト治療に適した髄腔内薬物送達装置の様々な例を、図３２〜３５に図示する。
特定の一例では、最大１６患者まで登録する。
コホート１：４患者（最低用量−１０ｍｇ）
コホート２：４患者（中間用量−３０ｍｇ）
コホート３：４患者（最高用量−１００ｍｇ）
無作為に４患者を無治療または装置の使用とする。
サンフィリッポ症候群Ａ型患者は、一般的に、初期発達里程標石（例えば、歩行、言語、トイレトレーニング）の遅れ、知能欠陥、多動性障害、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠乏、多動性障害、攻撃性および／または睡眠障害などを含む認知および神経発達障害を示す。徴候の全ては治験の基準の一部となり得る。以下の基準の包含に基づく試験のために患者を選択する：（１）３〜１８歳；（２）７７未満の知能指数または過去３年間におけるＩＱ１５〜３０の低下；（３）ＣＳＦ閉鎖または十分制御できない発作性疾患がない、ならびに（４）麻酔および／または手術危険度を示す共存症がない。
遅発乳児型サンフィリッポ症候群Ａ型の子供に６ヶ月間ＩＴ注射により投与したｒｈＨＮＳの上昇用量の安全性を決定する。患者の安全性の十分な評価を提供するには、登録および段階的拡大は非常に遅いだろう。さらに、全体の運動機能に対するｒｈＨＮＳの臨床的活性、ならびに血清中の単一および反復投与薬物動態、ならびに脳脊髄液（ＣＳＦ）中の濃度を評価する。
本試験の目的は、ｒｈＨＮＳの上昇用量の安全性および耐容性、ならびにＩＤＤＤの安全性、耐容性および長期開存性を評価することであるだろう。さらに、ＣＳＦおよび血液中の単一および反復ＩＴ投与後のｒｈＨＮＳの濃度、ならびにＣＦバイオマーカーおよび尿中ＧＡＧへのｒｈＨＮＳの影響がある。さらなる評価には、生理学および神経認知評価、神経機能ならびに脳構造容積などの臨床的パラメータへのｒｈＨＮＳの影響も含まれるだろう。さらに、日常生活への治療の影響およびバイオマーカーと症状との間の関係を評価することができる。
典型的には、ｒｈＨＮＳのＩＴ送達によるサンフィリッポ症候群Ａ型患者の処置は、種々の組織（例えば、神経系、腎臓、胆嚢および他の器官）中のＧＡＧの蓄積の低減を生じさせる。
本明細書に記載の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載されているが、後の実施例は単に本発明の化合物を例示するためのものであり、これらを限定することを意図するものではない。
本明細書および特許請求の範囲で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明記されない限り、複数形の指示対象を含むということを理解するべきである。あるグループの１つ以上の要素の間に「または（もしくは、あるいは）」が含まれる請求項または記載事項は、そうでないことが明記されるかまたは文脈から明らかでない限り、１つ、２つ以上またはすべてのグループの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する場合に満たされるものとする。本発明は、グループの中の正確に１つの要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態を含む。また本発明は、グループの２つ以上の要素または全要素が所与の製品または工程に存在する、使用されるまたは関連する実施形態も含む。さらに本発明は、別途明記されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙されている１つ以上の請求項の１つ以上の制限、要素、条項、記述用語などが、基本請求項に従属する別の請求項に（または関連する他の任意の請求項として）組み込まれるすべての変更、組合せおよび置換を包含するということを理解するべきである。要素が列挙されている場合（例えば、マーカッシュ群またはこれと同様の形式において）、要素の各下位グループも開示され、任意の要素（１つまたは複数）がそのグループから除外され得ることを理解するべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むという場合、本発明の特定の実施形態または本発明の特定の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはこのような要素、特性などから本質的になるということを理解するべきである。簡潔にするために、これらの実施形態があらゆる場合に正確に本明細書に具体的に記載されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様が、本明細書において具体的に除外されることが記載されているか否かにかかわらず、請求項から明確に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明するために、および本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において参照される刊行物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (72)

  1. ヘパランＮ−スルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質、塩、緩衝剤およびポリソルベート界面活性剤を含む髄腔内投与用の安定な製剤。
  2. 前記ＨＮＳタンパク質が、最大約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載の安定な製剤。
  3. 前記ＨＮＳタンパク質が、最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載の安定な製剤。
  4. 前記ＨＮＳタンパク質が、約１０〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  5. 前記ＨＮＳタンパク質が、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  6. 前記ＨＮＳタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  7. 前記塩がＮａＣｌである、請求項１から６のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  8. 前記ＮａＣｌが、約０〜３００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項７に記載の安定な製剤。
  9. 前記ＮａＣｌが、約１００〜２００ｍＭの濃度で存在する、請求項８に記載の安定な製剤。
  10. 前記ＮａＣｌが、約１４５ｍＭの濃度で存在する、請求項９に記載の安定な製剤。
  11. 前記ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  12. 前記ポリソルベート界面活性剤がポリソルベート２０である、請求項１１に記載の安定な製剤。
  13. 前記ポリソルベート２０が約０〜０．０５％の範囲の濃度で存在する、請求項１２に記載の安定な製剤。
  14. 前記ポリソルベート２０が約０．０２％の濃度で存在する、請求項１３に記載の安定な製剤。
  15. 前記ポリソルベート２０が約０．００５％の濃度で存在する、請求項１３に記載の安定な製剤。
  16. 前記緩衝剤がリン酸塩である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  17. 前記リン酸塩が５０ｍＭ以下の濃度で存在する、請求項１６に記載の安定な製剤。
  18. 前記リン酸塩が２０ｍＭ以下の濃度で存在する、請求項１６に記載の安定な製剤。
  19. 前記リン酸塩が約５ｍＭの濃度で存在する、請求項１７に記載の安定な製剤。
  20. 約５．０〜８．０のｐＨを有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  21. 約６．５〜７．５のｐＨを有する、請求項１８に記載の安定な製剤。
  22. 約７．０のｐＨを有する、請求項１９に記載の安定な製剤。
  23. 安定化剤をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  24. 前記安定化剤が、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ＰＥＧ４０００、ヒスチジン、アルギニン、リジン、リン脂質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の安定な製剤。
  25. 前記安定化剤がスクロースである、請求項２４に記載の安定な製剤。
  26. 前記スクロースが約０〜１０％の範囲の濃度で存在する、請求項２５に記載の安定な製剤。
  27. 前記スクロースが約０．５〜２．０％の範囲の濃度で存在する、請求項２６に記載の安定な製剤。
  28. 前記安定化剤がグルコースである、請求項２３に記載の安定な製剤。
  29. 前記グルコースが約０．５〜１．０％の範囲の濃度で存在する、請求項２８に記載の安定な製剤。
  30. 液体製剤である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  31. 凍結乾燥した乾燥粉末として製剤化される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  32. 最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１００〜２００ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩とを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤。
  33. 前記ＨＮＳタンパク質が約１５ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項３２に記載の安定な製剤。
  34. 前記ＮａＣｌが約１４５ｍＭの濃度である、請求項３２または３３に記載の安定な製剤。
  35. 約０〜１０％の濃度のスクロースをさらに含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の安定な製剤。
  36. 最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１４５ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩と、約０．５〜２％の濃度のスクロースとを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤。
  37. 最大約３０ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパランＮスルファターゼ（ＨＮＳ）タンパク質と、約１４５ｍＭの濃度のＮａＣｌと、約０．０２％の濃度のポリソルベート２０と、約５ｍＭの濃度のリン酸塩と、約０．５〜１．０％の濃度のグルコースとを含み、約７．０のｐＨを有する髄腔内投与用の安定な製剤。
  38. 凍結乾燥した乾燥粉末として製剤化される、請求項３６または３７に記載の安定な製剤。
  39. 請求項１から３８のいずれか一項に記載の安定な製剤の単一剤形を含む容器。
  40. アンプル、充填済み注射器、バイアル、薬包、Ｌｙｏ−Ｊｅｃｔ、レザバーから選択される、請求項３９に記載の容器。
  41. 充填済みバイアルである、請求項４０に記載の容器。
  42. 前記安定な製剤が、約５０ｍｌ未満の容積で存在する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の容器。
  43. 前記安定な製剤が、約５．０ｍｌ未満の容積で存在する、請求項４２に記載の容器。
  44. 請求項１から３８のいずれか一項に記載の製剤を、治療を必要とする対象に髄腔内投与するステップを含む、サンフィリッポＡ症候群の治療方法。
  45. 前記髄腔内投与が、前記対象に実質的な有害作用を生じさせない、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記髄腔内投与が、前記対象に実質的な適応Ｔ細胞媒介免疫応答を生じさせない、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記製剤の前記髄腔内投与が、１種または複数の標的脳組織への前記ＨＮＳタンパク質の送達を生じさせる、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記１種または複数の標的脳組織が、灰白質、白質、室周囲領域、軟膜クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状／被殻領域、中脳、脳橋もしくは髄質の深部領域、およびこれらの組み合わせの組織からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＨＮＳタンパク質が、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞に送達される、請求項４７または４８に記載の方法。
  50. 前記ＨＮＳタンパク質が、脊髄のニューロンにさらに送達される、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記製剤の前記髄腔内投与が、末梢標的組織への前記ＨＮＳタンパク質の全身送達をさらに生じさせる、請求項４４から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記末梢標的組織が、肝臓、腎臓および／または心臓から選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記製剤の前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織内でのリソソーム局在化を生じさせる、請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記製剤の前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるリソソーム蓄積を減少させる、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記リソソーム蓄積が、対照と比較して少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍または２倍だけ減少する、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記製剤の前記髄腔内投与が、ニューロンの空胞形成を減少させる、請求項４４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ニューロンがプルキンエ細胞を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記製剤の前記髄腔内投与が、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織においてＨＮＳ酵素活性を増加させる、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ＨＮＳ酵素活性が、対照と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍だけ増加する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記増加した酵素活性が、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 前記ＨＮＳ酵素活性が腰部領域において増加する、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記腰部領域において増加したＨＮＳ酵素活性が、少なくとも約２０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇまたは１０，０００ｎｍｏｌ／時・ｍｇである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記製剤の前記髄腔内投与が、サンフィリッポＡ症候群の少なくとも１つの症状もしくは特徴の強度、重症度または頻度の低下あるいは発症遅延を生じさせる、請求項４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記サンフィリッポＡ症候群の少なくとも１つの症状もしくは特徴が、聴力損失、言語発達障害、運動技能の欠乏、多動性障害、精神遅滞、攻撃性および／または睡眠障害である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記髄腔内投与が２週間に１回実施される、請求項４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記髄腔内投与が１か月に１回実施される、請求項４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記髄腔内投与が２ヶ月に１回実施される、請求項４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記髄腔内投与が静脈内投与と併せて使用される、請求項４４から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記静脈内投与が１か月に１回以下の頻度である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記静脈内投与が２ヶ月に１回以下の頻度である、請求項６８に記載の方法。
  71. 前記髄腔内投与が静脈内投与の非存在下で使用される、請求項４４から６７のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記髄腔内投与が同時免疫抑制薬療法の非存在下で使用される、請求項４４から７１のいずれか一項に記載の方法。
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