KR102497564B1 - 혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체 - Google Patents

혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체 Download PDF

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    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Abstract

본 발명은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체로서, 해당 항체가 중쇄의 가변 영역에 있어서, (a) CDR1이 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, (b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 (c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체 및 그의 유연체를 제공한다.

Description

혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체{NOVEL ANTI-HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODY CAPABLE OF PENETRATING BLOOD-BRAIN BARRIER}
본 발명은, 혈중에 투여하여 중추 신경계(CNS)에 있어서 기능시켜야 할 화합물(단백질, 저분자 화합물 등)이 혈액뇌관문을 통과할 수 있도록 하기 위해서, 그들 화합물과 결합시켜 이용하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체, 그의 제조법 및 그의 사용법에 관한 것이다.
뇌실 주위 기관(송과체, 뇌하수체, 최후야 등)을 포함하는 몇 개의 영역을 제외하고 뇌의 대부분의 조직에 혈액을 공급하는 모세혈관은, 근육 등 그 외의 조직에 존재하는 모세혈관과 달리, 그 내피를 형성하고 있는 내피 세포끼리가 강고한 세포간 접합에 의해 서로 밀착하고 있다. 그 때문에, 혈액으로부터 뇌로의 물질의 수동 수송이 방해되어, 예외는 있지만, 지용성이 높은 물질, 또는 분자량이 작고(200∼500돌턴 이하) 또한 생리 pH 부근에 있어서 전기적으로 중성인 물질 이외, 모세혈관으로부터 뇌로 이행하기 어렵다. 이와 같은, 뇌내의 모세혈관 내피를 개재시킨, 혈액과 뇌의 조직액 사이에서의 물질 교환을 제한하는 기구는, 혈액뇌관문(Blood-Brain Barrier, BBB)으로 불리고 있다. 또한, 혈액뇌관문은, 뇌뿐만 아니라, 뇌 및 척수를 포함하는 중추 신경계의 조직액과 혈액 사이의 물질 교환도 제한하고 있다.
혈액뇌관문의 존재에 의해, 중추 신경계의 세포의 대부분은, 혈중의 호르몬, 림포카인 등의 물질의 농도 변동의 영향을 받지 않고서, 그 생화학적인 항상성이 유지된다.
그렇지만, 혈액뇌관문의 존재는, 약제 개발에 있어서 문제를 제기한다. 예를 들어, α-L-이두로니다제의 결손에 기인하는 유전성 대사 질환인 뮤코다당증 I형(헐러 증후군)에 대해서는, 재조합 α-L-이두로니다제를 정맥내 보충하는 효소 보충 요법이, 그 치료법으로서 행해지고 있지만, 헐러 증후군에 있어서 확인되는 현저한 중추 신경계(CNS)의 이상에 대해서는, 효소가 혈액뇌관문을 통과할 수 없으므로 유효하지 않다.
중추 신경계에 있어서 작용시켜야 할 그와 같은 단백질 등의 고분자 물질에 혈액뇌관문을 통과시키기 위한 방법이, 여러 가지 개발되고 있다. 예를 들어, 신경 성장 인자의 경우, 이것을 내포시킨 리포솜을 뇌내 모세혈관의 내피 세포의 세포막과 융합시키는 것에 의해, 혈액뇌관문을 통과시키는 방법이 시도되고 있지만, 실용화에 이르지 않았다(비특허문헌 1). α-L-이두로니다제의 경우, 1회당에 투여되는 효소의 양을 증가시켜 그의 혈중 농도를 높이는 것에 의해, 혈액뇌관문에 있어서의 효소의 수동 수송을 높이는 시도가 행해지고, 헐러 증후군의 동물 모델을 이용하여, 이 수법에 의해 중추 신경계(CNS)의 이상이 완해됨이 나타나고 있다(비특허문헌 2).
또한, 혈액뇌관문을 회피하여, 고분자 물질을 수강내 또는 뇌내에 직접 투여하는 시도도 행해지고 있다. 예를 들어, 헐러 증후군(뮤코다당증 I형)의 환자의 수강내에 인간 α-L-이두로니다제를 투여하는 방법(특허문헌 1), 니만-픽병의 환자의 뇌실내에 인간 산 스핑고미엘리나제를 투여하는 방법(특허문헌 2), 헌터 증후군의 모델 동물의 뇌실내에 이두론산 2-설파타제(I2S)를 투여하는 방법(특허문헌 3)이 보고되어 있다. 이와 같은 수법에 의하면, 확실히 중추 신경계에 약제를 작용시킬 수 있다고 생각되는 한편, 침습성이 극도로 높다고 하는 문제가 있다.
혈액뇌관문을 통과하여 고분자 물질을 뇌내에 도달시키는 방법으로서, 뇌내 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 막단백질과 친화성을 가지도록 고분자 물질을 수식하는 방법이 여러 가지 보고되어 있다. 뇌내 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 막단백질로서는, 인슐린, 트랜스페린, 인슐린양(樣) 성장 인자(IGF-I, IGF-II), LDL, 렙틴 등의 화합물에 대한 수용체를 들 수 있다.
예를 들어, 신경 성장 인자(NGF)를 인슐린과의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 인슐린 수용체와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4∼6). 또한, 신경 성장 인자(NGF)를 항인슐린 수용체 항체와의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 인슐린 수용체와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4 및 7). 또한, 신경 성장 인자(NGF)를 트랜스페린과의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 트랜스페린 수용체(TfR)와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 8). 또한, 신경 성장 인자(NGF)를 항트랜스페린 수용체 항체(항TfR 항체)와의 융합 단백질의 형태로 합성하고, TfR과의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4 및 9).
항TfR 항체를 이용한 기술에 대해 더 보면, 항TfR 항체와 결합시키는 것에 의해 약제에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술에 있어서, 1본쇄 항체를 사용할 수 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한, hTfR과의 해리 상수가 비교적 큰 항hTfR 항체(저친화성 항hTfR 항체)가, 약제로 하여금 혈액뇌관문을 통과시키는 기술에 있어서, 적합하게 이용할 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 10 및 11, 비특허문헌 4). 더욱이, hTfR과의 친화성이 pH 의존적으로 변화하는 항TfR 항체가, 약제에 혈액뇌관문을 통과시키기 위한 캐리어로서 사용할 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 12, 비특허문헌 5).
일본 특허공표 2007-504166호 공보 일본 특허공표 2009-525963호 공보 일본 특허공개 2012-62312호 공보 미국 특허 5154924호 공보 일본 특허공개 2011-144178호 공보 미국 특허 2004/0101904호 공보 일본 특허공표 2006-511516호 공보 일본 특허공개 H06-228199호 공보 미국 특허 5977307호 공보 WO2012/075037 WO2013/177062 WO2012/143379
Xie Y. et al., J Control Release. 105. 106-19 (2005) Ou L. et al., Mol Genet Metab. 111. 116-22 (2014) Li JY. Protein Engineering. 12. 787-96 (1999) Bien-Ly N. et al., J Exp Med. 211. 233-44 (2014) Sada H. PLoS ONE. 9. E96340 (2014)
상기 배경하에서, 본 발명의 목적은, 혈중에 투여하여 중추 신경계에 있어서 기능시켜야 할 화합물(단백질, 저분자 화합물 등)이 혈액뇌관문을 통과할 수 있도록 하기 위해서, 그들 화합물과 결합시켜 이용할 수 있는 항TfR 항체, 그의 제조법 및 사용법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 예의 검토를 거듭한 결과, 본 명세서에 있어서 상술하는 항체 제작법에 의해 얻은, hTfR의 세포외 영역을 인식하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체(항hTfR 항체)가, 이것을 생체내에 투여했을 때 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과함을 발견하여, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
1. 항인간 트랜스페린 수용체 항체로서, 해당 항체가 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1이 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
2. 상기 1의 항체로서, 중쇄의 프레임워크 영역 3이 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
3. 상기 1 또는 2의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
4. 상기 1 또는 2의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
5. 상기 1 또는 2의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 62 또는 서열 번호 63,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
(d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 64
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한
프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
6. 상기 1 또는 2의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 62 또는 서열 번호 63,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
(d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 64
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한
프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
7. 상기 2의 항체로서, 해당 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
8. 상기 7의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 62 또는 서열 번호 63 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 64의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
9. 상기 7의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 62 또는 서열 번호 63 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 64의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
10. 상기 7의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
11. 상기 7의 항체로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
12. 상기 7의 항체로서, 해당 중쇄가, 서열 번호 66 또는 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
13. 상기 12의 항체로서, 단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 62 또는 서열 번호 63 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 64의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 해당 부분에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
14. 상기 12의 항체로서, 단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 62 또는 서열 번호 63 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 64의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 해당 부분에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
15. 상기 12의 항체로서, 단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
16. 상기 12의 항체로서, 단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 63의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 64의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 항체.
17. 상기 1∼16 중 어느 하나의 항체로서, 해당 항체의 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
항체.
18. 상기 17의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
또한
(c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
항체.
19. 상기 17의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
또한
(c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
항체.
20. 상기 17의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
항체.
21. 상기 17의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
항체.
22. 상기 1∼16 중 어느 하나의 항체로서,
해당 항체의 경쇄의 가변 영역이, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
23. 상기 22의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
24. 상기 22의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
25. 상기 22의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
26. 상기 22의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
27. 상기 1∼16 중 어느 하나의 항체로서, 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27 또는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
28. 상기 27의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
29. 상기 27의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
30. 상기 27의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
31. 상기 27의 항체로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체.
32. 상기 1∼31 중 어느 하나의 항체로서, 인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역 및 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역의 쌍방에 대해서 친화성을 갖는 것인, 항체.
33. 상기 32의 항체로서, 인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1X10-10M 이하인 것이며, 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1X10-9M 이하인 것인, 항체.
34. Fab 항체, F(ab')2 항체, 또는 F(ab') 항체인, 상기 1∼33 중 어느 하나의 항체.
35. scFab, scF(ab'), scF(ab')2 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1본쇄 항체인, 상기 1∼33 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체.
36. 상기 35의 항체로서, 그의 경쇄와 중쇄가 링커 서열을 개재시켜 결합하고 있는 것인, 항체.
37. 상기 36의 항체로서, 해당 경쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합하고 있는 것인, 항체.
38. 상기 35의 항체로서, 해당 중쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 경쇄가 결합하고 있는 것인, 항체.
39. 상기 36∼38 중 어느 하나의 항체로서, 해당 링커 서열이, 8∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 항체.
40. 상기 39의 항체로서, 해당 링커 서열이, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5의 각 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 항체.
41. 항인간 트랜스페린 수용체 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질로서,
해당 항인간 트랜스페린 수용체 항체가 상기 1∼40 중 어느 하나의 항체이고,
해당 단백질(A)가, 해당 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
42. 상기 41의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가, 해당 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
43. 상기 41 또는 42의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가, 해당 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 있어서 링커를 개재시켜 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
44. 해당 링커가, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드인, 상기 43의 융합 단백질.
45. 상기 44의 융합 단백질로서, 해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
46. 항인간 트랜스페린 수용체 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질로서,
해당 항인간 트랜스페린 수용체 항체가 상기 1∼40 중 어느 하나의 항체이고,
해당 단백질(A)가, 해당 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
47. 상기 46의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가, 해당 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
48. 상기 46 또는 47의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가, 해당 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 있어서 링커를 개재시켜 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
49. 해당 링커 서열이, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드인, 상기 48의 융합 단백질.
50. 상기 49의 융합 단백질로서, 해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
51. 해당 단백질(A)가, 인간 유래의 단백질인, 상기 41∼50 중 어느 하나의 융합 단백질.
52. 상기 41∼51 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가, 신경 성장 인자(NGF), 리소좀 효소, 모양체 신경 영양 인자(CNTF), 글리아세포주 신경 영양 인자(GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레그린 1, 에리트로포이에틴, 다베포에틴, 액티빈, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 6, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 각종 사이토카인, 종양괴사 인자 α 수용체(TNF-α 수용체), PD-1 리간드, PD-L1, PD-L2, 베타아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 항베타아밀로이드 항체, 항BACE 항체, 항EGFR 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항HER2 항체, 항TNF-α 항체, 항CTLA-4 항체, 및 그 외의 항체 의약으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 39∼49 중 어느 하나의 융합 단백질.
53. 해당 단백질(A)가 리소좀 효소이며, 해당 리소좀 효소가, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 인간 산성 α-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1, 트라이펩티딜펩티다제-1, 히알루로니다제-1, CLN1 및 CLN2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
54. 해당 단백질(A)가, 인간 이두론산-2-설파타제, 인간 산성 α-글루코시다제, 또는 인간 α-L-이두로니다제의 어느 하나인, 상기 41∼51 중 어느 하나의 융합 단백질.
55. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜, 인간 산성 α-글루코시다제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 57 또는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질.
56. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 66 또는 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 해당 중쇄가, 그 C말단측에서, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜, 서열 번호 55 또는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 인간 산성 α-글루코시다제와 결합하고 있는 것인,
융합 단백질.
57. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제이고, 해당 항체가 Fab 항체이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 인간 산성 α-글루코시다제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 89의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질.
58. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제이고, 해당 항체가 Fab 항체이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 해당 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 서열 번호 55 또는 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖는 인간 산성 α-글루코시다제와 결합하고 있는 것인,
융합 단백질.
59. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 α-L-이두로니다제이고, 해당 항체가 Fab 항체이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 인간 α-L-이두로니다제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 93의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질.
60. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)가 인간 α-L-이두로니다제이고, 해당 항체가 Fab 항체이며,
(1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(2) 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 해당 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 서열 번호 75 또는 서열 번호 76의 아미노산 서열을 갖는 인간 α-L-이두로니다제와 결합하고 있는 것인,
융합 단백질.
61. 상기 41의 융합 단백질로서, 인간 IgG Fc 영역 또는 그 일부가, 해당 단백질(A)와 해당 항체의 사이에 도입되는 것인, 융합 단백질.
62. 상기 61의 융합 단백질로서, 해당 단백질(A)의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 해당 항체의 중쇄 또는 경쇄가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
63. 상기 61 또는 62의 융합 단백질로서, 인간 IgG Fc 영역이 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
64. 상기 63의 융합 단백질로서, 인간 IgG Fc 영역이 링커 서열을 개재시켜 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 Fab 중쇄와 결합하고, 그것에 의해 형성되는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
65. 상기 1∼40 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 아미노산 서열을 코딩하는, DNA 단편.
66. 상기 41∼64 중 어느 하나의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는, DNA 단편.
67. 상기 65 또는 66의 DNA 단편을 짜넣어 이루어지는, 발현 벡터.
68. 상기 67의 발현 벡터로 형질 전환된 포유동물 세포.
69. 상기 1∼40 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 어느 것인가에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시켜야 할 저분자량의 약리 활성 물질을 결합시킨 것인, 항인간 트랜스페린 수용체 항체-약리 활성 물질 복합체.
70. 해당 약리 활성 물질이, 항암제, 알츠하이머병 치료제, 파킨슨병 치료제, 헌팅턴병 치료제, 통합 실조증 치료제, 울증 치료제, 다발성 경화증 치료제, 근위축성 측색경화증 치료제, 뇌종양을 포함하는 중추 신경계의 종양의 치료제, 뇌장애를 수반하는 리소좀병의 치료제, 당원병 치료제, 근디스트로피 치료제, 뇌허혈 치료제, 프리온병 치료제, 외상성의 중추 신경계 장애의 치료제, 바이러스성 및 세균성의 중추 신경계 질환에 대한 치료제, 뇌외과 수술 후의 회복에 이용하는 약제, 척추 외과 수술 후의 회복에 이용하는 약제, siRNA, 안티센스 DNA, 및 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 것인, 상기 69의 항인간 트랜스페린 수용체 항체-약리 활성 물질 복합체.
71. 단백질(A) 또는 저분자량의 약리 활성 물질에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시키기 위한, 상기 1∼40 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 사용.
72. 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위한, 해당 질환 상태에 대한 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 분자와 결합시키는 것에 의한 상기 1∼40 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 사용.
73. 중추 신경계의 질환의 치료 방법으로서, 해당 질환에 대한 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 치료상 유효량을, 상기 1∼40 중 어느 하나의 항인간 트랜스페린 수용체 항체 분자와의 결합체의 형태로 당해 질환을 갖는 환자에게 혈중 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
74. 인간 산성 α-글루코시다제에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시키기 위한, 상기 52∼58 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
75. 폼페병에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위한, 상기 52∼58 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
76. 폼페병에 수반하는 중추 신경계의 질환의 치료 방법으로서, 상기 52∼58 중 어느 하나의 융합 단백질의 치료상 유효량을, 당해 질환을 갖는 환자에게 혈중 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
77. 인간 산성 α-L-이두로니다제에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시키기 위한, 상기 52∼54, 59 또는 60 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
78. 헐러 증후군 또는 헐러-샤이에 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위한, 상기 52∼54, 59 또는 60 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
79. 헐러 증후군 또는 헐러-샤이에 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환의 치료 방법으로서, 상기 52∼54, 59 또는 60 중 어느 하나의 융합 단백질의 치료상 유효량을, 당해 질환을 갖는 환자에게 혈중 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.
본 발명은, 생리 활성이나 약리 활성을 갖는 단백질이나 저분자량의 물질이면서, 혈액뇌관문을 거의 또는 전혀 통과할 수 없기 때문에, 종래에는 혈중 투여로는 이용할 수 없었던 여러 가지 물질에 대해, 그것들을 혈액뇌관문 통과 가능한 형태로 할 수 있고, 따라서, 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한, 혈중 투여용의 새로운 약제로 하는 것을 가능하게 한다.
도 1은 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 대뇌피질의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 2는 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 해마의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 3은 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 소뇌의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 4는 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 뇌 이외의 각종 장기에 대한 인간화 항hTfR 항체의 축적량을 나타내는 도면. 세로축은, 각 장기의 습중량당의 인간화 항hTfR 항체의 양(μg/g 습중량)을 나타낸다. 백색 바는 왼쪽부터 순차로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를, 각각 투여, 흑색 바는, 트라스투주맙(허셉틴TM)을 투여한 원숭이의 각 장기에서의 축적량을 나타낸다. ND는 미측정을 의미한다.
도 5는 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 대뇌피질의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 6은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 해마의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)을 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 7은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 소뇌의 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 8은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 연수의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 9는 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 소뇌의, hGAA에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)를 투여, (b) hGAA를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 10은 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 마우스를 이용한 약효 평가의 결과를 나타내는 도면. (a) 우뇌, (b) 척수 경부, (c) 심장, (d) 횡격막, (e) 간장, (f) 비장에 있어서의 글리코겐 농도를 나타낸다. 각 도면 중, 1은 정상 대조군, 2는 병태 대조군, 3은 hGAA의 20mg/kg 투여군, 4∼7은 각각 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 2.5mg/kg, 5.0mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg 투여군을 나타낸다. 세로축은 글리코겐 농도(mg/g 습중량)를 나타낸다. 세로 바는 SD, #는 병태 대조군과의 비교로 p＜0.01, ##는 병태 대조군과의 비교로 p＜0.05, $은 hGAA 투여군과의 비교로 p＜0.01, $$은 hGAA 투여군과의 비교로 p＜0.05(모두 Tukey HSD test)를 나타낸다.
도 11은 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 마우스를 이용한 약효 평가의 결과를 나타내는 도면. (a) 대퇴사두근, (b) 비복근, (c) 가자미근, (d) 전경골근, (e) 장지신근비복에 있어서의 글리코겐 농도를 나타낸다. 각 도면 중, 1은 정상 대조군, 2는 병태 대조군, 3은 hGAA 투여군, 4∼7은 각각 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 2.5mg/kg, 5.0mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kg 투여군을 나타낸다. 세로축은 글리코겐 농도(mg/g 습중량)를 나타낸다. 세로 바는 SD, #는 병태 대조군과의 비교로 p＜0.01, ##는 병태 대조군과의 비교로 p＜0.05, $은 hGAA 투여군과의 비교로 p＜0.01, $$은 hGAA 투여군과의 비교로 p＜0.05(모두 Tukey HSD test)를 나타낸다.
도 12는 FabGS-GAA의 마우스를 이용한 약효 평가의 결과를 나타내는 도면. (a) 우뇌, (b) 심장, (c) 횡격막, (d) 대퇴사두근, (e) 가자미근, (f) 전경골근에 있어서의 글리코겐 농도를 나타낸다. 각 도면 중, 1은 정상 대조군, 2는 병태 대조군, 3은 hGAA 투여군, 4 및 5는 각각 FabGS-GAA의 5.0mg/kg, 20mg/kg 투여군을 나타낸다. 세로축은 글리코겐 농도(mg/g 습중량)를 나타낸다. 세로 바는 SD를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 「항체」란 말은, 주로 인간 항체, 마우스 항체, 인간화 항체, 인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체, 및 마우스 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체를 말하지만, 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 것인 한, 이들로 한정되는 것은 아니고, 또한, 항체의 동물종에도 특별히 제한은 없다. 단, 바람직한 것은, 인간화 항체이다.
본 발명에 있어서, 「인간 항체」란 말은, 그 단백질 전체가 인간 유래의 유전자로 코딩되어 있는 항체를 말한다. 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 인간의 유전자에, 원래의 아미노산 서열에 변화를 주지 않고서 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 「인간 항체」에 포함된다. 또한, 인간 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 인간 항체의 일부를 다른 인간 항체의 일부로 치환하여 제작한 항체도, 「인간 항체」이다. 인간 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR도, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 어느 인간 항체의 CDR을, 그 외의 인간 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 인간 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 인간 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 원래의 인간 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 「인간 항체」에 포함된다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 아미노산을 부가하는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 있어서 「인간 유래의 유전자」라고 할 때는, 인간 유래의 원래의 유전자에 더하여, 이것에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
원래의 항체의 아미노산 서열과 변이를 가한 항체의 아미노산 서열의 상동성은, 주지의 상동성 계산 알고리즘을 이용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 알고리즘으로서, BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444(1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 「마우스 항체」라고 할 때는, 그 단백질 전체가 마우스 유래의 유전자로 코딩되는 항체와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 말한다. 따라서, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 마우스의 유전자에, 원래의 아미노산 서열에 변화를 주지 않고서 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 또한, 마우스 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 마우스 항체의 일부를 다른 마우스 항체의 일부로 치환한 항체도, 마우스 항체에 포함된다. 마우스 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 예를 들어, 어느 마우스 항체의 CDR을, 다른 마우스 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 마우스 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 마우스 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 원래의 마우스 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 아미노산을 부가하는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 있어서 「마우스 유래의 유전자」라고 할 때는, 마우스 유래의 원래의 유전자에 더하여, 이것에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「인간화 항체」란 말은, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 인간 이외의 포유동물 유래이며, 그 이외의 영역이 인간 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체로서 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR로 치환하는 것에 의해 제작된 항체를 들 수 있다. 인간 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 더욱 바람직하게는 마우스이다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란 말은, 2개 이상의 상이한 종에서 유래하는, 2개 이상의 상이한 항체의 단편이 연결되어 이루어지는 항체를 말한다.
인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 인간 항체의 일부가 인간 이외의 포유동물의 항체의 일부에 의해 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것인가에서 유래한다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것인가에서 유래한다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상 영역으로 이루어진다고 할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스이다.
마우스 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 마우스 항체의 일부가 마우스 이외의 포유동물의 항체의 일부로 치환된 항체이다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 마우스 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 래트, 토끼, 말, 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 인간이다.
인간 항체와 마우스 항체의 키메라 항체는, 특히, 「인간/마우스 키메라 항체」라고 한다. 인간/마우스 키메라 항체에는, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 마우스 항체의 어느 것인가에서 유래한다. 인간/마우스 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 마우스 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역글로불린 경쇄와 1개의 면역글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 것이나, 이하에 상술하듯이,
(2) 면역글로불린 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체, 및
(3) 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체도 포함된다. 또한,
(4) 본래의 의미에서의 항체의 기본 구조로부터 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 포함한다)도, 본 발명에 있어서의 「항체」에 포함된다.
여기에서 Fab란, 가변 영역과 CL 영역(경쇄의 정상 영역)을 포함하는 1개의 경쇄와, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)을 포함하는 1개의 중쇄가, 각각 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. Fab에 있어서, 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)에 더하여, 추가로 힌지부의 일부를 포함해도 되지만, 이 경우의 힌지부는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합시키는 시스테인 잔기를 결여하는 것이다. Fab에 있어서, 경쇄와 중쇄는, 경쇄의 정상 영역(CL영역)에 존재하는 시스테인 잔기와, 중쇄의 정상 영역(CH1 영역) 또는 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기의 사이에 형성되는 다이설파이드 결합에 의해 결합한다. Fab를 형성하는 중쇄를 Fab 중쇄라고 한다. Fab는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합시키는 시스테인 잔기를 결여하고 있으므로, 1개의 경쇄와 1개의 중쇄로 이루어진다. Fab를 구성하는 경쇄는, 가변 영역과 CL 영역을 포함한다. Fab를 구성하는 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역으로 이루어지는 것이어도 되고, 가변 영역, CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부를 포함하는 것이어도 된다. 단 이 경우, 힌지부에서 2개의 중쇄 사이에 다이설파이드 결합이 형성되지 않도록, 힌지부는 중쇄 사이를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하지 않도록 선택된다. F(ab')에 있어서는, 그의 중쇄는 가변 영역과 CH1 영역에 더하여, 중쇄끼리를 결합시키는 시스테인 잔기를 포함하는 힌지부의 전부 또는 일부를 포함한다. F(ab')2는 2개의 F(ab')가 서로의 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. F(ab') 또는 F(ab')2를 형성하는 중쇄를 Fab' 중쇄라고 한다. 또한, 복수의 항체가 직접 또는 링커를 개재시켜 결합하여 이루어지는 2량체, 3량체 등의 중합체도, 항체이다. 더욱이, 이들에 한정하지 않고, 면역글로불린 분자의 일부를 포함하고, 또한 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것은 어느 것도, 본 발명에서 말하는 「항체」에 포함된다. 즉, 본 발명에 있어서 면역글로불린 경쇄라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄라고 할 때는, 면역글로불린 중쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 따라서, 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 한, 예를 들어, Fc 영역이 결실된 것도, 면역글로불린 중쇄이다.
또한, 여기에서 Fc 또는 Fc 영역이란, 항체 분자 중의, CH2 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 2), 및 CH3 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 3)으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 말한다.
더욱이, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는,
(5) 상기 (4)에서 나타낸 Fab, F(ab') 또는 F(ab')2를 구성하는 경쇄와 중쇄를, 링커 서열을 개재시켜 결합시켜, 각각 1본쇄 항체로 한 scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2도 포함된다. 여기에서, scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2에 있어서는, 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다. scFv에 있어서는, 경쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다.
더욱이, 본 명세서에서 말하는 「항체」에는, 완전장 항체, 상기 (1)∼(5)에 나타나는 것에 더하여, 상기 (4) 및 (5)을 포함하는 보다 넓은 개념인, 완전장 항체의 일부가 결손된 것인 항원 결합성 단편(항체 프래그먼트)의 어느 형태도 포함된다.
「항원 결합성 단편」이란 말은, 항원과의 특이적 결합 활성의 적어도 일부를 유지하고 있는 항체의 단편을 말한다. 결합성 단편의 예로서는, 예를 들어 상기 (4) 및 (5)에 나타나는 것에 더하여, Fab, Fab', F(ab')2, 가변 영역(Fv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 적당한 링커로 연결시킨 1본쇄 항체(scFv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 폴리펩티드의 2량체인 다이아보디, scFv의 중쇄(H쇄)에 정상 영역의 일부(CH3)가 결합한 것의 2량체인 미니보디, 그 외의 저분자화 항체 등을 포함한다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다. 또한, 이들 결합성 단편에는, 항체 단백질의 전장 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 이용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「1본쇄 항체」라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 예를 들어, 상기 (2), (3) 및 (5)에 나타나는 것은 1본쇄 항체에 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에 있어서의 「1본쇄 항체」이다. 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄가 결합한 1본쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실되어 있다. 면역글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이들 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 1본쇄 항체에는, 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR의 모두와 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 모두가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실시킨 1본쇄 항체로 할 수도 있다.
1본쇄 항체에 있어서, 면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로부터 구성되는 펩티드쇄이다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 2∼10회, 혹은 2∼5회 반복된 서열을 포함하는 것이다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시키는 경우, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)의 3개가 연속한 것에 상당하는 합계 15개의 아미노산을 포함하는 링커 서열이 적합하다.
본 발명에 있어서, 「인간 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」이란 말은, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 막단백질을 말한다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열 중 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대해서 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 「원숭이 트랜스페린 수용체」 또는 「원숭이 TfR」이란 말은, 특히, 필리핀원숭이(Macaca fascicularis) 유래의 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 막단백질이다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 2로 나타나는 아미노산 서열 중 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(원숭이 TfR의 세포외 영역)에 대해서도 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다.
hTfR에 대한 항체의 제작 방법으로서는, hTfR 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 세포를 이용하여, 재조합 인간 트랜스페린 수용체(rhTfR)를 제작하고, 이 rhTfR을 이용하여 마우스 등의 동물을 면역하여 얻는 방법이 일반적이다. 면역 후의 동물로부터 hTfR에 대한 항체 산생 세포를 취출하고, 이것과 미엘로마 세포를 융합시키는 것에 의해, 항hTfR 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다.
또한, 마우스 등의 동물로부터 얻은 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 rhTfR로 면역하는 것에 의해서도, hTfR에 대한 항체를 산생하는 세포를 취득할 수 있다. 체외 면역법을 이용하는 경우, 그 면역계 세포가 유래하는 동물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 개, 고양이, 말, 및 인간을 포함하는 영장류이고, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트 및 인간이며, 더욱 바람직하게는 마우스 및 인간이다. 마우스의 면역계 세포로서는, 예를 들어, 마우스의 비장으로부터 조제한 비세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포로서는, 인간의 말초혈, 골수, 비장 등으로부터 조제한 세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 면역했을 경우, hTfR에 대한 인간 항체를 얻을 수 있다.
체외 면역법에 의해 면역계 세포를 면역한 후, 세포를 미엘로마 세포와 융합시키는 것에 의해, 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다. 또한, 면역 후의 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응에 의해 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 이들을 이용하여 인공적으로 항체 유전자를 재구축할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻어진 그대로의 하이브리도마 세포에는, hTfR 이외의 단백질을 항원으로서 인식하는 항체를 산생하는 세포도 포함된다. 또한, 항hTfR 항체를 산생하는 하이브리도마 세포의 모두가, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항hTfR 항체를 산생한다고도 할 수 없다.
마찬가지로, 인공적으로 재구축한 항체 유전자에는, hTfR 이외의 단백질을 항원으로서 인식하는 항체를 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 모두가, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항hTfR 항체를 코딩하는 등의 원하는 특성을 구비한다고도 할 수 없다.
따라서, 상기에서 얻어진 그대로의 하이브리도마 세포로부터, 원하는 특성(hTfR에 대한 고친화성 등)을 갖는 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 선택하는 스텝이 필요하다. 또한, 인공적으로 재구축한 항체 유전자에 있어서는, 당해 항체 유전자로부터, 원하는 특성(hTfR에 대한 고친화성 등)을 갖는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 스텝이 필요하다. hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체(고친화성 항체)를 산생하는 하이브리도마 세포, 또는 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 방법으로서, 이하에 상술하는 방법이 유효하다. 한편, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체란, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정되는 hTfR과의 해리 상수(KD)가, 바람직하게는 1X10-8M 이하인 것이고, 보다 바람직하게는 1X10-9M 이하인 것이며, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하인 것이고, 더욱더 더욱 바람직하게는 1X10-11M 이하인 것이다. 예를 들어 적합한 것으로서, 해리 상수가 1X10-13M∼1X10-9M인 것, 1X10-13M∼1X10-10M인 것을 들 수 있다.
예를 들어, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성의 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 하이브리도마 세포의 배양 상청을 첨가하고, 그 다음에 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않은 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 플레이트에 첨가한 하이브리도마 세포의 배양 상청에 포함되는 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지되는 항체의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하여, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 하이브리도마 세포를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포주로서 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 세포주로부터, mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수도 있다.
상기의 인공적으로 재구축한 항체 유전자로부터, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 경우는, 일단, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 호스트 세포에 도입한다. 이 때, 호스트 세포로서 이용하는 세포로서는, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 항체 유전자를 발현시킬 수 있는 세포이면 원핵세포, 진핵세포를 불문하고 특별히 한정은 없지만, 인간, 마우스, 차이니즈 햄스터 등의 포유동물 유래의 세포가 바람직하고, 특히 차이니즈 햄스터 난소 유래의 CHO 세포, 또는 마우스 골수종에서 유래하는 NS/0 세포가 바람직하다. 또한, 항체 유전자를 코딩하는 유전자를 짜넣어 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터는, 포유동물 세포 내에 도입시켰을 때에, 해당 유전자를 발현시키는 것이면 특별히 한정 없이 이용할 수 있다. 발현 벡터에 짜넣어진 해당 유전자는, 포유동물 세포 내에서 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 서열(유전자 발현 제어 부위)의 하류에 배치된다. 본 발명에 있어서 이용할 수 있는 유전자 발현 제어 부위로서는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터, 인간 유비키틴 C 프로모터 등을 들 수 있다.
이와 같은 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포는, 발현 벡터에 짜넣어진 전술한 인공적으로 재구축한 항체를 발현하게 된다. 이와 같이 하여 얻은, 인공적으로 재구축한 항체를 발현하는 세포로부터, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 산생하는 세포를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 재조합 hTfR에 세포의 배양 상청을 접촉시키고, 그 다음에, 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않은 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 세포의 배양 상청에 포함되는 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지된 항체의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하여, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 세포를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포주로서 선택할 수 있고, 나아가서는, hTfR에 대해서 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 세포주로부터, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수 있다.
상기의 인공적으로 재구축한 항체 유전자로부터의, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 선택은, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 대장균에 도입하고, 이 대장균을 배양하여 얻은 배양 상청 또는 대장균을 용해시켜 얻은 항체를 포함하는 용액을 이용하여, 전술한 하이브리도마 세포를 선택하는 경우와 마찬가지의 방법으로, 원하는 유전자를 갖는 대장균을 선택하는 것에 의해서도 할 수 있다. 선택된 대장균주는, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 발현하는 것이다. 이 세포주로부터, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 대장균의 배양 상청 중에 항체를 분비시키는 경우에는, N말단측에 분비 시그널 서열이 결합하도록 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣으면 된다.
고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 다른 방법으로서, 전술한 인공적으로 재구축한 항체 유전자로 코딩된 항체를 파지 입자 상에 보지시켜 발현시키는 방법이 있다. 이 때, 항체 유전자는, 1본쇄 항체를 코딩하는 유전자로서 재구축된다. 항체를 파지 입자 상에 보지하는 방법은, 국제 공개 공보(WO1997/09436, WO1995/11317) 등에 기재되어 있어, 주지이다. 인공적으로 재구축한 항체 유전자로 코딩된 항체를 보지하는 파지로부터, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 보지하는 파지를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을, 플레이트에 첨가하여 보지시킨 후, 파지를 접촉시키고, 그 다음에 플레이트로부터 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않은 파지를 제거하고, 플레이트에 보지된 파지의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 파지 입자 상에 보지된 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지된 파지의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 파지의 양을 측정하여, 보다 많은 파지가 보지된 플레이트에 대응하는 파지 입자를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 파지 입자로서 선택할 수 있고, 나아가서는, hTfR에 대해서 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 파지 입자로부터, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수 있다.
상기의 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 산생하는 하이브리도마 세포 등의 세포, 또는, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 갖는 파지 입자로부터 cDNA 또는 파지 DNA를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 항hTfR 항체의 경쇄, 항hTfR 항체의 중쇄, 또는 항hTfR 항체인 1본쇄 항체의, 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법 등에 의해 증폭하여 단리할 수 있다. 마찬가지로 하여, 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편, 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법 등에 의해 증폭하여 단리할 수도 있다.
이 고친화성을 갖는 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자의 모두 또는 그 일부를 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환 세포를 배양하는 것에 의해, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생시킬 수 있다. 단리된 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 염기 서열로부터 항hTfR 항체의 아미노산 서열을 번역하여, 이 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 인공적으로 합성할 수도 있다. DNA 단편을 인공적으로 합성하는 경우, 적절한 코돈을 선택하는 것에 의해, 호스트 세포에 있어서의 항hTfR 항체의 발현량을 증가시킬 수 있다.
원래의 항hTfR 항체에 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하기 위해서, 단리된 DNA 단편에 포함되는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자에, 적절히 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 후의 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 아미노산 서열에 변이를 가하는 것에 의해, 항hTfR 항체와 결합하는 당쇄의 수, 당쇄의 종류를 개변하여, 생체 내에 있어서의 항hTfR 항체의 안정성을 증가시키는 것 등도 할 수 있다.
항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 경쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가시키는 경우, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 중쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가시키는 경우, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역에 대한 변이와, 상기의 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역에 대한 변이를 조합하여, 항hTfR 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 양방에 변이를 가할 수도 있다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환으로서는, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은, 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다. 단, 본 발명자가 먼저 발견하여 본원 발명과 동종의 효과를 가짐을 확인하고 있는 항체 번호 3(본원 출원 시점에 있어서 미공개)의 hTfR의 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열인 서열 번호 83은, 그 제17번째가 Trp이며, 이것에 반하여 본원 발명에 있어서의 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 프레임워크 영역 3은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 갖고, 그 N말단측으로부터 제17번째가 Leu로 치환된 것이다. 또한, CDR1의 아미노산 서열에 있어서는, 서열 번호 12의 제5번째의 Thr가, 서열 번호 66에서 나타나듯이 Met로 치환된 것이다. Trp와 Leu는 상기의 유사 관계에는 없고, 그리고 Thr와 Met도 상기의 유사 관계에는 없다. 그런데 후술하듯이, 당해 치환을 포함하는 항체 번호 3N은, 예상외로, 항체 번호 3과 효과의 점에서 동종이며, 게다가 한층 더 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 항hTfR 항체에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우에 있어서, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체를 다른 단백질(A)와 융합시켰을 때에 항hTfR 항체와 단백질(A)의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은, 링커의 일부를 구성한다. 항hTfR 항체와 단백질(A)의 융합 단백질에 있어서, 항hTfR 항체와 단백질(A)의 사이에 배치되는 링커에 대해서는 후에 상술한다.
상기의 방법 등에 의해 선택된 hTfR에 대해서 비교적 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포를 배양하여 얻어지는 항hTfR 항체, 및 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 발현시켜 얻어지는 항hTfR 항체는, 그 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 도입하는 것에 의해 원하는 특성을 갖는 항체로 개변시킬 수도 있다. 항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 변이의 도입은, 그 아미노산 서열에 대응하는 유전자에 변이를 가하는 것에 의해 행해진다.
항hTfR 항체는, 그 항체의 가변 영역의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하는 것에 의해, 항체의 hTfR에 대한 친화성을 적절히 조정할 수 있다. 예를 들어, 항체와 항원의 친화성이 높고, 수성액 중에서의 해리 상수가 현저하게 낮은 경우, 이것을 생체 내에 투여했을 때에, 항체가 항원과 해리되지 않고, 그 결과, 기능상의 문제가 생길 가능성이 있다. 이와 같은 경우에, 항체의 가변 영역에 변이를 도입하는 것에 의해, 해리 상수를, 원래의 항체의 2∼5배, 5∼10배, 10∼100배 등으로 단계적으로 조정하여, 목적에 합치한 가장 바람직한 항체를 획득할 수 있다. 반대로, 당해 변이의 도입에 의해, 해리 상수를, 원래의 항체의 1/2∼1/5배, 1/5∼1/10배, 1/10∼1/100배 등으로 단계적으로 조정할 수도 있다.
항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 치환, 결실, 부가 등의 변이의 도입은, 예를 들어, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 주형으로 하여, PCR 등의 방법에 의해, 유전자의 염기 서열의 특정한 부위에 변이를 도입하거나, 또는 랜덤으로 변이를 도입하는 것에 의해 행할 수 있다.
항체와 hTfR의 친화성의 조정을 목적으로 한, 항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 변이의 도입은, 예를 들어, 1본쇄 항체인 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 파지미드에 짜넣고, 이 파지미드를 이용하여 캡시드 표면 상에 1본쇄 항체를 발현시킨 파지를 제작하고, 변이원 등을 작용시키는 것에 의해 1본쇄 항체를 코딩하는 유전자 상에 변이를 도입시키면서 파지를 증식시키고, 증식시킨 파지로부터, 원하는 해리 상수를 갖는 1본쇄 항체를 발현하는 파지를, 전술한 방법에 의해 선택하거나, 또는 일정 조건하에서 항원 컬럼을 이용하여 정제하는 것에 의해, 얻을 수 있다.
상기의 고친화성 항체를 산생하는 세포를 선택하는 방법에 의해 얻어지는, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항체는, 바람직하게는, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정되는 hTfR과의 해리 상수(KD)가, 바람직하게는 1X10-8M 이하인 것이고, 보다 바람직하게는 1X10-9M 이하인 것이고, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하인 것이며, 더욱더 더욱 바람직하게는 1X10-11M 이하인 것이다. 예를 들어 적합한 것으로서, 해리 상수가 1X10-13M∼1X10-9M인 것, 1X10-13M∼1X10-10M인 것을 들 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다. 일단 얻어진 항체는, 변이를 도입하는 등을 하여, 원하는 특성을 갖도록 적절히 개변할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어지는 항hTfR 항체로부터, 원숭이 TfR에 대한 친화성을 갖는 항체를 선택하는 것에 의해, 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 항체를 얻을 수 있다. 원숭이 TfR에 대한 친화성을 갖는 항체는, 예를 들어, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작한 재조합 원숭이 TfR을 이용한 ELISA법 등에 의해 선택할 수 있다. 이 ELISA법에서는, 재조합 원숭이 TfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 항hTfR 항체를 접촉시키고, 그 다음에 재조합 원숭이 TfR과 결합하고 있지 않은 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정한다. 재조합 원숭이 TfR에 대한 친화성이 높을수록 플레이트에 보지되는 항체의 양이 많아지므로, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 항체를, 원숭이 TfR에 친화성을 갖는 항체로서 선택할 수 있다. 한편, 여기에서 말하는 「원숭이」란, 바람직하게는 인간을 제외한 유인원으로 분류되는 것이고, 보다 바람직하게는 긴꼬리원숭이과로 분류되는 것이고, 더욱 바람직하게는 마카크속으로 분류되는 것이고, 예를 들어, 필리핀원숭이 또는 히말라야원숭이이며, 특히 필리핀원숭이는, 평가에 이용하는데 있어서 편의성이 좋다.
인간 및 원숭이의 hTfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 항체는, 이 항체를 투여했을 때의 생체 내에서의 동태를, 원숭이를 이용하여 관찰할 수 있다고 하는 유리한 효과를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항hTfR 항체를 이용하여 의약을 개발하는 경우, 당해 의약의 약물 동태 시험을 원숭이를 이용하여 실시할 수 있기 때문에, 당해 의약의 개발을 현저하게 촉진할 수 있다.
본 발명에 있어서, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖고 또한 원숭이 TfR에 대해서도 친화성을 갖는 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때, 인간 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가 다음의 것이다:
(a) hTfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 2.5X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5X10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하,
(b) 원숭이 TfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1X10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하, 예를 들어 7.5X10-11M 이하.
예를 들어, hTfR 및 원숭이 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-9M 이하, 1X10-11M 이하 및 5X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하, 1X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에도 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-11M, 1X10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
상기의 고친화성 항체를 산생하는 세포를 선택하는 방법에 의해 얻어진, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항체는, 인간 이외의 동물의 항체인 경우, 인간화 항체로 할 수 있다. 인간화 항체란, 항원에 대한 특이성을 유지하면서, 인간 이외의 동물의 항체의 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열을 이용하여 인간 항체의 적절한 영역을, 당해 서열로 치환하는 것(인간 항체에의 당해 서열의 이식)에 의해 얻어지는 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체로서 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR로 치환한 항체를 들 수 있다. 인간 항체에 짜넣어지는 CDR가 유래하는 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 더욱 바람직하게는 마우스이다. 단, 인간 항체의 일부를 다른 인간 항체의 일부로 치환한 항체로 할 수도 있다.
인간화 항체의 제작법은, 당해 기술 분야에서 주지이며, 윈터(Winter) 등이 고안한, 인간 항체의 가변 영역에 있는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을, 비인간 포유동물의 항체의 CDR로 치환하는 방법(Verhoeyen M. Science. 239. 1534-1536(1988))에 기초하는 것이, 가장 일반적이다. 여기에서, 비인간 포유동물의 항체의 CDR뿐만 아니라, CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있는 CDR 외의 영역의 아미노산 서열에 의해, 억셉터가 되는 인간 항체의 대응하는 개소를 치환하는 것이, 도너 항체가 가지는 본래의 활성을 재현하기 위해서 필요한 경우가 있음도 주지이다(Queen C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 10029-10033(1989). 여기에서, CDR 외의 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고도 한다.
항체의 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 모두, 4개의 프레임워크 영역 1∼4(FR1∼4)를 포함한다. FR1은, CDR1에 그 N말단측에서 인접하는 영역이며, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, 그 N말단으로부터 CDR1의 N말단에 인접하는 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어진다. FR2는, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR1과 CDR2 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR3은, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR2와 CDR3 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR4는, CDR3의 C말단에 인접하는 아미노산으로부터 가변 영역의 C말단까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 단, 이것에 한정하지 않고, 본 발명에 있어서는, 상기의 각 FR 영역에 있어서, 그 N말단측의 1∼5개의 아미노산 및/또는 C말단측의 1∼5개의 아미노산을 제외한 영역을, 프레임워크 영역으로 할 수도 있다.
인간화 항체의 제작은, 인간 항체의 가변 영역의 CDR(과 경우에 따라 그 주변의 FR) 대신에, 비인간 포유동물의 항체의 CDR(과 경우에 따라 그 주변의 FR)을 이식하는 작업을 포함한다. 이 작업에 있어서, 바탕이 되는 인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 영역은, 생식 세포 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 등으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식 세포 계열 DNA 서열 및 아미노산 서열은, 「VBase」 인간 생식 세포계 서열 데이터베이스(인터넷에 있어서 www.mrccpe.cam.ac.uk/base에서 입수 가능)로부터 선택할 수 있다. 이 외, 공표된 문헌, 예를 들어 「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, 미국 보건복지성,NIH Publication No. 91-3242(1991)」, 「Tomlinson IM. J. fol. Biol. 227. 776-98(1992)」, 「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24: 827-836(1994)」 등에 기재된 DNA 서열 및 아미노산 서열로부터 선택할 수도 있다.
이상과 같이, 인간화 항체에 있어서, 원래의 인간 항체의 가변 영역에 이식되는 비인간 포유동물의 항체의 영역은, 일반적으로, CDR 그 자체, 또는 CDR과의 주변의 FR을 포함한다. 단, CDR과 함께 이식되는 FR도, CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있어, 실질적으로 항체의 상보성을 결정하는 기능을 갖는다고 생각되므로, 본 발명에 있어서 「CDR」이란 말은, 인간화 항체를 제작하는 경우에, 비인간 포유동물의 항체로부터 인간화 항체에 이식되는 영역, 또는 이식될 수 있는 영역을 말한다. 즉, CDR에는, 일반적으로 FR로 여겨지는 영역이어도, 그것이 CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있어, 실질적으로 항체의 상보성을 결정하는 기능을 갖고 있다고 생각되는 것인 한, 본 발명에 있어서는 CDR에 포함된다.
본 발명의 항hTfR 항체는, 이것을 정맥 주사 등에 의해 생체내에 투여했을 경우, 뇌내의 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 hTfR에 효율 좋게 결합할 수 있다. hTfR과 결합한 항체는, 엔도사이토시스, 트랜스사이토시스 등의 기구에 의해 혈액뇌관문을 통과하여 뇌내에 받아들여진다. 따라서, 뇌내에서 기능시켜야 할 단백질, 저분자 화합물 등을, 본 발명의 항hTfR 항체와 결합시키는 것에 의해, 이들 물질에 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에 도달시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항hTfR 항체는, 혈액뇌관문을 통과한 후에, 대뇌의 뇌실질, 해마의 신경양 세포, 소뇌의 푸르킨예 세포 등에, 또는 적어도 이들 중 어느 것인가에 도달할 수 있다. 그리고, 대뇌의 선조체의 신경양 세포 및 중뇌의 흑질의 신경양 세포에 도달할 것도 예상된다. 따라서, 이들 조직 또는 세포에 작용하는 단백질, 저분자 화합물 등을, 본 발명의 항hTfR 항체와 결합시키는 것에 의해, 이들 조직 또는 세포에 도달시킬 수 있다.
통상이면 혈액뇌관문을 통과할 수 없고, 그 때문에 정맥내 투여에서는 뇌내에서 생리적, 약리적인 작용을 거의 또는 전혀 발휘할 수 없는 물질(단백질, 저분자 화합물 등)을, 혈중으로부터 뇌내로 도달시키고 거기서 작용을 발휘시키는데 있어서, 본 발명의 항hTfR 항체는, 유효한 수단이 될 수 있다. 특히, 본 발명의 항hTfR 항체는 혈액뇌관문을 통과한 후에, 대뇌의 뇌실질, 해마의 신경양 세포, 소뇌의 푸르킨예 세포 등에, 또는 적어도 이들 중 어느 것인가에 도달한다. 그리고, 대뇌의 선조체의 신경양 세포 및 중뇌의 흑질의 신경양 세포에 도달할 것도 예상된다. 따라서, 그들 물질을 본 발명의 항hTfR 항체 분자와 결합한 형태로서 정맥내 투여 등에 의해 혈중 투여하는 것에 의해, 이들 뇌의 조직 또는 세포에 있어서 그들의 작용을 발휘시키거나 또는 강화하는 것이 가능해진다.
항hTfR 항체와 그와 같은 물질(단백질, 저분자 화합물 등)을 결합시키는 방법으로서는, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재시켜 결합시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄 혹은 그 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 항hTfR 항체 또는 단백질, 저분자 화합물 등의 어느 것인가와 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 항hTfR 항체와 단백질, 저분자 화합물 등을 결합시키는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG를 이용하여 본 발명의 항hTfR 항체와 원하는 다른 단백질(A)를 결합시킨 것은, 특히, 항hTfR 항체-PEG-단백질이라고 한다. 항hTfR 항체-PEG-단백질은, 항hTfR 항체와 PEG를 결합시켜 항hTfR 항체-PEG를 제작하고, 그 다음에 항hTfR 항체-PEG와 다른 단백질(A)를 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 항hTfR 항체-PEG-단백질은, 다른 단백질(A)와 PEG를 결합시켜 단백질-PEG를 제작하고, 그 다음에 단백질-PEG와 항hTfR 항체를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 항hTfR 항체 및 다른 단백질(A)와 결합시키려면, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 항hTfR 항체 및 다른 단백질(A) 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 hTfR 항체 및 다른 단백질(A)가 공유 결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=500∼60000이며, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다. 항hTfR 항체와 원하는 저분자 화합물을 결합시키는 경우도 마찬가지이다.
예를 들어, 항hTfR 항체-PEG는, 항hTfR 항체와 알데하이드기를 작용기로서 갖는 폴리에틸렌 글리콜(ALD-PEG-ALD)을, 해당 항체에 대한 ALD-PEG-ALD의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 항hTfR 항체-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 다른 단백질(A)와 반응시키는 것에 의해, 항hTfR 항체-PEG-단백질을 얻을 수 있다. 반대로, 먼저 다른 단백질(A)와 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 단백질-PEG를 제작하고, 그 다음에 단백질-PEG와 항hTfR 항체를 결합시키는 것에 의해서도, 항hTfR 항체-PEG-단백질을 얻을 수 있다.
항hTfR 항체와 다른 단백질(A)는, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 각각 다른 단백질(A)의 N말단 또는 C말단을 펩티드 결합에 의해 결합시킬 수도 있다. 이와 같이 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)를 결합시켜 이루어지는 융합 단백질은, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워서, 다른 단백질(A)를 코딩하는 cDNA가 인프레임으로 배치된 DNA 단편을, 포유동물 세포용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해, 얻을 수 있다. 이 포유동물 세포에는, 다른 단백질(A)를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 경쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입되고, 또한, 다른 단백질(A)를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 중쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도, 동일한 호스트 세포에 도입된다. 항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)를 결합시킨 융합 단백질은, 다른 단백질(A)를 코딩하는 cDNA의 5'말단측 또는 3'말단측에, 직접, 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 끼워서, 1본쇄 항hTfR 항체를 코딩하는 cDNA를 연결한 DNA 단편을, (포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물 또는 대장균 등의 원핵생물 세포용의) 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 이들 세포 중에서 발현시키는 것에 의해, 얻을 수 있다.
항hTfR 항체의 경쇄의 C말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 다른 단백질(A)가, 이 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 경쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 다른 단백질(A)가, 이 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 중쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체의 경쇄의 N말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 다른 단백질(A)가, 이 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 경쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체의 중쇄의 N말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 다른 단백질(A)가, 이 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 중쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
이 때 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개, 보다 바람직하게는 1∼17개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼5개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄이지만, 항hTfR 항체에 결합시켜야 할 다른 단백질(A)에 따라, 링커 서열을 구성하는 아미노산의 개수는, 1개, 2개, 3개, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정할 수 있다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항hTfR 항체가 hTfR과의 친화성을 유지하고, 또한 당해 링커 서열에 의해 연결된 다른 단백질(A)가, 생리적 조건하에서 당해 단백질의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 1∼50개의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 27개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 갖는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser을 포함하는 것은 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산 서열을 포함하는 것은 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 더욱이, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것도 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질에 있어서, 항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열은, 일반적으로 링커 서열을 개재시켜, 결합된다. 이 때, hTfR에 대한 항hTfR 항체의 친화성이 유지되는 한, 경쇄 유래의 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 중쇄 유래의 아미노산 서열이 결합해도 되고, 또한 이와는 반대로, 중쇄 유래의 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 경쇄 유래의 아미노산 서열이 결합해도 된다.
면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄이다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR과 친화성을 유지하고 또한 당해 항체에 결합한 다른 단백질(A)가, 생리적 조건하에서 그 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신으로부터 또는 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 2∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 서열을 포함하는 것이다. 링커 서열의 바람직한 일 태양으로서, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 3개 연속하여 이루어지는 15개의 아미노산으로 이루어지는 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우에 있어서의, 본 발명의 인간화 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 다른 단백질(A)의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 제 1 링커 서열을 개재시켜, 1본쇄 항체가 결합한 것을 예시할 수 있다. 여기에서 이용되는, 1본쇄 항체의 바람직한 일 태양으로서, 서열 번호 65에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 가변 영역의 C말단에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 제 1 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄의 가변 영역이 결합한 것인, 서열 번호 60에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것, 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하는 아미노산 서열에 아미노산 서열 Gly-Gly가 계속되는 32개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜, 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄가 결합한 것인, 서열 번호 98에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우에 있어서의 이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 1개의 펩티드쇄에 복수의 링커 서열이 포함되는 경우, 편의상, 각 링커 서열은 N말단측부터 순차로, 제 1 링커 서열, 제 2 링커 서열과 같이 명명한다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서의, 본 발명의 인간화 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 다른 단백질(A)의 C말단측에, Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 항hTfR 항체 중쇄의 가변 영역과 CH1 영역을 포함하는 영역을 융합시킨 것을 들 수 있다. 이 때 CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부가 포함되어도 되지만, 당해 힌지부는 중쇄 사이의 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서의 적합한 중쇄의 일례로서, 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 서열 번호 61의 아미노산 서열은, 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 Fab이며, 서열 번호 66의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 1번째∼226번째의 부분에 상당한다. 한편, 서열 번호 61의 N말단으로부터 1번째∼118번째의 부분이, 가변 영역(서열 번호 65)에 상당하고, 119번째∼216번째의 부분이 CH1 영역에 상당하며, 217번째∼226번째의 부분이 힌지부에 상당한다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서, 별도의 IgG의 Fc 영역을 융합 단백질에 추가로 도입할 수도 있다. Fc 영역을 융합 단백질에 도입하는 것에 의해, 융합 단백질의 혈중 등의 생체내에서의 안정성을 높일 수 있다. 이러한 Fc 영역을 도입한 융합 단백질로서는, 예를 들어, 다른 단백질(A)의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 중쇄가 결합하여 이루어지는 것이 있다.
다른 단백질(A)와 인간 IgG Fc 영역 사이의 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성된다. 여기서, 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 이와 같은 링커 서열은, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연결하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 인간 IgG Fc 영역과 Fab 중쇄 사이의 링커 서열에 대해서도 마찬가지이다.
한편, 인간 IgG Fc 영역을 도입하는 경우, 인간 IgG Fc 영역은 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 중쇄와 경쇄의 어느 것에 결합시켜도 된다. 또한, 항체는 F(ab')2, F(ab'), 1본쇄 항체를 포함하는 그 외의 항원 결합성 단편이어도 된다.
도입되는 인간 IgG Fc 영역의 IgG의 타입에는 특별히 한정은 없고, IgG1∼IgG5의 어느 것이어도 된다. 또한, 도입되는 인간 IgG Fc 영역은, Fc 영역의 전체여도 되고 그 일부여도 된다. 이러한 인간 IgG Fc 영역의 바람직한 일 실시형태로서, 인간 IgG1의 Fc의 전 영역인, 서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 인간 IgG Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄의 아미노산 서열로서, 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 61)의 N말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG Fc 영역을 결합시킨, 서열 번호 71로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질을, 알부민에 대한 친화성을 갖도록 개변할 수도 있다. 알부민에 대한 친화성은, 융합 단백질에, 알부민에 대해서 친화성을 갖는 화합물, 펩티드, 단백질 등을 결합시키는 것에 의해 달성할 수 있다. 알부민에 대한 친화성을 도입한 융합 단백질은, 적어도 그 일부가 알부민과결합하여 혈중을 순환한다. 알부민은, 이것과 결합한 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는다. 따라서, 알부민에 대한 친화성을 도입하는 것에 의해, 생체내에 투여한 융합 단백질의 혈중에서의 반감기를 장기화할 수 있으므로, 그 약효를 강화할 수 있다. 알부민에 대한 친화성의 도입은, 항hTfR 항체가, 항체의 안정성에 기여하는 Fc 영역을 결여하는 것, 예를 들어, Fab인 경우에 보다 효과적이다.
또한, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질이, 생체내에 투여했을 때에, 면역원성을 나타내는 경우에도, 알부민에 대한 친화성을 도입하는 것은 효과적이다. 융합 단백질의 면역원성을 나타내는 부위가, 융합 단백질이 알부민과 결합하는 것에 의해, 면역 세포에 제시되는 것이 저해되므로, 면역원성이 경감된다.
항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질에, 알부민에 대한 친화성을 도입하는 경우, 이러한 친화성을 도입하는 부분은, 항hTfR 항체의 경쇄, 항hTfR 항체의 중쇄, 다른 단백질(A), 및 링커 부분의 어느 것이어도 되고, 이들의 2 이상의 부분에 도입해도 된다.
알부민에 대해서 친화성을 갖는 펩티드 또는 단백질로서, 예를 들어, 서열 번호 74로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, Streptococcus strain G418 유래의 단백질의 알부민 결합 도메인(Alm T. Biotechnol J. 5. 605-17(2010))을, 알칼리 내성을 나타내도록 개변한 펩티드를 이용할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 알부민에 대해서 친화성을 갖는 펩티드 또는 단백질(알부민 친화성 펩티드)과, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질(항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질)을 결합시키는 방법으로서는, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재시켜 결합시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄 혹은 그의 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 알부민 친화성 펩티드 또는 융합 단백질의 어느 것과 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 알부민 친화성 펩티드와 융합 단백질을 결합시키는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG를 이용하여 알부민 친화성 펩티드와 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질을 결합시킨 것은, 특히, 알부민 친화성 펩티드-PEG-단백질(A) 융합 단백질이라고 한다. 알부민 친화성 펩티드-항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질은, 알부민 친화성 펩티드와 PEG를 결합시켜 알부민 친화성 펩티드-PEG를 제작하고, 그 다음에 알부민 친화성 펩티드-PEG와 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질을 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 알부민 친화성 펩티드-항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질은, 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질과 PEG를 결합시켜 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질을 제작하고, 그 다음에 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질-PEG와 알부민 친화성 펩티드를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질과 결합시키려면, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질이 공유 결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=500∼60000이며, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 알부민 친화성 펩티드-PEG는, 알부민 친화성 펩티드와 알데하이드기 변성 PEG(ALD-PEG-ALD)를, 해당 알부민 친화성 펩티드에 대한 해당 변성 PEG의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 알부민 친화성 펩티드-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질과 반응시키는 것에 의해, 알부민 친화성 펩티드-PEG-항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질이 얻어진다. 반대로, 먼저 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질과 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질-PEG를 제작하고, 그 다음에 융합 단백질-PEG와 알부민 친화성 펩티드를 결합시키는 것에 의해서도, 알부민 친화성 펩티드-PEG-항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질을 얻을 수 있다.
항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질을, 알부민 친화성 펩티드와 융합시킬 수도 있다. 이러한 융합 단백질(항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질-알부민 친화성 펩티드)은, 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질의 중쇄(중쇄와 단백질(A)의 융합 단백질을 포함한다) 또는 경쇄(경쇄와 단백질(A)의 융합 단백질을 포함한다)를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 개재시켜, 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 cDNA가 인프레임으로 배치되는 DNA 단편을, 포유동물 세포용 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해 얻을 수 있다. 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄(또는 중쇄와 단백질(A)의 융합 단백질)와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체를 구성하고 있는 경쇄와 단백질(A)의 융합 단백질(또는 경쇄)을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터도 동일한 호스트 세포에 아울러 도입되고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄(또는 경쇄와 단백질(A)의 융합 단백질)와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 중쇄와 단백질(A)의 융합 단백질(또는 중쇄)을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도 동일한 호스트 세포에 아울러 도입된다. 즉, 알부민 친화성 펩티드는, 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질의 중쇄(중쇄와 단백질(A)의 융합 단백질을 포함한다) 또는 경쇄(경쇄와 단백질(A)의 융합 단백질을 포함한다)의 N말단측 또는 C말단측의 어느 것에 결합시켜도 되지만, 단백질(A)를 항hTfR 항체의 중쇄의 N말단측에 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 C말단측에 결합시키는 것이 바람직하고, 특히 중쇄의 C말단측에 결합시키는 것이 바람직하다.
항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질을 알부민 친화성 펩티드와 융합시키는 경우, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 융합시킬 수 있다. 여기에서 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성된다. 여기서, 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 이와 같은 링커 서열은, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연결하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
알부민 친화성 펩티드를 도입한 항hTfR 항체-단백질(A) 융합 단백질의 알부민과의 결합 친화성은, 실시예 7에 기재된 바이오레이어 간섭법에 의해 측정했을 때, 바람직하게는 1X10-7M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-8M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-9M 이하이다.
Fab 항체는, Fc 영역 또는 알부민 친화성 펩티드의 도입 이외의 방법으로도 혈중에서 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, Fab 항체는, Fab 항체 자체, 또는 Fab 항체와 다른 단백질의 융합체를 PEG 수식시키는 것에 의해 안정화시킬 수 있다. 이러한 수법은, 단백질 의약의 분야에서 일반적으로 실시되고 있고, PEG화된 에리트로포이에틴, 인터페론 등이 의약품으로서 실용화되어 있다. 또한, Fab 항체는, 이것에 변이를 도입하는 것에 의해서도 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 경쇄의 N말단측으로부터 4번째의 메티오닌을 류신으로 치환하는 것에 의해 Fab 항체를 안정화시킬 수 있다. 단, 변이의 도입 방법은 이것으로 한정되지 않고, 중쇄에 변이를 도입해도 된다. 또한, Fab 항체의 안정화 방법은 이들의 것에 한정되지 않고, 주지된 수법은 모두 이용 가능하다.
항hTfR 항체와 결합시켜야 할 다른 단백질(A)에 특별히 한정은 없지만, 생체내에 있어서 생리 활성을 발휘할 수 있는 것이고, 특히, 뇌내에 도달시켜 그 기능을 발휘시켜야 하는 것임에도 불구하고, 그대로는 혈액뇌관문을 통과할 수 없기 때문에, 정맥내 투여로는 뇌내에서 기능시키는 것을 기대할 수 없는 단백질이다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들어, 신경 성장 인자(NGF)나, α-L-이두로니다제(IDUA), 이두론산-2-설파타제(IDS), 글루코세레브로시다제(GBA), β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제(LAMAN), β-만노시다제, 갈락토실세라미다제(GALC), 사포신 C, 아릴설파타제 A(ARSA), α-L-푸코시다제(FUCA1), 아스파틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제(ASM), α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제(GUSB), 헤파란 N-설파타제(SGSH), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제, 산성 세라미다제(AC), 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 아스파틸글루코사미니다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(PPT-1), 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1), 히알루로니다제-1, 산성 α-글루코시다제(GAA), CLN1, CLN2 등의 리소좀 효소를 들 수 있다.
항hTfR 항체와 결합시킨 신경 성장 인자(NGF)는, 알츠하이머병의 치매증 치료약으로서, 항hTfR 항체와 융합시킨 α-L-이두로니다제(IDUA)는 헐러 증후군 또는 헐러-샤이에 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 항hTfR 항체와 융합시킨 이두론산-2-설파타제(IDS)는 헌터 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 글루코세레브로시다제(GBA)는 고셔병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β갈락토시다제는 GM1-강글리오시도시스 1∼3형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, GM2 활성화 단백질은 GM2-강글리오시도시스 AB이형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 A는 샌드호프병 및 테이삭스병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 B는 샌드호프병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제는 I-세포병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-만노시다제(LAMAN)는 α-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-만노시다제는 β-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 갈락토실세라미다제(GALC)는 크라베병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 사포신 C는 고셔병양 축적증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아릴설파타제 A(ARSA)는 이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-L-푸코시다제(FUCA1)는 푸코시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파틸글루코사미니다제는 아스파틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-N-아세틸갈락토사미니다제는 쉰들러병 및 가와사키병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 스핑고미엘리나제(ASM)는 니만-픽병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-갈락토시다제 A는 파브리병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-글루쿠로니다제(GUSB)는 슬라이 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 헤파란 N-설파타제(SGSH), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제 및 N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제는 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 세라미다제(AC)는 파버병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아밀로-1,6-글루코시다제는 코리병(포브스-코리병)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 시알리다제는 시알리다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(PPT-1)은, 신경 세로이드리포푸신증 또는 Santavuori-Haltia병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1)은, 신경 세로이드리포푸신증 또는 Jansky-Bielschowsky병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 히알루로니다제-1은 히알루로니다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 α-글루코시다제(GAA)는 폼페병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, CLN1 및 2는 바텐병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 항hTfR 항체는, 혈액뇌관문을 통과한 후에, 대뇌의 뇌실질, 해마의 신경양 세포, 소뇌의 푸르킨예 세포 등에 도달하고, 또한 대뇌의 선조체의 신경양 세포 및 중뇌의 흑질의 신경양 세포에도 도달한다고 예상되므로, 이들 조직 또는 세포에 있어서 약효를 기능시켜야 할 단백질과 융합시키는 것에 의해, 그 단백질의 약효를 강화할 수 있다. 단, 의약 용도는 이들 질환에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 있어서 치료제로서 이용되는 것은, 질환의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
그 외, 항hTfR 항체와 결합시켜 약효를 발휘할 수 있는 단백질로서는, 리소좀 효소, 모양체 신경 영양 인자(CNTF), 글리아세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레그린 1, 에리트로포이에틴, 다베포에틴, 액티빈, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 6, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 각종 사이토카인, 종양괴사 인자 α 수용체(TNF-α 수용체), PD-1 리간드, PD-L1, PD-L2, 베타아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 항베타아밀로이드 항체, 항BACE 항체, 항EGFR 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항HER2 항체, 항TNF-α 항체, 항CTLA-4 항체, 및 그 외의 항체 의약 등을 들 수 있다.
항hTfR 항체와 결합시킨 리소좀 효소는 리소좀병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, CNTF는 근위축성 측색경화증의 치료제로서, GDNF, 뉴로트로핀 3 및 뉴로트로핀 4/5는 뇌허혈의 치료제로서, GDNF는 파킨슨병의 치료제로서, 뉴레그린 1은 통합 실조증의 치료제로서, 에리트로포이에틴 및 다베포에틴은 뇌허혈의 치료제로서, bFGF 및 FGF2는 외상성의 중추 신경계 장애의 치료제, 뇌외과 수술, 척추 외과 수술 후의 회복에, 베타아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 항베타아밀로이드 항체 및 항BACE 항체는 알츠하이머병의 치료제로서, 항EGFR 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체, 항HER2 항체, 및 항CTLA-4 항체는 뇌종양을 포함하는 중추 신경계의 종양의 치료제로서, TNFαR-항hTfR 항체는 뇌허혈 및 뇌염증성 질환의 치료제로서 사용할 수 있다.
알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경 변성 질환, 통합 실조증, 울증 등의 정신 장애, 다발성 경화증, 근위축성 측색경화증, 뇌종양을 포함하는 중추 신경계의 종양, 뇌장애를 수반하는 리소좀병, 당원병, 근디스트로피, 뇌허혈, 뇌염증성 질환, 프리온병, 외상성의 중추 신경계 장애 등의 질환에 대한 치료제는, 대개 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 다른 단백질(A)가 될 수 있다. 또한, 바이러스성 및 세균성의 중추 신경계 질환에 대한 치료제도, 대개 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 다른 단백질(A)가 될 수 있다. 더욱이, 뇌외과 수술, 척추 외과 수술 후의 회복에도 이용할 수 있는 약제도, 대개 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 다른 단백질(A)가 될 수 있다.
항hTfR 항체와 결합시켜야 할 다른 단백질(A)로서, 상기의 단백질의 천연형(야생형)의 것에 더하여, 천연형(야생형)의 이들 단백질의 1개 또는 복수개의 아미노산이, 다른 아미노산으로 치환, 결실 등이 된 유사물도, 이들 단백질로서의 기능을 완전하게 또는 부분적으로 갖는 한, 이들 단백질에 포함된다. 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이며, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합하여, 원하는 유사물로 할 수도 있다. 더욱이, 천연형(야생형)의 단백질 또는 그의 유사물의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 1개 또는 복수개의 아미노산이 부가된 것도, 이들 단백질로서의 기능을 완전하게 또는 부분적으로 갖는 한, 이들 단백질에 포함된다. 이 때 부가되는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합하여, 원하는 이들 단백질의 유사물로 할 수도 있다.
한편, 이들 다른 단백질(A)에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 이들 단백질을 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 이들 단백질과 항hTfR 항체의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)는, 서열 번호 55로 나타나는 883개의 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다. 단, 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열의 N말단측에 추가로 13개의 아미노산이 부가한 서열 번호 56으로 나타나는 896개의 아미노산으로부터 구성되는 것도 천연형의 hGAA에 포함된다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hGAA를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hGAA가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다. 서열 번호 66의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기 서열로서는 서열 번호 67로 나타나는 것을, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기 서열로서는 서열 번호 69로 나타나는 것을 예시할 수 있다.
인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)는, α-1,4-글루코시다제 또는 산성 말타제라고도 칭해진다. hGAA는, 리소좀 중 글리코겐의 α-1,4- 및 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 것에 의해, 글리코겐을 분해하는 활성을 갖는다. 폼페병은 II형 당원병(GSDII; glycogen storage disease type II)이라고도 하고, 리소좀 내의 산성 α-글루코시다제(산성 말타제) 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 글리코겐 축적에 의해 야기되는 질환이다. 폼페병 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hGAA는 폼페병에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 GAA」 또는 「hGAA」란 말은, 특히 천연형의 hGAA와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hGAA를 말하지만, 이것에 한정되지 않고, hGAA 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hGAA의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hGAA에 포함된다. hGAA의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hGAA의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hGAA에 아미노산을 부가시키는 경우, hGAA의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hGAA의 아미노산 서열은, 원래의 hGAA의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hGAA가 hGAA 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hGAA가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hGAA가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hGAA가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hGAA의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 58로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 서열 번호 59로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 폼페병의 치료제, 특히 폼페병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hGAA의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hGAA에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hGAA의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 I2S(hI2S)는, 서열 번호 50으로 나타나는 525개의 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다. 본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 인간 I2S를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 그 C말단측에서, 아미노산 서열 Gly-Ser로 이루어지는 링커를 개재시켜, 펩티드 결합에 의해 인간 I2S가 결합하여 서열 번호 53의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖는 것은, IgG1 타입의 항hTfR 항체의 중쇄와 hI2S가 융합한 것이고, 당해 중쇄의 부분은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 갖는다. 이 중쇄 부분을 서열 번호 68의 아미노산 서열로 치환하는 것에 의해, IgG4 타입의 항hTfR 항체와 hI2S가 융합한 것으로 할 수도 있다.
인간 I2S(hI2S)는, 글리코사미노글리칸에 속하는 헤파란 황산 및 데르마탄 황산의 황산 에스터 결합을 가수분해하는 활성을 갖는다. 본 효소에 유전적으로 이상을 갖는 헌터 증후군의 환자는, 헤파란 황산 및 데르마탄 황산의 대사 이상이기 때문에, 이들의 부분 분해물이 간장이나 비장 등의 조직 내에 축적되어, 골격 이상 등의 증상을 초래한다. 또한, 헌터 증후군의 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hI2S는 헌터 증후군에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 I2S」 또는 「hI2S」란 말은, 특히 천연형의 hI2S와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, I2S 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hI2S의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hI2S에 포함된다. hI2S의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hI2S의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hI2S에 아미노산을 부가시키는 경우, hI2S의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hI2S의 아미노산 서열은, 원래의 hI2S의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hI2S가 I2S 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hI2S가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hI2S가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hGAA의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 코딩하는 서열 번호 54의 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열(항hTfR 항체 경쇄)을 코딩하는 서열 번호 24의 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 폼페병의 치료제, 특히 폼페병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG1 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hGAA의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 인간 I2S에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 인간 I2S의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은, 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 α-L-이두로니다제(hIDUA)는, 서열 번호 75 또는 76으로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다. 서열 번호 76으로 나타나는 hIDUA는, 서열 번호 75로 나타나는 것의 N말단측에, Ala-Pro가 부가된 타입의 것이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hIDUA를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hIDUA가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
인간 α-L-이두로니다제(hIDUA)는, 데르마탄 황산, 헤파란 황산 분자 중에 존재하는 이두론산 결합을 가수분해하는 리소좀 효소이다. 헐러 증후군은 뮤코다당증 I형이라고도 하고, 리소좀 내의 α-L-이두로니다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 데르마탄 황산 등의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 헐러 증후군 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hIDUA는 헐러 증후군에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 IDUA」 또는 「hIDUA」란 말은, 특히 천연형의 hIDUA와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hIDUA를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hIDUA 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hIDUA의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hIDUA에 포함된다. hIDUA의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hIDUA의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hIDUA에 아미노산을 부가시키는 경우, hIDUA의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hIDUA의 아미노산 서열은, 원래의 hIDUA의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hIDUA가 hIDUA 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hIDUA가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hIDUA가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hIDUA가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hIDUA의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 90으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 헐러 증후군의 치료제, 특히 헐러 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hIDUA의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hIDUA에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hIDUA의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(hPPT-1)은, 서열 번호 77로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hPPT-1을 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hPPT-1이 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
신경 세로이드리포푸신증(Santavuori-Haltia병을 포함한다)은, 리소좀 내의 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 세로이드리포푸신의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 신경 세로이드리포푸신증 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hPPT-1은 신경 세로이드리포푸신증에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 PPT-1」 또는 「hPPT-1」이란 말은, 특히 천연형의 hPPT-1과 동일한 아미노산 서열을 갖는 hPPT-1을 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hPPT-1 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hPPT-1의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hPPT-1에 포함된다. hPPT-1의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hPPT-1의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hPPT-1에 아미노산을 부가시키는 경우, hPPT-1의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hPPT-1의 아미노산 서열은, 원래의 hPPT-1의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hPPT-1이 hPPT-1 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hPPT-1이 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hPPT-1이 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hPPT-1이 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hPPT-1의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 100으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 신경 세로이드리포푸신증의 치료제, 특히 신경 세로이드리포푸신증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hPPT-1의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hPPT-1에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hPPT-1의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 산성 스핑고미엘리나제(hASM)는, 서열 번호 78로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hASM를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hASM이 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
인간 산성 스핑고미엘리나제(hASM)는, 스핑고미엘린을 콜린인산과 세라미드로 가수분해하는 리소좀 효소이다. 니만-픽병은, 그 병인 및 증상의 차이에 의해 A∼F형으로까지 분류된다. 이 중에서, A형과 B형의 병인이 되는 것이 산성 스핑고미엘리나제(ASM)의 유전적 결손이다. 니만-픽병은, 리소좀 내의 산성 스핑고미엘리나제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의, 스핑고미엘린의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 니만-픽 병환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hASM는 니만-픽병에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 ASM」 또는 「hASM」이란 말은, 특히 천연형의 hASM와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hASM를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hASM 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hASM의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hASM에 포함된다. hASM의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hASM의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hASM에 아미노산을 부가시키는 경우, hASM의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hASM의 아미노산 서열은, 원래의 hASM의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hASM이 hASM 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hASM이 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hASM이 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hASM이 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hASM의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 106으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 니만-픽병의 치료제, 특히 니만-픽병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hASM의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hASM에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hASM의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 아릴설파타제 A(hARSA)는, 서열 번호 79로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hARSA를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hARSA가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)은, 리소좀 내의 아릴설파타제 A 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 설파티드 등의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 이염성 백질 변성증 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hARSA는 이염성 백질 변성증에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 ARSA」 또는 「hARSA」란 말은, 특히 천연형의 hARSA와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hARSA를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hARSA 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hARSA의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hARSA에 포함된다. hARSA의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hARSA의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hARSA에 아미노산을 부가시키는 경우, hARSA의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hARSA의 아미노산 서열은, 원래의 hARSA의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hARSA가 hARSA 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hARSA가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hARSA가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hARSA가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hARSA의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 115로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 이염성 백질 변성증의 치료제, 특히 이염성 백질 변성증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hARSA의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hARSA에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hARSA의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 헤파란 N-설파타제(hSGSH)는, 서열 번호 80으로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hSGSH를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hSGSH가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
산필리포 증후군은 뮤코다당증 II형(MPS III형)이라고도 하고, 리소좀 내의 헤파란 N-설파타제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 헤파란 황산의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 단, α-N-아세틸글루코사미니다제 등의 다른 효소의 결손도 병인이 될 수도 있다. 산필리포 증후군 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hSGSH는 산필리포 증후군에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 SGSH」 또는 「hSGSH」란 말은, 특히 천연형의 hSGSH와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hSGSH를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hSGSH 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hSGSH의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hSGSH에 포함된다. hSGSH의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hSGSH의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hSGSH에 아미노산을 부가시키는 경우, hSGSH의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hSGSH의 아미노산 서열은, 원래의 hSGSH의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hSGSH가 hSGSH 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hSGSH가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hSGSH가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hSGSH가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hSGSH의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 124로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 산필리포 증후군의 치료제, 특히 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hSGSH의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hSGSH에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hSGSH의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 글루코세레브로시다제(hGBA)는, 서열 번호 81로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hGBA를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hGBA가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
인간 글루코세레브로시다제(hGBA)는, 당지질 글루코세레브로시드(또는 글루코실세라미드)를 가수분해하는 리소좀 효소이다. 고셔병은, 리소좀 내의 글루코세레브로시다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 글루코세레브로시드의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 고셔병 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hGBA는 고셔병에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 GBA」 또는 「hGBA」란 말은, 특히 천연형의 hGBA와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hGBA를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hGBA 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hGBA의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hGBA에 포함된다. hGBA의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hGBA의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hGBA에 아미노산을 부가시키는 경우, hGBA의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hGBA의 아미노산 서열은, 원래의 hGBA의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hGBA가 hGBA 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hGBA가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hGBA가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hGBA가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hGBA의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 130으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 고셔병의 치료제, 특히 고셔병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hGBA의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hGBA에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hGBA의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 트라이펩티딜펩티다제-1(hTPP-1)은, 서열 번호 82로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hTPP-1을 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTPP-1이 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
신경 세로이드리포푸신증(Santavuori-Haltia병을 포함한다)은 리소좀 내의 트라이펩티딜펩티다제-1 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 리포푸신의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 신경 세로이드리포푸신증자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hTPP-1은 신경 세로이드리포푸신증에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 TPP-1」 또는 「hTPP-1」이란 말은, 특히 천연형의 hTPP-1과 동일한 아미노산 서열을 갖는 hTPP-1을 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hTPP-1 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hTPP-1의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hTPP-1에 포함된다. hTPP-1의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hTPP-1의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hTPP-1에 아미노산을 부가시키는 경우, hTPP-1의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hTPP-1의 아미노산 서열은, 원래의 hTPP-1의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hTPP-1이 hTPP-1 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hTPP-1이 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hTPP-1이 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hTPP-1이 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hTPP-1의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 136으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 신경 세로이드리포푸신증 치료제, 특히 신경 세로이드리포푸신증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hTPP-1의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hTPP-1에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hTPP-1의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(hNAGLU)는, 서열 번호 83으로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hNAGLU를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hNAGLU가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
산필리포 증후군은, 리소좀 내의 α-N-아세틸글루코사미니다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 헤파란 황산의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 산필리포 증후군 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hNAGLU는 산필리포 증후군에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 NAGLU」 또는 「hNAGLU」란 말은, 특히 천연형의 hNAGLU와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hNAGLU를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hNAGLU 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hNAGLU의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hNAGLU에 포함된다. hNAGLU의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hNAGLU의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hNAGLU에 아미노산을 부가시키는 경우, hNAGLU의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hNAGLU의 아미노산 서열은, 원래의 hNAGLU의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hNAGLU가 hNAGLU 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hNAGLU가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hNAGLU가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hNAGLU가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hNAGLU의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 142로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 산필리포 증후군의 치료제, 특히 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hNAGLU의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hNAGLU에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hNAGLU의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 β-글루쿠로니다제(hGUSB)는, 서열 번호 84로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hGUSB를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hGUSB가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
슬라이 증후군은 뮤코다당증 VII형(MPS VII형)이라고도 하고, 리소좀 내의 β-글루쿠로니다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 뮤코다당의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 슬라이 증후군 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hGUSB는 슬라이 증후군에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 GUSB」 또는 「hGUSB」란 말은, 특히 천연형의 hGUSB와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hGUSB를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hGUSB 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hGUSB의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hGUSB에 포함된다. hGUSB의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hGUSB의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hGUSB에 아미노산을 부가시키는 경우, hGUSB의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hGUSB의 아미노산 서열은, 원래의 hGUSB의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hGUSB가 hGUSB 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hGUSB가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hGUSB가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hGUSB가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hGUSB의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 150으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hGUSB의 융합 단백질이다. 제조된 융합 단백질은 슬라이 증후군의 치료제, 특히 슬라이 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hGUSB에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hGUSB의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 갈락토실세라미다제(hGALC)는, 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hGALC를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hGALC가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
크라베병은, 갈락토실세라미다제 활성의 결손에 의해 야기되는 질환이다. 크라베병 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hGALC는 크라베병에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 GALC」 또는 「hGALC」란 말은, 특히 천연형의 hGALC와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hGALC를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hGALC 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hGALC의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hGALC에 포함된다. hGALC의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hGALC의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hGALC에 아미노산을 부가시키는 경우, hGALC의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hGALC의 아미노산 서열은, 원래의 hGALC의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hGALC가 hGALC 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hGALC가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hGALC가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hGALC가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hGALC의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 158로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 크라베병의 치료제, 특히 크라베병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hGALC의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hGALC에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hGALC의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 산성 세라미다제(hAC)는, 서열 번호 86으로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hAC를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hAC가 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
파버병은 리소좀 내의 산성 세라미다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 세라미드의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 파버병 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hAC는 파버병에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 AC」 또는 「hAC」란 말은, 특히 천연형의 hAC와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hAC를 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hAC 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hAC의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hAC에 포함된다. hAC의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hAC의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hAC에 아미노산을 부가시키는 경우, hAC의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hAC의 아미노산 서열은, 원래의 hAC의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hAC가 hAC 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hAC가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hAC가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hAC가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hAC의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 166으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 파버병의 치료제, 특히 파버병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hAC의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hAC에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hAC의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 α-L-푸코시다제(hFUCA1)는, 서열 번호 87로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hFUCA1를 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hFUCA1이 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
푸코시도시스는 리소좀 내의 α-L-푸코시다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 푸코스 함유 올리고당의 축적에 의해 야기되는 질환이다. 푸코시도시스 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hFUCA1은 푸코시도시스에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 FUCA1」 또는 「hFUCA1」이란 말은, 특히 천연형의 hFUCA1와 동일한 아미노산 서열을 갖는 hFUCA1을 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hFUCA1 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hFUCA1의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hFUCA1에 포함된다. hFUCA1의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hFUCA1의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hFUCA1에 아미노산을 부가시키는 경우, hFUCA1의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hFUCA1의 아미노산 서열은, 원래의 hFUCA1의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hFUCA1이 hFUCA1 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hFUCA1이 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hFUCA1이 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hFUCA1이 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hFUCA1의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 174로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 푸코시도시스의 치료제, 특히 푸코시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hFUCA1의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hFUCA1에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hFUCA1의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
천연형의 인간 α-만노시다제(hLAMAN)는, 서열 번호 88로 나타나는 아미노산 서열로부터 구성되는 리소좀 효소의 일종이다.
본 발명에 있어서의, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 천연형의 hLAMAN을 융합시킨 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서, 경쇄가 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 66 또는 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지고, 그 C말단측에 펩티드 결합에 의해 링커 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hLAMAN이 결합하여 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG1 타입의 항hTfR 항체이며, 서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은 IgG4 타입의 항hTfR 항체이다.
인간 α-만노시다제(hLAMAN)는, α 형태의 만노스를 가수분해하는 리소좀 효소이다. α-만노시도시스는, 리소좀 내의 α-만노시다제 활성의 결손에 수반하는 세포 내의 만노스 함유 올리고당의 축적에 의해 야기되는 질환이다. α-만노시도시스 환자는 중추 신경 장애를 수반하는 경우가 있다. 항hTfR 항체와 결합시킨 hLAMAN은 α-만노시도시스에 수반하는 중추 신경 장애의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 LAMAN」 또는 「hLAMAN」이란 말은, 특히 천연형의 hLAMAN과 동일한 아미노산 서열을 갖는 hLAMAN을 말하지만, 이것에 한정하지 않고, hLAMAN 활성을 갖는 것인 한, 천연형의 hLAMAN의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 것도 hLAMAN에 포함된다. hLAMAN의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. hLAMAN의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. hLAMAN에 아미노산을 부가시키는 경우, hLAMAN의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 hLAMAN의 아미노산 서열은, 원래의 hLAMAN의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편 여기에서, hLAMAN이 hLAMAN 활성을 갖는다고 할 때는, 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에, 천연형의 hLAMAN이 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성을 갖고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성은, 천연형의 hLAMAN이 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 hLAMAN이 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
항hTfR 항체와 hLAMAN의 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 182로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터에 의해, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 제조된 융합 단백질은 α-만노시도시스의 치료제, 특히 α-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 융합 단백질은, IgG4 타입의 인간화 항hTfR 항체와 hLAMAN의 융합 단백질이다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hLAMAN에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체와 hLAMAN의 사이에 배치되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
상기와 같이 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질에 대해, 다른 단백질(A)가 hGAA, hI2S, hIDUA, hPPT-1, hASM, hARSA, hSGSH, hGBA, hTTP-1, hNAGLU, hGUSB, hAC, hFUca1, 및 hLAMAN인 융합 단백질을 각각 예시했지만, 항hTfR 항체와 이들을 포함하는 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 바람직한 실시형태에 있어서, 항hTfR 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열은, 항체가 hTfR에 대한 특이적인 친화성을 갖는 것인 한, 특별히 제한은 없다.
단, 여기에서 이용되는 항TfR 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때에,
인간의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 1X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5X10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하인 것이고,
원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하, 예를 들어 7.5X10-11M 이하인 것이다.
예를 들어, 인간의 TfR 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-9M 이하, 1X10-11M 이하 및 5X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하, 1X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-11M, 1X10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
항hTfR 항체에는, 항hTfR 항체에 다른 단백질(A)를 결합시키는 것과 동일한 수법에 의해, 비교적 짧은 펩티드쇄를 결합시킬 수도 있다. 항hTfR 항체에 결합시켜야 할 펩티드쇄는, 그 펩티드쇄가 원하는 생리 활성을 갖는 것인 한 한정은 없고, 예를 들어, 각종 단백질의 생리 활성을 발휘하는 영역의 아미노산 서열을 갖는 펩티드쇄를 들 수 있다. 펩티드쇄의 쇄길이는 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 2∼200개의 아미노산으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어 5∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 것이다.
항hTfR 항체에 저분자 물질을 결합시키는 경우, 후보가 되는 저분자 물질에 특별히 한정은 없지만, 뇌내에 도달시켜 그 기능을 발휘시켜야 할 것임에도 불구하고, 그대로는 혈액뇌관문을 통과할 수 없기 때문에, 정맥내 투여로는 뇌내에서 기능시킬 것을 기대할 수 없는 저분자 물질이다. 예를 들어, 이러한 저분자 물질로서, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 부설판, 티오테바, 니무스틴, 라니무스틴, 다카바진, 프로카바진, 테모졸로마이드, 카르무스틴, 스트렙토조토신, 펜다무스틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 5-플루오로우라실, 설파다이아진, 설파메톡사졸, 메토트렉세이트, 트리메토프림, 피리메타민, 플루오로우라실, 플루시토신, 아자티오프린, 펜토스타틴, 하이드록시유레아, 플루다라빈, 시타라빈, 젬시타빈, 이리노테칸, 독소루비신, 에토포시드, 레포플록사신, 시프로플록사신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 파클리탁셀, 도데탁셀, 마이토마이신 C, 독소루비신, 에피루비신 등의 항암제를 들 수 있다. 그 외, 항hTfR 항체와 결합시켜야 할 저분자 물질로서 siRNA, 안티센스 DNA, 짧은 펩티드를 들 수 있다.
항hTfR 항체와 저분자 물질을 결합시키는 경우, 저분자 물질은 경쇄 또는 중쇄의 어느 한쪽에만 결합시켜도 되고, 또한, 경쇄와 중쇄의 각각에 결합시켜도 된다. 또한, 항hTfR 항체는, hTfR에 대한 친화성을 갖는 것인 한, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열, 및/또는 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이어도 된다.
알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경 변성 질환, 통합 실조증, 울증 등의 정신 장애, 다발성 경화증, 근위축성 측색경화증, 뇌종양을 포함하는 중추 신경계의 종양, 뇌장애를 수반하는 리소좀병, 당원병, 근디스트로피, 뇌허혈, 뇌염증성 질환, 프리온병, 외상성의 중추 신경계 장애 등의 질환에 대한 치료제는, 일반적으로 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 저분자 물질 후보가 될 수 있다. 또한, 바이러스성 및 세균성의 중추 신경계 질환에 대한 치료제도, 일반적으로 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 저분자 물질 후보가 될 수 있다. 더욱이, 뇌외과 수술, 척추 외과 수술 후의 회복에도 이용할 수 있는 약제도, 일반적으로 항hTfR 항체와 융합시켜야 할 저분자 물질 후보가 될 수 있다.
항hTfR 항체가, 인간 이외의 동물의 것인 경우, 이것을 인간에게 투여했을 때에, 당해 항체에 대한 항원 항체 반응을 야기하여, 바람직하지 않은 부작용이 생길 우려가 높다. 인간 이외의 동물의 항체는, 인간화 항체로 함으로써 그와 같은 항원성을 감소시킬 수 있어, 인간에게 투여했을 때의 항원 항체 반응에 기인하는 부작용의 발생을 억제할 수 있다. 또한, 원숭이를 이용한 실험에 의하면, 인간화 항체는, 마우스 항체와 비교하여, 혈중에서 보다 안정되는 것이 보고되어 있어, 치료 효과를 그만큼 장기간 지속시킬 수 있다고 생각된다. 항원 항체 반응에 기인하는 부작용의 발생은, 항hTfR 항체로서 인간 항체를 이용하는 것에 의해서도 억제할 수 있다.
항hTfR 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우에 대해, 이하에 더욱 상세하게 설명한다. 인간 항체의 경쇄에는, λ쇄와 κ쇄가 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 경쇄는, λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 된다. 또한, 인간의 중쇄에는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄가 있고, 각각, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하고 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 중쇄는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 γ쇄이다. 더욱이, 인간의 중쇄의 γ쇄에는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄가 있고, 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대응하고 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 중쇄가 γ쇄인 경우, 그 γ쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 항hTfR 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체이며, 또한 IgG인 경우, 인간 항체의 경쇄는 λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 되고, 인간 항체의 중쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 예를 들어, 바람직한 항hTfR 항체의 하나의 태양으로서, 경쇄가 λ쇄이며 중쇄가 γ1쇄인 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)는, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 다른 단백질(A)의 C말단(또는 N말단)을, 각각 펩티드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 다른 단백질(A)를 항hTfR 항체의 중쇄의 N말단측(또는 C말단측)에 결합시키는 경우, 항hTfR 항체의 γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 또는 ε쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 다른 단백질(A)의 C말단(또는 N말단)이, 펩티드 결합에 의해 각각 결합된다. 항hTfR 항체의 경쇄의 N말단측(또는 C말단측)에 다른 단백질(A)를 결합시키는 경우, 항hTfR 항체의 λ쇄 또는 κ쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 다른 단백질(A)의 C말단(또는 N말단)이, 펩티드 결합에 의해 각각 결합된다. 단, 항hTfR 항체가, Fab 영역으로 이루어지는 것 또는 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab')2 및 F(ab'))인 경우, 다른 단백질(A)는, Fab, F(ab')2 및 F(ab')를 구성하는 중쇄 또는 경쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 그 C말단(또는 N말단)을 펩티드 결합에 의해 각각 결합시킬 수 있다.
인간화 항체 또는 인간 항체인 항hTfR 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 융합 단백질에 있어서, 항인간 트랜스페린 수용체 항체는, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
인간화 항체 또는 인간 항체인 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 다른 단백질(A)를 결합시킨 융합 단백질에 있어서, 항인간 트랜스페린 수용체 항체는, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 다른 단백질(A)는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체 또는 인간 항체와 다른 단백질(A)의 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄이지만, 항hTfR 항체에 결합시켜야 할 다른 단백질(A)에 따라, 링커 서열을 구성하는 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개 등으로 적절히 조정된다. 그와 같은 링커 서열은, 당해 링커 서열에 의해 연결된 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)가, 각각의 기능(hTfR에 대한 친화성, 및 생리적 조건하에서의 활성 또는 기능)을 유지하고 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이고, 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 서열을 포함하는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산 서열을 포함하는 것을, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것도, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
한편 여기에서, 항hTfR 항체 또는 인간 항체와 융합시킨 다른 단백질(A)가, 당해 다른 단백질(A)의 생리적 조건하에서의 활성 또는 기능을 유지하고 있다고 할 때 또는 단지 활성을 갖는다고 할 때는, 천연형인 다른 단백질(A)가 본래 갖는 활성에 대해서, 3% 이상의 활성 또는 기능을 유지하고 있는 것을 말한다. 단, 그 활성 또는 기능은, 천연형의 다른 단백질(A)가 본래 갖는 활성에 대해서, 10% 이상인 것이 바람직하고, 20% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 보다 바람직하다. 항hTfR 항체와 융합시킨 다른 단백질(A)가 변이를 가한 것인 경우도 마찬가지이다.
본 발명에 있어서의, 인간화 항hTfR 항체 또는 인간 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 한층 더 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 다른 단백질(A)를 융합시킨 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서의, 본 발명의 인간화 항hTfR 항체 또는 인간 항체와 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 다른 단백질(A)의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 항hTfR 항체 중쇄의 가변 영역과 CH1 영역을 포함하는 영역을 융합시킨 것을 들 수 있다. 이 때 CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부가 포함되어도 되지만, 당해 힌지부는, 중쇄 사이의 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
항hTfR 항체의 hTfR에 대한 특이적 친화성은, 주로 항hTfR 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열에 의존한다. 그들 CDR의 아미노산 서열은, 항hTfR 항체가 hTfR에 더하여 원숭이 hTfR에 대한 특이적인 친화성을 갖는 것인 한, 특별히 제한은 없다.
단, 본 발명에 있어서는, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항체로서, 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 인간화 항hTfR 항체 또는 인간 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때에,
인간의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 2.5X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5X10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하인 것이고,
원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하, 예를 들어 7.5X10-11M 이하인 것이다.
예를 들어, 인간의 TfR 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-9M 이하, 1X10-11M 이하 및 5X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하, 1X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-11M, 1X10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 실시형태로서, 중쇄의 가변 영역에 있어서:
(a) CDR1이 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체를 예시할 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 보다 구체적인 실시형태로서, 중쇄의 가변 영역에 있어서:
(a) CDR1이 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항체를 예시할 수 있다.
상기의 hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 실시형태, 및 hTfR에 친화성을 갖는 항체의 보다 구체적인 실시형태에 있어서, 항체의 중쇄의 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열로서 적합한 것으로, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 경쇄와 중쇄의 조합으로서는, 가변 영역에 있어서 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
(a) CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는
것인 경쇄와,
(d) CDR1이 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(e) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 포함하여 이루어지고, 또한
(f) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 포함하여 이루어지는 것인
중쇄의 조합.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 경쇄와 중쇄의 조합의 구체적 태양으로서는, 가변 영역에 있어서 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
CDR1로서 서열 번호 6, CDR2로서 서열 번호 8, 및 CDR3으로서 서열 번호 10의 아미노산 서열을 각각 포함하여 이루어지는 것인 경쇄와, CDR1로서 서열 번호 62, CDR2로서 서열 번호 13, 및 CDR3로서 서열 번호 15의 아미노산 서열을 각각 포함하여 이루어지는 것인 중쇄의 조합.
상기의 hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 경쇄와 중쇄의 조합, 및 hTfR에 친화성을 갖는 항체의 경쇄와 중쇄의 조합의 구체적 태양에 있어서, 항체의 중쇄의 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열로서 적합한 것으로, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 바람직한 실시형태로서는, 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
항hTfR 항체로서, 경쇄의 가변 영역이, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 중쇄의 가변 영역이, 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는, 항hTfR 항체.
서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 및 서열 번호 22로 나타나는, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, CDR1이 서열 번호 6 또는 7, CDR2가 서열 번호 8 또는 9, 및 CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 단, 서열 번호 17∼22에 기재된 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서, CDR이라고 할 때는, CDR의 서열은 이들로 한정되는 것은 아니고, 이들 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 CDR의 아미노산 서열의 임의의 연속한 3개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다.
서열 번호 65로 나타나는 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은,
(a) CDR1이 서열 번호 62 또는 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고, 추가로, 프레임워크 영역 3으로서 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 단, 서열 번호 65로 나타나는 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서, CDR이라고 할 때는, CDR의 서열은 이들로 한정되는 것은 아니고, 이들 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 CDR의 아미노산 서열의 임의의 연속한 3개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다. 프레임워크 영역에 대해서도 마찬가지이다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태로서는,
경쇄의 가변 영역이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄의 가변 영역이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄의 가변 영역이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 것, 및
경쇄의 가변 영역이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 것
을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태로서는,
경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것, 및
경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것
을 들 수 있다. 한편, 상기의 구체적인 실시형태에 있어서, 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것은 IgG1 타입의 항체이며, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것은 IgG4 타입의 항체이다. 모두 가변 영역으로서 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, hTfR에 친화성을 갖는 Fab인 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태로서는,
경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것
을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서, 별도의 Fc 영역을 Fab 중쇄에 도입한 것의 구체적 실시예로서는,
경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것,
경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
상기의 별도의 Fc 영역을 Fab 중쇄에 도입하는 경우에 있어서, 예를 들어, 다른 단백질(A)의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄를 결합시킬 수 있다. 한편, 서열 번호 71로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것은, 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열(아미노산 서열 61)의 N말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)이 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG Fc 영역을 결합시킨 것이다.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 실시형태를 상기와 같이 예시했다. 이들 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄는, 그 가변 영역의 아미노산 서열에, 항hTfR 항체와 hTfR의 친화성을 원하는 것으로 조정 등을 할 목적으로, 적절히, 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가할 수 있다.
경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
경쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가하는 경우, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
특히, 경쇄의 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
경쇄의 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중에 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
중쇄의 가변 영역인 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
중쇄의 가변 영역인 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열에 아미노산을 부가시키는 경우, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
특히, 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열 중의, 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 각 CDR의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열 중의, 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중에 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편, 상기와 같이 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역인 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열에, 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하는 경우에 있어서, 원이 되는 서열 번호 62 또는 63으로 나타나는 CDR1의 N말단측으로부터 5번째의 아미노산인 메티오닌과 서열 번호 64로 나타나는 프레임워크 영역 3의 N말단측으로부터 17번째의 아미노산인 류신은 원래와 동일한 위치에 보존되는 것이 바람직하다. 또한, 중쇄의 CDR1 및 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열도 원래와 동일한 위치에 보존되는 것이 바람직하다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역에 대한 변이와, 상기의 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역에 대한 변이를 조합하여, 항hTfR 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 양방에 변이를 가할 수도 있다.
상기의 항hTfR 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환으로서는, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다.
한편, 항hTfR 항체에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체를 다른 단백질(A)와 융합시켰을 때에, 항hTfR 항체와 다른 단백질(A)의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은 링커의 일부를 구성한다.
상기에 예시한 hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체를 포함하는 항체의 바람직한 실시형태에 있어서, 항hTfR 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열은, 항체가 hTfR 및 원숭이 TfR에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인 한, 특별히 제한은 없다.
단, 본 발명에 있어서는, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항체로서, 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 인간화 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때에,
인간의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 2.5X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5X10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하인 것이고,
원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-10M 이하, 예를 들어 7.5X10-11M 이하인 것이다.
예를 들어, 인간의 TfR 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-9M 이하, 1X10-11M 이하 및 5X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 5X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하, 1X10-12M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-12M 이하 및 7.5X10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5 X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5X10-11M, 1X10-11M, 1X10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
상기의 구체적인 실시형태로서 나타낸 hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체와, 다른 단백질(A)의 융합 단백질의 구체적인 실시형태로서는, 다른 단백질(A)가, 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA), 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S), 인간 α-L-이두로니다제(hIDUA), 인간 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(hPPT-1), 인간 산성 스핑고미엘리나제(hASM), 인간 아릴설파타제 A(hARSA), 인간 헤파란 N-설파타제(hSGSH), 인간 글루코세레브로시다제(hGBA), 인간 트라이펩티딜펩티다제-1(hTPP-1), 인간 α-N-아세틸글루코사미니다제(hNAGLU), 인간 β-글루쿠로니다제(hGUSB), 인간 산성 세라미다제(hAC), 인간 α-L-푸코시다제(hFUCA1), 및 α-만노시다제(hLAMAN)인 것을 들 수 있다.
다른 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hGAA는 서열 번호 55 또는 56의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hGAA가 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 57로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGAA가 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 58로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것을 예시할 수 있다. (1)은 항체가 IgG1 타입, (2)는 항체가 IgG4 타입의 것이 된다. 또한, hGAA는 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖는 것이다.
여기에서, 상기 (1)에 있어서 서열 번호 57에 포함되는 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 66으로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (2)에 있어서 서열 번호 58에 포함되는 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (2)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)이며 인간화 항체가 Fab 항체인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hGAA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
다른 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)이며 인간화 항체가 Fab 항체인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는, hGAA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 89로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것을 들 수 있다.
다른 단백질(A)가 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)인 융합 단백질은 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 것이고, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때에,
원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-11M 이하인 것이고,
인간의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-11M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하인 것이다.
예를 들어, 원숭이의 TfR 및 인간의 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-10M 이하 및 1X10-11M 이하, 1X10-10M 이하 및 1X10-12M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-11M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-11M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-12M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-11M, 1X10-12M, 1 X10-13M 등으로 할 수 있다. 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-12M, 5X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
다른 단백질(A)가 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다.
다른 단백질(A)가 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
hI2S가 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 53으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것을 예시할 수 있다. 이 경우, 항체는 IgG1 타입이다. 서열 번호 53에 포함되는 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 66으로 나타나는 것이다. 즉, 이 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 항체를 IgG4 타입으로 하는 것도 가능하고, 이 경우는, 중쇄를 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것으로부터 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 치환하면 된다.
다른 단백질(A)가 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)이며 인간화 항체가 Fab 항체인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hI2S가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
다른 단백질(A)가 (hIDUA)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hIDUA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hIDUA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hIDUA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hIDUA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hIDUA는 서열 번호 75 또는 76의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hIDUA)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hIDUA가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 90으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hIDUA가, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 8회 연속하는 합계 42개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 91로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hIDUA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 92로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hIDUA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 93으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hIDUA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 94로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hIDUA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 95로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hIDUA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 96으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hIDUA가 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 97로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(9) 서열 번호 98로 나타나는 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N(2)의 C말단측에서, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열에 아미노산 서열 Gly-Gly가 계속되는 7개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜, hIDUA가 결합하는 것인, 서열 번호 99로 나타나는 것을 예시할 수 있다.
(1)∼(3)은 항체가 IgG1 타입의 것, (4)∼(9)는 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(3)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(3)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (4)∼(9)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (4)∼(9)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hPPT-1)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hPPT-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hPPT-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hPPT-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hPPT-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hPPT-1은 서열 번호 77의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hPPT-1)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hPPT-1이, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 100으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hPPT-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 101로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hPPT-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 102로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hPPT-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 103으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hPPT-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 104로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hPPT-1이 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 105로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(6)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5) 및 (6)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5) 및 (6)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hASM)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hASM이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hASM이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hASM이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hASM이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hASM은 서열 번호 78의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hASM)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hASM이, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 106으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 107로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 108로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 109로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 110으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 111로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 112로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hASM이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 113으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(9) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hASM이 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 114로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(9)는 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5) 및 (6)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5) 및 (6)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hARSA)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hARSA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hARSA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hARSA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hARSA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hARSA는 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hARSA)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hARSA가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 115로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 116으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 117로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 118로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 119로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 120으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 121로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hARSA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 122로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(9) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hARSA가 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 123으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(9)는 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(9)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(9)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hSGSH)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hSGSH가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hSGSH가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hSGSH가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hSGSH가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hSGSH는 서열 번호 80의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hSGSH)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hSGSH가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 124로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hSGSH가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 125로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hSGSH가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 126으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hSGSH가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 127로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hSGSH가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 128로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hSGSH가 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 129로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5) 및 (6)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5) 및 (6)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5) 및 (6)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hGBA)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hGBA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGBA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hGBA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hGBA가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hGBA는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hGBA)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hGBA가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 130으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGBA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 131로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hGBA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 132로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hGBA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 133으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hGBA가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 134로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hGBA가 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 135로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5) 및 (6)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5) 및 (6)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5) 및 (6)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hTPP-1)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hTPP-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hTPP-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hTPP-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hTPP-1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hTPP-1은 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hTPP-1)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hTPP-1이, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 136으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hTPP-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 137로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hTPP-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 138로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hTPP-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 139로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hTPP-1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 140으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하여 이루어지는 링커를 C말단측에 가지는 hTfR의 중쇄(Fab)가, 2회 연속하여 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, hTPP-1이 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 141로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5) 및 (6)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5) 및 (6)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5) 및 (6)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hNAGLU)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hNAGLU가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hNAGLU가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hNAGLU가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hNAGLU가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hNAGLU는 서열 번호 83의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hNAGLU)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hNAGLU가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 142로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 143으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 144로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 145로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 146으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 147로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 148로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hNAGLU가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 149로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hGUSB)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hGUSB가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGUSB가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hGUSB가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hGUSB가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hGUSB는 서열 번호 84의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hGUSB)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hGUSB가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 150으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 151로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 152로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 153으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 154로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 155로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 156으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hGUSB가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 157로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hGALC)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hGALC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGALC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hGALC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hGALC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hGALC는 서열 번호 85의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hGALC)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hGALC가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 158로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 159로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 160으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 161로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 162로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 163으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 164로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hGALC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 165로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hAC)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hAC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hAC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hAC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hAC가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hAC는 서열차례 86의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hAC)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hAC가, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 166으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 167로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 168로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 169로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 170으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 171로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 172로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hAC가, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 173으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hFUCA1)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hFUCA1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hFUCA1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hFUCA1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hFUCA1이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hFUCA1는 서열 번호 87의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hFUCA1)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hFUCA1이, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 174로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 175로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 176으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 177로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 178로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 179로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 180으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hFUCA1이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 181로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 (hLAMAN)인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) hLAMAN이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hLAMAN이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) hLAMAN이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) hLAMAN이 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속, 또는 1∼20개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다. 또한, hLAMAN는 서열 번호 88의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 변이체이다.
다른 단백질(A)가 (hLAMAN)인 융합 단백질의 보다 구체적인 실시예로서는,
(1) hLAMAN이, 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 182로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 183으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(3) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 184로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(4) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 185로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(5) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 3회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 186으로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(6) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 5회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 187로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(7) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 10회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 188로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(8) hLAMAN이, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 20회 연속하여 이루어지는 링커를 개재시켜 hTfR의 중쇄(Fab)의 C말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 전자의 아미노산 서열이 서열 번호 189로 나타나는 것이고, 후자의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(1)∼(4)는 항체가 IgG1 타입의 것, (5)∼(8)은 항체가 Fab 타입의 것이 된다.
여기에서, 상기 (1)∼(4)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 68로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (1)∼(4)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한, 상기 (5)∼(8)에 있어서의 hTfR의 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 61로 나타나는 것이다. 즉, 상기 (5)∼(8)의 융합 단백질은, 인간화 항체로서 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄(Fab)가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
다른 단백질(A)가 인간 리소좀 효소인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 66 또는 68로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
여기에서 중쇄가 서열 번호 66을 갖는 것인 경우의 항체는 IgG1 타입의 것이며, 서열 번호 68인 경우는 IgG4 타입의 것이다.
다른 단백질(A)가 인간 리소좀 효소이며 인간화 항체가 Fab 항체인 융합 단백질의 구체적인 실시예로서는,
(1) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 23으로 나타나는 것,
(2) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 25로 나타나는 것,
(3) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타나는 것,
(4) 인간 리소좀 효소가 링커 서열을 개재시켜 hTfR의 Fab 중쇄의 C말단측 또는 N말단에서 결합하여 이루어지는 것과, hTfR의 경쇄로 이루어지고, Fab 중쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 61로 나타나는 것이고, 경쇄의 아미노산 서열이 서열 번호 29로 나타나는 것을 들 수 있다. 여기에서, 링커 서열은, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 1∼10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 적합하다.
상기 이외의 인간 리소좀 효소도, hGAA 및 hI2S에서 나타낸 것과 마찬가지의 태양으로, hTfR 항체와의 융합 단백질로 할 수 있다. 인간 리소좀 효소로서는, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아스파틸글루코사미니다제, α-갈락토시다제 A, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoA α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-황산 설파타제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 히알루로니다제-1, CLN1 및 CLN2를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 리소좀 이외의 단백질을 융합시키는 경우도 이와 같이 융합 단백질을 구축할 수 있다.
다른 단백질(A)가 상기의 인간 리소좀 효소인 융합 단백질은 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 것이고, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때에,
원숭이의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-11M 이하인 것이고,
인간의 TfR과의 해리 상수가, 바람직하게는 1X10-10M 이하, 보다 바람직하게는 5X10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 1X10-11M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1X10-12M 이하인 것이다.
예를 들어, 원숭이의 TfR 및 인간의 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1X10-10M 이하 및 1X10-10M 이하, 1X10-10M 이하 및 1X10-11M 이하, 1X10-10M 이하 및 1X10-12M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-11M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-11M 이하, 5X10-11M 이하 및 1X10-12M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-11M, 1X10-12M, 1 X10-13M 등으로 할 수 있다. 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1X10-12M, 5 X10-13M, 1X10-13M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
본 발명의 항hTfR 항체는, 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 분자와 결합시키는 것에 의해, 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위해서 사용할 수 있다. 또한, 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 분자와 결합시킨 항hTfR 항체는, 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 치료상 유효량을, 중추 신경계의 질환의 환자에게 혈중 투여(점적 정주 등의 정맥 주사를 포함한다)하는 것을 포함하는, 치료 방법에 있어서 사용할 수 있다. 혈중 투여된 생리 활성 단백질 또는 약리 활성 저분자 화합물의 분자와 결합시킨 항hTfR 항체는, 뇌내에 도달하는 것 외에, hTfR을 발현하는 다른 장기·기관에도 도달할 수 있다. 또한, 당해 약제는, 질환의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
특히, 본 발명의 항hTfR 항체는, 인간 산성 α-글루코시다제(hGAA)와 결합시키는 것에 의해, hGAA에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시킬 수 있으므로, 폼페병에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위해서 사용할 수 있다. 또한, hGAA와 결합시킨 항hTfR 항체는, 폼페병에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료상 유효량을, 폼페병의 환자에게 혈중 투여(점적 정주 등의 정맥 주사를 포함한다)하는 것을 포함하는, 치료 방법에 있어서 사용할 수 있다. 혈중 투여된 hGAA와 결합시킨 항hTfR 항체는, 뇌내에 도달하는 것 외에, hTfR을 발현하는 다른 장기·기관에도 도달할 수 있다. 또한, 당해 약제는, 당해 질환 상태의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
또한 특히, 본 발명의 항hTfR 항체는, 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)와 결합시키는 것에 의해, hI2S에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시킬 수 있으므로, 헌터 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위해서 사용할 수 있다. 또한, hI2S와 결합시킨 항hTfR 항체는, 헌터 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료상 유효량을, 헌터 증후군의 환자에게 혈중 투여(점적 정주 등의 정맥 주사를 포함한다)하는 것을 포함하는, 치료 방법에 있어서 사용할 수 있다. 혈중 투여된 hI2S와 결합시킨 항hTfR 항체는, 뇌내에 도달하는 것 외에, hTfR을 발현하는 다른 장기·기관에도 도달할 수 있다. 또한, 당해 약제는, 당해 질환 상태의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
또한 특히, 본 발명의 항hTfR 항체는, 인간 α-L-이두로니다제(hIDUA)와 결합시키는 것에 의해, hIDUA에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시킬 수 있으므로, 헐러 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위해서 사용할 수 있다. 또한, hIDUA와 결합시킨 항hTfR 항체는, 헐러 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료상 유효량을, 헐러 증후군의 환자에게 혈중 투여(점적 정주 등의 정맥 주사를 포함한다)하는 것을 포함하는, 치료 방법에 있어서 사용할 수 있다. 혈중 투여된 hIDUA와 결합시킨 항hTfR 항체는, 뇌내에 도달하는 것 외에, hIDUA를 발현하는 다른 장기·기관에도 도달할 수 있다. 또한, 당해 약제는, 당해 질환 상태의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
또한 특히, 본 발명의 항hTfR 항체는, 인간 리소좀 효소와 결합시키는 것에 의해, 인간 리소좀 효소에 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에서 기능을 발휘시킬 수 있으므로, 인간 리소좀 효소의 결손을 원인으로 하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료를 위한 혈중 투여용 약제의 제조를 위해서 사용할 수 있다. 또한, 인간 리소좀 효소와 결합시킨 항hTfR 항체는, 인간 리소좀 효소의 결손을 원인으로 하는 중추 신경계의 질환 상태의 치료상 유효량을, 해당하는 환자에게 혈중 투여(점적 정주 등의 정맥 주사를 포함한다)하는 것을 포함하는, 치료 방법에 있어서 사용할 수 있다. 혈중 투여된 인간 리소좀 효소와 결합시킨 항hTfR 항체는, 뇌내에 도달하는 것 외에, 인간 리소좀 효소를 발현하는 다른 장기·기관에도 도달할 수 있다. 또한, 당해 약제는, 당해 질환 상태의 발증을 예방하기 위해서 이용할 수도 있다.
본 발명의 항hTfR 항체와 결합시킨 단백질, 저분자 화합물 등은, 혈중에 투여하여 중추 신경계(CNS)에 있어서 약효를 발휘시켜야 할 약제로서 사용할 수 있다. 이러한 약제는, 일반적으로 점적 정맥 주사 등에 의한 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사에 의해 환자에게 투여되지만, 투여 경로에는 특별히 한정은 없다.
본 발명의 항hTfR 항체와 결합시킨 단백질, 저분자 화합물 등은, 약제로서 동결건조품, 또는 수성 액제 등의 형태로 의료 기관에 공급할 수 있다. 수성 액제의 경우, 약제를, 안정화제, 완충제, 등장화제를 함유하는 용액에 미리 용해한 것을, 바이알 또는 주사기에 봉입한 제제로서 공급할 수 있다. 주사기에 봉입된 제제는, 일반적으로 프리필드 시린지 제제라고 호칭된다. 프리필드 시린지 제제로 하는 것에 의해, 환자 자신에 의한 약제의 투여를 간이하게 할 수 있다.
수성 액제로서 공급되는 경우, 수성 액제에 함유되는 항hTfR 항체와 결합시킨 단백질, 저분자 화합물 등의 농도는, 용법 용량에 따라 적절히 조정되어야 할 것이지만, 예를 들어 1∼4mg/mL이다. 또한, 수성 액제에 함유되는 안정화제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 비이온성 계면활성제를 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 비이온성 계면활성제로서는, 폴리소르베이트, 폴록사머 등을 단독으로 또는 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)이 특히 적합하다. 또한, 수성 액제에 함유되는 비이온성 계면활성제의 농도는, 0.01∼1mg/mL인 것이 바람직하고, 0.01∼0.5mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.1∼0.5mg/mL인 것이 더욱 바람직하다. 안정화제로서 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 글리신 등의 아미노산을 사용할 수도 있다. 안정화제로서 사용하는 경우의, 수성 액제에 함유되는 아미노산의 농도는, 0.1∼40mg/mL인 것이 바람직하고, 0.2∼5mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.5∼4mg/mL인 것이 더욱 바람직하다. 수성 액제에 함유되는 완충제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 인산염 완충제가 바람직하고, 특히 인산 나트륨 완충제가 바람직하다. 완충제로서 인산 나트륨 완충제를 사용하는 경우의, 인산 나트륨의 농도는, 바람직하게는 0.01∼0.04M이다. 또한, 완충제에 의해 조정되는 수성 액제의 pH는, 바람직하게는 5.5∼7.2이다. 수성 액제에 함유 되는 등장화제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 염화 나트륨, 만니톨을 단독으로 또는 조합하여 등장화제로서 적합하게 사용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예로 한정되는 것은 의도하지 않는다. 한편, 실시예 1∼15는, 참고예(항체 번호 3)에 대한 것이다.
〔실시예 1〕 hTfR 발현용 벡터의 구축
인간 비장 Quick Clone cDNA(Clontech사)를 주형으로 하여 프라이머 hTfR5'(서열 번호 41) 및 프라이머 hTfR3'(서열 번호 42)를 이용하여, PCR에 의해 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)를 코딩하는 유전자 단편을 증폭시켰다. 증폭시킨 hTfR을 코딩하는 유전자 단편을, MluI와 NotI로 소화하고, pCI-neo 벡터(Promega사)의 MluI와 NotI의 사이에 삽입했다. 얻어진 벡터를, pCI-neo(hTfR)라고 이름 붙였다. 그 다음에, 이 벡터를, MluI와 NotI로 소화하여, hTfR을 코딩하는 유전자 단편을 잘라내고, 국제 공개 공보(WO2012/063799)에 기재된 발현 벡터인 pE-mIRES-GS-puro의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣는 것에 의해, hTfR 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro(hTfR)를 구축했다.
〔실시예 2〕 재조합 hTfR의 제작
일렉트로포레이션법에 의해, CHO-K1 세포에 pE-mIRES-GS-puro(hTfR)를 도입한 후, 메티오닌설폭시민(MSX) 및 퓨로마이신을 포함하는 CD OptiCHOTM 배지(Invitrogen사)를 이용하여 세포의 선택 배양을 행하여, 재조합 hTfR 발현 세포를 얻었다. 이 재조합 hTfR 발현 세포를 배양하여, 재조합 hTfR을 조제했다.
〔실시예 3〕 재조합 hTfR을 이용한 마우스의 면역
실시예 2에서 조제한 재조합 hTfR을 항원으로서 이용하여 마우스를 면역했다. 면역은, 마우스에 항원을 정맥내 투여 또는 복강내 투여하여 행했다.
〔실시예 4〕 하이브리도마의 제작
마지막으로 세포를 투여한 날의 약 1주일 후에 마우스의 비장을 적출하여 호모지나이즈하고, 비세포를 분리했다. 얻어진 비세포를 마우스 미엘로마 세포주(P3. X63. Ag8. 653)와 폴리에틸렌 글리콜법을 이용하여 세포 융합시켰다. 세포 융합 종료 후, (1X) HAT 서플리멘트(Life Technologies사) 및 10% Ultra low IgG 소 태아 혈청(Life Technologies사)을 포함하는 RPMI1640 배지에 세포를 현탁시키고, 세포 현탁액을 96웰 플레이트 20매에 200μL/웰씩 분주했다. 탄산 가스 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포를 10일간 배양한 후, 각 웰을 현미경하에서 관찰하여, 단일한 콜로니가 존재하는 웰을 선택했다.
각 웰의 세포가 거의 컨플루언트가 된 시점에서 배양 상청을 회수하고, 이것을 하이브리도마의 배양 상청으로서, 이하의 스크리닝에 제공했다.
〔실시예 5〕 고친화성 항체 산생 세포주의 스크리닝
재조합 hTfR 용액(Sino Biologics사)을 50mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.5∼9.6)으로 희석하여 5μg/mL의 농도로 조정하고, 이것을 고상 용액으로 했다. 고상 용액을, Nunc MaxiSorpTM flat-bottom 96웰 플레이트(기재: 폴리스타이렌, Nunc사)의 각 웰에 50μL씩 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 정치하여, 재조합 hTfR을 플레이트에 흡착시켜 고정했다. 고상 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 세정액(PBS-T: 0.05% Tween20을 함유하는 PBS)으로 3회 세정한 후, 각 웰에 블로킹액(1% BSA를 함유하는 PBS)을 200μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 정치했다.
블로킹액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정한 후, 각 웰에 하이브리도마의 배양 상청을 50μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 정치하여, 배양 상청에 포함되는 마우스 항hTfR 항체를 재조합 hTfR에 결합시켰다. 이 때, 컨트롤로서 마우스 항hTfR 항체를 산생하지 않는 하이브리도마의 배양 상청을 웰에 50μL 첨가한 것을 두었다. 또한, 각 배양 상청을 가한 웰의 옆의 웰에, 하이브리도마의 배양용 배지를 50μL 첨가한 것을 두어, 이것을 모크(mock) 웰로 했다. 측정은 n=2로 실시했다. 그 다음에, 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정했다.
상기의 각 웰에 100μL의 HRP 표지 염소 항마우스 이뮤노글로불린 항체 용액(프로메가사)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분간 정치했다. 그 다음에, 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정했다. 그 다음에, 각 웰에 50μL의 발색용 기질액 TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase(프로메가사)를 첨가하고, 실온에서 10∼20분간 정치했다. 그 다음에, 각 웰에 100μL의 정지액(2N 황산)을 첨가한 후, 플레이트 리더를 이용하여 각 웰의 450nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 각 배양 상청 및 컨트롤의 2개의 웰의 평균치를 취하고, 이들 평균치로부터, 각 배양 상청 및 컨트롤마다 둔 2개의 모크 웰의 평균치를 각각 뺀 것을 측정치로 했다.
높은 측정치를 나타낸 웰에 첨가한 배양 상청에 대응하는 14종류의 하이브리도마 세포를, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체(고친화성 항hTfR 항체)를 산생하는 세포주(고친화성 항체 산생 세포주)로서 선택했다. 이들 14종의 세포주를, 클론 1주∼클론 14주로 번호 붙였다. 이들 세포주로부터 클론 3주를 선택하여, 이하의 실험에 이용했다. 또한, 클론 3주가 산생하는 항hTfR 항체를, 항hTfR 항체 번호 3으로 했다.
〔실시예 6〕 고친화성 항hTfR 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 해석
실시예 5에서 선택한 클론 3주로부터 cDNA를 조제하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. 증폭시킨 유전자의 염기 서열을 번역하여, 이 세포주의 산생하는 항hTfR 항체 번호 3의 항체에 대해, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 결정했다.
항hTfR 항체 번호 3은, 경쇄의 가변 영역에 서열 번호 48에 기재된 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역에 서열 번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것이었다. 또한, 그의 경쇄의 가변 영역은, CDR1에 서열 번호 6 또는 7, CDR2에 서열 번호 8 또는 9, 및 CDR3에 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 그의 중쇄의 가변 영역은, CDR1에 서열 번호 11 또는 12, CDR2에 서열 번호 13 또는 14, 및 CDR3에 서열 번호 15 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이었다. 단, CDR는 상기의 아미노산 서열에 한정되지 않고, 이들 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 아미노산 서열의 일부를 포함하는 연속한 3개 이상의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다고 생각되었다.
항hTfR 항체 번호 3의, 경쇄의 가변 영역의 CDR1∼3과 중쇄의 가변 영역의 CDR1∼3에 포함되는 아미노산 서열의 서열 번호를, 표 1에 정리하여 나타낸다. 단, 표 1은 각 CDR의 아미노산 서열을 예시하는 것이고, 각 CDR의 아미노산 서열은 표 1에 기재된 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니고, 이들 아미노산 서열을 포함하는 영역의 아미노산 서열, 이들 아미노산 서열의 일부를 포함하는 연속한 3개 이상의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다고 생각된다.
Figure 112022118341703-pat00001
〔실시예 7〕 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
항hTfR 항체와 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정은, 바이오레이어 간섭법(BioLayerInterferometry: BLI)을 이용한 생체 분자 상호작용 해석 시스템인 Octet RED96(ForteBio사, a division of Pall Corporation)을 이용하여 실시했다. 바이오레이어 간섭법의 기본 원리에 대해 간단하게 설명한다. 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자의 층(레이어)에 특정 파장의 광을 투사했을 때, 생체 분자의 레이어와 내부의 참조가 되는 레이어의 2개의 표면에서 광이 반사되어, 광의 간섭파가 생긴다. 측정 시료 중의 분자가 센서 칩 표면의 생체 분자에 결합하는 것에 의해, 센서 선단의 레이어의 두께가 증가하여, 간섭파에 파장 시프트가 생긴다. 이 파장 시프트의 변화를 측정하는 것에 의해, 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자에 결합하는 분자수의 정량 및 속도론적 해석을 리얼타임으로 행할 수 있다. 측정은, 대개 Octet RED96에 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 실시했다. 인간 TfR로서는, N말단에 히스티딘 태그가 부가한, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열 중에서 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의, hTfR의 세포외 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 TfR(r인간 TfR: SinoBiological사)을 이용했다. 원숭이 TfR로서는, N말단에 히스티딘 태그가 부가한, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열 중에서 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의, 필리핀원숭이의 TfR의 세포외 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 원숭이 TfR(r원숭이 TfR: SinoBiological사)을 이용했다.
실시예 5에서 선택한 클론 3주를, 세포 농도가 약 2X105개/mL가 되도록, (1X) HAT 서플리멘트(Life Technologies사) 및 10% Ultra low IgG 소 태아 혈청(Life Technologies사)을 포함하는 RPMI1640 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양액을 원심 조작한 후에, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하고, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 미리 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 3배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 평형화해 둔 Protein G 컬럼(컬럼 체적: 1mL, GE헬스케어사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액에 의해 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착된 항체를 용출시켜, 용출 획분을 채취했다. 용출 획분에 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 pH 7.0으로 조정했다. 이것을 항hTfR 항체 번호 3의 정제품으로서 이하의 실험에 이용했다.
항hTfR 항체 번호 3의 정제품을, HBS-P＋(150mM NaCl, 50μM EDTA 및 0.05% Surfactant P20을 포함하는 10mM HEPES)로 2단계 희석하여, 0.78125∼50nM(0.117∼7.5μg/mL)의 7단계의 농도의 항체 용액을 조제했다. 이 항체 용액을 샘플 용액으로 했다. r인간 TfR과 r원숭이 TfR을, 각각 HBS-P＋로 희석하여, 25μg/mL의 용액을 조제하여, 각각 r인간 TfR-ECD(Histag) 용액 및 r원숭이 TfR-ECD(Histag) 용액으로 했다.
상기 2단계 희석하여 조제한 샘플 용액을, 96well plate, black(greiner bio-one사)에 200μL/웰씩 첨가했다. 또한, 상기 조제한 r인간 TfR-ECD(Histag) 용액 및 r원숭이 TfR-ECD(Histag) 용액을, 소정의 웰에 각각 200μL/웰씩 첨가했다. 베이스라인, 해리용 및 세정용의 웰에는, HBS-P＋를 200μL/웰씩 첨가했다. 재생용의 웰에는, 10mM Glycine-HCl(pH 1.7)을 200μL/웰씩 첨가했다. 활성화용의 웰에는, 0.5mM NiCl2 용액을 200μL/웰씩 첨가했다. 이 플레이트와 바이오센서(Biosensor/Ni-NTA: ForteBio사, a division of Pall Corporation)를, Octet RED96의 소정의 위치에 설치했다.
Octet RED96을 하기의 표 2에 나타내는 조건에서 작동시켜 데이터를 취득 후, Octet RED96 부속의 해석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응 곡선을 1:1 결합 모델 혹은 2:1 결합 모델에 피팅하여, 항hTfR 항체와 r인간 TfR 및 r원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 측정하고, 해리 상수(KD)를 산출했다. 한편, 측정은 25∼30℃의 온도하에서 실시했다.
Figure 112022118341703-pat00002
표 3에 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure 112022118341703-pat00003
항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과, 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR과의 해리 상수는 1X10-12M 이하이며, 원숭이 TfR과의 해리 상수도 1X10-12M 이하였다. 이들 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이 인간 TfR뿐만 아니라 원숭이 TfR과도 높은 친화성을 갖는 항체임을 나타낸다.
〔실시예 7-2〕 항hTfR 항체의 마우스를 이용한 뇌 이행 평가
그 다음에, 항hTfR 항체 번호 3에 대해, 항체가 BBB를 통과하여 뇌내로 이행하는 것을, 마우스 트랜스페린 수용체의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 인간 트랜스페린 수용체 유전자의 세포외 영역을 코딩하는 유전자로 치환한 hTfR 노크인 마우스(hTfR-KI 마우스)를 이용하여 평가했다. hTfR-KI 마우스는, 대체로 하기의 방법으로 제작했다. 또한, 항hTfR 항체 번호 3으로서는, 실시예 7에서 조제한 정제품을 이용했다.
세포내 영역이 마우스 hTfR의 아미노산 서열이며, 세포외 영역이 인간 hTfR의 아미노산 서열인 키메라 hTfR을 코딩하는 cDNA의 3'측에, loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한, 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 화학적으로 합성했다. 이 DNA 단편을, 5'암 서열로서 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열, 3'암 서열로서 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열을 갖는 타게팅 벡터에, 통상적 방법에 의해 짜넣고, 이것을 마우스 ES 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 도입했다. 유전자 도입 후의 마우스 ES 세포를, 네오마이신 존재하에서 선택 배양하고, 타게팅 벡터가 상동 재조합에 의해 염색체에 짜넣어진 마우스 ES 세포를 선택했다. 얻어진 유전자 재조합 마우스 ES 세포를, ICR 마우스의 8세포기배(숙주배)에 주입하고, 정관 결찰을 행한 마우스와의 교배에 의해 얻어진 위(僞)임신 마우스(레시피언트 마우스)에 이식했다. 얻어진 산자(産仔)(키메라 마우스)에 대해 모색 판정을 행하여, ES 세포가 생체의 형성에 고효율로 기여한 개체, 즉 전체 모에 대한 백색모가 차지하는 비율이 높은 개체를 선별했다. 이 키메라 마우스 개체를 ICR 마우스와 교배시켜 F1 마우스를 얻었다. 백색의 F1 마우스를 선별하고, 꼬리의 조직으로부터 추출한 DNA를 해석하여, 염색체 상에서 마우스 트랜스페린 수용체 유전자가 키메라 hTfR로 치환되어 있는 마우스를 hTfR-KI 마우스로 했다.
항hTfR 항체 번호 3의 정제품을, Fluorescein Labeling Kit-NH2(도진화학연구소)를 이용하여, 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(FITC)에 의해 형광 표지했다. 이 FITC 형광 표지한 항체를 포함하는 PBS 용액을 조제했다. 이 항체 용액을, 투여되는 항hTfR 항체의 용량이 3mg/kg이 되도록, 1마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 10∼12주령)에게 정맥 주사했다. 또한, 컨트롤로서 마찬가지로 하여 조제한 FITC 형광 표지한 마우스 IgG1(시그마사)을 포함하는 PBS 용액을, 3mg/kg의 용량으로 1마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 10∼12주령)에게 정맥 주사했다. 정맥 주사하고 나서 약 8시간 후에 생리 식염액으로 전신 관류하고, 뇌(대뇌와 소뇌를 포함하는 부분)를 채취했다. 적출한 뇌의 중량(습중량)을 측정한 후, Protease Inhibitor Cocktail(시그마사)을 포함하는 T-PER(Thermo Fisher Scientific사)을 첨가하고 뇌조직을 호모지네이트했다. 호모지네이트를 원심하고 상청을 회수하여, 상청 중에 포함되는 FITC 형광 표지한 항체의 양을 이하의 방법으로 측정했다. 우선, 항FITC Antibody(Bethyl사)를 High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 10μL씩 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정시켰다. 그 다음에, 각 웰에 Super Block Blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰에 뇌조직의 호모지네이트 상청을 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat)(Meso Scale Diagnostics사)를 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 FITC 형광 표지한 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 뇌의 그램중량(습중량)당에 포함되는 항hTfR 항체의 양(뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도)을 산출했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
컨트롤과 비교하여, 항hTfR 항체 번호 3의 뇌조직 중의 농도는, 약 27.8배였다. 이 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이, BBB를 적극적으로 통과하여 뇌내로 이행하는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00004
〔실시예 8〕 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 약물 동태 해석
항hTfR 항체 번호 3을, 5.0mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에게 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 생리 식염액으로 전신 관류를 실시했다. 또한, 음성 대조로서, 항hTfR 항체를 비투여한 1마리의 개체를 마찬가지로 전신 관류했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직을 적출했다. 이 뇌조직을 이용하여, 이하의 항hTfR 항체의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 행했다. 항hTfR 항체 번호 3으로서는, 실시예 7에 기재된 항체의 정제품을 이용했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 채취한 조직을, 뇌조직을 대뇌, 소뇌, 해마 및 연수로 나누고 나서, 각각 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 포함하는 RIPA Buffer(와코순약공업주식회사)로 호모지네이트하고 원심하여 상청을 회수했다. Affinipure Goat Antimouse IgG Fcγ pAb(Jackson ImmunoResearch사)를 High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 10μL씩 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정했다. 그 다음에, 각 웰에 SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여, 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰에 뇌조직의 호모지네이트 상청을 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Affinipure Goat Antimouse IgG Fab-Biotin(Jackson ImmunoResearch사)을 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 SULFO-Tag-Streptavidin(Meso Scale Diagnostics사)을 25μL씩 첨가하고, 30분 진탕했다. 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics사)를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 각 뇌조직의 그램중량(습중량)당에 포함되는 항hTfR 항체의 양(뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도)을 산출했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 5에 나타낸다. 대뇌, 소뇌, 해마 및 연수의 모두에 있어서, 항hTfR 항체 번호 3의 축적이 확인되었다. 이들 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00005
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 티슈텍 크라이오 3DM(사쿠라파인텍주식회사)을 이용하여, 채취한 조직을 -80℃까지 급속 냉동하여, 조직의 동결 블록을 제작했다. 이 동결 블록을 4μm로 박절 후, MAS 코트 슬라이드 글라스(마쓰나미유리주식회사)에 첩부했다. 조직 박편에 4% 파라폼알데하이드(와코순약공업주식회사)를 4℃에서 5분간 반응시켜, 조직 박편을 슬라이드 글라스 상에 고정했다. 계속하여, 조직 박편에 0.3% 과산화 수소수를 포함하는 메탄올 용액(와코순약공업주식회사)을 30분간 반응시켜, 내인성 퍼옥시다제를 실활시켰다. 그 다음에 슬라이드 글라스를 SuperBlock blocking buffer in PBS에 30분간 실온에서 반응시켜 블로킹했다. 그 다음에, 조직 박편에 Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사)를 1시간 실온에서 반응시켰다. 조직 박편을, DAB 기질(3,3'-diaminobenzidine, Vector Laboratories사)로 발색시키고, 마이어 헤마톡실린(Merck사)으로 대비 염색을 행하고, 탈수, 투철한 후에 봉입하고, 광학 현미경으로 관찰했다.
도 1에 대뇌피질의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 1b). 더욱이, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 대뇌피질에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 1a).
도 2에 해마의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 2b). 더욱이, 신경양 세포에도 특이적인 염색이 확인되고, 또한, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 해마에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 2a).
도 3에 소뇌의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 3b). 더욱이, 푸르킨예 세포에도 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 소뇌에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 3a).
이상의 대뇌, 해마 및 소뇌의 면역 조직화학 염색의 결과로부터, 항hTfR 항체 번호 3은, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합할 수 있고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지 받아들여짐을 알 수 있었다.
〔실시예 9〕 인간화 항hTfR 항체의 제작
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 포함되는 아미노산 서열의 인간화를 시도했다. 그렇게 해서, 서열 번호 17∼서열 번호 22에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 경쇄의 가변 영역과, 서열 번호 31∼서열 번호 36에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄의 가변 영역을 얻었다.
〔실시예 10〕 인간화 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 구축
상기의 항hTfR 항체 번호 3에 대해, 각각 인간화 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는, 경쇄 및 중쇄의 전장을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 때, 경쇄의 전장을 코딩하는 유전자의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 또한, 중쇄의 전장을 코딩하는 유전자의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 한편, 여기에서 도입한 리더 펩티드는, 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄를 호스트 세포인 포유동물 세포로 발현시켰을 때에, 경쇄 및 중쇄가 세포 외로 분비되도록, 분비 시그널로서 기능하는 것이다.
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 24)을 합성했다.
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 25로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 26)과, 가변 영역에 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 27로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 28)과, 가변 영역에 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 29로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 30)도 합성했다.
항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 32로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 37로 나타나는 아미노산 서열의 중쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 38)을 합성했다. 서열 번호 38로 나타나는 DNA 단편에 코딩되는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄는 IgG1이다.
더욱이, 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 32로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 39로 나타나는 아미노산 서열의 중쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 40)을 합성했다. 이 서열 번호 40으로 나타나는 DNA 단편에 코딩되는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄는 IgG4이다.
〔실시예 11〕 인간화 항hTfR 항체 발현 벡터의 구축
pEF/myc/nuc 벡터(인비트로젠사)를, KpnI와 NcoI로 소화하여, EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 T4DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo(인비트로젠사)를, BglII 및 EcoRI로 소화하여, CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다. pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1kbp의 영역을 절제했다. pcDNA3.1/Hygro(＋)(인비트로젠사)를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5'(서열 번호 43) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(서열 번호 44)를 이용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다. 증폭한 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI로 소화하고, 상기의 네오마이신 내성 유전자를 절제한 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축했다.
pE-hygr 벡터 및 pE-neo 벡터를 각각 MluI와 NotI로 소화했다. 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 24)과 중쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 38)을 MluI와 NotI로 소화하고, 각각 pE-hygr 벡터와 pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입했다. 얻어진 벡터를, 각각 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3), 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 발현용 벡터의 pE-neo(HC3)로서 이하의 실험에 이용했다.
더욱이, 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 26), 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 28), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 30)을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-hygr 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입하여, 각각 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-2), 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-3), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-4)을 구축했다.
더욱이 마찬가지로, 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 40)을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입하여, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4 발현용 벡터의 pE-neo(HC3-IgG4)를 구축했다.
〔실시예 12〕 인간화 항hTfR 항체 발현용 세포의 구축
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, 하기의 방법에 의해, GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)로 형질 전환했다. 세포의 형질 전환은 대체로 이하의 방법으로 행했다. 5X105개의 CHO-K1 세포를 CD OptiCHOTM 배지(라이프테크놀로지사)를 첨가한 3.5cm 배양 디쉬에 파종하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양했다. 배지를 Opti-MEMTM I 배지(라이프테크놀로지사)로 교환하고, 세포를 5X106세포/mL의 밀도가 되도록 현탁했다. 세포 현탁액 100μL를 채취하고, 이것에 Opti-MEMTM I 배지로 100μg/mL로 희석한 pE-hygr(LC3) 및 pE-neo(HC3) 플라스미드 DNA 용액을 5μL씩 첨가했다. GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 일렉트로포레이션을 실시하여, 세포에 플라스미드를 도입했다. 세포를, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 0.5mg/mL의 하이그로마이신 및 0.8mg/mL의 G418을 첨가한 CD OptiCHOTM 배지로 선택 배양했다.
그 다음에, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96웰 플레이트 상에 선택 배양으로 선택된 세포를 파종하고, 각 세포가 단클론 콜로니를 형성하도록 약 10일간 배양했다. 단클론 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 채취하고, 배양 상청 중의 인간화 항체 함량을 ELISA법으로 조사하여 인간화 항체 고발현 세포주를 선택했다.
이 때의 ELISA법은 대체로 이하의 방법으로 실시했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc사)의 각 웰에, 염소 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을 0.05M 탄산 수소염 완충액(pH 9.6)으로 4μg/mL로 희석한 것을 100μL씩 가하고 실온에서 적어도 1시간 정치하여 항체를 플레이트에 흡착시켰다. 그 다음에, PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, Starting Block (PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 각 웰에 200μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 30분 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS에 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-BT)으로 적당한 농도로 희석한 배양 상청 또는 인간 IgG 표준품을, 각 웰에 100μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS-BT로 희석한 HRP 표지 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을, 각 웰에 100μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, 인산-시트르산 완충액(pH 5.0)을 포함하는 0.4mg/mL o-페닐렌다이아민을 100μL씩 각 웰에 가하고, 실온에서 8∼20분간 정치했다. 그 다음에, 1mol/L 황산을 100μL씩 각 웰에 가하여 반응을 정지시키고, 96웰 플레이트 리더를 이용하여, 각 웰의 490nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 높은 측정치를 나타낸 웰에 대응하는 세포를, 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 고발현 세포주로 했다. 이것을 항체 번호 3 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-2) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-2 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-3 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-4) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-4 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3-IgG4)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3(IgG4) 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-2) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3-IgG4)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-2(IgG4) 발현주로 했다.
〔실시예 13〕 인간화 항hTfR 항체의 정제
실시예 12에서 얻어진 항체 번호 3 발현주, 항체 번호 3-2 발현주, 항체 번호 3-3 발현주 및 항체 번호 3-4 발현주를, 각각 세포 농도가 약 2X105개/mL가 되도록, CD OptiCHOTM 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양 상청을 원심 조작에 의해 회수하고, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하여, 배양 상청으로 했다. 회수한 배양 상청에, 150mM NaCl을 포함하는 5배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 미리 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 3배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 평형화해 둔 Protein A 컬럼(컬럼 체적: 1mL, Bio-Rad사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액에 의해 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착한 인간화 항체를 용출시켜, 용출 획분을 채취했다. 용출 획분에 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 중화하여, 이것을 항체의 정제품으로 했다.
여기에서, 항체 번호 3 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3으로 했다. 항체 번호 3-2 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2로 했다. 항체 번호 3-3 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3으로 했다. 또한, 항체 번호 3-4 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4로 했다.
또한, 실시예 12에서 얻어진 항체 번호 3(IgG4) 발현주, 및 항체 번호 3-2(IgG4) 발현주에 대해서도 상기와 마찬가지로 배양하고, 그 배양 상청으로부터, 각각 정제된 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 얻었다. 이들 2종의 항체는, 실시예 15에 기재된 원숭이를 이용한 약물 동태 해석에 이용했다.
〔실시예 14〕 인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 6에 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4(표 중, No. 3∼3-4에 각각 대응)의 인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure 112022118341703-pat00006
표 7에 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4(표중, 항체 번호 3∼3-4에 각각 대응)의 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure 112022118341703-pat00007
인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과, 인간화 항hTfR 항체 번호 3 및 3-4 항체에서, 인간 TfR과의 해리 상수는 1X10-12M 미만이었다(표 6). 또한, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2 및 3-3의 인간 TfR과의 해리 상수는, 각각 2.39X10-11M과 2.09X10-11M이었다. 한편, 이들 항체에 대응하는 인간화 전의 항hTfR 항체(항체 번호 3)의 인간 TfR과의 해리 상수는, 1X10-12M 미만이었다(표 3). 이들 결과는, 항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 높은 친화성이, 항체를 인간화하는 전후에서 유지됨을 나타내는 것이다.
그 다음에, 인간화 항hTfR 항체의 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과를 보면, 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4는, 인간화 전의 이들 항체에 대응하는 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR과의 해리 상수가 1X10-12M 미만이었던 것이, 인간화 후는 2.60X10-10M∼1.91X10-9M로, 원숭이 TfR에 대한 친화성의 저하가 관찰되었다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3에서는, 원숭이 TfR에 대한 친화성의 저하가 관찰되었지만, 이들 결과는, 항hTfR 항체의 원숭이 TfR에 대한 높은 친화성은, 항체를 인간화하는 전후에서 상실되지 않고 대체로 유지됨을 나타내는 것이다.
〔실시예 15〕 인간화 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 약물 동태 해석
인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 4종의 항체를 이용하여, 원숭이를 이용한 약물 동태 해석을 행했다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3은 중쇄가 IgG1이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄를 가변 영역은 그대로 하고 IgG4로 한 것이다. 또한, 인간화 항hfR 항체 번호 3-2는 중쇄가 IgG1이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)는 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 중쇄를 가변 영역은 그대로 하고 IgG4로 한 것이다. 이들 4종의 항체를, 각각, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 전, 투여 후 2분, 30분, 2시간, 4시간 및 8시간 후에 말초혈을 채취하고, 채혈 후에 전신 관류를 실시했다. 또한, 음성 대조로서, HER2 단백질에 대한 인간화 항체인 트라스투주맙(허셉틴TM, 추가이제약)를, 마찬가지로 하여 1마리의 개체에게 투여하고, 투여 전, 투여 후 2분, 30분, 2시간, 4시간 및 8시간 후에 말초혈을 채취하고, 채혈 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직, 척수 조직 및 그 외의 조직(간장, 심장, 비장 및 골수를 포함한다)을 적출했다. 이 뇌조직, 척수 조직 및 그 외의 조직을 이용하여, 이하의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 행했다.
조직 중 및 말초혈 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 한편, 뇌에 대해서는 채취한 조직을, 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누고 나서 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정을 행했다. 채취한 조직을, 각각 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 포함하는 RIPA Buffer(와코순약공업주식회사)로 호모지네이트하고 원심하여 상청을 회수했다. 말초혈에 대해서는 혈청을 분리했다. Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG Biotin(주식회사면역생물연구소), Sulfo-tag anti-human IgG (H＋L) antibody(Bethyl사) 및 뇌조직 호모지네이트를 SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)로 블로킹을 실시한 스트렙트아비딘 플레이트(Meso Scale Diagnostics사)에 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트에 고정했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 각 조직 중 및 말초혈 중에 포함되는 항체의 양을 산출했다. 농도의 측정은 각 샘플에 대해 3회 반복하여 행했다.
뇌조직 및 척수 조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure 112022118341703-pat00008
인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 항체 모두, 대뇌피질, 소뇌, 해마, 연수 및 척수에서의 축적이 확인되었다(표 8). 그 양은, 인간화 항hTfR 항체 번호 3에서는, 음성 대조의 트라스투주맙(허셉틴TM)과 비교하여, 대뇌피질에서 약 82배, 소뇌에서 약 68배, 해마에서 약 92배, 연수에서 약 54배, 척수에서 약 3.1배이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 128배, 소뇌에서 약 80배, 해마에서 약 136배, 연수에서 약 63배, 척수에서 약 3.1배이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 79배, 소뇌에서 약 66배, 해마에서 약 106배, 연수에서 약 54배, 척수에서 약 3.1배이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 93배, 소뇌에서 약 63배, 해마에서 약 117배, 연수에서 약 66배, 척수에서 약 3.2배였다(표 9). 이들 결과는, 이들 4종의 인간화 항hTfR 항체가, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00009
그 다음에, 간장, 심장, 비장 및 골수의 각 조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 도 4에 나타낸다. 간장, 및 비장에서는, 4종류의 인간화 항hTfR 항체 및 음성 대조의 트라스투주맙의 어느 것에 있어서도 축적이 확인되었지만, 그 양은 인간화 항hTfR 항체와 트라스투주맙에서 동등했다. 심장에서는, 인간화 항hTfR 항체가 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 축적량이 많은 경향이 있었지만, 그 양은 음성 대조의 1.5배∼2.8배 정도에 머물렀다. 골수에서는, 인간화 항hTfR 항체가, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 현저하게 축적량이 많은 경향이 있어, 그 양은 음성 대조의 3.5∼16배였다. 골수에 대한 인간화 항hTfR 항체의 축적은, 조혈 기관인 골수에서는 TfR의 발현량이 많아, TfR과 결합하는 것에 의해 많은 인간화 항hTfR 항체가 음성 대조와 비교하여 축적되었기 때문이라고 생각된다. 이들 데이터는, 이들 4종의 인간화 항hTfR 항체가, 중추 신경계인 대뇌, 소뇌, 해마 및 연수에 특이적으로 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
그 다음에, 인간화 항hTfR 항체의 혈중 동태의 측정 결과를 표 9-2에 나타낸다. 4종류의 인간화 항hTfR 항체는, 음성 대조의 트라스투주맙과 마찬가지로, 투여 후 8시간에 있어서도 혈중 농도가 60μg/mL 이상의 높은 값을 나타내어, 혈중에서 안정됨이 나타났다(표 9-2).
[표 9-2]
Figure 112022118341703-pat00010
뇌조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색은, 실시예 8에 기재된 방법으로 행했다. 단, 이 때, Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사) 대신에 Human IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사)를 이용했다.
도 5에 대뇌피질의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 5b∼e). 특히, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여한 원숭이의 대뇌피질(도 5c)에서는, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는 염색은 확인되지 않아, 도 5b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 5a).
도 6에 해마의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 해마에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 6b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 해마에서는 염색은 확인되지 않아, 도 6b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 6a).
도 7에 소뇌의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 소뇌에서는, 혈관 및 푸르킨예 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 7b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 소뇌에서는 염색은 확인되지 않아, 도 7b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 7a).
도 8에 연수의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 연수에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 8b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 연수에서는 염색은 확인되지 않아, 도 8b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 8a).
상기 실시예 8의 대뇌 및 소뇌의 면역 조직화학 염색의 결과로부터는, 인간화 전의 마우스 항체인 항hTfR 항체 번호 3은, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합할 수 있고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지, 받아들여짐을 나타내는 것이었다.
실시예 15의 대뇌, 해마, 소뇌 및 연수의 면역 조직화학 염색의 결과로부터는, 실험에 제공한 항hTfR 항체 번호 3을 인간화하여 얻어진 4종류의 인간화 항hTfR 항체는, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합하고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 대뇌피질에 있어서는 신경양 세포에까지, 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지, 연수에 있어서는 신경양 세포에 받아들여짐을 알 수 있었다.
〔실시예 16〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄로의 변이 도입
서열 번호 37로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역에 있어서, CDR1을 서열 번호 12로 나타나는 것으로 했을 때의, 당해 CDR1의 아미노산 서열을 1개 치환함과 함께, 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열을 1개 치환하는 인간화 항체의 중쇄를 작성했다. 이 새로운 항체의 중쇄는, CDR1에 서열 번호 62 또는 63의 아미노산 서열을 포함하고, 프레임워크 영역 3에 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 서열 번호 37로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산을 2개 치환한 것이다. 이 새로운 항체의 중쇄(인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄)는, 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 그 아미노산 서열의 가변 영역은 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.
표 10에 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 있어서의 서열 번호 12의 CDR1과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄에 있어서의 서열 번호 62의 CDR1의 얼라인먼트를 나타냈다. 당해 얼라인먼트에 있어서, N말단측으로부터 5번째의 아미노산이, 트레오닌으로부터 메티오닌으로 치환되어 있다.
표 11에는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 있어서의 프레임워크 영역 3(서열 번호 73)과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄에 있어서의 프레임워크 영역 3(서열 번호 64)의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타냈다. 당해 얼라인먼트 에 있어서, N말단측으로부터 17번째의 아미노산이, 트립토판으로부터 류신으로 치환되어 있다.
Figure 112022118341703-pat00011
Figure 112022118341703-pat00012
〔실시예 17〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현용 세포의 구축
서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 67)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이렇게 하여 합성한 DNA를 실시예 11에 기재된 방법으로 pE-neo 벡터에 짜넣고, 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 발현용 벡터의 pE-neo(HC3)N으로 했다. 이 pE-neo(HC3)N과 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3)을 이용하여, 실시예 12에 기재된 방법으로 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현주를 얻었다.
〔실시예 18〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 정제
실시예 17에서 얻어진 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현주를 이용하여, 실시예 13에 기재된 방법으로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 정제품을 얻었다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열 중, 표 10 및 표 11에서 나타나는 2개소의 아미노산을 치환한 것이다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 아미노산 서열은 동일하다.
〔실시예 19〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 비교
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 인간 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 12에 각각의 항체의 인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR에 대한 친화성을 나타내는 측정치는, 표 6에 나타난 것과 상이하지만, 실험 오차이다.
Figure 112022118341703-pat00013
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 13에 각각의 항체의 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR에 대한 친화성을 나타내는 측정치는, 표 7에 나타난 것과 상이하지만, 실험 오차이다.
Figure 112022118341703-pat00014
인간화 항hTfR 항체 번호 3N 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR과의 KD치를 비교하면, 전자가 5.07X10-11M이고 후자가 1.32X10-9M이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 원숭이 TfR의 KD치는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 그것과 비교하여, 약 30분의 1이었다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR과의 Kd치를 비교하면, 모두 1X10-12M 미만으로, 어느 항체도 인간 TfR에 높은 친화성을 갖는 것이었다. 또한, 어느 항체도 원숭이 TfR에 대한 친화성보다 인간 TfR에 높은 친화성을 갖는다.
인간화 항hTfR 항체를 약제로서 개발할 때에 실시하는 비임상 시험의 일환으로서, 원숭이를 이용한 약리 시험을 실시하는 경우가 많다. 여기에서, 원숭이를 이용한 약리 시험의 결과는, 인간을 이용한 임상 시험을 실시할 타당성을 판단하기 위해서 이용되므로, 원숭이 체내에서의 거동이, 인간에게 투여했을 때의 거동과 보다 근사한 것인 것이 바람직하다. 상기의 결과대로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 원숭이 TfR에 대한 친화성이 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 약 30배의 높은 값을 나타내므로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 원숭이 체내에서의 거동은, 인간에게 투여했을 때의 거동과 보다 근사하다고 말할 수 있다. 따라서, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N을 이용하는 것에 의해, 원숭이를 이용한 시험으로, 보다 인간에게 투여했을 때의 거동을 반영한 결과가 얻어진다. 따라서, 원숭이를 이용한 시험에 의해, 인간을 이용한 임상 시험을 실시할 때의 판단 재료로서 보다 유익한 결과가 얻어지게 된다.
〔실시예 20〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 원숭이를 이용한 뇌조직으로의 이행성의 비교
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N을, 각각, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직 및 척수 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누었다.
각 조직에 포함되는 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 실시예 15에 기재된 측정법에 준하여 행했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 14에 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 대뇌, 소뇌, 해마에 있어서의 농도를 비교하면, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 농도는, 대뇌에 있어서는 약 1.42배, 소뇌에 있어서는 약 1.56배, 해마에 있어서는 약 1.29배로 인간화 항hTfR 항체 번호 3보다 높은 값을 나타냈다. 연수에 있어서는 양자의 농도는 거의 동등했다. 경추에 있어서도, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 농도는, 약 1.47배로 인간화 항hTfR 항체 번호 3보다 높은 값을 나타냈다. 이들 결과는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N이 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 비교하여, 보다 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과하여 대뇌, 소뇌, 해마 등의 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이다. 즉, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00015
〔실시예 20-2〕 hFc-인간화 항hTfR 항체 발현용 세포의 제작
서열 번호 71로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IgG Fc 영역을 도입한 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 72)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입한다. 이렇게 하여 합성한 DNA를 실시예 11에 기재된 방법으로 pE-neo 벡터에 짜넣고, 얻어진 벡터를 pE-neo(Fc-Fab HC(3N))로 했다. 이 pE-neo(Fc-Fab HC(3N))와 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3)을 이용하여, 실시예 12에 기재된 방법으로 CHO 세포를 형질 전환시켜, Fc-Fab(3N) 발현주를 얻었다.
〔실시예 20-3〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 제작
Fc-Fab(3N) 발현주를 이용하여, 실시예 13에 기재된 방법으로, Fc-Fab(3N)의 정제품을 얻었다.
〔실시예 20-4〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 비교
실시예 20-3에서 얻어진 Fc-Fab(3N)의 정제품의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 결과를 표 14-2에 나타낸다. Fc-Fab(3N)은 인간 TfR에 높은 친화성을 나타냈다(KD＜1.0X10-12). 이 결과는, Fc-Fab(3N)은, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
[표 14-2]
Figure 112022118341703-pat00016
〔실시예 20-5〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 뇌조직으로의 이행성의 측정
실시예 20-3에서 얻어진 Fc-Fab(3N)을, 5.0mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직 및 척수 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누었다.
각 조직에 포함되는 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 실시예 15에 기재된 측정법에 준하여 행했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 14-3에 나타낸다. Fc-Fab(3N)의 대뇌, 소뇌, 해마에 있어서의 농도는, 각각, 0.80μg/g 습중량, 0.80μg/g 습중량, 및 1.05μg/g이었다. 또한, 연수 및 척수에 있어서의 농도는, 각각, 0.68μg/g 습중량, 0.67μg/g 습중량이었다. 이들 결과는, Fab인 인간화 항hTfR 항체의 N말단측에 Fc 영역을 결합시켰을 경우에도, 항hTfR 항체가 BBB를 통과할 수 있음을 나타내는 것이다. Fab에 원하는 물질(단백질, 생리 활성 물질)을 결합시킨 결합체가, 생체내에 투여했을 때에 불안정한 경우에, Fab의 N말단측에 Fc 영역에 결합시키는 것에 의해, BBB를 통과하는 특성을 유지시키면서, 이러한 결합체를 생체내에서 안정화, 예를 들어, 당해 결합체의 혈중반감기를 증가시킬 수 있다.
[표 14-3]
Figure 112022118341703-pat00017
〔실시예 21〕 hI2S-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질 발현용 세포의 제작
서열 번호 37로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 C말단측에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 52로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 51로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 hI2S가 결합한 단백질을 코딩한다. 또한, 이 DNA 단편은, 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 분비 시그널로서 기능하는 리더 펩티드를 코딩하는 서열을 갖고, 3'측에는 NotI 서열을 갖는다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-3)를 구축했다.
또한, 서열 번호 66으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 C말단측에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hI2S를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 54로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 53으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 hI2S가 결합한 단백질을 코딩한다. 또한, 이 DNA 단편은, 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 분비 시그널로서 기능하는 리더 펩티드를 코딩하는 서열을 갖고, 3'측에는 NotI 서열을 갖는다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-I2S-3N)를 구축했다.
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, pE-neo(HC-I2S-3)와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)로 형질 전환하여, hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 3으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 3으로 했다.
또한, CHO 세포를, pE-neo(HC-I2S-3N)와 pE-hygr(LC3)로 형질 전환하여, hI2S와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hI2S-항hTfR 항체 발현주 3N으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hI2S와 인간화 항hTfR 항체와의 융합 단백질을 I2S-항hTfR 항체 3N으로 했다.
〔실시예 22〕 I2S-항hTfR 항체의 제조
I2S-항hTfR 항체를, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 21에서 얻은 hI2S-항hTfR 항체 발현주 3 및 3N을, 각각 세포 농도가 약 2X105개/mL가 되도록, CD OptiCHOTM 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양 상청을 원심 조작에 의해 회수하고, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하여, 배양 상청으로 했다. 회수한 배양 상청에, 컬럼 체적의 5배용의 150mL NaCl을 포함하는 20mM Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 컬럼 체적의 3배용의 150mM NaCl을 포함하는 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화해 둔 Protein A 컬럼(컬럼 체적: 1mL, Bio-Rad사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 공급하여 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착된 I2S-항hTfR 항체를 용출시켰다. 이 I2S-항hTfR 항체를 포함하는 용출액의 pH를 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 pH 7.0로 조정하고, 그 다음에 아미콘 울트라 30kDa막(Millipore사)을 이용하여 PBS로 버퍼 교환했다. 이렇게 하여 얻어지는 것을 I2S-항hTfR 항체 3 및 I2S-항hTfR 항체 3N의 정제품으로 했다.
〔실시예 23〕 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
실시예 22에서 얻은 I2S-항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법에 준하여 측정했다. 표 15에 I2S-항hTfR 항체 3 및 I2S-항hTfR 항체 3N의 인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 또한, 표 16에 I2S-항hTfR 항체 3 및 I2S-항hTfR 항체 3N의 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
I2S-항hTfR 항체 3N은, I2S-항hTfR 항체와 비교하여, 약 5배의 인간 TfR에 대한 친화성을 나타냈다(표 15). 또한, I2S-항hTfR 항체 3N은, I2S-항hTfR 항체와 비교하여, 매우 높은 원숭이 TfR에 대한 친화성을 나타냈다(표 16). I2S-항hTfR 항체 3N은, I2S-항hTfR 항체 3보다, 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대해 높은 친화성을 나타냈다.
Figure 112022118341703-pat00018
Figure 112022118341703-pat00019
〔실시예 24〕 I2S-항hTfR 항체 3과 I2S-항hTfR 항체 3N의 원숭이를 이용한 뇌조직으로의 이행성의 비교
실시예 22에서 얻은 I2S-항hTfR 항체 3 및 I2S-항hTfR 항체 3N을, 각각, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직 및 척수 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누었다.
각 조직에 포함되는 I2S-항hTfR 항체의 농도 측정은, 대체로 실시예 20에 기재된 순서로 행했다. 뇌조직 중의 I2S-항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 17에 나타낸다. I2S-항hTfR 항체 3N과 I2S-항hTfR 항체 3의 대뇌, 소뇌, 해마, 연수, 및 경추에 있어서의 농도를 비교하면, I2S-항hTfR 항체 3N의 농도는, I2S-항hTfR 항체 3의 농도와 비교하여, 대뇌에 있어서는 약 2.12배, 소뇌에 있어서는 약 1.97배, 해마에 있어서는 약 2.41배, 연수에 있어서는 1.94배, 및 경추에 있어서는 1.63배로 I2S-항hTfR 항체 3보다 높은 값을 나타냈다. 이 결과는, I2S-항hTfR 항체 3N이, I2S-항hTfR 항체 3과 비교하여, 보다 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과할 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00020
〔실시예 25〕 hGAA-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질 발현용 세포의 제작
서열 번호 68로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)의 C말단측에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 서열 번호 55로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hGAA를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 59로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편은, 서열 번호 58로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)에 링커 서열(Gly Ser)을 개재시켜 hGAA가 결합한 단백질을 코딩한다. 또한, 이 DNA 단편은, 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 분비 시그널로서 기능하는 리더 펩티드를 코딩하는 서열을 갖고, 3'측에는 NotI 서열을 갖는다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(HC-GAA-3N(IgG4))를 구축했다.
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, pE-neo(HC-GAA-3N(IgG4))와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)로 형질 전환하여, hGAA와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hGAA-항hTfR 항체 발현주 3N(IgG4)으로 했다. 이 세포주가 발현하는 hGAA와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 GAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)으로 했다.
〔실시예 26〕 GAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 제조
GAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)은, 실시예 25에서 얻은 hGAA-항hTfR 항체 발현주 3N(IgG4)을 이용하여, 대체로 실시예 22에 기재된 방법으로 제조했다.
〔실시예 27〕 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
실시예 26에서 얻은 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 23에 기재된 방법에 준하여 측정했다. 또한, 하기의 실시예 31에서 제작한 FabGS-GAA의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정 결과에 대해서도 여기에 기재한다.
hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)은, 인간 TfR 및 원숭이 TfR의 어느 것에도, 매우 높은 친화성을 나타냈다. 결과를 표 17-2에 나타낸다. FabGS-GAA도 인간 TfR 및 원숭이 TfR의 어느 것에도, 높은 친화성을 나타내지만, 그 친화성은 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)과 비교하여 낮았다.
[표 17-2]
Figure 112022118341703-pat00021
〔실시예 28〕 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 원숭이를 이용한 뇌조직으로의 이행성 평가
실시예 26에서 얻은 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 뇌조직으로의 이행성은, 실시예 24에 기재된 방법에 준하여 평가할 수 있다. 구체적으로는, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)을, 5.0mg/kg 및 20mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여했다. 또한, 대상약으로서, 폼페병 치료약으로서 시판되고 있는 hGAA를, 5.0mg/kg 및 20mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여했다. 또한, 20mg/kg의 용량의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)은 3마리의 원숭이에게 투여하고, 그 외의 것은 1마리의 원숭이에게 투여했다. 20mg/kg의 용량의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)을 투여한 원숭이에 대해서는, 투여 4시간, 8시간, 및 24시간 후에, 각각 1마리씩 생리 식염액(오쓰카제약공장사)을 이용하여 전신 관류를 실시했다. 그 외의 원숭이에 대해서는, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다.
관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직, 척수 조직, 및 골격근 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마, 연수, 및 교(橋)로 나누었다. 또한, 골격근 조직에 대해서는, 대퇴직근, 장지신근, 가자미근, 상완삼두근, 대요근, 횡격막, 및 설근을 적출했다. 또한, 약제를 비투여한 1마리의 웅성 필리핀원숭이를, 생리 식염액(오쓰카제약공장사)을 이용하여 전신 관류하고, 대뇌피질 및 대퇴직근을 적출했다. 적출한 각 조직을 Protease Inhibitor Cocktail(시그마사)를 포함하는 T-PER(Thermo Fisher Scientific사)로 호모지네이트하고, 원심 후 상청을 회수했다. 조제한 상청을 이용하여, 이하의 ECL법에 의한 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 및 hGAA의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 실시했다.
ECL법에 의한 단백질의 농도 측정:
토끼 항hGAA 폴리클로날 항체를 MSD GOLD Sulfo-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery사)를 이용하여 SULFO 표지하여, SULFO 표지 항hGAA 항체를 조제했다. 또한, 토끼 항hGAA 폴리클로날 항체를 EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo Scientific사)을 이용하여 Biotin 표지하여, Biotin 표지 항hGAA 항체를 조제했다. SULFO 표지 항hGAA 항체와 Biotin 표지 항hGAA 항체를 등량 혼합한 용액을 조제하고, 이것에, 상기에서 얻어진 상청을 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트하여, 이것을 항체 반응 시료로 했다. 스트렙트아비딘으로 코팅된 플레이트인 Streptavidin Gold Plate 96 well(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 1% BSA/PBS 용액을 첨가하고 1시간 정치하여, 플레이트를 블로킹했다.
블로킹 후의 플레이트의 각 웰을, 200μL의 PBS-T(시그마사)로 세정한 후, 각 웰에 항체 반응 시료를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후, 플레이트의 각 웰을 PBS-T로 세정하고, 그 다음에, 4X Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)와 주사용수(오쓰카제약공장사)의 등량 혼합액을 첨가하고, SectorTM Imager 6000(Meso Scale Diagnostics사)을 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 또는 hGAA의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 시료의 측정치를 내삽하는 것에 의해 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 및 hGAA를 정량하여, 뇌의 그램중량(g 습중량)당에 포함되는 양을 산출했다.
ECL법에 의한 농도 측정 결과를 표 18에 나타낸다. 우선, 뇌조직의 결과에 대해 본다. hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)을 투여한 원숭이에서는, 투여 8시간 후의 대뇌피질에 있어서의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 농도가, 5mg/kg과 20mg/kg의 용량으로 투여한 것에서, 각각 0.740μg/g 습중량, 1.42μg/g 습중량으로 농도 의존적으로 증가했다. 소뇌, 해마, 연수, 및 교에 있어서도 마찬가지의 결과였다. 한편, hGAA를 투여한 원숭이에서는, 투여 8시간 후의 대뇌피질에 있어서의 hGAA의 농도가, 5mg/kg와 20mg/kg의 용량으로 투여한 것에서, 각각 0.414μg/g 습중량, 0.435μg/g 습중량으로 거의 동일한 값이었다. 소뇌, 해마, 연수, 및 교에 있어서도 마찬가지의 결과였다. 약제를 비투여한 원숭이의 hGAA를 정량한 대뇌피질에 있어서의 내재성 GAA의 값이 0.425μg/g 습중량이므로, 정맥내 투여한 hGAA는, 거의 뇌내에 받아들여지지 않음을 알 수 있다. 한편, 정맥내 투여한 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)은, BBB를 통과하여 뇌내에 받아들여짐을 알 수 있다.
그 다음에, 골격근 조직의 결과에 대해 본다. 5mg/kg의 용량으로, 각각 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)과 hGAA를 투여한 원숭이에서는, 투여 8시간 후의 대퇴직근에 있어서의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)과 hGAA의 농도가, 전자는 0.311μg/g 습중량이며 후자는 0.251μg/g 습중량으로 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)이 hGAA와 비교하여 약 1.23배의 정량치를 나타냈다. 20mg/kg의 용량으로 투여한 것에 대해서도 마찬가지의 결과였다. 또한, 장지신근, 가자미근, 상완삼두근, 대요근, 횡격막, 및 설근에 대해서도 마찬가지의 결과였다. 즉, 정맥내 투여한 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)은, 정맥내 투여한 hGAA와 비교하여, 골격근 조직에 받아들여지는 양이 많음을 알 수 있다.
Figure 112022118341703-pat00022
면역 조직화학 염색:
뇌조직 중의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 및 hGAA의 면역 조직화학 염색은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 티슈텍 크라이오 3DM(사쿠라파인텍주식회사)를 이용하여, 상기에서 얻어진 뇌조직을 -80℃까지 급속 냉동하고, 이 동결 블록을 LEICA CM1860 UV 크리오스탯(Leica Biosystems Nussloch사)을 이용하여 4μm로 박절 후, MAS 코팅 슬라이드 글라스(마쓰나미유리주식회사)에 첩부했다. 조직 박편에 4% 파라폼알데하이드(와코순약공업주식회사)를 4℃에서 5분간 반응시켜, 조직 박편을 슬라이드 글라스 상에 고정했다. 계속하여, 조직 박편에 0.3% 과산화 수소수를 포함하는 메탄올 용액(와코순약공업주식회사)을 30분간 반응시켜, 내인성 퍼옥시다제를 실활시켰다. 그 다음에 슬라이드 글라스를 SuperBlock blocking buffer in PBS에 30분간 실온에서 반응시켜 블로킹했다. 그 다음에, 조직 박편에 1차 항체로서 토끼 항hGAA 폴리클로날 항체를 16시간, 4℃에서 반응시켰다. 그 다음에, 조직 박편을 CSAII Rabbit Link(Agilent사), 및 CSAII Biotin-free Tyramide Signal Amplification System 키트(Agilent사)로 처리했다. 그 다음에, 조직 박편에 Anti-Fluorescein HRP를 15분간, 실온에서 반응시켰다. 그 다음에, DAB 기질(3,3'-diaminobenzidine, Vector Laboratories사)로 발색시키고, 마이어 헤마톡실린(Merck사)으로 대비 염색을 행하고, 탈수, 투철한 후에 봉입하고, 광학 현미경으로 관찰했다. 한편, 면역 조직화학 염색은, 20mg/kg의 용량으로 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)을 투여한 것과 20mg/kg의 용량으로 hGAA를 투여한 원숭이의 소뇌에 대해서만 실시했다. 따라서, 투여 후 경과 시간은 모두 8시간이다.
도 9에 소뇌의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 및 hGAA의 면역 조직화학 염색 결과를 나타낸다. hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)를 투여한 원숭이의 소뇌에서는, 혈관 및 푸르킨예 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(도 9a). 한편, hGAA를 투여한 원숭이의 소뇌에서는, 이러한 염색은 확인되지 않았다(도 9b). 이들 결과는, 통상에서는 혈액뇌관문을 통과할리가 없는 hGGA를, 항hTfR 항체 3N(IgG4)과 융합시키는 것에 의해, 혈액뇌관문을 통과시켜, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지, 받아들여지게 할 수 있음을 나타내는 것이다.
〔실시예 29〕 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 마우스를 이용한 약효 평가-글리코겐의 농도의 정량(1)
폼페병의 병태 모델인 산성 α-글루코시다제(GAA) 유전자를 파괴한 녹아웃 마우스를 바탕으로 하여, 실시예 7-2에 기재된 방법으로 마우스 TfR의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 인간 TfR 수용체 유전자의 세포외 영역을 코딩하는 유전자로 치환하여, GAA 유전자를 호모로 결손하고 또한 키메라 TfR 유전자를 헤테로로 갖는 마우스(GAA-KO/hTfR-KI마우스)를 제작했다. 마우스를 7군으로 나누어, 표 19에 나타내는 용법, 용량으로, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 또는 hGAA를 정맥내 투여했다. 한편, 약제 비투여의 정상 마우스를 정상 대조(제1군), 약제 비투여의 GAA-KO/hTfR-KI 마우스를 병태 대조(제2군)로 했다. 각 군 모두 마우스는 5마리로 했다. 또한, 마우스는 웅성 및 자성의 9∼14주령(투여 개시 시)을 이용했다.
Figure 112022118341703-pat00023
제2회째와 제3회째의 시험 물질 투여 시에는, 투여 10∼20분 전에, 다이펜하이드라민을 10mL/kg의 용량으로 마우스에게 투여했다. 이것은 시험 물질의 투여에 의해 실험 동물에게 아나팔락시스 쇼크 등의 면역 반응이 생기는 것을 방지하기 위한 조치이다. 마지막 투여로부터 13일 후에, 이소플루란 마취하, 마우스를 단두하여 우뇌 및 척수 경부를 신속하게 적출한 후, 재빠르게 액체 질소에 침지하여 급속 동결했다. 동결 후, 각 조직의 습중량을 측정했다. 심장, 횡격막, 간장, 비장, 대퇴사두근, 가자미근, 전경골근, 장지신근, 비복근(채취한 골격근: 우각)에 대해서는, 방혈에 의해 충분히 혈액을 제거한 후, 조직을 채취하고, 생리 식염액으로 세정 후, 각 조직의 습중량을 측정했다. 측정 후의 장기는 1.5mL 튜브에 봉입하고, 액체 질소로 순간 동결했다.
각 조직의 습중량에 대해서 20배량의 주사 용수를 첨가하고, 비즈 파쇄기를 이용하여 조직을 호모지네이트했다. 조직의 호모지네이트를 원심 튜브로 옮기고, 100℃에서 5분간 가열 처리를 행하고, 얼음 상에 정치했다. 계속하여, 13000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상청을 회수했다. 상청은 -70℃ 이하의 온도에서 동결 보존했다.
상기 상청 중에 포함되는 글리코겐의 농도를, Glycogen Assay Kit(viovision사)에 의해 측정했다. 측정 결과를 도 10 및 도 11에 나타낸다. 도 10은, 우뇌, 척수 경부, 심장, 횡격막, 간장 및 비장에 있어서의 글리코겐의 농도를 나타낸다(각각, 도 10a∼f). 또한, 도 11은, 대퇴사두근, 가자미근, 전경골근, 장지신근, 비복근에 있어서의 글리코겐의 농도를 나타낸다(각각, 도 11a∼e). 단, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군은, 최종 투여 후 5일 후에 사망했으므로, 이것을 제외했다.
이하에 결과의 도 10 및 도 11의 결과를 고찰한다.
뇌:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, 및 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 뇌조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0815, 3.08, 2.36, 2.07, 1.00, 0.891 및 0.592mg/g 습중량이었다(도 10(a)). hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 병태 대조군 및 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 또한, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)에 의한 글리코겐의 감소는 용량 의존성을 나타냈다.
척수 경부:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 경수 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0459, 3.10, 2.68, 2.26, 1.77, 1.06 및 0.795mg/g 습중량이었다(도 10(b)). hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 또한, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 또한, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)에 의한 글리코겐의 감소는 용량 의존성을 나타냈다.
심장:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 심장 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0816, 32.4, 4.54, 12.3, 3.45, 1.10 및 0.205mg/g 습중량이었다(도 10(c)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하면, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여량으로 유의미한 감소를 나타냈다.
횡격막:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 횡격막 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0824, 14.1, 6.96, 12.4, 5.57, 2.68 및 0.564mg/g 습중량이었다(도 10(d)). hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하면, 10mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여량으로 유의미한 감소를 나타냈다.
간장:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 간장 중의 글리코겐 농도는, 각각 1.16, 22.5, 2.65, 8.88, 2.95, 3.01 및 1.46mg/g 습중량이었다(도 10(e)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg 투여군의 hGAA 투여군과 동등한 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다.
비장:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 비장 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0295, 3.15, 0.182, 0.368, 0.165, 0.122 및 0.0990mg/g 습중량이었다(도 10(f)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg 투여군의 hGAA 투여군과 동등의 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다.
대퇴사두근:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 대퇴사두근 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0529, 8.66, 7.41, 6.40, 2.68, 1.71 및 0.282mg/g 습중량이었다(도 11(a)). hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 병태 대조군 및 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하여, 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 한편, 20mg/kg의 hGAA 투여군은 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소는 나타내지 않았다.
비복근:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 비복근 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.173, 7.68, 5.09, 5.23, 2.40, 1.58 및 0.221mg/g 습중량이었다(도 11(b)). hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 한편, 20mg/kg의 hGAA 투여군은 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소는 나타내지 않았다.
가자미근:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 가자미근 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.116, 12.08, 2.233, 7.20, 2.74, 1.07 및 0.378mg/g 습중량이었다(도 11(c)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소를 나타냈다. 또한, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 20mg/kg의 hGAA 투여군과 동등한 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다.
전경골근:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 전경골 근조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0419, 9.68, 8.23, 4.13, 2.56, 0.895 및 0.277mg/g 습중량이었다(도 11(d)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군 및 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 한편, 20mg/kg의 hGAA 투여군은 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소는 나타내지 않았다.
장지신근:
정상 대조군, 병태 대조군, 20mg/kg의 hGAA 투여군, hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4)의 2.5, 5.0, 10 및 20mg/kg 투여군의 장지신근 조직 중의 글리코겐 농도는, 각각 0.0950, 10.4, 9.11, 4.79, 2.59, 1.34 및 0.188mg/g 습중량이었다(도 11(e)). hGAA-항HTFR 항체 3N(IgG4) 투여군의 모두에 있어서, 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 또한, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군의 투여량이 5.0mg/kg 이상인 군에 있어서, 20mg/kg의 hGAA 투여군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소가 확인되었다. 한편, 20mg/kg의 hGAA 투여군은 병태 대조군과 비교하여 유의미한 조직 중의 글리코겐의 감소는 나타내지 않았다.
〔실시예 30〕 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 마우스를 이용한 약효 평가-병리 조직학적 평가(2)
실시예 29에서 채취한 좌뇌, 척수 경부, 대퇴사두근, 가자미근, 장지신근을, 충분량의 10% 중성 완충 포르말린액에 침지했다. 약 24시간 후에 10% 중성 완충 포르말린액을 교환했다. 조직 채취일부터 3일 후에, 80% 에탄올에 침지하고, 48시간 딜레이 타이머를 설정하여 자동 고정 포매 장치(사쿠라 로터리)에 의해 에탄올로부터 톨루엔으로 치환하고, 최종적으로 파라핀에 침지 후, 포매했다. 이것을 PAS 염색 및 HE 염색에 제공했다.
이하에 PAS 염색의 결과를 고찰한다.
대뇌피질:
세포 내의 PAS 염색성은, 병태 대조군 및 20mg/kg의 hGAA 투여군에서는 전 예가 중등도였지만, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 2.5∼20mg/kg 투여군에서는 염색성의 저하가 나타났다. 혈관의 PAS 염색성에 대해서는, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 염색성의 저하가 나타났다.
해마·치상회, 및 기저핵:
병태 대조군과 비교하여, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 20mg/kg 투여군에서는, 세포내 및 혈관의 PAS 염색성의 저하가 나타났다. 기저핵에서는, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 2.5mg/kg 투여군 및 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 5.0mg/kg 투여군에서도, PAS 염색성의 저하가 나타났다.
간뇌(시상·시상하부):
병태 대조군과 비교하여, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 2.5∼20mg/kg 투여군에서 PAS 염색성의 저하가 나타났다.
중뇌∼교:
hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 5.0∼20mg/kg 투여군에서 PAS 염색성의 저하가 나타났다.
연수:
병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 PAS 염색성의 저하가 나타났다.
소뇌:
푸르킨예 세포층·과립층에서는, 병태 대조군과 비교하여, 2.5∼20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는, 푸르킨예 세포 주위의 세포 내의 PAS 염색성의 저하 경향이 나타났다. 백질에서는, 2.5mg/kg 및 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 PAS 염색성의 저하 경향이 나타났다.
대퇴사두근:
병태 대조군과 비교하여, 5.0mg/kg 및 10mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서, PAS 염색성의 저하 경향이 나타나고, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)에서는, 염색성의 현저한 감소가 확인되었다.
가자미근:
병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg의 hGAA 투여군, 및 10mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 PAS 염색성 저하가 나타나고, 더욱이, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는, 염색성의 현저한 감소가 확인되었다.
그 다음에, 이하에 HE 염색의 결과를 고찰한다.
대뇌피질:
대뇌피질: 병태 대조군과 비교하여, 5.0∼20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는 세포종대의 경감화 경향이 나타났다. 대뇌 백질(뇌량, 해마채, 전교련) 및 뇌실: 병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg의 hGAA 투여군, 5.0∼20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 백질의 공포의 감소가 확인되었다.
연수 병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서만 세포종대의 경감화 경향이 나타났다.
소뇌:
백질의 세포종대에 대하여, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 경감화 경향이 나타났다.
대퇴사두근:
병태 대조군과 비교하여, 10mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 근섬유의 공포·공극 형성의 경감화 경향이 나타나고, 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는, 더한 경감화가 확인되었다.
가자미근:
병태 대조군과 비교하여, 20mg/kg의 hGAA 투여군, 5.0∼10mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 근섬유의 공포·공극 형성의 경감화가 나타나고, 더욱이 20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는 동 소견은 거의 나타나지 않았다.
장지신근:
병태 대조군과 비교하여, 5.0mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서 근섬유의 공포·공극 형성의 경감화가 나타나고, 10∼20mg/kg의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4) 투여군에서는, 더한 경감화가 확인되었다.
이상의 hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)의 마우스를 이용한 약효 평가의 결과는, hGAA-항hTfR 항체 3N(IgG4)이 5mg/kg 이상의 용량으로 투여되는 것에 의해, 시판되는 hGAA를 20mg/kg 투여의 용량으로 투여했을 경우보다도, 병리 조직학적으로도 폼페병의 치료약으로서 효과적임을 나타내는 것이고, 그 효과는, 중추 신경계 및 골격근 조직에 있어서 극히 현저함을 나타내는 것이다.
〔실시예 31〕 Fab 항hTfR 항체 3N과 hGAA의 융합 단백질(FabGS-GAA)의 제작
서열 번호 89로 나타나는 인간화 항hTfR 항체의 Fab 중쇄와 hGAA의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성하고, 이것을 pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, 발현 벡터 pE-neo(Fab HC-GS-GAA)를 구축했다. 이 때 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 5'말단측에는 분비 시그널로서 기능하는 리더 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 도입했다. pE-neo(Fab HC-GS-GAA)와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)로, CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection로부터 입수)를 형질 전환하여, Fab인 항hTfR 항체 3N과 hGAA의 융합 단백질(FabGS-GAA)을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 발현주를, 실시예 22에 기재된 방법에 준하여 배양하여, 배양 상청을 얻었다. 배양 상청을, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, CH1 어피니티 컬럼인 Capture Select IgG-CH1 컬럼(컬럼 체적: 약 1.0mL, Thermo Fisher사)에 부하하여, 융합 단백질을 CH1 어피니티 컬럼에 흡착시켰다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)을 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 50mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로, CH1 어피니티 컬럼에 흡착된 융합 단백질을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M HEPES-NaOH 완충액(pH 7.5)을 넣어 둔 용기에 받아, 즉시 중화시켰다. 이렇게 하여 얻어진 것을 FabGS-GAA의 정제품으로서 이하의 실험에 이용했다.
〔실시예 32〕 Fab GS-GAA의 마우스를 이용한 약효 평가
실시예 28에 기재가 있는 마우스(GAA-KO/hTfR-KI 마우스)에, 표 19-2에 나타내는 용법, 용량으로, 실시예 31에서 얻은 Fab GS-GAA, 또는 hGAA를 정맥내 투여했다. 한편, 약제 비투여의 정상 마우스를 정상 대조(제1군), 약제 비투여의 GAA-KO/hTfR-KI 마우스를 병태 대조(제2군)로 했다. 각 군 모두 마우스는 3∼4마리로 했다. 또한, 마우스는 웅성 및 자성의 9∼14주령(투여 개시 시)을 이용했다. 투여 1주일 후에, 실시예 29에 기재된 방법으로, 우뇌, 심장, 횡격막, 대퇴사두근, 가자미근, 전경골근을 채취하여, 이들 조직에 포함되는 글리코겐의 농도를 측정했다. 측정 결과를 도 12에 나타낸다. Fab GS-GAA 투여군에서는, 글리코겐의 농도를 측정한 모든 장기에 있어서, hGAA보다 현저하게 글리코겐이 감소했다. 특히, 그 감소 경향은, 우뇌 및 심장에 있어서 현저했다. 또한, 5.0mg/kg의 용량의 Fab GS-GAA 투여군에 있어서도, 20mg/kg의 용량의 hGAA 투여군과 비교하여, 우뇌 및 심장에 있어서 현저한 글리코겐의 감소가 확인되었다. 이들 결과는, Fab GS-GAA가, 폼페병의 치료약으로서 특히 뇌 및/또는 심장의 기능 장애를 수반하는 폼페병의 치료약으로서 사용할 수 있음을 나타낸다.
[표 19-2]
Figure 112022118341703-pat00024
〔실시예 33〕 각종 인간 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질의 제작
표 20-A∼표 20-C에 나타나는 서열 번호의 아미노산 서열을 갖는 표 20-A∼표 20-C에서 「융합 단백질명」으로서 나타나는 명칭의, 인간화 항hTfR 항체의 중쇄(단, scFab-IDUA에 대해서는 1본쇄 인간화 항hTfR 항체)와 각종 인간 리소좀 효소의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성하고, 이것을 pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, 발현 벡터를 구축했다. 이 때 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 5'말단측에는 분비 시그널로서 기능하는 리더 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 도입했다. 각각의 발현 벡터의 명칭을 표 20-A∼표 20-C에 나타낸다. 얻어진 각 발현 벡터와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)로, CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를 형질 전환하여, 각종 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 발현주를, 실시예 22에 기재된 방법에 준하여 배양하여, 배양 상청을 얻었다.
배양 상청에 포함되는 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을, 항체가 Fab인 것에 대해서는 하기의 정제법 1로, 항체가 중쇄의 전장을 포함하는 것에 대해서는 하기의 정제법 2에 의해 생성했다.
정제법 1: 배양 상청을, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, CH1 어피니티 컬럼인 Capture Select IgG-CH1 컬럼(컬럼 체적: 약 1.0mL, Thermo Fisher사)에 부하하여, 융합 단백질을 CH1 어피니티 컬럼에 흡착시켰다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)을 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 50mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로, CH1 어피니티 컬럼에 흡착한 융합 단백질을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M HEPES-NaOH 완충액(pH 7.5)을 넣어 둔 용기에 받아, 즉시 중화시켰다.
정제법 2:
배양 상청을, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)으로 평형화한, 프로테인 A 어피니티 컬럼인 MabSelect SuRe LX 컬럼(컬럼 체적: 약 1.0mL, GE Healthcare사)에 부하하여, 융합 단백질을 프로테인 A에 흡착시켰다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 100mM NaCl을 함유하는 20mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.0)을 공급하여 컬럼을 세정했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 50mM NaCl을 함유하는 100mM 글리신 완충액(pH 3.0)으로, 프로테인 A에 흡착된 융합 단백질을 용출시켰다. 용출액은, 미리 1M HEPES-NaOH 완충액(pH 7.5)을 넣어 둔 용기에 받아, 즉시 중화시켰다.
이렇게 하여 얻어진 융합 단백질의 정제품을 이용하여, 하기의 실험을 실시했다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을, 표 20-A∼표 20-C의 최우열에 나타내듯이 이름 붙였다.
[표 20-A]
Figure 112022118341703-pat00025
[표 20-B]
Figure 112022118341703-pat00026
[표 20-C]
Figure 112022118341703-pat00027
〔실시예 34〕 각종 인간 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성 및 효소 활성의 측정
인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성은 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 인간 리소좀 효소의 활성은, 하기의 방법으로 측정했다. 단, hAC 및 hLAMAN의 효소 활성은 측정하고 있지 않다.
hIDUA의 활성 측정:
정제한 hIDUA의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.1% BSA를 포함하는 50mM 시트르산 완충액(pH 3.5)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)를 사용했다. 다음에, 기질로서 4-Methylumbelliferyl α-L-Iduronide(glycosynth사)를 동 완충액으로 1mM로 희석한 것을, 각 웰에 60μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰에 0.05M Glycine/NaOH 산 완충(pH 10.6)을 200μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의하여, 단백질 단위 중량(mg)당의 비활성(比活性)을 구했다. 이하의 융합 단백질에 대해서도 비활성을 구했다.
hPPT-1의 활성 측정:
β-Glucosidase(오리엔탈효모사)를 0.2% BSA 및 0.00625% Triton X-100을 포함하는 0.4M Na2HPO4/0.2M 시트르산 완충액(pH 4.0)으로 0.25mg/mL로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 다음에, 정제한 hPPT-1의 항TfR 항체 융합 단백질을, 동 완충액으로 적당한 농도로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-Methylumbelliferyl 6-Thio-palmitate-β-D-glucopyranoside(Santa Cruz Biotechnology사)를 동 완충액으로 0.25mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지하고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의했다.
hASM의 활성 측정:
정제한 hASM의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.1mM 아세트산 아연, 0.25mg/mL BSA, 및 0.15% Tween20을 포함하는 250mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 6-Hexadecanoylamino-4-methylumbelliferyl phosphorylcholine(Carbosynth사)를 동 완충액으로 1mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 200μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의하여, 단백질 단위 중량(mg)당의 비활성을 구했다.
hARSA의 활성 측정:
정제한 hARSA의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.5% BSA 및 1.0% Triton-X 100을 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl sulfate potassium salt(SIGMA사)를 동 완충액으로 5mM로 희석하고, 각 웰에 100μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의했다.
hSGSH의 활성 측정:
정제한 hSGSH의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.2% BSA를 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl 2-deoxy-2-sulfamino-α-D-glucopyranoside(Carbosynth사)를 동 완충액으로 5mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 동 완충액으로 희석한 0.5mg/mL α-Glucosidase(오리엔탈효모사)를, 각 웰에 20μL씩 가하고, 37℃에서 17시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의했다.
hGBA의 활성 측정:
정제한 hGBA의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.1% BSA, 0.15% Triton-X 100, 및 0.125% 타우로콜산 나트륨을 포함하는 100mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside(SIGMA사)를 동 완충액으로 3.5mM로 희석하고, 각 웰에 70μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/분, 37℃로 정의했다.
hTPP-1의 활성 측정:
정제한 hTPP-1의 항TfR 항체 융합 단백질을, 150mM NaCl 및 0.1% Triton-X 100을 포함하는 50mM 폼산 나트륨 완충액(pH 3.5)으로 적당한 농도로 희석하고, 37℃에서 1시간 프리인큐베이션했다. 스탠다드로는 7-Amino-4-methylcoumarin(AMC)(SIGMA사)을 사용하여, 마찬가지로 처리했다. 1시간 후, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 다음에, 기질로서 Ala-Ala-Phe-7-amido-4-methylcoumarin(SIGMA사), 150mM NaCl 및 0.1% Triton-X 100을 포함하는 100mM 아세트산 완충액(pH 4.0)으로 25mM로 희석하고, 각 웰에 40μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 100mM 모노클로로아세트산/130mM NaOH/100mM 아세트산 완충액(pH 4.3)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 AMC μmol/분, 37℃로 정의했다.
hGAA의 활성 측정:
정제한 hGAA의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.5% BSA를 포함하는 PBS(-)(pH 7.2)로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl-a-D-glucopyranoside(SIGMA사)를 200mM 아세트산 완충액(pH 4.3)으로 2.2mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 200μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/min, 37℃로 정의했다.
hNAGLU의 활성 측정:
정제한 hNAGLU의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.1% BSA를 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.3)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminide(Calbiochem사)를 동 완충액으로 1mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/min, 37℃로 정의했다.
hGUSB의 활성 측정:
정제한 hGUSB의 항TfR 항체 융합 단백질을, 50mM NaCl을 포함하는 25mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronidehydrate(SIGMA사)를 동 완충액으로 2mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/min, 37℃로 정의했다.
hGALC의 활성 측정:
정제한 GALC의 항TfR 항체 융합 단백질을, 125mM NaCl 및 0.5% Triton X-100을 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside(SIGMA사)를 동 완충액으로 1mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/min, 37℃로 정의했다.
hFUCA1의 활성 측정:
정제한 FUCA1의 항TfR 항체 융합 단백질을, 0.2% BSAl을 포함하는 100mM 시트르산 완충액(pH 5.5)으로 적당한 농도로 희석하고, 플루오로눈크 플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 20μL씩 가했다. 스탠다드로는 4-Methylumbelliferone(4MU)(SIGMA사)을 사용했다. 다음에, 기질로서 4MU-α-L-fucopyranoside(SIGMA사)를 동 완충액으로 2mM로 희석하고, 각 웰에 20μL씩 가했다. 플레이트 믹서로 교반 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm를 측정했다. 한편, 효소 활성은, 1 Unit을 4MUμmol/min, 37℃로 정의했다.
표 21에, 각종 인간 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성 및 효소 활성의 측정을 나타낸다. 한편, 친화성 및 효소 활성의 측정은, 실시예 33에서 얻은 리소좀 효소와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질의 일부에 대해서만 실시했다. 즉, 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성 측정은 24종류, 효소 활성 측정은 20종류의 융합 단백질에 대해서만 실시했다.
효소 활성을 측정한 융합 단백질은, 모두 리소좀 효소로서의 효소 활성을 갖는 것이었다. 또한, 인간 TfR과의 친화성을 측정한 융합 단백질은, 모두 인간 TfR과 높은 친화성을 갖는 것이고, 가장 친화성이 낮은 것이라도, 그 KD치는 2.09x10-10이며, 19종류의 융합 단백질은, 그 KD치가 1.00x10-12 미만이었다. 또한, 원숭이 TfR과의 친화성을 측정한 융합 단백질은, 모두 원숭이 TfR과 높은 친화성을 갖는 것이고, 가장 친화성이 낮은 것이라도, 그 KD치는 3.05x10-8이며, 12종류의 융합 단백질은, 그 KD치가 1.00x10-12 미만이었다.
여기에서 이용한 항hTfR 항체는, 중쇄가, 가변 영역으로서 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것인 중쇄(IgG) 또는 Fab 중쇄이며, 경쇄가, 가변 영역으로서 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이들 결과는, 리소좀 효소를, 가변 영역으로서 이들 아미노산 서열을 포함하는 것과의 융합 단백질로 하는 것에 의해, 인간 TfR을 개재시켜 BBB를 통과시키고, 또한, 뇌내에서 효소 활성을 발휘시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure 112022118341703-pat00028
본 발명의 항hTfR 항체는, 이것과 융합시키는 것에 의해, 원하는 생리 활성 단백질, 저분자 물질 등을 혈액뇌관문을 통과시킬 수 있으므로, 중추 신경계에 있어서 작용시켜야 할 생리 활성 단백질, 저분자 물질 등을 뇌내에 송달하는 수단을 제공하는 것으로서 유용성이 높다.
1 혈관
2 뇌실질
3 신경양 세포
4 푸르킨예 세포
서열 번호 3: 링커예 1의 아미노산 서열
서열 번호 4: 링커예 2의 아미노산 서열
서열 번호 5: 링커예 3의 아미노산 서열
서열 번호 6: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 7: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 8: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 9: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 10: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 11: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 12: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 13: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 14: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 15: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 16: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
서열 번호 17: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1
서열 번호 18: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 2
서열 번호 19: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 3
서열 번호 20: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 4
서열 번호 21: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 5
서열 번호 22: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 6
서열 번호 23: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역의 아미노산 서열 2를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 24: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 25: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 4를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 26: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 4를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 27: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 5를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 28: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 5를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 29: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 6을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 30: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 6을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 31: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1
서열 번호 32: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 2
서열 번호 33: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 3
서열 번호 34: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 4
서열 번호 35: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 5
서열 번호 36: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 6
서열 번호 37: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 38: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄의 아미노산 서열 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 39: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열
서열 번호 40: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 41: 프라이머 hTfR5', 합성 서열
서열 번호 42: 프라이머 hTfR3', 합성 서열
서열 번호 43: 프라이머 Hyg-Sfi5', 합성 서열
서열 번호 44: 프라이머 Hyg-BstX3', 합성 서열
서열 번호 45: 키메라 hTfR을 코딩하는 cDNA의 3'측에 loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한 DNA의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 46: 타게팅 벡터의 5'암 서열, 합성 서열
서열 번호 47: 타게팅 벡터의 3'암 서열, 합성 서열
서열 번호 48: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 49: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 51: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄(인간화 2)와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 52: 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄(인간화 2)와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 53: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 54: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hI2S의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 57: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hGAA의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 58: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGAA의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 59: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGAA의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 60: 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 아미노산 서열
서열 번호 61: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 62: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 63: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 64: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열
서열 번호 65: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 66: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 67: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 68: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열
서열 번호 69: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 70: 인간 IgG의 Fc 영역의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 71: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 72: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 73: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열
서열 번호 74: 알부민 결합 도메인의 아미노산 서열
서열 번호 75: 인간 IDUA의 아미노산 서열 1
서열 번호 76: 인간 IDUA의 아미노산 서열 2
서열 번호 77: 인간 PPT-1의 아미노산 서열
서열 번호 78: 인간 ASM의 아미노산 서열
서열 번호 79: 인간 ARSA의 아미노산 서열
서열 번호 80: 인간 SGSH의 아미노산 서열
서열 번호 81: 인간 GBA의 아미노산 서열
서열 번호 82: 인간 TPP-1의 아미노산 서열
서열 번호 83: 인간 NAGLU의 아미노산 서열
서열 번호 84: 인간 GUSB의 아미노산 서열
서열 번호 85: 인간 GALC의 아미노산 서열
서열 번호 86: 인간 AC의 아미노산 서열
서열 번호 87: 인간 FUCA1의 아미노산 서열
서열 번호 88: 인간 LAMAN의 아미노산 서열
서열 번호 89: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGAA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-GAA
서열 번호 90: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-IDUA
서열 번호 91: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS8-IDUA
서열 번호 92: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-IDUA
서열 번호 93: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-IDUA
서열 번호 94: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-IDUA
서열 번호 95: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-IDUA
서열 번호 96: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-IDUA
서열 번호 97: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hIDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-IDUA
서열 번호 98: 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N(2)의 아미노산 서열
서열 번호 99: 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N와 IDUA의 융합 단백질의 아미노산 서열, scFab-IDUA
서열 번호 100: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-PPT1
서열 번호 101: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-PPT1
서열 번호 102: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-PPT1
서열 번호 103: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-PPT1
서열 번호 104: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-PPT1
서열 번호 105: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hPPT-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-PPT1
서열 번호 106: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-ASM
서열 번호 107: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-ASM
서열 번호 108: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-ASM
서열 번호 109: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-ASM
서열 번호 110: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-ASM
서열 번호 111: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-ASM
서열 번호 112: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-ASM
서열 번호 113: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-ASM
서열 번호 114: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hASM의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-ASM
서열 번호 115: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-ARSA
서열 번호 116: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-ARSA
서열 번호 117: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-ARSA
서열 번호 118: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-ARSA
서열 번호 119: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-ARSA
서열 번호 120: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-ARSA
서열 번호 121: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-ARSA
서열 번호 122: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-ARSA
서열 번호 123: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hARSA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-ARSA
서열 번호 124: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-SGSH
서열 번호 125: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-SGSH
서열 번호 126: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-SGSH
서열 번호 127: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-SGSH
서열 번호 128: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-SGSH
서열 번호 129: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hSGSH의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-SGSH
서열 번호 130: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GBA
서열 번호 131: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-GBA
서열 번호 132: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-GBA
서열 번호 133: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-GBA
서열 번호 134: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-GBA
서열 번호 135: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGBA의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-GBA
서열 번호 136: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-TPP1
서열 번호 137: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-TPP1
서열 번호 138: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-TPP1
서열 번호 139: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-TPP1
서열 번호 140: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-TPP1
서열 번호 141: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hTPP-1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Tandem Fab HC-TPP1
서열 번호 142: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-NAGLU
서열 번호 143: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-NAGLU
서열 번호 144: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-NAGLU
서열 번호 145: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-NAGLU
서열 번호 146: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-NAGLU
서열 번호 147: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-NAGLU
서열 번호 148: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-NAGLU
서열 번호 149: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hNAGLU의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-NAGLU
서열 번호 150: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GUSB
서열 번호 151: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-GUSB
서열 번호 152: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-GUSB
서열 번호 153: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-GUSB
서열 번호 154: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-GUSB
서열 번호 155: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-GUSB
서열 번호 156: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-GUSB
서열 번호 157: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGUSB의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-GUSB
서열 번호 158: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GALC
서열 번호 159: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-GALC
서열 번호 160: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-GALC
서열 번호 161: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-GALC
서열 번호 162: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-GALC
서열 번호 163: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-GALC
서열 번호 164: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-GALC
서열 번호 165: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hGALC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-GALC
서열 번호 166: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-AC
서열 번호 167: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-AC
서열 번호 168: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-AC
서열 번호 169: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-AC
서열 번호 170: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-AC
서열 번호 171: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-AC
서열 번호 172: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-AC
서열 번호 173: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hAC의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-AC
서열 번호 174: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-FUCA1
서열 번호 175: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-FUCA1
서열 번호 176: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-FUCA1
서열 번호 177: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-FUCA1
서열 번호 178: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-FUCA1
서열 번호 179: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-FUCA1
서열 번호 180: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-FUCA1
서열 번호 181: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hFUCA1의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-FUCA1
서열 번호 182: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-LAMAN
서열 번호 183: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS5-LAMAN
서열 번호 184: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS10-LAMAN
서열 번호 185: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, IgG4 HC-GS20-LAMAN
서열 번호 186: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS3-LAMAN
서열 번호 187: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS5-LAMAN
서열 번호 188: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS10-LAMAN
서열 번호 189: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄와 hLAMAN의 융합 단백질의 아미노산 서열, Fab HC-GS20-LAMAN
SEQUENCE LISTING <110> JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD. <120> NOVEL ANTI-HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODY CAPABLE OF PENETRATING BLOOD-BRAIN BARRIER <130> FP17-0782-00 <150> JP2016-252148 <151> 2016-12-26 <160> 189 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr 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an exemplified linker 3 <400> 5 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 6 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 7 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 8 Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 9 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR 3 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No. 3 <400> 10 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 11 Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 12 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 13 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 14 Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 3 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 15 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 3 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 16 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 17 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 24 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 24 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 25 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 4 as the variable region <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 26 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 4 as the variable region, synthetic sequence <400> 26 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag agccccctga gcctgcctgt gacacctggc 120 gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 27 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 5 as the variable region <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 28 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 5 as the variable region, synthetic sequence <400> 28 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag acacccctga gcctgcctgt gacacctggc 120 gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaggctgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 29 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 6 as the variable region <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 30 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 6 as the variable region, synthetic sequence <400> 30 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagatccagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgttcttctg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Val Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavychain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 38 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427 <210> 39 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain (IgG4) of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 1418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain (IgG4) of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 40 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hTfR5', synthetic sequence <400> 41 ccgacgcgtc gccaccatga tggatcaagc tagatcagca ttc 43 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hTfR3', synthetic sequence <400> 42 ataatgcggc cgcttaatga tgatgatgat gatgaaactc attgtcaatg tcccaaacg 59 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic sequence <400> 43 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence <400> 44 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 45 <211> 4460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "Nucleotide sequence of the DNA formed of a cDNA encoding chimeric hTfR and a loxP-flanked neomycin resistance gene placed on the cDNA's 3' side, synthetic sequence " <400> 45 gtttatcctc ccttgtagca gctgagaatg atggatcaag ccagatcagc attctctaac 60 ttgtttggtg gggaaccatt gtcatacacc cggtttagcc ttgctcggca agtagatgga 120 gataacagtc atgtggagat gaaactggct gcagatgaag aagaaaatgc cgacaataac 180 atgaaggcta gtgtcagaaa acccaagagg tttaatggaa gactctgctt tgcagctatt 240 gcactagtca ttttcttctt gattggattc atgagtggct acctgggcta ttgtaaaggg 300 gtagaaccaa aaactgagtg tgagagactg gcaggaaccg agtctccagt gagggaggag 360 ccaggagagg acttccctgc agcacgtcgc ttatattggg atgacctgaa gagaaagttg 420 tcggagaaac tggacagcac agacttcacc ggcaccatca agctgctgaa tgaaaattca 480 tatgtccctc gtgaggctgg atctcaaaaa gatgaaaatc ttgcgttgta tgttgaaaat 540 caatttcgtg aatttaaact cagcaaagtc tggcgtgatc aacattttgt taagattcag 600 gtcaaagaca gcgctcaaaa ctcggtgatc atagttgata agaacggtag acttgtttac 660 ctggtggaga atcctggggg ttatgtggcg tatagtaagg ctgcaacagt tactggtaaa 720 ctggtccatg ctaattttgg tactaaaaaa gattttgagg atttatacac tcctgtgaat 780 ggatctatag tgattgtcag agcagggaaa atcacctttg cagaaaaggt tgcaaatgct 840 gaaagcttaa atgcaattgg tgtgttgata tacatggacc agactaaatt tcccattgtt 900 aacgcagaac tttcattctt tggacatgct catctgggga caggtgaccc ttacacacct 960 ggattccctt ccttcaatca cactcagttt ccaccatctc ggtcatcagg attgcctaat 1020 atacctgtcc agacaatctc cagagctgct gcagaaaagc tgtttgggaa tatggaagga 1080 gactgtccct ctgactggaa aacagactct acatgtagga tggtaacctc agaaagcaag 1140 aatgtgaagc tcactgtgag caatgtgctg aaagagataa aaattcttaa catctttgga 1200 gttattaaag gctttgtaga accagatcac tatgttgtag ttggggccca gagagatgca 1260 tggggccctg gagctgcaaa atccggtgta ggcacagctc tcctattgaa acttgcccag 1320 atgttctcag atatggtctt aaaagatggg tttcagccca gcagaagcat tatctttgcc 1380 agttggagtg ctggagactt tggatcggtt ggtgccactg aatggctaga gggatacctt 1440 tcgtccctgc atttaaaggc tttcacttat attaatctgg ataaagcggt tcttggtacc 1500 agcaacttca aggtttctgc cagcccactg ttgtatacgc ttattgagaa aacaatgcaa 1560 aatgtgaagc atccggttac tgggcaattt ctatatcagg acagcaactg ggccagcaaa 1620 gttgagaaac tcactttaga caatgctgct ttccctttcc ttgcatattc tggaatccca 1680 gcagtttctt tctgtttttg cgaggacaca gattatcctt atttgggtac caccatggac 1740 acctataagg aactgattga gaggattcct gagttgaaca aagtggcacg agcagctgca 1800 gaggtcgctg gtcagttcgt gattaaacta acccatgatg ttgaattgaa cctggactat 1860 gagaggtaca acagccaact gctttcattt gtgagggatc tgaaccaata cagagcagac 1920 ataaaggaaa tgggcctgag tttacagtgg ctgtattctg ctcgtggaga cttcttccgt 1980 gctacttcca gactaacaac agatttcggg aatgctgaga aaacagacag atttgtcatg 2040 aagaaactca atgatcgtgt catgagagtg gagtatcact tcctctctcc ctacgtatct 2100 ccaaaagagt ctcctttccg acatgtcttc tggggctccg gctctcacac gctgccagct 2160 ttactggaga acttgaaact gcgtaaacaa aataacggtg cttttaatga aacgctgttc 2220 agaaaccagt tggctctagc tacttggact attcagggag ctgcaaatgc cctctctggt 2280 gacgtttggg acattgacaa tgagttttaa cgtggctcgc tgatcagcct cgactgtgcc 2340 ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 2400 tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 2460 gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 2520 caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag 2580 ctggggctcg atcctctagt taagcttccc agcggccgct atcgaattcc gatcatattc 2640 aataaccctt aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag gtctgaagag 2700 gagtttacgt ccagccaagc taattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt 2760 ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc 2820 ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 2880 tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt 2940 cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca 3000 ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct 3060 tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc 3120 tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa 3180 agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc 3240 aatatgggat cggccattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 3300 gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 3360 ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 3420 ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 3480 tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 3540 gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 3600 gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 3660 gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 3720 gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 3780 cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 3840 atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 3900 cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 3960 gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 4020 tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg gatccgctgt aagtctgcag aaattgatga 4080 tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt tcctgtcata ctttgttaag 4140 aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat tggagctacg ggggtggggg 4200 tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc tctttactat tgctttatga 4260 taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa accaaattaa gggccagctc 4320 attcctccca ctcatgatct atagatccct cgatcgagat ccggaaccct taatataact 4380 tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtccctcga agaggttcac tagttctaga 4440 gcatttaaat acgtgctagc 4460 <210> 46 <211> 5003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the 5'-arm of targeting vector, synthetic sequence <400> 46 aaagacattc ccagggtccc taagggctcc atctgggagc gcgctatctg tagtcctgtt 60 gtggtttaag ataccactct ctttgttatt tgtaaattta ccacaggctg ggcagtaaag 120 tacagatagg aagaaaagag tgtgaacgtt tgcagtttta acagaactcc ttttatttgc 180 tatgcattgc aacaaccctc taaaagcaat aatggcgata aacatgcaag ttaatctaca 240 actttatcac cctagtaaat cattggttcc tatttccctt ccataggctg aacatagtga 300 gcactggtag ctctttgctt ggcttaagcg ctgcttgtta aaatctaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaagatttg cagttttgct ttaaagtttt tcctttaaag catctctgag ctgcaaaaac 420 tcgtctttag gatatggttt tggcggagac ctaagcctgc aagtaggaat attttaaaga 480 gtaaaggctg atactttcga acttgcaccg cagggttggg tgtcggtcaa ggttaggcgg 540 agggcgacag gccaactcca aagacacggc gggggagggg tgcggtggag aaagcgagcc 600 gcagccaatc gcacgcgctc tcccgacacc tgccgccttg gcgccttttc taggctactc 660 cgcgcacgca ctggctgcgc gcgcagttcg cctccagcgg tcttggggga gcacctcggt 720 aggtgtacgt gcggaaggaa gtgacgtaga tccagagggc cggccggggg gtggggccga 780 gctataagct ttgggtggga ggcagcgctg ccttcagaag gcgtgcggag cgcgggctgc 840 tgcattgcgg actgtagagg cgcttcctag tgagtgactc ccttgtcagc ggcacggccc 900 atcgtggtcc tcgcgtggcg ggcggaccag agcgagacgc cagggcctgg gtggtgcggg 960 cggggaggcg gaggggtgtc gcggagtccg gggctgagga gcgcgggttg caggtgcagc 1020 gcggtgggtg tggggagccg ctgtaccctg cgcccctcgg gtcctccggg ccttcgcagg 1080 ccagtgctag gccgcgggtt cgagagtcac cacgctgagg cgcaggcttg ttccgccggg 1140 agcacgtggt ggcggctgga ggaagtcgcc ccagggaacg gctgtcgggg tacgtgggtg 1200 accttggggc ccctcgcagg agggcgtcac agctgaaaag gacaaagctg ttttctattc 1260 ggttactagt gtcacggaca tttagagggg cggggggagc ttccaataac tgcacgttgg 1320 aacttcggca ccacctggtc ggtttttttg ccagtctctc cctcttggcc cagcgtgtgg 1380 aatctcattt ttctagggca gaataggtct gaacgctgca ggtaatacta agaacgtctc 1440 tagcatctcc taagatggga gaacgtagaa atacgacctc tttgtacgag ctcttttaga 1500 actagctgta gagaaccagc gtgcaccctg gtgttggaca gctctctaaa atggtgtttg 1560 agggtaagaa aactgcattt gcaaattttt cagttagcac actttgtccc gagcgtaaaa 1620 tgaaatgatc tccttatact taggcagaag actggactgg attgctgttc agtttctgtg 1680 ctattttttt aaaataggat ttaagtggga aatagttgtg ttacagaaat tctcggctat 1740 tctgtgctat ttttttttaa ataggattta agtgggaaat agttgtgtta cagaaattct 1800 cggctacctg atacttttat tctaagatta gatgagttgg ctctgagctg tgaaatatga 1860 cctctttgac aaagacattt aagctgattc aggatgttat ctacaaagaa aacgggattt 1920 agcttgtgtg ggtccacttg catttatttt ctgttaagga ttataataaa ctgctttata 1980 caggaatcca atatcagctg ttttttatat agagagcata atacttttta ctttgagaga 2040 ggatgttgtc aaggaatggt ggctgtgaac ctggcctgtg ttgactggtt agatctgtct 2100 gcctaacccc accctaaggc taagtagtta tatgcttgtg gcaatgtgct tatttataat 2160 agggcaagat tatgggctaa atttgggtta gacaacaatg aaagttaatt aaacgaccct 2220 caggccttgg gtctactatg tgtaagtgat ttccttctct cccagatgag tgctatacaa 2280 aataaacttc agtgacctca agtggttttg accttttggt tgctattcag aaaactatgg 2340 aaatgaaaac ctgctaccta tttcctattg ccttttcaat ttcccaaaga aggtctcccc 2400 tatgaatcca tgggtagcct tgaactcaga tccacctgct tctgtttgga gagtgataag 2460 attaaaggca agtgccacca cacccagcaa agtaggctct taaaactaaa acctttgcag 2520 tcgggcatgg tgccacacac ctttggtccc agcactgggg ggtaaggcag aggcaggtgg 2580 atcactgagt ttgaggtcag ctagtgctga agagtaagag cctgtcttta aaacatctca 2640 acagctgggc agtcgtggtc cattccttta atcccagcac ttgggaggca gaggcaagtg 2700 gatttttgag ttcgaggcca gcctggtcta cagagtgagt tccaggacag ccagggatac 2760 acagagaaac cctgtctcaa aaaaccaaaa tataaataaa taaataaaga ttgggagaga 2820 agtcaaggat ctcataggtg gtcagggagc tacaactgca gtagtaaaga agtaggactt 2880 aaaagaacag ggccggcact aattttgagg atctagatcg ggccctcaat taaggaactt 2940 ccttttgtgt gaactcagaa tttgaaatga aatgtgcttg tcagaaccat tgcatggctt 3000 attttttaat gaaaagtctg gctagtatct gcttatcttc cagcttccag ctcaaagtta 3060 aggtcataga tcaaaagaac tatgtcttta tcttagttgt atcttaattt ttattagaat 3120 tgaatggttt tcctaatgtt tggtaacatc aaaggtgtgt aagtaaaagt gagaaatcaa 3180 gattaacttt ctcttggcaa agattgttga cattggtgac atcttggacc aaatgagaat 3240 tgttttactt ttaaatgtcc catcaacagc tctcagttag gctgttctat ctggtttgtc 3300 ttgccatgct tgcagagtat agatttgaca atttgaaaat tcaaaaagct atataaatag 3360 gtatgttgct atatgtaaga ttttaaatga gtcagttaag acttaaagaa taactgggtt 3420 tattttatct tgtcaggtta tcactgtgta gaccaggttg accttgaaaa caaattctct 3480 gcttcccaag tgctgggatt aaaggcgtgt gtcactagct ctgacactgg ctactttgga 3540 actactatgg tgttcacaaa tgcagagttg agtgttggga ttaaatggaa atttcatgtc 3600 ttttttttta actttccctt ctacacaggg cttctctgtg tagtcctggc tgtccttgta 3660 gctctagact aggctgaatt caaactcaga tccacccacc taagtgctga gattaaaggc 3720 atgtgccacc actgcccagt tctgaattgt tggggttttt tttttgttgt tattcttaat 3780 tttagttcga tgaattaaaa tcgaaataac ttgtttctta gaaaaataag gtgtaattgg 3840 gttataaagc caaatttaga cattaatacc aacagcctgt ttaggctcaa aattgttcaa 3900 tcattttatt agtattatta ttaatcatat caacttgaga cctgtttggg aaagcagaat 3960 attttaggga tagctatttc agacaagcat taatgtgtta gctgtttttt tccccctaga 4020 atatgattaa aattggctca gggtggggcc ttctagttct ggctctagcg attgggtctg 4080 tttctggtga ggtggtagtg ataaactgta acagaaggga caagagattg ggcttctgag 4140 aacatgtatg atctggtatg tgactttaat cattaaagca tggggattca aaaatactaa 4200 tgaataggcc ttagaactag tcctgagtgt tttgtaaaat aacagtctta attctcctag 4260 tttctggatt tttttctttg tctttggata ctaagtttaa gcatttattt ggacagagtg 4320 gtgcccacta gctgttctat tctagtactt gggaggcaag aggcagaacg aacatggcca 4380 gcttggacaa cttaagaaaa ctgaaaggct tgccatccta gtttttcttt tgattaaaca 4440 cacttatatt ctaactagtt ttctctatcc tttgggtttt gttttgtttt ttatttgttt 4500 tgtagctcta gctggctggc ttcggaattg cctgcctccc aagtgctagg attaaaggca 4560 tcacagtcac tacccaattg atatcatgat tcttaattca acttctaaga acaaattatc 4620 acactctgaa tctaacatgg aatagcatta tccatgttca gatatctttg tctcaaggct 4680 caggtttatc ctttgtagct ttctttttgc tatcccacct ctattcagca tccagtcaag 4740 gatcactgag ttggttatca gtaaattaaa cattttaatt aatgtctagg agacaggtta 4800 tggtatagtt ctcagtgctg ggaagttgac atggtaggat ctcagttcat ggccagccag 4860 aactttctgg tgagatcctg gttcaagcac tacagagctt ttctagaaaa gtaactatat 4920 ttaggagtaa gtttgatata atgacaatcc catcgtaagc cttcagtaac ctgatgcatt 4980 ggtctctgtt ttaatatcag gta 5003 <210> 47 <211> 2604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the 3'-arm of targeting vector, synthetic sequence <400> 47 gcattctcta acttggtaag gtactttcat ctatctgaaa aaatgttcag taaaaaacaa 60 aacaaaaaca tgacttcacc cagtgagtac aagatgatac ccccaatttt tttttttttt 120 attatatgta tgtacactgt agctgtcttc agacacacca gaagagggcg tcagatctca 180 tcagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggacttga acactggacc tttggaaaag 240 cagttgggta ctcttaccca ctgagctatc acaccagccc caatacccca aattttgacc 300 agcctttttt tttttttttt tttttttttt aaatctgaac taatggtatt aaggtgaaac 360 agattgcaca aaagaggtac taggtttttc tttgaggcaa ggtctttcta tattgcctca 420 ggttgacctt aaactccaac ttcctttttt tccccaagtg ctggagattg tagacagata 480 tatacaacac cccaaaacaa atatgtttag tttcgattaa gattcattat gtggggctag 540 agggatgact tagaggttaa gaacactgcc tgctcttcca gaggtcctga gttcaattcc 600 cagcaaccac gtggtggctc acaaccatct gtaatgggat ccgatgccct ctttctggtg 660 tgtttgaaga cagctacagt gtcctcatac ataaaaaaaa taaacaaaca gatcttttaa 720 aaaaaaaggt acagtgtact tatacattat ataaatgaat gattctttaa aaaattaatt 780 atgggaaata cttatgaaga atagggtagc tttggctgtt ttggaaacgt tatataacaa 840 ggtagaacta aaatgtatgc cagtaatccc agaggaatca ttagccagtc agggctagtc 900 tgagcaatgt ggcaagataa acccatctct ttaaaaaaaa aaaaaagtat tataaataga 960 aatgttatag gaaacaggaa atagaaaccc tcgaaaggct gaatgaaaga gtattagtgg 1020 gctggagaga tggttcagcg gttaagagca ctatctcctg agttcagttc ccagtgacca 1080 catggtggct cacagccatc tgtaatgaga tctgacgccc tcttctgggg tgtctgaaga 1140 cagcgacagt gtactcacat aaaataaata cataaagact gttagttagc cttcatctac 1200 catttacaga actgggcaca gaaaggagtt catcagttat aaagggtaac tttccatatg 1260 aatgtttgtc atattattat gcatatagta taatgaccaa actactgtaa tgtcttaata 1320 tttgtatctc ttttctcttt tttaaaaata tcagtttggt ggggaaccat tgtcatacac 1380 ccggtttagc cttgctcggc aagtagatgg agataacagt catgtggaga tgaaactggc 1440 tgcagatgaa gaagaaaatg ccgacaataa catgaaggct agtgtcagaa aacccaagag 1500 gtttaatgga agactctgct ttgcagctat tgcactagtc attttcttct tgattggtaa 1560 gaatgagtgg ccattcagaa ggatttctta tgactaacta gttcttagac tagctagttc 1620 ttagactagc tagttcttgt ttcttttgga tgaggagatg ctttgtactt taaatggcac 1680 tggggctccc tacctgccgg cagattaggt cctgcaagat gggaaacgtt tacattatgg 1740 atgttttatt agagatatgc aggacatttg gaatagtact aagaaaggct tccagtaaga 1800 caaggtgtgc acccatgtct taaacaggtc actgtaaaat atgacttagt tgtggtaatt 1860 taaattccat taaactcagg ttcataattt tctattagat tctcatagtt taattaaaag 1920 ttttcaggga taagttaaaa atgagttctg tgagtttagc tctaaaactt cctgttttta 1980 ggattcatga gtggctacct gggctattgt aagcgtgtag aacaaaaaga ggagtgtgtg 2040 aaactggctg aaacggagga gacagacaag tcagaaacca tggaaacaga ggatgttcct 2100 acatcatctc gcttatattg ggcagacctc aaaacactgt tgtcagagaa gttgaactcc 2160 atagagtttg ctgacaccat caagtaagct caacttccca agttcagtcc tgatggaaac 2220 gtttttgttg ggggggtagg gagacttgaa aggctttcag agggtcctcc tgacaatgtg 2280 gaactatgct gacaggaaat taggacttac ctggagagcc tcatagcctc ctttttcttc 2340 agaatcgttt tatcagttgt agtttagtgt gggatgtcag attttcttct gttctaatat 2400 tccttttaaa aattttttaa aattaaaatt actttttatg tattatgagt atagcctgca 2460 tatatgaatg aatgtgcatt actaattaca cttatctcct agtgcctaca taagccttat 2520 agatggttgt gagccagcat gtgggtgctg gaatccaaaa tggttcttgc aagaccaaat 2580 atgttacatc ccagagccat taca 2604 <210> 48 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 49 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Ser Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 50 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser 180 185 190 Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg 195 200 205 Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu 210 215 220 Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn 225 230 235 240 Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile 245 250 255 Ser Val Pro 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Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser 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Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile 530 535 540 Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys 545 550 555 560 Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr 565 570 575 Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn 580 585 590 Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu 595 600 605 Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys 610 615 620 Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser 625 630 635 640 Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro 645 650 655 Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile 660 665 670 Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala 675 680 685 Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu 690 695 700 Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys 705 710 715 720 Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val 725 730 735 Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr 740 745 750 Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly 755 760 765 Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu 770 775 780 Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu 785 790 795 800 Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met 805 810 815 Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe 820 825 830 Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro 835 840 845 Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu 850 855 860 Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly 865 870 875 880 Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp 885 890 895 Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile 900 905 910 Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val 915 920 925 Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala 930 935 940 Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met 945 950 955 960 Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 965 970 975 <210> 52 <211> 3011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of anti-hTfR antibody No.3 (humanized 2) and hI2S, synthetic sequence <400> 52 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440 tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500 ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560 ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620 ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680 cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740 tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800 agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860 cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920 cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980 atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040 ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100 gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160 caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220 tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280 ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340 acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400 gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460 gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520 gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580 ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640 tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700 tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760 atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820 atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880 gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940 gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000 taagcggccg c 3011 <210> 53 <211> 975 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3N and hI2S <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 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Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe 820 825 830 Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro 835 840 845 Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu 850 855 860 Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly 865 870 875 880 Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp 885 890 895 Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile 900 905 910 Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val 915 920 925 Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala 930 935 940 Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met 945 950 955 960 Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 965 970 975 <210> 54 <211> 3011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3N and hI2S, synthetic sequence <400> 54 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat cttccgaaac gcaggccaac 1440 tcgaccacag atgctctgaa cgttcttctc atcatcgtgg atgacctgcg cccctccctg 1500 ggctgttatg gggataagct ggtgaggtcc ccaaatattg accaactggc atcccacagc 1560 ctcctcttcc agaatgcctt tgcgcagcaa gcagtgtgcg ccccgagccg cgtttctttc 1620 ctcactggca ggagacctga caccacccgc ctgtacgact tcaactccta ctggagggtg 1680 cacgctggaa acttctccac catcccccag tacttcaagg agaatggcta tgtgaccatg 1740 tcggtgggaa aagtctttca ccctgggata tcttctaacc ataccgatga ttctccgtat 1800 agctggtctt ttccacctta tcatccttcc tctgagaagt atgaaaacac taagacatgt 1860 cgagggccag atggagaact ccatgccaac ctgctttgcc ctgtggatgt gctggatgtt 1920 cccgagggca ccttgcctga caaacagagc actgagcaag ccatacagtt gttggaaaag 1980 atgaaaacgt cagccagtcc tttcttcctg gccgttgggt atcataagcc acacatcccc 2040 ttcagatacc ccaaggaatt tcagaagttg tatcccttgg agaacatcac cctggccccc 2100 gatcccgagg tccctgatgg cctaccccct gtggcctaca acccctggat ggacatcagg 2160 caacgggaag acgtccaagc cttaaacatc agtgtgccgt atggtccaat tcctgtggac 2220 tttcagcgga aaatccgcca gagctacttt gcctctgtgt catatttgga tacacaggtc 2280 ggccgcctct tgagtgcttt ggacgatctt cagctggcca acagcaccat cattgcattt 2340 acctcggatc atgggtgggc tctaggtgaa catggagaat gggccaaata cagcaatttt 2400 gatgttgcta cccatgttcc cctgatattc tatgttcctg gaaggacggc ttcacttccg 2460 gaggcaggcg agaagctttt cccttacctc gacccttttg attccgcctc acagttgatg 2520 gagccaggca ggcaatccat ggaccttgtg gaacttgtgt ctctttttcc cacgctggct 2580 ggacttgcag gactgcaggt tccacctcgc tgccccgttc cttcatttca cgttgagctg 2640 tgcagagaag gcaagaacct tctgaagcat tttcgattcc gtgacttgga agaagatccg 2700 tacctccctg gtaatccccg tgaactgatt gcctatagcc agtatccccg gccttcagac 2760 atccctcagt ggaattctga caagccgagt ttaaaagata taaagatcat gggctattcc 2820 atacgcacca tagactatag gtatactgtg tgggttggct tcaatcctga tgaatttcta 2880 gctaactttt ctgacatcca tgcaggggaa ctgtattttg tggattctga cccattgcag 2940 gatcacaata tgtataatga ttcccaaggt ggagaccttt tccagttgtt gatgccttaa 3000 taagcggccg c 3011 <210> 55 <211> 883 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 1 5 10 15 Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu 20 25 30 Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu 35 40 45 Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr 50 55 60 Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Ala Thr 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caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaagga tctgctcacc ctggacggcc tagggccgtg 1440 cctacccagt gcgacgtgcc tcctaattcc aggttcgact gcgcccccga taaagccatc 1500 acccaggaac agtgtgaggc caggggctgt tgctatattc ccgccaagca gggcctgcag 1560 ggcgctcaga tgggccagcc ctggtgcttc ttccccccct cctatccctc ctacaagctg 1620 gaaaacctgt cctcctccga gatgggctac acagccaccc tcacaaggac aacccccacc 1680 ttcttcccca aggacatcct caccctgcgg ctggatgtga tgatggagac cgagaaccgg 1740 ctgcacttca ccatcaagga ccctgccaat cggcggtacg aggtgcctct ggaaaccccc 1800 cgggtgcact ccagggctcc ttcccctctg tatagcgtgg agtttagcga ggagcccttc 1860 ggcgtgatcg tgcaccggca gctcgacgga agggtgctgc tgaacaccac cgtcgccccc 1920 ctgttcttcg ccgatcagtt cctccagctg tccacctccc tgccctccca gtacattacc 1980 ggcctggctg agcacctgag ccccctgatg ctgtccacca gctggacaag gatcaccctg 2040 tggaatcggg acctcgctcc cacccctgga gccaatctgt acggcagcca ccccttctac 2100 ctggccctcg aagatggagg cagcgctcat ggcgtgttcc tgctgaattc caacgctatg 2160 gacgtggtgc tccaaccctc ccctgccctg tcctggagga gcacaggcgg cattctggac 2220 gtctacattt tcctcggccc cgagcctaaa tccgtcgtcc agcagtacct ggacgtggtg 2280 ggctaccctt ttatgcctcc ttactggggc ctgggctttc acctgtgtag gtggggctat 2340 tccagcaccg ctattacacg gcaggtcgtc gaaaacatga cacgggccca ctttcccctg 2400 gacgtccaat ggaatgacct ggactacatg gactcccggc gggacttcac attcaataag 2460 gacggcttcc gggacttccc tgccatggtg caggagctgc atcagggagg ccggaggtac 2520 atgatgattg tggaccctgc tatttccagc tccggacctg ctggctccta ccggccctac 2580 gacgagggac tgcggagggg cgtcttcatc acaaacgaaa ccggtcagcc cctgattgga 2640 aaggtgtggc ccggttctac agctttcccc gactttacaa accccacagc cctggcttgg 2700 tgggaggaca tggtggccga gtttcacgac caggtgcctt tcgacggcat gtggatcgat 2760 atgaacgagc cttccaactt tatcaggggc agcgaggatg gctgccccaa caacgagctc 2820 gagaatcccc cctacgtccc cggagtcgtg ggaggcacac tccaggctgc cacaatctgc 2880 gccagctccc atcagttcct gagcacccat tacaacctgc ataacctgta cggcctcacc 2940 gaagccatcg ccagccatag ggctctggtg aaggccaggg gaacacggcc tttcgtgatc 3000 tccaggagca catttgccgg ccacggcagg tacgctggcc actggacagg cgatgtctgg 3060 tcctcctggg agcaactggc ttccagcgtc cccgagatcc tccagttcaa cctgctgggc 3120 gtgcccctgg tgggcgccga cgtgtgcggc tttctcggca acacctccga ggagctgtgt 3180 gtgcggtgga cccagctggg cgccttctat ccctttatgc ggaatcacaa cagcctgctg 3240 tccctgcctc aggaacccta cagcttcagc gaacctgctc agcaggccat gcggaaggcc 3300 ctgaccctcc ggtatgccct gctgccccac ctctataccc tgtttcatca ggctcatgtg 3360 gctggcgaga cagtggctag gcctctgttc ctggagtttc ccaaggattc cagcacatgg 3420 acagtggacc atcagctgct gtggggcgag gctctgctga tcacacccgt gctgcaggcc 3480 ggcaaagccg aggtgacagg ctatttcccc ctgggaacct ggtacgacct ccagacagtg 3540 cccattgagg ccctgggttc tctccctcct cctcctgccg ctcccaggga acctgctatc 3600 cactccgaag gccagtgggt gaccctgcct gctcccctgg acacaatcaa cgtccacctg 3660 cgggctggct acattattcc tctccaggga cccggcctga caaccacaga gagcaggcag 3720 cagcccatgg ccctggctgt cgctctgaca aaaggaggcg aggcccgggg agagctcttc 3780 tgggatgacg gcgagagcct ggaggtcctg gagaggggag cctataccca ggtgatcttc 3840 ctcgcccgga acaacaccat tgtgaacgag ctggtgaggg tcacatccga aggagccgga 3900 ctgcaactgc agaaagtgac agtgctgggc gtcgccaccg ctcctcaaca ggtgctgtcc 3960 aacggcgtgc ccgtctccaa ctttacctac agccccgaca ccaaggtgct ggacatttgt 4020 gtgtccctgc tgatgggcga acagtttctg gtgtcctggt gttaataagc ggccgc 4076 <210> 60 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of single-chain humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 130 135 140 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 61 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr 225 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 62 Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 63 Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 64 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 65 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 67 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N, synthetic sequence <400> 67 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427 <210> 68 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 69 <211> 1418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4), synthetic sequence <400> 69 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418 <210> 70 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 71 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N, further introduced with Fc region of human IgG <400> 71 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 245 250 255 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 260 265 270 Met Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 275 280 285 Glu Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Glu Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 305 310 315 320 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 325 330 335 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 340 345 350 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 355 360 365 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 370 375 380 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 385 390 395 400 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 405 410 415 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 420 425 430 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 435 440 445 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 450 455 460 Asp Lys Thr His Thr 465 <210> 72 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N, further introduced with Fc region of human IgG <400> 72 acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60 agtcggcagc ccagcacctg aactcctggg aggtccgtca gtcttcctct tccccccaaa 120 acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 180 gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 240 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct 300 caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 360 agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 420 acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac 480 ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 540 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 600 ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 660 cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 720 taaaggtggc ggagggtctg gaggaggcgg tagcggcgga ggaggttccg ggggcggtgg 780 aagcggaggc ggtggatccg aggtgcaact agtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc 840 cggggagtct ctgaagattt cctgtaaggg ttctggatac agctttatga actactggct 900 gggatgggtg cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggggaca tctaccccgg 960 cggagactac cctacataca gcgagaagtt caaggtccag gtcaccatct cagccgacaa 1020 gtccatcagc accgcctacc tgcagttgag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta 1080 ttactgtgcg agatcaggca attacgacga agtggcctac tggggccaag gaaccctggt 1140 caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa 1200 gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 1260 ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 1320 cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt 1380 gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 1440 gaaagttgag ccgaagagct gtgataagac gcatacgtaa taagcggccg c 1491 <210> 73 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 73 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 74 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of albumin binding domain <400> 74 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 75 <211> 628 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ala Glu Ala Pro His Leu Val His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp 1 5 10 15 Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro 20 25 30 His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn 35 40 45 Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg 50 55 60 Thr His Trp Leu Leu Glu Leu Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg 65 70 75 80 Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu 85 90 95 Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser 100 105 110 Gly His Phe Thr Asp Phe Glu Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys 115 120 125 Asp Leu Val Ser Ser Leu Ala Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu 130 135 140 Ala His Val Ser Lys Trp Asn Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His 145 150 155 160 His Asp Phe Asp Asn Val Ser Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr 165 170 175 Tyr Asp Ala Cys Ser Glu Gly Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg 180 185 190 Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu 195 200 205 Ser Trp Gly Leu Leu Arg His Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr 210 215 220 Gly Glu Ala Gly Val Arg Leu Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly 225 230 235 240 Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln 245 250 255 Gln Ile Arg Gln Leu Phe Pro Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn 260 265 270 Asp Glu Ala Asp Pro Leu Val Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg 275 280 285 Ala Asp Val Thr Tyr Ala Ala Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His 290 295 300 Gln Asn Leu Leu Leu Ala Asn Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu 305 310 315 320 Leu Ser Asn Asp Asn Ala Phe Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala 325 330 335 Gln Arg Thr Leu Thr Ala Arg Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro 340 345 350 His Val Gln Leu Leu Arg Lys Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu 355 360 365 Ala Leu Leu Asp Glu Glu Gln Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly 370 375 380 Thr Val Leu Asp Ser Asn His Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His 385 390 395 400 Arg Pro Gln Gly Pro Ala Asp Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr 405 410 415 Ala Ser Asp Asp Thr Arg Ala His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr 420 425 430 Leu Arg Leu Arg Gly Val Pro Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr 435 440 445 Arg Tyr Leu Asp Asn Gly Leu Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg 450 455 460 Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg 465 470 475 480 Ala Ala Glu Asp Pro Val Ala Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly 485 490 495 Gly Arg Leu Thr Leu Arg Pro Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu 500 505 510 Val His Val Cys Ala Arg Pro Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg 515 520 525 Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser 530 535 540 Asp Glu His Val Gly Ser Lys Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe 545 550 555 560 Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr 565 570 575 Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser 580 585 590 Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser 595 600 605 Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser 610 615 620 Pro Gly Asn Pro 625 <210> 76 <211> 626 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ala Pro His Leu Val His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu 1 5 10 15 Arg Arg Phe Trp Arg Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser 20 25 30 Gln Ala Asp Gln Tyr Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala 35 40 45 Tyr Val Gly Ala Val Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His 50 55 60 Trp Leu Leu Glu Leu Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu 65 70 75 80 Ser Tyr Asn Phe Thr His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu 85 90 95 Asn Gln Leu Leu Pro Gly Phe Glu Leu Met Gly Ser Ala Ser Gly His 100 105 110 Phe Thr Asp Phe Glu Asp Lys Gln Gln Val Phe Glu Trp Lys Asp Leu 115 120 125 Val Ser Ser Leu Ala Arg Arg Tyr Ile Gly Arg Tyr Gly Leu Ala His 130 135 140 Val Ser Lys Trp Asn Phe Glu Thr Trp Asn Glu Pro Asp His His Asp 145 150 155 160 Phe Asp Asn Val Ser Met Thr Met Gln Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Asp 165 170 175 Ala Cys Ser Glu Gly Leu Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Arg Leu Gly 180 185 190 Gly Pro Gly Asp Ser Phe His Thr Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ser Trp 195 200 205 Gly Leu Leu Arg His Cys His Asp Gly Thr Asn Phe Phe Thr Gly Glu 210 215 220 Ala Gly Val Arg Leu Asp Tyr Ile Ser Leu His Arg Lys Gly Ala Arg 225 230 235 240 Ser Ser Ile Ser Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile 245 250 255 Arg Gln Leu Phe Pro Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu 260 265 270 Ala Asp Pro Leu Val Gly Trp Ser Leu Pro Gln Pro Trp Arg Ala Asp 275 280 285 Val Thr Tyr Ala Ala Met Val Val Lys Val Ile Ala Gln His Gln Asn 290 295 300 Leu Leu Leu Ala Asn Thr Thr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu Leu Ser 305 310 315 320 Asn Asp Asn Ala Phe Leu Ser Tyr His Pro His Pro Phe Ala Gln Arg 325 330 335 Thr Leu Thr Ala Arg Phe Gln Val Asn Asn Thr Arg Pro Pro His Val 340 345 350 Gln Leu Leu Arg Lys Pro Val Leu Thr Ala Met Gly Leu Leu Ala Leu 355 360 365 Leu Asp Glu Glu Gln Leu Trp Ala Glu Val Ser Gln Ala Gly Thr Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asn His Thr Val Gly Val Leu Ala Ser Ala His Arg Pro 385 390 395 400 Gln Gly Pro Ala Asp Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser 405 410 415 Asp Asp Thr Arg Ala His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg 420 425 430 Leu Arg Gly Val Pro Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr 435 440 445 Leu Asp Asn Gly Leu Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly 450 455 460 Arg Pro Val Phe Pro Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala 465 470 475 480 Glu Asp Pro Val Ala Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg 485 490 495 Leu Thr Leu Arg Pro Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His 500 505 510 Val Cys Ala Arg Pro Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg 515 520 525 Ala Leu Pro Leu Thr Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu 530 535 540 His Val Gly Ser Lys Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln 545 550 555 560 Asp Gly Lys Ala Tyr Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn 565 570 575 Leu Phe Val Phe Ser Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg 580 585 590 Val Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro 595 600 605 Val Pro Tyr Leu Glu Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly 610 615 620 Asn Pro 625 <210> 77 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asp Pro Pro Ala Pro Leu Pro Leu Val Ile Trp His Gly Met Gly Asp 1 5 10 15 Ser Cys Cys Asn Pro Leu Ser Met Gly Ala Ile Lys Lys Met Val Glu 20 25 30 Lys Lys Ile Pro Gly Ile Tyr Val Leu Ser Leu Glu Ile Gly Lys Thr 35 40 45 Leu Met Glu Asp Val Glu Asn Ser Phe Phe Leu Asn Val Asn Ser Gln 50 55 60 Val Thr Thr Val Cys Gln Ala Leu Ala Lys Asp Pro Lys Leu Gln Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Asn Ala Met Gly Phe Ser Gln Gly Gly Gln Phe Leu Arg Ala 85 90 95 Val Ala Gln Arg Cys Pro Ser Pro Pro Met Ile Asn Leu Ile Ser Val 100 105 110 Gly Gly Gln His Gln Gly Val Phe Gly Leu Pro Arg Cys Pro Gly Glu 115 120 125 Ser Ser His Ile Cys Asp Phe Ile Arg Lys Thr Leu Asn Ala Gly Ala 130 135 140 Tyr Ser Lys Val Val Gln Glu Arg Leu Val Gln Ala Glu Tyr Trp His 145 150 155 160 Asp Pro Ile Lys Glu Asp Val Tyr Arg Asn His Ser Ile Phe Leu Ala 165 170 175 Asp Ile Asn Gln Glu Arg Gly Ile Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Asn Leu 180 185 190 Met Ala Leu Lys Lys Phe Val Met Val Lys Phe Leu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Val Asp Pro Val Asp Ser Glu Trp Phe Gly Phe Tyr Arg Ser Gly Gln 210 215 220 Ala Lys Glu Thr Ile Pro Leu Gln Glu Thr Ser Leu Tyr Thr Gln Asp 225 230 235 240 Arg Leu Gly Leu Lys Glu Met Asp Asn Ala Gly Gln Leu Val Phe Leu 245 250 255 Ala Thr Glu Gly Asp His Leu Gln Leu Ser Glu Glu Trp Phe Tyr Ala 260 265 270 His Ile Ile Pro Phe Leu Gly 275 <210> 78 <211> 583 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu 20 25 30 Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly 35 40 45 Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala 50 55 60 Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala 65 70 75 80 Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met 85 90 95 Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly 100 105 110 Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp 115 120 125 Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser 130 135 140 Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp 145 150 155 160 Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala 165 170 175 Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg 180 185 190 Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu 195 200 205 Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe 210 215 220 Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His 225 230 235 240 Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu 245 250 255 Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn 260 265 270 His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly 275 280 285 Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu 290 295 300 Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe 305 310 315 320 Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met 325 330 335 Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp 340 345 350 Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu 355 360 365 Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His 370 375 380 Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr 385 390 395 400 Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu 405 410 415 Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val 420 425 430 Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly 435 440 445 Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val 450 455 460 Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile 465 470 475 480 Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr 485 490 495 Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr 500 505 510 Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr 515 520 525 His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu 530 535 540 Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu 545 550 555 560 Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu 565 570 575 Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 580 <210> 79 <211> 489 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn Leu Asp 20 25 30 Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val Pro Val 35 40 45 Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg Leu Pro 50 55 60 Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro Ser Ser Arg Gly 65 70 75 80 Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val Leu Ala Ala Arg 85 90 95 Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val Gly Pro 100 105 110 Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His Arg Phe Leu Gly 115 120 125 Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn Leu Thr Cys Phe 130 135 140 Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln Gly Leu Val Pro 145 150 155 160 Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln Pro Pro Trp Leu 165 170 175 Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His Asp Leu Met Ala 180 185 190 Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Tyr Ala Ser His 195 200 205 His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe Ala Glu Arg Ser 210 215 220 Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu Asp Ala Ala Val 225 230 235 240 Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Thr 245 250 255 Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr Met Arg Met Ser 260 265 270 Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Gly Thr Thr Tyr 275 280 285 Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp Pro Gly His Ile 290 295 300 Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu Leu Pro 305 310 315 320 Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn Val Thr Leu Asp 325 330 335 Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Ser Pro Arg 340 345 350 Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu Val Arg Gly Val 355 360 365 Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe Phe Thr Gln Gly 370 375 380 Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala Ser Ser 385 390 395 400 Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Asp 405 410 415 Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala Gly Ala Thr Pro 420 425 430 Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala Gln Leu 435 440 445 Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala Arg Gly Glu Asp 450 455 460 Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr Pro Arg Pro Ala 465 470 475 480 Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala 485 <210> 80 <211> 482 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Pro Arg Asn Ala Leu Leu Leu Leu Ala Asp Asp Gly Gly Phe Glu 1 5 10 15 Ser Gly Ala Tyr Asn Asn Ser Ala Ile Ala Thr Pro His Leu Asp Ala 20 25 30 Leu Ala Arg Arg Ser Leu Leu Phe Arg Asn Ala Phe Thr Ser Val Ser 35 40 45 Ser Cys Ser Pro Ser Arg Ala Ser Leu Leu Thr Gly Leu Pro Gln His 50 55 60 Gln Asn Gly Met Tyr Gly Leu His Gln Asp Val His His Phe Asn Ser 65 70 75 80 Phe Asp Lys Val Arg Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ser Gln Ala Gly Val 85 90 95 Arg Thr Gly Ile Ile Gly Lys Lys His Val Gly Pro Glu Thr Val Tyr 100 105 110 Pro Phe Asp Phe Ala Tyr Thr Glu Glu Asn Gly Ser Val Leu Gln Val 115 120 125 Gly Arg Asn Ile Thr Arg Ile Lys Leu Leu Val Arg Lys Phe Leu Gln 130 135 140 Thr Gln Asp Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Val Ala Phe His Asp Pro 145 150 155 160 His Arg Cys Gly His Ser Gln Pro Gln Tyr Gly Thr Phe Cys Glu Lys 165 170 175 Phe Gly Asn Gly Glu Ser Gly Met Gly Arg Ile Pro Asp Trp Thr Pro 180 185 190 Gln Ala Tyr Asp Pro Leu Asp Val Leu Val Pro Tyr Phe Val Pro Asn 195 200 205 Thr Pro Ala Ala Arg Ala Asp Leu Ala Ala Gln Tyr Thr Thr Val Gly 210 215 220 Arg Met Asp Gln Gly Val Gly Leu Val Leu Gln Glu Leu Arg Asp Ala 225 230 235 240 Gly Val Leu Asn Asp Thr Leu Val Ile Phe Thr Ser Asp Asn Gly Ile 245 250 255 Pro Phe Pro Ser Gly Arg Thr Asn Leu Tyr Trp Pro Gly Thr Ala 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hIDUA, IgG4 HC-IDUA <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 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the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hIDUA, IgG4 HC-GS20-IDUA <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 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protein of single-chain humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hIDUA <400> 99 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln 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humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hPPT-1, IgG4 HC-GS10-PPT1 <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr 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acid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hPPT-1, Fab HC-GS3-PPT1 <400> 104 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 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108 <211> 1078 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hASM, IgG4 HC-GS10-ASM <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 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1125 <210> 110 <211> 824 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hASM, Fab HC-GS3-ASM <400> 110 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 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Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hARSA, Fab HC-GS5-ARSA <400> 120 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser 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chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hSGSH, IgG4 HC-GS20-SGSH <400> 127 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu 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Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hNAGLU, IgG4 HC-NAGLU <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 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fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hNAGLU, Fab HC-GS5-NAGLU <400> 147 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 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hGUSB, IgG4 HC-GS10-GUSB <400> 152 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 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IgG4 HC-GS5-GALC <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 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<211> 884 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hGALC, Fab HC-GS3-GALC <400> 162 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 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the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hGALC, Fab HC-GS10-GALC <400> 164 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 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Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hAC, Fab HC-GS10-AC <400> 172 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser 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IgG4 HC-FUCA1 <400> 174 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys 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chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hFUCA1, Fab HC-GS20-FUCA1 <400> 181 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly 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LAMANid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) and hLAMAN, IgG4 HC-GS10-LAMAN <400> 184 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 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Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Glu Thr 245 250 255 Cys Pro Thr Val Gln Pro Asn Met Leu Asn Val His Leu Leu Pro His 260 265 270 Thr His Asp Asp Val Gly Trp Leu Lys Thr Val Asp Gln Tyr Phe Tyr 275 280 285 Gly Ile Lys Asn Asp Ile Gln His Ala Gly Val Gln Tyr Ile Leu Asp 290 295 300 Ser Val Ile Ser Ala Leu Leu Ala Asp Pro Thr Arg Arg Phe Ile Tyr 305 310 315 320 Val Glu Ile Ala Phe Phe Ser Arg Trp Trp His Gln Gln Thr Asn Ala 325 330 335 Thr Gln Glu Val Val Arg Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Leu Glu Phe 340 345 350 Ala Asn Gly Gly Trp Val Met Asn Asp Glu Ala Ala Thr His Tyr Gly 355 360 365 Ala Ile Val Asp Gln Met Thr Leu Gly Leu Arg Phe Leu Glu Asp Thr 370 375 380 Phe Gly Asn Asp Gly Arg Pro Arg Val Ala Trp His Ile Asp Pro Phe 385 390 395 400 Gly His Ser Arg Glu Gln Ala Ser Leu Phe Ala Gln Met Gly Phe Asp 405 410 415 Gly Phe Phe Phe Gly Arg Leu Asp Tyr Gln Asp Lys Trp Val Arg Met 420 425 430 Gln Lys Leu Glu Met Glu Gln Val Trp Arg Ala Ser Thr Ser Leu Lys 435 440 445 Pro Pro Thr Ala Asp Leu Phe Thr Gly Val Leu Pro Asn Gly Tyr Asn 450 455 460 Pro Pro Arg Asn Leu Cys Trp Asp Val Leu Cys Val Asp Gln Pro Leu 465 470 475 480 Val Glu Asp Pro Arg Ser Pro Glu Tyr Asn Ala Lys Glu Leu Val Asp 485 490 495 Tyr Phe Leu Asn Val Ala Thr Ala Gln Gly Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn 500 505 510 His Thr Val Met Thr Met Gly Ser Asp Phe Gln Tyr Glu Asn Ala Asn 515 520 525 Met Trp Phe Lys Asn Leu Asp Lys Leu Ile Arg Leu Val Asn Ala Gln 530 535 540 Gln Ala Lys Gly Ser Ser Val His Val Leu Tyr Ser Thr Pro Ala Cys 545 550 555 560 Tyr Leu Trp Glu Leu Asn Lys Ala Asn Leu Thr Trp Ser Val Lys His 565 570 575 Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala Asp Gly Pro His Gln Phe Trp Thr Gly 580 585 590 Tyr Phe Ser Ser Arg Pro Ala Leu Lys Arg Tyr Glu Arg Leu Ser Tyr 595 600 605 Asn Phe Leu Gln Val Cys Asn Gln Leu Glu Ala Leu Val Gly Leu Ala 610 615 620 Ala Asn Val Gly Pro Tyr Gly Ser Gly Asp Ser Ala Pro Leu Asn Glu 625 630 635 640 Ala Met Ala Val Leu Gln His His Asp Ala Val Ser Gly Thr Ser Arg 645 650 655 Gln His Val Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Gln Leu Ala Ala Gly Trp Gly 660 665 670 Pro Cys Glu Val Leu Leu Ser Asn Ala Leu Ala Arg Leu Arg Gly Phe 675 680 685 Lys Asp His Phe Thr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Ile Ser Ile Cys Pro 690 695 700 Leu Ser Gln Thr Ala Ala Arg Phe Gln Val Ile Val Tyr Asn Pro Leu 705 710 715 720 Gly Arg Lys Val Asn Trp Met Val Arg Leu Pro Val Ser Glu Gly Val 725 730 735 Phe Val Val Lys Asp Pro Asn Gly Arg Thr Val Pro Ser Asp Val Val 740 745 750 Ile Phe Pro Ser Ser Asp Ser Gln Ala His Pro Pro Glu Leu Leu Phe 755 760 765 Ser Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly Phe Ser Thr Tyr Ser Val Ala Gln 770 775 780 Val Pro Arg Trp Lys Pro Gln Ala Arg Ala Pro Gln Pro Ile Pro Arg 785 790 795 800 Arg Ser Trp Ser Pro Ala Leu Thr Ile Glu Asn Glu His Ile Arg Ala 805 810 815 Thr Phe Asp Pro Asp Thr Gly Leu Leu Met Glu Ile Met Asn Met Asn 820 825 830 Gln Gln Leu Leu Leu Pro Val Arg Gln Thr Phe Phe Trp Tyr Asn Ala 835 840 845 Ser Ile Gly Asp Asn Glu Ser Asp Gln Ala Ser Gly Ala Tyr Ile Phe 850 855 860 Arg Pro Asn Gln Gln Lys Pro Leu Pro Val Ser Arg Trp Ala Gln Ile 865 870 875 880 His Leu Val Lys Thr Pro Leu Val Gln Glu Val His Gln Asn Phe Ser 885 890 895 Ala Trp Cys Ser Gln Val Val Arg Leu Tyr Pro Gly Gln Arg His Leu 900 905 910 Glu Leu Glu Trp Ser Val Gly Pro Ile Pro Val Gly Asp Thr Trp Gly 915 920 925 Lys Glu Val Ile Ser Arg Phe Asp Thr Pro Leu Glu Thr Lys Gly Arg 930 935 940 Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Gly Arg Glu Ile Leu Glu Arg Arg Arg Asp 945 950 955 960 Tyr Arg Pro Thr Trp Lys Leu Asn Gln Thr Glu Pro Val Ala Gly Asn 965 970 975 Tyr Tyr Pro Val Asn Thr Arg Ile Tyr Ile Thr Asp Gly Asn Met Gln 980 985 990 Leu Thr Val Leu Thr Asp Arg Ser Gln Gly Gly Ser Ser Leu Arg Asp 995 1000 1005 Gly Ser Leu Glu Leu Met Val His Arg Arg Leu Leu Lys Asp Asp 1010 1015 1020 Gly Arg Gly Val Ser Glu Pro Leu Met Glu Asn Gly Ser Gly Ala 1025 1030 1035 Trp Val Arg Gly Arg His Leu Val Leu Leu Asp Thr Ala Gln Ala 1040 1045 1050 Ala Ala Ala Gly His Arg Leu Leu Ala Glu Gln Glu Val Leu Ala 1055 1060 1065 Pro Gln Val Val Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Leu 1070 1075 1080 Gly Ala Pro Pro Arg Thr Gln Phe Ser Gly Leu Arg Arg Asp Leu 1085 1090 1095 Pro Pro Ser Val His Leu Leu Thr Leu Ala Ser Trp Gly Pro Glu 1100 1105 1110 Met Val Leu Leu Arg Leu Glu His Gln Phe Ala Val Gly Glu Asp 1115 1120 1125 Ser Gly Arg Asn Leu Ser Ala Pro Val Thr Leu Asn Leu Arg Asp 1130 1135 1140 Leu Phe Ser Thr Phe Thr Ile Thr Arg Leu Gln Glu Thr Thr Leu 1145 1150 1155 Val Ala Asn Gln Leu Arg Glu Ala Ala Ser Arg Leu Lys Trp Thr 1160 1165 1170 Thr Asn Thr Gly Pro Thr Pro His Gln Thr Pro Tyr Gln Leu Asp 1175 1180 1185 Pro Ala Asn Ile Thr Leu Glu Pro Met Glu Ile Arg Thr Phe Leu 1190 1195 1200 Ala Ser Val Gln Trp Lys Glu Val Asp Gly 1205 1210 <210> 188 <211> 1238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino LAMANid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hLAMAN, Fab HC-GS10-LAMAN <400> 188 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Glu Thr Cys Pro Thr Val Gln Pro Asn 275 280 285 Met Leu Asn Val His Leu Leu Pro His Thr His Asp Asp Val Gly Trp 290 295 300 Leu Lys Thr Val Asp Gln Tyr Phe Tyr Gly Ile Lys Asn Asp Ile Gln 305 310 315 320 His Ala Gly Val Gln Tyr Ile Leu Asp Ser Val Ile Ser Ala Leu Leu 325 330 335 Ala Asp Pro Thr Arg Arg Phe Ile Tyr Val Glu Ile Ala Phe Phe Ser 340 345 350 Arg Trp Trp His Gln Gln Thr Asn Ala Thr Gln Glu Val Val Arg Asp 355 360 365 Leu Val Arg Gln Gly Arg Leu Glu Phe Ala Asn Gly Gly Trp Val Met 370 375 380 Asn Asp Glu Ala Ala Thr His Tyr Gly Ala Ile Val Asp Gln Met Thr 385 390 395 400 Leu Gly Leu Arg Phe Leu Glu Asp Thr Phe Gly Asn Asp Gly Arg Pro 405 410 415 Arg Val Ala Trp His Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu Gln Ala 420 425 430 Ser Leu Phe Ala Gln Met Gly Phe Asp Gly Phe Phe Phe Gly Arg Leu 435 440 445 Asp Tyr Gln Asp Lys Trp Val Arg Met Gln Lys Leu Glu Met Glu Gln 450 455 460 Val Trp Arg Ala Ser Thr Ser Leu Lys Pro Pro Thr Ala Asp Leu Phe 465 470 475 480 Thr Gly Val Leu Pro Asn Gly Tyr Asn Pro Pro Arg Asn Leu Cys Trp 485 490 495 Asp Val Leu Cys Val Asp Gln Pro Leu Val Glu Asp Pro Arg Ser Pro 500 505 510 Glu Tyr Asn Ala Lys Glu Leu Val Asp Tyr Phe Leu Asn Val Ala Thr 515 520 525 Ala Gln Gly Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn His Thr Val Met Thr Met Gly 530 535 540 Ser Asp Phe Gln Tyr Glu Asn Ala Asn Met Trp Phe Lys Asn Leu Asp 545 550 555 560 Lys Leu Ile Arg Leu Val Asn Ala Gln Gln Ala Lys Gly Ser Ser Val 565 570 575 His Val Leu Tyr Ser Thr Pro Ala Cys Tyr Leu Trp Glu Leu Asn Lys 580 585 590 Ala Asn Leu Thr Trp Ser Val Lys His Asp Asp Phe Phe Pro Tyr Ala 595 600 605 Asp Gly Pro His Gln Phe Trp Thr Gly Tyr Phe Ser Ser Arg Pro Ala 610 615 620 Leu Lys Arg Tyr Glu Arg Leu Ser Tyr Asn Phe Leu Gln Val Cys Asn 625 630 635 640 Gln Leu Glu Ala Leu Val Gly Leu Ala Ala Asn Val Gly Pro Tyr Gly 645 650 655 Ser Gly Asp Ser Ala Pro Leu Asn Glu Ala Met Ala Val Leu Gln His 660 665 670 His Asp Ala Val Ser Gly Thr Ser Arg Gln His Val Ala Asn Asp Tyr 675 680 685 Ala Arg Gln Leu Ala Ala Gly Trp Gly Pro Cys Glu Val Leu Leu Ser 690 695 700 Asn Ala Leu Ala Arg Leu Arg Gly Phe Lys Asp His Phe Thr Phe Cys 705 710 715 720 Gln Gln Leu Asn Ile Ser Ile Cys Pro Leu Ser Gln Thr Ala Ala Arg 725 730 735 Phe Gln Val Ile Val Tyr Asn Pro Leu Gly Arg Lys Val Asn Trp Met 740 745 750 Val Arg Leu Pro Val Ser Glu Gly Val Phe Val Val Lys Asp Pro Asn 755 760 765 Gly Arg Thr Val Pro Ser Asp Val Val Ile Phe Pro Ser Ser Asp Ser 770 775 780 Gln Ala His Pro Pro Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ser Leu Pro Ala Leu 785 790 795 800 Gly Phe Ser Thr Tyr Ser Val Ala Gln Val Pro Arg Trp Lys Pro Gln 805 810 815 Ala Arg Ala Pro Gln Pro Ile Pro Arg Arg Ser Trp Ser Pro Ala Leu 820 825 830 Thr Ile Glu Asn Glu His Ile Arg Ala Thr Phe Asp Pro Asp Thr Gly 835 840 845 Leu Leu Met Glu Ile Met Asn Met Asn Gln Gln Leu Leu Leu Pro Val 850 855 860 Arg Gln Thr Phe Phe Trp Tyr Asn Ala Ser Ile Gly Asp Asn Glu Ser 865 870 875 880 Asp Gln Ala Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Asn Gln Gln Lys Pro 885 890 895 Leu Pro Val Ser Arg Trp Ala Gln Ile His Leu Val Lys Thr Pro Leu 900 905 910 Val Gln Glu Val His Gln Asn Phe Ser Ala Trp Cys Ser Gln Val Val 915 920 925 Arg Leu Tyr Pro Gly Gln Arg His Leu Glu Leu Glu Trp Ser Val Gly 930 935 940 Pro Ile Pro Val Gly Asp Thr Trp Gly Lys Glu Val Ile Ser Arg Phe 945 950 955 960 Asp Thr Pro Leu Glu Thr Lys Gly Arg Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Gly 965 970 975 Arg Glu Ile Leu Glu Arg Arg Arg Asp Tyr Arg Pro Thr Trp Lys Leu 980 985 990 Asn Gln Thr Glu Pro Val Ala Gly Asn Tyr Tyr Pro Val Asn Thr Arg 995 1000 1005 Ile Tyr Ile Thr Asp Gly Asn Met Gln Leu Thr Val Leu Thr Asp 1010 1015 1020 Arg Ser Gln Gly Gly Ser Ser Leu Arg Asp Gly Ser Leu Glu Leu 1025 1030 1035 Met Val His Arg Arg Leu Leu Lys Asp Asp Gly Arg Gly Val Ser 1040 1045 1050 Glu Pro Leu Met Glu Asn Gly Ser Gly Ala Trp Val Arg Gly Arg 1055 1060 1065 His Leu Val Leu Leu Asp Thr Ala Gln Ala Ala Ala Ala Gly His 1070 1075 1080 Arg Leu Leu Ala Glu Gln Glu Val Leu Ala Pro Gln Val Val Leu 1085 1090 1095 Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Leu Gly Ala Pro Pro Arg 1100 1105 1110 Thr Gln Phe Ser Gly Leu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Ser Val His 1115 1120 1125 Leu Leu Thr Leu Ala Ser Trp Gly Pro Glu Met Val Leu Leu Arg 1130 1135 1140 Leu Glu His Gln Phe Ala Val Gly Glu Asp Ser Gly Arg Asn Leu 1145 1150 1155 Ser Ala Pro Val Thr Leu Asn Leu Arg Asp Leu Phe Ser Thr Phe 1160 1165 1170 Thr Ile Thr Arg Leu Gln Glu Thr Thr Leu Val Ala Asn Gln Leu 1175 1180 1185 Arg Glu Ala Ala Ser Arg Leu Lys Trp Thr Thr Asn Thr Gly Pro 1190 1195 1200 Thr Pro His Gln Thr Pro Tyr Gln Leu Asp Pro Ala Asn Ile Thr 1205 1210 1215 Leu Glu Pro Met Glu Ile Arg Thr Phe Leu Ala Ser Val Gln Trp 1220 1225 1230 Lys Glu Val Asp Gly 1235 <210> 189 <211> 1288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino LAMANid sequence of fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N and hLAMAN, Fab HC-GS20-LAMAN <400> 189 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Glu Thr Cys Pro Thr Val Gln 325 330 335 Pro Asn Met Leu Asn Val His Leu Leu Pro His Thr His Asp Asp Val 340 345 350 Gly Trp Leu Lys Thr Val Asp Gln Tyr Phe Tyr Gly Ile Lys Asn Asp 355 360 365 Ile Gln His Ala Gly Val Gln Tyr Ile Leu Asp Ser Val Ile Ser Ala 370 375 380 Leu Leu Ala Asp Pro Thr Arg Arg Phe Ile Tyr Val Glu Ile Ala Phe 385 390 395 400 Phe Ser Arg Trp Trp His Gln Gln Thr Asn Ala Thr Gln Glu Val Val 405 410 415 Arg Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Leu Glu Phe Ala Asn Gly Gly Trp 420 425 430 Val Met Asn Asp Glu Ala Ala Thr His Tyr Gly Ala Ile Val Asp Gln 435 440 445 Met Thr Leu Gly Leu Arg Phe Leu Glu Asp Thr Phe Gly Asn Asp Gly 450 455 460 Arg Pro Arg Val Ala Trp His Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu 465 470 475 480 Gln Ala Ser Leu Phe Ala Gln Met Gly Phe Asp Gly Phe Phe Phe Gly 485 490 495 Arg Leu Asp Tyr Gln Asp Lys Trp Val Arg Met Gln Lys Leu Glu Met 500 505 510 Glu Gln Val Trp Arg Ala Ser Thr Ser Leu Lys Pro Pro Thr Ala Asp 515 520 525 Leu Phe Thr Gly Val Leu Pro Asn Gly Tyr Asn Pro Pro Arg Asn Leu 530 535 540 Cys Trp Asp Val Leu Cys Val Asp Gln Pro Leu Val Glu Asp Pro Arg 545 550 555 560 Ser Pro Glu Tyr Asn Ala Lys Glu Leu Val Asp Tyr Phe Leu Asn Val 565 570 575 Ala Thr Ala Gln Gly Arg Tyr Tyr Arg Thr Asn His Thr Val Met Thr 580 585 590 Met Gly Ser Asp Phe Gln Tyr Glu Asn Ala Asn Met Trp Phe Lys Asn 595 600 605 Leu Asp Lys Leu Ile Arg Leu Val Asn Ala Gln Gln Ala Lys Gly Ser 610 615 620 Ser Val His Val Leu Tyr Ser Thr Pro Ala Cys Tyr Leu Trp Glu Leu 625 630 635 640 Asn Lys Ala Asn Leu Thr Trp Ser Val Lys His Asp Asp Phe Phe Pro 645 650 655 Tyr Ala Asp Gly Pro His Gln Phe Trp Thr Gly Tyr Phe Ser Ser Arg 660 665 670 Pro Ala Leu Lys Arg Tyr Glu Arg Leu Ser Tyr Asn Phe Leu Gln Val 675 680 685 Cys Asn Gln Leu Glu Ala Leu Val Gly Leu Ala Ala Asn Val Gly Pro 690 695 700 Tyr Gly Ser Gly Asp Ser Ala Pro Leu Asn Glu Ala Met Ala Val Leu 705 710 715 720 Gln His His Asp Ala Val Ser Gly Thr Ser Arg Gln His Val Ala Asn 725 730 735 Asp Tyr Ala Arg Gln Leu Ala Ala Gly Trp Gly Pro Cys Glu Val Leu 740 745 750 Leu Ser Asn Ala Leu Ala Arg Leu Arg Gly Phe Lys Asp His Phe Thr 755 760 765 Phe Cys Gln Gln Leu Asn Ile Ser Ile Cys Pro Leu Ser Gln Thr Ala 770 775 780 Ala Arg Phe Gln Val Ile Val Tyr Asn Pro Leu Gly Arg Lys Val Asn 785 790 795 800 Trp Met Val Arg Leu Pro Val Ser Glu Gly Val Phe Val Val Lys Asp 805 810 815 Pro Asn Gly Arg Thr Val Pro Ser Asp Val Val Ile Phe Pro Ser Ser 820 825 830 Asp Ser Gln Ala His Pro Pro Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ser Leu Pro 835 840 845 Ala Leu Gly Phe Ser Thr Tyr Ser Val Ala Gln Val Pro Arg Trp Lys 850 855 860 Pro Gln Ala Arg Ala Pro Gln Pro Ile Pro Arg Arg Ser Trp Ser Pro 865 870 875 880 Ala Leu Thr Ile Glu Asn Glu His Ile Arg Ala Thr Phe Asp Pro Asp 885 890 895 Thr Gly Leu Leu Met Glu Ile Met Asn Met Asn Gln Gln Leu Leu Leu 900 905 910 Pro Val Arg Gln Thr Phe Phe Trp Tyr Asn Ala Ser Ile Gly Asp Asn 915 920 925 Glu Ser Asp Gln Ala Ser Gly Ala Tyr Ile Phe Arg Pro Asn Gln Gln 930 935 940 Lys Pro Leu Pro Val Ser Arg Trp Ala Gln Ile His Leu Val Lys Thr 945 950 955 960 Pro Leu Val Gln Glu Val His Gln Asn Phe Ser Ala Trp Cys Ser Gln 965 970 975 Val Val Arg Leu Tyr Pro Gly Gln Arg His Leu Glu Leu Glu Trp Ser 980 985 990 Val Gly Pro Ile Pro Val Gly Asp Thr Trp Gly Lys Glu Val Ile Ser 995 1000 1005 Arg Phe Asp Thr Pro Leu Glu Thr Lys Gly Arg Phe Tyr Thr Asp 1010 1015 1020 Ser Asn Gly Arg Glu Ile Leu Glu Arg Arg Arg Asp Tyr Arg Pro 1025 1030 1035 Thr Trp Lys Leu Asn Gln Thr Glu Pro Val Ala Gly Asn Tyr Tyr 1040 1045 1050 Pro Val Asn Thr Arg Ile Tyr Ile Thr Asp Gly Asn Met Gln Leu 1055 1060 1065 Thr Val Leu Thr Asp Arg Ser Gln Gly Gly Ser Ser Leu Arg Asp 1070 1075 1080 Gly Ser Leu Glu Leu Met Val His Arg Arg Leu Leu Lys Asp Asp 1085 1090 1095 Gly Arg Gly Val Ser Glu Pro Leu Met Glu Asn Gly Ser Gly Ala 1100 1105 1110 Trp Val Arg Gly Arg His Leu Val Leu Leu Asp Thr Ala Gln Ala 1115 1120 1125 Ala Ala Ala Gly His Arg Leu Leu Ala Glu Gln Glu Val Leu Ala 1130 1135 1140 Pro Gln Val Val Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Leu 1145 1150 1155 Gly Ala Pro Pro Arg Thr Gln Phe Ser Gly Leu Arg Arg Asp Leu 1160 1165 1170 Pro Pro Ser Val His Leu Leu Thr Leu Ala Ser Trp Gly Pro Glu 1175 1180 1185 Met Val Leu Leu Arg Leu Glu His Gln Phe Ala Val Gly Glu Asp 1190 1195 1200 Ser Gly Arg Asn Leu Ser Ala Pro Val Thr Leu Asn Leu Arg Asp 1205 1210 1215 Leu Phe Ser Thr Phe Thr Ile Thr Arg Leu Gln Glu Thr Thr Leu 1220 1225 1230 Val Ala Asn Gln Leu Arg Glu Ala Ala Ser Arg Leu Lys Trp Thr 1235 1240 1245 Thr Asn Thr Gly Pro Thr Pro His Gln Thr Pro Tyr Gln Leu Asp 1250 1255 1260 Pro Ala Asn Ile Thr Leu Glu Pro Met Glu Ile Arg Thr Phe Leu 1265 1270 1275 Ala Ser Val Gln Trp Lys Glu Val Asp Gly 1280 1285

Claims (11)

  1. 항인간 트랜스페린 수용체 항체와 인간 헤파란 N-설파타제의 융합 단백질로서, 해당 항체의 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1이 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    (c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지며,
    해당 항체의 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser을 포함하여 이루어지고, 또한
    (c) CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중쇄의 프레임워크 영역 3이 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    해당 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가 Fab 항체, F(ab')2 항체, 또는 F(ab') 항체인, 융합 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    해당 항체가 Fab 항체이며,
    (1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    (2) 해당 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 해당 인간 헤파란 N-설파타제와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 128의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
    융합 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서,
    해당 항체가 Fab 항체이며,
    (1) 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    (2) 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 해당 중쇄가, 그 C말단측에서, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열을 개재시켜, 해당 인간 헤파란 N-설파타제와 결합하고 있는 것이고, 해당 인간 헤파란 N-설파타제가 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    융합 단백질.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는, DNA 단편.
  8. 제 7 항의 DNA 단편을 짜넣어 이루어지는, 발현 벡터.
  9. 제 8 항의 발현 벡터로 형질 전환된 포유동물 세포주.
  10. 제 5 항 또는 제 6 항의 융합 단백질을 포함하는, 산필리포 증후군에 수반하는 중추 신경계의 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  11. 제 5 항 또는 제 6 항의 융합 단백질의 제조 방법으로서,
    상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 포유동물 세포를 배양함으로써, 해당 포유동물 세포에 상기 융합 단백질을 배양 배지에 분비시키는 스텝을 포함하는, 제조 방법.
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