CN114058603B

CN114058603B - 一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法

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Publication number: CN114058603B
Application number: CN202111420060.5A
Authority: CN
Inventors: 施婧妮; 雷宵; 徐灿; 宫安; 王梁
Original assignee: Wuhan New Biocalysis Solution Co ltd
Current assignee: Wuhan New Biocalysis Solution Co ltd
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN114058603A

Abstract

本发明公开了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，包含以下组分：0.2％～0.3％(w/v)蔗糖，0.1％～0.4％(w/v)海藻糖，0.2％～0.5％(w/v)D‑甘露醇，0.1％～0.4％(w/v)甘氨酸，0.02％～0.05％(v/v)吐温20，5mM～10mM Mg²⁺。本发明通过配方筛选和优化，所得到的鞘磷脂酶冻干粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性。

Description

一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法

技术领域

本发明一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

鞘磷脂(Sphingomyslin,SM)存在于大多数哺乳动物细胞的质膜内，是细胞膜上的一类磷脂，是构成脂筏的重要组成部分。鞘磷脂酶(Sphingomyelinase,SPC)是鞘磷脂代谢途径中一类十分重要的水解酶，鞘磷脂在其水解作用下产生神经酰胺，所以鞘磷脂酶也被认为是控制神经酰胺合成的关键酶之一。

小而密低密度脂蛋白(small dense Low-Density Lipoprotein,sdLDL)是低密度脂蛋白(Low-Density Lipoprotein,LDL)中颗粒较小密度较大的亚组分，具有较强的致动脉粥样硬化作用，同时也是导致冠心病的重要危险因素。目前临床上检测sdLDL运用最广泛的方法是利用酶法生化诊断试剂，鞘磷脂酶是该类诊断试剂的核心原料，对鞘磷脂酶的制备方法和长期储存稳定性的研究具有重要意义。

酶制剂在保存时会受到环境因素的影响，温度或高或温差过大都会使酶制剂产生失活的现象。目前常用的酶制剂保存方法通常包括：1、低温保存，低温保存能够保持酶的性能在一定时期内相对稳定，但若要进行半年以上长时间的保存需要置于-70℃并经过专业的密封程序；2、结晶保存，结晶保存的酶可在长时间内保持稳定性，但结晶过程需要严格控制含水量，否则易带来微生物污染等问题；3、加入保护剂冻干保存，保护剂能够使酶的稳定性更加优越，但冻干保护剂的选择也直接影响了冻干酶制剂的储存稳定性。由于冻干过程是一个复杂的相变过程，鞘磷脂酶作为一种蛋白质，在冷冻干燥过程中极易受到冻干过程的低温效应、冻结效应和脱水效应的影响，最终导致其酶活性的降低甚至失活。因此为了减少鞘磷脂酶活性在冻干过程中的损伤，筛选合适的冻干保护剂尤为重要。

申请人检索的背景文献情况如下：

公开号为CN109837270A的专利文献中公开了一种使鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法，该专利提供了一种能够提高鞘磷脂酶在液体中稳定性的配方，其制备鞘磷脂酶采用的储存方法是液体试剂，而非冻干粉末。阿拉丁CAS号为9031-54-3的鞘磷脂酶为液体制剂为保存于50％甘油/0.25M磷酸盐缓冲液中的液体制剂。与之类似的，sigma货号为9031-54-3的鞘磷脂酶浓度约100units/mg，且同样需要在50％甘油-250mM磷酸盐缓冲液的保护下，于2～8℃保存。

除此之外，现有技术中暂未搜索到鞘磷脂酶关于冷冻干燥制备的相关文献及方法。冻干粉有着便于产品运输、储存时占地面积小等液体酶制剂不具备的优点，因此随着鞘磷脂酶的需求量日益增大，研究开发出一种配方简单、成本低廉、稳定有效的鞘磷脂酶冻干保护剂配方尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种鞘磷脂酶的冻干保护剂及制备方法，通过配方筛选和优化，所得到的鞘磷脂酶冻干粉具有酶活力高、热稳定性好、储存时间长、外观良好的特性。

本发明提供了鞘磷脂酶的冻干保护剂，包含按质量计的如下组分：蔗糖2～3份，海藻糖1～4份，D-甘露糖2～5份，甘氨酸1～4份，吐温20 0.2～0.5份和适量提供Mg²⁺的镁盐。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂包含以下组分蔗糖2～3g/L，海藻糖1～4g/L，D-甘露醇2～5g/L，甘氨酸1～4g/L，吐温20 0.02％～0.05％(v/v)，Mg²⁺5mM～10mM。

在一种实施方式中，所述Mg²⁺以盐的形式加入，包括但不限于氯化镁、硝酸镁、硫酸镁中的一种或几种复配。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂还含有酸碱调节剂。

在一种实施方式中，所述酸碱调节剂的浓度为10～100mM，缓冲能力在pH 6.0～8.0之间，所述酸碱调节剂包括但不限于柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。所述缓冲液用以维持鞘磷脂酶在其最适pH条件从而保证最大催化活性。

本发明还提供了所述冻干保护剂在制备鞘磷脂酶冻干粉中的应用。

本发明还提供了所述冻干保护剂在延长鞘磷脂酶冻干粉储存稳定期方面的应用。

在一种实施方式中，所述鞘磷脂酶冻干粉按如下方法制备：

(1)配制鞘磷脂酶和冻干保护剂的混合物，使溶液体系中鞘磷脂酶浓度为1～40mg/mL；

(2)将步骤(1)配制的混合物冻干。

本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的混合物中鞘磷脂酶浓度为20mg/mL，酸碱调节剂为20mM HEPES缓冲液，冻干保护剂由以下组分组成：0.2％(w/v)蔗糖，0.2％(w/v)海藻糖，0.4％(w/v)D-甘露醇，0.2％(w/v)甘氨酸，0.03％(v/v)吐温20，5mM Mg²⁺。

在一种实施方式中，所述步骤(1)的混合物中鞘磷脂酶浓度为40mg/mL，酸碱调节剂为40mM Tris-HCl缓冲液，冻干保护剂由以下组分组成：0.3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)海藻糖，0.5％(w/v)D-甘露醇，0.3％(w/v)甘氨酸，0.05％(v/v)吐温20，10mM Mg²⁺。

在一种实施方式中，所述步骤(2)的冻干采用真空冷冻干燥。

在一种实施方式中，所述鞘磷脂酶是来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的依赖Mg²⁺的中性鞘磷脂酶。

在一种实施方式中，所述鞘磷脂酶是利用基因工程手段表达获得或者是从野生菌中分离提取获得的。

在一种实施方式中，所述外源表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统或酵母表达系统。

在一种实施方式中，所述鞘磷脂酶是通过粗分离、柱层析等方式获得。

在一种实施方式中，粗分离包括但不限于盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法；所述柱层析包括但不限于分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。

本发明还提供应用所述方法制备的鞘磷脂酶冻干粉。

有益效果：

1、本发明的鞘磷脂酶冻干保护剂具有良好的冻干保护效果，使鞘磷脂酶经过冻干处理后的存活率维持在90％甚至95％以上，减少了冻干过程中的酶活损失。

2、本发明的冻干保护剂有助于提高鞘磷脂酶的储藏稳定性，获得的鞘磷脂酶冻干粉在42℃加速孵育14天残余活力能够维持在90％以上；在-20℃冰箱存放1年，其酶活性维持在90％以上，具有良好的稳定性，便于储存运输以及酶的下游应用。

3、应用本发明的冻干保护剂制备的鞘磷脂酶冻干粉，外观良好，呈无定形白色粉末，无冒泡，皱缩等现象，冻干粉具有良好的溶解性，粉末以水复溶时间不超过10秒，蛋白比活力≥360U/mg_固体粉末。

附图说明

图1不同保护剂配方对鞘磷脂酶冻干过程及热稳定性的影响。

图2不同保护剂配方对鞘磷脂酶冻干过程及热加速孵育过程中蛋白纯度的影响。

具体实施方式

(一)技术术语：

鞘磷脂酶：本发明所提及的“鞘磷脂酶(Sphingomyelinase,SPC)”是指如酶命名法所定义的EC 3.1.4.12类中的酶。出于本发明的目的，根据具体实施方式中提及的方法确定鞘磷脂酶活性。在本发明的上下文中，所述鞘磷脂酶是来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的依赖Mg²⁺的中性鞘磷脂酶。鞘磷脂酶是利用基因工程手段在动物细胞或微生物细胞中表达获得的，或是从野生型微生物的细胞培养液中分离提取获得的。采用基因工程手段表达鞘磷脂酶的外源表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统或酵母表达系统。

细胞培养液：本发明所提及的细胞培养液是指由动物细胞或微生物在培养基中生长所产生的、未经回收或经过回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述细胞培养液可以含有细胞、目的产物、细胞破碎后释放的内容物及细胞碎片。例如，微生物细胞培养液包含被微生物利用后的培养基成分以及可通过离心去除微生物细胞后存在的细胞碎片。

冻干保护剂：本发明所提及的冻干保护剂是指在鞘磷脂酶的冷冻干燥和储藏过程中，有助于维持鞘磷脂酶在其最适pH条件从而保证最大催化活性制剂或组分。保护剂形式可以为固体或液体。保护剂的组分可选自：蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温和提供Mg²⁺的镁盐；镁盐

酸碱调节剂：本发明所提及的酸碱调节剂是指能被用来控制常温常压下或低温高压下，气体或液体逸度的固体或液态组合通常为强酸弱碱或弱酸强碱盐类，可在反应或保存中逐渐释放出盐中的酸或碱以保持稳定的酸碱值。在本发明上下文中，酸碱调节剂用以维持鞘磷脂酶在其最适pH条件下发挥最大催化活性。

纯化：本发明所提及的纯化是指从含目标组分的样品中去除杂质或污染物，以获得具有更高的绝对或相对浓度的目标组分。

热稳定性：是指酶在一定温度下保持一段时间后，仍能够保持一定活性的能力。本申请的实施例中提及的热稳定性是指酶在42℃、50％湿度孵育14天后的残余活力。

残余活力(％)：残余酶活性的百分比，也即，将酶经过一定条件下的处理，再于37℃下测得的处理后的酶活力与处理前的酶活力的比值。在本发明上下文中，冻干后的残余活力是指鞘磷脂酶经过真空冷冻干燥处理后的酶活与真空冷冻干燥处理前的酶活的百分比；升温孵育一段时间后的残余活力是指孵育结束时的鞘磷脂酶的酶活与真空冷冻干燥处理前的酶活的百分比。

鞘磷脂酶酶活力检测方法

鞘磷脂酶活力检测原理：鞘磷脂经鞘磷脂酶作用，水解生成磷酸胆碱和神经酰胺，偏碱条件下，磷酸胆碱进一步被碱性磷酸酶(ALP酶)水解产生胆碱，而胆碱在胆碱氧化酶(COD酶)的氧化作用下，最终生成甜菜碱，同时生成副产物H₂O₂。H₂O₂通过Trinder反应即在4-氨基安替比林(4-AAP)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)和过氧化物酶(POD)存在下，生成红色醌亚胺化合物，其颜色的深浅与H₂O₂含量成正比，在555nm处测定终产物醌亚胺的吸光度，通过计算出H₂O₂生成量，从而得出鞘磷脂酶的活力。

酶活定义：单位酶活定义为在37℃每分钟催化生成1μmol H₂O₂所需的酶量。

操作步骤：首先配制0.9ml反应混合液，体系中包括50mM Tris-HCl，pH 8.0；2mMMgCl₂；1mM鞘磷脂；2mM 4-AAP；2mM TOOS；10mM NaCl；0.1％Triton X–100(W/V)、5U POD酶，将反应混合物在37℃预热5min后，加入10U ALP酶、10U COD酶及50μL待测酶液,混匀，37℃反应，并用分光光度计在555nm下，记录1min内的吸光度变化记为ΔAs。同时以酶稀释液作为空白对照，酶稀释液：10mM pH 8.0Tris-HCl，含0.1％TritonX–100和10mM NaCl，替换待测酶液，其余操作同上，记录空白对照的吸光度变化记为ΔAb，将ΔAs－ΔAb记为ΔOD。通过下列公式计算鞘磷脂酶的活力：

Weight activity(U/mg)＝Volume activity×1/C

其中Vt表示反应液总体积(1.05mL)；Vs表示酶液体积(0.05mL)；1/2表示1摩尔过氧化氢生成1/2摩尔醌亚胺染料；df表示稀释倍数；C表示酶液浓度(mg/mL)；39.2表示标准反应条件下，生色基团在555nm处毫摩尔吸光系数(cm²/μmol)。酶液的浓度检测采用Bicinchoninic Acid(BCA)法进行检测。

实施例1鞘磷脂酶的分离和纯化

以利用外源表达系统制备的鞘磷脂酶发酵液为原料，所述外源表达系统包括但不限于大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统或酵母表达系统。

以大肠杆菌表达系统为例介绍鞘磷脂酶的破碎提取方式。可选地，为了便于下游纯化的进行，可在目的蛋白的N端或C端添加His-tag，或在两端均添加His-tag。

将发酵完成的大肠杆菌发酵液通过离心的方式收集含目的蛋白的微生物细胞组分，将获得的微生物细胞通过机械法如高压匀浆破碎法或物理方法如超声波破碎法等两种方式进行细胞破碎，使目的蛋白从菌体中释放出来，通过离心或过滤除去破碎的菌体碎片，获得活力为450U/mL的鞘磷脂酶粗酶液。可选地，在细胞破碎前用缓冲液或生理盐水洗涤细胞1～3次。

粗酶液可通过以下方式进行纯化处理：

1、采用盐析法进行粗分离：

利用硫酸铵分级沉淀蛋白质。首先配制饱和硫酸铵溶液(通常饱和度为33％～60％)，边搅拌边慢慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液至粗酶液中，将溶液置于4℃，磁力搅拌器搅拌6小时或搅拌过夜，使蛋白质充分沉淀；将蛋白质溶液于12000g 4℃离心20min，弃上清保留沉淀，沉淀用20mM pH7.5 HEPES充分溶解后，进行透析步骤，透析液为20mM pH7.5HEPES，以彻底除去硫酸铵。

2、采用柱层析进行纯化：将步骤1粗分离后的酶液进行亲和层析处理：

采用金属离子螯合亲和层析，所述金属离子包含但不限定于Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺等能够提供电子供体配位点的过渡态金属离子；其中亲和层析的填料包含但不限定于IDA、NTA、TED等类型。

以Ni²⁺亲和层析为例介绍鞘磷脂酶的分离纯化过程，选择Ni-NTA层析柱，具体方法为：将步骤1获得的粗酶液以40mg/ml填料的上样量上样至Ni-NTA 6FF，样品溶液和Ni-NTA6FF柱层析的缓冲体系均为20mM HEPES pH7.5，通过提高咪唑浓度的方式进行线性洗脱(0～0.5M咪唑)，根据活性检测结果，收集不同浓度咪唑的洗脱组分，最终以20mM咪唑除去杂蛋白，收集200mM咪唑洗脱组分，并对洗脱液进行透析步骤，透析液为20mM pH7.5 HEPES，以除去洗脱液中的咪唑，最终得到纯度大于90％、比活力为385U/mg的纯酶液。

实施例2冻干粉的制备方法

将用于制备冻干粉的酶液、或酶液与保护剂的混合溶液倒入干净无菌的玻底直径14cm的玻璃平皿中，保证液面高度不超过1cm，以保证最好的升华效果(液面过高、液体体积过多会影响升华效率)，后置于冷冻干燥机的板层上冻干。

冻干机程序设置如下；

a.预冻阶段：设置板层温度为-45℃，时长2.5h；退火温度-25℃，时长2h；随后再降温至-45℃，时长3h；回温速率为1℃/min；

b.一次升华：设置真空值在20pa以下，由步骤a的-45℃升至-18℃，时长22h；第二阶段板层温度升至-15℃，时长12h；第三阶段板层温度升至-12℃，时长3h；第四阶段板层温度升至-10℃，时长3h；回温速率为0.5℃/min；

c.解析干燥：设置真空值在10pa以下，第一阶段板层温度升至15℃，时长1h；第二阶段板层温度升至30℃，时长1h；回温速率为1℃/min；

d.冻干程序结束，最终获得白色粉末酶粉，-20℃保存。

实施例3

配制保护剂配方：蔗糖2～3g/L，海藻糖1～4g/L，D-甘露醇2～5g/L，甘氨酸1～4g/L，吐温20 0.2mL/L～0.5mL/L，Mg²⁺5mM～10Mm；其中，Mg²⁺以盐的形式加入，镁盐选自：氯化镁、硝酸镁、硫酸镁中的一种或几种的复配。

将上述保护剂配方中的各组分加入至含酸碱调节剂的溶液体系中。所述酸碱调节剂的浓度可控制在10～100mM，使保护剂的缓冲能力处于pH 6.0～8.0之间；其中，酸碱调节剂选自：柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。通过添加所述缓冲液可维持鞘磷脂酶处于其最适pH，从而使混合体系中的鞘磷脂酶保持最大催化活性。

向上述配制好的冻干保护剂溶液与鞘磷脂酶的酶液混合，使混合后的体系中鞘磷脂酶蛋白浓度达1～40mg/L。

实施例4

保护剂配方：蔗糖2g/L，海藻糖2g/L，D-甘露醇4g/L，甘氨酸2g/L，吐温20 0.03％(v/v)，Mg²⁺5mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁，固体混合物以20mM pH 7.5HEPES缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、HEPES缓冲液浓度为20mM，保护剂的物料浓度与配方一致。

将所制备的冻干酶液进行分装，按照实施例2的步骤冷冻干燥制得鞘磷脂酶冻干粉1

实施例5

保护剂配方：蔗糖3g/L，海藻糖3g/L，D-甘露醇5g/L，甘氨酸3g/L，吐温20 0.05％(v/v)，Mg²⁺10mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁，固体混合物以40mM pH 7.5Tris-HCl缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为40mg/mL、Tris-HCl缓冲液浓度为40mM，其余物料浓度与配方一致。

将所制备的冻干酶液进行分装，按照实施例2的步骤冷冻干燥制得鞘磷脂酶冻干粉2

实施例6

保护剂配方：蔗糖3g/L，海藻糖2g/L，D-甘露醇2g/L，甘氨酸1g/L，吐温20 0.02％(v/v)，Mg²⁺5mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁，固体混合物以20mM pH 7.5HEPES缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、HEPES缓冲液浓度为20mM，其余物料浓度与配方一致。

将所制备的冻干酶液进行分装，按照实施例2的步骤冷冻干燥制得鞘磷脂酶冻干粉3

实施例7

保护剂配方：蔗糖2g/L，海藻糖3g/L，D-甘露醇4g/L，甘氨酸2g/L，吐温20 0.02％(v/v)，Mg²⁺10mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁，固体混合物以20mM pH 7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浓度为20mM，其余物料浓度与配方一致。

将所制备的冻干酶液进行分装，按照实施例2的步骤冷冻干燥制得鞘磷脂酶冻干粉4

实施例8

保护剂配方：蔗糖3g/L，海藻糖1g/L，D-甘露醇3g/L，甘氨酸4g/L，吐温20 0.05％(v/v)，Mg²⁺10mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁，固体混合物以50mM pH 7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为40mg/mL、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液浓度为50mM，其余物料浓度与配方一致。

将所制备的冻干酶液进行分装，按照实施例2的步骤冷冻干燥制得鞘磷脂酶冻干粉5。

实施例9

保护剂配方：蔗糖2g/L，海藻糖1g/L，D-甘露醇2g/L，甘氨酸1g/L，吐温20 0.02％(v/v)，Mg²⁺5mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁或硝酸镁，固体混合物以20mM pH 7.5HEPES缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、HEPES缓冲液浓度为20mM，其余物料浓度与配方一致。

实施例10

保护剂配方：蔗糖3g/L，海藻糖4g/L，D-甘露醇5g/L，甘氨酸4g/L，吐温20 0.05％(v/v)，Mg²⁺10mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、无水氯化镁或硫酸镁等镁盐，固体混合物以20mM pH 7.5HEPES缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、HEPES缓冲液浓度为20mM，其余物料浓度与配方一致。

实施例11

保护剂配方：蔗糖2.5g/L，海藻糖2.5g/L，D-甘露醇3.5g/L，甘氨酸2.5g/L，吐温200.035％(v/v)，Mg²⁺7.5mM。

按配方比例分别称量蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘氨酸、吐温20、硫酸镁或硝酸镁等镁盐，固体混合物以20mM pH 7.5 HEPES缓冲液充分溶解，并调节混合液pH至7.5，0.22um滤膜过滤；随后将配方混合液与待冻干的酶液充分混匀，使得冻干酶液中蛋白浓度为20mg/mL、HEPES缓冲液浓度为20mM，其余物料浓度与配方一致。

实施例12

对应用实施例4～8的保护剂配方所制备的鞘磷脂酶冻干粉1～5进行酶活性和热稳定性的分析，分别测定酶液冻干前、冻干后酶粉和酶粉热加速孵育后的活性变化，结果如下：

(1)测定制备的鞘磷脂酶冻干粉1～5活性，对比鞘磷脂酶冻干前后的蛋白活性损失率，再将制备的冻干粉1～5分别放置于42℃、相对湿度50％的恒温恒湿箱中热加速孵育14天，14天后测定其蛋白比活力，

结果如图1所示：未添加任何保护剂的鞘磷脂酶经过冻干过程或活性损失23.2％，制得的冻干粉于42℃孵育14天后蛋白活性仅剩65.3％；实施例4～8制备的酶粉，冻干后蛋白活力均为冻干前活力的90％以上，分别为97.5％、97.3％、95.0％、94.0％、93.7％，冻干粉42℃孵育14天后残余活力分别为96.4％、96.2％、93.6％、93.6％、92.3％；优选地，实例例4与实施例5冻干后及热稳定性残余活力都在95％以上。由此，本发明实施例中提供的冻干保护剂能够有效减小鞘磷脂酶在冻干过程活性的损失，活性损失不超过10％，所制备的鞘磷脂酶冻干粉在42℃孵育14天能够维持活力稳定，且复溶后无絮状沉淀。

(2)对鞘磷脂酶冻干粉进行SDS-PAGE电泳，检测鞘磷脂酶在冻干过程和热加速孵育过程中的蛋白纯度变化，结果如图2所示：实施例4～8制备的冻干粉1～5蛋白纯度与冻干前样品无明显变化，热加速孵育后酶粉的蛋白纯度与冻干前及孵育前样品蛋白纯度一致，说明了实施例4～8提供的保护剂配方能够有效保护鞘磷脂酶，防止其在冻干和储存过程中发生降解，蛋白质的结构保持稳定性。

3.鞘磷脂酶冻干粉长期储存稳定性测试

将实施例4～11制备得到的鞘磷脂酶冻干粉及对照组酶粉分别置于-20℃冰箱中储存，放置360天，每隔60天定期取样测定其蛋白活力，冻干粉1～5及对照组的结果如表1所示：

表1鞘磷脂酶在-20℃储存360天蛋白活力(U/mg)的变化

实施例	0天	60天	120天	180天	240天	300天	360天
								空白对照	295.5	280.3	265.5	250.4	240.6	220.0	208.5
冻干粉1	375.3	374.5	372.7	370.5	368.2	367.4	365.5
								冻干粉2	374.5	372.1	370.8	368.5	367.2	365.2	364.6
冻干粉3	365.6	362.5	360.2	358.5	356.1	356.0	355.6
								冻干粉4	362.0	360.5	358.7	356.3	355.2	354.0	353.5
冻干粉5	360.8	358.5	356.9	354.6	353.1	352.4	350.8

与表1的结果类似，实施例6～8制备的冻干酶粉在-20天储存360天后的活力保持在350U/mg以上，且复溶后的酶液澄清、无絮状沉淀。不添加保护剂的空白对照冻干后的酶活性明显低于冻干粉1～5，在-20℃储存360天活性降低至70％，且空白对照酶粉用纯水复溶后有大量絮状沉淀物。

以上结果表明，实施例4～11提供的保护剂配方能够有效保护鞘磷脂酶的稳定性，并提高酶在-20℃的储存稳定性。

对比例1：

具体实施方式同实施例5，区别在于，省略使用吐温20，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、373.2U/mg，42℃孵育14天后的酶活为360.5U/mg，酶粉以纯水复溶后有大量絮状沉淀物。

对比例2：

具体实施方式同实施例5，区别在于，将吐温20替换为聚乙二醇6000，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、372.5U/mg，42℃孵育14天后的酶活为361.3U/mg，酶粉以纯水复溶后有大量絮状沉淀物。

对比例3：

具体实施方式同实施例5，区别在于，省略使用蔗糖和海藻糖，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、350.5U/mg，42℃孵育14天后的酶活为320.0U/mg，酶粉复溶状态澄清。

对比例4：

具体实施方式同实施例5，区别在于，省略使用D-甘露醇，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、370.5U/mg，42℃孵育14天后的酶活为360.0U/mg，酶粉复溶状态澄清。

对比例5：

具体实施方式同实施例5，区别在于，省略使用甘氨酸，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、373U/mg，42℃孵育14天后的酶活为365U/mg，酶粉复溶状态澄清。

对比例6：

具体实施方式同实施例5，区别在于，省略使用Mg²⁺，按照实施例2的方法制备冻干酶粉，结果显示，冻干前后的酶活分别为385.0U/mg、368.3U/mg，42℃孵育14天后的酶活为360.5U/mg，酶粉复溶状态澄清。

实施例5、对比例1和对比例2的结果显示，吐温20有助于提高鞘磷脂酶的热稳定性和储存稳定性，并能改善酶粉复溶后出现絮状沉淀的现象。实施例9～11的结果显示，不同化合物来源的Mg²⁺(例如实施例9来源于无水氯化镁或硝酸镁，实施例10来源于无水氯化镁或硫酸镁，实施例11来源于硫酸镁或硝酸镁)均能达到提高鞘磷脂酶热稳定性及稳定性的作用，可见，促进酶液稳定性的作用与Mg²⁺及其浓度相关，与具体使用的化合物来源基本无关。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.鞘磷脂酶的冻干保护剂，其特征在于，包含以下组分：

蔗糖2~3 g/L，海藻糖1~4 g/L， D-甘露醇2~5 g/L，甘氨酸1~4 g/L，吐温20 0.02%~0.05%（v/v）， Mg²⁺ 5mM~10mM。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述Mg²⁺由镁盐提供；所述镁盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁中的一种或几种复配。

3.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其特征在于，还含有酸碱调节剂；所述酸碱调节剂包括柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲剂、Tris-盐酸缓冲剂、PIPES缓冲剂、HEPES缓冲剂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲剂或磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲剂。

4.根据权利要求3所述的冻干保护剂，其特征在于，所述酸碱调节剂的浓度为10~100mM，缓冲能力在pH 6.0~8.0之间。

5.权利要求1~4任一所述的冻干保护剂在制备鞘磷脂酶冻干粉和/或延长鞘磷脂酶制剂储存稳定期中的应用，其特征在于，所述鞘磷脂酶是来源于金黄色葡萄球菌的依赖 Mg²⁺的中性鞘磷脂酶。

6.一种制备鞘磷脂酶冻干粉的方法，其特征在于，所述鞘磷脂酶是来源于金黄色葡萄球菌的依赖 Mg²⁺的中性鞘磷脂酶；所述方法包括如下步骤：

（1）配制鞘磷脂酶和冻干保护剂的混合体系，使混合体系中鞘磷脂酶浓度为1~40mg/mL，冻干保护剂中各组分在混合体系中的浓度为：蔗糖2~3 g/L，海藻糖1~4 g/L， D-甘露醇2~5 g/L，甘氨酸1~4 g/L，吐温20 0.2~0.5 mL/L， Mg²⁺ 5mM~10mM；

（2）将步骤（1）配制的混合物冻干。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的鞘磷脂酶是经过了粗分离和/或柱层析后的酶液。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的冻干采用真空冷冻干燥。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述鞘磷脂酶是利用基因工程手段表达获得或者是从野生菌中分离提取获得的。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述鞘磷脂酶是利用基因工程手段表达获得或者是从野生菌中分离提取获得的。

11.应用权利要求6~10任一所述方法制备的鞘磷脂酶冻干粉。