BR112013012213A2

BR112013012213A2 - moléculas de ligação a antígeno mul tlespecíficas tendo função alternativa à função dos fatores viii, ix e x de coagulação sanguínea, e anticorpo bies- 5 pecífico, seus usos na prevenção ou tratamento de hemorragia, ácido nucleico, vetor, célula, método para produzir as referidas moléculas de ligação, composição farmacêutica e kit

Info

Publication number: BR112013012213A2
Application number: BR112013012213-7A
Authority: BR
Inventors: Tomoyuki Igawa; Tsukasa Suzuki; Zenjiro Sampei; Kazutaka Yoshihashi; Tetsuhiro Soeda; Atsushi Muto; Takehisa Kitazawa; Tetsuo Kojima; Yukiko NISHIDA; Chifumi Imai
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2020-09-01
Also published as: PT2644698T; LTPA2018507I1; US10450381B2; PL2644698T3; US20220267470A1; MX355060B; CA2817964A1; TW201414836A; EP2644698B1; JP5246906B1; TWI452135B; JP2022191374A; HRP20180421T1; MX2013005394A; US20160222129A1; JP2021065233A; KR101398363B1; KR20190033644A; US9334331B2; RS57038B1

Abstract

  MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO MULTlESPECÍFICAS TENDO FUNÇÃO ALTERNATIVA À FUNÇÃO DOS FATORES VIII, IX E X DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA, E ANTICORPO BIESPECÍFICO, SEUS USOS NA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE HEMORRAGIA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA, MÉTODO PARA PRODUZIR AS REFERIDAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT. A presente invenção refere-se a vários anticorpos biespecíficos que se ligam especificamente a fator IX de coagulação sanguínea/fator IX de coagulação sanguínea e substituem funcionalmente a função do cofator do fator VIII de coagulação sanguínea, ou seja, a função para promoter a ativação do fator X de coagulação sanguínea pelo fator IX de coagulação sanguínea. A partir desses anticorpos, foram descobertas com sucesso moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas tendo alta atividade de substituir funcionalmente o fator VIII de coagulação sanguínea.

Description

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO MULTl ESPECÍFICAS TENDO FUNÇÃO AL- TERNATIVA À FUNÇÃO DOS FATORES VIII, IX E X DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA, E ANTICORPO BIESPECÍFICO, SEUS USOS NA PREVEN- 5 ÇÃO OU TRATAMENTO DE HEMORRAGIA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA, MÉTODO PARA PRODUZIR AS REFERIDAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT". Campo Técnico A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno 1O multiespecíficas que substituem funcionalmente o fator VIII de coagulação sanguínea, um cofator que intensifica reações enzimáticas, e composições farmacêuticas que compreendem tal molécula como ingrediente ativo.

Antecedentes da Invenção Hemofilia A em uma anormalidade hemorragia causada por de- 15 créscimo ou deficiência hereditária da função do fator VIII (FVIII) de coagula- ção sanguínea.

Pacientes que sofrem de hemofilia A são geralmente admi- nistrados com uma formulação de F,VIII para hemorragia (administração em demanda). Nos anos recentes, as formulações F.VIII são também adminis- tradas profilaticamente para prevenir eventos hemorrágicos (administração 20 preventiva; Documentos de não Patentede não Patente 1 e 2). A meia-vida das formulações de F.VIII no sangue é de cerca de 12 a 16 horas.

Portanto, para prevenção contínua, são administradas aos pacientes três vezes na semana (Documentos de não Patentede não Patente 3 e 4). Nas administra- ções em demanda, as formulações F.VIII são também administradas adicio- 25 nalmente quando necessário em intervalos regulares para prevenir outra hemorragia.

Além disso, a administração das formulações F.VIII é feita intra- venosamente.

Portanto, há uma grande necessidade por agentes farmacêu- ticos com uma carga menor que as formulações F.VIII.

Ocasionalmente, anticorpos anti-F.VIII (inibidores) são desenvol- 30 vidos em pacientes com hemofilia.

Tais inibidores cancelam os efeitos das formulações das formulações F.VIII.

Para hemorragia em pacientes que têm inibidores desenvolvidos (pacientes com inibidores), formulações de desvio

Segue-se folha 1 a/88

1a/88 são administradas.

Seus mecanismos de ação não são dependentes da fun- ção F.VIII, ou seja, a função de catalisar a ativação do fator X(F.X) de coagu- lação sanguínea por fator IX (F.IXa) de coagulação sanguínea ativado.

Por- tanto, em alguns casos, as formulações de desvio não podem interromper

Segue-se folha 2/88 suficientemente a hemorragia.

Por conseguinte, há uma necessidade grande por agentes farmacêuticas que não são afetados pela presença de inibidores e os quais podem substituir funcionalmente o F.VIII.

Recentemente, como um meio para resolver o problema, os an- 5 ticorpos que substituem funcionalmente o F.VIII e seu uso foram descritos (Documentos de Patente 1, 2, e 3). Os anticorpos podem ser eficazes para hemofilia adquirida a qual os anticorpos anti-F.Vlll estão presentes e para a doença de von Willebrand causada por uma anormalidade ou deficiência da função do fator von Willebrand (vWF), mas a atividade de substituir fundo- 10 nalmente o F.VIII não era sempre suficiente.

Portanto, como agentes farma- cêuticos que exibem um efeito hemostático alto, os anticorpos com uma ati- vidade maior de substituir funcionalmente o F.VIII que os anticorpos mencio- nados acima eram desejados.

Anterioridades 15 Documento de Patente Documento de Patente 1 WO 20051035754 Documento de Patente 2 WO 20051035756 Documento de Patente 3 WO 20061109592 Documento de não Patente 20 Documento de não Patente 1 Blood 58, 1-13 (1981) Documento de não Patente 2 Nature 312, 330-337 (1984) Documento de não Patente 3 Nature 312, 337-342 (1984) Documento de não Patente 4 Biochim.Biophys.Acta 871, 268- 278 (1986 25 Sumário da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção Um objetivo da presente invenção é proporcionar moléculas de ligação a antígeno multiespecificas que substituem funcionalmente o F.VIII, um cofator que intensifica as reações enzimáticas. 30 Meios para Resolver os Problemas Como resultado da pesquisa efetuada, os presentes inventores foram bem sucedidos em descobrir anticorpos biespecíficos tendo melhor yI Id atividade promotora de geração de F.Xa que os anticorpos conhecidos den- tre vários anticorpos biespecíficos que se ligam especificam a F.IXIF.IXa e F.X, e substituem a função de cofator de F.VIII, ou seja, a função que pro- move a ativação de F.X por F.IXa (função promotora da geração de F.Xa). 5 Além disso, os presentes inventores descobriram as posições nas sequências de aminoácidos de anticorpos biespecíficos tendo a ativida- de de substituir funcionalmente o F.VIIi, os quais são importantes em aper- feiçoar a atividade de promover a geração de F.Xa desses anticorpos, e, assim, eles conseguiram obter anticorpos biespecíficos nos quais a atividade 10 de substituir funcionalmente o F.VIII é ainda aumentada por substituição desses aminoácidos. Eles também conseguiram obter anticorpos biespecífi- cos que não somente têm alta atividade em substituir funcionalmente o - F.VIII, mas têm também uma baixa ação inibitória de F.Xase. Satisfazer am- bas as propriedades é muito difícil. 15 Especificamente, a presente invenção se refere a moléculas de ligação a antígeno multiespecífrcas que substituem funcionalmente o F.VIII, um cofator que intensifica reações enzimáticas, e as composições farmacêu- ticas que compreendem tal molécula como ingrediente ativo, e se refere es- pecificarnente aos seguintes: 20 [1] uma molécula de ligação a antigeno multiespecífica que substitui funcionalmente o fator VIII de coagulação sanguínea, que compre- ende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea e/ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator X de coagula- 25 ção sanguínea, em que a substituição funcional para o fator VIII de coagula- ção sanguínea resulta da atividade promotora da geração do fator X (X.a) de coagulação sanguínea ativado maior que a atividade de um anticorpo bies- pecifico (hA69-KQlhB26-PF/Hal-AQ) que compreende uma cadeia H que contém SEQ ID Nos: 165 e uma cadeia L compartilhada que compreende a 30 SEQ ID NO: 167.

[2] a molécula de ligação a antigeno multiespecífica de [1], que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende um primeiro sítio de ligação a antigeno que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea elou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, e um terceiro polipeptídeo que compreende um terceiro sítio de ligação a peptídeo que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea elou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, 5 bem como um segundo polipeptídeo que compreende um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator X de coagulação sanguínea e um quarto polipeptídeo que compreende um quarto sítio de ligação a antígeno que reconhece um fator X de coagulação sanguínea;

[3] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [2], em 10 que o primeiro e o terceiro polipeptídeo compreendem, cada um, um sítio de ligação a antígeno de uma cadeia H ou cadeia L de um anticorpo contra o fator IX de coagulação sanguínea ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, respectivamente; e o segundo e o quarto polipeptídeo compreende, cada um, um sítio de ligação a antigeno de uma cadeia H ou cadeia L de um 15 anticorpo contra fator X de coagulação sanguínea, respectivamente;

[4] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [3], em que o sítio de ligação a antígeno do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H que consis- tem em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das 20 seguintes (a1) a (a11), ou um sítio de ligação a antígeno equivalente a estas, e o sítio de ligação a antígeno do segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (b1) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente 25 às mesmas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 75, 76, e 77 (CDRs da cadeia H de Qí), respectivamente; (a2) um sítio de ligação a antigeno compreendendo uma CDR 1, 30 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 (CDRs da cadeia H de Q31), respectivamente; (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1,

2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 81, 82, e 83 (CDRs da cadeia H de Q64), respectivamente; (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 84, 85, e 86 5 (CDRs da cadeia H de Q85), respectivamente; (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 87, 88, e 89 (CDRs da cadeia H de 0153), respectivamente; (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 10 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 90, 91, e 92 (CDRs da cadeia H de Q354), respectivamente; (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 93, 94, e 95 (CDRs da cadeia H de Q360), respectivamente; 15 (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: (CDRs da ca- deia H de Q405), respectivamente; (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 99, 100, e 20 101 (CDRs da cadeia H de Q458), respectivamente; (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 102, 103, e 104 (CDRs da cadeia H de Q460), respectivamente; (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 25 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 105, 106, e 107 (CDRs da cadeia H de Q499), respectivamente; (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 108, 109, e 110 (CDRs da cadeia H de J232), respectivamente; 30 (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 111, 112, e 113 (CDRs da cadeia H de J259), respectivamente;

.:: (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 114, 115, e 116 (CDRs da cadeia H de J268), respectivamente; (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 5 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 117, 118, e 119 (CDRs da cadeia H de J300), respectivamente; (b5) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 120, 121, e 122 (CDRs da cadeia H de J321), respectivamente; 10 (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 123, 124, e 125 (CDRs da cadeia H de J326), respectivamente; - (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 126, 127, e 15 128 (CDRs da cadeia H de J327), respectivamente; (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 129, 130, e 131 (CDRs da cadeia H de J339), respectivamente; (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 20 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 32, 133, e 134 (CDRs da cadeia H de J344), respectivamente; (b10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 135, 136, e 137 (CDRs da cadeia H de J346), respectivamente; e 25 (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 174, 175, e 176 (CDRs da cadeia H de J142), respectivamente;

[5] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [3], em que o sítio de ligação a antígeno do primeiro polipeptídeo compreende um 30 sítio de ligação a antígeno, que compreende uma região variável da cadeia H que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos das se- guintes (a1) a (all), ou um sitio de ligação a antígeno funcionalmente equi-

rií i:3 valente às mesmas, e o sítio de ligação a antígeno do segundo polipeptídeo compreende uma região variável da cadeia H que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes )bl) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: 5 (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 35 (Região variável da cadeia H de 01); (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 36 (Região variável da 10 cadeia H de Q31); (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 37 (Região variável da cadeia H de Q1); (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 15 variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 38 (Região variável da cadeia H de Q85); (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 39 (Região variável da cadeia H de Q153); 20 (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 40 (Região variável da cadeia H de Q354); (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 41 (Região variável da 25 cadeia H de Q360); (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 42 (Região variável da cadeia H de Q405); (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 30 variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 43 (Região variável da cadeia H de Q458); (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região

::

variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 44 (Região variável da cadeia H de Q460); (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 45 (Região variável da 5 cadeia H de Q499); (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 46 (Região variável da cadeia H de J232); (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 10 variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 47 (Região variável da cadeia H de J259); (b3) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 48 (Região variável da cadeia H de J268); 15 (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 49 (Região variável da cadeia H de J300); (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 50 (Região variável da 20 cadeia H de J321); (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 51 (Região variável da cadeia H de J326); (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 25 variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 52 (Região variável da cadeia H de J327); (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 53 (Região variável da cadeia H de J339); 30 (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 54 (Região variável da cadeia H de J344);

• :: (b10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 55 (Região variável da cadeia H de J346); e (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 5 variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 172 (Região variável da cadeia H de J142);

[6] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de 13], em que os sítios de ligação a antígeno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compreendem um sítio de ligação a antígeno que com- 10 preende as CDRs da cadeia L que consistem em qualquer uma das sequên- cias de aminoácidos selecionadas das seguintes (cl) a (c10), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: (cl) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 138, 139, 15 e 140 (CDR da cadeia L de L2), respectivamente; (c2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 142, e 143 (CDR da cadeia L de L45), respectivamente; (c3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 20 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 145, e 146 (CDR da cadeia L de L248), respectivamente; (c4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147, 148, e 149 (CDR da cadeia L de L324), respectivamente; 25 (c5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 150, 151, e 152 (CDR da cadeia L de L334), respectivamente; (c6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 153, 154, 30 e 155 (CDR da cadeia L de L377), respectivamente; (c7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 156, 157,

1 :: e 158 (CDR da cadeia L de L404), respectivamente; (c8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 159, 160, e 161 (CDR da cadeia L de L406), respectivamente; 5 (c9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 137, 138, e 139 (CDR da cadeia L de L408), respectivamente; e (cl 0) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma CDRI, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 178, 10 e 179 (CDR da cadeia L de L180), respectivamente;

[7] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [3], em que os sítios de ligação a antígeno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compreendem um sítio de ligação a antígeno que com- preende a região variável da cadeia L que consiste em qualquer uma das 15 sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (cl) a (c10), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: (c1) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 56 (região variável da cadeia L de L2); 20 (c2) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 57 (região variável da cadeia L de L45); (c3) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 58 (região 25 variável da cadeia L de L248); (c4) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 59 (região variável da cadeia L de L324); (c5) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência 30 de aminoácidos da região variável de cadeia L of SEQ 1D NO: 60 (região va- riável da cadeia L de L334); (c6) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 61 (região variável da cadeia L de L377); (c7) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 62 (região 5 variável da cadeia L de L404); (c8) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L of SEQ ID NO: 63 (região va- riável da cadeia L de L406); (c9) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência 10 de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 64 (região variável da cadeia L de L408); e (c10) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 173 (região variável da cadeia L de L180); 15 [8] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [3], em que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem ainda uma região constante da cadeia H do anticorpo, e o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma região constante da cadeia L do anticorpo;

[9] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [3], em 20 que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem uma região cons- tante da cadeia H do anticorpo, e o terceiro e o quarto polipeptídeos com- preendem uma região constante da cadeia L do anticorpo, em que o terceiro e o quarto polipeptídeos são uma cadeia L comumente compartilhada;

[10] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [8] ou 25 [9], em que o primeiro polipeptídeo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nas seguintes (dl) a (d6) ou do grupo que consiste nos seguintes (d7) a (d9), e o segundo polipeptí- deo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consis- 30 te em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas de um grupo diferente daquele de o primeiro polipeptídeo mencionado acima: (dl) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 65 (G4k);

(d2) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 66 (z7); (d3) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 67 (z55); (d4) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 68 (z 106); 5 (d5) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 69 (z118); (d6) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 70 (z121); (d7) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 71 (G4h); 10 (d8) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 72 (z107); e (d9) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 73 (z119); [11 ] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [8] ou 15 [9], em que o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem a região cons- tante da cadeia L do anticorpo que consiste na seguinte sequência de ami- noácidos de: (e) uma região constante da cadeia L de SEQ ID NO: 74 (k);

[12] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [8] ou 20 [9], em que o primeiro polipeptideo compreende qualquer uma da cadeia H do anticorpo selecionada das seguintes (a1) a (a14), o segundo polipeptídeo compreende qualquer uma da cadeia H do anticorpo selecionada das se- guintes (b1) a (b12), e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo com- preendem qualquer uma da cadeia L do anticorpo selecionada das seguintes 25 (c1) a (c10): (a1) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k); (a2) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 2 (Q31-z7); 30 (a3) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 3 (Q64-z55); (a4) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a-

minoácidos de SEQ ID NO: 10 (Q64-z7); (a5) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k); (a6) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- 5 minoácidos de SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k); (a7) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 13 (Q354-z106); (a8) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k); 10 (a9) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 15 (Q360-z118); (a10) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k); (all) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de 15 aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (Q458-z106); (a12) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (Q460-z121); (a13) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (Q499-z118); 20 (a14) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (Q499-z121); (b1) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 4 (J268-G4h); (b2) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- 25 minoácidos de SEQ ID NO: 5 (J321-G4h); (b3) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 6 (J326-z107); (b4) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 7 (J344-z107); 30 (b5) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 21 (J232-G4h); (b6) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a-

minoácidos de SEQ ID NO: 22(J259-zí07); (b7) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 23 (J300-z107); (b8) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- 5 minoácidos de SEQ ID NO: 24 (J327-z107); (b9) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 25 (J327-z119); (b10) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (J339-z119); 10 (b11) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27(J346-z107); (b12) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170(J142-G4h); (cl) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- 15 minoácidos de SEQ ID NO: 8(L2-k); (c2) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 9(L45-k); (c3) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 28 (L248-k); 20 (c4) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 29 (L324-k); (c5) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 30 (L334-k); (c6) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- 25 minoácidos de SEQ ID NO: 31(L377-k); (c7) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 32 (L404-k); (c8) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 33 (L406-k); 30 (c9) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 34(L408-k); e (c10) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 (L180-k);

[13] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [1], em que o primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a um epítopo que se sobrepõe ao epítopo que se liga a um anticorpo 5 que consiste da cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e o a cadeia L do anticorpo de qualquer uma das (cl) a (c10) de [12], e o segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a um epítopo que se sobrepõe que se liga a um anticorpo que consiste na cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e a cadeia L do anticorpo de 10 qualquer uma de (cl) a (c10) de [12];

[14] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [8] ou

[9], em que o primeiro polipeptídeo compreende qualquer uma cadeia H do anticorpo, selecionada das seguintes (e1) a (e3), o segundo polipeptídeo compreende qualquer uma cadeia H do anticorpo selecionada dos seguintes 15 (f1) a (13), e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo compreendem qualquer uma cadeia L do anticorpo selecionada do grupo das seguintes (g 1) a (g4): (e1) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- 20 dela H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L de qualquer uma de (c1) a (c10), de [12]; (e2) uma cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo do aminoácido selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b, e 102 por numeração de Kabat em qual- 25 quer uma cadeia H do anticorpo selecionada de (e1) é substituído com outro aminoácido; (e3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 34 é a isoleucina, o resíduo de a- minoácido na posição 35 é a asparagina, glutamina, ou serina, o resíduo de 30 aminoácido na posição 49 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 61 é a arginina, o resíduo de aminoácido na posição 62 é o ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 96 é a serina ou a treonina, o resíduo de aminoácido na posição 98 é lisina ou a arginina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é fenilalanina ou tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100b é glicina, ou o resíduo de aminoácido na posição 102 é tirosina em qualquer cadeia H do anticorpo selecionada de (e1); 5 (f1) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer um de (b1) a (b12) de [12] e uma cadeia L do anticorpo de qualquer um de (cl) a (c10) de [12]; (f2) uma cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo 10 de aminoácido selecionado de os resíduos de aminoácidos nas posições 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100, e 100a por numeração de Kabat em qualquer cadeia H do anticorpo de (f1) é substituída com outro aminoácido; (f3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 35 é ácido aspártico, o resíduo de 15 aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 73 a lisina, o resíduo de aminoácido na posição 76 é glicina, o resíduo de aminoácido na posição 96 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 76 é tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é tirosina, ou o resíduo de aminoácido na posição 100a é histidina em qualquer cadeia H 20 do anticorpo selecionada de (f1); (g1) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L do anti- corpo de qualquer uma de (c1) a (c10), de [12]; 25 (g2) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e uma cadeia L do anti- corpo de qualquer uma de (cl) a (c10), de [12]; (g3) uma cadeia L do anticorpo, em que pelo menos um resíduo 30 de aminoácido é selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94, e 95 pela numeração de Kabat na cadeia L do anticorpo ou de (g1) ou de (g2) é substituída com outro aminoá-

`rill-T; cido; e (g4) uma cadeia L do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 27 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na 5 posição 31 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 32 é glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 50 é arginina ou glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 52 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 54 é lisina, o resíduo de a- minoácido na posição 55 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na po- 10 sição 92 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 93 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 94 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posi- ção 95 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posição 95 é prolina na ca- deia L do anticorpo de ou (g1) ou (g2);

[15] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de [1] a 15 [14], em que a molécula de ligação a antígeno multiespecífica é um anticor- po multiespecífico;

[16] um anticorpo biespecífico de qualquer um de (a) a (u): (a) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- 20 noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilha- da da SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que 25 o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e o terceiro polipep- tídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilhada de SEQ ID NO: 9; 30 (c) um anticorpo biespecífico (Q31-z71J326-zl071L2-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 2, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consis-

te na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L são comumente compartilhada de SEQ ID NO: 8; (d) um anticorpo biespecífico (Q64-z551J344-z1071L45-k), em 5 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o segundo peptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L da SEQ ID NO: 9; (e) um anticorpo biespecífico (Q64-z7IJ326-zl071L334-k), em 10 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na segunda de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; 15 (f) um anticorpo biespecifico (Q64-z71J344-zí07/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 20 Ihada de SEQ ID NO: 33; (g) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k1J268-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro 25 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (h) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J321-G4hIL334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 30 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30;

(i) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k1J232-G4hIL406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro 5 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (j) um anticorpo biespecífico (Q354-z1061J259-z1071L324-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 10 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 29; (k) um anticorpo biespecífico (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 15 aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (I) um anticorpo biespecífico (Q360-zl18/J300-z1071L334-k), em 20 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; 25 (m) um anticorpo biespecífico (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptideo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 30 Ihada de SEQ ID NO: 28; (n) um anticorpo biespecífico (Q458-z1061J346-z1071L408-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 34; 5 (o) um anticorpo biespecífico (Q460-z121/J327-zl19/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 10 Ihada de SEQ ID NO: 30, (p) um anticorpo biespecífico (Q499-z1181J327-z1071L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro 15 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (q) um anticorpo biespecífico (Q499-z1181J327-zl071L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ 1D NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 20 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 31; (r) um anticorpo biespecífico (Q499-zl181J346-zl071L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 25 aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 28; (s) um anticorpo biespecífico (Q499-z 121 /J 327-G4h/L404-k), em 30 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 32; (t) um anticorpo biespecífico (Q499-z1211J339-zl19/L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 31; e 10 (u) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- 15 Ihada de SEQ ID NO: 171;

[17] um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação a antí- geno multiespecífica de qualquer um de [1] a [15] ou o anticorpo biespecífico de [161;

[18] um vetor inserido com o ácido nucleico de [17]; 20 [19] uma célula que compreende o ácido nucleico de [17] ou o vetor de [18];

[20] um método para produzir a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [15] ou o anticorpo biespecífico de

[16] por cultivar a célula de [19]; 25 [21] uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [15] ou o anti- corpo específico de [16], e um veículo farmaceuticamente aceitável;

[22] a composição de [21], que é uma composição farmacêutica usada na prevenção e/ou no tratamento de hemorragia, uma hemorragia que 30 acompanha uma doença, ou uma doença causada por hemorragia;

[23] a composição de [22], em que a hemorragia, a hemorragia que acompanha uma doença, ou a doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve elou progride devido ao decréscimo ou deficiên- cia da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coa- gulação sanguínea, ativado;

[24] a composição de [23], em que a doença que se desenvolve 5 elou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é hemofilia A;

[25] a composição de [23], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator 10 VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é uma doença que mostra emergência de um inibidor contra o fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado;

[26] a composição de [23], em que a doença que se desenvolve 15 elou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é hemofilia adquirida;

[27] a composição de [23], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator 20 VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é doença de von Willebrand;

[28] método para prevenir elou tratar hemorragia, uma hemorra- gia que acompanha uma doença, ou doença causada por hemorragia, que compreende a etapa de administrar a molécula de ligação a antígeno multi- 25 específica de qualquer um de [1] a [15] ou o anticorpo específico de [16], ou a composição de qualquer um de [21] a [27]; e

[29] um kit para uso na prevenção elou no método de tratamento de [28], que compreende pelo menos a molécula de ligação a antígeno mul- tiespecífica de qualquer um de [1] a [15] ou o anticorpo específico de [16], ou 30 a composição de qualquer um de [21] a [27]. Além disso, a presente invenção se refere a:

[30] uso da molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qualquer um de [1] a [15], o anticorpo biespecífico de [16], ou a composição de qualquer um de [21] a [27] na fabricação de um agente para prevenir elou tratar hemorragia, hemorragia que acompanha uma doença, ou doença cau- sada por hemorragia, e 5 [31] a molécula de ligação a antígeno multiespecífica de qual- quer um de [1] a [15], o anticorpo específico de [16], ou a composição de qualquer um de [21] a [27] para prevenir elou tratar hemorragia, uma hemor- ragia que acompanha uma doença, ou uma doença causada por hemorragi- a; 10 A presente invenção também se refere a anticorpos biespecífi- cos que substituem funcionalmente o F.VIII, um cofator que intensifica as reações enzimáticas, e composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo como um ingrediente ativo, e, mais especificamente, se refere a:

[32] um anticorpo específico que substitui funcionalmente o fator 15 VIII de coagulação sanguínea, que compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea elou o fator IX de coagulação sanguínea e um sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator X de coagulação sanguínea, em que o anticorpo biespecífico é qual- quer um dos seguintes (a) a (u): 20 (a) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilha- 25 da da SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e o terceiro polipep- 30 tídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilhada de SEQ ID NO: 9; (c) um anticorpo biespecífico (Q31-z71J326-z1071L2-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 2, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consis- te na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L são comumente compartilhada de 5 SEQ ID NO: 8; (d) um anticorpo biespecífico (Q64-z551J344-z1071L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o segundo peptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o terceiro poli- 10 peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L da SEQ ID NO: 9; (e) um anticorpo biespecifico (Q64-z7/J326-z1071L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na segunda de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 6, e 15 o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; (f) um anticorpo biespecífico (Q64-z7IJ344-zí07/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (g) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (h) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J321-G4h/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; (i) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 33; (j) um anticorpo biespecífico (Q354-z1061J259-z1071L324-k), em 10 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de r aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 29; 15 (k) um anticorpo biespecífico (Q360-G4kIJ232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ 1D NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 20 Ihada de SEQ ID NO: 33; (I) um anticorpo biespecífico (Q360-zl 1 8/J300-zl 07/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e o terceiro 25 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; (m) um anticorpo biespecífico (Q405-G4kIJ232-G4h/L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 30 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 28;

(n) um anticorpo biespecífico (Q458-z1061J346-zí07/L408-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro 5 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 34; (o) um anticorpo biespecífico (Q460-z1211J327-zl19/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 10 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptideo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (p) um anticorpo biespecifico (Q499-zl181J327-zl071L334-k), em que o primeiro polipeptideo é uma cadeia H que consiste na sequência 15 de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (q) um anticorpo biespecífico (Q499-z1181J327-z107/L377-k), 20 em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 31; 25 (r) um anticorpo biespecífico (Q499-zl18/J346-zl071L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 30 Ihada de SEQ ID NO: 28; (s) um anticorpo biespecífico (Q499-z121/J327-G4h/L404-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 32; 5 (t) um anticorpo biespecifico (Q499-z1211J339-z1191L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 10 Ihada de SEQ ID NO: 31; e (u) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 15 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 171;

[33] um ácido nucleico que codifica o anticorpo biespecífico de

[32]; 20 [34] um vetor inserido com o ácido nucleico de [33];

[35] uma célula que compreende o ácido nucleico de [33] ou o vetor de [34];

[36] um método para produzir o anticorpo biespecífico de [32] por cultivar a célula de [35]; 25 [37] uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo biespecífico de [32], e um veículo farmaceuticamente aceitável;

[38] a composição de [37], que é uma composição farmacêutica usada na prevenção elou no tratamento de hemorragia, uma hemorragia que acompanha uma doença, ou uma doença causada por hemorragia; 30 [39] a composição de [381, em que a hemorragia, a doença que acompanha a hemorragia, ou a doença causada por hemorragia é uma do- ença que se desenvolve elou progride devido a um decréscimo ou deficiên-

cia da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou o fator VIII de coagulação sanguínea, ativado;

[40] a composição de [39], em que a doença que se desenvolve elou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator 5 VII] de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é hemofilia;

[41] a composição de [39], em que a doença que se desenvolve elou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- 10 vado, é uma doença que mostra emergência de um inibidor contra o fator VIII de coagulação sanguínea elou o fator VIII de coagulação sanguínea, ativado;

[42] a composição de [39], em que a doença que se desenvolve elou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator 15 VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- vado, é hemofilia adquirida;

[43] a composição de [39], em que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decréscimo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea elou fator VIII de coagulação sanguínea, ati- 20 vado, é a doença de von Willebrand;

[44] um método para prevenir e/ou tratar hemorragia, uma he- morragia que acompanha uma doença, ou uma doença causada por hemor- ragia, ou uma doença causada por hemorragia, que compreende a etapa de administrar o anticorpo biespecifico de [32] ou a composição de [37] a [43]; 25 [45] um kit para uso na prevenção elou método de tratamento de

[44], que compreende o anticorpo biespecífico de [32], ou a composição de qualquer um de [37] a [43];

[46] uso do anticorpo biespecífico de [32] ou a composição de qualquer um de [37] a [43] na fabricação de um agente para prevenir e/ou 30 tratar hemorragia, uma doença que acompanha uma hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia, e

[47] o anticorpo biespecífico de [32] ou a composição de qual-

quer um de [37] a [43] para prevenir elou tratar hemorragia, uma doença que acompanha uma hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia.

Efeitos da Invenção A presente invenção proporciona anticorpos que reconhecem 5 tanto uma enzima como seu substrato, que são moléculas de ligação a antí- geno multiespecíficas tem alta atividade de substituir funcionalmente o F.VIII.

Além disso, a presente invenção proporciona anticorpos que reconhecem tanto uma enzima como seu substrato, que são moléculas de ligação a antí- geno multiespecíficas com alta atividade de substituir funcionalmente F.Vlll e 10 uma baixa ação inibitória de F.Xase.

Já que se acredita que os anticorpos humanizados têm estabilidade alta no sangue e imunogenicidade, os anti- corpos multiespecíficos da presente invenção podem ser bastante promisso- res como produtos farmacêuticos.

Breve Descrição dos Desenhos 15 A Figura 1 descreve a ação inibitória de F.Xase. (a) F.Vllla forma um complexo com F.IXa (F.Xase) e ativa F.X. (b) Um anticorpo biespecífico que se liga a F.IXa e F.X e ativa F.X. (c) Ambos o F.Vllla e o anticorpo biespecífico ativa F.X sem 20 competição; (d) A ligação do anticorpo biespecífico a F.lXa elou F.X inibe a formação do complexo formado entre F.Xase e F.X. (e) A ligação do anticorpo biespecífico a F.[Xa elou F.X inibe a atividade de F.Xase. 25 A Figura 2 descreve a seleção.

Aproximadamente 200 tipos de cada um dos genes para os anticorpos contra F.IXa humano e F.X humano foram produzidos, e eles foram incorporados aos vetores de expressão de células animais, 40.000 ou mais anticorpos biespecíficos como uma combi- nação de um anticorpo anti-F.IXa e um anticorpo anti-F.X foram expressos 30 transitoriamente.

A atividade promotora de geração de F.Xa e a ação inibitó- ria de F.Xase foram avaliadas quanto à seleção para anticorpos específicos tendo alta atividade promotora de geração de F.Xa e baixa ação inibitória de

I:i F.Xase. Além disso, ao se substituir aminoácidos quando necessários levou à produção de anticorpos protótipos. A Figura 3 mostra as atividades promotoras de F.Xa de hA69- KQIhB26-PFIhAL-AQ, Q 1 -G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4kJJ321-G4h/L45-k, 5 Q31-z71J326-zl071L2-k, e Q64-z551J344-zl071L45-k. As concentrações das soluções de anticorpos foram de 300, 30, e 3 pglmL (as concentrações de- pois de misturar o Fator IXa Humano, Novact (marca registrada) M, Fator X humano, e a solução de anticorpos eram de 100, 10, e 1 pg/mL), a reação enzimática e a revelação da cor foram realizadas por dez minutos e 50 minu- 10 tos, respectivamente. Como resultado, esses anticorpos mostraram uma ati- vidade promotora de geração de F.Xa maior em comparação com hA69- KQIhB26-PF/Hal-AQ descrito em WO 20061109592.

1 A Figura 4 mostra a atividade promotora de geração de F.Xa de hA69-KQ/hB26-PFIHal-AQ, anticorpos protótipos, e anticorpos modificados 15 com substituições de aminoácidos. As concentrações das soluções de anti- corpos eram de 300, 30, e 3 pglmL (as concentrações depois de misturar o Fator IXa Humano, Novact (marca registrada) M, Fator X humano, e a solu- ção de anticorpos eram de 100, 10 e 1 . g/mL, a reação enzimática e a reve- lação de cor foram realizadas por dois minutos e 20 minutos, respectivamen- 20 te. Como resultado, esses anticorpos modificados mostraram uma atividade promotora de geração de F.Xa maior em comparação com os anticorpos pro- tótipos. A Figura 5 mostra a ação inibitória de F.Xase de hA69-KQIhB26- PFIHal-Aq, anticorpos protótipos, e anticorpos modificados com substitui- 25 ções de aminoácidos. A figura mostra os efeitos de hA69-KQIhB26-PF/hAL- AQ, Q1-G4kIJ268-G4hIL45-k, Q31-z71J326-z107/L2-k, QI-G4kIJ321- G4hIL45-k, Q64-z551J344-z107/L45-k, Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85- G4kIJ321-G4h/L334-k, Q64-z71J344-z107/L406-k, Q64-z7IJ326-z1071L334- k, Q153-G4kIJ142-G4h/L180-k, Q405-G4k/J232-G4h/L248-k, Q360- 30 G4k/J232-G4h/L406-k, Q153-G4kIJ232-G4h/L406-k, Q458-zl061J346- zl 07/L408-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q499-z1181J327-z107/L377-k, Q499-z 121 /J 327-z l I 9/L404-k, Q499-zl 21 /J 339-z 119/L377-k, Q499-

z1181J346-zl 071L248-k, Q354-zl 061J259-z1 071L324-k, Q460-zl 211J327- z1191L334-k, e Q499-z1181J327-z1071L334-k na ativação de F.X por F.IXa na presença de F.Vllla.

As ações inibitórias de F.Xase dos anticorpos são indi- cadas como o valor obtido subtraindo-se a absorbâncias da solução reacio- 5 nal isenta de anticorpos das absorbâncias da solução reacional suplementa- da com anticorpos.

As concentrações das soluções de anticorpos eram de 300 e 30 pglmL (as concentrações depois de mistura o Fator IXa Humano, F.Vllla, Fator X humano e a solução de anticorpos eram de 100 e 10 pglmL), a reação enzimática e a revelação de cor foram realizadas por seis minutos 10 e 4 minutos, respectivamente.

Quanto mais positivo o valor da ação inibitória de F.Xase mostrado no eixo horizontal, mais fraca é a ação inibitória de F.Xase.

Como resultado, hA69-KQIhB26-PF/Hal-AQ descrito em WO 20061109592 mostrou ação inibitória forte de F.Xase.

Todos dos anticorpos da presente invenção mostraram ação inibitória de F.Xase inibitória em com- 15 paração com o hA69-KQIhB26-PF/Hal-AQ, ou não mostrou ação inibitória.

A Figura 6A mostra as sequências de aminoácidos dos anticor- pos protótipos e os anticorpos modificados com substituições de aminoáci- dos.

Quando o nome da sequência não está indicado na coluna Ref, a se- quência da região variável da coluna de Nome é mencionada.

Um "-(hífen)" 20 é mostrado onde um aminoácido é ausente no número por numeração de Kabat.

Um ". (ponto)" é mostrado onde o aminoácido é o mesmo quando em comparação com a região variável da coluna de Nome e a coluna de Ref.

E o aminoácido da região variável da coluna de Nome é mostrada onde os a- minoácidos são diferentes.

Os aminoácidos são considerados importantes 25 para o aperfeiçoamento da atividade promotora de geração F.Xa foram indi- cados aos estriturá-los.

A Figura 6B é uma continuação da Figura 6A.

A Figura 6C é uma continuação da Figura 6B.

A Figura 6D é uma continuação da Figura 6C. 30 Modo para Realizar a Invenção As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas descritas aqui compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno e um segundo sítio i ::

de ligação a antigeno que podem se ligar especificamente a pelo menos dois tipos diferentes de antígenos.

Embora o primeiro sítio de ligação a antígeno e o segundo sítio de ligação a antígeno não estejam particularmente limitado desde que eles tenham atividade para se ligarem a F.XI elou F.1Xa, e F.X, 5 respectivamente, os exemplos incluem sítios necessários para ligação com antígeno, tais como anticorpos, anticorpos de arcabouço (moléculas anticor- pos-símile) ou peptídeos, ou fragmentos contando tais sítios.

Moléculas de arcabouço são moléculas que exibem função ligando-se a moléculas alvo, e qualquer peptídeo pode ser usado desde que eles sejam polipeptideos de 10 conformação estável que possam se ligar a pelo menos um antígeno alvo.

Exemplos de tais polipeptideos incluem regiões variáveis de anticorpos, fi- bronectina (WO 20021032925), domínio de proteína A (WO 19951001937), domínio de receptor A de LDL (WO 20041044011, WO 2005/040229), anqui- rina (WO 2002/020565), e outros, e também moléculas descritas nos docu- 15 mentos por Nygren et al. (Current in Structural Biology, 7: 463-469 (1997); e Journal of Immunol Methods, 290: 3-28 (2004)), Binz et a1. (Nature Biotech 23: 1257-1266 (2005)), e Hosse et al. (Protein Science 15: 14-27(2006)). A- lém disso, conforme mencionado em Curr Opin Moi Ther. 2010 Aug; 12(4): 487-95 e Drugs. 2008; 68(7): 901-12, moléculas de peptídeos que podem se 20 ligar a antígenos-alvo podem ser usadas.

Aqui, as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas não são particularmente limitadas desde que seja moléculas que possam se ligar a pelo menos dois tipos diferentes de antígenos, mas exemplos incluem po- lipeptídeos contendo os sítios de ligação a antígeno mencionados acima, 25 tais como anticorpos e moléculas de arcabouço bem como seus fragmentos, e aptãmeros que compreendem moléculas de ácido nucleico e peptídeos, e podem ser moléculas simples ou multímeros destas.

As moléculas de liga- ção a antigeno multiespecíficas preferidas incluem anticorpos multiespecífi- cos que podem se ligar especificamente a pelo menos dois antígenos dife- 30 rentes.

Exemplos particularmente preferidos de anticorpos que têm atividade de substituir funcionalmente F.VIII da presente invenção incluem anticorpos biespecíficos (BsAb) que podem se ligar especificamente a dois antígenos diferentes (eles podem ser chamados de anticorpos específicos duais). Na presente invenção, a expressão "cadeia L comumente com- partilhada" se refere a uma cadeia L que pode se ligar a duas ou mais ca- deias H diferentes, e mostram capacidade de ligação a cada antígeno.

Aqui, 5 a expressão "cadeia(s) H diferente(s)" se refere preferivelmente a cadeias H de anticorpos contra antígenos diferentes, mas sem limitação às mesmas, e também se refere a cadeias H cujas sequências de aminoácidos são diferen- tes uma das outras.

A cadeia L compartilhada pode ser obtida, por exemplo, de acordo com o método descrito no WO 20061109592. 10 As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção (preferivelmente, anticorpos biespecíficos) são anticorpos tendo especificidade para dois ou mais antígenos diferentes, ou moléculas com- preendendo de tais anticorpos.

Anticorpos monoclonais usados na presente invenção na presente invenção incluem não somente anticorpos derivados 15 de anticorpos tais como seres humanos, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, carneiros, camelos, e maçados, mas incluem também anticorpos recombinantes de gene artificialmente modificado tais como anticorpos qui- méricos, anticorpos humanizados, e anticorpos biespecificos.

Além disso, a cadeias L de um anticorpo que se tornarão uma 20 molécula de ligação de antígeno multiespecifica da presente invenção po- dem ser diferentes, mas preferivelmente têm cadeias L comumente compar- tilhadas.

As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção são preferivelmente anticorpos recombinantes produzidos usando- 25 se técnica de recombinação genética (vide, por exemplo, Borrebaeck CAK e Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado na Inglaterra por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Os anticorpos recom- binantes podem ser obtidos por clonagem de DNAs que codificam anticorpos a partir de hibridomas ou células produtoras de anticorpos, tais como linfóci- 30 tos sensibilizados, que produzem anticorpos, inserindo estes nos vetores adequados, e então introduzindo os mesmos nos hospedeiros (células hos- pedeiras) para produzir os anticorpos.

Além disso, os anticorpos da presente invenção podem incluir não somente anticorpos inteiros, mas também fragmentos de anticorpos e anticorpos de baixo peso molecular (minocorpos), e anticorpos modificados.

Por exemplo, os fragmentos de anticorpos e minicorpos incluem 5 diacorpos (Dbs), anticorpos lineares, e moléculas de anticorpo de cadeia simples (daqui por diante chamado de scFvs). Aqui, um fragmento "Fv" é definido como o fragmento de anticorpo menor que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação.

Um fragmento "Fv" é um dímero (dímero de VH-VL) no qual uma 10 região variável da cadeia H (VH) e uma região variável de cadeia L (VL) são fortemente ligadas por uma ligação não-covalente.

As três regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) de cada uma das regiões variáveis interagem uma com a outra para formar um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero de VH-VL.

Seis CDRs conferem o sítio de ligação de 15 antígeno a um anticorpo.

Contudo, uma região variável sozinha (ou metade do Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) pode reconhecer e se ligar a um antígeno, embora sua afinidade seja menor que aquela do sítio de ligação inteiro.

Um fragmento Fab (também chamado F(ab)) ainda compreende 20 uma região constante de cadeia L e uma região constante de cadeia H (CH1). Um fragmento Fab' difere de um fragmento Fab em que ele compre- ende adicionalmente vários resíduos derivados da terminação carboxila da região CH1 da cadeia H, que compreende uma ou mais cisternas da região da dobradiça do anticorpo.

Fab'-SH se refere a um Fab', no qual um ou mais 25 resíduos de cisteína de sua região constante compreendem um grupo tiol livre.

Um fragmento F(ab') é produzido por clivagem de pontes dissulfídicas entre os resíduos de cisterna na região da dobradiça de do digerido de pep- sina F(ab')2. Outros fragmentos de anticorpos quimicamente ligados são também conhecidos daqueles versados na técnica. 30 Diacorpos são anticorpos bivalentes construídos por fusão gêni- ca (Holliger, P. et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93111161). Diacorpos são dímeros que consistem em duas ca-

deias polipeptídicas, nas quais cada cadeia polipeptídica compreende uma região variável da cadeia L (VL) e uma região variável da cadeia H (VH) li- gadas com um ligante curto o suficiente para impedir a associação desses dois domínios dentro da mesma cadeia, por exemplo, um ligante de preferi- 5 velmente de 2 a 12 aminoácidos, mais preferivelmente de 3 a 10 aminoáci- dos, particularmente de 3 a 10 aminoácidos, particularmente de cerca de 5 aminoácidos.

A cadeia polipeptídica forma um dímero já que o ligante entre a VL e a VH codificadas no mesmo polipeptídeo é muito curta para forma um fragmento de região variável de cadeia simples.

Portanto, os diacorpos com- 10 preendem dois sítios de ligação a antígeno.

Uma anticorpo de cadeia simples ou um fragmento de anticorpo scFv compreende as regiões de VH e VL de um anticorpo, e essas regiões existem em uma cadeia polipeptídica simples.

Em geral, um polipeptídeo de Fv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre as regiões de VH e 15 VL, e isso permite que um scFV forme uma estrutura necessária para liga- ção a antígeno (para revisão sobre scFvs, vide Pluckthun "The Pharmaco- logy of Monoclonal Antibodies" Vol. 113 (Rosenburg and Moore ed. (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994). No contexto da presente invenção, ligantes não são particularmente limitados desde que eles não inibam a ex- 20 pressão da regiões variáveis do anticorpo ligadas em suas extremidades.

Anticorpos específicos do tipo IgG podem ser secretadas de hi- bridomas híbridos (quadromas) produzidos por fusão de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein C et ai.

Nature 1983, 305: 537-540). Eles podem ser também secretados tomando-se os genes das cadeia L e da ca- 25 deia H constituindo os dois tipo de IgGs de interesse, um total de quatro ti- pos de genes, e introduzindo estes em células que coexpressam os genes.

Nesse caso, ao se introduzir substituições de aminoácidos nas regiões CH3 das cadeias H, IgGs tendo combinação heterogênea das ca- deias H podem ser preferencialmente secretadas (Ridgway JB et al.

Protein 30 Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant AM et at.

Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681; WO 2006/106905; Davis JH etal.

Protein Eng Des Sel. 2010,4: 195-202).

Referindo-se às cadeias L, já que a diversidade das regiões va- riáveis da cadeia L é menor que àquela das regiões variáveis da cadeia H, as cadeias L comumente compartilhadas que podem conferir a capacidade de ligação a ambas as cadeias H podem ser obtidas.

Os anticorpos da pre- 5 sente invenção compreendem cadeias L comumente compartilhadas.

IgGs biespecíficos podem ser eficazmente expressos por introdução dos genes da cadeia L comumente compartilhada e ambas as cadeias H nas células.

Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por reticula- ção química dos Fabs.

F(ab')2 biespecifico pode ser produzido, por exemplo, 10 preparando-se Fab's de um anticorpo, usando este para produzir um Fab' maleimidizado com orto-fenilenodimaleimida (o-PDM), e então região este com Fab' preparado a partir de outro anticorpo para reticular os Fab's deri- vados de anticorpos diferentes (Keler T et al.

Cancer Research 1997, 57: 4008-4014). 0 método de se ligar quimicamente um derivado de Fab'- 15 trionitrobenzoico (TNB) e um fragmento de anticorpo tal como Fab'-tiol (SH) é também conhecido (Brennan M et al.

Science 1985, 229: 81-83). Em vez de reticulação química, um zíper de leucina derivado de Fos e Jun pode ser usado também.

Formação preferencial de heterodímeros por Fos e Jin é utilizada, muito embora eles possam também formar homo- 20 dímeros.

Fab' ao qual o zíper de leucina de Fos é adicionado, e outro Fab' ao qual outro zíper de leucina de Jun é adicionado são expressos e prepara- dos.

Fab'-Fos e Fab'-Jun monoméricos preparados reduzidos sob condições brandas são misturados e reagidos para formar F(ab')2 (Kostelny SA et al.

J. of Immunology, 1992, 148: 1547-53). (Kostelny SA et al.

J. of Immunology, 25 1992, 148: 1547-53). Esse método pode ser aplicado não somente aos Fab's, mas também aos scFvs, Fvs, e outros.

Além disso, anticorpos biespecíficos incluindo SC(Fv)2 tal como IgG-scFv (Protein Eng Des Sel. 2010 Apr; 23(4): 221-8) and BiTE (Drug Dis- cov Today. 2005 Sep 15; 10(18): 1237-44.), DVD-lg (Nat Biotechnol. 2007 30 Nov; 25(11): 1290-7. Epub 2007 Oct 14.; and MAbs. 2009 Jul; 1(4): 339-47. Epub 2009 Jul 10.), e outros também (IDrugs 2010, 13: 698-700) incluindo anticorpos dois-em-um (Science. 2009 Mar 20; 323(5921): 1610-4; e Immu-

notherapy. 2009 Sep; 1(5): 749-51.), Tri-Fab, scFv tandem, e diacorpos são conhecidos (MAbs. 2009 November; 1(6): 539-547). Além disso, mesmo quando formas moleculares são usada, tais como scFv-Fc e scaffold-Fc, an- ticorpos biespecificos podem ser produzidos eficazmente por secreção pre- 5 ferencial de uma combinação heteróloga de Fcs (Ridgway JB et al., Protein Engineering 1996, 9: 617-621; Merchant AM et al.

Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681; WO 20061106905; e Davis JH et al., Protein Eng Des Sei. 2010, 4: 195-202.). Um anticorpo biespecífico pode ser também produzido usando- 10 se um diacorpo.

Um diacorpo biespecífico é um heterodímero de dois frag- mentos scFV de crossover.

Mais especificamente, ele é produzido por for- mação de um heterodímero usando-se VH(A)-VL(B) e VH(B)-VL(A) prepara- do por ligação de VHs e VLs derivadas de dois tipos de anticorpos, A e B, usando-se um ligante relativamente curto de cerca de 5 resíduos (Holliger P 15 etal.

Proc Nati.

Acad.

Sci.

USA 1993, 90: 6444-6448). A estrutura desejada pode ser obtida por ligação de dois scFvs com um ligante flexível e relativamente longo que compreende cerca de 15 resíduos (diacorpo de cadeia simples: Kipriyanov SM et al.

J. of Molecular Biology. 1999, 293: 41-56), e realização de substituições apropriadas de a- 20 minoácidos (botões-em-orifícios : Zhu Z et al.

Protein Science. 1997, 6: 781- 788; VHNL interface engineering: Igawa T et al.

Protein Eng Des Sel. 2010, 8: 667-77). Um SC(Fv)2 que pode ser produzido por ligação de dois tipos de scFvs com um ligante flexível e relativamente longo, compreendendo cerca 25 de 15 resíduos, pode ser também um anticorpo biespecífico (Mallender WD etal.

J. of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206). Exemplos de anticorpos modificados incluem anticorpos ligados a várias moléculas, tal como, polietileno glicol (PEG). Os anticorpos da pre- sente invenção incluem tais anticorpos modificados.

No contexto da presente 30 invenção, a substância à qual os anticorpos modificados estão ligados não é limitada.

Tais anticorpos modificados podem ser obtidos modificando-se quimicamente os anticorpos obtidos.

Tais métodos são bem estabelecidos na técnica.

Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos huma- nos, anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, e outros, e suas ori- gens, não estão limitados.

Eles podem ser também geneticamente modifica- 5 dos, tais como anticorpos quiméricos ou humanizados.

Os métodos para obtenção de anticorpos humanos são bem co- nhecidos da técnica.

Por exemplo, animais transgênicos que contêm o reper- tório inteiro de genes de anticorpos humanos podem ser imunizados com antígenos desejados para obter anticorpos humanos (vide os Pedidos de 10 Patente Internacional WO 93/12227, WO 92103918, WO 94102602, WO - 94/25585, WO 96/34096, e WO 96/33735). Anticorpos geneticamente modificados podem ser também pro- duzidos usando-se métodos conhecidos.

Especificamente, por exemplo, an- ticorpos quiméricos podem compreender regiões variáveis da cadeia H e da 15 cadeia L de um anticorpo de animal imunizado, e regiões constantes da ca- deia H e da cadeia L de um anticorpo humano.

Anticorpos quiméricos podem ser obtidos por ligação DNAs que codificam as regiões variáveis do anticor- po derivado do animal imunizado, com os DNAs codificando as regiões constantes de um anticorpo humano, inserção deste em um vetor de expies- 20 são, e então introdução dele nas células hospedeiras para produzir os anti- corpos.

Os anticorpos humanizados são anticorpos modificados frequen- temente referidos como anticorpos humanos "remodelados". Um anticorpo humanizado é construído transferindo-se as CDRs de um anticorpo derivado 25 de um animal imunizado para as regiões determinantes de complementari- dade de um anticorpo humano.

Técnicas de recombinação genética conven- cionais para tais fins são conhecidas (vide a Publicação de Pedido de Paten- te EP 239400; Publicação Internacional WO 96102576; Sato K et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856; Publicação Internacional WO 99151743). 30 As moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas da presente invenção são aquelas que reconhecem FIX elou F.IXa, e F.X, e substituem funcionalmente a função de cofator de F.VIII, e são caracterizadas pelo fato de que as moléculas têm atividade promotora de geração de F.Xa mais alta em comparação com hA69-KQIhB26-PFlhAL-AQ (descrito em WO 20061109592), que é conhecido como um anticorpo biespecífico que substi- tui funcionalmente o F.VIII.

Além disso, os anticorpos da presente invenção 5 têm usualmente uma estrutura que compreende uma região variável de um anticorpo anti-F.IXa e uma região variável de um anticorpo anti-F.X.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica que substitui funcionalmente o F.VIII, que compreende um primeiro site de ligação a antígeno que reco- 10 nhece FIX elou F.IXa, e um segundo sítio de ligação a antígeno que reco- nhece F.X, em que a função que substitui a função de F.VIII é causada por atividade promotora de geração de F.Xa em comparação com a atividade do anticorpo específico (hA69-KQIhB26-PF/hAL-AQ), que compreende as ca- deias H que consistem nas SEQ ID Nos: 165 e 166, e uma cadeia L cornu- 15 mente compartilhada que consiste em SEQ ID NO: 167. A molécula de ligação a antígeno multiespecífica da presente in- venção compreende um primeiro polipeptídeo e um terceiro polipeptideo que compreende um sítio de ligação a antígeno que reconhece F-IX elou F.IXa, e um segundo polipeptídeo e um quarto polipeptídeo que compreende um sítio 20 de ligação a antígeno que reconhece F.X.

O primeiro polipeptídeo e o tercei- ro polipeptídeo, e o segundo polipeptídeo e o quarto polipeptídeo, incluem, cada um, o sítio de ligação a antígeno da cadeia de anticorpo H e o sítio de ligação a antígeno da cadeia L do anticorpo.

Por exemplo, em uma molécula de ligação a antígeno multies- 25 pecífica da presente invenção, o primeiro polipeptídeo e o terceiro polipeptí- deo incluem um sítio de ligação a antígeno de uma cadeia H e cadeia L de um anticorpo contra FIX ou F.IXa, respectivamente; e o segundo polipeptí- deo e o quarto polipeptídeo compreendem uma sítio de ligação a antígeno de uma cadeia H e cadeia L de um anticorpo contra F.X, respectivamente_ 30 Nesse momento, os sítios de ligação a antígeno da cadeia L do anticorpo incluído no primeiro polipeptídeo e no terceiro polipeptídeo, e no segundo polipeptídeo e no quarto polipeptídeo podem ser cadeias L comu-

CDTí;i mente compartilhadas.

Um polipeptídeo que compreende um sítio de ligação a antígeno de uma cadeia L do anticorpo na presente invenção é preferivelmente um polipeptídeo que compreende toda ou parte da sequência da cadeia L do 5 anticorpo que se liga ao FIX, F.IXa elou F.X.

Modalidades preferidas do sítio de ligação a antígeno do primei- ro polipeptídeo de um anticorpo da presente invenção incluem, especifica- mente, sítio de ligação a antígeno que compreendem as sequências de ami- noácidos de: 10 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q1 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q1 (SEQ ID NOs: 75, 76, e 77, respec- tivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q 34(SEQ ID NOs: 78, 79, e 80, respectivamente); 15 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q64 (SEQ ID NOs: 81, 82, e 83, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q85 (SEQ ID NOs: 84, 85, e 86, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de 0153 (SEQ ID 20 NOs: 87, 88, e 89, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q354 (SEQ ID NOs: 90, 91, e 92, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de 0360 (SEQ ID NOs: 93, 94, e 95, respectivamente); 25 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q405 (SEQ ID NOs: 96, 97, e 98, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de Q458 (SEQ ID NOs: 99, 100, e 101, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de 0460 (SEQ ID 30 NOs: 102, 103, e 104, respectivamente); e Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de 0499 (SEQ ID NOs: 105, 106, e 107, respectivamente), mencionadas nos Exemplos descri-

tos adiante, ou sítios de ligação a antígeno que são funcionalmente equiva- lentes a eles.

Modalidades preferidas do sítio de ligação a antígeno de um se- 5 gundo polipeptídeo incluem especificamente, por exemplo, sítios de ligação a antígeno que compreende as sequências de aminoácidos de: Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J232 (SEQ ID NOs: 108, 109, e 110, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J259 (SEQ ID 10 NOs: 111, 112, e 113, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J268 (SEQ ID NOs: 114, 115, e 116, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J300 (SEQ ID NOs: 117, 118, e 119, respectivamente); 15 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J321 (SEQ ID NOs: 120, 121, e 122, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J326 (SEQ ID NOs: 123, 124, e 125, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J327 (SEQ ID 20 NOs: 126, 127, e 128, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J339 (SEQ ID NOs: 129, 130, e 131, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J344 (SEQ ID NOs: 132, 133, e 134, respectivamente); 25 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J346 (SEQ ID NOs: 135, 136, e 137, respectivamente); e Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de J142 (SEQ ID NOs: 174, 175, e 176, respectivamente), mencionadas nos Exemplos descritos adiante, ou sítios de liga- 30 ção a antígeno que são funcionalmente equivalentes a eles. Mais especificamente, a presente invenção proporciona molécu- Ias de ligação a antígeno multiespecíficas, em que o sítio de ligação a anti-

geno do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H que consistem em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas dos seguintes (a1) a (all), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas, e o sítio de 5 ligação a antígeno do segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H que consistem em qualquer uma das sequências selecionadas das seguintes (b1) a (b11), ou um sítio de antígeno funcionalmente equivalente a estas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 10 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 75, 76, e 77 (CDRs da cadeia H de Q1), respectivamente; (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 (CDRs da cadeia H de Q31), respectivamente; 15 (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 81, 82, e 83 (CDRs da cadeia H de Q64), respectivamente; (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 84, 85, e 86 20 (CDRs da cadeia H de Q85), respectivamente; (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 87, 88, e 89 (CDRs da cadeia H de Q153), respectivamente; (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 25 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 90, 91, e 92 (CDRs da cadeia H de Q354), respectivamente; (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 93, 94, e 95 (CDRs da cadeia H de Q360), respectivamente; 30 (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: (CDRs da ca- deia H de Q405), respectivamente;

(a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 99, 100, e 101 (CDRs da cadeia H de Q458), respectivamente; (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 5 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ iD NOs: 102, 103, e 104 (CDRs da cadeia H de Q460), respectivamente; (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 105, 106, e 107 (CDRs da cadeia H de Q499), respectivamente; 10 (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 108, 109, e 110 (CDRs da cadeia H de J232), respectivamente; (b2) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID 15 NOs: 111, 112, e 113 (CDRs da cadeia H de J259), respectivamente; (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 114, 115, e 116 (CDRs da cadeia H de J268), respectivamente; (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 20 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 117, 118, e 119 (CDRs da cadeia H de J300), respectivamente; (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 120, 121, e 122 (CDRs da cadeia H de J321), respectivamente; 25 (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 123, 124, e 125 (CDRs da cadeia H de J326), respectivamente; (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 126, 127, e 30 128 (CDRs da cadeia H de J327), respectivamente; (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 129, 130, e

131 (CDRs da cadeia H de J339), respectivamente; (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 32, 133, e 134 (CDRs da cadeia H de J344), respectivamente; 5 (b10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 135, 136, e 137 (CDRs da cadeia H de J346), respectivamente; e (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 174, 175, 10 e 176 (CDRs da cadeia H de J142), respectivamente.

As modalidades preferidas do sítio de ligação a antígeno do ter- ceiro e quarto polipeptídeos incluem especificamente, por exemplo, sítios de ligação a antígeno que compreendem as sequências de: Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L2 (SEQ iD 15 NOs: 138, 139, e 140, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L45 (SEQ ID NOs: 141, 142, e 143, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L248 (SEQ ID NOs: 144, 145, e 146, respectivamente); 20 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L324 (SEQ ID NOs: 147, 148, e 149, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L334 (SEQ ID NOs: 150, 151, e 152, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L377 (SEQ ID 25 NOs: 153, 154, e 155, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L404 (SEQ ID NOs: 156, 157, e 158, respectivamente); Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L406 (SEQ ID NOs: 159, 160, e 161, respectivamente); 30 Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L408 (SEQ ID NOs: 162, 163, e 164, respectivamente); e Sequência de cada CDR1, 2 e 3 da cadeia H de L180 (SEQ ID

NOs: 177, 178, e 179, respectivamente), mencionadas nos Exemplos descritos adiante, ou sítios de liga- ção a antígeno que são funcionalmente equivalentes a eles.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona molécu- 5 Ias de ligação a antígeno multiespecíficas, em que os sítios de ligação a an- tígeno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compreen- dem um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia L que consistem em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (c1) a (cl), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente 10 equivalentes a estas: (cl) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 138, 139, e 140 (CDR da cadeia L de L2), respectivamente; (c2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 15 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 142, e 143 (CDR da cadeia L de L45), respectivamente; (c3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 145, e 146 (CDR da cadeia L de L248), respectivamente; 20 (c4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147, 148, e 149 (CDR da cadeia L de L324), respectivamente; (c5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 150, 151, 25 e 152 (CDR da cadeia L de L334), respectivamente; (c6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 153, 154, e 155 (CDR da cadeia L de L377), respectivamente; (c7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDRI, 30 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 156, 157, e 158 (CDR da cadeia L de L404), respectivamente; (c8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1,

tiIYM

2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 159, 160, e 161 (CDR da cadeia L de L406), respectivamente; (c9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 137, 138, 5 e 139 (CDR da cadeia L de L408), respectivamente; e (c10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 178, e 179 (CDR da cadeia L de L180), respectivamente; As cadeias de aminoácidos das regiões de variáveis da cadeia H 10 de QI, Q31, Q64, Q85, 0153, 0354, 0360, Q405, Q458, 0460, e Q499 da presente invenção são indicadas pelas seguintes SEQ ID NOs, respectiva- mente: Q1:SEQIDNO:35 Q31: SEQ ID NO: 36 15 064: SEQ ID NO: 37 Q85: SEQ ID NO: 38 Q153: SEQ ID NO: 39 Q354: SEQ ID NO: 40 Q360: SEQ ID NO: 41 20 Q405: SEQ ID NO: 42 Q458: SEQ ID NO: 43 Q460: SEQ ID NO: 44 Q499: SEQ ID NO: 45 As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia 25 H de J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346, e J142 da presente invenção são indicadas pelas seguintes SEQ ID NOs.

Respectiva- mente: J232: SEQ ID NO: 46 J259: SEQ ID NO: 47 30 J268: SEQ ID NO: 48 J300: SEQ ID NO: 49 J321: SEQ ID NO: 50

J326: SEQ ID NO: 51 J327: SEQ ID NO: 52 J339: SEQ ID NO: 53 J344: SEQ ID NO: 54 5 J346: SEQ ID NO: 55 J142: SEQ ID NO: 172 Mais especificamente, a presente invenção proporciona molécu- Ias de ligação a antígeno multiespecíficas, e, que o sítio de ligação a antíge- no do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que 10 compreende uma região variável da cadeia H que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (a 1) a (ai 1), ou um sitio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente as estas, o se- gundo sítio de ligação a antígeno do segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende uma região variável da cadeia H 15 que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos das seguin- tes (a1) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalen- te a estas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 75, 76, e 77 20 (CDRs da cadeia H de Q1), respectivamente; (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 (CDRs da cadeia H de Q31), respectivamente; (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 25 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 81, 82, e 83 (CDRs da cadeia H de 064), respectivamente; (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 84, 85, e 86 (CDRs da cadeia H de Q85), respectivamente; 30 (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 87, 88, e 89 (CDRs da cadeia H de Q153), respectivamente;

(a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 90, 91, e 92 (CDRs da cadeia H de Q354), respectivamente; (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 5 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 93, 94, e 95 (CDRs da cadeia H de Q360), respectivamente; (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: (CDRs da ca- deia H de Q405), respectivamente; 10 (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 99, 100, e 101 (CDRs da cadeia H de Q458), respectivamente; (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 102, 103, 15 e 104 (CDRs da cadeia H de Q460), respectivamente; (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 105, 106, e 107 (CDRs da cadeia H de Q499), respectivamente; (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 20 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 108, 109, e 110 (CDRs da cadeia H de J232), respectivamente; (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 111, 112, e 113 (CDRs da cadeia H de J259), respectivamente; 25 (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 114, 115, e 116 (CDRs da cadeia H de J268), respectivamente; (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 117, 118, e 30 119 (CDRs da cadeia H de J300), respectivamente; (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 120, 121, e

122 (CDRs da cadeia H de J321), respectivamente; (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 123, 124, e 125 (CDRs da cadeia H de J326), respectivamente; 5 (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 126, 127, e 128 (CDRs da cadeia H de J327), respectivamente; (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 129, 130, e 10 131 (CDRs da cadeia H de J339), respectivamente; (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 32, 133, e 134 (CDRs da cadeia H de J344), respectivamente; (b10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 15 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 135, 136, e 137 (CDRs da cadeia H de J346), respectivamente; e (b11) um sitio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 174, 175, e 176 (CDRs da cadeia H de J142), respectivamente. 20 Além disso, as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia L de L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408, e L180 da presente invenção são indicadas pelas seguintes SEQ ID NOs, respecti- vamente: L2: SEQ ID NO: 56 25 L45: SEQ ID NO: 57 L248: SEQ ID NO: 58 L324: SEQ ID NO: 59 L334: SEQ ID NO: 60 L377: SEQ ID NO: 61 30 L404: SEQ ID NO: 62 L406: SEQ ID NO: 63 L408: SEQ ID NO: 64

L180: SEQ ID NO: 173 Mais especificamente, a presente invenção proporcionar molécu- Ias de ligação a antígeno multiespecíficas, em que os sítios de ligação a an- tígeno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compreen- 5 dem um sítio de ligação a antígeno que compreende uma região variável da cadeia L que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (cl) a (c10), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: (cl) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- 10 quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 56 (re- gião variável da cadeia L de L2); (c2) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 57 (re- gião variável da cadeia L de L45); 15 (c3) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 58 (re- gião variável da cadeia L de L248); (c4) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 59 (re- 20 gião variável da cadeia L de L324); (c5) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 60 (re- gião variável da cadeia L de L334); (c6) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- 25 quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 61 (re- gião variável da cadeia L de L377); (c7) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 62 (re- gião variável da cadeia L de L404); 30 (c8) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 63 (re- gião variável da cadeia L de L406);

(c9) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 64 (re- gião variável da cadeia L de L408); e (c10) um sítio de ligação a antígeno que compreende uma se- 5 quência de aminoácidos da região variável da cadeia L SEQ ID NO: 173 (re- gião variável da cadeia L de L180). As sequências de aminoácidos de CDR1 a 3 e FR1 a 4 em cada uma das sequências são conforme descritas nas Figuras 3A a D.

Quando da produção de anticorpo de tamanho natural usando- 10 se as regiões variáveis descritas na presente invenção, sem limitações parti- culares, regiões constantes bem conhecidas daqueles versados na técnica podem ser usadas.

Por exemplo, podem ser usadas as regiões constantes descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", (1991), U.S.

Department of Health and Human Services.

Public Health Service National 15 Institutes of Health, ou "An efficient route to human bispecific IgG", (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681. Exemplos preferidos das regiões constantes de anticorpos da presente invenção incluem as regiões constan- tes dos anticorpos lgG.

Quando do uso da região constante de um anticorpo IgG, seu tipo não é limitado, e uma região constante da subclasse de IgG, 20 tais como IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, pode ser usada.

Mutações de aminoá- cidos podem ser introduzidas, por exemplo, aquelas que intensificam ou di- minuem a ligação aos receptores de Fcy (Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14; 103(11): 4005-10; and MAbs. 2009 Nov; 1(6): 572-9), ou intensificam ou diminuem a ligação a FcRn (J Biol Chem. 2001 Mar 2; 276(9): 6591-604; 25 Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69; e J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24), mas não são limitadas a estes.

Dois tipos de cadeias H devem estar heterologamente associados para produzirem um anticorpo bi- específico.

A tecnologia de botões-em-orifícios ((J immunol Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2): 7-15; e J Biol Chem. 2010 Jul 2; 285(27): 20850-9), a tecno- 30 logia de repulsão eletrostática (WO 20061106905), a tecnologia de SEED- body (Protein Eng Des Sei. 2010 Apr; 23(4): 195-202), e outras podem ser usadas para a associação heteróloga de dois tipos de cadeias H via um do-

mínio de CH3. Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser aqueles com uma cadeia de açúcar modificada ou deficiente.

Exemplos de anticorpos tendo cadeias de açúcar modificadas incluem anticorpos enge- nheirados por glicosilação (tal como, WO 99154342), anticorpos com cadeias 5 de açúcar desfucosiladas (WO 00161739, WO 02131140, WO 20061067847, WO 20061067913, etc.), e anticorpos tendo cadeia de açúcar com GIcNAc de bifurcação (tal como, WO 02179255). Exemplos conhecidos de métodos para produzir anticorpos IgG deficientes em cadeia de açúcar incluem o método para introduzir uma mutação para asparagina na posição 297 na numeração 10 EU ((J lmmunol Methods. 2002 May 1; 263(1-2): 133-47; e J Biol Chem. 2010 Jul 2; 285(27): 20850-9). Além disso, a heterogeneidade que acompa- nha a deleção da lisina C-terminal em IgG, e a heterogeneidade que acom- panha o desemparelhamento das pontes dissulfídicas na região de dobradi- ça de IgG2 podem ser diminuídas por introdução de deleções/substituições 15 de aminoácidos (WO 20091041613). A presente invenção proporciona, por exemplo, moléculas de li- gação a antígeno multiespecíficas, em que o primeiro e o segundo polipepti- deos compreendem uma região constante da cadeia H do anticorpo, e o ter- ceiro e o quarto polipeptideos compreendem uma região constante da ca- 20 deia L do anticorpo.

Além disso, a presente invenção proporciona moléculas de liga- ção a antígeno multiespecíficas, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste 25 nas seguintes (dl) a (d6) ou o grupo que consiste nas seguintes (d7) a (d9), e o segunda polipeptídeo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas de um grupo diferente daquele do primeiro polipeptídeo men- ciona acima: 30 (dl) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 65 (G4k); (d2) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 66 (z7); (d3) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 67 (z55);

(d4) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 68 (z 106); (d5) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 69 (z118); 5 (d6) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 70 (z121); (d7) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 71 (G4h); (d8) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 72 (z107); e 10 (d9) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 73 (z119). Além disso, a presente invenção proporciona moléculas de liga- ção a antígeno multiespecíficas, em que o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma região constante da cadeia L do anticorpo da seguinte 15 sequência de aminoácidos de: (e) uma região constante da cadeia L da SEQ ID NO: 74 (k). Na presente invenção, a frase "substituem funcionalmente F.VIll" significa que F.IX elou F.IXa, e F.X são reconhecidos, e a ativação de F.X é promovida (geração de F.Xa é promovida). 20 Na presente invenção, a "atividade promotora da geração de F.Xa" pode ser confirmada por avaliação das moléculas de ligação a antíge- no multiespecíficas usando-se, por exemplo, um sistema de medição que compreende FIX (enzima ativadora de F.IX), FIX, F.X, substrato sintético de F S-222 (substrato sintético de F.Xa), e fosfolipídios.

Esse sistema de medi- 25 cão mostra a correlação entre a gravidade da doença e os sintomas clínicos em casos de hemofilia A (Rosen S, Andersson M, Blomba"ck M et al.

Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity.

Thromb Haemost 1985, 54: 811-23). Ou seja, no presente sistema de medição, é esperado que substâncias de teste que mostram atividade 30 promotora de geração de F.Xa maior mostrem melhores efeitos hemostáticos contra episódios em hemofilia A.

Com esses resultados, se uma molécula de ligação a antígeno multiespecifica com atividade de substituir funcionalmente

F.VIII é uma molécula que tem atividade mais alta que hA69-KQlhB26- PFlhAL-AQ, ela pode render atividade promotora de coagulação sanguínea, excelente, e efeitos excelentes podem ser obtidos como um componente farmacêutico para prevenir e/ou tratar hemorragia, uma doença que acorn- 5 panha uma hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia.

Para obter efeitos excelentes como o componente farmacêutico mencionado acima, por exemplo, atividade promotora de geração de F.Xa medida sob as condições descritas no [Exemplo 2] é preferivelmente não menor que àquela de Q153- G4kIJ142-G4h/L180-k.

Aqui, a "atividade promotora de geração de F.Xa" é o 10 valor obtido subtraindo-se a alteração na absorbância por 20 minutos em um solvente a partir da alteração da absorbância por 20 minutos em uma solu- ção de anticorpo.

Uma modalidade preferida da presente invenção é um anticorpo multiespecífico que substitui funcionalmente F.VIII, que reconhece F.XI elou 15 F.lXa, e F.X.

Os anticorpos multiespecíficos mencionados acima da presente invenção são, preferivelmente, anticorpos que compreende CDRs da cadeia H de anticorpos anti-F.IXIF.[Xa ou CDRs funcionalmente equivalentes as es- tes, de CDRs das cadeia H de anticorpos anti-EX ou CDRs funcionalmente 20 equivalentes a estes.

Além disso, os anticorpos da presente invenção são preferivel- mente anticorpos que compreendem um sítio de ligação a antígeno tendo: sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 75, 76, e 77 da CDR 1 1 2 e 3 (CDRs da cadeia H de 01), respectivamente;

25 sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 78, 79, e 80 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q31), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 81, 82, e 83 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q64), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 84, 85, e 86 da 30 CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de 085), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 87, 88, e 89 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q153), respectivamente;

sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 90, 91, e 92 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q354), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 93, 94, e 95 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q360), respectivamente; 5 sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 96, 97, e 98 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q405), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 99, 100, e 101 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q458), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 102, 103, e 104 da 10 CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de 0460), respectivamente; ou sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 105, 106, e 107 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de Q499), respectivamente, em um anticorpo anti-F.IXIIXa ou um sítio de ligação a antígeno 15 funcionalmente equivalente a este, e um sítio de antígeno que compreende: sequências de aminoácidos de SEQ 1D NOs 108, 109, e 110 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J232), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 111, 112, e 113 da 20 CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J259), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 114, 115, e 116 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J268), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 117, 118, e 199 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J300), respectivamente; 25 sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 120, 121, e 122 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J321), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 123, 124, e 125 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J326), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 126, 127, e 128 da 30 CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J327), respectivamente; sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 129, 130, e 131 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J339), respectivamente;

sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 132, 133, e 134 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J334), respectivamente; as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 135, 136, e 137 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia H (CDRs da cadeia H de J346), respectivamen- 5 te; ou sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs 174, 175, e 176 da CDR 1, 2, e 3 da cadeia (CDRs da cadeia H de J142), respectivamente, em um anticorpo anti-F.X, ou um sítio de ligação a antígeno e- quivalente a este. 10 Na presente invenção, "os sítios de ligação a antígeno são fun- cionalmente equivalentes" significa que as atividades de substituírem funcio- nalmente F.VIII possuídas pelas moléculas de ligação a antígeno multiespe- cíficas com sítio de ligação a antígeno são equivalentes.

Na presente invenção, o termo "equivalente" não significa ne- 15 cessariamente o mesmo grau de atividade, e a atividade pode ser intensifi- cada, ou a atividade pode ser diminuída desde que haja atividade maior que a de hA69-KQ/hB26-PFIhAL-AQ de acordo com o sistema de medição des- crito acima, ou preferivelmente a atividade promotora de geração de F.Xa medida sob as condições descritas no [Exemplo 2] é equivalente a ou não 20 menos que Q153-G4k1J142-G4h/L180-k.

Os anticorpos mencionados acima podem ter uma ou mais subs- tituições de aminoácidos, deleções, adições, elou inserções na região variá- vel (sequências de CDR elou sequências de FR) da sequência de aminoáci- dos desde que tenham atividade maior que àquela do hA69-KQlhB26- 25 PFIhAL-AQ de acordo com o sistema de medição descrito acima na página 35, linhas 11-30, ou preferivelmente atividade promotora de geração de F.Xa medida sob as condições descritas no [Exemplo] é equivalente a ou não menor que àquela do Q153-G4k/J142-G4h/L180-k.

Método de introduzir mu- tações em proteínas em bem conhecido daqueles versados na técnica como 30 um método de introduzir uma ou mais substituições, deleções, adições elou inserções de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos.

Por exemplo, aqueles versados na técnica podem preparar um mutante funcionalmente equivalente, desejado, a um multi mero de polipeptídeo multiespecïfico tendo a atividade de substituir funcionalmente FVIII por introdução de mutações apropriadas na sequência de aminoácidos usando-se mutagênese sítio- direcionada (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, 5 M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site- directed mutagenesis.

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Proc Natl Acad Sci U S A. 82: 488-492) e outros. 15 Como tal, os anticorpos da presente invenção podem incluir também anticorpos com uma ou mais mutações de aminoácidos na região variável, e tendo atividade maior que aquela do hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ de acordo com o sistema de medição descrito acima na página 35 linhas 11- 30, ou, preferivelmente, a atividade promotora de geração de F.Xa sob as 20 condições descritas no [Exemplo 2] é equivalente a ou não menos que aque- Ia do Q153-G4k/J142-G4h/L180-k.

Quando um resíduo de aminoácido é alterado, o aminoácido é, preferivelmente, mutado para um aminoácido diferente que conserva as pro- priedades da cadeia lateral do aminoácido.

Exemplos das propriedades da 25 cadeia lateral do aminoácido são: aminoácidos hidrofóbicos (A, 1, L, M, F, P, W, Y, e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, e T), ami- noácidos contendo cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I, e P), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo o grupo hidroxila (S, T, e Y), aminoáci- dos contendo cadeias laterais contendo enxofre (C e M), aminoácidos con- 30 tendo cadeias laterais contendo ácido carboxílico e amida (D,N, E, e Q), a- minoácidos contendo ácidos laterais básicos (R, K, e H), e aminoácidos con- tendo cadeias laterais aromáticas (H, F, Y, e W) (aminoácidos são represen-

tados por códigos de uma letra em parênteses). As substituições de aminoá- cidos dentro de cada grupo são chamadas substituições conservativas.

Já é conhecido que um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos modificada, na qual um ou mais resíduos de aminoácidos em uma dada se- 5 quência de aminoácidos são deletados, adicionados, elou substituídos com outros aminoácidos podem reter a atividade biológica natural (Mark, D.

F. et al., Proc.

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Acad.

Sci.

USA 10 (1982) 79: 6409-13). Tais mutantes têm uma identidade de aminoácidos de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, ainda mais preferi- velmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, e, mais preferivelmente, pelo menos 95%, com as regiões variáveis (por exemplo, sequências de CDR, 15 sequências de FR, e outras regiões variáveis) da presente invenção.

Aqui, a identidade de sequência é definida como a percentagem de resíduos idênti- cos àqueles na sequência de aminoácidos original da região variável da ca- deia pesada ou região variável da cadeia leve, determinada depois das se- quências são alinhadas e lacunas são apropriadas introduzidas para maxi- 20 mizar a identidade de sequência conforme necessário.

A identidade das se- quências de aminoácidos pode ser determinada pelo método descrito abai- xo.

Alternativamente, as sequências de aminoácidos das regiões va- riáveis que têm uma substituição, adição, elou inserção de um ou mais ami- 25 noácidos na sequência de aminoácidos das regiões variáveis (sequências de CDR elou sequências de FR), e têm uma atividade maior que aquela de hA69-KQIhB26-PFIhAL-AQ de acordo com o sistema de medição descrito acima na página 35, linhas 11-30, ou preferivelmente atividade promotora de geração de F.Xa medida sob as condições descritas no [Exemplo 2] é equi- valente a ou não menos aquela de Q153-G4kIJ142-G4h/L180-k pode ser obtida a partir de ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas para ácido nucleico composto da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos das regiões variáveis.

As condições de hibridiza- ção rigorosas para isolar um ácido nucleico que hibridiza sob condições rigo- rosas para um ácido nucleico que inclui a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos das regiões variáveis incluem, por e- 5 xemplo, as condições de ureia 6M, SDS a 0,4%, 0,5 x SSC, e 37°C, ou con- dições de hibridização com rigores equivalentes a estas.

Com condições mais vigorosas, por exemplo, as condições de ureia 6M, SDS a 0,4%, 0,1 x SSC, e 42°C, isolamento dos ácidos nucleicos com homologia muito maior pode ser esperada.

As sequências dos ácidos nucleicos isolados podem ser 10 determinadas pelos métodos conhecidos descritos abaixo.

A homologia das sequências de nucleotídeos totais do ácido nucleico isolado é de pelo menos 50% ou de identidade de sequência maior, preferivelmente 70% ou maior, mais preferivelmente 90% ou maior (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou maior). 15 Os ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas a um ácido nucleico composto da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos das regiões variáveis podem ser também isola- dos, em vez dos métodos descritos acima usando-se técnicas de hibridiza- ção, métodos de amplificação gênica tal como reação em cadeia de polime- 20 rase (PCR) usando iniciadores sintetizados com base na informação de se- quência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos das regi- ões variáveis.

A identidade de uma sequência de aminoácidos para outra pode ser determinada usando-se o algoritmo BLAST, por Karlin e Altschul (Proc. 25 Natl.

Acad.

Sci.

USA (1993) 90: 5873-7). Programas tais como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo (Altschul et ai., J.

Moi.

Biol. (1990) 215: 403-10. Para analisar as sequências de nucleotídeos de acordo com BLASTN baseado no BLAST, os parâmetros são estabeleci- dos, por exemplo, como escore = 100 e comprimento de palavra = 12. Por 30 outro lado, os parâmetros usados para a análise das sequências de aminoá- cidos por BLASTX baseado no BLAST incluem, por exemplo, escore = 50 e comprimento de palavra = 3. Parâmetros padrão para cada análise são co-

nhecidos da técnica (vide por, por exemplo, o site na web de National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov). A presente invenção pode proporcionar também anticorpos que 5 se ligam a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado pelos anticorpos descritos acima.

Se um anticorpo reconhece um epítopo que se sobrepõe a um epitopo que é reconhecido por outro anticorpo pode ser confirmado pela competição entre os dois anticorpos contra o epitopo.

A competição entre os 10 anticorpos pode ser avaliada por ensaios de ligação competitivos usando-se meios tais como ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), método de transferência de energia de fluorescência (FRET) e tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico (FMAT®)). A quantidade de anticorpos ligados a um antígeno se correlaciona indiretamente com a capacidade de ligação dos 15 anticorpos competidores dos candidatos (anticorpos de teste) que se ligam competitivamente ao epítopo em sobreposição.

Em outras palavras, confor- me a quantidade de ou a afinidade dos anticorpos de teste contra o epítopo em sobreposição aumenta, a quantidade de anticorpos ligados ao antígeno diminui, e a quantidade dos anticorpos de teste ligados ao antígeno aumen- 20 ta.

Especificamente, anticorpos marcados apropriadamente e anticorpos a serem avaliados simultaneamente adicionados aos antígenos, e os assim anticorpos ligados são detectados usando-se o marcador.

A quantidade de anticorpos ligados ao antígeno pode ser facilmente determinada por marca- ção dos anticorpos de antemão.

Esse marcador não está particularmente 25 limitado, e o método de marcação é selecionado de acordo com a técnica de ensaio usada.

O método de marcação inclui marcação fluorescente, radio- marcação, marcação enzimática, e outros.

Por exemplo, anticorpos marcados fluorescentemente e anticor- pos não marcados ou anticorpos de teste são simultaneamente adicionados 30 a contas imobilizadas com F.IX, F.IXa ou F.X, e os anticorpos marcados são detectados por tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico.

Aqui, o "epítopo que se liga ao epitopo de sobreposição" se refe-

re a um anticorpo que pode reduzir a ligação do anticorpo marcado de pelo menos 50% em uma concentração que é usualmente 100 vezes maior, pre- ferivelmente 80 vezes maior, mais preferivelmente 50 vezes maior, ainda mais preferivelmente 30 vezes maior, e ainda mais preferivelmente 10 vezes 5 maior que uma concentração na qual o anticorpo não marcado reduz a liga- ção do anticorpo marcado de 50% (IC50 ). As moléculas de ligação a antígeno multiespecificas, que têm si- tios de ligação a antígeno de anticorpos que se ligam a epítopos que se so- brepõem aos epítopos ligados pelos anticorpos mencionados acima, podem 10 render uma atividade excelente de substituir funcionalmente o F.VIII.

Além disso, em sítios de ligação a antígeno que se liga a epítopos que se sobre- põem aos epítopos ligados pelos anticorpos mencionados acima, um ou mais aminoácidos podem ser alterados para obter uma atividade melhor de substituir funcionalmente o F.VIII.

As moléculas de ligação a antígeno multi- 15 específicas tendo uma atividade melhor de substituir funcionalmente o F.VIII podem ser obtidas por alteração dos aminoácidos dos sítios de ligação a antígeno e seleção das moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas tendo atividade maior que o hA69-KQIhB26-PF/hAL-AQ de acordo com o sistema de medição descrito acima, ou, tendo, preferivelmente, atividade 20 promotora de geração de F.Xa medida sob as condições descritas acima no [Exemplo 2] que é equivalente a ou não menor que aquela do Q153- G4k/J142-G4h/L180-k.

Para obter uma atividade excelente de substituir fun- cionalmente F.Vlil da presente invenção, as seguintes alterações de amino- ácidos são particularmente preferidas. 25 (1) Pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado dos resí- duos de aminoácidos nas posições 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b, 102 por numeração de Kabat na cadeia H do anticorpo que reconhece F.IX e/ou F.IXa é substituído com um aminoácido diferente. (2) Pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado dos resí- 30 duos de aminoácido nas posições 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100, e 100a pelo número de Kabat do anticorpo que reconhece F.

X é substituído com um a- minoácido diferente.

(3) Pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado dos resí- duos de aminoácido nas posições 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94, e 95 por numeração de Kabat na cadeia L do anticorpo é substituído com aminoácido. 5 Além disso, na presente invenção, os aminoácidos preferidos para obter uma atividade melhor de substituir funcionalmente F.VIII incluem aqueles mencionados em (4) a (6) abaixo.

Com respeito a esses aminoáci- dos, a cadeia H do anticorpo pode ter originalmente tais aminoácidos, ou os aminoácidos da cadeia H podem ser modificados para terem tal sequência. 10 (4) Uma cadeia H do anticorpo que reconhece F.IX elou F.IXa, em que, por numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido na posição 34 é isoleucina, o resíduo de aminoácido na posição 35 é asparagina, glutamina, ou serina, o resíduo de aminoácido na posição 49 é serina, o resíduo de a- minoácido na posição 61 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 62 15 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 96 é serina ou treo- nina, o resíduo de aminoácido na posição 98 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é fenilalanina ou tirosina, o resíduo de ami- noácido na posição 100b é glicina, o resíduo de aminoácido na posição 102 é tirosina. 20 (5) Uma cadeia H do anticorpo que reconhece F.X, em que, por numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido na posição 35 é ácido aspár- tico, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de amino- ácido na posição 73 é lisina, o resíduo de aminoácido na posição 76 é glici- na, o resíduo de aminoácido na posição 96 é lisina ou arginina o resíduo de 25 aminoácido na posição 98 é tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100a é histidina. (6) Uma cadeia L do anticorpo, em que, por numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 27 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na 30 posição 31 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 32 é glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 50 é arginina ou glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 52 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 52

• ::

é serina, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 54 é lisina, o resíduo de aminoácido na posição 55 é ácido glutâmico, a posição de resíduo de aminoácido na posição 92 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 93 é serina, o resíduo de aminoácido na 5 posição 94 é prolina, o resíduo de aminoácido na posição 95 é prolina.

Dentre os resíduos de aminoácido do anticorpo de (1) a (6), as posições favoráveis de resíduos de aminoácido para obter uma atividade similar ao F.VIII, particularmente excelente, são mostradas nos seguintes (1) a (3). 10 (1) Os resíduos de aminoácidos nas posições 34, 35, 61, 98, 100, e 100b, particularmente resíduos de aminoácido nas posições 61 e 100, por numeração de Kabat na cadeia H do anticorpo que reconhece F.IX e/ou F.IXa. (2) Os resíduos de aminoácidos nas posições 35, 53, 73, 96, 98, 15 100, e 100a por numeração de Kabat na cadeia H do anticorpo que reco- nhece F.X. (3) Os resíduos de aminoácido nas posições 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 93, 94, e 95, e, particularmente, nos resíduos de aminoácido nas po- sições 27, 30, 31, 50, 53, 94, e 95, por numeração de Kabat na cadeia L do 20 anticorpo.

Especificamente, a presente invenção proporciona moléculas de ligação a antígeno multi específicas, em que o primeiro polipeptídeo compre- ende qualquer uma das cadeias H do anticorpo selecionadas das seguintes (a1) a (a14) e qualquer uma das cadeias L do anticorpo selecionadas das 25 seguintes (cl) a (c10), e o segundo polipeptídeo compreende qualquer uma das cadeias H selecionadas das seguintes (b1) a (b12) e qualquer uma das cadeias L do anticorpo selecionadas das seguintes (cl) a (c10): (a1) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k); 30 (a2) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Q31-z7); (a3) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (Q64-z55); (a4) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (Q64-z7); (a5) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k); (a6) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k); (a7) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (Q354-z106); 10 (a8) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k); (a9) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (Q360-z118); (a10) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de 15 aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k); (all) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (Q458-z106); (a12) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (Q460-z121); 20 (a13) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (Q499-z118); (a14) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (Q499-zl 21); (b1) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de 25 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (J268-G4h); (b2) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (J321-G4h); (b3) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (J326-z107); 30 (b4) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (J344-z107); (b5) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (J232-G4h); (b6) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (J259-z107); (b7) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (J300-z107); (b8) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (J327-z107); (b9) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (J327-z119); 10 (b10) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (J339-z119); (b11) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (J346-z107); (b12) uma cadeia H do anticorpo que consiste na sequência de 15 aminoácidos de SEQ ID NO: 170 (J142-G4h); (cl) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2-k); (c2) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (L45-k); 20 (c3) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (L248-k); (c4) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (L324-k); (c5) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de 25 aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (L334-k); (c6) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (L377-k); (c7) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (L404-k); 30 (c8) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (L406-k); (c9) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de s i:

aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (L408-k); e (c10) uma cadeia L do anticorpo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 (L180-k). A presente invenção proporciona também moléculas de ligação 5 a antígeno multiespecíficas, em que o primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo que a se liga a um anticorpo que consiste na cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14), e a cadeia L do anticorpo de qualquer uma de (cl) a (c10) descritas acima, e o segundo polipeptídeo compreende um 10 sitio de ligação a antígeno que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo que se liga a um anticorpo que consiste na cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e a cadeia L de qualquer uma de (cl) a (c10) descritas acima.

Além disso, a presente invenção proporciona moléculas de liga- 15 cão a antígeno multiespecíficas, em que o primeiro polipeptídeo compreende qualquer uma cadeia H do anticorpo, selecionada das seguintes (e1) a (e3), o segundo polipeptídeo compreende qualquer uma cadeia H do anticorpo, selecionada das seguintes (f1) a (f3), e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo compreendem qualquer uma cadeia L do anticorpo, selecionada 20 das seguintes (g1) a g4): (e1) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L de qualquer uma de (c1) a (c10), de [12]; 25 (e2) uma cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo do aminoácido selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b, e 102 por numeração de Kabat em qual- quer uma cadeia H do anticorpo selecionada de (e1) é substituído com outro aminoácido; 30 (e3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 34 é a isoleucina, o resíduo de a- minoácido na posição 35 é a asparagina, glutamina, ou serina, o resíduo de aminoácido na posição 49 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 61 é a arginina, o resíduo de aminoácido na posição 62 é o ácido glutãmico, o resíduo de aminoácido na posição 96 é a serina ou a treonina, o resíduo de aminoácido na posição 98 é lisina ou a arginina, o resíduo de aminoácido na 5 posição 100 é fenilalanina ou tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100b é glicina, ou o resíduo de aminoácido na posição 102 é tirosina em qualquer cadeia H do anticorpo selecionada de (e1); (fl) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- 10 dela H do anticorpo de qualquer um de (b1) a (b12) de [12] e uma cadeia L do anticorpo de qualquer um de (c1) a (c10) de [12]; (f2) uma cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de os resíduos de aminoácidos nas posições 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100, e 100a por numeração de Kabat em qualquer cadeia 15 H do anticorpo de (f1) é substituída com outro aminoácido; (f3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração, o resí- duo de aminoácido na posição 35 é ácido aspártico, o resíduo de aminoáci- do na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 73 a lisina, o resíduo de aminoácido na posição 76 é glicina, o resíduo de aminoácido 20 na posição 96 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 76 é tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é tirosina, ou o resíduo de aminoácido na posição 100a é histidina em qualquer cadeia H do anticorpo selecionada de (f1); (g 1) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epítopo que 25 se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L do anti- corpo de qualquer uma de (c1) a (c10), de [12]; (g2) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epitopo que se sobrepõe a um epitopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- 30 deia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e uma cadeia L do anti- corpo de qualquer uma de (c1) a (c10), de [12]; (g3) uma cadeia L do anticorpo, em que pelo menos um resíduo de aminoácido é selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94, e 95 pela numeração de Kabat na cadeia L do anticorpo ou de (g1) ou de (g2) é substituída com outro aminoá- cido; e 5 (g4) uma cadeia L do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 27 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 31 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 32 é glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 50 é arginina ou glutamina, o resíduo de 10 aminoácido na posição 52 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 54 é lisina, o resíduo de a- minoácido na posição 55 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na po- sição 92 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 93 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 94 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posi- 15 cão 95 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posição 95 é prolina na ca- deia L do anticorpo de ou (g1) ou (g2). As substituições de aminoácidos podem ser realizadas nos anti- corpos (clones) da presente invenção para evitar desamidação, oxidação da metionina, e assim por diante, ou para estabilizar estruturalmente os anticor- 20 pos_ O método para obter as moléculas de ligação a antígeno multi- específicas de presente invenção não é particularmente limitada, e pode ser qualquer método.

Anticorpos biespecíficos podem ser gerados de acordo com os métodos descritos no WO 20061109592, WO 20061035756, WO 25 20061106905, ou WO 2007111435, que são conhecidos como exemplos dos métodos para produzir os anticorpos biespecíficos; e então os anticorpos desejados tendo atividade que substitui a função de cofator podem ser sele- cionados e obtidos.

Por exemplo, o anticorpo biespecífico descrito em qualquer um 30 dos seguintes (a) a (u) é proporcionado pela presente invenção: (a) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami-

noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilha- da da SEQ ID NO: 9; 5 (b) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5, e o terceiro polipep- tídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilhada 10 de SEQ ID NO: 9; (c) um anticorpo biespecífico (Q31-z7/J326-z1071L2-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 2, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consis- te na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo 15 e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L são comumente compartilhada de SEQ ID NO: 8; (d) um anticorpo biespecifico (Q64-z551J344-zí07/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o segundo peptídeo é uma cadeia H que 20 consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L da SEQ ID NO: 9; (e) um anticorpo biespecifico (Q64-z7/J326-zl071L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 25 que consiste na segunda de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; (f) um anticorpo biespecífico (Q64-z71J344-z1071L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti-

Ihada de SEQ ID NO: 33; (g) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 5 que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro polipeptideo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; (h) um anticorpo biespecifico (Q85-G4kIJ321-G4h/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (i) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; 20 (j) um anticorpo biespecífico (Q354-z1061J259-z1071L324-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- 25 Ihada de SEQ ID NO: 29; (k) um anticorpo biespecífico (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro 30 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; (I) um anticorpo biespecifico (Q360-zl18/J300-z107/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 5 Ihada de SEQ ID NO: 30; (m) um anticorpo biespecífico (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro 10 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 28; (n) um anticorpo biespecífico (Q458-z1061J346-z1071L408-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 15 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 34; (o) um anticorpo biespecífico (Q460-zl211J327-zl191L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência 20 de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 30; (p) um anticorpo biespecífico (Q499-zl181J327-zl07/L334-k), 25 em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; 30 (q) um anticorpo biespecífico (Q499-zl18/J327-z1071L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 31; (r) um anticorpo biespecífico (Q499-z1181J346-z1071L248-k), em 5 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 28; 10 (s) um anticorpo biespecífico (Q499-z1211J327-G4h/L404-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptideo são uma cadeia L comumente comparti- 15 Ihada de SEQ ID NO: 32; (t) um anticorpo biespecífico (Q499-z1211J339-zl19/L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e o terceiro 20 polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 31; e (u) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J142-G4hIL180-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 25 aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- Ihada de SEQ ID NO: 171; Sequências de aminoácidos, pesos moleculares, pontos isoelé- 30 tricos, ou presença ou ausência e forma das cadeias de açúcar dos anticor- pos da presente invenção variam dependendo das células ou hospedeiros para produzir os anticorpos ou métodos de purificação descritos abaixo.

Contudo, desde que os anticorpos obtidos tenham funções equivalentes aos anticorpos descritos da presente invenção, eles estão incluídos na presente invenção.

Por exemplo, quando um anticorpo da presente invenção é ex- presso em células procarióticas tal como E. co/i, um resíduo de metionina 5 será adicionado à terminação N da sequência de aminoácidos do anticorpo, original.

Os anticorpos da presente invenção compreendem também tais an- ticorpos.

Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser produzidos pelos métodos conhecidos daqueles versados na técnica. 10 Com base na sequência obtida do anticorpo anti-F.IX/F.IXa ou do anticorpo anti-F.X, o anticorpo anti-F.IXIF.IXa ou do anticorpo anti-F.X pode ser preparado, por exemplo, por técnicas de recombinação genética conhecidas daqueles versados na técnica.

Especificamente, um polinucleo- tídeo que codifica um anticorpo pode ser construído com base na sequência 15 do anticorpo anti-F.IX/F.IXa ou do anticorpo anti-F.X, inserido em vetor de expressão, e então expresso em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M.

S. et ai., J.

Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, A.

H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. e Sker- ra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzy- 20 mol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.

E. e Walker, B.

W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137). Os vetores incluem vetores M13, vetores PUC, pBR322, pBlues- cript, e pCR-Script.

Alternativamente, quando o objetivo é subclonar e extir- 25 par cDNA, os vetores incluem, por exemplo, pGEM-T, pDIRECT, e pT7, a- lém dos vetores descritos acima.

Os vetores de expressão são, particular- mente, úteis quando são usados vetores para produzir os anticorpos da pre- sente invenção.

Por exemplo, quando se objetiva a expressão em E. coil, tais como JM109, DH5a, HB101, e XL1-Blue, os vetores de expressão não 30 somente têm as características que permitem a amplificação de vetores em E. colí, mas devem também conter um promotor que permita a expressão eficaz em E. colí, por exemplo, o promotor IacZ (Ward et al., Nature (1989)

341: 544-546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), promotor araB (Better etal., Science (1988) 240: 1041-1043), promotor T7 e outros.

Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QlAexpress system" (Qiagen), "sistema QlAex- press" (Qiagen), pEGFP, ou pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmen- 5 te BL21 que expressa T7 RNA polimerase) além dos vetores descritos aci-

Os vetores de plasmídeo de expressão podem conter sequên- cias de sinais para secreção de anticorpo.

Com uma sequência de sinais para secreção de anticorpo, um sequência de sinais pel B ((Lei, S.

P. et a! J. 10 Bacteriol. (1987) 169: 4379) pode ser usada quando uma proteína é secre- tada no periplasma de E.coli.

O vetor pode ser introduzido nas células hos- pedeiras por cloreto de cálcio ou métodos de eletroporação, por exemplo.

Além dos vetores de E. co!!, os vetores para produzir os anticor- pos da presente invenção incluem vetores de expressão de mamíferos (por 15 exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids.

Res. 1990, 18(17): p5322), pEF, e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de inse- tos (por exemplo, "o sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac" (Gib- co-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por e- xemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus animal (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão retrovirais (por exemplo, pZlPneo), vetores de expressão de levedura (por exemplo, "Kit de Expressão Pichia" (Invitrogen), pNV11, e SP-Q01), e vetores de ex- pressão de Bacillus subtilis (por exemplo, PL608 e pKTH50), por exemplo.

Quando é pretendida a expressão em células animais tais como células CHO, COS, e NIH3T3, os vetores de plasmïdeos de expressão de- vem ter um promotor essencial para expressão em células, por exemplo, o promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277: 108), o promotor MMLV- LTR, o promotor EF1a (Mizushima et ai., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322), e o promotor CMV, e, mais preferivelmente, eles têm um gene para selecionar células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a fármacos que permite a avaliação usando-se um agente (neomicina, G418, e similares). Os vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-

RSV, pBK-CMV, pOPRSV, e pOP13, por exemplo.

Além disso, o seguinte método pode ser usado para expressão gênica estável e amplificação gênica em células.

As células CHO deficientes em via de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor que con- 5 tém um gene DHFR que compensa a deficiência (por exemplo, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), e o vetor é amplificado usando-se metotrexato (MTX). Alternativamente, o método a seguir pode ser usado para expressão gênica transitória: as célu- las COS com um gene que expressa o antígeno SV40 T no seu cromossomo 10 são transformadas com um vetor com origem de replicação de SV40 (pcD e outros). As origens de replicação derivadas de poliomavírus, adenovírus, papilomavírus bovino (BPV), etc., podem ser usadas também.

Para amplifi- car o número de cópias do gene em células hospedeiras, os vetores de ex- pressão podem ainda conter marcadores de seleção tais como o gene de 15 aminoglicosídeo transferase, o gene de timidina quinase (TK), o gene de xantina-guanina fosforibosiltransferase de E. coli (Ecogpt), e gene de di- hidrofolato redutase (dhfr); Os anticorpos da presente invenção obtidos pelos métodos des- Gritos acima podem ser isolados de dentro de células hospedeiras ou de fora 20 das células hospedeiras (o meio, ou similar), e purificados até se tornarem homogêneos.

Os anticorpos podem ser isolados e purificados por método rotineiros usados para isolar e purificar os anticorpos, e o tipo de método é limitado.

Por exemplo, os anticorpos podem ser isolados e purificados por seleção e combinação de cromatografia em coluna, filtração, ultrafiltração, 25 salting-out, precipitação com solvente, extração com solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese de SDS-gel de poliacrilamida, isso- eletrofocalização, diálise, recristalização, e outros.

As cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia por afini- dade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, filtração em 30 gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual.

Ed Daniel R.

Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Os métodos cromatográficos descritos acima podem ser conduzidos usando-se cromatografia líquida, por exemplo, HPLC e FPLC.

Colunas que podem ser usadas em cromatografia por afinidade incluem colunas de proteína e colu- nas de proteína G.

As colunas que usam a proteína A incluem, por exemplo, 5 colunas de proteína A e colunas de proteína G.

Em uma modalidade dos anticorpos da presente invenção, já que os anticorpos da presente invenção substituem funcionalmente o cofator F.VIII, espera-se que eles se tornem agentes farmacêuticos eficazes contra doenças resultantes do decréscimo da atividade (função) desse cofator.

E- lo xemplos das doenças mencionadas acima incluem hemorragia, doença que acompanham hemorragia, elou doenças causadas por hemorragia.

Em par- ticular, há vários efeitos terapêuticos excelentes em hemofilias, onde distúr- bios hemorrágicos são causados por deficiência ou decréscimo da função F.VIIIIF.VIIIa.

Dentre as hemofilias, é esperado que eles se tornem agentes 15 terapêuticos excelentes para hemofilia A, em que distúrbios hemorrágicos são causados por deficiência hereditária ou decréscimos da função de F.VIII/F.Vllia.

A presente invenção proporciona composições (farmacêuticas) que compreendem os anticorpos da presente invenção e veículos farmaceu- 20 ticamente aceitáveis.

Por exemplo, espera-se que os anticorpos da presente invenção que reconhecem ambos FIX ou F.IXa e F.X, e substituem funcio- nalmente o F.VIII se tornem produtos farmacêuticos (composições farmacêu- ticas) ou agentes farmacêuticos para prevenir elou tratar hemorragia, doen- ças que acompanham hemorragia, ou doenças causadas por hemorragia, e 25 similares.

No contexto da presente invenção, hemorragia, doenças que acompanham hemorragia, ou doenças causadas por hemorragia se referem preferivelmente a doenças que se desenvolvem elou progridem devido à redução ou deficiência da atividade de F.VlII elou fator VIII (F.Vllla) de coa- 30 gulação ativado.

Tais doenças incluem a hemofilia A descrita acima, doen- ças nas quais um inibidor contra F.VIII/F.VIlla aparecem, hemofilia adquirida, doença de Von Willebrand e outras, mas não estão particularmente limitadas

, off**i a estas.

As composições farmacêuticas usadas para fins terapêuticos ou preventivos, que compreendem da presente invenção como ingredientes ativos, podem ser formuladas por misturamento, se necessário, com veícu- 5 los farmaceuticamente adequados, veículos, e de modo que são inativos contra os anticorpos.

Por exemplo, água esterilizada, solução salina fisioló- gica, estabilizantes, excipientes, antioxidantes (tal como ácido ascórbico), tampões (tais como fosfato, citrato, histidina, e outros ácidos orgânicos, an- tissépticos, agentes tensoativos (tais como PEG e Tween), agentes quelan- 10 tes (tal como EDTA), e ligantes podem ser usados.

Eles podem compreen- der também outros polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas tais como albumina sérica, gelatina, e imunoglobulinas, aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, ácido glutãmico, metionina, arginina, e lisina, açúcares e carboidratos tais como polissacarideos e monossacarídeos, e 15 álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol.

Quando da preparação de uma solução aquosa para injeção, soluções salinas fisiológicas e isotônicas compreendendo glicose e outros adjuvantes tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio podem ser usados, e, se necessário, em com- binação com solubilizantes apropriados tais como álcool (por exemplo, eta- 20 nol), poliálcoois (tais como propileno glicol e PEG), e tensoativos não-iônicos (tais como, polissorbato 80, polissorbato 20, poloxãmero 188, e HCO-50). No misturamento de hialuronidase na formulação, um volume maior de fluido pode ser administrado simultaneamente (Expert Opin Drug Deliv. 0712007; 4(4): 427-40). 25 Se necessário, os anticorpos da presente invenção podem ser encapsulados em microcápsulas (por exemplo, aquelas feitas de hidroxime- tilcelulose, gelatina, e poli(metacrilato de metila)O, ou incorporados como componentes de sistemas de distribuição de fármacos coloidais (vide, por exemplo, mícroesferas de albumina, microemulsão, nanopartículas, e nano- 30 cápsulas) (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science 16a Edi- ção", Oslo Ed. (1980)). Métodos para preparar os agentes farmacêuticos como agentes farmacêuticos de liberação controlada são também conheci-

dos, e tais métodos podem ser aplicados aos anticorpos da presente inven- ção (Langer et al., J.

Biomed.

Mater.

Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); Patente US 3.773.919; Pedido de Patente EP 58,481; Sidman etal., Biopolymers 22: 547-556 (1983); EP 133.988). 5 A dose de uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser apropriadamente determinada ao se considerar a forma de dosa- gem, método de administração, idade do paciente e peso corporal, sintomas do paciente, tipo da doença, e grau de progresso da doença, e é por fim de- fina pelos clínicos.

Em geral, a dose diária para um adulto é de 0,1 mg a 10 2.000 mg de uma só vez ou em várias porções, ainda mais preferivelmente de 0,2 a 1.000 mg/dia, ainda mais preferivelmente de 0,5 a 500 mg/dia, ain- da mais preferivelmente de 1 a 300 mg/dia, ainda mais preferivelmente de 3 a 100 mg/dia, e mais preferivelmente de 5 a 50 mg/dia.

Essas doses podem variar, dependendo do peso corporal do paciente e da idade, e do método de 15 administração, contudo, a seleção da dosagem adequada está bem dentro do alcance daqueles versados na técnica.

Similarmente, o período de dosa- gem pode ser apropriadamente determinado dependendo do progresso te- rapêutico.

Além disso, a presente invenção proporciona genes ou ácidos 20 nucleicos que codificam os anticorpos da presente invenção.

Ainda, a terapia gênica pode ser realizada incorporando-se genes ou ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da presente invenção em vetores para a terapia gê- nica.

Além da administração direta usando-se plasmídeos "nus", métodos de administração incluem administração depois da embalagem em lipossomos, 25 e assim formar uma variedade de vetores de vírus tais como vetores de re- trovírus, vetores de adenovírus, vetores de vírus de vaccinia, poxvírus, veto- res, vetores de víruos adenoassociados, e vetores HVJ (vide Adolph "Viral Genome Methods" CRC Press, Florida (1996)), ou revestir com contas de veículos tais como partículas de ouro coloidais (WO 93117706, e outros). 30 Conduto, desde que os anticorpos sejam expressos in vivo e suas atividades sejam exercidas, qualquer método pode ser usado para administração.

Pre- ferivelmente, uma dose suficiente pode ser administrada por via parenteral

• ::

adequada (tal como injeção ou infusão intravenosa, intraperitoneal, subcutâ- nea, intradérmica, intramuscular, em tecidos adiposos ou glândulas mamá- rias; inalação; bombardeio com partículas acionadas a gás (usando pistola de elétrons e similar); ou via nasal tal como gotas nasais). Alternativamente, 5 os genes que codificam os anticorpos de presente invenção podem ser ad- ministrados em células sanguíneas, células da medula óssea, e similares, ex vivo, usando-se transfecção por lipossomos, bombardeio com partículas (Pa- tente US 4.945.050), ou infecção viral, e as células podem ser reintroduzidas nos pacientes.

Qualquer gene que codifique um anticorpo da presente in- 10 venção pode ser usado em terapia gênica, e seus exemplos incluem genes que compreendem sequências de nucleotideos que codificam as CDRs de 01, Q31, Q64, 085, 0153, 0354, Q360, 0405, Q458, Q460, Q499, J232, J259, J268, J300, J321, J326, J327, J339, J344, J346, J142, L2, L45, L248, L324, L334, L377, L404, L406, L408, e L180 descritas acima. 15 A presente invenção proporciona também métodos para prevenir elou tratar hemorragia, doenças que acompanham hemorragia, elou doen- ças causadas por hemorragia compreendendo a etapa de administrar os anticorpos ou as composições da presente invenção.

Os anticorpos ou as composições podem ser administrados, por exemplo, pelos métodos men- 20 cionados acima.

Além disso, a presente invenção proporciona kits para serem usados com os métodos mencionados acima, em que tais kits compreendem pelo menos um anticorpo ou composição da presente invenção.

Ainda, os kits podem incluir embalados com eles uma seringa, agulha para injeção, 25 meio farmaceuticamente aceitável, algodão encharcado com álcool, banda- gem adesiva, bula para descrever o método de uso, e similares.

A presente invenção também se refere ao uso de uma molécula de ligação a antígeno multi específica, um anticorpo biespecífico, ou uma composição da presente invenção na fabricação de um agente para prevenir 30 elou tratar hemorragia, doença que acompanha hemorragia, ou doença cau- sada por hemorragia.

Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma molécula

1.1171.7:3 de ligação a antígeno multiespecifica, um anticorpo biespecífico, ou uma composição da presente invenção para prevenir elou tratar hemorragia, uma doença que acompanha uma hemorragia, ou uma doença causada por he- morragia. 5 Todas as prioridades citadas aqui são incorporadas a título de referência neste relatório descritivo.

Exemplos Aqui abaixo, a presente invenção será descrita especificamente com referência aos Exemplos, mas não é para se interpretar como se a 10 mesma estivesse limitada a estes.

Exemplo 1 Produção de Anticorpos Biespecíficos Tendo Ativida- de Promotora de Geração de F.Xa No WO 2006;109592, hA69-KQIhB26-PF/Hal-AQ foi obtido como um anticorpo biespecífico tendo atividade de substituir funcionalmente o 15 F.VIII.

Contudo, houve a possibilidade de que este anticorpo tivesse ação inibitória sobre a reação na qual o F.IXa ativa o F.X usando-se F.Vllla como cofato r.

Como mostrado na Figura 1, os anticorpos que se ligam a F.IXIF.IXa ou F.X podem inibir a formação do complexo de F.IXa-F.Vllla (Fa- 20 tor Xase (F.Xase), ou inibir a atividade de F-Xase (ativação do F.X). Abaixo, a inibição da formação de F.Xase elou a ação de inibir a atividade de F.Xase será mencionada como ação inibitória de F.Xase.

A ação inibitória de F.Xase é a inibição de uma reação de coagulação na qual o F.Vllla serve como o cofator, que pode suprimir a função de F.VIII remanescente em um paciente 25 ou a função da formulação de F.VIII administrada.

Portanto, é desejável que a atividade promotora de geração de F.Xa, que é o objetivo do anticorpo bi- específico, é alto, enquanto a ação inibitória de F.Xase é baixa.

Em particu- lar, é mais desejável que a atividade promotora de geração de F.Xa e a ação inibitória de F.Xase sejam separadas tanto quanto possível. 30 Contudo, a ação inibitória de F.Xase é devida à ligação ao antí- geno (F.IXa elou F.X), que é uma propriedade fundamental do anticorpo.

Por outro lado, um anticorpo biespecífico tendo ação promotora de geração de

F.Xa (substituindo funcionalmente o F.VIII) também precisa se ligar aos antí- genos (F.IXa e F.X). Portanto, é previsto que seja extremamente difícil se obter anticorpos biespecíficos que não têm ação inibitória de F.Xase, mas têm atividade promotora de geração de F.Xa (substituindo funcionalmente 5 F.VIII). Similarmente, é previsto que seja extremamente difícil diminuir a a- ção inibitória de F.Xase enquanto se aumenta a atividade inibitória de gera- ção de F.Xa por introdução de substituições de aminoácidos em um anticor- po biespecifico. Os presentes inventores prepararam genes para aproximada- 10 mente 200 tipos de anticorpos contra FIXa humano e F.X humano, respecti- vamente, usando um método conhecido daqueles versados na técnica, que é o método para obter genes de anticorpo provenientes de células produto- ras de anticorpos de animais imunizados com um antígeno (F.IXa humano ou F.X humano), e introduzir substituições de aminoácidos, quando necessá- 15 rio. Cada gene de anticorpo foi incorporado em um vetor de expressão de célula animal.

40.000 ou mais anticorpos específicos como combinações de anticorpo anti-F.IXa e anticorpo anti-F.X foram transitoriamente expressos por transfecção simultânea do vetor de expressão da cadeia H do anticorpo 20 anti-F.IXa humano, o vetor de expressão da cadeia H do anticorpo anti-F.X humano, e o vetor de expressão da cadeia L do anticorpo comumente com- partilhada nas células mamíferas, tais como células HEK293H. Como contro- le comparativo, o anticorpo biespecífico h69-KQIhB26-PF/Hal-AQ (SEQ ID NOs: 165/166/167) descrito no WO 20061109592 foi preparado. 25 Já que as mutações mencionadas acima no WO 20061106905 ou WO 19961027011 foram introduzidas no domínio CH3 de cada cadeia H, acreditou-se que os anticorpos biespecificos haviam sido principalmente ex- pressos. Os anticorpos no sobrenadante da cultura de células foram purifi- cados por um método conhecido daqueles versados na técnica usando-se a 30 Proteína A. Os presentes inventores mediram a atividade promotora de ge- ração de F.Xa desses anticorpos pelo método descrito abaixo. Todas as re-

ações foram realizadas à temperatura ambiente.

Cinco microlitros da solução de anticorpo diluída com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de albumina sérica bovina (daqui por diante denominada TBSB) foram misturados com 2,5 pL de 27 nglmL.

O 5 fator IXa beta humano (Enzyme Research Laboratories) e 2,5 pL de 6 Ul/mL de Novact® M (Kaketsuken), e então incubados em uma placa de 384 po- ços, à temperatura ambiente, por 30 minutos.

A reação enzimática nessa solução mista foi iniciada por adição de 5 pL de 24,7 pg/ML do Fator X Humano (Enzyme Research Laboratori- es), e dez minutos mais tarde, 5 pL de EDTA 0,5M foram adicionados para finalizar a reação.

A reação de coloração foi iniciada por adição de 5 pL de solução de substrato de coloração.

Depois de uma reação de coloração de 50 minutos, a alteração de absorbância em 405 nn, foi medida usando-se o SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices). A atividade promotora de gera- 15 ção de F.Xa foi indicada como o valor obtido por subtração da absorbância da solução reacional isenta de anticorpo a partir da absorbância da solução reacional isenta de anticorpos.

TBCP (TBSB contendo uma solução de fosfolipídio 93,75 p (SYSMEX CO.), CaCl2 7,5mM e MgCl2 1,5mM) foi usada como o solvente 20 para o Fator IXa Humano, Novact°) M, e o Fator X Humano.

Uma solução de substrato de coloração S-2222TM (CHROMOGENIX) foi dissolvida em água purificada em 1,47 mglmL, e então usada neste ensaio.

Para avaliar a ação inibitória de F.Xase dos anticorpos, os pre- sentes inventores mediram os efeitos sobre a ativação do F.X por F.IXa na 25 presença de F.Vllla usando o método a seguir.

Todas as reações foram rea- lizadas à temperatura ambiente.

Cinco microlitros da solução de anticorpos diluída com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de albumina sérica bovina (daqui por diante referida como TBSB) foram misturados com 2,5 pL de 80,9 pL de 80,9 ng;mL de Fator IXa beta Humano (Enzyme Research Laboratories), e então incubados em uma placa de 384 poços à temperatura ambiente, por 30 minutos.

2,5 pL de 1,8 UIImL de F.Vllla (o método de produção será des- crito mais tarde) foi ainda adicionado, e 30 segundos depois a reação enzi- mática nesta solução mista foi iniciada por adição de 5 pL de 24,7 pg/mL do Fator X Humano (Enzyme Research Laboratories). Seis minutos mais tarde, 5 5 pL de EDTA 0,5M foram adicionados para finalizar a reação. A reação de coloração foi iniciada por adição de 5 pL de solução de substrato de colora- ção. Depois de uma reação de coloração de 14 minutos, a alteração da ab- sorbância em 405 nm foi medida usando-se Spectra Max 340PC384 (Molecu- lar Devices). A ação inibitória de um anticorpo foi indicada como o valor obti- 10 do por subtração da absorbância da solução reacional isenta de anticorpos a partir da absorbância da solução reacional suplementada com anticorpos. F.Vllla foi preparado misturando-se 5,4 Ul/mL de Kogenate° FS (Bayer HealthCare) e 1,11 pg/mL de alfa Trombina Humana (Enzyme Rese- arch Laboratories) em uma razão em volume de 1:1, incubando-se à tempe- 15 ratura ambiente por um minuto, e então adicionando-se 7,5 UlmL de Hirudin (Merck KgaA) em uma quantidade que é a metade do volume da solução da mistura. A solução preparada foi definida como 1,8 UI/mL de FVIIIa, e um minuto depois da adição de Hirudin, este foi usado em ensaios. TBCP (TBSB contendo solução de fosfolipídio 93,75pM (SYS- 20 MEX CO.), CaCl2 7,5 mM e MgCl2 1,5mM) foi usada para o solvente para o Fator IXa Humano, Fator X Humano, Kogenate® FS, alfa Trombina Humana, e Hirudin. Uma solução de substrata de coloração S-2222TM (CHROMOGE- NIX) foi dissolvida em água purificada a 1,47 mglmL, e então usada neste ensaio. 25 As atividades promotoras de F.Xa de cada um dos anticorpos biespecificos são indicados nas Figuras 3 e 4, e as ações inibitórias de F.Xase de cada um dos anticorpos biespecificos estão indicados na Figura

5. Várias substituições de aminoácidos que aumentam a atividade promotora de geração de F.Xa foram encontradas, mas como esperado, a maior parte 30 das substituições de aminoácidos que aumentam a atividade promotora de geração de F.Xa aumentou a ação inibitória de F.Xase também, e a ação inibitória de F.Xase foi suprimida enquanto o aumento da atividade promoto-

ra da geração de F.Xa foi muito difícil.

Sob tais circunstâncias, os inventores da presente invenção ob- tiveram Q1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q1-G4k/J321-G4h/L45-k, Q31-z7/J326- z107/L2-k, Q64-z55/J344-zí07/L45-k como anticorpos biespecíficos com alta 5 atividade promotora de geração de F,Xa e baixa ação inibitória de F.Xase.

Além disso, Q1-G4k (SEQ ID NO: 1), Q31-z7 (SEQ ID NO: 2), e Q64-z55 (SEQ ID NO: 3) foram obtidos com cadeias H do anticorpo anti-F.IXa huma- no, J268-G4h (SEQ ID NO: 4), J321-G4h (SEQ ID NO: 5), J326-z107 (SEQ ID NO: 6), e J344-z107 (SEQ ID NO: 7) foram obtidos como cadeias H do 10 anticorpo anti-F.X humano protótipo e L2-k (SEQ ID NO: 8) e L45-k (SEQ ID NO: 9) foram obtidos como cadeias L do anticorpo comumente compartilha- das protótipo.

O caractere antes o hífen no nome da sequência indica a regi- ão variável e o caractere depois do hífen indica a região constante.

Cada nome do anticorpo biespecífico é indicado pela listagem dos nomes das se- 15 quências de cada cadeia a ser transfectada.

A maioria dos anticorpos biespecíficos tendo atividade promotora de geração de FX.a próxima àquela do hA69-KQIhB26-PF/hAL-AQ tinha a- ção inibitória conforme se esperava, mas, foi constatado que esses anticor- pos biespecíficos (Q 1-G4k/J268-G4h/L45-k, Q 1-G4k1J321-G4h/L45-k, Q31- 20 z7/J326-z107/L2-k, Q64-z55/J344-z1071L45-k) tinham maior atividade pro- motora de geração de F.Xa e menor ação inibitória de F.Xase que o hA69- KQ/hB26-PF/hAL-AQ descrito em WO 20061109592. Os presentes invento- res conduziram exames para aumentar mais a atividade promotora de gera- ção de F.Xa a reduzir a ação inibitória de F.Xase usando esses quatro anti- 25 corpos como anticorpos protótipos.

Seleção de anticorpos biespecíficos que aumentam a atividade promotora de geração de F.Xa e reduzem a ação ini- bitória de F.Xase é mostrada na Figura 2. Exemplo 2 Produção de Anticorpos Modificados Os presentes inventores introduziram várias combinações de 30 mutações de aminoácidos que afetam as atividades promotoras de geração de F.Xa e ações inibitórias de F.Xase no Exemplo 1 para cada uma das ca- deias dos anticorpos protótipos por um método conhecido daqueles vertidos

[;1 Y1:f ]

na técnica tal como PCR para introduzir mutações e avaliou as combinações de cadeias modificadas em larga escala para avaliar para substituições de aminoácidos que irão ainda as atividades produtoras de geração de F.Xa e reduzem as ações inibitórias de F.Xase dos quatro anticorpos protótipos. 5 Cada um dos anticorpos biespecíficos modificados com substitu- ições de aminoácidos foi expresso transitoriamente e purificado por métodos similares àqueles para os anticorpos protótipos.

As atividades promotoras de geração de F.Xa dos anticorpos foram medidas usando-se o método a se- guir.

Todas as reações foram efetuadas à temperatura ambiente. 10 Cinco microlitros da solução de anticorpo diluída com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de albumina sérica bovina (daqui por diante denominada TBSB) foram misturados com 2,5 pL de 27 nglmL.

O fator IXa beta humano (Enzyme Research Laboratories) e 2,5 pL de 6 Ul/mL de Novact® M (Kaketsuken), e então incubados em uma placa de 384 poços, 15 à temperatura ambiente, por 30 minutos.

A reação de coloração foi iniciada por adição de 5 pL de 20 solução de substrato de coloração.

Depois de uma reação de coloração de 20 minutos, a alteração de absorbância em 405 nn, foi medida usando-se o SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices). A atividade promotora de gera- ção de F.Xa foi indicada como o valor obtido por subtração da absorbância da solução reacional isenta de anticorpos a partir da absorbância da solução 25 reacional isenta de anticorpos.

TBCP (TBSB contendo uma solução de fosfolipídio 93,75 p (SYSMEX CO.), CaCl2 7,5mM e MgCl2 1,5mM) foi usada como o solvente para o Fator IXa Humano, Novact°) M, e o Fator X Humano.

Uma solução de substrato de coloração S-2222® (CHROMOGENIX) foi dissolvida em água 30 purificada em 1,47 mglmL, e então usada neste ensaio.

As ações inibitórias de F.Xase dos anticorpos foram também a- valiados por métodos previamente descritos.

As atividades promotoras de geração de F.Xa de cada um dos anticorpos biespecíficos modificados são indicadas na Figura 4, e as ações inibitórias de F.Xase de cada um dos anticorpos biespecíficos são indicados na Figura 5. 5 Os inventores da presente invenção obtiveram Q85-G4k/J268- G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, Q64-z71J344-zl071L406-k, and Q64-z71J326-z1071L334-k como anticorpos biespecíficos com alta atividade de geração de F.Xa e baixa ação inibitória de F.Xase.

Além disso, eles des- cobriam Q64-z7 (SEQ ID NO: 10) e Q85-G4k (SEQ ID NO: 11) como a ca- 10 deia H do anticorpo anti-F.IXa humano (SEQ ID NO: 30) e [406-k (SEQ ID NO: 33) como as cadeias L do anticorpo comumente compartilhada com ati- vidade promotora de geração F.Xa, aumentada.

Embora as ações tenham aumentado ligeiramente, a atividade promotora de geração de F.Xa aumen- tou bastante nos Q85-G4k/J268-G4h/L406-k, Q85-G4k/J321-G4h/L334-k, 15 Q64-z71J344-zí07/L406-k, e Q64-z71J326-zl071L334-k.

Já que estes anti- corpos modificados têm atividades promotoras de F.Xa bastante altas em comparação com o aumento das ações inibitórias de F.Xase, a atividade promotora de geração de F.Xa e a ação inibitória de F.Xase poderiam ser separadas em comparação com os anticorpos protótipos.

Desse modo, as 20 combinações que suprimem a ação inibitória de F.Xase e aumentam a ativi- dade promotora de F.Xa foram descobertas.

Embora a atividade promotora de geração de F.Xa seja preferida para os anticorpos protótipos para substituírem funcionalmente o F.VIII por anticorpos biespecíficos, a ação inibitória de F.Xase foi considerada favorá- 25 vel para uso clínico em pacientes que mantém as funções de F.VIII ou paci- entes que recebem o tratamento com formulações de F.VIII.

Portanto, outras modificações foram realizadas para produzir anticorpos biespecíficos nos quais a ação inibitória de F.Xase não é aumentada ao mesmo tempo em que atividade promotora de geração de F.Xa é subsequente aumentada. 30 Como resultado Q153-G4klJ232-G4h/L406-k, Q354-z1061J259- z107/L324-k, Q360-G4k/J232-G4h/L406-k, Q360-z118/J300-z107/L334-k, Q405-G4kIJ232-G4h/L248-k, Q458-zl 06/J346-zl 07/L408-k, Q460-

z1211J327-z1191L334-k, 0499-z 118/J327-z107/L334-k, 0499-z 1181J 327- z 1071L377-k, Q499-z 1181J 346-z 1071L248-k, Q499-z1 21 1J 327-z 119/L404-k, Q499-zl211J339-z119/L377-k, e 01 53-G4k/J1 42-G4h/L1 80-k foram obtidos como anticorpos biespecíficos com alta atividade promotora de geração de 5 F.Xa e baixa ação inibitória de F.Xase.

Além disso, os inventores descobri- ram que Q153-G4k (SEQ ID NO: 12), Q354-z106 (SEQ ID NO: 13), Q360- G4k (SEQ ID NO: 14), Q360-z118 (SEQ ID NO: 15), Q405-G4k (SEQ ID NO: 16), Q458-z106 (SEQ ID NO: 17), Q460-z121 (SEQ ID NO: 18), Q499-z118 (SEQ ID NO: 19), and Q499-z121 (SEQ ID NO: 20) como a cadeia H do an- 10 ticorpo anti-F.IXa humano, J232-G4h (SEQ ID NO: 21), J259-z107 (SEQ ID NO: 22), J300-z107 (SEQ ID NO: 23), J327-z107 (SEQ ID NO: 24), J327- z119 (SEQ ID NO: 25), J339-z119 (SEQ ID NO: 26), J346-z107 (SEQ ID NO: 27), J142-G4h (SEQ ID NO: 170) como a cadeia H do anticorpo anti-F.X hu- mano com atividade promotora de geração de FXa aumentada, e L248-k 15 (SEQ ID NO: 28), L324-k (SEQ ID NO: 29), L377-k (SEQ ID NO: 31), L404-k (SEQ ID NO: 32), L408-k (SEQ ID NO: 34), e L180-k (SEQ ID NO: 171) co- mo as cadeias L do anticorpo comumente compartilhada.

Já que esses anticorpos têm atividades promotoras de geração de F.Xa, altas, enquanto têm as ações inibitórias de F.Xase suprimidas, eles 20 podem ter propriedades bastante úteis para pacientes que mantêm a função de F.VIII alta e pacientes que recebem tratamento com formulações de F.VIII.

Já que os anticorpos têm geralmente meias-vidas longas, e podem ser administrados subcutaneamente, esses anticorpos específicos podem ser de grande valor para pacientes com hemofilia A, quando em comparação 25 com a terapia de reposição existente por administração intravenosa de for- mulações F.VIII existentes para hemofilia A.

As comparações de sequências das regiões variáveis de cada uma das cadeias usadas no Exemplo 1 e Exemplo 2 são mostradas nas Fi- guras 6A a D.

Por exemplo, para intensificar a atividade promotora de gera- 30 cão de F.Xa de um anticorpo biespecífico, os seguintes aminoácidos foram constatados como sendo importantes: na cadeia H do anticorpo anti-F.IXa humano, isoleucina na posição 34, asparagina, glutamina, ou serina na posi-

cão 35, serina na posição 49, arginina na posição 61, ácido glutâmico na posição 62, serina ou treonina na posição 96, lisina ou arginina na posição 98, serina ou ácido glutâmico na posição 99, fenilalanina ou tirosina na posi- ção 100, glicina na posição 100tá, tirosina na posição 102, e outros; na ca- 5 deia H do anticorpo anti-F.X humano, ácido aspártico na posição 35, arginina na posição 53, lisina na posição 73, glicina na posição 76, lisina ou arginina na posição 96, tirosina na posição 98, tirosina na posição 100, histidina na posição 100a, e outros; na cadeia L do anticorpo comumente compartilhada, lisina ou arginina na posição 27, ácido glutâmico na posição 30, arginina na 10 posição 31, glutamina na posição 32, arginina ou glutamina na posição 50, serina na posição 52, arginina na posição 53, lisina na posição 54, ácido glu- tâmico na posição 55, serina na posição 92, serina na posição 93, prolina na posição 94, prolina na posição 95, e outros (os aminoácidos da região variá- vel são numerados pela numeração de Kabat (Kabat EA et ai. 1991. Se- 15 quences of Proteins of Immunological Interest.

NIH)). Aplicabilidade Industrial A presente invenção proporcionar moléculas de ligação a antí- geno multiespecíficas tendo alta atividade de substituir funcionalmente o F.VIII, que são anticorpos que reconhecem tanto a enzima como seu subs- 20 trato.

Além disso, a presente invenção proporciona moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas com alta atividade de substituir funcionalmente o F.VIII e uma baixa ação de atividade inibitória de F.Xase, que são anticorpos que reconhecem tanto a enzima como seu substrato.

Já que anticorpos humanizados podem ter em geral alta estabili- 25 dade no sangue e baixa imunogenicidade, os anticorpos multiespecíficos da presente invenção são muito promissores como produtos farmacêuticos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica que substitui funcionalmente o fator VIII de coagulação sanguínea, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece o 5 fator IX de coagulação sanguínea e/ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator X de coagulação sanguínea, em que a substituição funcional para o fator VIII de coagulação sanguínea resulta da atividade promotora da geração do fator X (F.Xa) de coagulação sanguínea ativado maior que a atividade de um anti- 1O corpo biespecífico (hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ) que compreende uma ca- deia H compreendendo SEQ ID NOs: 165 e 166 e uma cadeia L comumente compartilhada que compreende a SEQ ID NO: 167.

2. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea e/ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, e um terceiro polipeptídeo que compreende um terceiro sítio de ligação a peptídeo que reconhece o fator IX de coagulação sanguí- nea e/ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, bem como um se- gundo polipeptídeo que compreende um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece o fator X de coagulação sanguínea e um quarto polipeptídeo que compreende um quarto sítio de ligação a antígeno que reconhece um fator X de coagulação sanguínea.

3. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo compreendem, cada um, um sítio de ligação a antígeno de uma cadeia H ou cadeia L de um anticorpo contra o fator IX de coagula- ção sanguínea ou o fator IX de coagulação sanguínea, ativado, respectiva- mente; e o segundo e o quarto polipeptídeo compreende, cada um, um sítio de ligação a antígeno de uma cadeia H ou cadeia L de um anticorpo contra fator X de coagulação sanguínea, respectivamente.

4. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antíge- no do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H que consistem em qualquer uma das se- quências de aminoácidos selecionadas das seguintes (a1) a (a11), ou um 5 sítio de ligação a antígeno equivalente a estas, e o sítio de ligação a antíge- no do segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs da cadeia H consistindo em qualquer uma das sequên- cias de aminoácidos selecionadas das seguintes (b1) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas: 1O (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 75, 76, e 77 (CDRs da cadeia H de 01), respectivamente; (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 (CDRs da cadeia H de Q31 ), respectivamente; (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 81, 82, e 83 (CDRs da cadeia H de Q64), respectivamente; (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 84, 85, e 86 (CDRs da cadeia H de Q85), respectivamente; (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 87, 88, e 89 (CDRs da cadeia H de Q153), respectivamente; (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 90, 91, e 92 (CDRs da cadeia H de Q354), respectivamente; (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 93, 94, e 95 (CDRs da cadeia H de Q360), respectivamente; (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: (CDRs da ca-

deia H de Q405), respectivamente; (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 99, 100, e 101 (CDRs da cadeia H de Q458), respectivamente; 5 (a1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 102, 103, e 104 (CD Rs da cadeia H de Q460), respectivamente; (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 105, 106, 1O e 107 (CDRs da cadeia H de Q499), respectivamente; (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 108, 109, e 11 O (CDRs da cadeia H de J232), respectivamente; (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 111, 112, e 113 (CDRs da cadeia H de J259), respectivamente; (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 114, 115, e 116 (CDRs da cadeia H de J268), respectivamente; (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 117, 118, e 119 (CDRs da cadeia H de J300), respectivamente; (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 120, 121, e 122 (CDRs da cadeia H de J321), respectivamente; (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo a COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 123, 124, e 125 (CDRs da cadeia H de J326), respectivamente; (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 126, 127, e 128 (CDRs da cadeia H de J327), respectivamente; (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1,

2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 129, 130, e 131 (CDRs da cadeia H de J339), respectivamente; (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 132, 133, e 5 134 (CDRs da cadeia H de J344), respectivamente; (b1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 135, 136, e 137 (CDRs da cadeia H de J346), respectivamente;e (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia H de sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 174, 175, e 176 (CDRs da cadeia H de J142), respectivamente.

5. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antíge- no do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno, que compreende uma região variável da cadeia H que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos das seguintes (a1) a (a11), ou um sitio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas, e o sítio de liga- ção a antígeno do segundo polipeptídeo compreende uma região variável da cadeia H que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (b1) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 35 (Região variável da cadeia H de 01); (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 36 (Região variável da cadeia H de 031); (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 37 (Região variável da cadeia H de 064); (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 38 (Região variável da cadeia H de Q85); (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 39 (Região variável da cadeia H de Q153); 5 (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 40 (Região variável da cadeia H de Q354); (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 41 (Região variável da 1O cadeia H de Q360); (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 42 (Região variável da cadeia H de Q405); (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 43 (Região variável da cadeia H de Q458); (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 44 (Região variável da cadeia H de Q460); (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 45 (Região variável da cadeia H de Q499); (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 46 (Região variável da cadeia H de J232); (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 47 (Região variável da cadeia H de J259); (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 48 (Região variável da cadeia H de J268); (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 49 (Região variável da cadeia H de J300); (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 50 (Região variável da 5 cadeia H de J321 ); (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 51 (Região variável da cadeia H de J326); (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região 1O variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 52 (Região variável da cadeia H de J327); (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 53 (Região variável da cadeia H de J339); (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 54 (Região variável da cadeia H de J344); (b1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 55 (Região variável da cadeia H de J346); e (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma região variável da cadeia H de sequência de SEQ ID NO: 172 (Região variável da cadeia H de J142).

6. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os sítios de ligação a antígeno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compre- endem um sítio de ligação a antígeno que compreende as CDRs da cadeia L que consistem em qualquer uma das sequências de aminoácidos seleciona- das das seguintes (c1) a (c10), ou um sítio de ligação a antígeno funcional- mente equivalente a estas: (c1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 138, 139,

e 140 (COR da cadeia L de L2), respectivamente; (c2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 142, e 143 (COR da cadeia L de L45), respectivamente; 5 (c3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 145, e 146 (COR da cadeia L de L248), respectivamente; (c4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147, 148, 1O e 149 (COR da cadeia L de L324), respectivamente; (c5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 150, 151, e 152 (COR da cadeia L de L334), respectivamente; (c6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 153, 154, e 155 (COR da cadeia L de L377), respectivamente; (c7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 156, 157, e 158 (COR da cadeia L de L404), respectivamente; (c8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 159, 160, e 161 (COR da cadeia L de L406), respectivamente; (c9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma CDR1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 137, 138, e 139 (COR da cadeia L de L408), respectivamente; e ( c1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma COR 1, 2, e 3 da cadeia L de sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 178, e 179 (COR da cadeia L de L 180), respectivamente.

7. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os sítios de ligação a antí- geno incluídos no terceiro polipeptídeo e no quarto polipeptídeo compreen- dem um sítio de ligação a antígeno que compreende uma região variável da cadeia L que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (c1) a (c10), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente a estas: (c1) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência 5 de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 56 (região variável da cadeia L de L2); (c2) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 57 (região variável da cadeia L de L45};

1. 1O (c3) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 58 (região variável da cadeia L de L248); (c4) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 59 (região 15 variável da cadeia L de L324); (c5) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L of SEQ ID NO: 60 (região va- riável da cadeia L de L334); (c6) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência 20 de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 61 (região variável da cadeia L de L377); (c7) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 62 (região variável da cadeia L de L404); 25 (c8) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L of SEQ ID NO: 63 (região va- riável da cadeia L de L406); (c9) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 64 (região 30 variável da cadeia L de L408); e (c1 O) um sítio de ligação a antígeno que compreende sequência de aminoácidos da região variável de cadeia L de SEQ ID NO: 173 (região variável da cadeia L de L 180).

8. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os primeiro e segundo poli- peptídeos compreendem ainda uma região constante da cadeia H do anti- 5 corpo, e o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma região cons- tante da cadeia L do anticorpo.

9. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os primeiro e segundo poli- peptídeos compreendem uma região constante da cadeia H do anticorpo, e 1O o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem uma região constante da cadeia L do anticorpo, em que os terceiro e quarto polipeptídeos são uma cadeia L comumente compartilhada. 1 O. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro poli- peptídeo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nas seguintes (d1) a (d6) ou do grupo que consiste nos seguintes (d7) a (d9), e o segundo polipeptídeo compreende uma região constante da cadeia H do anticorpo que consiste em qualquer uma das se- quências de aminoácidos selecionadas de um grupo diferente daquele de o primeiro polipeptídeo mencionado acima: (d1) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 65 (G4k); (d2) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 66 (z7); (d3) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 67 (z55); (d4) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 68 (z106); (d5) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 69 (z118); (d6) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 70 (z121); (d7) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 71 (G4h); (d8) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 72

(z107); e (d9) uma região constante da cadeia H de SEQ ID NO: 73 (z119).

11. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo 5 com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o terceiro e o quarto polipeptídeos compreendem a região constante da cadeia L do anti- corpo que consiste na seguinte sequência de aminoácidos de: (e) uma região constante da cadeia L de SEQ ID NO: 74 (k).

12. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo 1O com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro poli- peptídeo compreende qualquer uma da cadeia H do anticorpo selecionada das seguintes (a1) a (a14), o segundo polipeptídeo compreende qualquer uma da cadeia H do anticorpo selecionada das seguintes (b1) a (b12), e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo compreendem qualquer uma da cadeia L do anticorpo selecionada das seguintes (c1) a (c1 O): (a1) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k); (a2) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 2 (Q31-z7); (a3) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 3 (Q64-z55); (a4) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 10 (Q64-z7); (a5) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k); (a6) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k); (a7) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 13 (Q354-z106); (a8) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k); (a9) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a-

minoácidos de SEQ ID NO: 15 (Q360-z118); (a10) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k); (a11) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (Q458-z106); (a12) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (Q460-z121); (a13) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (Q499-z118); (a14) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (Q499-z121 ); (b1) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 4 (J268-G4h); (b2) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 5 (J321-G4h); (b3) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 6 (J326-z107); (b4) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 7 (J344-z107); (b5) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 21 (J232-G4h); (b6) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 22 (J259-z107); (b7) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 23 (J300-z107); (b8) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 24 (J327-z107); (b9) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 25 (J327-z119); (b1 O) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (J339-z119); (b 11) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (J346-z107); (b12) uma cadeia H do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170 (J142-G4h); (c1) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- 5 minoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2-k); (c2) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 9 (L45-k); (c3) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 28 (L248-k); 1O (c4) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 29 (L324-k); (c5) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 30 (L334-k); (c6) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 31 (L377-k); (c7) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 32 (L404-k); (c8) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 33 (L406-k); (c9) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de a- minoácidos de SEQ ID NO: 34 (L408-k); e (c1 O) uma cadeia L do anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 (L 180-k).

13. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica, caracteriza- da pelo fato de que reconhece o fator IX de coagulação sanguínea e/ou o fator IX de coagulação sanguínea ativado, e reconhece o fator X de coagula- ção sanguínea, em que o sítio de ligação a antígeno do primeiro polipeptídeo compreende um segundo sítio de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia H consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionada das seguintes (a1) a (a11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas, o sítio de ligação a antígeno do se- gundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compre-

ende CDRs de cadeia H consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionada das seguintes (b1) a (b11 ), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas, e os sítios de ligação a antígeno incluídos nos terceiro e quarto polipeptídeos compreendem um sítio 5 de ligação a antígeno que compreende CDRs de cadeia L consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionada das seguintes (c1) a (c1 O), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- 1O cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 75, 76, e 77 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q1de cadeia H), respectivamente; (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 78, 79, e 80 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q31 de cadeia H), respectivamente; (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 81, 82, e 83 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q34 de cadeia H), respectivamente; (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 84, 85, e 86 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q35 de cadeia H), respectivamente; (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 87, 88, e 89 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q153 de cadeia H), respectivamente; (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 90, 91, e 92 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q354 de cadeia H), respectivamente; (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 93, 94, e 95 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q360 de cadeia H), respectivamente; (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 96, 97, e 98 de COR 1, 2, e 3 de ca- deia H (CDRs de Q405 de cadeia H), respectivamente;

(a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 99, 100, e 101 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de 0458 de cadeia H), respectivamente; (a1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- 5 cias de aminoácidos de SEQ ID Nüs: 102, 103, e 104 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de 0460 de cadeia H), respectivamente; . (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID Nüs: 105, 106, e 107 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de 0499 de cadeia H), respectivamente; 1O (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 108, 109, e 11 O de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J232 de cadeia H), respectivamente; (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 111, 112, e 113 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J259 de cadeia H), respectivamente; (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 114, 115, e 116 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J268 de cadeia H), respectivamente; (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID Nüs: 117, 118, e 119 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J300 de cadeia H), respectivamente; (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID Nüs: 120, 121, e 122 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J321 de cadeia H), respectivamente; (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 123, 124, e 125 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J326 de cadeia H), respectivamente; (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 126, 127, e 128 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J327 de cadeia H), respectivamente; (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID Nüs: 129, 130, e 131 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J339 de cadeia H), respectivamente; (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 132, 133, e 134 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J344 de cadeia H), respectivamente; 5 (b10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 135, 136, e 137 de COR 1, 2, e 3 de cadeia H (CDRs de J346 de cadeia H), respectivamente; (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 174, 175, e 176 de COR 1, 2, e 3 de 1O cadeia H (CDRs de J142 de cadeia H), respectivamente; ( c1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 138, 139, e 140 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L2 de cadeia L), respectivamente; (c2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 141, 142, e 143 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L45 de cadeia L), respectivamente; (c3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 144, 145, e 146 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L248 de cadeia L), respectivamente; (c4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 147, 148, e 149 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L324 de cadeia L), respectivamente; (c5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 150, 151, e 152 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L334 de cadeia L), respectivamente; (c6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 153, 154, e 155 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L377 de cadeia L), respectivamente; (c7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 156, 157, e 158 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L404 de cadeia L), respectivamente; (c8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo s~quên-

cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 159,160, e 161 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L406 de cadeia L), respectivamente; (c9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 137, 138, e 139 de COR 1, 2, e 3 de 5 cadeia L (CDRs de L408 de cadeia L), respectivamente; (c1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 177, 178, e 179 de COR 1, 2, e 3 de cadeia L (CDRs de L 180 de cadeia L), respectivamente.

14. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo 1O com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno do primeiro polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antíge- no que compreende uma região variável de cadeia H consistindo em qual- quer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (a1) a (a11), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas, o sítio de ligação a antígeno do segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que compreende uma região variável de ca- deia H consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos sele- cionadas das seguintes (b1) a (b11), ou um sítio de ligação a antígeno fun- cionalmente equivalente às mesmas, e os sítios de ligação a antígeno incluí- dos nos terceiro e quarto polipeptídeos compreendem um sítio de ligação a antígeno que compreende uma região variável de cadeia L consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (c1) a (c1 O), ou um sítio de ligação a antígeno funcionalmente equivalente às mesmas: (a1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 de região variável de cadeia H (região variável de 01 de cadeia H); (a2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 de região variável de cadeia H (região variável de 031 de cadeia H); (a3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 de região variável de cadeia H

(região variável de Q64 de cadeia H); (a4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 de região variável de cadeia H (região variável de Q85 de cadeia H); 5 (a5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 de região variável de cadeia H (região variável de Q153 de cadeia H); (a6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 de região variável de cadeia H 1O (região variável de Q354 de cadeia H); (a7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 de região variável de cadeia H (região variável de Q360 de cadeia H); (a8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 de região variável de cadeia H (região variável de Q405 de cadeia H); (a9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 de região variável de cadeia H (região variável de Q458 de cadeia H); (a10) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 de região variável de cadeia H (região variável de Q460 de cadeia H); (a11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 de região variável de cadeia H (região variável de Q499 de cadeia H); (b1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 de região variável de cadeia H (região variável de J232 de cadeia H); (b2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 de região variável de cadeia H (região variável de J259 de cadeia H); (b3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se-

quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 de região variável de cadeia H (região variável de J268 de cadeia H); (b4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 de região variável de cadeia H 5 (região variável de J300 de cadeia H); (b5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 de região variável de cadeia H (região variável de J321 de cadeia H); (b6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- 1O quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 de região variável de cadeia H (região variável de J326 de cadeia H); (b7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 de região variável de cadeia H (região variável de J327 de cadeia H); (b8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 de região variável de cadeia H (região variável de J339 de cadeia H); (b9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 de região variável de cadeia H (região variável de J344 de cadeia H); (b1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 de região variável de cadeia H (região variável de J346 de cadeia H); (b11) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172 de região variável de cadeia H (região variável de J142 de cadeia H); (c1) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 de região variável de cadeia L (região variável de L2 de cadeia L); (c2) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 de região variável de cadeia L (região variável de L45 de cadeia L);

(c3) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 de região variável de cadeia L (região variável de L248 de cadeia L); (c4) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- 5 quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 de região variável de cadeia L (região variável de L324 de cadeia L); ( c5) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 de região variável de cadeia L (região variável de L334 de cadeia L); (c6) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 de região variável de cadeia L (região variável de L377de cadeia L); (c7) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 de região variável de cadeia L (região variável de L404 de cadeia L); (c8) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 de região variável de cadeia L (região variável de L406 de cadeia L); (c9) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 de região variável de cadeia L (região variável de L408 de cadeia L); e (c1 O) um sítio de ligação a antígeno compreendendo uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 de região variável de cadeia L (região variável de L 180 de cadeia L).

15. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que os primeiro e segundo polipeptídeos compreendem uma região constante de cadeia H de anticorpo e os terceiro e quarto polipeptídeos compreendem uma região constante de cadeia L de anticorpo.

16. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que os primeiro e segun- do polipeptídeos compreendem uma região constante de cadeia H de anti-

corpo e os terceiro e quarto polipeptídeos compreendem uma região cons- tante de cadeia L de anticorpo e, em que os terceiro e quarto polipeptídeos são uma cadeia L comumente compartilhada.

17. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo 5 com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro poli- peptídeo compreende uma região constante de cadeia H de anticorpo con- sistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionadas das seguintes (d1) a (d6), ou o grupo consistindo nas seguintes (d7) a (d9), o segundo polipeptídeo compreende uma região constante de cadeia H de 1O anticorpo consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos se- lecionadas de um grupo diferente daqueles do primeiro polipeptídeo supraci- tados e os terceiro e quarto polipeptídeos compreendem uma região cons- tante de cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos (e) a seguir: (d1) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 65 (G4k); (d2) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 66 (z7); (d3) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 67 (z55); (d4) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 68 (z106); (d5) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 69 (z118); (d6) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 70 (z121); (d7) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 71 (G4h); (d8) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 72 (z107); e (d9) uma região constante de cadeia H de SEQ ID NO: 73 (z119);e (e) uma região constante de cadeia L de SEQ ID NO: 74 (k).

18. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro poli- peptídeo compreende uma cadeia H de anticorpo das seguintes (a1) a (a14),

o segundo polipeptídeo compreende uma cadeia H de anticorpo das seguin- tes (b1) a (b12), e os terceiro e quarto polipeptídeos compreendem qualquer uma das cadeias L de anticorpo das seguintes (c1) a (c1 O): (a1) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (Q1-G4k); (a2) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (Q31-z7); (a3) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (Q64-z55); 1O (a4) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 O (Q64-z7); (a5) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (Q85-G4k); (a6) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (Q153-G4k); (a7) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (Q354-z106); (a8) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (Q360-G4k); (a9) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (Q360-z118); (a10) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 (Q405-G4k); (a11) uma cadeia H de anticorpo -consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (Q458-z106); (a12) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (Q460-z121); (a13) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (Q499-z118); (a14) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (Q499-z121); (b1) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (J268-G4h); (b2) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (J321-G4h); (b3) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (J326-z107); (b4) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (J344-z107); (b5) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (J232-G4h); 1O (b6) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (J259-z107); (b7) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (J300-z107); (b8) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 (J327-z107); (b9) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (J327-z119); (b1 O) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (J339-z119); (b11) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (J346-z107); (b12) uma cadeia H de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170 (J142-G4h); ( c1) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (L2-k); (c2) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (L45-k); (c3) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (L248-k); (c4) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (L324-k); (c5) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (L334-k); (c6) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (L377-k); (c7) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de 5 aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (L404-k); (c8) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (L406-k); ( c9) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (L408-k); and 1O ( c1 O) uma cadeia L de anticorpo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 (L180-k).

19. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizada pelo fato de que o primeiro poli- peptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a um epíto- po que se sobrepõe ao epítopo que se liga a um anticorpo que consiste da cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e a cadeia L do anti- corpo de qualquer uma das (c1) a (c1 O), como definida na reivindicação 12 ou 18, e o segundo polipeptídeo compreende um sítio de ligação a antígeno que se liga a um epítopo que se sobrepõe que se liga a um anticorpo que consiste na cadeia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e a ca- deia L do anticorpo de qualquer uma de (c1) a (c1 O), como definida na rei- vindicaç~o 12 ou 18.

20. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 9, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende qualquer uma cadeia H do anticorpo, selecionada das seguintes (e1) a (e3), o segundo polipeptídeo compreende qualquer ca- deia H do anticorpo selecionada das seguintes (f1) a (f3), e os terceiro e quarto polipeptídeos compreendem qualquer cadeia L do anticorpo selecio- nada do grupo das seguintes (g1) a (g4): (e1) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L de qualquer uma de (c1) a (c10), conforme definida na reivindicação 12 ou 18; (e2) uma cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo do aminoácido selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 34, 35, 49, 61, 62, 96, 98, 100, 100b, e 102 por numeração de Kabat em qual- 5 quer uma cadeia H do anticorpo selecionada de (e1) é substituído com outro aminoácido; (e3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 34 é a isoleucina, o resíduo de a- minoácido na posição 35 é a asparagina, glutamina, ou serina, o resíduo de 1O aminoácido na posição 49 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 61 é a arginina, o resíduo de aminoácido na posição 62 é o ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 96 é a serina ou a treonina, o resíduo de aminoácido na posição 98 é lisina ou a arginina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é fenilalanina ou tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 1 OOb é glicina, ou o resíduo de aminoácido na posição 102 é tirosina em qualquer cadeia H do anticorpo selecionada de (e1 ); (f1) uma cadeia H de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) conforme definida na reivindicação 12 e uma cadeia L do anticorpo de qualquer um de (c1) a (c1 O) como definida na reivindicação 12 ou 18; (f2) urna cadeia H do anticorpo, em que pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de os resíduos de aminoácidos nas posições 35, 53, 73, 76, 96, 98, 100, e 1 OOa por numeração de Kabat em qualquer cadeia H do anticorpo de (f1) é substituída com outro aminoácido; (f3) uma cadeia H do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 35 é ácido aspártico, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 73 a lisina, o resíduo de aminoácido na posição 96 é glicina, o resíduo de aminoácido na posição 96 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 98 é tirosina, o resíduo de aminoácido na posição 100 é tirosina, ou o resíduo de aminoácido na posição 1 OOa é histidina em qualquer cadeia H do anticorpo selecionada de (f1 ); (g1) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca~ deia H do anticorpo de qualquer uma de (a1) a (a14) e uma cadeia L do anti- 5 corpo de qualquer uma de (c1) a (c10), como definida na reivindicação 12 ou 18; (g2) uma cadeia L de um anticorpo que se liga a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ligado por um anticorpo que consiste em uma ca- deia H do anticorpo de qualquer uma de (b1) a (b12) e uma cadeia L do anti- 1O corpo de qualquer uma de (c1) a (c1 O), conforme definida na reivindicação 12; (g3) uma cadeia L do anticorpo, em que pelo menos um resíduo de aminoácido é selecionado dos resíduos de aminoácidos nas posições 27, 30, 31, 32, 50, 52, 53, 54, 55, 92, 93, 94, e 95 pela numeração de Kabat na cadeia L do anticorpo ou de (g1) ou de (g2) é substituída com outro aminoá- cido; e (g4) uma cadeia L do anticorpo, em que pela numeração de Ka- bat, o resíduo de aminoácido na posição 27 é lisina ou arginina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na posição 31 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 32 é glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 50 é arginina ou glutamina, o resíduo de aminoácido na posição 52 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 53 é arginina, o resíduo de aminoácido na posição 54 é lisina, o resíduo de a- minoácido na posição 55 é ácido glutâmico, o resíduo de aminoácido na po- sição 92 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 93 é serina, o resíduo de aminoácido na posição 94 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posi- ção 95 é prolina, ou o resíduo de aminoácido na posição 95 é prolina na ca- deia L do anticorpo de ou (g1) ou (g2);

21. Molécula de ligação a antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a molécula de ligação a antígeno multiespecífica é um anticorpo multiespecí- fico.

22. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de ser de a- cordo com qualquer um de (a) a (u): (a) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- 5 noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilha- da da SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo biespecífico (Q1-G4k/J268-G4h/L45-k),em que 1O o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidosde SEQ ID N0:5, e o terceiro polipep- tídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente compartilhada de SEQ ID NO: 9; (c) um anticorpo biespecífico (Q31-z7/J326-z107/L2-k),em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 2, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consis- te na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L são comumente compartilhada de SEQ ID NO: 8; (d) um anticorpo biespecífico (Q64-z55/J344-z107/L45-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o segundo peptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o terceiro poli- peptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia Lda SEQ ID NO: 9; (e) um anticorpo biespecífico (Q64-z7/J326-z107/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na segunda de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 6, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (f) um anticorpo biespecífico (Q64-z7/J344-z107/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 5 lhada de SEQ ID NO: 33; (g) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J268-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e o terceiro 1O polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; (h) um anticorpo biespecífico (Q85-G4k/J321-G4h/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (i) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J232-G4h/L406-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; U) um anticorpo biespecífico (Q354-z106/J259-z107/L324-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 29; (k) um anticorpo biespecífico (Q360-G4k/J232-G4h/L406-k),em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 33; (I) um anticorpo biespecífico (Q360-z118/J300-z107 /L334-k), em 5 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (m) um anticorpo biespecífico (Q405-G4k/J232-G4h/L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 28; (n) um anticorpo biespecífico (Q458-z106/J346-z107/L408-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 34; (o) um anticorpo biespecífico (Q460-z121/J327-z119/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 30; (p) um anticorpo biespecífico (Q499-z118/J327-z107/L334-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti-

. '

r

29/31 lhada de SEQ ID NO: 30; (q) um anticorpo biespecífico (Q499-z118/J327-z107/L377-k), em que o primeíro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 5 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 31; (r) um anticorpo biespecífico (Q499-z118/J346-z107/L248-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de 1O aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 28; (s) um anticorpo biespecífico (Q499-z121/J327-G4h/L404-k), em 15 que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste nã sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 32; 20 (t) um anticorpo biespecífico (Q499-z121/J339-z119/L377-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- 25 lhada de SEQ ID NO: 31; e (u) um anticorpo biespecífico (Q153-G4k/J142-G4h/L 180-k), em que o primeiro polipeptídeo é uma cadeia H que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o segundo polipeptídeo é uma cadeia H 30 que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170, e o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo são uma cadeia L comumente comparti- lhada de SEQ ID NO: 171.

,, ' ,. 30/31

23. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a mo- lécula de ligação a antígeno multiespecífica, como definida em qualquer um • das reivindicações 1 a 21, ou o anticorpo biespecífico, corno definido na rei- vindicação 22. 5

24. Vetor, caracterizado pelo fato de que é inserido com o ácido nucleico, como definido na reivindicação 23.

25. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 23 ou o vetor, como definido na reivindicação 24. 10

26. Método para produzir a molécula de ligação a antígeno mul- tiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou o anticorpo biespecífico, como definido na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser por cultivo da célula, como definida na reivindicação 25.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que 15 compreende a molécula de ligação a antígeno multiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou o anticorpo biespecífico, co- mo definido na reivindicação 22, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

28. Uso da molécula de ligação a antígeno multiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do anticorpo biespecífi- 20 co, como definido na reivindicação 22, ou da composição, como definida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um a- gente para prevenção e/ou tratamento de hemorragia, uma doença que a- companha hemorragia, ou uma doença causada por hemorragia.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fa- 25 to de que a hemorragia, a doença que acompanha hemorragia, ou a doença causada por hemorragia é uma doença que se desenvolve e/ou progride devido ao decréscimo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea e/ou fator VIII de coagulação sanguínea, ativado.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fa- 30 to de que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decrésci- mo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea e/ou fator VIII de coagulação sanguínea, ativado, é hemofilia A.

I • 31/31

31. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fa- to de que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decrésci- •• • • • mo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea e/ou • fator VIII de coagulação sanguínea, ativado, é uma doença que mostra e- 5 mergência de um inibidor contra o fator VIII de coagulação sanguínea e/ou fator VIII de coagulação sanguínea ativado.

32. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fa- to de que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decrésci- mo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea e/ou 1O fator VIII de coagulação sanguínea ativado é hemofilia adquirida.

33. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fa- to de que a doença que se desenvolve e/ou progride devido a um decrésci- mo ou deficiência da atividade do fator VIII de coagulação sanguínea e/ou fator VIII de coagulação sanguínea ativado é doença de von Willebrand. 15

34. Kit para uso de acordo com o uso, como definido em qual- quer uma das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que com- preende pelo menos a molécula de ligação a antígeno multiespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou o anticorpo específi- co, como definido na reivindicação 22, ou a composição, como definida na 20 reivindicação 27.

35. Invenção, caracterizada por quaisquer formas de suas con- cretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exem- plo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.