KR20240035625A - Siglec-15를 위한 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Siglec-15를 위한 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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댈러스 벤자민 플라이스
솔로몬 랭거만
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넥스트큐어 인코포레이티드
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Abstract

Siglec-15 결합 분자가 제공된다. 상기 분자는 전형적으로 Siglec-15에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. Siglec-15 리간드-결합 분자가 또한 제공된다. 분자는 전형적으로 Siglec-15 폴리펩타이드 또는 융합 단백질이다. Siglec-15 매개된 면역억제의 감소를 필요로 하는 대상체에서 Siglec-15 매개된 면역억제를 감소시키기 위해서 분자를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

SIGLEC-15를 위한 항체 및 이의 사용 방법{ANTIBODIES FOR SIGLEC-15 AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/500, 578호, 2017년 1월 27일자 출원된 제62/451,271호 및 2017년 9월 21일자로 출원된 제62/397,794호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이들 모두는 허용되는 경우 이들의 전문이 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 면역조정, 보다 특별하게는 Siglec-15 및 이로부터 개시되는 신호전달을 조정하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
시알산-결합 Ig-유사 렉틴(Sialic acid-binding Ig-like lectin: "Siglec")은 Ig 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이러한 1형 막관통 단백질은 시알산-결합 N-말단 V-세트 도메인, 가변적인 수의 C2-세트 Ig 도메인, 막관통 영역 및 사이토솔 꼬리를 포함하고, 세포-표면 당접합체의 말단 영역에 부착된 시알산에 특이적으로 결합한다. Siglec의 2개의 1차 하위세트가 식별되었는데: 하나의 하위세트는 인간에서는 CD-33 및 CD33-관련된 Siglec, 예컨대, Siglec-5, -6, -7, -8, -9, 10, -11, -14 및 -16을 포함하고, 마우스에서는 CD33 및 Siglec-E, -F, -G 및 -H를 포함한다(Crocker and Redelinghuys, Biochemical Society Transactions, 36 (6):1467-1471 (2008)). 제2 하위세트는 Sn(시알로어드헤신(sialoadhesin))(siglec-1), CD22(siglec-2), MAG(미엘린-연관된 당단백질)(siglec-4) 및 siglec-15로 만들어지며, 이들 모두는 포유동물에서 잘 보존된다. 신경계에서 발현되는 MAG를 제외하고, Siglec는 백혈구의 다양한 하위세트 상에서 별도로 발현되는데, 여기서 이들은 면역 및 염증성 반응의 양성 및 음성 조절에서 역할을 한다(McMillan and Crocker, Carbohydr. Res., 343:2050-2056 (2008) 및 Crocker, et al., Nat. Rev. Immunol., 7:255 266 (2007)).
연구는, 다수의 Siglec가 면역 세포 상에서 발현되고, 면역억제성 특성을 갖는다는 것을 나타낸다. 그러나, Siglec-15를 비롯한, Siglec의 하위세트는 12kD의 신호 어댑터 분자 DNAX 활성화 단백질(DAP12)과 연관되는데, 이것은 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖고, 면역 세포 활성화와 관련된다(Takamiya, et al., Glycobiology, 23(2):178-87 (2013)). Siglec-15는 비장 및 림프절의 대식세포 및 수지상 세포 상에서 특이적으로 발현되고, sTn 항원을 우세하게 인식한다(Angata, et al., Glycobiology, 17(8):838-46 (2007) Epub 2007 May 4.). sTn을 과발현하는 H157 세포(H157/ST6GalNAc-I)는 Siglec-15-발현 M-CSF-유도된 대식세포로부터 TGF-β의 분비를 자극하였다(Takamiya, et al., Glycobiology, 23(2):178-87 (2013)). 추가로, THP-1 세포로부터의 TGF-β의 분비는, Siglec-15-DAP12 유도된 신호전달뿐만 아니라 하나 이상의 DAP12-독립적, Sky-의존적, 또는 가능하게는 Sky-독립적 경로에 적어도 부분적으로 의존적일 수 있는 방식으로, 각각 THP-1 세포에서의 Siglec-15의 과발현 및 H157 세포에서의 ST6GalNAc-I(sTn 구조의 생합성에 책임이 있는 효소)의 과발현에 의해서 향상된다. TGF-β는 종양 세포, 및 대식세포를 비롯한 종양-침윤성 백혈구 둘 모두에 의해서 생산되고, 예를 들어, 종양 세포 침습을 향상시킴으로써 그리고 면역 세포의 기능을 저해함으로써, 종양 진행 및 전이에 기여한다(Flavell, et al., Nat Rev Immunol, 10:554-567 (2010)). 이러한 데이터는, Siglec-15에 의한 종양-연관된 sTn의 인식이 골수 세포로부터의 TGF-β 생산을 향상시키고, 결국 종양 세포에 이로운 종양 미세환경을 변형시키는 신호 전달 경로의 DAP12-Syk 경로를 활성화시킨다는 것을 나타낼 수 있다(Takamiya, et al., Glycobiology, 23(2):178-87 (2013)). Siglec 15는 이의 세포질 도메인 내에 전형적인 ITIM 도메인(SNYENL(서열번호 191))을 갖는다. 이의 기능은 특징규명되도록 유지된다.
그러나, Siglec-15 및 그로부터 개시된 신호전달을 조정하기 위한 툴 및 기술에 대한 필요성이 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 Siglec-15를 검출 및 조정하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 Siglec-15 및 이로부터 개시된 신호전달을 조정하여 면역 반응을 증가시키거나 또는 면역 억제를 감소 또는 반전시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 파골세포 분화를 조정하여 골 재흡수를 감소시키거나 골 형성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 Siglec-15 및 이로부터 개시된 신호전달을 조정함으로써 질환 및 장애를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
Siglec-15 결합 분자가 제공된다. 상기 분자는 전형적으로 Siglec-15에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 Siglec-15 결합 분자는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 상기 CDR은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드, 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 3개의 경쇄 CDR, 및 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드, 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체의 3개의 중쇄 CDR을 포함하되, 여기서 Siglec-15 결합 분자는 Siglec-15에 결합한다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 본 명세서에서 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A라 지칭되는 마우스 항-인간 단클론성 항체 중 하나의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 본 명세서에서 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A라 지칭되는 마우스 항-인간 단클론성 항체 중 하나의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역(들)을 포함한다.
일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는,
(I) 세포(바람직하게는 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나;
(II) 내생 농도로 세포(바람직하게는 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나;
(III) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하고, 그리고 Siglec-15(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2 등)와, Neu5Acα2-6GalNAcα, LRRC4C, Siglec-15-반대-수용체(S15-CR) 또는 이들의 조합물 간의 결합을 조정하거나;
(IV) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하고, 그리고 TGF-β 분비를 감소시키거나, 예방하거나 또는 저해하거나;
(V) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나; 또는
(IV) 이들의 조합이다.
Siglec-15를 내인성으로 발현하는 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 암 세포를 포함한다.
Siglec-15 결합 분자는 면역글로불린 불변 영역(Fc)으로부터의 하나 이상의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 불변 도메인은 인간 불변 도메인, 예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 IgG 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 도메인이다. Siglec-15 결합 분자는 검출 가능하게 표지될 수 있거나, 또는 접합된 독소, 약물, 수용체, 효소, 수용체 리간드를 포함한다. Siglec-15 결합 분자는 단클론성 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 단일 쇄 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다.
일 실시형태는 서열번호 195, 197, 199, 201 또는 209의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 경쇄를 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 203, 206 또는 207의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄를 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 195, 197, 199, 201 또는 209의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 경쇄 및 서열번호 203, 206 및 207의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄를 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공한다.
일 실시형태는 서열번호 209, 195, 207, 199 또는 201의 경쇄 CDR 및 서열번호 203, 206 또는 207의 중쇄 CDR 및 이들의 조합물을 갖는 항체를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 209, 210 또는 211에 따른 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 212, 213, 215 또는 216에 따른 중쇄 아미노 서열을 갖는 항체를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 209, 210 또는 211에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 212, 213, 215 또는 216에 따른 중쇄 아미노 서열을 갖는 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 분자가 감소된 Fc 수용체(FcR) 결합 활성도를 나타내거나 또는 결합 활성도를 나타내지 않도록 변형된다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 향상된 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC) 활성도를 나타내도록 변형된다.
일 실시형태는 서열번호 193 또는 194와 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 융합 단백질을 제공한다.
Siglec-15 결합 분자 및 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 리간드 및/또는 이의 반대-수용체에 대한 Siglec-15의 결합을 감소시키거나 예방하거나, Siglec-15-매개된 신호 전달을 감소시키거나 예방하거나, 또는 이들의 조합이다. 리간드는 시알릴화된 당단백질일 수 있다. 리간드는 종양 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 하기 예는 류신-풍부 반복부-함유 단백질 4C(LRRC4C)가 Siglec-15에 대한 리간드이고, 암 세포에 의해서 발현될 수 있음을 나타낸다. Siglec-15-반대-수용체는 또한 면역 세포, 예컨대, T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고, 이것은 Siglec-15에 의해서 결속되는 경우 T 세포 저해로 이어진다.
치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 전형적으로, 방법은 대상체에게, 예를 들어, 약제학적 조성물 중의 유효량의 Siglec-15 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 길항성 Siglec-15 결합 분자는 면역 반응을 증가시키거나, 종양 성장을 지연시키거나 예방하거나, 종양-매개된 면역 억제를 저해하거나, 종양을 제거하거나, 활성도를 변경하도록 종양-연관된 대식세포(TAM)의 활성도를 고갈시키거나 차단하거나, TAM-매개된 면역 억제를 감소시키거나, T 세포 억제를 감소시키거나 반전시키거나, T 세포 증식을 증가시키거나 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 암 또는 종양은 Siglec-15를 발현하는 대식세포를 포함한다. Siglec-15 결합 분자는 대상체에게 유효량으로 투여되어 대식세포에 의한 TGF-β의 발현 및/또는 분비를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암 또는 감염성 질환을 갖는다. 암은 Siglec-15의 리간드를 발현 또는 과발현하는 세포를 포함할 수 있다.
대상체에게 유효량의 길항성 Siglec-15 결합 분자를 투여함으로써 파골세포 분화를 감소시키는 방법, 골 재흡수를 감소시키는 방법, 골 형성을 증가시키는 방법, 및 이들의 조합이 또한 제공된다.
일부 실시형태에서, 효능적 Siglec-15 결합 분자는 면역 반응을 감소시키거나, T 세포 억제를 증가시키거나 향상시키거나, T 세포 증식을 증가시키거나 또는 이들의 조합이다. Siglec-15 결합 분자는 대상체에게 유효량으로 투여되어 대식세포에 의한 TGF-β의 발현 및/또는 분비를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 염증, 자가면역 질환을 갖거나, 또는 이식 수령인이다.
일부 실시형태는 상체에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
검출 및 진단 방법이 또한 제공된다. 검출 및 진단 방법 중 임의의 것은 치료 방법과 결합될 수 있다. 예를 들어, 질환, 장애 또는 감염의 검출 또는 진단 방법은 (a) 개시된 Siglec-15 결합 분자를 사용하여 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계, 및 (b) Siglec-15의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하되, 대조군 수준과 비교하여 Siglec-15의 검정된 수준의 증가는 질환, 장애 또는 감염을 나타낸다.
질환, 장애 또는 감염의 진행을 모니터링하는 방법은, (a) 개시된 Siglec-15 결합 분자를 사용하여 제1 시점 및 추후 시점에서 수득된 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 제1 시점 및 추후 시점에서 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현의 수준을 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 제1 시점과 비교된 추후 시점에서의 Siglec-15의 검정된 수준의 증가는 질환, 장애 또는 감염의 진행을 나타낸다.
(a) 개시된 Siglec-15 결합 분자를 사용한 치료 전 및 후에 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 시간에 걸쳐서 Siglec-15의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해서 치료 전 Siglec-15의 수준과 비교된 치료 후 Siglec-15의 검정된 수준의 감소는 치료에 대한 선호되는 반응을 나타내는, 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법이 제공된다.
도 1은 2마리의 면역화된 Siglec-15 넉아웃 마우스 및 2마리의 비-면역화된 Siglec-15 넉아웃 마우스의 혈장 항체 역가를 나타낸 곡선.
도 2a 내지 도 2c는 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B, 및 105A의 서열 경쇄 가변 영역을 나타내고, 제1(2a), 제2(2b), 및 제3(2c) 상보성 결정 영역(CDR)을 강조한 정렬.
도 3a 내지 도 3c는 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B, 및 105A의 서열 중쇄 가변 영역을 나타내고, 제1(3a), 제2(3b), 및 제3(3c) 상보성 결정 영역(CDR)을 강조한 정렬.
도 4A는 인간 또는 마우스 Siglec-15-발현 세포에 대한 항-Siglec-15 항체의 직접 결합을 측정하기 위한 검정의 다이어그램. 도 4B(1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9) 및 도 8c(6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 및 105A(NC105))는 도 4A에 도시된 검정에서 Siglec-15-발현 세포에 대한 항-Siglec-15 항체(% 양성 세포)의 결합을 나타낸 막대 그래프. 도 4C는 포말린-고정된 Siglec-15-발현 세포에 대한 항-Siglec-15 항체(1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 및 105A(NC105))(% 양성 세포)의 결합을 나타낸 막대 그래프.
도 5A 내지 도 5B는 K562.hS15 세포(9A, 배경 결합 차감) 및 293T.mS15 세포(9B)에 대한 정제된 1C12, 8H8, 5G12, 3H10, 9A5, 6F8, 8C8, 1H3, 10G9, 1B2, 및 1C3 Ab 결합을 나타낸 선 그래프(1차 항체 농도(㎍/㎖)의 함수로서의 평균 형광 강도(MFI)). 도 5C는 293T.mS15에 상대적인 K562.hS15 세포에 대한 정제된 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9 Ab의 점 플롯 결합(MFI).
도 6A는 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 및 10G9 Ab 각각에 의해서 검출된 hS15+ U87 세포의 백분율을 나타낸 막대 그래프. 도 6B는 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 및 10G9 Ab 각각에 의해서 검출된 hS15+ U87 세포의 MFI를 나타낸 막대 그래프. 도 6C는 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9 Ab 각각에 의해서 검출된 S15+ U87 세포의 백분율을 나타낸 막대 그래프.
도 7A는 항체 차단 검정을 도시한 도면. 리간드 LRRC4C를 발현하는 293T 세포를 가용성 수용체(hS15.hG1) 및 항-S15 항체로 처리하고, 그 다음 결합된 수용체를 PE-항-hFc 항체로 검출한다. 도 7B는 hS15.hG1-1 및 10G9, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 1B2, NC1, NC5, NC728A(NC28), NC38, NC41, NC53, 63A(NC63), NC73, NC74, NC76, 77A(NC77), 82B(NC82), NC84, NC87, NC90, 92A(NC92), CI3-33, CI1-33) 항체에 대한 hS15.G1 결합의 %를 나타낸 막대 그래프. 도 7C는 대조군 mAb, 및 1B2, 1C3, 1H3, 8H8, 6F8, 8C8, 9A5, 1C12, 3H10, 10G9, 및 5G12 항체에 대한 S15/LRRC4C의 차단(%)을 나타낸 막대 그래프. 도 7D는 1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9에 대한 S15/LRRC4C의 차단(%)을 나타낸 막대 그래프. 도 7E는 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 및 105A(NC105))에 대한 S15/LRRC4C의 차단(%)을 나타낸 막대 그래프.
도 8a는 T 세포 억제 검정의 다이어그램. 도 8b 및 도 8c는 CD8+ T 세포(12B)와 CD4+ T 세포(12C)로 분할하고, 항체 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 및 10G9에 대한 hS15.hG1를 사용하여(예를 들어, +hS15.hG1)(각각의 쌍의 좌측 막대) 수행된 검정 및 hS15.hG1을 사용하지 않고(예를 들어, -hS15.hG1)(각각의 쌍에서 우측 막대) 수행된 검정을 비교한 %로서의 인간 T 세포의 hS15.hG1-매개된 억제의 S15 mAb 반전을 나타낸 막대 그래프. 도 8d 내지 8g는 항체 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9(도 8d 및 12E) 및 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 및 105A(NC105)(도 8f 및 8g)에 대해서, hS15.hG1을 사용하여 수행된 검정에 대해서 CD8+ T 세포(도 8d 및 8F)와 CD4+ T 세포(도 8e 및 도 8g)로 분할된 %로서의 인간 T 세포의 hS15.hG1-매개된 억제의 S15 mAb 반전을 나타낸 막대 그래프. 도 8h 및 도 8i는 % hS15_LRRC4C 차단 활성도의 함수로서의 CD8 T 세포 증식을 나타낸 점 플롯.
도 9A는 INFγ 분비에서의 변경을 측정하기 위한 검정의 다이어그램. 도 9B는 항체 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 및 10G9에 대한, 도 13A에 다이어그램으로 표현된 검정의 결과를 나타낸 막대 그래프.
도 10은 하기 2가지 방식으로 단핵구가 농축되고, 단리된 새로운 PBMC의 파골세포 형성 검정에서 항체 1C12, 8H8, 5G12, 3H10, 9A5, 6F8, 8C8, 1H3, 10G9, 1B2, 및 1C3의 존재 하에서 TRAP(타트레이트-내성 산 포스파타제)(Abs 540㎚)를 나타낸 막대 그래프: MACS 칼럼 분류(좌측 패널) 또는 무혈청 배지 중의 플라스틱에 대한 부착(우측 패널).
도 11은 Siglec-15(S15):Siglec-15-반대-수용체(S15-CR)를 포함하는 종양 미세환경(TME)에서의 면역의 Siglec-15 음성 조절 >>> 증식 및 사이토카인, 및/또는 Siglec-15:LRRC4C의 T 세포 지시된 저해 >>> TME에서 TGF-β 및 면역 억제의 대식세포 생산에 대한 모델을 도시한 다이어그램. 다이어그램은 Siglec-15 및 이의 리간드의 골수 세포, T 세포, 및 암 세포 발현 및 이로부터의 신호전달, 뿐만 아니라 분자 항-Siglec-15(차단 및 표적화) 및 LRRC4C 항체 및 Siglec-15 융합 단백질(비-가교결합/차단) 간의 상호작용을 나타낸다.
도 12A는 인간화된 5G12 가변 경쇄 L1-L5의 아미노산 서열을 나타낸 표. 도 12B는 인간화된 5G12 가변 중쇄 H1-H3의 아미노산 서열을 나타낸 표.
도 13A는 뮤린 VL에 대한 인간화된 5G12 가변 경쇄 VL1-Vl5의 서열 정렬을 나타낸 도면. 도 13B는 인간화된 5G12 가변 중쇄 VH1-VH3의 서열 정렬을 나타낸 도면.
도 14A는 T 세포의 % 증식은 S15 Fc의 농도가 증가함에 따라 감소한다는 것을 보여주는 T 세포의 % 증식 대 인간 S15 Fc(㎍/㎖)의 선 그래프. 도 14B는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 IFN-γ의 pg/㎖의 막대 그래프. 도 14C는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 TNF-α의 pg/㎖의 막대 그래프. 도 14D는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 IL-6의 pg/㎖의 막대 그래프.
도 15A 및 도 15B는 인간 S15 또는 마우스 S15를 발현하는 세포에 대한 하이브리도마로부터 정제된 S15 mAb의 결합에 대한 양성 세포의 백분율을 나타낸 막대 그래프.
도 16A 및 도 16B는 제시된 항체로 처리된 분할된 CD8+ T 세포의 백분율의 막대 그래프. 도 16C 및 도 16D는 제시된 항체로 처리된 분할된 CD4+ T 세포의 백분율의 막대 그래프.
도 17A 및 17B는 5G12로 처리된 동물에서 종양 세포 접종 후 생존 백분율 대 일 수를 나타낸 선 그래프. 도 17C는 체중 증가 백분율 대 ID8.OVA 접종 후 일 수의 선 그래프.
도 18은 체중 증가 백분율 대 ID8.OVA 접종 후 일 수의 선 그래프.
도 19A는 제시된 항체와 함께 인간 M-CSF 및 인간 RANKL의 존재 하에서 96-웰 플레이트에서 시딩한 후 미테니이(Mitenyi) 단핵구 자성 비드를 사용하여 인간 PBMC로부터 수거된 인간 CD14+ 단핵구를 나타낸 개략적인 다이어그램. 도 19B는 1H3으로 제시된 바와 같이 처리된 파골세포를 나타낸 현미경 사진. 도 19C는 타트레이트-내성 산 포스포타제 분석을 위해서 7일 후에 수집된 상청액의 흡광도 540㎚의 막대 그래프.
도 20은 INF-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A 및 TNF-α에 대한 사이토카인(pg/㎖)을 나타낸 막대 그래프.
도 21은 제시된 항체와 함께 RANKL의 존재 하에서 배양된 마우스 RAW 264.7 대식세포 세포의 흡광도 540㎚의 막대 그래프.
도 22는 1H3 가변 경쇄의 예시적인 인간화된 아미노산 서열의 비교를 나타낸 도면.
도 23은 1H3 가변 중쇄의 예시적인 인간화된 아미노산 서열의 비교를 나타낸 도면.
도 24는 Siglec-15에 대한 제안된 작용 모두의 도면.
도 25A는 M2 대식세포가 Siglec-15를 발현한다는 것을 나타내는 계수치 대 Siglec-15 PE의 FACS 히스토그램. 도 25B는 M1 대식세포에 대한 계수치 대 Siglec-15 PE의 FACS 히스토그램. 도 25C는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)로 처리된 마우스 골수-유래 골수 세포에 대한 계수치 대 Siglec-15 PE의 FACS 히스토그램. 도 25D는 M-CSF 및 인터류킨-10(IL-10)으로 처리된 마우스 골수-유래 골수 세포에 대한 계수치 대 Siglec-15 PE의 FACS 히스토그램. 도 25E는 M-CSF 또는 M-CSF + IL10로 처리되고, 아이소타입-PE(회색 박스) 또는 항-Siglec-15 PE로 염색된 마우스 골수-유래 골수 세포에 대한 MFI-PE의 막대 그래프.
도 26A는 Siglec-15 Fc(농도 지점의 좌측 칼럼) 또는 가용성 Siglec-15(각각의 농도 지점의 우측 칼럼)로 코팅된 플레이트에 시딩된 공여자 #1603으로부터의 인간 CD14+ 단핵구로부터의 상청액에 대한 흡광도 450㎚의 막대 그래프. 도 26B는 Siglec-15 Fc(농도 지점의 좌측 칼럼) 또는 가용성 Siglec-15(각각의 농도 지점의 우측 칼럼)로 코팅된 플레이트에 시딩된 공여자 #1704으로부터의 인간 CD14+ 단핵구로부터의 상청액에 대한 흡광도 450㎚의 막대 그래프. 도 26C는 공여자 #1603으로부터의 세포에 대한 TNF-α(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프. 도 26D는 공여자 #1603으로부터의 세포에 대한 IL-6(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프. 도 26E는 공여자 #1603으로부터의 세포에 대한 IL-1β(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프. 도 26F는 공여자 #1704로부터의 세포에 대한 TNF-α(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프. 도 26G는 공여자 #1704로부터의 세포에 대한 IL-6(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프. 도 26H는 공여자 #1704로부터의 세포에 대한 IL-1β(pg/㎖) 대 Siglec-15 Fc(㎍/㎖)의 막대 그래프.
도 27A는 실시예 19에 대한 실험 프로토콜의 다이어그램. 도 27B는 항-CD3/CD28 비드(1 pan-T 세포 : 2 비드)와 함께 1 골수 세포 : 2 T 세포의 세포비에서 CFSE 표지된 음성적으로 선택된 자가유래 pan-T 세포와 공배양된 M2φ, M1φ 및 미성숙 DC; S15 Fc로 전처리된 인간 골수 세포의 % CD8 증식의 막대 그래프. 좌측으로부터 우측으로의 칼럼은 다음과 같다: 도 27C 내지 27G의 경우 T 세포 단독, T 세포 + 비드, 처리된 S15 Fc, M2φ, M1φ, 및 imDC. 도 27C는 상기의 처리된 바와 같은 세포에 대한 IFN-γ(pg/㎖)의 막대 그래프. 도 27D는 상기의 처리된 바와 같은 세포에 대한 TNF-α(pg/㎖)의 막대 그래프. 도 27E는 상기의 처리된 바와 같은 세포에 대한 백분율 CD4 증식. 도 27F는 상기의 처리된 바와 같은 세포에 대한 IL-6(pg/㎖)의 막대 그래프. 도 27G는 상기의 처리된 바와 같은 세포에 대한 IL-10(pg/㎖)의 막대 그래프.
도 28A는 공여자 1709로부터의 세포에 대한 흡광도 450㎚ 대 mAb(㎍/㎖)의 선 그래프. 상단 선은 대조군 mAb이고, 하단 선은 S15 mAb이다. 도 28B는 공여자 1713로부터의 세포인 것을 제외하고는 도 28A와 동일한 도면.
도 29는 파골세포 형성에서 Siglec-15가 하는 역할을 도시한 다이어그램.
도 30A는 0일에 S15 Fc로 처리되고, 항-αvβ3 인테그린 mAb로 염색된 인간 CD14+ 단핵구의 FACS 히스토그램. 도 30B는 6일에 S15 Fc로 처리되고, 항-αvβ3 인테그린 mAb로 염색된 인간 CD14+ 단핵구의 FACS 히스토그램.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 분자는 결합이 이의 동족 항원에 대해서 항체의 특이성 및 친화도를 나타내는 경우 제2 분자에 "면역특이적으로 결합"할 수 있다고 지칭된다. 항체는 결합이 면역글로불린 분자의 항원 인식 부위에 관련되는 경우 항원의 표적 영역 또는 입체배좌("에피토프")에 면역특이적으로 결합할 수 있다고 지칭된다. 특정 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 면역검정, BIACORE(등록상표) 검정 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 검정에 의해서 결정되는 바와 같이, 다른 항원이 항원 인식 부위에 의해서 인식되는 약간의 서열 또는 입체배좌 유사성을 갖는 경우 더 낮은 친화도로 다른 항원에 결합할 수 있지만, 완전히 비관련된 항원에 결합하지 않을 것이다. 그러나, 바람직하게는, 항체(및 이의 항원 결합 단편)는 다른 항원과 교차 반응하지 않을 것이다. 항체는 또한 항원 인식 부위, 예컨대, Fc 영역에 관여되지 않은 분자의 다른 영역/도메인 내의 결합 도메인으로 인해서, 예컨대, FcR 수용체에 대해서 면역특이적이지 않은 방식으로 다른 분자에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 분자는 결합이 이의 동족 결합 리간드에 대해서 수용체의 특이성 및 친화도를 나타내는 경우 제2 분자에 "물리특이적으로 결합한다"고 지칭된다. 분자는 하나를 초과하는 다른 분자에 물리특이적으로 결합할 수 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 "가변 영역" 항원 인식 부위를 보유하는 면역글로불린 분자를 나타내도록 의도된다. 용어 "가변 영역"은 면역글로불린의 이러한 도메인을 항체에 의해서 넓게 공유된 도메인(예컨대, 항체 Fc 도메인)과 구별하도록 의도된다. 가변 영역은 잔기가 항원 결합에 책임이 있는 "초가변 영역"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 전형적으로 경쇄 가변 도메인 내의 대략적으로 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3)에서 그리고 중쇄 가변 도메인 내의 대략적으로 잔기 27 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프로부터의 잔기"(즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917)를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다. 용어 항체는 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체(예를 들어, 문헌[Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25]; 국제 공개 제WO 94/04678호 및 제WO 94/25591; 미국 특허 제6,005,079호), 단일 쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), 단일 쇄 항체, 다이설파이드-연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 및 항-유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 항-Id 및 항-항-Id 항체 대 항체)를 포함한다. 특히, 이러한 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 단편"은 항체의 상보성 결정 영역("CDR") 및 임의로 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 포함하고, 항원에 면역특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 프레임워크 잔기를 함유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 쇄(ScFv), 및 이의 돌연변이체, 자연 발생 변이체, 및 항체의 "가변 영역" 항원 인식 부위를 비롯한 융합 단백질 및 이종 단백질(예를 들어, 독소, 상이한 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단편"은 적어도 5개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 60개의 인접한 아미노 잔기, 적어도 70개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접한 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접한 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 인접한 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "조정하다"는 효과, 결과 또는 활성도(예를 들어, 신호 변환)를 변경하는 능력을 지칭한다. 이러한 조정은 효능적 또는 길항적일 수 있다. 길항적 조정은 부분적(즉, 제거는 아니지만 약화시킴)일 수 있거나, 또는 그것은 이러한 활성도를 완전히 폐지(예를 들어, 중화)시킬 수 있다. 조정은 항체의 결합 이후 수용체의 내재화 또는 표적 세포 상의 수용체의 발현의 감소를 포함할 수 있다. 효능적 조정은 활성도(예를 들어, 신호 변환)를 향상시키거나 또는 달리 증가 또는 향상시킬 수 있다. 더 추가의 실시형태에서, 이러한 조정은 도출된 신호 변환의 본성을 변경하도록 리간드와 이의 동족 수용체 간의 상호작용의 본성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 분자는 리간드 또는 수용체에 대한 결합에 의해서, 이러한 분자가 다른 리간드 또는 수용체에 결합하는 능력을 변경시킴으로써 이의 전체 활성도를 변경할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조정은 측정 가능한 면역계 활성도의 적어도 10% 변화, 보다 바람직하게는, 이러한 활성도의 적어도 50% 변화, 또는 보다 더 바람직하게는, 이러한 활성도의 적어도 2배, 5배, 10배 또는 적어도 100배 변화를 제공할 것이다.
용어 "실질적으로"는 결합 또는 나타낸 효과와 관련하여 사용되는 바와 같이 관찰된 효과가 생리학적으로 또는 치료적으로 관련이 있음을 나타내도록 의도된다. 따라서, 예를 들어, 분자는 차단 정도가 생리학적으로 또는 치료적으로 관련되는 경우(예를 들어, 이러한 정도가 완전한 것의 60% 초과, 완전한 것의 70% 초과, 완전한 것의 75% 초과, 완전한 것의 80% 초과, 완전한 것의 85% 초과, 완전한 것의 90% 초과, 완전한 것의 95% 초과, 또는 완전한 것의 97% 초과인 경우) 리간드 또는 수용체의 활성도를 실질적으로 차단할 수 있다. 유사하게, 분자는, 이러한 면역특이성 및 특징이 60%를 초과하게 동일하거나, 70%를 초과하게 동일하거나, 75%를 초과하게 동일하거나, 80%를 초과하게 동일하거나, 85%를 초과하게 동일하거나, 90%를 초과하게 동일하거나, 95%를 초과하게 동일하거나, 또는 97%를 초과하게 동일한 경우, 또 다른 분자와 실질적으로 동일한 면역특이성 및/또는 특징을 갖는다고 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "공자극성" 신호는 양성 공자극성 신호(예를 들어, 활성도를 향상시키는 신호) 및 음성 공자극성 신호(예를 들어, 활성도를 저해하는 신호)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유도체"는 모체 또는 참조항체의 동일한 표적에 면역특이적으로 결합하지만 모체 또는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 비해서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 변형을 포함함으로써 모체 또는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 아미노산 서열이 상이한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 바람직하게는 이러한 유도체는 모체 또는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 실질적으로 동일한 면역특이성 및/또는 특징, 또는 동일한 면역특이성 및 특징을 가질 것이다. 이러한 유도체의 아미노산 치환 또는 첨가는 자연 발생(즉, DNA-암호화된) 또는 비자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어 "유도체"는 예를 들어, 향상된 또는 손상된 효과기 또는 결합 특징을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는, 예를 들어, 항체 등을 형성하도록, 키메라 또는 인간화된 변이체, 뿐만 아니라 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항체"는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자, 예컨대, 비인간 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체로부터 유래된 분자이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 인간 프레임워크 영역 및 비인간(통상적으로 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린은 "공여자"라 지칭되며, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용자"라 지칭된다. 불변 영역이 존재할 필요는 없지만, 그것이 존재하면, 그것은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 즉, 적어도 약 85 내지 99%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야 한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외한, 인간화된 면역글로불린의 모든 부분은 자연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 인간화된 항체는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 인간화된 항체는 전형적인 키메라 항체를 포함하지 않을 것인데, 그 이유는 예를 들어, 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비인간이기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내생 농도"는 분자가 세포(세포는 정상 세포, 암 세포 또는 감염된 세포일 수 있음)에 의해서 자연적으로(즉, 발현 벡터 또는 재조합 프로모터의 부재 하에서) 발현되는 수준을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 및 "치료적 용도"는 Siglec-15 또는 이의 리간드에 의해서 악화된 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 제거, 감소 또는 개선을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 이러한 증상의 임상적으로 관련된 제거, 감소 또는 개선을 매개하기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 효과는 이의 크기가 수령인 대상체의 건강 또는 예후에 영향을 주기에 충분하다면 임상적으로 관련된다. 치료적 유효량은 질환의 발병을 지연 또는 최소화시키기에, 예를 들어, 암의 확산을 지연 또는 최소화시키기에 충분한 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 질환의 치료 또는 관리에 치료적 이익을 제공하는 치료제의 양을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방제"는 장애 또는 질환의 임의의 증상을 검출하기 전에 장애 또는 질환의 예방에 사용될 수 있는 작용제를 지칭한다. "예방적 유효"량은 이러한 보호를 매개하기에 충분한 예방제의 양이다. 예방적 유효량은 또한 질환의 예방에 예방적 이익을 제공하는 예방제의 양을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 세포의 비제어된 성장으로부터 초래되는 신생물 또는 종양을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 암은 백혈병 및 림프종을 명백히 포함한다. 용어 "암"은 원위 부위로 전이될 가능성을 갖고 비-암세포의 것과 상이한 표현형 특질, 예를 들어, 3차원 기질, 예컨대, 연한천(soft agar)에서의 집락의 형성 또는 3차원 기저부 막 또는 세포외 기질 제제에서의 관형 네트워크 또는 웹-유사 기질의 형성을 나타내는 질환 관련 세포를 지칭한다. 비-암 세포는 연한천에서 집락을 형성하지 않고, 3차원 기저부 막 또는 세포외 기질 제제에서 뚜렷한 구체-유사 구조를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역 세포"는 T 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 대식세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 조혈 기원으로부터의 임의의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "원자가"는 분자당 사용 가능한 결합 부위의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역학", "면역학적" 또는 "면역" 반응은 수령인 환자에서 펩타이드에 대해서 지향된 이로운 체액(항체 매개된) 및/또는 세포(항원-특이적 T 세포 또는 이의 분비 산물에 의해서 매개된) 반응의 발달이다. 이러한 반응은 면역원의 투여에 의해서 유도된 능동 반응 또는 항체 또는 프라이밍된 T-세포의 투여에 의해서 유도된 수동 반응일 수 있다. 세포 면역 반응은 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 연관된 폴리펩타이드 에피토프의 제시에 의해서 도출되어 항원-특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화시킨다. 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호염구, 수지상 세포, 성상세포, 미세아교세포 세포, 호산구의 활성화, 호중구 또는 선천성 면역의 다른 성분의 활성화 또는 모집에 관여할 수 있다. 세포-매개된 면역학적 반응의 존재는 증식 검정(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구) 검정에 의해서 결정될 수 있다. 면역원의 보호 또는 치료 효과에 대한 체액 및 세포 반응의 상대적인 기여는 면역화된 동계 동물로부터의 항체 및 T-세포를 별개로 단리시키고, 제2 대상체에서 보호 또는 치료적 효과를 측정함으로써 구별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역제" 또는 "면역원"은 임의로 아주반트와 함께, 포유동물에게 투여 시에 그 자체에 대해서 면역학적 반응을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체", "숙주", "대상체", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 인간, 설치류, 예컨대, 마우스 및 래트, 및 다른 실험실 동물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 포유동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 변형(예를 들어, 포스포릴화 또는 글리코실화)에 상관없이, 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭한다. 용어 폴리펩타이드는 단백질 및 이의 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 "외인성"(그것이 "이종"임을 의미하고, 즉, 숙주 세포에 대한 외부 물질이 사용됨), 예컨대, 박테리아 세포에 의해서 생산된 인간 폴리펩타이드일 수 있다. 폴리펩타이드는 본 명세서에서 아미노산 잔기 서열로서 개시되어 있다. 이러한 서열은 아미노에서부터 카복시 말단으로 좌측에서 우측으로 쓰여져 있다. 표준 명명법에 따라서, 아미노산 잔기 서열은 하기에 제시된 바와 같이 3문자 또는 단일 문자 암호에 의해서 명명된다: 알라닌(Ala, A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 아이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 상이하지만, 본질적인 특성을 보유하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드의 전형적인 변이체는 또 다른 참조 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 차이가 제한되어 참조 폴리펩타이드 및 변이체의 서열은 전체적으로 상당히 유사하고, 다수의 영역에서 동일하다. 변이체 및 참조 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 첨가 및/또는 결실)에 의해서 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환된 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 암호에 의해서 암호화된 것일 수 있거나 암호화된 것이 아닐 수 있다. 폴리펩타이드의 변이체는 자연 발생, 예컨대, 대립유전자 변이체일 수 있거나, 또는 그것은 자연 발생인 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다.
변형 및 변화는 본 개시내용의 폴리펩타이드의 구조에서 일어날 수 있고, 폴리펩타이드와 유사한 특징을 갖는 분자를 여전히 수득할 수 있다(예를 들어, 보존적 아미노산 치환). 예를 들어, 특정 아미노산은 활성도의 인지 가능한 손실 없이 서열 내의 다른 아미노산에 대해서 치환될 수 있다. 그것은 폴리펩타이드의 생물학적 기능 활성도를 정의하는 폴리펩타이드의 상호작용 능력 및 본성이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 서열 내에서 일어날 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
이러한 변화의 생성 시에, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 폴리펩타이드에 상호작용 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서의 수치 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 관련 기술 분야에서 이해된다. 특정 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산을 대체할 수 있고, 유사한 생물학적 활성도를 갖는 폴리펩타이드가 여전히 생성될 수 있음이 공지되어 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징을 기준으로 수치 지수가 할당되어 있다. 이러한 지수는 다음과 같다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산의 상대적인 수치 특징은 생성된 폴리펩타이드의 2차 구조를 결정하고, 이것은 결국 폴리펩타이드와 다른 분자, 예컨대, 효소, 물질, 수용체, 항체, 항원 및 공동인자의 상호작용을 정의하는 것으로 여겨진다. 아미노산은 유사한 수치 지수를 갖는 또 다른 아미노산에 의해서 치환될 수 있고, 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 여전히 수득하는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 변화 시에, 수치 지수가 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 이의 ± 1 이내인 것이 특히 바람직하고, ± 0.5 이내인 것이 보다 더 특별하게 바람직하다.
유사한 아미노산의 치환은 또한 친수성을 기준으로 행해질 수 있고, 특히, 이에 의해서 생성된 생물학적 기능이 동등한 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 면역학적 실시형태에서의 사용을 위해서 의도된다. 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 대해서 할당되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신 (0); 프롤린(-0.5 ± 1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 것으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드를 여전히 수득할 수 있다고 이해된다. 이러한 변화 시에, 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 이의 ± 1 이내인 것이 특히 바람직하고, ± 0.5 이내인 것이 보다 더 특별하게 바람직하다.
상기에 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 다양한 상기 특징을 고려한 예시적인 치환은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 하기를 포함한다(본래 잔기: 예시적인 치환): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) 및 (Val: Ile, Leu). 따라서 본 개시내용의 실시형태는 상기에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 특히, 폴리펩타이드의 실시형태는 관심대상 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "백분율(%) 서열 동일성"은 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해서, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 참조 핵산 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율로서 정의된다. 백분율 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 관련 기술 분야 내의 기술에 포함되는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 비교될 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터는 공지된 방법에 의해서 결정될 수 있다.
본 명세서에의 목적을 위해서, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 이것과의 또는 이것과 비교하여 주어진 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성(이것은 대안적으로 주어진 서열 D에 대한, 이것과의 또는 이것과 비교하여 특정 % 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 서열 C로서 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
분율 W/Z의 100배,
여기서, W는 C 및 D의 프로그램의 정렬 시에 서열 정렬 프로그램에 의해서 동일한 매치로서 점수매겨진 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, Z는 D 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 동일하지 않음이 인식될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 표준 약제학적 담체, 예컨대, 인산염 완충 염수 용액, 물 및 에멀션, 예컨대, 유/수 또는 수/유 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결정기" 및 "에피토프"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 항체에 의해서 인식되는 구조를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "입체배좌 에피토프"는 항원의 아미노산 서열의 불연속적 섹션을 포함하는 에피토프이다. 항체는 항원의 3-D 표면 특징부, 형상 또는 3차 구조를 기준으로 입체배좌 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "선형 에피토프"는 항원으로부터의 아미노산의 연속적 서열에 의해서 형성된 에피토프이다. 선형 에피토프는 전형적으로 약 5 내지 약 10개의 연속적 아미노산 잔기를 포함한다. 항체는 항원의 1차 서열을 기초로 하는 선형 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항원-결합 부위"라고도 지칭되는 "파라토프"는 항원을 인식하고 이에 결합하는 항체의 부분이다.
II. 조성물
A. Siglec-15 서열
시알산-결합 Ig-유사 렉틴 15("Siglec-15", CD33 항원-유사 3, 및 CD33L3이라고도 지칭됨)는 인간 비장 및 림프절의 대식세포 및/또는 수지상 세포 상에서 발현되는 1형 막관통 단백질이다(Angata, et al., Glycobiology, 17(8):838-46 (2007), 전문이 본 명세서에 구체적으로 참고로 포함됨). Siglec-15의 세포외 도메인은 시알릴화된 당단백질에 결합하고, Neu5Acα2-6GalNAcα-구조를 우세하게 인식한다.
Siglec-15는 막관통 도메인에서의 이의 라이신 잔기(잔기 K274)를 통해서 활성화 어댑터 단백질 DNAX 활성화 단백질 (DAP)12 및 DAP10과 회합하는데, 이는 이것이 활성화 신호전달 분자로서 기능한다는 것을 나타낸다. Siglec-15의 오쏘로그는 포유동물뿐만 아니라 다른 나머지 척추동물에도 존재하고, 척추독물의 면역계에서 보존된 조절 역할을 하는 것으로 여겨진다.
Siglec-15는 T 세포 증식 및 염증성전 사이토카인 생산을 저해함으로써 T 세포 기능을 직접 조절한다. Siglec-15는 골수 세포를 통해서 T 세포 기능에 간접적으로 영향을 미친다. 종양 세포 또는 M2 대식세포 상에서 발현된 Siglec-15는 골수 세포 상에서 이의 결합 파트너와 상호작용하여 생존 및 분화 신호를 제공하여 TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 생산하는 고유한 골수 세포 집단을 생성한다. 분비된 사이토카인은 종양 성장을 추가로 촉진시킨다. 골수 세포의 이러한 하위세트는 T 세포에서 IFN-γ 생산을 감소시킴으로써 T 세포 기능에 영향을 줄 수 있다.
인간 Siglec-15에 대한 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 하기를 포함하고:
(서열번호 1), UniProtKB - Q6ZMC9 (SIG15_인간), 이의 전체는 구체적으로 참고로 포함된다.
인간 Siglec-15는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 19로부터의 신호 펩타이드 서열, 서열번호 1의 아미노산 20 내지 263으로부터의 세포외 도메인(볼드 및 이탤릭체로 표시됨), 서열번호 1의 아미노산 264 내지 284로부터의 막관통 도메인, 및 서열번호 1의 아미노산 285 내지 328로부터의 세포질 도메인을 포함한다. Ig-유사 V-유형 도메인은 서열번호 1의 아미노산 40 내지 158(단일 밑줄로 표시됨)로부터 유래된다고 예측되고, Ig-유사 C2-유형 도메인은 서열번호 1의 아미노산 168 내지 251(이중 밑줄로 표시됨). 다이설파이드 결합은 잔기 64와 142 사이; 95와 104 사이; 및 187과 237 사이에 형성된다고 여겨지며, 글리코실화는 잔기 172에서 예측된다. 아미노산 276 내지 279는 폴리-류신 도메인이라고 지칭되어 왔다. 공지된 변이체는 F273L 치환 변이체이다.
마우스 Siglec-15에 대한 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 하기를 포함하고:
(서열번호 2), UniProtKB - A7E1W8 (A7E1W8_마우스), 이의 전체는 구체적으로 참고로 포함된다.
마우스 Siglec-15는 서열번호 2의 아미노산 1 내지 23으로부터의 신호 펩타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 24 내지 262로부터의 세포외 도메인(볼드 및 이탤릭체로 표시됨), 서열번호 2의 아미노산 263 내지 283으로부터의 막관통 도메인, 및 서열번호 2의 아미노산 284 내지 342로부터의 세포질 도메인을 포함한다. Ig-유사 V-유형 도메인은 서열번호 2의 아미노산 40 내지 145(단일 밑줄로 표시됨)로부터 유래된다고 예측되고, Ig-유사 C2-유형 도메인은 서열번호 2의 아미노산 169 내지 250(이중 밑줄로 표시됨).
B. Siglec-15-결합 분자
Siglec-15-결합 분자, 예컨대, Siglec-15에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편 및 다른 폴리펩타이드가 제공된다. 마우스 항-Siglec-15 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 이로부터의 CDR의 서열은 하기에 제공된다. 하기 서열 중 1개 이상을 포함하는 항체, 항원 결합 단편 및 다른 폴리펩타이드 및 이의 변이체가 제공된다. 예를 들어, Siglec-15에 결합하는 항-Siglec-15 항체 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개의 CDR 및/또는 항-Siglec-15 항체 중쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 항체, 항원 결합 단편, 및 폴리펩타이드이 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체, 항원 결합 단편, 및 폴리펩타이드는 항-Siglec-15 항체의 경쇄 가변 영역, 항-Siglec-15의 중쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합물을 포함하고, Siglec-15에 결합할 수 있다.
예를 들어, 개시된 분자는 Siglec-15(예를 들어 서열번호 1, 서열번호 2 등)에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어,
(I) 세포(바람직하게는 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합할 수 있거나;
(II) 내생 농도로 세포(바람직하게는 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합할 수 있거나;
(III) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 그리고 Siglec-15(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2 등)와, Neu5Acα2-6GalNAcα, LRRC4C, Siglec-15-반대-수용체(S15-CR) 또는 이들의 조합물 간의 결합을 조정하거나;
(IV) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 그리고 TGF-β 분비를 감소시키거나, 예방하거나 또는 저해하거나;
(V) 살아있는 세포(여기서 세포는 골수 세포, 예컨대, 대식세포 또는 수지상 세포, 또는 암 세포(예를 들어 뇌암 세포, 신장 세포 암종 세포(RCC), 유잉(Ewing) 육종 세포, 유방암 세포, 또는 난소암 세포임)의 표면 상에 배열된 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합할 수 있거나;
(VI) 이들의 조합인 분자가 제공된다.
1. 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 서열
하기 실시예에 기술된 바와 같이, Siglec-15 넉아웃 마우스(N=2)를 CFA(완전 프로인드 아주반트)로 유화된 hS15.mIg(마우스 IgG2a와 융합된 인간 Siglec 15 세포외 도메인[ECD])로 면역화시켜 마우스 항-인간 Siglec-15 mAb의 패널을 생성하였다.
본 명세서에서 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A(또한 NC6 및 #6), 28A(또한 NC28 및 #28), 63A(NC63 및 #63이라고도 지칭됨), 71A(NC71 및 #71이라고도 지칭됨), 77A(NC77 및 #77이라고도 지칭됨), 80A(NC80 및 #80이라고도 지칭됨), 82B(NC82 및 #82라고도 지칭됨), 83B(NC83 및 #83이라고도 지칭됨), 92A(NC92 및 #92라고도 지칭됨), 93B(NC93 및 #93이라고도 지칭됨), 99B(NC99 및 #99라고도 지칭됨), 104B(NC104 및 #104라고도 지칭됨), 및 105A(NC105 및 #105라고도 지칭됨)라고 지칭된, 24개의 하이브리도마에 의해서 생성된 단클론성 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열이 하기에 제공된다. CDR은 경쇄 및 중쇄 서열의 문맥에서 밑줄 및 볼드체이다. 서열 및 CDR은 도 2A 내지 도 3C의 정렬에 도시되어 있다.
a. 1B2 서열:
i. 경쇄
1B2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPWT FGGGTKLEIK(서열번호 3), 이것은 하기를 갖는다:
1B2 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 24)
1B2 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
1B2 경쇄 CDR3: FQGSHVPWT(서열번호 39).
1B2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG(서열번호 74).
ii. 중쇄
1B2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLVESGGGFVKPGGSLKLSCAAS GFTFSDYGMH WVRQAPEKGLEWVA YISSGSSIIYYADTVKG RFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAR DHYHGNGSDY WGQGTTLTVSS(서열번호 13), 이것은 하기를 갖는다:
1B2 중쇄 CDR1: GFTFSDYGMH(서열번호 46)
1B2 중쇄 CDR2: YISSGSSIIYYADTVKG(서열번호 56)
1B2 중쇄 CDR3: DHYHGNGSDY(서열번호 67).
1B2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTATCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGACCACTACCATGGTAACGGGTCCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 85).
b. 1C3 서열:
i. 경쇄
1C3 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISC RSSKSLLHSNGNTYLY WFLQRPGQSPQLLIY RMSNLAS GVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGFYYC MQHLEYPYT FGGGTRLEIK(서열번호 4), 이것은 하기를 갖는다:
1C3 경쇄 CDR1: RSSKSLLHSNGNTYLY(서열번호 25)
1C3 경쇄 CDR2: RMSNLAS(서열번호 33)
1C3 경쇄 CDR3: MQHLEYPYT(서열번호 40).
1C3 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTATATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTTTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGGCTGGAAATAAAA(서열번호 75).
ii. 중쇄
1C3 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKAS GYIFTDYYVN WVKQRPGQGLEWIG KIGPGSVSIYYNEKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAS YYYGFAY WGQGTLVTVSA(서열번호 14), 이것은 하기를 갖는다:
1C3 중쇄 CDR1: GYIFTDYYVN(서열번호 47)
1C3 중쇄 CDR2: KIGPGSVSIYYNEKFKG(서열번호 57)
1C3 중쇄 CDR3: YYYGFAY(서열번호 68).
1C3 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACTGACTATTATGTAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCTGGAAGTGTTAGTATTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 86).
c. 1H3 서열:
i. 경쇄
1H3 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIQMTQASSSLSVSLGGRVTITC KASDHINNWLA WYQQKPGNAPRLLIS GATSLET GVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYC QQYWSSPLT FGAGTKLELK(서열번호 5), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 경쇄 CDR1: KASDHINNWLA(서열번호 26)
1H3 경쇄 CDR2: GATSLET(서열번호 34)
1H3 경쇄 CDR3: QQYWSSPLT(서열번호 41).
1H3 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GACATCCAGATGACACAGGCTTCATCCTCCTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTAATAATTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGTTGCTACTTATTACTGTCAACAGTATTGGAGTTCTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 76).
ii. 인간화된 경쇄
일 실시형태는 하기의 가변 경쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSSPLTFGGGTKVEIK(서열번호 209), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 경쇄 CDR1: KASDHINNWLA(서열번호 26)
1H3 경쇄 CDR2: GATSLET(서열번호 34)
1H3 경쇄 CDR3: QQYWSSPLT(서열번호 41).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
또 다른 실시형태는 하기의 가변 경쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKVPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYWSSPLTFGGGTKVEIK(서열번호 210), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 경쇄 CDR1: KASDHINNWLA(서열번호 26)
1H3 경쇄 CDR2: GATSLET(서열번호 34)
1H3 경쇄 CDR3: QQYWSSPLT(서열번호 41).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
또 다른 실시형태는 하기의 가변 경쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC-15 항체를 제공하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYWSSPLTFGGGTKVEIK(서열번호 211), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 경쇄 CDR1: KASDHINNWLA(서열번호 26)
1H3 경쇄 CDR2: GATSLET(서열번호 34)
1H3 경쇄 CDR3: QQYWSSPLT(서열번호 41).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
iii. 중쇄
1H3 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS NYGVH WVRQPPGKGLEWLV LIWSDGSTTYNSALKS RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTGDTAMYYCAR HPYDDYSGYYYTMDY WGQGTSVTVSS(서열번호 15), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 중쇄 CDR1: NYGVH(서열번호 48)
1H3 중쇄 CDR2: LIWSDGSTTYNSALKS(서열번호 58)
1H3 중쇄 CDR3: HPYDDYSGYYYTMDY(서열번호 69).
1H3 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAAGCAATTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTACTGATATGGAGTGATGGAAGCACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGGTGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGACATCCCTATGATGATTATTCCGGCTATTACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 87).
iv. 인간화된 중쇄
일 실시형태는 하기의 가변 중쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC 15 항체를 제공하고:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWIVLIWSDGSTTYNSALKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 212), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 중쇄 CDR1: NYGVH(서열번호 48)
1H3 중쇄 CDR2: LIWSDGSTTYNSALKS(서열번호 58)
1H3 중쇄 CDR3: HPYDDYSGYYYTMDY(서열번호 69).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
또 다른 실시형태는 하기의 가변 중쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC 15 항체를 제공하고:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWIG LIWSDGSTTY A SALKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVS(서열번호 213), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 중쇄 CDR1: NYGVH(서열번호 48)
1H3 중쇄 CDR2: LIWSDGSTTYASALKS(서열번호 214)
1H3 중쇄 CDR3: HPYDDYSGYYYTMDY(서열번호 69).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
또 다른 실시형태는 하기의 가변 중쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC 15 항체를 제공하고:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWIG LIWSDGSTTYN PS LKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVS(서열번호 215), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 중쇄 CDR1: NYGVH(서열번호 48)
1H3 중쇄 CDR2: LIWSDGSTTYNPSLKS(서열번호 218)
1H3 중쇄 CDR3: HPYDDYSGYYYTMDY(서열번호 69).
밑줄친 아미노산은 모 서열에 대해서 변화된 것이다.
또 다른 실시형태는 하기의 가변 중쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-SIGLEC 15 항체를 제공하고:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWIG LIWS E GSTTY A SALKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVS(서열번호 216), 이것은 하기를 갖는다:
1H3 중쇄 CDR1: NYGVH(서열번호 48)
1H3 중쇄 CDR2: LIWSEGSTTYASALKS(서열번호 217)
1H3 중쇄 CDR3: HPYDDYSGYYYTMDY(서열번호 69).
d. 1C12 서열:
i. 경쇄
1C12 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPWT FGGGTKLEIK(서열번호 3), 이것은 하기를 갖는다:
1C12 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 24)
1C12 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
1C12 경쇄 CDR3: FQGSHVPWT(서열번호 39).
1C12 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA(서열번호 77).
ii. 중쇄
1C12 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS GFSFSDYGMH WVRQAPEKGLEWVA YISSGSSILYYADIVK GRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAR DHYHGNGSDY WGQGTTLTVSS(서열번호 16), 이것은 하기를 갖는다:
1C12 중쇄 CDR1: GFSFSDYGMH(서열번호 49)
1C12 중쇄 CDR2: YISSGSSILYYADIVK(서열번호 59)
1C12 중쇄 CDR3: DHYHGNGSDY(서열번호 67).
1C12 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCTCTTTCAGTGACTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTATCCTCTACTATGCAGACATAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGACCACTACCATGGTAACGGGTCCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 88).
e. 3H10 서열:
i. 경쇄
3H10 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QIILTQSPAIMSASPGEKVTMTC SASSSTSFMH WYQQKPGTSPKRWIF DTSKLA SGVPGRFIGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYC HQRSAYPWT FGGGTKLEIK(서열번호 6), 이것은 하기를 갖는다:
3H10 경쇄 CDR1: SASSSTSFMH(서열번호 27)
3H10 경쇄 CDR2: DTSKLA(서열번호 35)
3H10 경쇄 CDR3: HQRSAYPWT(서열번호 42).
3H10 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAAATTATTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTACAAGTTTCATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTTTGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGGTCGCTTCATTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCACCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTGCTTACCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(서열번호 78).
ii. 중쇄
3H10 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTAS GFNIKDYYMH WVKERPEQGLEWIG RIDPEDGDIEYDPKFQG KATMTADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAVYYCVT DYDYDGGWFAY WGQGTLVTVSA(서열번호 17), 이것은 하기를 갖는다:
3H10 중쇄 CDR1: GFNIKDYYMH(서열번호 50)
3H10 중쇄 CDR2: RIDPEDGDIEYDPKFQG(서열번호 60)
3H10 중쇄 CDR3: DYDYDGGWFAY(서열번호 70).
3H10 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAAGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGGATGGTGATATTGAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTCACGGACTATGATTACGACGGAGGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 89).
f. 5G12 서열:
i. 경쇄
5G12 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITC KASQDINSYLS WFQQKPGKSPKTLIY RANRLVD GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC LQYDEFPYT FGGGTKLEIKR(서열번호 7), 이것은 하기를 갖는다:
5G12 경쇄 CDR1: KASQDINSYLS(서열번호 28)
5G12 경쇄 CDR2: RANRLVD(서열번호 36)
5G12 경쇄 CDR3: LQYDEFPYT(서열번호 43).
5G12 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(서열번호 79).
ii. 중쇄
5G12 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYWIT WVIQRPGQGLEWIG DIYCGSDTMHYNEKFKN KATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR WWDYGSSYDYFDY WGQGTTLTVSS(서열번호 18), 이것은 하기를 갖는다:
5G12 중쇄 CDR1: GYTFTSYWIT(서열번호 51)
5G12 중쇄 CDR2: DIYCGSDTMHYNEKFKN(서열번호 61)
5G12 중쇄 CDR3: WWDYGSSYDYFDY(서열번호 71).
5G12 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAACCTGGGTGATACAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATTGTGGTAGTGATACTATGCACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACTACGGTAGTAGCTACGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 90).
g. 6F8 서열:
i. 경쇄
6F8 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISC RSSKSLLHSNGNTYLY WFLQRPGQSPQLLIY RMSNLAS GVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYC MQHLEYPYT FGGGTKLEIKR(서열번호 8), 이것은 하기를 갖는다:
6F8 경쇄 CDR1: RSSKSLLHSNGNTYLY(서열번호 25)
6F8 경쇄 CDR2: RMSNLAS(서열번호 33)
6F8 경쇄 CDR3: MQHLEYPYT(서열번호 40).
6F8 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTATTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(서열번호 80).
ii. 중쇄
6F8 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKQSGPELVRPGASVKISCEAS GYTFTDYYVN WVKQRPGRGLEWIG KIGPGSVSIYYNEKFKD KATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCAS YYYGFAY WGQGTLVTVSA(서열번호 19), 이것은 하기를 갖는다:
6F8 중쇄 CDR1: GYTFTDYYVN(서열번호 52)
6F8 중쇄 CDR2: KIGPGSVSIYYNEKFKD(서열번호 62)
6F8 중쇄 CDR3: YYYGFAY(서열번호 68).
6F8 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCGAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATTATGTAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCTGGAAGTGTTAGTATTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 91).
h. 8C8 서열:
i. 경쇄
8C8 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISC RSSKSLLHSNGNTYLY WFLQRPGQSPQLLIY RMSNLAS GVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYC MQHLEYPYT FGGGTKLEIK(서열번호 9), 이것은 하기를 갖는다:
8C8 경쇄 CDR1: RSSKSLLHSNGNTYLY(서열번호 25)
8C8 경쇄 CDR2: RMSNLAS(서열번호 33)
8C8 경쇄 CDR3: MQHLEYPYT(서열번호 40).
8C8 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(서열번호 81).
ii. 중쇄
8C8 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKAS GYTFTDYYVN WVKQRPGQGLEWIG KIGPESVSIYYSEKFKA KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAS YYYGFAY WGQGTLVTVSA(서열번호 20), 이것은 하기를 갖는다:
8C8 중쇄 CDR1: GYTFTDYYVN(서열번호 52)
8C8 중쇄 CDR2: KIGPESVSIYYSEKFKA(서열번호 63)
8C8 중쇄 CDR3: YYYGFAY(서열번호 68).
8C8 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATTATGTAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCTGAAAGTGTTAGTATTTATTACAGTGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 92).
i. 8H8 서열:
i. 경쇄
8H8 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC RSSSGAVTTGNFAN WVQEKPDHLFTGLIG GTNNRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC ALWYSNHWV FGGGTKLTVL(서열번호 10), 이것은 하기를 갖는다:
8H8 경쇄 CDR1: RSSSGAVTTGNFAN(서열번호 29)
8H8 경쇄 CDR2: GTNNRAP(서열번호 37)
8H8 경쇄 CDR3: ALWYSNHWV(서열번호 44).
8H8 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACTGGTAACTTTGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA(서열번호 82).
ii. 중쇄
8H8 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGS GFTFSGFWMS WVRQTPGKTLEWIG DINSDGSAINYAPSIKD RFTIFRDNDKNTLYLQMNNVRSEDTATYFCVR YDDYGYFDV WGTGTTVTVSS(서열번호 21), 이것은 하기를 갖는다:
8H8 중쇄 CDR1: GFTFSGFWMS(서열번호 53)
8H8 중쇄 CDR2: DINSDGSAINYAPSIKD(서열번호 64)
8H8 중쇄 CDR3: YDDYGYFDV(서열번호 72).
8H8 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACGGGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGGGTTCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGGCAGTGCAATAAACTACGCACCATCCATAAAGGATCGATTCACTATCTTCAGAGACAATGACAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAATGTGCGATCGGAGGACACAGCCACGTATTTCTGTGTGAGATATGATGATTACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 93).
j. 9A5 서열:
i. 경쇄
9A5 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSVTIGQSASISC KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSKLDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEIK(서열번호 11), 이것은 하기를 갖는다:
9A5 경쇄 CDR1: KSSQSLLDSDGKTYLN(서열번호 30)
9A5 경쇄 CDR2: LVSKLDS(서열번호 38)
9A5 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
9A5 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAGTCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 83).
ii. 중쇄
9A5 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
HVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAS GYTFTSYGLI WVKQRTGQGLEWIG EIYPRSGNTYYNEKFKG KATLTADISSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAS SSPHGDY WGQGTTLTVSS(서열번호 22), 이것은 하기를 갖는다:
9A5 중쇄 CDR1: GYTFTSYGLI(서열번호 54)
9A5 중쇄 CDR2: EIYPRSGNTYYNEKFKG(서열번호 65)
9A5 중쇄 CDR3: SSPHGDY(서열번호 73).
9A5 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CACGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTTTAATCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTAATACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACATATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTTCCTCTCCTCACGGGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 94).
k. 10G9 서열:
i. 경쇄
10G9 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QAVVTQESALTTSPGETVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPDHLFTGLIG GTNNRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC ALWYSNHWV FGGGTKLTVL(서열번호 12), 이것은 하기를 갖는다:
10G9 경쇄 CDR1: RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 31)
10G9 경쇄 CDR2: GTNNRAP(서열번호 37)
10G9 경쇄 CDR3: ALWYSNHWV(서열번호 44).
10G9 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA(서열번호 84).
ii. 중쇄
10G9 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGS GFTFSDFWMS WVRQTPGKTLEWIG DINSDGSAVNYAPSIKD QFTIFRDNDKRTLHLQMINVRSEDTATYFCVR YDDYGYFDV WGTGTTVTVSS(서열번호 23), 이것은 하기를 갖는다:
10G9 중쇄 CDR1: GFTFSDFWMS(서열번호 55)
10G9 중쇄 CDR2: DINSDGSAVNYAPSIKD(서열번호 66)
10G9 중쇄 CDR3: YDDYGYFDV(서열번호 72).
10G9 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTAGTGCAACCTGGGGGGTCACGGGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGACTTCTGGATGAGCTGGGTTCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGGCAGTGCAGTTAACTACGCACCATCCATAAAGGATCAATTCACTATCTTCAGAGACAATGACAAGAGGACCCTGCACCTGCAGATGATCAATGTTCGATCGGAGGACACAGCCACGTATTTCTGTGTGAGATATGATGATTACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 95).
l. 6A 서열
i. 경쇄
6A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPLT FGAGTKLELK(서열번호 96), 이것은 하기를 갖는다:
6A 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 24)
6A 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
6A 경쇄 CDR3: FQGSHVPLT(서열번호 157).
6A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAGGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 120).
ii. 중쇄
6A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK DDYMH WVKQRPEQGLEWIG CIDPENGDTEYASKFQD KATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTT YVGFAY WGQGTLVTVST(서열번호 108), 이것은 하기를 갖는다:
6A 중쇄 CDR1: DDYMH(서열번호 162)
6A 중쇄 CDR2: CIDPENGDTEYASKFQD(서열번호 170)
6A 중쇄 CDR3: YVGFAY(서열번호 182).
6A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAATTCCAGGACAAGGCCACTATAACAACAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTACA(서열번호 133).
m. 28A 서열
i. 경쇄
28A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSIPIGQPASISC KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSELDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEIK(서열번호 97), 이것은 하기를 갖는다:
28A 경쇄 CDR1: KSSQSLLDSDGKTYLN(서열번호 30)
28A 경쇄 CDR2: LVSELDS(서열번호 153)
28A 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
28A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGATTCCCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGTAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTCATCTATCTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATTTGGGAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 121).
ii. 중쇄
28A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFI SYGIT WVKQRTGQGLEWIG EIHPRSGNTYYNENFKD RASLTADKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCAR GGPGDY WGQGTTLTVSS(서열번호 109), 이것은 하기를 갖는다:
28A 중쇄 CDR1: SYGIT(서열번호 163)
28A 중쇄 CDR2: EIHPRSGNTYYNENFKD(서열번호 171)
28A 중쇄 CDR3: GGPGDY(서열번호 183).
28A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCATAAGCTATGGTATAACCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTCATCCTAGAAGTGGTAATACTTACTACAATGAGAATTTCAAGGACAGGGCCTCACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAGGTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGGGTGGGCCGGGGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 134).
n. 63A 서열
i. 경쇄
63A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSKLDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEIK(서열번호 98), 이것은 하기를 갖는다:
63A 경쇄 CDR1: KSSQSLLDSDGKTYLN(서열번호 30)
63A 경쇄 CDR2: LVSKLDS(서열번호 38)
63A 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
63A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 122).
ii. 중쇄
63A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT SYGIS WVKQRTGQGLEWIG QIYPRSDNTYYNERFKGK ATLTADKSSSTAYMALRSLTSEDSAVYFCAR EGGPDY WGQGTTLTVSS(서열번호 110), 이것은 하기를 갖는다:
63A 중쇄 CDR1: SYGIS(서열번호 164)
63A 중쇄 CDR2: QIYPRSDNTYYNERFKGK(서열번호 172)
63A 중쇄 CDR3: EGGPDY(서열번호 184).
63A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTAGAAGTGACAATACTTACTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGCGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 135).
o. 71A 서열
i. 경쇄
71A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPLT FGAGTKLELK(서열번호 99), 이것은 하기를 갖는다:
71A 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 24)
71A 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
71A 경쇄 CDR3: FQGSHVPLT(서열번호 157).
71A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GACGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTACAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 123).
ii. 중쇄
71A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK DDYMH WVKQRPEQGLEWIG CIDPENGDIEYASRFQG KATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTT YVGFGY WGQGTLVTVSA(서열번호 111), 이것은 하기를 갖는다:
71A 중쇄 CDR1: DDYMH(서열번호 162)
71A 중쇄 CDR2: CIDPENGDIEYASRFQG(서열번호 173)
71A 중쇄 CDR3: YVGFGY(서열번호 185).
71A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCTGAGAATGGTGATATTGAATATGCCTCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCACCAGCCTGACATCTGCGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 136).
p. 77A 서열
i. 경쇄
77A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISC RSSQNIVHSNGNTYLE WYLKKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGMYYC FQGSHVPLT FGAGTKLELK(서열번호 100), 이것은 하기를 갖는다:
77A 경쇄 CDR1: RSSQNIVHSNGNTYLE(서열번호 146)
77A 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
77A 경쇄 CDR3: FQGSHVPLT(서열번호 157).
77A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATAGTACATAGTAATGGTAACACCTATTTAGAATGGTACCTGAAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTCTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATGTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGAGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 124).
ii. 중쇄
77A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK DDYMH WVKQRPEQGLEWIG CIDPENGDTEYASKFQG KATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCTT YVGFGY WGQGTLVTVSA(서열번호 112), 이것은 하기를 갖는다:
77A 중쇄 CDR1: DDYMH(서열번호 162)
77A 중쇄 CDR2: CIDPENGDTEYASKFQG(서열번호 174)
77A 중쇄 CDR3: YVGFGY(서열번호 185).
77A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGTATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGTCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 137).
q. 80A 서열
i. 경쇄
80A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSNQSLLNSGDQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYC QNDYSYPLT FGAGTKLELK(서열번호 101), 이것은 하기를 갖는다:
80A 경쇄 CDR1: KSNQSLLNSGDQKNYLT(서열번호 147)
80A 경쇄 CDR2: WASTRES(서열번호 154)
80A 경쇄 CDR3: QNDYSYPLT(서열번호 158).
80A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAATCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAGATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTATTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 125).
ii. 중쇄
80A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCRASGYTFT DFYIN WVKQRPGQGLEWIA RIYPGSDETYYNEKFKD KVTLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAL WFFDV WGTGTTVTVSS(서열번호 113), 이것은 하기를 갖는다:
80A 중쇄 CDR1: DFYIN(서열번호 165)
80A 중쇄 CDR2: RIYPGSDETYYNEKFKD(서열번호 175)
80A 중쇄 CDR3: WFFDV(서열번호 186).
80A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAACTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTTCTACATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCTGGAAGTGATGAGACTTACTACAATGAGAAGTTTAAGGACAAGGTCACACTGACTGCAGAAAAATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCCCTCTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 138).
r. 82B 서열
i. 경쇄
82B 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSVTIGQSASISC KSSQSLLDSDGNTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSELDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEIK(서열번호 102), 이것은 하기를 갖는다:
82B 경쇄 CDR1: KSSQSLLDSDGNTYLN(서열번호 148)
82B 경쇄 CDR2: LVSELDS(서열번호 153)
82B 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
82B 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACTATTGGACAATCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCCTAGATAGTGATGGAAACACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATTTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 126).
ii. 중쇄
82B 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT SDGIT WVKQRTGQGLEWIG QIHPRSGNTYYNGKFKG KATLTADRSSSTTYMELRSLTSEDSAVYFCAK TGTGDY WGQGTTLTVSS(서열번호 114), 이것은 하기를 갖는다:
82B 중쇄 CDR1: SDGIT(서열번호 166)
82B 중쇄 CDR2: QIHPRSGNTYYNGKFKG(서열번호 176)
82B 중쇄 CDR3: TGTGDY(서열번호 187).
82B 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGATGGTATTACCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTCATCCTAGAAGTGGTAATACCTACTACAATGGGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAGATCCTCCAGCACAACGTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 139).
s. 83B 서열
i. 경쇄
83B 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EIQMTQSPSSMSASLGDRITITC QATQDIVKNLN WYQQKPGKPPSFLIY YATELAE GVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLESEDFADYYC LQFYEFPYT FGGGTKLEIK(서열번호 103), 이것은 하기를 갖는다:
83B 경쇄 CDR1: QATQDIVKNLN(서열번호 149)
83B 경쇄 CDR2: YATELAE(서열번호 155)
83B 경쇄 CDR3: LQFYEFPYT(서열번호 159).
83B 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACAGAATAACCATCACTTGCCAGGCAACTCAAGACATTGTTAAGAATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATGCAACTGAACTGGCAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTATTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAGTTTTATGAATTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(서열번호 127).
ii. 중쇄
83B 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT DYNMH WVKQSHGKSLEWIG YINPNNGGTSYNQKFKD KATLTVNKSSSTAFMELRSLASEDSAVYYCAR SDWEDC WGQGTTLTVSS(서열번호 115), 이것은 하기를 갖는다:
83B 중쇄 CDR1: DYNMH(서열번호 167)
83B 중쇄 CDR2: YINPNNGGTSYNQKFKD(서열번호 177)
83B 중쇄 CDR3: SDWEDC(서열번호 188).
83B 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAACCCTAACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAAACAAGTCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGGCATCGGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGTCTGACTGGGAAGACTGCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 140).
t. 92A 서열
i. 경쇄
92A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLIC SASSSVSYMH WYQQKSGTSPKLLIY RTSNLAS GVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYC HQWSSWT FGGGTQLEIK(서열번호 104), 이것은 하기를 갖는다:
92A 경쇄 CDR1: SASSSVSYMH(서열번호 150)
92A 경쇄 CDR2: RTSNLAS(서열번호 156)
92A 경쇄 CDR3: HQWSSWT(서열번호 160).
92A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAATTTGCAGTGCCAGCTCGAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTTACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCCAGCTGGAAATCAAA(서열번호 128).
ii. 중쇄
92A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVQLQESGPGLVKFSQSLSLTCSVTGYSIT SGYYWN WIRQFPGNKLEWMG YIRHDGSNNYNPSLKN RISITRDTSKNQFFLKLNSVITEDTATYYCVR EIYDGSSGYFDVWGT GTTVTVSS(서열번호 116), 이것은 하기를 갖는다:
92A 중쇄 CDR1: SGYYWN(서열번호 168)
92A 중쇄 CDR2: YIRHDGSNNYNPSLKN(서열번호 178)
92A 중쇄 CDR3: EIYDGSSGYFDVWGT(서열번호 189).
92A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAATTTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGACACGATGGTAGCAATAACTACAACCCGTCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGATTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAAGAGAGATCTATGATGGTTCCTCCGGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 141).
u. 93B 서열
i. 경쇄
93B 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQPEDLAVYYC QNDYSFPFT FGSGTELEMK(서열번호 105), 이것은 하기를 갖는다:
93B 경쇄 CDR1: KSSQSLLNSGNQKNYLT(서열번호 151)
93B 경쇄 CDR2: WASTRES(서열번호 154)
93B 경쇄 CDR3: QNDYSFPFT(서열번호 161).
93B 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAATTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGCCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAGAGTTGGAAATGAAA(서열번호 129).
ii. 중쇄
93B 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT DYYIN WVKQRPGQGLEWIA RIYPGNGNTDYNEKFKD KATLTAEKSSTTAYIQLSSLTSEDSAVYFCCL WYFDV WGTGTTVTVSS(서열번호 117), 이것은 하기를 갖는다:
93B 중쇄 CDR1: DYYIN(서열번호 169)
93B 중쇄 CDR2: RIYPGNGNTDYNEKFKD(서열번호 179)
93B 중쇄 CDR3: WYFDV(서열번호 190).
93B 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTACTATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCTGGAAATGGTAATACTGACTACAATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGCAGAAAAATCCTCCACCACTGCCTACATACAACTCAGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTTGCCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 142).
v. 99B 서열
i. 경쇄
99B 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC KSSQSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSKLDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEIK(서열번호 106), 이것은 하기를 갖는다:
99B 경쇄 CDR1: KSSQSLLDSDGKTYLN(서열번호 30)
99B 경쇄 CDR2: LVSKLDS(서열번호 38)
99B 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
99B 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 130).
ii. 중쇄
99B 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT SDGIT WLKQRTGQGLEWIG QIHPRSGNTYYNEKFKG KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAK TGTGDY WGQGTTLTVSS(서열번호 118), 이것은 하기를 갖는다:
99B 중쇄 CDR1: SDGIT(서열번호 166)
99B 중쇄 CDR2: QIHPRSGNTYYNEKFKG(서열번호 180)
99B 중쇄 CDR3: TGTGDY(서열번호 187).
99B 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGACGGTATAACCTGGCTGAAACAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTCATCCTAGAAGTGGTAATACCTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 143).
w. 104B 서열
i. 경쇄
104B 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC KSSLSLLDSDGKTYLN WLLQRPGQSPKRLIY LVSKLDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKIIRVEAEDLGIYYC WQGTHFPFT FGSGTKLEVK(서열번호 107), 이것은 하기를 갖는다:
104B 경쇄 CDR1: KSSLSLLDSDGKTYLN(서열번호 152)
104B 경쇄 CDR2: LVSKLDS(서열번호 38)
104B 경쇄 CDR3: WQGTHFPFT(서열번호 45).
104B 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCTGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCATCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAGTAAAA(서열번호 131).
ii. 중쇄
104B 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
QVQLQQSGPELARPGASVKLSCKASGYTFT SYGIS WVKQRTGQGLEWIG QIHPRSGNTYYNENFKG KATLTAAKSSSTAYLELRSLTSEDSAVYFCAR EGGPDY WGQGTTLTVSS(서열번호 119), 이것은 하기를 갖는다:
104B 중쇄 CDR1: SYGIS(서열번호 164)
104B 중쇄 CDR2: QIHPRSGNTYYNENFKG(서열번호 181)
104B 중쇄 CDR3: EGGPDY(서열번호 184).
104B 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGGTGAAGCAAAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTCATCCTAGAAGTGGTAATACTTACTACAATGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGCCAAATCCTCCAGCACAGCGTACCTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 144).
x. 105A 서열
i. 경쇄
105A 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPLT FGAGTKLELK(서열번호 99), 이것은 하기를 갖는다:
105A 경쇄 CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE(서열번호 24)
105A 경쇄 CDR2: KVSNRFS(서열번호 32)
105A 경쇄 CDR3: FQGSHVPLT(서열번호 157).
105A 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTACAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(서열번호 132).
ii. 중쇄
105A 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 하기와 같고:
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIK DDYMH WVKQRPEQGLEWIG CIDPENGDIEYASRFQG KATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTT YVGFGY WGQGTLVTVSA(서열번호 111), 이것은 하기를 갖는다:
105A 중쇄 CDR1: DDYMH(서열번호 162)
105A 중쇄 CDR2: CIDPENGDIEYASRFQG(서열번호 173)
105A 중쇄 CDR3: YVGFGY(서열번호 185).
105A 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 하기와 같다:
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCTGAGAATGGTGATATTGAATATGCCTCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCACCAGCCTGACATCTGCGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 145).
2. 항-Siglec-15 항체 및 이의 항원 결합 단편
1종 이상의 Siglec-15 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질, 또는 단편 또는 변이체에 결합하는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 비롯한, Siglec-15 결합 분자가 개시된다. 본 명세서에 개시된 항체는 전형적으로 Siglec-15 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 융합체 상에 존재하는 에피토프에 결합하는, 단클론성 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시형태에서 항체는 입체배좌 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서 항체 선형 에피토프에 결합한다. 선형 에피토프는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 그 초과의 연속적 아미노산 길이일 수 있다. 에피토프는 하나 이상의 비-아미노산 요소, 번역후 변형 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 번역후 번형의 예는 글리코실화, 포스포릴화, 아세틸화, 시트룰린화(citrullination) 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 항체는 하나 이상의 당 기에 의해서 적어도 부분적으로 형성된 에피토프에 결합할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 내인성 Siglec-15 폴리펩타이드, 또는 재조합 Siglec-15 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합물 상에 존재하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Siglec-15의 세포외 도메인, 또는 이의 단편, 또는 이로부터 형성된 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Siglec-15가 1종 이상의 리간드에 결합하는 것을 감소시키거나 예방하거나, Siglec-15에 의해서 조정된 세포내 신호전달을 감소시키거나, 또는 이들의 조합인 기능 차단 항체이다.
상기에 논의된 바와 같이, Siglec-15는 시알릴화된 당단백질에 결합하고, Neu5Acα2-6GalNAcα- 구조를 우세하게 인식한다. 하기 실험 실시예는 Siglec-15가 류신-풍부 반복부-함유 단백질 4C(LRRC4C)(Netrin-G1 리간드, 및 NGL-1이라고도 지칭됨)에 결합한다는 것을 보여주는데, 이것은 Neu5Acα2-6GalNAcα- 구조에 좌우되거나 이에 무관할 수 있다. LRRC4C에 대한 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 하기를 포함한다:
MLNKMTLHPQQIMIGPRFNRALFDPLLVVLLALQLLVVAGLVRAQTCPSVCSCSNQFSKVICVRKNLREVPDGISTNTRLLNLHENQIQIIKVNSFKHLRHLEILQLSRNHIRTIEIGAFNGLANLNTLELFDNRLTTIPNGAFVYLSKLKELWLRNNPIESIPSYAFNRIPSLRRLDLGELKRLSYISEGAFEGLSNLRYLNLAMCNLREIPNLTPLIKLDELDLSGNHLSAIRPGSFQGLMHLQKLWMIQSQIQVIERNAFDNLQSLVEINLAHNNLTLLPHDLFTPLHHLERIHLHHNPWNCNCDILWLSWWIKDMAPSNTACCARCNTPPNLKGRYIGELDQNYFTCYAPVIVEPPADLNVTEGMAAELKCRASTSLTSVSWITPNGTVMTHGAYKVRIAVLSDGTLNFTNVTVQDTGMYTCMVSNSVGNTTASATLNVTAATTTPFSYFSTVTVETMEPSQDEARTTDNNVGPTPVVDWETTNVTTSLTPQSTRSTEKTFTIPVTDINSGIPGIDEVMKTTKIIIGCFVAITLMAAVMLVIFYKMRKQHHRQNHHAPTRTVEIINVDDEITGDTPMESHLPMPAIEHEHLNHYNSYKSPFNHTTTVNTINSIHSSVHEPLLIRMNSKDNVQETQI(서열번호 192, UniProtKB - Q9HCJ2 LRC4C_인간 및 이의 전체가 본 명세서에 구체적으로 참고로 포함됨).
Siglec-15는 또한 면역 세포, 예컨대, T 세포 상의 반대-수용체(S15-CR)에 결합할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 기능 차단(길항성) Siglec-15 결합 분자는 Siglec-15와 이의 리간드, 예컨대, Neu5Acα2-6GalNAcα- 구조, LRRC4C, 또는 Siglec-15-반대-수용체를 갖는 당단백질의 상호작용을 감소시키거나, 저해하거나, 예방한다.
일부 실시형태에서, Siglec-15에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합은 면역 활성화을 증가시키거나, 면역 억제를 감소시키거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Siglec-15의 Ig-유사 V-유형 도메인 또는 Ig-유사 C2-유형 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 Siglec-15의 시알산 결합 부위를 포함한다(예를 들어 에피토프는 서열번호 1의 잔기 143을 포함한다).
일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A와 동일한 에피토프의 부분 또는 전부에 결합한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체배좌 에피토프일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A와 동일한 에피토프 특이성을 갖는다. 이것은 단클론성 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A의 파라토프를 함유하는 재조합 항체를 생산함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 분자는 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A 중 임의의 것의 경쇄 CDR의 일부 또는 전부, 전체 경쇄 가변 영역, 중쇄 CDR의 일부 또는 전부, 전체 중쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
Siglec-15-결합 분자는 상기에 열거된 클론의 CDR의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 CDR을 포함할 수 있고, 이것은 Siglec-15에 대한 면역특이적 결합을 나타낸다.
예를 들어, 개시된 분자는 서열번호 24 내지 45 및 146 내지 161 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 분자는 적어도 하나의 경쇄 CDR1, 하나의 경쇄 CDR2, 및 하나의 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자는 서열번호 24 내지 31 및 146 내지 152로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 분자는 서열번호 32 내지 38 및 153 내지 156으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 분자는 서열번호 39 내지 45 및 157 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 분자는 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 여기서 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR3은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
개시된 분자는 서열번호 46 내지 73 및 162 내지 190 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 분자는 적어도 하나의 중쇄 CDR1, 하나의 중쇄 CDR2, 및 하나의 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다. 분자는 서열번호 46 내지 55 및 162 내지 169로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1을 포함할 수 있다. 분자는 서열번호 56 내지 66 및 170 내지 181로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2를 포함할 수 있다. 분자는 서열번호 67 내지 73 및 182 내지 190으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 분자는 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3을 포함하고, 여기서 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Siglec-15-결합 분자는 상기에 열거된 클론 중 임의의 것에 의해서 생산된 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이것은 인간 Siglec-15에 대한 면역특이적 결합을 나타낸다.
예를 들어, 개시된 Siglec-15-결합 분자는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 이것은 Siglec-15에 대한 면역특이적 결합을 나타낸다.
추가로 또는 대안적으로 개시된 Siglec-15-결합 분자는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 이것은 Siglec-15에 대한 면역특이적 결합을 나타낸다.
Siglec-15-결합 분자는 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR 및 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR(예를 들어 일부 실시형태에서, 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR)을 포함하는 면역글로불린 분자(예를 들어 항체, 다이아바디, 융합 단백질 등)일 수 있고, 여기서 경쇄 CDR은 하기를 포함한다:
(1) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1;
(2) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR2;
(3) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR3;
(4) 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR2;
(5) 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3;
(6) 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
또는
(7) 마우스 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR 1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3.
분자는 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR 및 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR(예를 들어 일부 실시형태에서, 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR)을 포함하는 면역글로불린 분자일 수 있고, 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
(1) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1;
(2) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR2;
(3) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR3;
(4) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2;
(5) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR3;
(6) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3;
또는
(7) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3.
분자는 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR 및 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR(예를 들어 일부 실시형태에서, 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR)을 포함하는 면역글로불린 분자일 수 있고, 여기서 경쇄 CDR은 하기를 포함한다:
(1) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1;
(2) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR2;
(3) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR3;
(4) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR2;
(5) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1 및 경쇄 CDR3;
(6) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
또는
(7) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3;
그리고 여기서 중쇄 CDR은 하기를 포함한다:
(1) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1;
(2) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR2;
(3) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR3;
(4) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR2;
(5) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1 및 중쇄 CDR3;
(6) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3;
또는
(7) 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 인간화된 변이체의 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3.
예를 들어, 항체는 뮤린 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A, 또는 이의 키메라 항체, 또는 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 또는 105A의 CDR(들)에 상응하는 CDR(들)을 갖는 인간화된 변이체 하나 이상의 CDR을 가질 수 있다.
일 실시형태는 서열번호 227, 228, 및 229로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 가변 경쇄 아미노산 서열 및/또는 서열번호 230, 231, 233, 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 가변 중쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 단클론성 항체를 제공한다.
3. 항체 조성물
개시된 Siglec-15-결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 개시된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 임의의 부류의 전체 면역글로불린(즉, 무손상 항체), 이의 단편, 및 항체의 적어도 항원 결합 가변 도메인을 함유하는 합성 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 분자는 항체 경쇄뿐만 아니라 적어도 항체 중쇄의 가변 도메인 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 분자는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역(특히, CH1 및 힌지 영역, 또는 CH1, 힌지 및 CH2 영역, 또는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의의 부류의 면역글로불린 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불변 도메인은 보체 고정 불변 도메인인데, 여기서 항체는 세포독성 활성도를 나타내고, 그 부류는 전형적으로 IgG1인 것이 바람직하다. 다른 실시형태에서, 이러한 세포독성 활성도가 바람직하지 않은 경우, 불변 도메인은 IgG2 또는 IgG4 부류를 가질 수 있다. 항체는 하나 초과의 부류 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있고, 목적하는 효과기 기능을 최적화하기 위해서 특정 불변 도메인을 선택하는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술에 포함된다.
가변 도메인은 항체 중에서 서열이 상이하고, 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 통상적으로 항체의 가변 도메인을 통해서 균일하게 분포되지 않는다. 그것은 전형적으로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두 내의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 분절에 집중된다. 가변 도메인의 보다 상당히 보존되는 부분을 프레임워크(FR)라 부른다. 네이티브 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 베타-시트 구조를 부분적으로 형성하는 3개의 CDR에 의해서 연결된 주로 베타-시트 구성을 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄 내의 CDR은 FR 영역과 인접하게 보유되고, 다른 쇄로부터의 CDR은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.
또한 생물활성도를 갖는 항체의 단편이 개시된다. 다른 서열에 부착되든 부착되지 않든 간에 이러한 단편은 특정 영역 또는 특이적 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택된 변형을 포함하되, 단편의 활성도는 비변형된 항체 또는 항체 단편과 비교할 때 상당히 변경되거나 손상되지 않는다.
기술은 또한 본 개시내용의 항원 펩타이드에 특이적인 단일 쇄 항체의 생산을 위해서 개작될 수 있다. 단일 쇄 항체의 생산 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 단일 쇄 항체는 짧은 펩타이드 링커를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합하여, 단일 분자 상에서 항원 결합 부위를 재구성함으로써 생성될 수 있다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩타이드 또는 링커를 통해서 다른 가변 도메인의 N-말단에 테더링된 단일 쇄 항체 가변 단편(scFv)은 항원 결합 및 결합의 특이성을 상당히 방해하지 않으면서 개발되었다. 링커는 중쇄 및 경쇄가 이의 적절한 입체배좌 배향으로 함께 결합하는 것을 허용하도록 선택된다.
2가 단일 쇄 가변 단편(다이-scFv)은 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있다. 이것은 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드를 생산하여, 탠덤 scFv를 산출함으로써 수행될 수 있다. ScFv는 또한 2개의 가변 영역이 함께 접히기에는 너무 짧아서, scFv를 이량체화시키는 링커 펩타이드(약 5개의 아미노산)를 사용하여 설계될 수 있다. 이러한 유형은 다이아바디로서 공지되어 있다. 다이아바디는 상응하는 scFv보다 최대 40배 더 낮은 해리 상수를 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 다이아바디가 이의 표적에 대해서 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 것을 의미한다. 훨씬 더 짧은 링커(하나 이상의 아미노산)이 삼량체(트라이아바디 또는 트라이바디)의 형성으로 이어진다. 테트라바디가 또한 생산되었다. 이것은 다이아바디보다 이의 표적에 대해서 훨씬 더 높은 친화도를 나타낸다.
단클론성 항체는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되며, 즉, 집단 내의 개별 항체가 항체 분자의 작은 하위세트에 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속한 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속한 항체 내의 상응하는 서열, 뿐만 아니라 목적하는 길항성 활성도를 나타내는 한 이러한 항체의 단편과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다.
a. 키메라 및 인간화된 항체
개시된 서열 및 이의 기능적 변이체 중 하나 이상을 포함하는 키메라 항체 및 이의 항원 결합 단편이 또한 제공된다.
키메라 항체를 생산하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202]; 및 미국 특허 제6,311,415호, 제5,807,715호, 제4,816,567호 및 제4,816,397호 참고). 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 키메라 항체는 예를 들어, CDR-이식(유럽 특허 제EP 239,400호; 국제 공개 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5 530,101호, 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing)(유럽 특허 제EP 592, 106호; 제EP 519, 596호; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805; 및 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969]), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5, 565, 332호)을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
개시된 분자는 인간 또는 인간화된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 다수의 비인간 항체(예를 들어, 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래된 것)는 인간에서 본래 항원성이기 때문에, 인간에게 투여될 때 바람직하지 않은 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 따라서, 방법에서 인간 또는 인간화된 항체의 사용은 인간에게 투여된 항체가 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 기회를 줄이기 위해서 제공된다.
면역화 시, 내생 글로불린 생산의 부재 하에서 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(J(H)) 유전자의 동형 결실은 내생 항체 생산의 완전한 저해를 초래한다고 설명되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서의 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 시험감염 시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다.
임의로, 항체는 다른 종에서 생성되고, 및 인간에서의 투여를 위해서 "인간화된다". 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화된 항체는 수령인 항체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해서 대체된 인간 면역글로불린(수령인 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해서 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수령인 항체에서도 내수송된 CDR 또는 프레임워크에서도 발견되지 않는 잔기를 또한 함유할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 전부를 함유할 것인데, 여기서 CDR 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 최적으로 함유할 것이다.
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 유럽 특허 제EP 239,400호, 제EP 592,106호, 및 제EP 519,596호; 국제 공개 제WO 91/09967호 및 제WO 93/17105호; 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 제5,565,332호, 제5,585,089호, 제5,766,886호 및 제6,407,213호; 및 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-360; Morea et al., 2000, Methods 20:267-79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-973; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596] 참고).
일반적으로, 인간화된 항체는 비인간인 기원으로부터의 그것 내에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 종종 "내수송" 잔기로서 지칭되는데, 이것은 전형적으로 "내수송" 가변 도메인으로부터 취해진다. 항체 인간화 기술은 일반적으로 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 DNA 서열을 조정하기 위해서 재조합 DNA 기술을 사용하는 것을 포함한다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체함으로써 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 비인간 항체(또는 이의 단편)의 인간화된 형태는 키메라 항체 또는 단편이며, 여기서 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 짧은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되어 있다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부의 CDR 잔기 및 가능하게는 일부의 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해서 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는 데 사용될 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 선택은 항원성을 감소시키기 위해서 매우 중요할 수 있다. "최상 정합" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해서 스크리닝된다. 이어서 설치류의 것에 가장 유사한 인간 서열이 인간화된 항체에 대해서 인간 프레임워크(FR)로서 허용된다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화된 항체에 대해서 사용될 수 있다.
항체는 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되는 것이 추가로 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 인간화된 항체는 모체 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모체 서열 및 상이한 개념의 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해서 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 입수 가능하고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체배좌 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식에서, FR 잔기는 컨센서스 및 내수송 서열로부터 선택 및 조합될 수 있어서 목적하는 항체 특징, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여된다.
인간, 인간화된 또는 키메라 항체 유도체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 전부를 포함할 수 있는데, 여기서 CDR 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 것에 상응하고, 프레임워크 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 이러한 항체는 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함한다. 이러한 항체의 불변 도메인은 항체의 제안된 기능, 특히 요구될 수 있는 효과기 기능에 관련하여 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 항체의 불변 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 인간화된 항체 유도체가 치료 용도를 위해서 의도되고, 항체 효과기 기능, 예컨대, 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존 세포독성(CDC) 활성도가 필요한 경우 구체적인 실시형태에서, 특히 IgG1 및 IgG3 아이소타입의 인간 IgG 불변 도메인이 사용된다. 대안적인 실시형태에서, 항체가 치료 용도를 의해서 의도되고 항체 효과기 기능이 요구되지 않는 경우 IgG2 및 IgG4 아이소타입이 사용된다. Fc 불변 도메인은 항체 효과기 기능을 변경시키는 하나 이상의 아미노산 변형, 예컨대, 미국 특허 출원 공재 제2005/0037000호 및 제2005/0064514호에 개시된 것을 포함한다.
인간화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모체 서열에 정확하게 상응할 필요는 없고, 예를 들어, 공여자 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 적어도 하나의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해서 돌연변이될 수 있어서 그 부위에서의 CDR 또는 프레임워크 잔기는 컨센서스 또는 공여자 항체 중 어느 하나에 상응하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않다. 통상적으로, 인간화된 항체 잔기의 적어도 75%, 보다 통상적으로는 90% 또는 95% 초과가 모체 프레임워크 영역(FR) 및 CDR 서열의 것에 상응하다. 인간화된 항체는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있는데, 이러한 기술은 CDR-이식(유럽 특허 제EP 239,400호; 국제 공개 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 리서페이싱(유럽 특허 제EP 592,106호 및 제EP 519,596호; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973)], 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호), 및 미국 특허 제6,407,213호, 제5,766,886호, 제5,585,089호, 국제 공개 제WO 9317105호, 문헌[Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al., 2000, Methods 20:267-79, Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596]에 기술된 기술을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경시키기 위해서, 예를 들어, 개선시키기 위해서 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하기 위해서 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하고 특정 위치에서 특별한 프레임워크 잔기를 식별하기 위해서 서열을 비교함으로써 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해서 식별된다 (예를 들어, 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제5,585,089호; 미국 공개 제2004/0049014호 및 제2003/0229208호; 미국 특허 제6, 350,861호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,693,761호; 제5,585,089호; 및 제5, 530,101호 및 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature 332:323] 참고).
개시된 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체의 인간, 키메라 또는 인간화된 유도체는 인간에서 생체내 방법을 위해서 사용될 수 있다. 뮤린 항체 또는 다른 종의 항체는 다수의 용도(예를 들어, 시험관내 또는 동일계 검출 검정, 급성 생체내 용도)를 위해서 이롭게 사용될 수 있다. 이러한 인간 또는 인간화된 항체는 1종 이상의 비인간 CDR의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 인간화된 항체 유도체는 비유도체 인간화된 항체와 비교하는 경우 실질적으로 동일한 결합, 더 강한 결합 또는 더 약한 결합을 가질 수 있다. 구체적인 실시형태에서, CDR의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기는 치환, 결실 또는 첨가될 수 있다(즉, 돌연변이됨). 완전 인간 항체가 인간 대상체의 치료적 치료를 위해서 특히 바람직하다.
이러한 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이 방법을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다(미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 국제 공개 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호 참고). 이러한 인간 항체는 기능적 외인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다.
예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 동종 재조합에 의해서 마우스 배아 줄기세포 내에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기세포 내에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 동종 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별개로 또는 동시에 비기능성이 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실은 외인성 항체 생산을 예방한다. 변형된 배아 줄기세포는 낭포 내에서 확장되거나 미세주입되어 키메라 마우스를 생산한다. 이어서 키메라 마우스는 사육되어 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원 예를 들어, 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 사용하여 종래의 방법을 사용하여 면역화된다. 항원에 대해서 지향되는 단클론성 항체는 종래의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 수득될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,916,771호 참고). 트랜스제닉 마우스에 의해서 번식된 인간 면역글로불린 트랜스젠은 B 세포 분화 동안 재배열하고, 그 후 종류 변환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개요를 위해서 문헌[Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]을 참고하기 바라며, 이의 전문은 참고로 본 명세서에 포함된다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서 국제 공개 제WO 98/24893호, 제WO 96/34096호, 및 제WO 96/33735호; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호, 및 제5,939,598호를 참고하기 바라며, 이의 전문은 참고로 본 명세서에 포함된다. 또한, 회사, 예컨대, 아브제닉스, 인크(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 메다렉스(Medarex)(미국 뉴저지주 프린스톤 소재)와 계약을 맺어 상기에 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해서 지향된 인간 항체를 제공할 수 있다.
인간 억셉터 프레임워크 서열에 대한 DNA 서열 암호는 인간 생식계열 VH 분절 VH1-18 및 JH6 및 인간 생식계열 VL 분절 VK-A26 및 JK4로부터의 FR 분절을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, CDR 중 1종 이상은 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 프레임워크 영역 내에 삽입된다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 컨센서스 프레임워크 영역, 및 인간 프레임워크 영역일 수 있다(인간 프레임워크 영역의 목록에 대해서는 문헌[Chothia et al., 1998, "Structural Determinants In The Sequences Of Immunoglobulin Variable Domain," J. Mol. Biol. 278: 457-479]을 참고하기 바란다).
i. 인간화된 5G12
일 실시형태는 인간화된 5G12 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
b. 단일 쇄 항체
Siglec-15-결합 분자는 단일 쇄 항체일 수 있다. 단일 쇄 항체의 생산 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 단일 쇄 항체는 짧은 펩타이드 링커를 사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합하여, 단일 분자 상에서 항원 결합 부위를 재구성함으로써 생성된다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 15 내지 25개의 아미노산 펩타이드 또는 링커를 통해서 다른 가변 도메인의 N-말단에 테더링된 단일 쇄 항체 가변 단편(scFv)은 항원 결합 및 결합의 특이성을 상당히 방해하지 않으면서 개발되었다. 링커는 중쇄 및 경쇄가 이의 적절한 입체배좌 배향으로 함께 결합하는 것을 허용하도록 선택된다. 이들 Fv는 네이티브 항체의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 불변 영역(Fc)이 존재하지 않는다.
c. 1가 항체
시험관내 방법이 또한 1가 항체를 제조하기에 적합하다. 단편, 특히, Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 관련 기술 분야에 공지된 일상적인 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 소화는 파파인을 사용하여 수행될 수 있다. 항체의 파파인 소화는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위, 및 잔류하는 Fc 단편을 갖는, Fab 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는, 2개의 항원 조합 부위를 갖고, 항원을 여전히 가교결합할 수 있는, F(ab')2 단편이라 지칭되는 단편을 산출한다.
항체 소화에서 생산되는 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 도메인의 카복시 말단에서의 몇몇 잔기의 첨가에 의해서 Fab 단편과 상이하다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 다이설파이드 브리지에 의해서 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편이다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. 항체 단편은 본래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
d. 항체 단편의 접합체 또는 융합체
항체의 표적화 기능은 항체 또는 이의 단편을 치료제와 커플링시킴으로써 치료적으로 사용될 수 있다. 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는, 항체 또는 단편(예를 들어, 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc))과 치료제의 이러한 커플링은 면역접합체를 제조함으로써 또는 융합 단백질을 제조함으로써 달성될 수 있다.
항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는, 항체 또는 단편과 치료제의 이러한 커플링은 면역접합체를 제조함으로써 또는 융합 단백질을 제조함으로써 또는 항체 또는 단편을 핵산, 예컨대, siRNA에 연결함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 이의 반감기를 변경시키도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 항체의 반감기를 증가시켜 항체가 더 긴 시간 기간 동안 순환계 또는 치료 부위에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 순환계 또는 치료될 부위에서 연장된 시간 기간 동안 항체의 역가를 유지시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체는 예를 들어, Xtend(상표명) 항체 반감기 연장 기술(젠코어(Xencor), 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재)을 사용하여 반감기를 연장시킨 Fc 변이체로 조작될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항-DNA 항체의 반감기는 가능한 부작용을 감소시키기 위해서 감쇠된다. 개시된 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위해서 사용될 수 있다. 약물 모이어티는 전통적인 화학 치료제에 제한되는 것으로서 이해되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성도를 보유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 독소, 예컨대, 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소를 포함할 수 있다.
e. 단일특이적 항체 및 다중특이적 항체
일부 실시형태에서 개시된 항체는 Siglec-15에만 결합하는, 단일특이적이다. 인간 Siglec-15에 대한 특이성에 더하여, 상이한 면역계 표적에 대해서 특이성을 나타내는, 이러한 항체의 이중특이적 유도체, 이러한 항체의 삼중특이적 유도체 또는 더 높은 다중 특이성의 유도체 항체가 또한 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체는 인간 Siglec-15 및 특정 세포 유형 및 조직에 대해서 항체를 표적화하는 데 중요한 항원(예를 들어, 치료될 종양의 암 항원과 연관된 항원)에 결합할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 다중특이적 항체는 면역조정 효과를 향상시키고, 하나의 분자에서 다수의 작용 기전, 예컨대, 리간드 차단, 면역 세포 활성화 및 직접적인 종양 표적화를 조합하기 위해서 대안적인 면역조정 경로에 관여된 분자, 예컨대, B7-H1, PD-1, CTLA4, TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, LIGHT 또는 LAG3에 결합한다.
f. 유도체
개시된 Siglec-15-결합 분자 중 임의의 것의 "유도체"의 생산 및 사용이 또한 개시된다. 유도체 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해서 변형될 수 있다. 용어 유도체는 비아미노산 변형, 예를 들어, 글리코실화(예를 들어, 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등의 내용물을 가짐), 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미데이트화될 수 있고, 공지된 보호/차단기에 의해서 유도체화될 수 있고, 단백질분해 절단될 수 있고, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대해서 연결될 수 있는 등의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변경된 탄수화물 변형은 하기 중 하나 이상을 조정한다: 항체의 가용화, 하위세포 이송의 용이성 및 항체의 분비, 항체 어셈블리의 촉진, 입체배좌 온전성 및 항체-매개된 효과기 기능.
구체적인 실시형태에서 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형이 없는 항체에 비해서 항체 매개된 효과기 기능을 향상시킨다. 변경된 항체 매개된 효과기 기능으로 이어지는 탄수화물 변형은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294)] 참고). 탄수화물 함량을 변경시키는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Wallick, S.C. et al. (1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen," J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M.H. et al. (1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region," J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E.G. et al. (1995) "The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody," Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003) "Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering," Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740] 참고).
개시된 항체는 목적하는 기능을 매개하는 데 있어서 항체의 더 높은 효능을 증가시키기 위해서 재조합 수단에 의해서 변형될 수 있다. 따라서, 항체는 재조합 수단을 사용한 치환에 의해서 변형될 수 있다. 전형적으로, 치환은 보존적 치환일 것이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역 내의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 잔기로 대체될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호, 미국 특허 제6,194,551호, 출원 제WO 9958572호; 및 문헌[Angal, et al., Mol. Immunol. 30:105-08 (1993)] 참고). 아미노산의 변형은 아미노산의 결실, 첨가, 치환을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변화는 목적하는 활성도, 예를 들어, 보체-의존 세포독성을 감소시키기 위해서 수행된다. 빈번하게는, 항체는 검출 가능한 신호를 제공하는 물질에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합됨으로써 표지된다. 광범위한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있고, 과학 및 특허 문헌 둘 모두에 널리 보고되어 있다. 이러한 항체는 Siglec-15 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 또는 융합체에 대한 결합에 대해서 스크리닝될 수 있다(예를 들어, 문헌[Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996] 참고).
일부 실시형태에서, 항체 유도체는 모체 항체와 유사하거나 동일한 기능을 보유할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 항체 유도체는 모체 항체에 비해서 변경된 활성도를 나타낼 것이다. 예를 들어, 유도체 항체(또는 이의 단편)는 이의 에피토프에 보다 단단하게 결합할 수 있거나 모체 항체보다 단백질분해에 더 내성일 수 있다.
유도체화된 항체에서의 치환, 첨가 또는 결실은 항체의 Fc 영역에 존재할 수 있고, 이에 의해서 1종 이상의 FcγR에 대한 항체의 결합 친화도를 변경하기 위해서 제공될 수 있다. 1종 이상의 FcγR에 대해서 변형된 결합을 갖는 항체를 변형시키는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, PCT 공개 제WO 04/029207호, 제WO 04/029092호, 제WO 04/028564호, 제WO 99/58572호, 제WO 99/51642호, 제WO 98/23289호, 제WO 89/07142호, 제WO 88/07089호, 및 미국 특허 제5,843,597호 및 제5,642,821호 참고).
일부 실시형태에서, 항체는 Fc 영역이 결실(예를 들어, Fab 또는 F(ab)2 등)되거나 분자가 감소된 Fc 수용체(FcR) 결합 활성도를 갖거나 결합 활성도를 갖지 않거나, 또는 향상된 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC) 활성도를 나타내도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 항체는 FcγR, 예를 들어, FcγRIIIA를 활성화시키기 위해서 변경된 친화도를 갖는다. 이러한 변형은 또한 변경된 Fc-매개된 효과기 기능을 가질 수 있다. Fc-매개된 효과기 기능은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(미국 특허 제6,194,551호, 및 제WO 00/42072호 참고). 특정 실시형태에서, Fc 영역의 변형은 변경된 항체-매개된 효과기 기능, 다른 Fc 수용체(예를 들어, Fc 활성화 수용체)에 대한 변경된 결합, 변경된 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성도, 변경된 C1q 결합 활성도, 변경된 보체-의존 세포독성(CDC), 식세포 활성도, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 항체를 생성한다.
유도체화된 항체는 포유동물, 예컨대, 인간에서 모체 항체의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 변경시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 변경은 15일 초과, 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기를 초래할 수 있다. 포유동물, 예컨대, 인간에서 인간화된 항체 또는 이의 단편의 증가된 반감기는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서, 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/거나 투여될 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들어, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 관여되는 것으로 식별된 아미노산 잔기를 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 첨가)시킴으로써 생성될 수 있다. 인간화된 항체는 생물학적 반감기를 증가시키도록 조작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,277,375호 참고). 예를 들어, 인간화된 항체는 증가된 생체내 또는 혈청 반감기를 갖기 위해서 Fc-힌지 도메인에서 조작될 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 중합체 분자, 예컨대, 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 부착함으로써 생성될 수 있다. PEG는 상기 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해서 또는 라이신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해서 다작용성 링커를 사용하여 또는 사용하지 않고 상기 항체 또는 항체 단편에 부착될 수 있다. 생물학적 활성도의 최소 손실을 초래하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 접합 정도는 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장하기 위해서 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해서 면밀하게 모니터링될 것이다. 미반응 PEG는 예를 들어, 크기 배제 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해서 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다.
항체는 또한 실질적으로 면역원성 반응이 없는 포유동물 순환계 내로 주사될 수 있는 조성물을 제공하기 위해서 데비이스(Davis) 등(미국 특허 제4,179,337호 참고)에 의해서 기술된 방법 및 커플링제에 의해서 변형될 수 있다.
인간화된 항체의 프레임워크 잔기는 변형될 수 있다. 프레임워크 영역 내의 잔기는 항원 결합을 변경시키기 위해서, 예를 들어, 개선시키기 위해서 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하기 위해서 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하고 특정 위치에서 특별한 프레임워크 잔기를 식별하기 위해서 서열을 비교함으로써 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해서 식별될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 및 문헌[Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327] 참고).
개시된 Siglec-15-결합 분자는 이종 분자(즉, 비관련 분자)에 재조합 방식으로 융합되거나 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접합 둘 모두 포함)될 수 있다. 융합은 반드시 직접적일 필요는 없지만, 링커 서열을 통해서 일어날 수 있다.
일부 실시형태에서 이러한 이종 분자는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이다. 이러한 이종 분자는 대안적으로 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 약물 모이어티, 예컨대, 대식세포-특이적 표적화 시약(예컨대, 세포내 카복실에스터라제, hCE1(Needham, L.A. et al. (2011) "Drug Targeting To Monocytes And Macrophages Using Esterase-Sensitive Chemical Motif," J. Pharmacol. Exp. Ther. DOI:10.1124/jpet.111.183640), 키틴 및 키토산(Muzzarelli, R.A. (2010) "Chitins And Chitosans As Immunoadjuvants And Non-Allergenic Drug Carriers," Mar Drugs 8(2):292-312), 갈락토실화된 저밀도 지질단백질(Wu, F. et al. (009) "Galactosylated LDL Nanoparticles: A Novel Targeting Delivery System To Deliver Antigen To Macrophages And Enhance Antigen Specific T Cell Responses," Molec. Pharm. 6(5):1506-1517), N-폼일-Met-Leu-Phe(fMLF), 대식세포-특이적 화학 유인제(Wan, L. et al. (2008) "Optimizing Size And Copy Number For PEG-Fmlf (N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine) Nanocarrier Uptake By Macrophages," Bioconjug. Chem. 19(1):28-38), 말레일화 또는 만노실화된 단백질, 예컨대, 말레일화된 알부민(Anatelli, F. et al. (2006) "Macrophage-Targeted Photosensitizer Conjugate Delivered By Intratumoral Injection," Mol Pharm. 3(6):654-664; Bansal, P. et al. (1999) "MHC Class I-Restricted Presentation Of Maleylated Protein Binding To Scavenger Receptors," J. Immunol. 162(8):4430-4437); 또한 Mukhopadhyay, A. et al. (2003) "Intracellular Delivery Of Drugs To Macrophages," Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 84:183-209 참고), 독소(예컨대, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소(즉, PE-40), 다이프테리아 독소, 리신, 젤로닌, 또는 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질), 단백질(예컨대, 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 또는 세포사멸제(예를 들어, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β)), 생물학적 반응 변형제(예컨대, 예를 들어, 림포카인(예를 들어, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6")), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 집락 자극 인자("G-CSF"), 또는 대식세포 집락 자극 인자, ("M-CSF"), 또는 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬("GH"))), 사이토톡신(예를 들어, 세포정지제 또는 세포파괴제, 예컨대, 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체), 항대사체(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, BiCNU(등록상표)(카르무스틴; BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파마이드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 또는 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 분자는 제2 항체와 접합되어 미국 특허 제4,676,980호에서 세갈(Segal)에 의해서 기술된 바와 같은 항체 이종접합체를 형성한다. 이러한 이종접합체 항체는 합텐(예컨대, 플루오레세인 등), 또는 세포 마커(예를 들어, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT 등) 또는 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, TGF-베타, IFNg, Flt3, BLys) 또는 케모카인(예를 들어, CCL21) 등에 추가로 결합할 수 있다.
융합 단백질의 Fc 부분은 아이소타입 또는 하위부류에 의해서 달라질 수 있고/있거나, 키메라 또는 혼성체일 수 있고/있거나, 예를 들어 효과기 기능을 개선시키고, 반감기 및 조직 접근성을 제어하고, 생물물리학적 특징, 예컨대 안정성을 증가시키고, 생산 효율(그리고 비용 감소)를 증가시키기 위해서 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질의 작제 및 이의 제조 방법에 유용한 다수의 변형이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452, Swann, P.G. (2008) "Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:493-499 (2008), and Presta, L.G. (2008) "Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:460-470]을 참고하기 바란다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 네이티브 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 혼성체, 예를 들어, IgG2/IgG4 Fc 불변 영역으로 이루어진 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은 Fc 감마 수용체 및 보체에 대한 결합을 예방하도록 변형된 IgG4, 1종 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 개선시키도록 변형된 IgG1, 효과기 기능을 최소화하도록 변형된 IgG1(아미노산 변화), (전형적으로, 발현 숙주를 변화시킴으로써) 변경된 글리칸을 갖는/글리칸을 갖지 않는 IgG1, 및 FcRn에 대한 변경된 pH-의존적 결합을 갖는 IgG1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 힌지 영역보다 적은 영역을 포함할 수 있다. 비호지킨 림프종 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증에 대해서 리툭시맙(CD20에 대한 키메라 마우스/인간 IgG1 단클론성 항체)으로 치료된 환자에서의 치료 결과는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 대한 구별되는 고유 친화도를 갖는 Fcγ 수용체의 대립유전자 변이체의 각각의 발현과 상관관계가 있다. 특히, 저 친화도 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)의 고 친화도 대립유전자를 갖는 환자는 더 높은 반응률을 나타내었고, 비호지킨 림프종의 경우, 무진행 생존을 개선시켰다. 따라서, Fc 도메인에서 개시된 항체 및 단편은 저 친화도 저해성 Fc 수용체 CD32B(FcγRIIB)에 대한 결합을 감소시키고, 야생형 결합 수준을 유지시키거나 저 친화도 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태는 반감기를 증가시키는, FcγR에 대해서 감소된 결합을 갖는 IgG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체를 포함한다. 대표적인 IgG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체는 문헌[Angal, S. et al. (1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (Igg4) Antibody," Molec. Immunol. 30(1):105-108; Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452]; 및 미국 특허 제6,982,323호에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서 IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 변형되고; 예를 들어, 문헌[Angal, S. et al. (1993)]에는 세린 241이 프롤린으로 대체된 IgG1 및 IgG2 변이체가 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 분자의 Fc 도메인은 CD16A에 대한 결합을 향상시키는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유한다. CD16A에 대한 결합을 증가시키고, CD32B에 대한 결합을 감소시키는 인간 IgG1의 Fc 도메인 내의 대다수의 치환은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 문헌[Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890]에 기술되어 있다. CD32B에 대한 감소된 결합 및/또는 CD16A에 대한 증가된 결합을 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환은 임의의 조합으로 인간 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P 및 Y300L 치환을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환을 함유하는데, 그 이유는 이러한 돌연변이가 FcR 결합을 폐지하기 때문이다.
치료 모이어티를 항체에 접합시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있고; 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp.　243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc. ); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; 및 Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:119-158]을 참고하기 바란다.
개시된 분자 중 임의의 것을 마커 서열, 예컨대, 펩타이드에 융합시켜 정제를 용이하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩타이드인 헤마글루티닌 "HA" 태그이고, 이것은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프(Wilson, I.A. et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778) 및 "플래그(flag)" 태그(Knappik, A. et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques 17(4):754-761)에 상응한다.
개시된 Siglec-15-결합 분자는 진단제 또는 치료제 또는 혈청 반감기가 증가될 필요가 있는 또 다른 분자에 접합될 수 있다. 항체는 예를 들어, 임상 시험 절차의 일부로서 질환, 장애 또는 감염의 발달 또는 진행을 모니터링하기 위해서, 예를 들어, 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해서, 또는 특정 요법에 반응할 가능성이 더 높은 환자(예컨대, 높은 수준의 Siglec-15를 발현하는 사람)를 선택하기 위해서 진단학적으로(생체내, 동일계내 또는 시험관내) 사용될 수 있다.
검출은 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을, 검출 가능한 물질에 커플링시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 물질, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 검출 가능한 물질은 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 중간체(예를 들어, 관련 기술 분야에 공지된 링커 등)를 통해서 항체에 직접 또는 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다(예를 들어, 진단학에서 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온의 경우 미국 특허 제4,741,900호 참고). 이러한 진단 및 검출은 항체에 검출 가능한 물질, 예컨대, 비제한적으로 다양한 효소, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 효소; 보결기 복합체, 예컨대, 비제한적으로 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대, 비제한적으로, 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대, 비제한적으로, 비스무트(213Bi), 탄소(14C), 크로뮴(51Cr), 코발트(57Co), 플루오린(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 아이오딘(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브데넘(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸디늄(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트라이튬(3H), 제논(133Xe), 이테븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn); 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용한 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
개시된 분자는 고체 지지체에 부착될 수 있고, 이것은 표적 항원 또는 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 결합을 통해서 지지체에 고정된 표적 항원 결합할 수 있는 다른 분자의 면역검정 또는 정제에 특히 유용하다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스타이렌, 폴리바이닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
임의의 이러한 항체, 융합 단백질 또는 단편을 암호화하는 핵산 분자(DNA 또는 RNA), 뿐만 아니라 이러한 핵산 분자를 전송 또는 복제할 수 있는 이러한 벡터 분자(예컨대, 플라스미드)가 또한 개시된다. 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 함유할 수 있다.
3. 제조 방법
Siglec-15-결합 분자는 폴리펩타이드의 생산, 예를 들어, 시험관내 합성, 재조합 DNA 생산 등의 생산에 유용한 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 생산될 수 있다. 인간화된 항체는 전형적으로 재조합 DNA 기술에 의해서 생산된다. 항체는 재조합 면역글로불린 발현 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간화된 항체를 비롯한 면역글로불린 분자의 재조합 생산은 미국 특허 제4,816,397(보스(Boss) 등), 미국 특허 제6,331,415호 및 제4,816,567호(둘 모두 카빌리(Cabilly) 등), 영국 특허 제GB 2,188,638호(윈터(Winter) 등), 및 영국 특허 제GB 2,209,757호에 기술되어 있다. 인간화된 면역글로불린을 비롯한 면역글로불린의 재조합 발현을 위한 기술은 문헌[Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991), 및 Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992)]에서 찾아볼 수 있다. 재조합 항체의 생성, 설계 및 발현에 관한 추가적인 정보는 문헌[Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993)]에서 찾아볼 수 있다.
재조합 키메라 항체의 예시적인 생산 방법은 하기를 포함할 수 있다: a) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서 항체 중쇄를 암호화 및 발현하는 발현 벡터를 작제함으로써(여기서 항-Siglec-15 항체의 CDR 및 가변 영역을 인간 면역글로불린으로부터 유래된 Fc 영역에 융합됨) 키메라 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생산하는 단계; b) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서, 뮤린 항-인간 Siglec-15 단클론성 항체의 항체 경쇄를 암호화 및 발현하는 발현 벡터를 작제함으로써, 키메라 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생산하는 단계; c) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하여 키메라 항체의 발현을 위한 형질주입된 숙주 세포를 생산하는 단계; 및 d) 키메라 항체를 생산하도록 종래의 세포 배양 기술에 의해서 형질주입된 세포를 배양하는 단계.
재조합 인간화된 항체의 예시적인 생산 방법은 하기를 포함할 수 있다: a) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서 항-인간 Siglec-15 중쇄를 암호화 및 발현하는 발현 벡터를 작제함으로써(여기서 공여자 항체 결합 특이성을 유지하는 것이 요구되는 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR은 항-인간 Siglec-15 항체(들)의 인간화된 변이체로부터 유래되고, 항체의 나머지는 인간 면역글로불린으로부터 유래됨) 인간화된 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생산하는 단계; b) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서, 항체 경쇄를 암호화 및 발현하는 발현 벡터를 작제함으로써(여기서 공여자 항체 결합 특이성을 유지하는 것이 요구되는 가변 영역 프레임워크의 최소 부분 및 CDR은 비인간 면역글로불린, 예컨대, 개시된 뮤린 항-인간 Siglec-15 항체로부터 유래되고, 항체의 나머지는 인간 면역글로불린으로부터 유래됨), 인간화된 항체 경쇄의 발현을 위한 벡터를 생산하는 단계; c) 종래의 분자 생물학 방법에 의해서 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하여 인간화된 항체의 발현을 위한 형질주입된 숙주 세포를 생산하는 단계; 및 d) 인간화된 항체를 생산하도록 종래의 세포 배양 기술에 의해서 형질주입된 세포를 배양하는 단계.
예시적인 방법과 관련하여, 숙주 세포는 상이한 선택 가능한 마커를 함유할 수 있는 이러한 발현 벡터(중쇄 및 경쇄 암호 서열을 제외하고는 동일할 수 있음)로 공동 형질주입될 수 있다. 이러한 절차는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동일한 발현을 제공한다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 재조합 항체를 발현시키는 데 사용되는 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, 에쉐리키아 콜라이, 또는 진핵 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 HEK-293 세포)일 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포의 선택에 좌우되며, 선택된 숙주 세포에서 목적하는 발현 및 조절 특징을 갖도록 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 CHO-K1, NSO 및 PER.C6(크루셀(Crucell), 네덜란드, 레이덴 소재)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
개시된 항체 중 임의의 것을 사용하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 항-유전형 항체를 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Greenspan, N.S. et al. (1989) "Idiotypes: Structure And Immunogenicity," FASEB J. 7:437-444; 및 Nisinoff, A. (1991) "Idiotypes: Concepts And Applications," J. Immunol. 147(8):2429-2438] 참고).
C. Siglec-15 리간드-결합 분자
Siglec-15 리간드에 결합하는 분자, 예컨대, Siglec-15 단백질, Siglec-15 융합 단백질, 및 이의 단편 및 변이체가 또한 제공된다. Siglec-15 리간드-결합 분자는 Siglec-15 리간드, 예컨대, 시알릴화된 당단백질, LRRC4C, Siglec-15-반대 수용체 등에 결합할 수 있다 일부 실시형태에서, Siglec-15 리간드-결합 분자는 Siglec-15 리간드를 통해서 신호 전달을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 리간드-결합 분자는 Siglec-15 또는 이의 리간드를 통한 신호 전달을 유도하지 않으면서 Siglec-15와 이의 리간드 간의 상호작용을 차단시키거나 달리 감소시킨다. Siglec-15 리간드-결합 분자를 사용하여 하기에 보다 상세하게 논의되고 실시예에 설명된 바와 같이 Siglec-15 활성도를 조절할 수 있고, 이를 치료적으로 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체를 치료할 수 있다.
1. Siglec-15 폴리펩타이드
일부 실시형태에서, Siglec-15 리간드-결합 분자는 Siglec-15, 또는 이의 단편 또는 변이체이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Siglec-15 리간드-결합 분자는 서열번호 1 또는 2와 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 예컨대, 이의 세포외 도메인, 또는 하위도메인, 예컨대, IgV 도메인, IgC 도메인 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 폴리펩타이드는 가용성이거나 달리는 무세포이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Siglec-15는 막관통 도메인, 세포질 도메인 또는 리더 서열 중 하나 이상이 없다.
2. Siglec-15 융합 단백질
일부 실시형태에서, Siglec-15 리간드-결합 분자는 Siglec-15 융합 단백질이다. 다른 폴리펩타이드에 커플링되어 융합 단백질을 형성하는 Siglec-15 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질이 제공된다. Siglec-15 융합 폴리펩타이드는 (i) 제2 폴리펩타이드에 직접 융합되거나 또는 (ii) 임의로, 제2 폴리펩타이드에 융합된 링커 펩타이드 서열에 융합된 Siglec-15 단백질 중 전부 또는 일부를 포함하는 제1 융합 파트너를 가질 수 있다. 융합 단백질은 2개 이상의 융합 단백질을 이량체화 또는 다량체화하는 기능을 하는 도메인을 임의로 함유한다. 일부 실시형태에서 융합 단백질은 이량체화 또는 다량체화되지 않는다. 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인은 별개의 도메인일 수 있거나, 또는 대안적으로는 융합 단백질의 다른 도메인(Siglec-15 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드) 중 하나 중의 하나 내에 함유될 수 있다. 유사하게, 융합 단백질을 이량체화 또는 다량체화하는 기능을 하는 도메인은 별개의 도메인일 수 있거나, 또는 대안적으로는 융합 단백질의 다른 도메인(Siglec-15 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드 또는 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인) 중 하나 중의 하나 내에 함유될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이량체화/다량체화 도메인 및 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인은 동일하다.
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 화학식 I을 갖는다:
N-R1-R2-R3-C
식 중, "N"은 융합 단백질의 N-말단을 나타내고, "C"는 융합 단백질의 C-말단을 나타내고, "R1"은 Siglec-15 폴리펩타이드이고, "R2"는 임의적인 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인이고, "R3"은 제2 폴리펩타이드이다. 대안적으로, R3은 Siglec-15 폴리펩타이드일 수 있고, R1은 제2 폴리펩타이드일 수 있다.
융합 단백질은 이량체화 또는 다량체화될 수 있다. 이량체화 또는 다량체화는 이량체화 또는 다량체화 도메인을 통해서 2개 이상의 융합 단백질 간에 또는 그 중에서 일어날 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질의 이량체화 또는 다량체화는 화학적 가교결합에 의해서 일어날 수 있다. 형성되는 이량체 또는 다량체는 동종이량체/동종다량체 또는 이종이량체/이종다량체일 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 일부 실시형태에서 융합 단백질은 이량체화 또는 다량체화되지 않는다.
일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 도메인, 예를 들어 인간 면역글로불린 Cγ1 쇄의 힌지, CH2 및/또는 CH3 영역, 뮤린 면역글로불린 Cγ2a 쇄의 힌지, CH2 및/또는 CH3 영역, 인간 면역글로불린 Cγ1의 CH2 및/또는 CH3 영역 등에 상응하는 아미노산 서열을 함유한다.
융합 단백질의 Fc 부분은 아이소타입 또는 하위부류에 의해서 달라질 수 있고/있거나, 키메라 또는 혼성체일 수 있고/있거나, 예를 들어 효과기 기능을 개선시키고, 반감기 및 조직 접근성을 제어하고, 생물물리학적 특징, 예컨대 안정성을 증가시키고, 생산 효율(그리고 비용 감소)를 증가시키기 위해서 변형될 수 있다. 개시된 융합 단백질의 작제 및 이의 제조 방법에 유용한 다수의 변형이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Mueller, et al., Mol. Immun., 34(6):441-452 (1997), Swann, et al., Cur. Opin. Immun., 20:493-499 (2008), 및 Presta, Cur. Opin. Immun. 20:460-470 (2008)]을 참고하기 바란다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 네이티브 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서 Fc 영역은 혼성체, 예를 들어, IgG2/IgG4 Fc 불변 영역으로 이루어진 키메라이다. Fc 영역에 대한 변형은 Fc 감마 수용체 및 보체에 대한 결합을 예방하도록 변형된 IgG4, 1종 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 개선시키도록 변형된 IgG1, 효과기 기능을 최소화하도록 변형된 IgG1(아미노산 변화), (전형적으로, 발현 숙주를 변화시킴으로써) 변경된 글리칸을 갖는/글리칸을 갖지 않는 IgG1, 및 FcRn에 대한 변경된 pH-의존적 결합을 갖는 IgG1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Fc 영역은 전체 힌지 영역, 또는 전체 힌지 영역보다 적은 영역을 포함할 수 있다.
비호지킨 림프종 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증에 대해서 리툭시맙(CD20에 대한 키메라 마우스/인간 IgG1 단클론성 항체)으로 치료된 환자에서의 치료 결과는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 대한 구별되는 고유 친화도를 갖는 Fcγ 수용체의 대립유전자 변이체의 각각의 발현과 상관관계가 있다. 특히, 저 친화도 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)의 고 친화도 대립유전자를 갖는 환자는 더 높은 반응률을 나타내었고, 비호지킨 림프종의 경우, 무진행 생존을 개선시켰다. 또 다른 실시형태에서, Fc 도메인은 저 친화도 저해성 Fc 수용체 CD32B(FcγRIIB)에 대한 결합을 감소시키고, 야생형 결합 수준을 유지시키거나 저 친화도 활성화 Fc 수용체 CD16A(FcγRIIIA)에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태는 반감기를 증가시키는 FcR에 대해서 결합을 감소시킨 IgG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체를 포함한다. 대표적인 IG2-4 혼성체 및 IgG4 돌연변이체는 문헌[Angal, S. et al., Molecular Immunology, 30(1):105-108 (1993); Mueller, J. et al., Molecular Immonology, 34(6): 441-452 (1997)]; 및 미국 특허 제6,982,323호(왕 등)에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서 IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 예를 들어, 앤갈(Angal) 등에 기술되어 있고, 세린 241이 프롤린으로 대체된 IgG1 및 IgG2가 결실되어 있다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CD16A에 대한 결합을 향상시키는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 함유한다. CD16A에 대한 결합을 증가시키고, CD32B에 대한 결합을 감소시키는 인간 IgG1의 Fc 도메인 내의 대다수의 치환은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 문헌[Stavenhagen, et al., Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)]에 기술되어 있다. CD32B에 대한 감소된 결합 및/또는 CD16A에 대한 증가된 결합을 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환은 임의의 조합으로 인간 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P 및 Y300L 치환을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R929P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환을 함유하는데, 그 이유는 이러한 돌연변이가 FcR 결합을 폐지하기 때문이다.
개시된 융합 단백질은 Siglec-15 폴리펩타이드를 제2 폴리펩타이드로부터 분리하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커 도메인를 임의로 한유한다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 면역글로불린의 힌지 영역을 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 힌지 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 힌지가 유래될 수 있는 적합한 인간 면역글로불린은 IgG, IgD 및 IgA를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 힌지 영역은 인간 IgG로부터 유래된다. 면역글로불린 힌지 영역 및 다른 도메인의 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
예시적인 융합 단백질은 Siglec15 ECD-IgG1 Fc 융합 단백질(L234F/L235E/P331S)이다.
뮤린 리더 서열은 밑줄로 표시된다. Siglec-15 세포외 도메인(ECD)은 이탤릭체이다. 힌지 영역은 이중 밑줄이다. 나머지 서열은 IgG1 Fc로부터 유래된다. IgG1 Fc 도메인 내의 L234F/L235E/P331S 돌연변이는 볼드체 및 점선 밑줄이다.
일부 실시형태에서, 리더 서열은 융합 단백질로부터 절단되거나 달리 누락된다. 예를 들어, 융합 단백질은 하기 서열을 가질 수 있다:
일 실시형태에서 융합 단백질은 서열번호 193 또는 194와 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다.
일부 실시형태에서, 리더 서열, 링커(예를 들어, 힌지 영역), 제2 융합 파트너(예를 들어, IgG1 Fc 도메인), 또는 이들의 조합물은 또 다른 서열(들)(예를 들어 대안적인 리더 서열, 힌지, Fc 도메인 등)을 대체한다. 적합한 치환은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,005,616호 참고, 이의 전체는 구체적으로 참고로 포함됨).
3. Siglec-15 핵산 및 세포
Siglec-15 폴리펩타이드, 이의 단편, 및 융합체를 암호화하는 벡터가 또한 제공된다. 핵산, 예컨대, 상기에 기술된 것은 세포에서의 발현을 위해서 벡터 내에 삽입될 수 있다. 따라서 Siglec-15 폴리펩타이드, 이의 단편 및 융합체를 함유하고 발현하는 세포가 또한 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 삽입된 분절의 복제를 유발하도록 또 다른 DNA 분절이 삽입될 수 있는 리플리콘, 예컨대, 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드이다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터이고, "발현 제어 서열"은 또 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다.
벡터 내의 핵산은 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"은 유전 작제물 내에 도입되어 발현 제어 서열이 관심대상 암호 서열의 발현을 효과적으로 제어하는 것을 의미한다. 발현 제어 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 영역을 포함한다. 프로모터는 전사가 시작되는 지점의 상류(일반적으로 RNA 폴리머라제 II에 대한 개시 부위 근처)의 전형적으로 100개 이내의 뉴클레오타이드의 DNA 분자의 영역으로 구성된 발현 제어 서열이다. 암호 서열을 프로모터의 제어 하에 존재하도록 하기 위해서, 프로모터의 하류에 1개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 폴리펩타이드의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위를 위치시킬 필요가 있다. 인핸서는 시간, 위치 및 수준의 면에서 발현 특이성을 제공한다. 프로모터와 달리, 인핸서는 전사 부위로부터 다양한 거리에 위치되는 경우 기능할 수 있다. 인핸서는 또한 전사 개시 부위로부터 하류에 위치될 수 있다. 암호 서열은, RNA 폴리머라제가 암호 서열을 mRNA로 전사할 수 있고, 이어서 그것이 암호 서열에 의해서 암호화된 단백질로 전사될 수 있을 때 "작동 가능하게 연결"되어 있고 세포 내에서 발현 제어 서열의 "제어 하에"있다.
적합한 발현 벡터는 예를 들어, 박테리오파지, 바쿨로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 허피스 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 레트로바이러스, 백시나 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스로부터 유래된 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다수의 벡터 및 발현계가 회사, 예컨대, 노바젠(Novagen)(미국 위스콘신주 매디슨 소재), 클론테크(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 스트라타젠(Stratagene)(미국 캘리포니아주 라올라 소재), 및 인비트로젠 라이프 테크놀로지스(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
발현 벡터는 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 전형적으로 암호화된 폴리펩타이드와의 융합체로서 발현된다. 이러한 태그는 카복실또는 아미노 말단 중 어느 하나를 비롯한 폴리펩타이드 내에 어느 곳에서도 삽입될 수 있다. 유용한 태그의 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 헤마글루티닌, Flag(상표명) 태그(코닥(Kodak), 미국 코네티컷주 뉴헤븐 소재), 말토스 E 결합 단백질 및 단백질 A를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, Siglec-15 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 Ig 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 핵산, 예를 들어, 인간 면역글로불린 Cγ1 쇄의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 상응하는 아미노산 서열을 함유하는 벡터 내에 존재한다.
발현될 핵산을 함유하는 벡터는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질전환된" 및 "형질주입된"은 다수의 기술 중 하나에 의한 세포 내로의 핵산 분자(예를 들어, 벡터)의 도입을 포함한다. 특정 기술에 제한되지 않지만, 다수의 이러한 기술은 관련 기술 분야에서 널리 확립된다. 원핵 세포는 예를 들어, 전기천공법 또는 염화칼슘 매개된 형질전환에 의해서 핵산으로 형질전환될 수 있다. 핵산은 예를 들어, 인산칼슘, 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질주입, 리포펙션, 전기천공법, 또는 미세주사를 비롯한, 기술에 의해서 포유동물 세포 내로 형질주입될 수 있다. 숙주 세포(예를 들어, 원핵 세포 또는 진핵 세포 예컨대, CHO 세포)를 사용하여 예를 들어, 본 명세서에 기술된 Siglec-15 융합 폴리펩타이드를 생산할 수 있다.
기술된 벡터를 사용하여 세포에서 Siglec-15를 발현할 수 있다. 예시적인 벡터는 아데노바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나의 접근법은 배양물에서 1차 세포 내로의 핵산 전달, 그 다음 전신으로 또는 특정 기관 또는 조직 내로, 숙주 내에서의 생체외 형질전환된 세포의 자가유래 이식을 포함한다. 생체외 방법은 예를 들어, 대상체로부터 세포를 수거하는 단계, 세포를 배양하는 단계, 이를 발현 벡터로 형질도입시키는 단계, 및 세포를 암호화된 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 분자 생물학 기술 분야에 공지되어 있다. 형질도입 단계는 예를 들어, 인산칼슘, 리포펙션, 전기천공법, 바이러스 감염, 및 바이오리스틱 유전자(biolistic gene) 전달을 비롯한, 생체외 유전자 요법에 대해서 사용되는 임의의 표준 수단에 의해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 리포솜 또는 중합체 마이크로입자가 사용될 수 있다. 이어서 성공적으로 형질도입된 세포를 예를 들어, 암호 서열 또는 내약성 유전자의 발현을 위해서 선택할 수 있다. 이어서 세포를 (바람직한 경우) 치사량으로 조사하고, 대상체에게 주입 또는 이식할 수 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 세포 내에 형질주입된다.
생체내 핵산 요법은 생체내에서 기능적 활성 DNA의 포유동물 체조직 또는 체기관 내로의 직접 전달에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 림프구 조직 또는 종양에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 림프구 조직 특이적 표적화는 림프구 조직-특이적 전사 조절 요소(TRE), 예컨대, B 림프구-, T 림프구- 또는 수지상 세포-특이적 TRE를 사용하여 달성될 수 있다. 림프구 조직 특이적 TRE는 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
핵산은 또한 바이러스 수단에 의해서 생체내로 투여될 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 관련 기술 분야에 널리 공지된 바와 같이, 복제 결함 레트로바이러스를 생산하는 패키징 세포주를 사용하여 레트로바이러스 벡터 내에 패키징될 수 있다. 복제되지 않을 수 있는, 재조합 아데노바이러스 및 백시나 바이러스 다른 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA 또는 RNA, 또는 바이러스 벡터에 더하여, 조작된 박테리아가 벡터로서 사용될 수 있다.
핵산은 또한 리포솜, 중합체 마이크로입자 및 나노입자 및 다양이온, 예컨대, 아시알로당단백질/폴리라이신을 비롯한, 다른 담체에 의해서 전달될 수 있다.
생체내에서 바이러스- 및 담체-매개된 유전자 전달에 더하여, 플라스미드 DNA의 투여 및 입자 폭발 매개된 유전자 전달을 비롯한, 관련 기술 분야에 널리 공지된 물리적 수단이 DNA의 직접 전달을 위해서 사용될 수 있다.
D. 약제학적 조성물
개시된 Siglec-15-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. Siglec-15-결합 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 비경구(근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 경피(수동족으로 또는 이온도입법 또는 전기천공법), 또는 점막경유(코, 질, 직장 또는 설하) 투여 경로에 의한 투여 또는 생체침식성(bioerodible) 삽입물을 사용한 투여를 위한 것일 수 있고, 각각의 투여 경로에 적절한 투여형으로 제형화될 수 있다.
일부 생체내 접근법에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 치료적 유효량으로 대상체에게 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 치료하고자 하는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 저해 또는 개선시키거나 또는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 달리 제공하기에 충분한 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 다양한 인자, 예컨대, 대상체-의존적 변수(예를 들어, 연령, 면역계 건강 등), 질환 및 달성될 치료에 따라서 달라질 것이다.
개시된 Siglec-15-결합 분자의 경우, 추가 연구가 수행되기 때문에, 다양한 환자에서 다양한 병태의 치료를 위한 적절한 투여량 수준에 관련된 정보가 제시될 것이며, 통상의 기술자들은 수령인의 치료 내용, 연령 및 일반적인 건강을 고려하여 적절한 투여를 찾아낼 수 있을 것이다. 선택된 투여량은 목적하는 치료 효과, 투여 경로 및 목적하는 치료 기간에 좌우된다. 일반적으로, 정맥내 주사 또는 주입의 경우, 투여량은 더 낮을 수 있다.
환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 환자의 체중당 0.01㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏이다. 환자에게 투여되는 투여량은 예를 들어, 환자의 체중당 0.01㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 0.01㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 0.01㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏, 0.01 내지 2㎎/㎏, 0.01 내지 1㎎/㎏, 0.01㎎/㎏ 내지 0.75㎎/㎏, 0.01㎎/㎏ 내지 0.5㎎/㎏, 0.01㎎/㎏ 내지 0.25㎎/㎏, 0.01 내지 0.15㎎/㎏, 0.01 내지 0.10㎎/㎏, 0.01 내지 0.05㎎/㎏, 또는 0.01 내지 0.025㎎/㎏일 수 있다. 예시적인 특정 투여량은 0.2㎎/㎏, 0.3㎎/㎏, 1㎎/㎏, 3㎎/㎏, 6㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 0.01㎎/㎏의 낮은 용량이 인지 가능한 약력학적 효과를 갖기에 적합한 것으로 여겨진다. 0.10 내지 1㎎/㎏의 용량 수준이 가장 적절한 것으로 예측된다. 더 높은 용량(예를 들어 1 내지 30㎎/㎏)은 또한 활성인 것으로 예측될 것이다.
일반적으로, 인간 항체는 외부 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해서 다은 종으로부터의 항체보다 인간 신체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 더 낮은 투여량의 인간 항체 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 추가로, 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투여량 및 빈도는 변형, 예를 들어, 지질화에 의해서 항체의 흡수 및 조직 통과를 향상시킴으로써 감소될 수 있다.
특정 실시형태에서, Siglec-15-결합 분자는 국지적으로, 예를 들어 주사에 의해서 치료하고자 하는 부위에 직접 투여된다. 전형적으로, 주사는 전신 투여에 의해서 달성될 수 있는 것보다 더 큰 Siglec-15-결합 분자 조성물의 증가된 농도를 유발한다. Siglec-15-결합 분자 조성물은 치료하고자 하는 부위로부터의 폴리펩타이드의 수동적 확산을 감소시킴으로써 폴리펩타이드 조성물의 증가된 국지화된 농도를 발생시키는 것을 돕기 위해서 하기에 기술된 바와 같이 매트릭스와 조합될 수 있다.
1. 비경구 투여를 위한 제형
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 비경구 주사 또는 주입에 의해서 수성 용액으로 투여된다. 이러한 제형은 또한 현탁액 또는 에멀션의 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 유효량의 Siglec-15-결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 및 이것은 임의로 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아주반트 및/또는 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 하기 중 하나 이상을 임의로 포함한다: 희석제, 멸균수, 다양한 완충제 내용물(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 완충 염수 및 첨가제, 예컨대, 세정제 및 가용화제(예를 들어, TWEEN 20(폴리솔베이트-20), TWEEN 80(폴리솔베이트-80)), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 및 보존제(예를 들어, 티머솔(Thimersol), 벤질 알코올) 및 벌킹 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨). 비수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예컨대, 올리브유 및 옥수수유, 젤라틴 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 제형은 동결건조되고, 사용 직전에 재용해/재현탁될 수 있다. 제형은 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과에 의해서, 멸균제를 조성물에 혼입함으로써, 조성물을 조사(irradiating)함으로써 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.
2. 제어 전달형 중합체 매트릭스
본 명세서에 개시된 Siglec-15-결합 분자는 또한 제어 방출형 제형으로 투여될 수 있다. 제어 방출형 중합체 장치는 중합체 장치(막대, 실린더, 필름, 디스크)의 이식 또는 주사(마이크로입자) 이후에 전신으로의 장기간 방출을 위해서 제조될 수 있다. 매트릭스는 마이크로입자, 예컨대, 작용제가 고형 중합체 매트릭스 내에 분산된 마이크로구체 또는 코어가 중합체 쉘과 상이한 재료이고, 펩타이드가 본래 액체 또는 고체일 수 있는 코어 중에 분산 또는 현탁된 마이크로캡슐의 형태일 수 있다. 본 명세서에 구체적으로 정의되지 않는 한, 마이크로입자, 마이크로구체 및 마이크로캡슐은 상호 교환 가능하게 사용된다. 대안적으로, 중합체는 나노미터 내지 4센티미터 범위의 얇은 슬랩(slab) 또는 필름, 그라인딩 또는 다른 표준 기술에 의해서 제조된 분말, 또는 심지어는 젤, 예컨대, 하이드로젤로서 주조될 수 있다.
비-생분해성 또는 생분해성 매트릭스가 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전달을 위해서 사용될 수 있다. 이것은 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 합성 중합체는 전형적으로 분해 및 방출 프로파일의 더 양호한 특징을 갖는다. 중합체는 방출이 바람직한 기간을 기준으로 선택된다. 일부 경우에 선형 방출이 가장 유용할 수 있지만, 나머지 것 중에서 펄스형 방출 또는 "벌크 방출"이 보다 유효한 결과를 제공할 수 있다. 중합체는 하이드로젤(전형적으로 최대 약 90중량%의 물을 흡수함)의 형태일 수 있고, 임의로 다가 이온 또는 중합체와 가교결합될 수 있다.
매트릭스는 용매 증발, 분무 건조, 용매 추출 및 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법에 의해서 형성될 수 있다. 생체침식성 마이크로구체는 예를 들어, 문헌[Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); 및 Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)]에 기술된 바와 같이, 약물 전달을 위한 마이크로구체를 제조하기 위해서 개발된 방법 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다.
장치는 이식 또는 주사 면적을 치료하기 위한 국지 방출 - 전신의 치료를 위한 투여량보다 훨씬 더 적은 투여량을 전형적으로 전달할 것임 - 또는 전신 전달을 위해서 제형화될 수 있다. 이것은 피하에, 근육, 지방 내에 이식 또는 주사되거나 삼켜질 수 있다.
III. 사용 방법
개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자의 사용 방법이 또한 제공된다. 면역 반응을 증가시키거나, 종양 성장을 지연시키거나 예방하거나, 종양-매개된 면역 억제를 저해하거나, 종양을 제거하고/하거나 활성도를 변경하도록 종양-연관된 대식세포(TAM)의 활성도를 고갈시키거나 차단하거나, TAM-매개된 면역 억제를 감소시키거나, T 세포 억제를 감소시키거나 반전시키거나, T 세포 증식을 증가시키기 위한 이러한 분자의 용도가 개시된다. 또한 암 및 다른 질환의 진단 및 치료에서 이러한 분자의 용도가 제공된다.
TAM는 염증과 암 간의 관련을 제공한다. 대식세포는 활성화된 혈액 단핵구로부터 유래된 면역계 세포이다. 이것은 병원체, 죽은 세포, 세포 부스러기 및 세포외 기질(ECM)의 다양한 성분을 제거(즉, 식세포작용)하는 작용을 함으로써 병원체 또는 조직 손상에 의해서 유도된 염증성 반응에 참여하는 것으로 주로 인식된다. 대식세포는 종양 미세환경에 중요한 구성성분을 구성하고 종양 질량의 최대 50%를 나타내는 것으로 밝혀져 있다.
식세포작용을 매개하는 것에 더하여, 대식세포는 신생혈관유발(pro-angiogenic) 성장 인자 및 기질-리모델링 프로테아제를 분비하고, 따라서 종양 발달 및 성장에 필요한 혈관 기반체(즉, 혈관신생)의 발달에 역할을 한다(Pollard, J.W. (2009), Nat. Rev. Immunol. 9:259-270). 종양 내에서의 대식세포의 존재는 종양의 성장을 돕는 것으로 보인다. 다수의 연구는 종양 내에서의 종양-연관된 대식세포의 존재는 생존의 부정적인 예후 인자라는 증가를 제공한다(Farinha, P. et al. (2005), Blood 106:2169-2174; Dave, S.S. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351:2159-2169; Solinas, G. et al. (2009), J. Leukoc. Biol. 86(5):1065-1073). TAM, 뿐만 아니라 호중구, 섬유모세포 및 다른 세포는 종양 세포와 협력하여 종양에서 혈관신생을 용이하게 한다(Nucera, S. et al. (2011), Int. J. Dev. Biol. doi: 10.1387/ijdb.103227sn; Zamarron, B.F. et al. (2011), Int. J. Biol. Sci. 7(5):651-658; Liu, J. et al. (2011), PLoS One. 6(4):e19495; Rigo, A. et al. (2010), Molec. Cancer 9(273):1-13; Lin, J.Y. et al. (2011), Chin. J. Cancer 30(4):280-286; Vergati, M. (2011), J. Biomed. Biotechnol. 2011:182413).
연구는, Siglec-15가 종양 세포 인식과 DAP12-Syk 신호 전달 경로를 커플링시킴으로써 TAM를 유도적으로 발현하고, TGF-β 분비를 향상시킨다는 것을 나타낸다(Takamiya, et al., Glycobiology, 23(2):178-87 (2013). 타카미야(Takamiya)에 의해서 제안된 구체적인 모델에서, 종양 세포에 의해서 분비된 M-CSF는 Siglec-15의 발현이 동반된, 대식세포로의 단핵구 분화를 유도한다. 시알릴-Tn 항원과 Siglec-15 간의 상호작용은 DAP12-Syk 경로를 통해서 대식세포로부터 TGF-β 생산을 향상시키고, 종양 미세환경을 면역 억제의 방향 및 따라서 종양 진행 및 심지어는 전이로 유도한다.
기능 차단의 결합 또는 Siglec-15에 대한 항-Siglec-15 항체의 감소는 1종 이상의 리간드에 결합하는 Siglec-15의 능력을 감소, 차단, 길항작용, 감쇠 또는 불완전하게 폐지하고, 따라서 Siglec-15에 의해서 매개되는, TGF-β의 분비를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 저해성 면역 신호전달을 감소 또는 예방한다. TGF-β의 증가된 발현은 종종 다수의 암의 악성 종양 및 TGF-β에 대한 세포 성장 저해 반응에서의 결합과 상관관계가 있어서, 면역억제-기반 종양형성으로 이어진다. Siglec-15-매개된 TGF-β 분비를 감소시키는 것은 면역 반응의 전체 증가 및 대상체에서의 종양 진행의 직접적 또는 간접적인 감소로 이어진다.
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 것을 비롯한 항-Siglec-15 항체를 감소시키고 차단하는 기능이 중추 혈액 단핵 세포(PBMC) 증식 검정에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식의 Siglec-15-매개된 억제를 반전시킬 수 있다는 것을 보여준다.
따라서, 가장 전형적으로는 면역 억제의 감소 또는 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 항-Siglec-15 기능 차단 항체를 투여함으로써 면역 억제를 감소시키고/거나 면역 반응을 증가시키는 방법이 제공된다.
적합한 항체, 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 본 명세서에 개시되어 있고, 이것은 증식, 이동, 접착, 연한천 성장, 혈관신생, 세포-세포 소통, 아포토시스, 이송, 신호 변환을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 시험관내 검정, 및 생체내 검정, 예컨대, 종양 성장의 저해에 의해서 추가로 선택될 수 있다. 개시된 항체의 기능을 시험하기 위한 예시적인 검정은 하기 실시예에 제공되어 있다.
본 명세서에 제공된 항체는 또한 진단 및 연구 응용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 비-중화 항체는 항원의 수용체-결합 또는 생물학적 활성도를 저해하지 않으면서 특이적 항원에 결합할 수 있고, 포획 검정 및 다른 풀-다운(pull-down)(예를 들어 ELISA)에서 사용될 수 있다. 중화(예를 들어, 기능 차단) 항체가 경쟁 결합 검정에 유용할 수 있다.
항체는 또한 Siglec-15 폴리펩타이드 또는 이의 리간드를 정량하는 데 사용될 수 있다.
A. 면역 반응 증가 분자
1. 치료 및 예방 용도
인간 Siglec-15 및 Siglec-15 리간드-결합 분자에 면역특이적으로 결합하여 Siglec-15와 이의 리간드 및/또는 반대-수용체 중 1종 이상 간의 결합을 감소시킬 수 있는 분자(특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 치료 및/또는 예방 용도가 제공된다(예를 들어 길항제 분자).
일부 실시형태에서, 분자는 Siglec-15와, 시알릴화된 당단백질 리간드, 예를 들어 대상체의 세포에 의해서 내인성으로 발현되는 시알릴화된 당단백질 간의 결합을 감소시키거나 예방하여, Siglec-15 매개된 신호 전달을 감소시키거나 예방한다. 추가로 또는 대안적으로, 분자는 Siglec-15와 이의 반대-수용체 간의 결합을 감소시키거나 예방하여, 반대-수용체를 통한 Siglec-15 -매개된 신호 전달 및/또는 신호 전달을 감소시키거나 예방한다. 예를 들어, 개시된 분자는 시알산 결합 부위를 파괴하는 Siglec-15 상의 하나 이상의 부위(예를 들어, 서열번호 1의 잔기 143을 포함하는 에피토프) 및/또는 Siglec-15 반대-수용체에 결합하는 데 중요한 결합 부위에서 항원에 결합할 수 있다. 예시적인 조성물은 하기 실시예에 제시되어 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 및 1B2는 ("강한 차단제")이고, 10G9, 8H8, 및 9A5는 ("부분적 차단제")이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 면역 반응을 상향조정하는 데 사용되는 분자는 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 1B2, 10G9, 8H8 또는 9A5의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자는 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 1B2, 10G9, 8H8 또는 9A5의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 그것은 뮤린 항-인간 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 1B2, 10G9, 8H8, 또는 9A5, 또는 이의 키메라 또는 인간화된 변이체이다.
상기에 논의된 바와 같이, Siglec-15와 시알릴화된 당단백질 리간드 및/또는 Siglec-15 반대-수용체 간의 상호작용은 T 세포의 증식을 저해할 수 있고, 사이토카인, 예컨대, TGF-β의 생산을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 대상체에게 개시된 Siglec-15-결합 분자를 투여하는 것은 Siglec-15-리간드 및/또는 반대 수용체 결합/상호작용을 차단하거나 달리 길항작용함으로써 대상체의 면역계를 상향조정한다. 또 다른 실시형태에서, 항-Siglec-15 항체의 결합활성(avidity) 및/또는 친화도는, 그것이 Siglec-15의 더 높은 수준을 발현하는 세포(예를 들어, 종양 연관된 대식세포(TAM) 또는 암 세포임)에만 결합하도록 하여 이러한 세포 집단의 특이적 표적화를 허용하는 정도일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 분자는 예를 들어, 종양 미세환경에서 TGF-β의 생산을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, Siglec-15를 발현하는 세포는 단핵구이다. 보다 구체적인 실시형태에서, Siglec-15를 발현하는 세포는 대식세포, 예를 들어 TAM이다.
상기에 제시된 바와 같이, 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 면역 억제성 활성도를 조정하도록 TAM에 결합하여 이를 실질적으로 차단할 수 있다. 추가로, 이러한 항체를 사용하여 종양 미세환경 내에서 Siglec-15 TAM를 고갈시킬 수 있거나, 또는 말초 혈액에서 TAM의 농도를 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 조정 및 고갈은 정상 Siglec-15 기능을 손상시키거나 파괴하도록 부위에 결합하는 Siglec-15 항체를 사용하여 달성된다. 이러한 파괴의 결과로서, TAM 활성도는 감소(조정)되고/되거나 종양에서 대식세포의 실제 또는 효과적인(기능적) 농도가 감소된다. 대안적으로, 이러한 변형 또는 고갈은 독소와 접합된 항-Siglec-15 항체를 사용하여 달성되어, TAM에 대한 이의 결합은 대식세포의 사멸로 이어진다.
추가로, 개시된 길항제 분자를 사용하여 T 세포 증식을 유도, 증가 또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 반응은 Siglec-15가 T 세포 상의 반대-수용체에 결합하는 것을 감소시키거나 예방함으로써 유도된다. 면역계의 상향 조정은 암 및 만성 감염의 치료에 특히 바람직하고, 따라서 개시된 조성물은 이러한 장애의 치료에 사용될 수 있다.
2. 치료하고자 하는 대상체
a. 암의 치료
개시된 기능 감소 조성물 및 방법은 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 방법은 대상체에게 임의의 양의 Siglec-15 결합 분자 투여함으로써 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 자극시키거나 향상시키거나, 종양 성장 또는 진행을 감소시키거나 예방하거나, 또는 이들의 조합을 포함한다. 방법은 암의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다.
암 세포는 비록 다양한 기전을 통할지라도, 이의 발달 동안 특징적인 기능성 능력 세트를 획득한다. 이러한 능력은 회피 아포토시스(evading apoptosis), 성장 신호에서의 자족, 항-성장 신호에 대한 무감각, 조직 침투/전이, 무한한 잠재력 및 지속된 혈관신생을 포함한다. 용어 "암 세포"는 전암성 암 세포 및 악성 암 세포 둘 모두를 포함하는 의미이다. 일부 실시형태에서, 암은 국지화되어 유지된 양성 종양을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 암은 이웃하는 신체 구조에 침윤하고, 이를 파괴하고, 윈위 부위로 확산된 악성 종양을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 암은 특이적 암 항원(예를 들어, 범(pan)-암종 항원(KS 1/4), 난소 암종 항원(CA125), 전립선 특이적 항원(PSA), 암배아 항원(CEA), CD19, CD20, HER2/neu 등)과 연관된다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 하기를 비롯한(이에 제한되지 않음) 암 또는 다른 비정상적 증식성 질환의 치료 또는 예방에 유용하다: 암종, 예컨대, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종; 예컨대, 편평 세포암종; 림프구 계통의 조혈 종양, 예컨대, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종(Berketts lymphoma); 골수 계통의 조혈 종양, 예컨대, 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구 백혈병; 간엽성 기원의 종양, 예컨대, 섬유육종 및 횡문근종육종(rhabdomyoscarcoma); 다른 종양, 예컨대, 흑색종, 정상피종, 기형암종(tetratocarcinoma), 신경모세포종 및 신경교종; 중추 신경계 및 말초 신경계의 종양, 예컨대, 별아교세포종, 신경모세포종, 신경교종, 및 신경초종; 간엽성 기원의 종양, 예컨대, 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종; 및 다른 종양, 예컨대, 흑색종, 색소성 건피증(xenoderma pegmentosum), 각화 상피 종양(keratoactanthoma), 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형암종.
아포토시스에서의 일탈에 의해서 유발된 암이 또한 개시된 방법 및 조성물에 의해서 치료될 수 있다. 이러한 암은 소포 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존형 종양, 및 전암성 병변, 예컨대, 가족성 선종성 용종증, 및 골수이형성 증후군을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 악성종양 또는 이상증식성(dysproliferative) 변화(예컨대, 화생(metaplasias) 및 이형성증(dysplasias)), 또는 과증식성 장애가 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장, 또는 자궁에서 이러한 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 육종, 흑색종 또는 백혈병이 이러한 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방된다.
개시된 조성물 및 방법은 비정상적으로 높은 수준의 Siglec-15 자체 또는 Siglec-15의 당단백질 리간드를 발현하는 세포와 연관된 암, 많은 수의 종양 연관된 대식세포를 갖는 암(특히 대식세포가 Siglec-15를 발현하는 경우), 및/또는 또 다른 세포 유형(들)이 높은 수준의 Siglec-15 또는 Siglec-15 리간드를 발현하는 암의 치료에 특히 유용하다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해서 치료 또는 예방될 수 있는 구체적인 암 및 관련된 장애는, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 예컨대, 골수아구성, 전골수구, 골수단핵구성, 단핵구성, 적백혈병 백혈병 및 골수이형성 증후군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 백혈병, 만성 백혈병, 예컨대, 비제한적으로 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병; 진성 다혈구증; 림프종, 예컨대, 비제한적으로 호지킨병 또는 비호지킨병 림프종(예를 들어, 미만성 역형성 림프종 카이나제(ALK) 음성, 거대 B-세포 림프종(DLBCL); 미만성 역형성 림프종 카이나제(ALK) 양성, 거대 B-세포 림프종(DLBCL); 역형성 림프종 카이나제(ALK) 양성, ALK+ 역형성 거대-세포 림프종(ALCL), 급성 골수 림프종(AML)); 다발성 골수종, 예컨대, 비제한적으로 스몰더링(smoldering) 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화 골수종, 형질구성 백혈병, 고립성 형질세포종 및 골수외 형질세포종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 의미 불명 단클론성 감마글로불린증; 양성 단클론성 감마글로불린증; 중쇄병; 골 및 결합 조직 육종, 예컨대, 비제한적으로, 뼈육종, 골육종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 거대 세포 종양, 골의 섬유육종, 척색종, 골막 육종, 연조직 육종, 맥관육종(혈관육종), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 신경초종, 횡문근육종, 활막 육종; 신경교종, 별아교세포종, 뇌줄기 신경교종, 상의세포종, 핍지교정, 비신경교(nonglial) 종양, 청신경총종, 두개인두종, 수모세포종, 수막종, 솔방울세포종, 솔방울샘모세포종, 1차 뇌 림프종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 뇌종양; 선암, 소엽(소세포) 암종, 관내 암종, 수질 유방암, 점액성 유방암, 관상형 유방암, 유두상 유방암, 파제트병, 및 염증성 유방암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 유방암; 갈색세포종(pheochromocytom) 및 부산피질 암종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 부신암; 갑상선암, 예컨대, 비제한적으로, 유두상 또는 소포 갑상선암, 수질 갑상선암 및 역형성 갑상선암; 인슐린종, 가스트린종, 글루카곤종, 비포마, 소마토스타틴-분비 종양, 및 카시노이드 또는 도세포 종양; 쿠싱병, 프로락틴-분비 종양, 말단비대증, 및 요붕증(diabetes insipius)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 뇌하수체암; 안 흑색종, 예컨대, 홍채 흑색종, 맥락막 흑색종, 및 모양체 흑색종, 및 망막모세포종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 안암; 편평 세포암종, 선암, 및 흑색종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 질 암; 편평 세포암종, 흑색종, 선암, 기저 세포암종, 육종, 및 파제트병을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 외음부암; 편평 세포암종, 및 선암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 자궁경부암; 자궁내막 암종 및 자궁 육종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 자궁암; 난소 상피 암종, 경계형 종양, 생식 세포 종양, 및 기질 종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 난소암; 편평암, 선암, 선낭 암종, 점막표피모양 암종, 선편평세포암종, 육종, 흑색종, 형질세포종, 우상 암종, 및 연맥 세포(소세포) 암종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 식도암; 선암, 균상형(폴립형), 궤양성, 표재 확장성, 산만 확장성(diffusely spreading), 악성 림프종, 지방육종, 섬유육종, 및 암육종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 위암; 결장암; 직장암; 간세포암종 및 간모세포종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 간 암, 선암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 담낭암; 유두상, 결절성, 및 미만성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 담도암종; 비소세포 폐암, 편평 세포암종(표피형 암종), 선암, 거대-세포암종 및 소세포 폐암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 폐암; 아세포성(germinal) 종양, 정상피종, 역형성, 일반적(전형적), 정모세포성, 비정상피종, 배아 암종, 기형종 암종, 융모막암종(난황낭 종양)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고환암, 선암, 평활근육종, 및 횡문근육종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 전립선암; 음경암(penal cancer); 편평 세포암종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 경구암; 기저암; 선암, 점막표피모양 암종, 및 선양낭성 암종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 침샘암; 편평 세포암, 및 우상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인두암; 기저 세포암종, 편평 세포암종 및 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 결절성 흑색종, 흑자 악성 흑색종, 말단 흑색점 흑색종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 피부암; 신장 세포암, 선암, 부신종, 섬유육종, 이행성 세포암(신우 및/또는 요관(uterer))을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 신장 암; 윌름스 종양; 이행성 세포암종, 편평 세포암, 선암, 암육종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 방광암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 암은 점액육종, 골원성 육종, 내피육종, 림프관내피육종, 중피종, 활막종, 혈관모세포종, 상피 암종, 낭샘암종, 기관지 암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종 및 유두상 선암(이러한 장애의 검토에 대해서는 문헌[Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America] 참고).　
b. 감염의 치료
개시된 기능 감소 조성물 및 방법은 감염 및 감염성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 방법은 대상체에게 임의의 양의 Siglec-15 결합 분자를 투여함으로써 대상체에서 감염 유발제에 대한 면역 반응을 자극시키거나 향상시키거나, 감염 질환 진행을 감소시키거나 예방하거나, 또는 이들의 조합을 포함한다. 방법은 감염의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다.
감염 또는 질환은 세포내로 도입되어, 즉, 세포독성 T 림프구에 의해서 공격되는 박테리아, 바이러스, 원생동물, 유충, 또는 다른 미생물 병원균에 의해서 유발될 수 있다.
감염 또는 질환은 급성 또는 만성일 수 있다. 급성 감염은 전형적으로 단기간의 감염이다. 급성 미생물 감염 동안, 면역 세포는 면역조절 수용체를 발현하기 시작한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 급성 감염에 대한 면역 자극 반응을 증가시키는 것을 포함한다.
감염은 예를 들어, 비제한적으로 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에쉐리키아 콜라이, 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 마이코박테리움(Mycobacterium)에 의해서 유발될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개시된 조성물은 만성 감염, 예를 들어, T 세포 고갈 또는 T 세포 무력증이 발생하여 감염이 연장된 시간 기간에 걸쳐서 숙주와 함께 남아있게 하는 감염을 치료하는 데 사용된다.
치료하고자 하는 예시적인 감염은 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 T-림프영양성 바이러스(HTLV), 허피스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 또는 인간 유두종 바이러스에 의해서 유발되는 만성 감염이다.
바이러스 감염은 T 세포에 의해서 주로 제거되기 때문에, T-세포 활성도의 증가는 감염성 바이러스제의 보다 신속하거나 철저한 클리어런스가 동물 또는 인간 대상체에게 이로울 상황에서 치료적으로 유용할 것이다. 따라서, 개시된 조성물은 면역결핍(예를 들어, HIV), 유두종(예를 들어, HPV), 허피스(예를 들어, HSV), 뇌염, 인플루엔자(예를 들어, 인간 인플루엔자 바이러스 A), 및 감기(예를 들어, 인간 리노바이러스) 및 예를 들어, HTLV, 간염 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 백시나 바이러스, 및 광견병 바이러스에 의해서 유발되는 다른 바이러스 감염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 국지 또는 전신 바이러스 감염의 치료를 위해서 투여될 수 있다. 이러한 분자는 바이러스 피부 질환, 예컨대, 허피스 병변 또는 슁글(shingle), 또는 생식기 사마귀를 치료하기 위해서 국소적으로 투여될 수 있다. 이러한 분자는 또한 AIDS, 인플루엔자, 감기, 또는 뇌염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 전신 바이러스 질환을 치료하기 위해서 전신에 투여될 수 있다.
치료될 수 있는 대표적인 감염은 악티노마이세스(Actinomyces), 아나바에나(Anabaena), 바실루스, 박테로이데스, 브델로비브리오(Bdellovibrio), 보데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 캠필로박터(Campylobacter), 카울로박터(Caulobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에쉐리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 할로박테리움(Halobacterium), 헬리오박터(Heliobacter), 해모필루스(Haemophilus), B형 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza type B: HIB), 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium), 레지오넬라(Legionella), 렙트스피로시스(Leptspirosis), 리스테리아, 메닌고코쿠스(Meningococcus) A, B 및 C, 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 마이오박테리움(Myobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 믹소코쿠스(Myxococcus), 네이세리아(Neisseria), 나이트로박터(Nitrobacter), 오실라토리아(Oscillatoria), 프로클로론(Prochloron), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 포도스피릴룸(Phodospirillum), 리켓시아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에타(Spirochaeta), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 설폴로버스(Sulfolobus), 써모플라즈마(Thermoplasma), 티오바실루스(Thiobacillus), 및 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 에르시니아(Yersinia), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캅술라텀(Histoplasma capsulatum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 리켓시아 리켓시(Rickettsia ricketsii), 리켓시아 타이피(Rickettsia typhi), 마이코플라즈마 뉴모니아에, 클라마이디알 스시타시(Chlamydial psittaci), 클라마이디알 트라코마티스(Chlamydial trachomatis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 트라이파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis) 및 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 미생물에 의해서 유발되는 감염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 미생물은 박테리아, 예컨대, 클레브시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 파스테우렐라(Pasteurella); 콜레라, 파상풍, 보툴리즘, 탄저병, 페스트(plague), 및 라임병(Lyme diease)과 연관된 병원균; 또는 진균 또는 기생충 병원균, 예컨대, 칸디다(Candida)(알라비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 아스퍼길루스(Aspergillus)(푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 털곰팡이속(Genus Mucorales)(무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizophus)), 스포로트릭스(Sporothrix)(쉔키이(schenkii)), 블라스토마이세스(Blastomyces)(데르마티티디스(dermatitidis)), 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides)(브라실리엔시스(brasiliensis)), 콕시디오이데스(Coccidioides)(이미티스(immitis)) 및 히스토플라즈마(Histoplasma)(캅술라투마(capsulatuma)), 엔타모에바(Entamoeba), 히스톨리티아(histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 나에글레리아 포울레리(Naegleria fowleri), 아칸타모에바종(Acanthamoeba sp.), 기아디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움종(Cryptosporidium sp.), 뉴모사이스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 톡소플라스마 군디(Toxoplasma gondi) 등), 스포로트릭스(Sporothrix), 블라스토마이세스(Blastomyces), 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides), 콕시디오이데스(Coccidioides), 히스토플라즈마(Histoplasma), 엔타모에바(Entamoeba), 히스톨리티카(Histolytica), 발란티디움(Balantidium), 나에글레리아(Naegleria), 아칸타모에바(Acanthamoeba), 기아디아(Giardia), 크립토스포리둠(Cryptosporidium), 뉴모사이스티스(Pneumocystis), 플라스모디움(Plasmodium), 바베시아(Babesia), 또는 트리파노소마(Trypanosoma) 등의 것을 포함한다.
B. 면역 반응 감소 분자
1. 치료 및 예방 용도
인간 Siglec-15 또는 이의 리간드에 결합하고, Siglec-15와 이의 리간드 및/또는 반대-수용체 중 1종 이상 간의 결합을 증가 또는 향상시킬 수 있는 분자(특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 치료 및/또는 예방 용도가 제공되거나(예를 들어, 효능제 분자) 또는 Siglec-15 또는 Siglec-15 반대-수용체 매개된 신호 전달을 직접적으로 증가 또는 향상시키는 것이 또한 제공된다.
상기에 논의된 바와 같이, Siglec-15와 시알릴화된 당단백질 리간드 및/또는 Siglec-15 반대-수용체 간의 상호작용은 T 세포의 증식을 저해할 수 있고, 사이토카인, 예컨대, TGF-β의 생산을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 기능 활성화 Siglec-15-결합 분자 또는 기능 활성화 Siglec-15 리간드-결합 분자를 대상체에게 투여하는 것은, Siglec-15-리간드 및/또는 반대-수용체 결합/상호작용을 유도하거나 달리 효능작용시킴으로써 또는 Siglec-15 또는 Siglec-15 반대-수용체 신호 전달을 직접 자극시킴으로써 대상체의 면역계를 하향조정한다. 일부 실시형태에서, 분자는 예를 들어, 단핵구, 예컨대, 대식세포로부터의 TGF-β의 생산 및/또는 이의 분비를 증가시킨다.
추가로, 개시된 효능제 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자를 사용하여 T 세포 증식을 감소시키거나 낮출 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 반응은 Siglec-15가 T 세포 상의 반대-수용체에 결합하는 것을 증가시키거나 향상시킴으로써 유도된다. 면역계의 하향 조정은 염증 및 자가면역 질환 및 장애의 치료에 그리고 이식 거부 및/또는 이식편대숙주병을 치료 또는 예방하는데 특히 바람직하고, 따라서 개시된 조성물은 이러한 장애의 치료에 사용될 수 있다.
a. 염증성 반응
일부 실시형태에서, Siglec-15 효능제 분자는 염증, 예를 들어 급성, 만성 또는 지속적 염증 중 1종 이상의 증상을 치료 또는 완화시키는 데 사용된다.
염증을 비롯한 면역 반응은, 유효량의 Siglec-15-결합 분자를 투여하여 면역 세포(예를 들어 T 세포 또는 B 세포)의 생물학적 활성도를 저해 또는 감소시키거나 또는 염증 부위에서 염증전 분자의 양을 감소시킴으로써 대상체, 바람직하게는 인간에서 저해 또는 감소될 수 있다. 예시적인 염증전 분자는 IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-18, IL-17, IL-6, IL-23, IL-22, IL-21 및 MMP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
b. 과염증성 반응
일부 실시형태에서, Siglec-15-결합 분자는 면역계를 둔화시킨다. 예를 들어, Siglec-15-결합 분자는 과염증성 반응을 통해서 건강한 조직의 손상을 유발하는 감염에 대한 면역 자극 반응을 제어하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 작용제는 과-염증성 반응을 또한 겪는 감염을 갖는 대상체에게 투여된다. 이러한 경우에, 과도한 면역 반응을 제어하는 것은 대상체에게 이로울 수 있다.
c. 염증 및 자가면역
질환/장애
개시된 조성물은 염증 또는 자가면역 질환 및 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 대표적인 염증성 또는 자가면역 질환/장애는 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질항체증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 림프세포증식 증후군(alps), 자가면역 혈소판감소성자반병(ATP), 베체트병, 물집유사천포창, 셀리악-스프루 피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 증후군 면역 결핍 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증, 흉터유사천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군(Crest syndrome), 크론병, 데고병(Dego's disease), 피부근염, 피부근염 - 청소년, 원판성 루푸스, 필수 혼합 한냉글로불린혈증, 섬유근육통 - 섬유근염, 그레이브병, 길랑-바레(guillain-barre), 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), Iga 신장병, 인슐린 의존형 당뇨병(I형), 아동 관절염, 메니에르병(Meniere's disease), 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증, 심상성천포창, 악성빈혈 , 결절성동맥주위염, 다발연골염, 다선성 증후군(polyglancular syndrome), 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 레이노 증후군(Raynaud's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스열, 사르코이드증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 강직-인간 증후군, 타카야수동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서 염증 또는 자가면역 질환은 병원균에 의해서 유발되거나, 또는 감염의 결과이다.
d. 이식체
Siglec-15-결합 분자는 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에서 이식 거부를 감소 또는 저해시키는 데 사용될 수 있다. 이식 거부는, 유효량의 효능제 Siglec-15 결합 분자를 투여하여 면역 세포의 생물학적 활성도를 저해 또는 감소시키거나 또는 이식 부위에서 염증전 사이토카인 또는 염증과 연관되거나 염증을 촉진시키는 다른 분자의 양을 감소시킴으로써 대상체에서 저해 또는 감소될 수 있다.
이식된 물질은 세포, 조직, 기관, 사지, 손가락 또는 신체, 바람직하게는 인간 신체의 일부일 수 있다. 이식체는 전형적으로 동종 또는 이종이다. 효능제 Siglec-15 분자는 전형적으로 이식 거부를 감소시키거나 저해하기 위해서 유효량으로 대상체에게 투여된다. 분자는 임의의 허용 가능한 투여 경로에 의해서 전신으로 또는 국지적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분자는 이식 이전, 이식 시기에, 또는 이식 이후에 이식 부위에 투여된다.
분자는 이식될 세포, 조직 또는 기관에 직접 생체외에서 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 물질은 이식 이전, 이식 이후 또는 둘 모두에 Siglec-15-결합 분자와 접촉된다.
다른 실시형태에서, Siglec-15-결합 분자는 면역 조직 또는 기관, 예컨대, 림프절 또는 비장에 투여된다.
i. 세포
세포의 임의의 유형의 집단이 대상체에게 이식될 수 있다. 세포는 균질하거나 불균질할 수 있다. 불균질은 세포 집단이 하나를 초과하는 유형의 세포를 함유한다는 것을 의미한다. 예시적인 세포는 조상 세포, 예컨대, 줄기세포 및 만능 세포를 포함하는데, 이것은 공여자로부터 수거되고, 대상체에게 이식될 수 있다. 세포는 이식 전에 생체외에서 임의로 처리된다. 세포는 자가유래 또는 이종 세포일 수 있다.
ii. 조직
임의의 조직이 이식체로서 사용될 수 있다. 예시적인 조직은 피부, 지방 조직, 심혈관 조직, 예컨대, 정맥, 동맥, 모세혈관, 밸브; 신경 조직, 골수, 폐 조직, 안 조직, 예컨대, 각막 및 수정체, 연골, 골, 및 점막 조직을 포함한다. 조직은 상기에 논의된 바와 같이 변형될 수 있다.
iii. 기관
이식을 위해서 사용될 수 있는 예시적인 기관은 신장, 간, 심장, 비장, 방광 폐, 위, 눈, 혀, 췌장, 장 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이식될 기관은 또한 상기에 논의된 바와 같이 이식 이전에 변형될 수 있다.
일 실시형태는 유효량의 Siglec-15-결합 분자를 투여하여 대조군에 비해서 만성 이식 거부를 저해 또는 감소시킴으로써 대상체에서 만상 이식 거부를 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
e. 이식편대숙주병(GVHD)
분자는 또한 유효량의 Siglec-15-결합 분자를 투여하여 이식편대숙주병(GVHD)과 연관된 1종 이상의 증상을 개선시킴으로써 GVHD를 치료하는 데 사용될 수 있다. GVHD는, 이식된 골수 내의 기능성 면역 세포가 수령인을 "외부물질"로서 인식하고, 면역학적 공격을 시작하는 동종이계 조혈 줄기세포 이식과 연관된 주요 합병증이다. 그것은 또한 특정 상황 하에서 수혈에서 일어날 수 있다. GVD의 증상은 피부 발진 또는 피부 색상 및 감촉의 변화, 설사, 구역, 비정상적 간 기능, 피부의 황변, 증가된 감염 민감성, 건조함, 따끔거리는 눈 및 민감한 또는 건조한 입을 포함한다.
f. 당뇨병
효능제 Siglec-15-결합 분자는 또한 당뇨병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 방법은 대상체에서 인슐린 생산 세포를 이식하고, 대상체에게 유효량의 분자를 투여하여 이식 거부를 감소 또는 저해하는 것을 포함한다. 바람직하게는 인슐린 생산 세포는 베타 세포 또는 도 세포이다. 특정 실시형태에서, 인슐린 생산 세포는 인슐린을 생산하도록 조작된 재조합 세포이다.
인슐린 생산 세포는 알지네이트, 아가로스, 히알루론산, 콜라겐, 합성 단량체, 알부빈, 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 키틴, 키토산, 헤파란, 헤파란 설페이트 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 적합한 중합체를 사용하여, 매트릭스, 예컨대, 중합체 매트릭스 내에 캡슐화될 수 있다.
C. 파골세포 골 재흡수의 치료적 저해
연구는, Signlec-15 발현 및 기능이 파골세포형성에서 중요하다는 것을 나타낸다(Stuible, et al., J. Biol Chem., 289(10): 6498-6512 (2014), Ishida-Kitagawa, J. Biol. Chem., 287, 17493-17502 (2012), 이들 각각의 전문은 구체적으로 참고로 포함됨). Siglec-15 단백질은 파골세포 분화 동안 상당히 상향 조절되기 때문에, 단백질은 미분화된 세포에서는 검출 가능하지 않다. 결과는 Siglec-15 및 DAP12가 파골세포 내에서 외인성 발현 수준에서 복합체를 형성하는다는 것을 나타낸다. Siglec-15(-/-) 넉아웃 마우스는 약한 골다공증을 갖는다.
생체내　연구는 또한 Siglec-15 항체가 생리학적 맥락에서 파골세포 활성도를 저해할 수 있고, 골 손실을 감소시키기 위한 치료적 전략을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 세포 표면에서의 수용체의 활성화 및 이의 식장용 하향 조절은 종종 Siglec-15 신호전달에 대해서, 신호전달의 강도 및 기간을 제한하는 수단으로서 커플링되고, 엔도사이토시스(endocytosis)는 항체 결찰이 수용체 클러스터링 또는 단순히 이량체화를 유도하는지의 여부에 따라서 서로와 배타적으로 일어날 것이다.
Siglec-15는 상당히 제한된 발현 패턴을 갖는 파골세포-고유한 수용체이고, 따라서 Siglec-15-표적화 요법은 선택적이다. Siglec-15 항체는 비교적 늦은 단계에서 파골세포 분화를 저해하고, 따라서 파골세포와 골아세포 간의 커플링된 상호작용을 보존하고, 기존의 파골세포-표적화 요법의 합병증을 회피하는 것은 초기 단계에서 파골세포 세포사를 유도하거나(비스포스포네이트(bisphosphonates)) 또는 초기 단계에서 이의 분화를 예방하고(데노수맙(denosumab)), 원치 않는 부작용의 발생은 턱의 골괴사 및 대퇴골의 비전형적 골절을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 인간 Siglec-15에 면역특이적으로 결합하여 Siglec-15와 이의 리간드 및/또는 반대-수용체 중 하나 이상 간의 결합을 감소 또는 차단할 수 있는 개시된 분자(특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편)(예를 들어, 효능제 분자)는 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량으로 투여되어 파골세포 분화, 기능 또는 이들의 조합을 감소 또는 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서 분자는 유효량으로 투여되어 골 손실을 감소시키거나, 골 형성을 증가시키거나, 골 광물 밀도를 증가시키거나 또는 이들의 조합이다.
D. 표적화 및 검출
Siglec-15 기능에 대한 효과와 무관하게, 개시된 Siglec-15 결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자는 치료적 화물(therapeutic cargo)을 전달하고/거나 각각 세포 또는 조직 상에서의 Siglec-15 또는 이의 리간드의 존재를 검출하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, Siglec-15 결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자는 관심대상 생물학적 분자에 접합되어 접합체를 형성할 수 있다. 약물학적 활성 분자, 예컨대, 무기 및 유기 분자, 약제학적 작용제, 약물, 펩타이드, 단백질, 유전 물질 등을 포함하는 화물이 Siglec-15 결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자에 접합될 수 있고, 이것은 이어서 화물을 각각 Siglec-15 또는 이의 리간드를 발현하는 세포 또는 조직에 표적화할 수 있다. Siglec-15 분자는 펩타이드 결합에 의해서 또는 화학적 또는 펩타이드 링커 분자에 의해서 폴리펩타이드에 화학적으로 연결될 수 있다. 약물 또는 다른 약제학적 소분자를 항체 단편에 부착하는 방법은 널리 공지되어 있고, 이작용성 화학물질 링커, 예컨대, N-석신이미딜 (4-아이오도아세틸)-아미노벤조에이트; 설포석신이미딜(4-아이오도아세틸)-아미노벤조에이트; 4-석신이미딜-옥시카보닐-∀-(2-피리딜다이티오) 톨루엔; 설포석신이미딜-6-[.알파.-메틸-∀-(피리딜다이티올)-툴루아미도] 헥사노에이트; N-석신이미딜-3-(-2-피리딜다이티오)-프로피오네이트; 석신이미딜-6-[3(-(-2-피리딜다이티오)-프로프리온아미도] 헥사노에이트; 설포석신이미딜-6-[3(-(-2-피리딜다이티오)-프로피온아미도] 헥사노에이트; 3-(2-피리딜다이티오)-프로피온일 하이드라자이드, 엘만 시약(Ellman's reagent), 다이클로로트라이아진산, S-(2-티오피리딜)-L-시스테인 등을 포함한다.
융합 단백질은 항체 중쇄 또는 경쇄의 아미노 또는 카복시 말단에 관심대상 단백질을 배치하도록 설계될 수 있지만, 전체 중쇄는 필요하지 않을 수 있다. 가능한 구성은 부착된 단백질의 기능적 온전성을 유지시키는 데 필요한 경우 스페이서 서열와 함께 또는 그것 없이 중쇄 및 경쇄의 절두된 부분을 사용하는 것을 포함한다.
대안적으로, 보편적인 담체 시스템이 고안될 수 있다. 예를 들어, 다양한 단백질 또는 DNA가 일반적인 담체, 예컨대, 단백질 A, 폴리-L-라이신, 헥사-히스티딘 등에 접합될 수 있다. 이어서 접합된 담체는 Siglec-15 결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자와 복합체를 형성할 것이다. 면역글로불린에 대한 결합을 담당하는 담체 분자의 작은 부분이 담체로서 사용될 수 있다. 다른 유사한 구성은 항체 중쇄 또는 경쇄 내에서 조작된 단백질과 상호작용하는 담체의 설계를 포함한다.
일부 실시형태에서, Siglec-15 결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 나노담체를 Siglec-15 또는 Siglec-15 리간드 양성 세포에 표적화하기 위해서 나노입자 내에 또는 그 상에 접합되거나 달리 혼입될 수 있다. 나노담체, 예를 들어, 마이크로- 또는 나노- 중합체 입자, 리포솜, 나노튜브 등은 Siglec-15 또는 Siglect-15 리간드 양성 세포 또는 이의 미세환경으로 전달하기 위한 활성제를 포함할 수 있다.
마찬가지로, Siglec-15 결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 검출 가능한 마커와 접합될 수 있거나 또는 비접합될 수 있고, 시험관내 또는 생체내에서 각각 Siglec-15 또는 Siglec-15 리간드 발현을 검출하기 위해서 2차 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 따라서 분자는 영상화, 면역조직화학 및 다른 검정을 위해서 사용될 수 있다.
IV. 병용 요법
개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자는 이를 필요로 하는 대상체에게 단독으로 또는 1종 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자 및 추가적인 치료제는 별개로, 그러나 동시에 투여된다. 개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자 및 추가적인 치료제는 또한 동일한 조성물의 부분으로서 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자 및 제2 치료제는 상이한 시간에 별개로, 그러나 동일한 치료 요법의 부분으로서 투여된다.
대상체는 제2 치료제의 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 시간 이전에 또는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 초과의 일 이전에 제1 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 제2 작용제의 제1 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21, 28, 35 또는 48일 이전 마다 제1 작용제의 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 개시된 Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자는 제1 또는 제2 치료제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 Siglec-15 결합 분자 및 1종 이상의 Siglec-15 리간드-결합 분자가 조합물로 투여된다.
Siglec-15-결합 및/또는 Siglec-15 리간드-결합 분자 및 추가적인 치료제는 치료 요법의 부분으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 치료제가 대상체에게 4일째마다 투여될 수 있는 경우, 제2 치료제는 제1일, 제2일, 제3일 또는 제4일 또는 이들의 조합일에 투여될 수 있다. 제1 치료제 또는 제2 치료제는 전체 치료 요법 전체에서 반복적으로 투여될 수 있다.
예시적인 분자는 사이토카인, 화학치료제, 방사성핵종, 다른 면역치료제, 효소, 항생제, 항바이러스제(특히 단독, 또는 HIV 또는 B형 또는 C형 간염의 치료를 위한 뉴클레오사이드와 조합된 프로테아제 저해제), 항-기생충제(유충, 원생동물), 성장 인자, 성장 저해제, 호르몬, 호르몬 길항제, 항체 및 이의 생물활성 단편(인간화된, 단일 쇄, 및 키메라 항체 포함), 항원 및 백신 제형(아주반트 포함), 펩타이드 약물, 항-염증제, Toll-유사 수용체에 결합하여 선천적인 면역계를 활성화시키는 리간드(폴리이노신산:폴리사이티딜산(폴리I:C) 및 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않음), 적응성 면역계를 동원 및 최적화하는 분자, 세포독성 T 림프구, 자연 살해 세포 및 헬퍼 T-세포의 작용을 활성화시키거나 상향조절하는 다른 분자, 및 억제인자 또는 조절 T-세포를 불활성화시키거나 하향조절하는 다른 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
추가적인 치료제는 치료하고자 하는 병태, 장애 또는 질환을 기준으로 선택된다. 예를 들어, Siglec-15-결합 분자는 면역 반응을 향상시키거나 촉진시키거나, 또는 면역 반응을 저해하거나 억제하는 기능을 하는 1종 이상의 추가적인 작용제와 함께 공동투여될 수 있다.
A. 화학치료제
Siglec-15-결합 및 Siglec-15 리간드-결합 분자는 1종 이상의 화학치료제 및 프로-아폽토틱제(pro-apoptotic agent)와 조합될 수 있다. 대표적인 화학치료제는 암사크린, 블레오마이신, 부설판, 카페시타빈, 카보플라틴, 카부스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 크리산타스파제(crisantaspase), 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시카바마이드, 이다루비신, 이소파마이드, 이리노테칸, 류코보린, 리포솜 독소루비신, 리포솜 다우노루비신, 로무스틴, 멜팔란, 머캅토퓨린, 멘스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 프로카바진, 랄티트렉세드, 사트라플라틴, 스트렙토조신, 테가퍼-우라실, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 티오테파, 티오구아닌, 토포테칸, 트레오설판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 대표적인 프로-아폽토틱제는 플루다라빈타우로스포린, 사이클로헥스이미드, 악티노마이신 D, 락토실세라마이드, 15d-PGJ(2) 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
B. 다른 면역조정제
1. PD-1 길항제
일부 실시형태에서, Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 PD-1 길항제와 공동투여된다. 예정된 사멸-1(PD-1)은 T 세포 상에서 유도될 때 음성 면역 반응을 전달하는 수용체의 CD28 패밀리의 구성원이다. PD-1과 이의 리간드(B7-H1 또는 B7-DC) 중 하나 간의 접촉은 T 세포 증식 및/또는 T 세포 반응의 강도 및/또는 기간을 감소시키는 저해성 반응을 유도한다. 적합한 PD-1 길항제는 전문이 본 명세서에 참고로 구체적으로 포함된 미국 특허 제8, 114, 845호, 제8, 609,089호 및 제8,709,416호에 기술되어 있고, PD-1의 리간드에 결합하여 이를 차단하여 PD-1 수용체에 대한 리간드의 결합을 방해하거나 저해하거나, 또는 PD-1 수용체를 통한 저해성 신호 변환을 유도하지 않으면서 PD-1 수용체에 적접 결합하여 이를 차단하는 화합물 또는 작용제를 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-1 수용체 길항제는 저해성 신호 변환을 촉발하지 않으면서 PD-1 수용체에 직접 결합하고, 또한 PD-1 수용체의 리간드에 결합하여 리간드가 PD-1 수용체를 통해서 신호 변환을 촉발하는 것을 감소시키거나 저해한다. PD-1 수용체에 결합하고, 저해성 신호의 형질도입을 촉발하는 리간드의 수 및/또는 양을 감소시킴으로써, 더 적은 세포가 PD-1 신호 변환에 의해서 전달된 음성 신호 전달에 의해서 약화되고, 더 강한 면역 반응이 달성될 수 있다.
PD-1 신호전달은 주조직 적합 유전자 복합체(MHC)에 의해서 제시된 펩타이드 항원에 인접하여 PD-1 리간드(예컨대, B7-H1 또는 B7-DC)에 대한 결합에 의해서 유도된다고 여겨진다(예를 들어, 문헌[Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105:10275-10276 (2008)] 참고). 따라서, T 세포막 상의 PD-1 및 TCR의 공동결찰을 예방하는 단백질, 항체 또는 소분자가 또한 유용한 PD-1 길항제이다.
일부 실시형태에서, PD-1 수용체 길항제는 PD-1의 리간드 또는 PD-1 자체(특히 TCR로의 PD-1의 공동결찰은 이러한 결합에 이어지지 않는 경우)에 대한 결합에 의해서 PD-1 수용체 신호 변환을 감소시키거나 방해하고, 이에 의해서 PD-1 수용체를 통해서 저해성 신호 변환을 촉발시키지 않는 소분자 길항제 또는 항체이다.
본 발명의 방법에 의해서 고려되는 다른 PD-1 길항제는 PD-1 또는 PD-1의 리간드에 결합하는 항체, 및 다른 항체를 포함한다.
적합한 항-PD-1 항체는 미국 특허 제7332582호, 제7488802호, 제7521051호, 제7524498호, 제7563869호, 제7981416호, 제8088905호, 제8287856호, 제8580247호, 제8728474호, 제8779105호, 제9067999호, 제9073994호, 제9084776호, 제9205148호, 제9358289호, 제9387247호, 제9492539호, 제9492540호에 기술된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들 모두는 전문이 참고로 포함된다.
또한 문헌[Berger et al., Clin. Cancer Res., 14:30443051 (2008)]을 참고하기 바란다.
예시적인 항-B7-H1(라고도 지칭됨 항-PD-L1) 항체는 하기 미국 특허 제8383796호, 제9102725호, 제9273135호, 제9393301호, 및 제9580507호에 기술된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 이들 모두는 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
항-B7-DC(항-PD-L2라고도 지칭됨) 항체에 대해서는 미국 특허 제7,411,051호, 제7,052,694호, 제7,390,888호, 제8188238호, 및 제9255147호를 참고하기 바라며, 이들 모두는 이들의 전문이 본 명세서에 구체적으로 참고로 포함된다.
다른 예시적인 PD-1 수용체 길항제는 B7-DC 폴리펩타이드, 예컨대, 이의 동족체 및 변이체, 뿐만 아니라 상기 중 임의의 것의 활성 단편, 및 이들 중 임의의 것을 혼입한 융합 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 항체, 예컨대, 인간 IgG의 Fc 부분에 커플링된 B7-DC의 가용성 부분을 포함하고, 인간 B7-DC의 막관통 부분의 전부 또는 일부를 혼입하지 않는다.
PD-1 길항제는 또한 예를 들어 마우스 또는 영장류, 예컨대, 인간으로부터의 포유동물 B7-H1의 단편일 수 있고, 여기서 단편은 PD-1에 결합하여 이를 차단하지만, PD-1을 통해서 저해성 신호 변환을 초래하지 않는다. 단편은 또한 융합 단백질, 예를 들어, Ig 융합 단백질의 부분일 수 있다.
다른 유용한 폴리펩타이드 PD-1 길항제는 PD-1 수용체의 리간드에 결합하는 것을 포함한다. 이것은 PD-1 리간드, 예컨대, B7-H1 또는 B7-DC에 결합하고, 내생 PD-1 수용체에 대한 결합을 예방함으로써, 저해성 신호 변환을 예방할 수 있는 PD-1 수용체 단백질, 또는 이의 가용성 단편을 포함한다. B7-H1은 단백질 B7.1에 결합하는 것으로 밝혀져 있다(Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). 이러한 단편은 또한 자연 리간드에 대한 결합을 증가시키는, 돌연변이, 예컨대, A99L 돌연변이를 포함하는 PD-1 단백질의 가용성 ECD 부분을 포함한다(Molnar et al., PNAS, 105:10483-10488 (2008)). B7-H1 리간드에 결합하고, 내생 PD-1 수용체에 대한 결합을 예방함으로써, 저해생 신호 변환을 예방할 수 있는 B7-1 또는 이의 가용성 단편이 또한 유용하다.
PD-1 및 B7-H1 안티-센스 핵산, DNA 및 RNA 둘 모두, 뿐만 아니라 siRNA 분자는 또한 PD-1 길항제일 수 있다. 이러한 안티-센스 분자는 T 세포 상에서의 PD-1의 발현뿐만 아니라 T 세포 리간드, 예컨대, B7-H1, PD-L1 및/또는 PD-L2의 생산을 예방한다. 예를 들어, 담체, 예컨대, 폴리에틸렌이민과 복합체화된 siRNA(예를 들어, 약 21개 뉴클레오타이드 길이, PD-1을 암호화하는 유전자 또는 PD-1 리간드를 암호화하는 유전자에 대해서 특이적임, 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 쉽게 구매될 수 있음)(문헌[Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009)] 참고)는 PD-1뿐만 아니라 PD-1의 리간드를 발현하고, 이러한 수용체 및 리간드의 발현을 감소시켜 T 세포에서 저해성 신호 변환의 감소를 달성하는 세포에 의해서 쉽게 포획됨으로써, T 세포를 활성화시킨다.
2. CTLA4 길항제
면역 반응에서 T 세포의 효과를 매개하는 데 유용한 다른 분자가 또한 추가적인 치료제로서 고려된다. 일부 실시형태에서, 분자는 CTLA4의 길항제, 예를 들어 길항성 항-CTLA4 항체이다. 본 발명의 방법에서의 사용에 고려되는 항-CTLA4 항체의 예는 특허 제PCT/US2006/043690호(Fischkoff et al., WO/2007/056539)에 기술된 항체를 포함한다.
항-PD-1, 항-B7-H1, 및 항-CTLA4 항체에 대한 투여량은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 0.1 내지 100㎎/㎏의 범위, 또는 1 내지 50㎎/㎏, 또는 10 내지 20㎎/㎏의 더 좁은 범위일 수 있다. 인간 대상체에 대한 적절한 용량은 5 및 15㎎/㎏일 수 있고, 10㎎/㎏의 항체(예를 들어, 인간 항-PD-1 항체)가 구체적인 실시형태이다.
본 발명의 방법에 유용한 항-CTLA4 항체의 구체적인 예는 예를 들어, 약 10㎎/㎏의 용량으로 투여되는 인간 항-CTLA4 항체인 이필리무맙, 및 예를 들어, 약 15㎎/㎏의 용량으로 투여되는 인간 항-CTLA4 항체인 트레멜리무맙이다(또한 문헌[Sammartino, et al., Clinical Kidney Journal, 3(2):135-137 (2010), published online December 2009] 참고).
다른 실시형태에서, 길항제는 소분자이다. 일련의 작은 유기 화합물이 B7-1 리간드에 결합하여 CTLA4에 대한 결합을 예방하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Erbe et al., J. Biol. Chem., 277:7363-7368 (2002)] 참고). 이러한 작은 유기물은 단독으로 항-CTLA4 항체와 함께 투여되어 T 세포의 저해성 신호 변환을 감소시킬 수 있다.
3. 증강제(potentiating agent)
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 증강제를 포함한다. 증강제는 가능하게는 하나 초과의 기전에 의해서, 면역 반응 상향조절제의 효능을 증가시키는 작용을 하지만, 정확한 작용 기전은 본 발명의 광범위한 실시에 본질적인 것이 아니다.
일부 실시형태에서, 증강제는 사이클로포스파마이드이다. 사이클로포스파마이드(CTX, Cytoxan(등록상표), 또는 Neosar(등록상표))는 옥사자포스포린(oxazahosphorine) 약물이고, 유사체는 이포스파마이드(IFO, Ifex), 퍼포스파마이드, 트로포스파마이드(트로포스파마이드; Ixoten), 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 전구약물 및 대사산물(전문이 포함된 미국 특허 출원 제20070202077호)을 포함한다. 이포스파마이드(MITOXANA(등록상표))는 사이클로포스파마이드의 구조 유사체이고, 이의 작용 기전은 사이클로포스파마이드의 작용 기전과 동일하거나 실질적으로 유사하다고 간주된다. 퍼포스파마이드(4-하이드로퍼옥시사이클로포스파마이드) 및 트로포스파마이드는 또한 사이클로포스파마이드와 구조적으로 관련된 알킬화제이다. 예를 들어, 퍼포스파마이드는 DNA를 알킬화시킴으로써, DNA 복제 및 RNA 및 단백질 합성을 저해한다. 신규 옥사자포스포린 유도체는 감소된 숙주 독성과 함께 선택성 및 반응을 개선시키려는 시도로 설계 및 평가되었다(Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). 이것은 마포스파마이드(NSC 345842), 글루포스파마이드(D19575, 베타-D-글루코실아이소포스포르아마이드 머스타드), S-(-)-브로모포스파마이드(CBM-11), NSC 612567(알도포스파마이드 퍼하이드로티아진) 및 NSC 613060(알도포스파마이드 티아졸리딘)를 포함한다. 마포스파마이드는 4-하이드록시-CPA의 화학적으로 안정한 4-티오에탄 설폰산염인 옥사자포스포린 유사체이다. 글루포스파마이드는 IFO의 알킬화 대사산물인 아이소포스포르아마이드 머스타드가 베타-D-글루코스 분자에 글리코시드에 의해서 연결된 IFO 유도체이다. 추가적인 사이클로포스파마이드 유사체는 전문이 본 명세서에 참고로 포함되고 발명의 명칭이 "Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents"인 미국 특허 제5,190,929호에 기술되어 있다.
CTX 자체는 비독성이지만, 이의 대사산물 중 일부는 DNA 가교결합을 유도하고, 더 높은 용량에서 가닥 절단을 유도하는 세포독성 알킬화제이다. 다수의 세포는 CTX에 내성인데, 그 이유는 그것이 높은 수준의 해독 효소 알데하이드 데하이드로게나제(ALDH)를 발현하기 때문이다. CTX는 림프구를 증식시키는 것을 표적으로 하는데, 그 이유는 림프구(그러나 조혈 줄기세포 아님)가 단지 낮은 수준의 ALDH를 발현하고, 순환 세포가 DNA 알킬화제에 대부분 민감하기 때문이다.
저용량의 CTX(200㎎/㎏ 미만)는 암의 인간 및 마우스 모델에서 항-종양 면역 반응의 자극을 비롯한, 면역 자극 효과를 가질 수 있다(Brode & Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008)). 이러한 낮은 용량은 치료효과가 없고, 직접적 항-종양 활성도를 갖지 않는다. 이에 반해서, 고용량의 CTX는 항-종양 반응을 저해한다. 몇몇 기전이 항-종양 면역 반응의 강화에서 CTX의 역할을 설명할 수 있다:(a) CD4+CD25+FoxP3+ Treg(및 특히 억제성일 수 있는 특이적으로 증식하는 Treg)의 고갈, (b) B 림프구의 고갈; (c) 종양 세포 성장의 억제를 초래하는 산화질소(NO)의 유도; (d) CD11b+Gr-1+ MDSC의 동원 및 확장. 이러한 1차 효과는 다수의 2차 효과를 갖고; 예를 들어 Treg 고갈 후에 대식세포는 더 많은 IFN-γ 및 더 적은 IL-10을 생산한다. CTX는 또한 타입 I IFN 발현을 유도하고, 림프구의 항상성 증식을 촉진시키는 것으로 밝혀져 있다.
Treg 고갈은 CTX가 항-종양 면역 반응을 증강시키는 기전으로서 가장 자주 언급되어 있다. 이러한 결론은 입양 전달 실험의 결과를 부분적으로 기반으로 한다. AB1-HA 종양 모델에서, 9일에 CTX 처리는 75% 치료율을 제공한다. 12일에 정제된 Treg의 전달은 CTX 반응을 거의 완전히 저해하였다(van der Most et al. Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009). HHD2 종양 모델에서 유사한 결과가 관찰되었는데: CTX 전처리 후 CD4+CD25+ Treg의 입양 전달은 백신에 대한 치료 반응을 제거하였다(Taieb, J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)).
다수의 인간 임상 시도는, 저용량 CTX가 안전하고, 널리 용인되고, 항-종양 면역 반응을 위한 효과적인 작용제인 것을 입증하였다(Bas, & Mastrangelo Cancer Immunol. Immunother. 47:1-12 (1998)).
항-종양 면역 반응을 증강시키기 위한 CTX에 대한 최적의 용량은, Treg 수준을 정상 수준 미만으로 낮춤으로써 전체 T 세포 수치를 낮추지만, 치료 수준 미만인 것이다(문헌[Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)] 참고).
CTX가 면역증강제로서 사용된 인간 임상 시험에서, 300㎎/m2의 용량이 통상적으로 사용되었다. 평균 남성(6ft, 1.98m2의 신체 표면적을 갖는 170파운드(78㎏)의 경우, 300㎎/m2가 8㎎/㎏, 또는 624㎎의 총 단백질이다. 암의 마우스에서, 효능은 15 내지 150㎎/㎏ 범위의 용량에서 인지되었고, 이는 30g 마우스에서 0.45 내지 4.5㎎의 총 단백질에 관련된다(Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001), Hengst et al Cancer Res. 41:2163-2167 (1981), Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980)).
더 큰 포유동물, 예컨대, 영장류, 예컨대, 인간, 환자에서, 이러한 ㎎/m2 용량이 사용될 수 있지만, 한정된 시간 간격에 걸쳐서 투여되는 단위 용량이 또한 사용될 수 있다. 이러한 단위 용량은 한정된 시간 기간 동안 1일 기준으로 투여될 수 있고, 예컨대, 최대 3일, 또는 최대 5일, 또는 최대 7일, 또는 최대 10일, 또는 최대 15일 또는 최대 20일 또는 최대 25일이 본 발명에 의해서 모두 구체적으로 고려된다. 동일한 요법이 본 명세서에 언급된 다른 증강제에 대해서 적용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 증강제는 활성도 및/또는 조절 T 림프구(T-reg)의 수를 감소시키는 작용제, 예컨대, 수니티닙(SUTENT(등록상표)), 항-TGFβ 또는 이마티닙(GLEEVAC(등록상표))이다. 언급된 치료 요법은 또한 아주반트를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
유용한 증강제는 또한 유사분열 저해제, 예컨대, 파클리탁솔, 아로마타제 저해제(예를 들어, 레트로졸) 및 혈관신생 저해제(VEGF 저해제, 예를 들어, 아바스틴, VEGF-Trap)(예를 들어, 문헌[Li et al., Clin Cancer Res. 2006 Nov 15; 12(22):6808-16] 참고), 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 독소루비신, TLR4 길항제, 및 IL-18 길항제를 포함한다.
C. 항미생물제
일 실시형태에서, Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 상기에 논의된 바와 같은 질환의 치료 및 예방에서, 그리고 또한 중증 외상 상해, 예컨대, 주요 화상, 개방 골절, 우발 유산 또는 다른 상처와 관련하여 예방 또는 예방적 역할에서 사용될 수 있다. 따라서, Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 항미생물제, 예컨대, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 항기생충제, 또는 에션셜 오일과 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 추가의 박테리아, 진균 또는 바이러스 합병증을 예방하기 위해서 병원에 입원할 때 Siglec-15-결합 분자 및/또는 항미생물제가 투여된다. 항생제는 병원균을 표적으로 할 수 있고, Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 추가 감염 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 향상된 반응을 제공하도록 면역계를 자극할 수 있다.
D. 면역억제제
일부 실시형태에서, 면역 반응, 또는 염증성/자가면역 질환/장애는 대상체에게 Siglec-15-결합 또는 리간드-결합 분자 및 면역 억제성인 제2 작용제를 투여함으로써 치료된다. 면역억제제는 다른 림프구 표면 마커(예를 들어, CD40, 알파-4 인테그린) 또는 사이토카인)에 대한 항체, 융합 단백질(예를 들어, CTLA-4-Ig(Orencia(등록상표)), TNFR-Ig(Enbrel(등록상표))), TNF-α 차단제, 예컨대, 엔브렐(Enbrel), 레마케이드(Remicade), 심지아(Cimzia) 및 휴미라(Humira), 사이클로포스파마이드(CTX)(즉, Endoxan(등록상표), Cytoxan(등록상표), Neosar(등록상표), Procytox(등록상표), Revimmune(상표명)), 메토트렉세이트(MTX)(즉, Rheumatrex(등록상표), Trexall(등록상표)), 벨리무맙(즉, Benlysta(등록상표)), 따른 면역억제 약물(예를 들어, 사이클로스포린 A, FK506-유사 화합물, 라파마이신 화합물, 또는 스테로이드), 항-증식제, 세포독성제, 또는 면역억제를 도울 수 있는 다른 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
치료제는 CTLA-4 융합 단백질, 예컨대, CTLA-4-Ig(아바타셉트)일 수 있다. CTLA-4-Ig 융합 단백질은 T 세포 상의 공자극성 수용체, CD28과 항원 제시 세포 상의 CD80/CD86 (B7-1/B7-2)에 대한 결합에 대해서 경쟁함으로써, T 세포 활성화를 저해하는 기능을 한다. 또 다른 실시형태에서, 치료제는 벨라타셉트라고 공지된 CTLA-4-Ig 융합 단백질이다. 벨라타셉트는 생체내에서 CD86에 대한 이의 결합활성을 상당히 증가시키는 2개의 아미노산 치환기를 함유한다(L104E 및 A29Y). 또 다른 실시형태에서, 치료제는 Maxy-4이다.
또 다른 실시형태에서, 치료제는 사이클로포스파마이드(CTX)이다. 사이토포스판이라고도 공지된 사이클로포스파마이드(Endoxan(등록상표), Cytoxan(등록상표), Neosar(등록상표), Procytox(등록상표), Revimmune(상표명)에 대한 일반명)은 옥사조포린 군으로부터의 질소 머스타드 알킬화제이다. 그것은 다양한 유형의 암 및 일부 자가면역 장애를 치료하는 데 사용된다. 사이클로포스파마이드(CTX)는 신장 루푸스를 갖는 환자에서 미만성 증식성 사구체신염을 위해서 사용되는 1차 약물이다.
이러한 치료제는 항-이중 가닥 DNA(항-ds DNA) 자가 항체의 혈액 또는 혈청 수준을 감소시키기 위해서 그리고/또는 이를 필요로 하는 환자에서 단백뇨를 감소시키기 위해서 유효량으로 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 치료제는 혈청에서 아데노신의 양을 증가시킨다(예를 들어, 국제 특허 제WO 08/147482호 참고). 예를 들어, 제2 치료제는 CD73-Ig, 재조합 CD73, 또는 CD73의 발현을 증가시키는 또 다른 작용제(예를 들어, 사이토카인 또는 단클론성 항체 또는 소분자)일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 제WO 04/084933호 참고). 또 다른 실시형태에서 치료제는 인터페론-베타이다.
치료제는 티사브리(Tysabri) 또는 MS에 대한 또 다른 치료제일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 제2 치료제는 만성 염증을 우선적으로 치료하고, 이에 의해서 치료 요법은 급성 및 만성 염증 둘 모두를 표적으로 한다. 바람직한 실시형태에서 제2 치료제는 TNF-α 차단제이다.
치료제는 Th1, Th17, Th22, 및/또는 IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-18 IL-17, IL-6, IL-23, IL-22, IL-21, 및 MMP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 염증성 분자를 분비하거나 또는 다른 분자가 이들을 분비하도록 하는 다른 세포에 의한 분화, 증식, 활성도, 및/또는 사이토카인 생산 및/또는 분비를 저해하거나 감소시키는 소분자일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 치료제는 Treg와 상호작용하거나, Treg 활성도를 향상시키거나, Treg에 의한 IL-10 분비를 촉진시키거나 향상시키거나, Treg의 수를 증가시키거나, Treg의 억제 능력을 증가시키거나 또는 이들의 조합인 소분자이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 Treg 활성도 또는 생산을 증가시킨다. 예시적인 Treg 향상제는 IL-12, IFN-γ, 및 IL-4에 대한 항체인 글루코코티코이드 플루티카손, 살메테로알; 비타민 D3, 및 덱사메타손 및 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 치료제는 항체, 예를 들어, 전염증성 분자, 예컨대, IL-6, IL-23, IL-22 또는 IL-21에 대한 기능 차단 항체인, 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "라파마이신 화합물"은 중성 트라이사이클릭 화합물 라파마이신, 라파마이신 유도체, 라파마이신 유사체, 및 라파마이신과 동일한 작용 기전(예를 들어, 사이토카인 기능의 저해)을 갖는 것으로 생각되는 다른 마크롤라이드 화합물을 포함한다. 표현 "라파마이신 화합물"은 라파마이신, 예를 들어, 이의 치료적 효과를 향상시키기 위해서 변형된 유사한 마크로사이클릭 구조를 갖는 화합물과 구조적 유사성을 갖는 화합물을 포함한다. 예시적인 라파마이신 화합물은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 국제 특허 제WO95122972호, 제WO 95116691호, 제WO 95104738호, 미국 특허 제6,015,809호; 제5, 989,591호; 미국 특허 제5,567,709호; 제5,559,112호; 제5,530,006호; 제5,484,790호; 제5,385,908호; 제5,202,332호; 제5,162,333호; 제5,780,462호; 제5,120,727호 참고).
표현 "FK506-유사 화합물"은 FK506, 및 FK506 유도체 및 유사체, 예를 들어, FK506, 예를 들어, 이의 치료적 효과를 향상시키기 위해서 변형된 유사한 마크로사이클릭 구조를 갖는 화합물과 구조적 유사성을 갖는 화합물을 포함한다. FK506-유사 화합물의 예는 예를 들어, 국제 특허 제WO 00101385호에 기술된 것을 포함한다. 바람직하게는, 표현 "라파마이신 화합물"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 FK506-유사 화합물을 포함하지 않는다.
E. 항염증제
다른 적합한 치료제는 항염증제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항염증제는 비스테로이드, 스테로이드 또는 이들의 조합물일 수 있다. 한 실시형태는 약 1%(w/w) 내지 약 5%(w/w), 전형적으로 약 2.5%(w/w) 또는 항염증제를 함유하는 경구 조성물을 제공한다. 비스테로이드 항염증제의 대표적인 예는 옥시캄, 예컨대, 피록시캄, 아이속시캄, 테녹시캄, 수독시캄; 살리실레이트, 예컨대, 아스피린, 다이살시드, 베노릴레이트, 트라일리세이트, 사파프린, 솔프린, 다이플루니살, 및 펜도살; 아세트산 유도체, 예컨대, 다이클로페낙, 펜클로페낙, 인도메타신, 설린닥, 톨메틴, 아이속세팍, 퍼로페낙, 티오피낙, 지도메타신, 아세마타신, 펜티아작, 조메피락, 클린다낙, 옥세피낙, 펠비낙, 및 케토롤락; 페나메이트, 예컨대, 메페나믹, 메클로페나믹, 플루페나믹, 니플루믹, 및 톨페남산; 프로피온산 유도체, 예컨대, 이부프로펜, 나프록센, 베녹사프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 인도프로펜, 피르프로펜, 카르프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜, 및 티아프로페닉; 피라졸, 예컨대, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 페프라존, 아자프로파존, 및 트라이메타존을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이들 비스테로이드 항염증제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
스테로이드 항염증 약물의 대표적인 예는 코티코스테로이드, 예컨대, 하이드로코티손, 하이드록실-트라이암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 덱사메타손-포스페이트, 베클로메타손 다이프로피오네이트, 클로베타솔 발러레이트, 데소나이드, 데스옥시메타손, 데스옥시코티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 다이클로리손, 다이플로라손 다이아세테이트, 다이플루코톨론 발러레이트, 플루아드레놀론, 플루클로롤론 아세토나이드, 플루드로코티손, 플루메타손 피발레이트, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루오시노나이드, 플루코틴 부틸에스터, 플루오코톨론, 플루프레드니덴(플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루란드레놀론, 할시노나이드, 하이드로코티손 아세테이트, 하이드로코티손 부티레이트, 메틸프레드니솔론, 트라이암시놀론 아세토나이드, 코티손, 코토독손, 플루세토나이드, 플루드로코티손, 다이플루오로손 다이아세테이트, 플루라드레놀론, 플루드로코티손, 다이플루로손 다이아세테이트, 플루라드레놀론 아세토나이드, 메드리손, 암시나펠, 암시나파이드, 베타메타손 및 이의 에스터의 나머지, 클로로프레드니손, 클로르프레드니손 아세테이트, 클로코텔론, 클레스시놀론, 다이클로리손, 다이플루르프레드네이트, 플루클로로나이드, 플루니솔리데, 플루오로메탈론, 플루페롤론, 플루프레드니솔론, 하이드로코티손 발러레이트, 하이드로코티손 사이클로펜틸프로피오네이트, 하이드로코타메이트, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손 다이프로피오네이트, 트라이암시놀론 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
V. 진단 방법
Siglec-15-결합 분자, 특히 항체 및 이의 항원-결합 단편은 진단 목적을 위해서, 예컨대, Siglec-15 발현과 연관된 질환, 장애 또는 감염을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해서, 또는 적합한 환자 집단 또는 프로파일을 결정하거나 이의 결정 또는 식별에 도움을 주기 위해서 사용될 수 있다. 방법 중 임의의 것은, 예를 들어, 대상체에게 유효량의 1종 이상의 치료적 Siglec-15-결합 분자를 투여함으로써 대상체를 치료하는 방법과 커플링될 수 있다.
암을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 질환, 장애 또는 감염의 검출 또는 진단은 (a) 하기 항원에 면역특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체(또는 이의 단편)를 사용하여 Siglec-15 또는 이의 유도체의 발현을 대상체의 세포, 혈청, 혈장, 혈액에서 또는 조직 샘플(예를 들어, 종양 샘플)에서 검정하는 단계; 및 (b) 항원의 수준을 대조군 수준, 예를 들어, 정상 조직 샘플에서의 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 항원의 대조군 수준과 비교하여 항원의 검정된 수준의 증가는 질환, 장애 또는 감염을 나타낸다. 이러한 항체 및 단편은 면역검정, 예컨대, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정 (RIA) 및 형광-활성화 세포 분류(FACS)에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 단편은 시험관내 또는 동일계 조직 샘플 또는 생체내의 세포에서의 IHC 측정을 위해서 사용된다. 따라서, 항체 및 단편은 인간에서 질환, 장애, 또는 감염을 검출 및 진단하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 진단은 a) 대상체에게 (예를 들어, 비경구로, 피하로 또는 복강내로) 유효량의 이러한 표지된 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 단계; b) 표지된 분자가 Siglec-15가 발현되는 대상체 내의 부위에서 우선적으로 농축되도록 하기 위해서(그리고 결합되지 않은 표지된 분자가 배경 수준으로 제거되게 하기 위해서) 투여 이후에 임의의 시간 간격 동안 기다리는 단계; c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 d) 대상체에서 표지된 항체를 검출하여, 배경 수준보다 높거나 낮은 표지된 항체의 국지화된 수준은 대상체가 질환, 장애 또는 감염을 갖는다는 것을 나타내고/거나 Siglec-15+ 조직의 위치 또는 상대적인 발현 수준을 나타내는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에 따라서, 항체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 영상화 시스템을 사용하여 생체내에서 검출 가능한 영상화 모이어티로 표지될 수 있다. 배경 수준은 검출된 표지된 분자의 양을 특정 시스템에 대해서 이미 결정된 표준 값과 비교하는 것을 비롯한 다양한 방법에 의해서 결정될 수 있다.
다른 방법은 예를 들어, (a) Siglec-15 결합 분자를 사용하여 제1 시점 및 추후 시점에서 수득된 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 제1 시점 및 추후 시점에서 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현의 수준을 비교하는 단계(여기서 제1 시점과 비교된 추후 시점에서의 Siglec-15의 검정된 수준의 증가는 질환, 장애 또는 감염의 진행을 나타냄)에 의해서 질환, 장애 또는 감염의 진행을 모니터링하는 것을 포함한다.
치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법은 (a) Siglec-15 결합 분자를 사용한 치료 전 및 후에 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 시간에 걸쳐서 Siglec-15의 수준을 비교하는 단계(이에 의해서 치료 전 Siglec-15의 수준과 비교된 치료 후 Siglec-15의 검정된 수준의 감소는 치료에 대한 선호되는 반응을 나타냄)를 포함할 수 있다.
대상체의 체격 및 사용되는 영상화 시스템은 진단 영상을 생성하는 데 필요한 영상화 모이어티의 양을 결정할 것이라는 것이 이해될 것이다.
사용되는 표지의 유형 및 투여 모드를 비롯한 몇몇 변수에 따라서, 대상체 내의 부위에서 표지된 분자가 우선적으로 농축되게 하기 위해서 그리고 비결합된 표지된 분자가 배경 수준으로 제거되기 위한 투여 이후의 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 또 다른 실시형태에서 투여 이후의 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
일 실시형태에서, 질환, 장애 또는 감염의 모니터링은 질환, 장애 또는 감염을 진단하는 방법을, 예를 들어, 초기 진단 1개월 후에, 초기 진단 6개월 후에, 초기 진단 1년 후에 등에 반복함으로써 수행된다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝에 대해서 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 대상체에서 검출될 수 있다. 이러한 방법은 사용된 표지의 유형에 좌우된다. 통상의 기술자는 특정 표지를 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 장치는 컴퓨터 단층 촬영(CT), 전신 스캔, 예컨대, 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자성 공명 영상화(MRI), 및 초음파검사법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
구체적인 실시형태에서, 분자는 방사성 동위원소로 표지되고, 방사선 반응성 수술 장비를 사용하여 환자에서 검출된다(투르스톤(Thurston) 등의 미국 특허 제5,441,050호). 또 다른 실시형태에서, 분자는 형광 화합물로 표지되고, 형광 반응성 스캐닝 장비를 사용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 실시형태에서, 분자는 양전자 방출 금속으로 표지되고, 양전자 방출-단층 촬영을 사용하여 환자에서 검출된다. 추가의 또 다른 실시형태, 분자는 상자성 표지로 표지되고, 자성 공명 영상화(MRI)를 사용하여 환자에서 검출된다.
VI. 키트
개시된 Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자는 양을 표시하는 밀폐식 밀봉 용기, 예컨대, 앰플 및 사™ˆ(sachette)에 포장될 수 있다. 분자는 밀폐식 밀봉 용기 내의 건조 멸균 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 제공될 수 있고, 예를 들어, 대상체에 대한 투여를 위해서 적절한 농도로 물 또는 염수를 사용하여 재구성될 수 있다. 예를 들어, 분자는 적어도 5㎎, 또는 적어도 10㎎, 적어도 15㎎, 적어도 25㎎, 적어도 35㎎, 적어도 45㎎, 적어도 50㎎, 또는 적어도 75㎎의 단위 투여량으로 밀폐식 밀봉 용기 내에 건조 멸균 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 동결건조된 분자는 본래 용기 내에 2 내지 8℃에서 저장될 수 있고, 전형적으로 재구성 후에 12시간 이내, 또는 6시간 이내, 또는 5시간 이내, 또는 3시간 이내, 또는 1시간 이내에 투여된다.
대안적인 실시형태에서, 분자는 양 및 농도를 나타내는 밀폐식 밀봉 용기에 액체 형태로 제공된다. 일부 실시형태에서, 밀폐식 밀봉 용기에 제공된 분자의 액체 형태는 적어도 1㎎/㎖, 또는 적어도 2.5㎎/㎖, 적어도 5㎎/㎖, 적어도 8㎎/㎖, 적어도 10㎎/㎖, 적어도 15㎎/㎖, 적어도 25㎎/㎖, 적어도 50㎎/㎖, 적어도 100㎎/㎖, 적어도 150㎎/㎖, 적어도 200㎎/㎖의 분자를 포함한다.
Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자가 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트가 또한 제공된다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 1종 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 약제학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 약제학적 팩 또는 키트는 또한 개시된 약제학적 조성물의 성분 중 1종 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 임의로 연관된 이러한 용기(들)는 약제학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해서 규정된 형태의 설명서를 가질 수 있고, 설명서는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다.
상기에 기술된 방법을 위해서 설계된 키트가 또한 제공된다. 실시형태는 전형적으로 1종 이상의 Siglec-15-결합 또는 Siglec-15 리간드-결합 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 또한 하나 이상의 용기 내에, 암의 치료에 유용한 1종 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 포함한다.
실시예
실시예 1: SIGLEC-15 항체 및 이의 중쇄 및 경쇄 서열
물질 및 방법
마우스 항-인간 Siglec-15 단클론성 항체
Siglec-15 넉아웃 마우스(N=2)를 CFA(완전 프로인드 아주반트)로 유화된 hS15.mIg(마우스 IgG2a와 융합된 인간 Siglec 15 세포외 도메인[ECD])로 면역화시켰다. 마우스에게 또한 GM-CSF 및 항-CD40의 주사를 제공하였다. 마우스를 2주 후에 동일한 면역원으로 시험감염시켰다. 1:1000 내지 1:100,000,000 이하의 다양한 희석으로, hS15.hIg(인간 IgG1과 융합된 인간 Siglec 15 ECD) 코팅된 ELISA 플레이트에서 꼬리 출혈로부터 수집된 혈청을 시험함으로써 항혈청 역가를 평가하였다. 도 1은 항-hS15 항체가 1:100,000 초과의 희석에서 검출되었음을 나타낸다. 마우스에게 2주 후에 제3 용량의 항원을 제공하였다. 최종 부스트 3일 후에, 마우스 비장세포를 수거하고, 10% FBS 및 글루타민이 보충된 RPMI 중에 재현탁시키고, 이후에 융합시켜 하이브리도마를 형성하였다.
Siglec-15 넉아웃(S15 KO) 비장세포의 전기융합
융합된 세포를 메틸셀룰로스 젤/배지에 플레이팅하고; 융합된 세포 위에 남아있는 것을 저온 보존하였고, 이것은 또 다른 클로닝 배취를 위해서 해동될 수 있다.
단일 클론을 취하고, 10x96웰 플레이트(960 클론)에 넣었다.
상청액을 2주 후에 수집하였다.
RACE
중쇄 및 경쇄의 RACE(cDNA 단부의 신속 증폭) 식별을 하기 프로토콜에 따라서 수행하였다: (1) mRNA 변성, (2) cDNA 합성, (3) 5'RACE 반응, (4) PCR 결과(아가로스 젤 상에서)를 분석하여 증폭된 DNA 단편을 가시화함 - 올바른 항체 가변 영역 DNA 단편은 500 내지 700개 염기쌍 크기를 가짐, (5) TOPO 클로닝된 PCR 양성 밴드; (6) PCR-증폭된 TOPO 클론, 그 다음 젤 전기영동 및 아가로스 젤로부터의 회수, (7) 총 218개의 클론의 서열결정, (8) 서열결정 데이터를 사용하여 CDR 분석을 수행함(CDR 영역을 vbase2.org를 통해서 입수 가능한 VBASE2를 사용하여 정의함).
결과
항체를 RACE 방법을 사용하여 클로닝시켰다. 218개의 클로닝된 DNA 단편을 서열결정한 후, 항체 서열 분석은 본 명세서에서 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B 및 105A라 지칭되는 24종의 항체 샘플에 대해서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 식별하였다. 서열을 하기 및 상기에 제공한다. 중쇄 및 경쇄 서열 및 CDR을 상기 및 하기에 제공하고, 도 2A 내지 3C에 도시한다.
1B2 서열:
FASTA 포맷의 1B2 VL 아미노산 서열
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1H3 서열:
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FASTA 포맷의 1C12 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 3H10 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 5G12 VL 아미노산 서열
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6F8 서열:
FASTA 포맷의 6F8 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 8C8 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 8C8 VH 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 8H8 VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 8H8 VH 뉴클레오타이드 서열
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9A5 서열:
FASTA 포맷의 9A5 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 9A5 VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 9A5 VH 아미노산 서열
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9A5 VH 뉴클레오타이드 서열 FASTA 포맷의
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10G9 서열:
FASTA 포맷의 10G9 VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 10G9 VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 10G9 VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 10G9 VH 뉴클레오타이드 서열
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6A 서열:
FASTA 포맷의 6A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 6A VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 6A VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 6A VH 뉴클레오타이드 서열
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28A 서열:
FASTA 포맷의 28A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 28A VH 아미노산 서열
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63A 서열:
FASTA 포맷의 63A VL 아미노산 서열
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GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(서열번호 122)
FASTA 포맷의 63A VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 63A VH 뉴클레오타이드 서열
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCTGGGTGAAGCAGAGAACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTAGAAGTGACAATACTTACTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGCGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(서열번호 135)
71A 서열:
FASTA 포맷의 71A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 71A VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 71A VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 71A VH 뉴클레오타이드 서열
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77A 서열:
FASTA 포맷의 77A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 77A VL 뉴클레오타이드 서열
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80A 서열:
FASTA 포맷의 80A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 80A VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 80A VH 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 82B VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 82B VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 82B VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 82B VH 뉴클레오타이드 서열
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83B 서열:
FASTA 포맷의 83B VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 83B VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 83B VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 82B VH 뉴클레오타이드 서열
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92A 서열:
FASTA 포맷의 92A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 92A VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 92A VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 92A VH 뉴클레오타이드 서열
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93B 서열:
FASTA 포맷의 93B VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 93B VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 93B VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 93B VH 뉴클레오타이드 서열
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99B 서열:
FASTA 포맷의 99B VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 99B VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 99B VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 99B VH 뉴클레오타이드 서열
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104B 서열:
FASTA 포맷의 104B VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 104B VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 104B VH 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 104B VH 뉴클레오타이드 서열
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105A 서열:
FASTA 포맷의 105A VL 아미노산 서열
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FASTA 포맷의 105A VL 뉴클레오타이드 서열
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FASTA 포맷의 105A VH 아미노산 서열
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGCIDPENGDIEYASRFQGKATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTTYVGFGYWGQGTLVTVSA(서열번호 111)
FASTA 포맷의 105A VH 뉴클레오타이드 서열
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCTGAGAATGGTGATATTGAATATGCCTCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCACCAGCCTGACATCTGCGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(서열번호 145)
실시예 2: 항-huS15 항체는 인간 S15 또는 마우스 S15를 발현하는 세포에 결합한다.
물질 및 방법
인간 293T 및 마우스 CRC MC38 종양 세포주를 인간 Siglec 15 또는 마우스 Siglec 15를 보유하는 렌티벡터로 형질도입하였다. 세포를 분류하여 인간 S15 및 마우스 S15 안정적인 세포주를 확립하였다. 293T.hS15 및 MC38.mS15 안정적인 세포를 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, Fc 수용체를 차단한 후 정제된 Siglec-15 mAb와 함께 인큐베이션시켰다. 100㎕ FACS 완충액 중의 1E05개 세포를 개별 튜브로 분취하고, 1㎍의 정제된 mAb를 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100㎕ FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 0.005㎍의 항-마우스 IgG-PE 2차 항체를 샘플에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정 완충액 중에 고정시키고, 그 다음 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
검정을 도 4A에 도시한다.
결과
1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9(도4B), 및 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 71A(NC71), NC74, 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), NC87, 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 105A(NC105)(도 4C)를 포함하는 항-huS15 항체를 인간 S15 또는 마우스 S15를 발현하는 세포에 대한 결합에 대해서 시험하였다. 결과를 도 4B 내지 4C에 나타낸다.
1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 및 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 또는 105A(NC105)를 포함하는 항-huS15 항체를 또한 포말린-고정된 세포에 대한 결합에 대해서 시험하였다. 결과를 도 4D에 나타낸다.
실시예 3: 정제된 항체는 마우스 및 인간 Siglec-15에 결합한다.
물질 및 방법
S15-TM 일시적으로 형질주입된 293T 세포(오페레타(Operetta))
S15-TM 일시적으로 형질주입된 K562 세포(FACS)
293T 세포를 리포펙타민 시스템을 사용하여 뮤린 Siglec-15 플라스미드 DNA로 일시적으로 형질주입시키고, K562 세포를 전기천공법에 의해서 인간 Siglec-15 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 100uL FACS 완충액(0.5%의 혈청을 함유하는 PBS) 중의 1e5개의 형질주입된 세포를 개별 튜브로 분취하고, 1ug의 정제된 mAb를 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100uL FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 0.005ug의 항-마우스 IgG-PE 2차 항체를 샘플에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정 완충액(PBS 중의 2% 폼알데하이드) 중에 고정시키고, 그 다음 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
U87 세포를 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, Fc 수용체를 차단한 후 정제된 Siglec-15 mAb와 함께 인큐베이션시켰다. 100uL FACS 완충액 중의 1e5개의 세포를 개별 튜브로 분취하고, 1ug의 정제된 mAb를 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100uL FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 0.005ug의 항-마우스 IgG-PE 2차 항체를 샘플에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정 완충액 중에 고정시키고, 그 다음 유세포 분석법에 의해서 분석하였다.
결과
정제된 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9를 293T 세포(인간 배아 신장 293 세포의 고도로 형질주입 가능한 유도체)에 의해서 발현된 마우스 Siglec-15(MS15) 및 K-562 세포(말단 아구 악화(terminal blast crisis)를 갖는 53세 여성의 흉수)에 의해서 발현된 인간 Siglec-15(hS15)에 대한 결합에 대해서 시험하였다. 결과를 도 5A 내지 도 5C에 나타낸다.
정제된 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 및 5F10을 또한 인간 Siglec-15(hS15)를 내인성으로 발현하는 인간 U87 신경교종 세포에 대한 결합에 대해서 시험하였다. 결과를 도 6A 내지 도 6C에 도시하는데, 이것은 각각, 각각의 항체에 대한 hS15+ 세포의 백분율(도 6A 및 도 6C) 및 평균 형광 강도(MFI)(도 6B)를 나타낸다.
실시예 4: 항-Siglec-15 항체는 Siglec-15 기능을 차단할 수 있다.
물질 및 방법
hS15.hG1의 제조
IgG 골격에 융합된 완전 S15 세포외 도메인을 포함하는 단량체 S15 융합 단백질을 친화도 및 경쟁 분석을 위해서 제조하였다. 트롬빈 절단 가능한 hS15.hFc cDNA를 pEE17.4로 서브클로닝하였다. 37℃에서 단편화 융합 단백질이 일시적으로 형질주입된 CHO 세포에서 인지되지만, 293 세포에서는 인지되지 않는다. 무손상 융합 단백질은 31℃에서 보다 효율적으로 발현된다.
융합 단백질은 하기 서열을 갖는다:
절단된 신호 서열을 갖는 성숙 융합 단백질은 하기와 같다:
뮤린 리더 서열은 밑줄로 표시된다. Siglec-15 세포외 도메인(ECD)은 이탤릭체이다. 힌지 영역은 이중 밑줄이다. 나머지 서열은 IgG1 Fc로부터 유래된다. IgG1 Fc 도메인 내의 L234F/L235E/P331S 돌연변이는 볼드체 및 점선 밑줄이다.
차단 분석
293T.LRRC4C 세포를 2라운드의 렌티-LRRC4C 형질도입에 의해서 확립하였다.
293T.LRRC4C 안정적인 세포를 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, Fc 수용체를 차단한 후 인큐베이션시켰다. 100㎕ FACS 완충액 중의 1E05 세포를 개별 튜브로 분취하고, 2㎍의 정제된 mAb를 먼저 첨가하고, 그 다음 0.2ug의 hSiglec-15hFc를 첨가하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 100㎕ FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 0.005㎍의 항-인간 IgG-PE 2차 항체를 샘플에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 과량의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정 완충액 중에 고정시키고, 그 다음 유세포 분석법에 의해서 분석하여 LRRC4C에 대한 Siglec-15의 결합을 결정하였다.
1㎍/㎖의 hS15.hG1 + 100㎕의 sup 또는 33㎍/㎖의 Cl#3, #1
검정을 도 7A에 도시한다.
결과
결과를 도 7B 내지 도 7E에 나타낸다.
S15/LRRC4C 상호작용의 완전 차단제는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다:
5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 1B2
부분 차단제는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다:
10G9, 8H8, 9A5
실시예 5: S15 mAb는 인간 T 세포의 hS15.hG1-매개된 억제를 반전시킨다.
물질 및 방법
PBMC 증식 검정
0.05㎍/㎖로 코팅된 항-CD3
총 인간 PBMC +/- 5㎍/㎖ hS15.hFc 및 12㎍/㎖ 의 Siglec-15 mAb, 또는 제시된 바와 같은 대조군
항-인간 CD3(클론 OKT3)을 96-웰 편평 바닥 조직 배양 플레이트의 웰당 100㎕의 PBS 중의 0.03㎍/㎖로 밤새 4℃에서 코팅하였다. PBS 및 비결합 CD3을 흡인시키고, 그 직후에 검정을 위한 성분을 첨가하였다. 건강한 인간 공여자로부터의 총 PBMC를 5μM의 CFSE로 10분 동안 RPMI-완전 배지(10% FBS 함유) 중에서 37℃에서 표지하고, 2회 세척하고, 그 다음 2.5E05개 세포/웰의 농도로 웰에 첨가하기 위해서 재현탁시켰다. 가용성 hSiglec-15hFc 또는 대조군을 웰에 5㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하고, 정제된 Siglec-15 mAb 또는 대조군을 12㎍/㎖의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 사이토카인 분석을 위해서 소량의 상청액을 제거한 후, 세포를 둥근 바닥 플레이트로 옮기고, Fc 수용체를 차단시키고, 세포를 CD4 및 CD8 형광 mAb로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포를 FACS 완충액 중에서 2회 세척한 후, 유세포 분석법에 의한 분석을 위해서 고정시켰다. 컨디셔닝된 상청액에서의 IFN감마 수준을 MSD ELISA 키트에 의해서 평가하였다.
검정을 도 8a 및 도 9A에 도시한다.
결과
정제된 항체 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 및 10G9를 PBMC 증식 검정으로 시험하였다(도 8b, 도 8c, 도 8d, 및 도 8e), 6A(NC6), 28A(NC28), 63A(NC63), 77A(NC77), 80A(NC80), 82B(NC82), 83B(NC83), 92A(NC92), 93B(NC93), 99B(NC99), 104B(NC104), 105A(NC105)(도 8f 및 도 8g). CD4+ 및 CD8+ T 세포는 게이팅형이었고, 세포 분열(증식)의 척도로서 CFSE 희석에 대해서 분석하였다. 증가된 희석은 보다 높은 세포 증식을 나타내었다. 결과는 특정 S15 mAb가 인간 T 세포의 hS15.hG1-매개된 억제를 반전시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
그러나, hS15와 LRRC4C의 상호작용의 차단은 T-세포 기능의 향상과는 상관관계가 없다. 결과를 도 8h 및 도 8i에 나타낸다.
인간 T 세포에서 IFNγ 생산의 hS15.hG1-매개된 감소를 반전시키는 S15 mAb가 또한 식별되었다. 결과를 도 9B에 나타낸다.
실시예 6: S15 mAb는 파골세포 형성을 차단할 수 있다.
물질 및 방법
새로운 PBMC를 단리시키고, 2가지 방식으로 단핵구를 농축시켰다:
MACS 칼럼 분류(도 10, 좌측 패널); 또는
무혈청 배지 중에서 플라스틱에 대한 부착(도 10, 우측 패널).
세포를 M-CSF 및 RANKL와 8일 동안 25E9 또는 S15 mAb와 함께 배양하고, TRAP(타트레이트-내성 산 포스파타제)에 대해서 검정하였다.
결과
도 15에 도시된 결과는, S15 mAb가 파골세포 형성을 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7: 인간화된 5G12 항체
클론 5G12를 인간화시켜, 3개의 인간화된 중쇄 및 5개의 인간화된 경쇄를 제공하였다(도 12A 및 도 12B).
5G12 hVL1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK(서열번호 219)
5G12 hVL1의 CDR1
KASQDINSYLS(서열번호 28)
5G12 hVL1의 CDR2
RANRLVD(서열번호 36)
5G12 hVL1의 CDR3
LQYDEFPYT(서열번호 43)
5G12 hVL2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK(서열번호 195)
5G12 hVL2의 CDR1
KASQDINTYLS(서열번호 196)
5G12 hVL2의 CDR2
RANRLVD(서열번호 36)
5G12 hVL2의 CDR3
LQYDEFPYT(서열번호 43)
5G12 hVL3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK(서열번호 197)
5G12 hVL3의 CDR1
KASQDINVYLS(서열번호 198)
5G12 hVL3의 CDR2
RANRLVD(서열번호 36)
5G12 hVL3의 CDR3
LQYDEFPYT(서열번호 43)
5G12 hVL4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIQSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK(서열번호 199)
5G12 hVL4의 CDR1
KASQDIQSYLS(서열번호 200)
5G12 hVL4의 CDR2
RANRLVD(서열번호 36)
5G12 hVL4의 CDR3
LQYDEFPYT(서열번호 43)
5G12 hVL5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLTSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK(서열번호 201)
5G12 hVL5의 CDR1
KASQDINVYLS(서열번호 198)
5G12 hVL5의 CDR2
RANRLTS(서열번호 202)
5G12 hVL5의 CDR3
LQYDEFPYT(서열번호 43)
5G12 hVH1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYSGSDTMHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 203)
5G12 hVH1의 CDR1
SYWIT(서열번호 204)
5G12 hVH1의 CDR2
DIYSGSDTMHYAEKFQG(서열번호 205)
5G12 hVH1의 CDR3
WWDYGSSYDYFDY(서열번호 71)
5G12 hVH2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYSGSDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 206)
hVH2의 CDR1
SYWIT(서열번호 204)
hVH2의 CDR2
DIYSGSDTTHYAEKFQG(서열번호 374)
hVH2의 CDR3
WWDYGSSYDYFDY(서열번호 71)
5G12 hVH3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWISWVRQAPGQGLEWMGDIYSGSDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 207)
5G12 hVH3의 CDR1
SYWIS(서열번호 208)
5G12 hVH3의 CDR2
DIYSGSDTTHYAEKFQG(서열번호 374)
5G12 hVH3의 CDR3
WWDYGSSYDYFDY(서열번호 71)
실시예 8: 막 결합된 S15는 면역억제성이다.
물질 및 방법
시험관내 PMBC T 세포 억제 검정 방법:
건강한 공여자의 분리반출법 유래된 백혈구-풍부 산물로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(키바이올로직스(KeyBiologics), 미국 테네시주 멤피스 소재)를 표준 피콜 구배 절차, 그 다음 저온보존을 사용하여 수거하였다. 검정 일에, 동결된 PBMC를 해동시키고, RPMI 완전 배지(RPMI-C, RPMI[써모피셔(ThermoFisher)] + 10% 페탈클론(FetalClone) III 혈청[하이클론(HyClone)])로 세척하고, 계수하였다. 세포를 RPMI-C 중에서 5μM CFSE(써모피셔)로 10분 동안 37℃에서 표지하고, 그 다음 RPMI-C로 2회 세척하였다. 총 PMBC(3E05개 세포/웰)를 4℃에서 밤새 항-인간 CD3(OKT3, 50ng/㎖; 이바이오사이언스(eBioScience))으로 미리 코팅된 96-웰 편평 바닥 코닝 코스타(Corning Costar) 플레이트에 플레이팅하였다. Siglec-15 hG1 Fc 융합 단백질을 제시된 바와 같은 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 세포를 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 72시간에, 50㎕의 상청액을 웰로부터 수거하고, 사이토카인 수준의 분석을 위해서 즉시 동결시켰다. 이어서 세포를 피펫팅에 의해서 각각의 웰로부터 수거하고, 유세포 분석법 염색 및 분석을 위해서 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. Fc 수용체를 TruStain FcX(2㎕/웰; 바이오레전드(Biolegend))로 차단하고, 그 다음 1시간 동안 4℃에서 CD4 APC-eFluor 780(2㎕/웰; 써모피셔) 및 CD8 eFluor 450(2㎕/웰; 써모피셔)에 대한 항체로 염색하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 FACS 완충액(1% 페탈클론 III 혈청을 함유하는 PBS)으로 2회 세척하였다. 세포를 150㎕ 고정 완충액(PBS 중의 3% 폼알데하이드) 중에 재현탁시키고, YETI 유세포 분석기(프로펠 랩스(Propel Labs))로 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo)로 분석하였다. 데이터를 비자극 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 비교하여 CFSE 희석을 기준으로 나눈 세포의 백분율로서 나타낸다. 상청액을 설명서에 따라서 IFN-γ, TNF-α 및 IL-6에 대해서 U-PLEX 키트(메조 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics)[MSD)])를 사용하여 분석하였다. U-PLEX를 메조 퀵플렉스(Meso QuickPlex) SQ 120 장비를 사용하여 판독하였다.
결과
막 결합된 S15는 면역억제성이다. 도 14A는 T 세포의 % 증식은 S15 Fc의 농도가 증가함에 따라 감소한다는 것을 보여주는 T 세포의 % 증식 대 인간 S15 Fc(㎍/㎖)의 선 그래프. 인간 PBMA를 CFSE로 표지하고, 항0CD3(OKT3) 코팅된 96웰 플레이트에 첨가하고, 제시된 농도에서 3일 동안 인간 S15 Fc 융합 단백질과 함께 배양하였다. 도 14B는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 IFN-γ의 pg/㎖의 막대 그래프. 도 14C는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 TNF-α의 pg/㎖의 막대 그래프. 도 14D는 0 또는 5㎍/㎖의 S15 Fc로 처리된 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액에서의 IL-6의 pg/㎖의 막대 그래프.
실시예 9: 인간 S15 또는 마우스 s15를 발현하는 세포에 대한 하이브리도마로부터 정제된 s15 mAb의 결합.
물질 및 방법
인간 S15(293T.hS15)를 안정하게 발현하는 293T 세포 및 마우스 S15(MC38.mS15)를 안정하게 발현하는 마우스 MC38 세포를 조직 배양물로부터 수거하였다. PBS로 1회 세척한 후, 세포를 염색을 위해서 96-웰 U-바닥 플레이트에 시딩하였다(5E04 세포/웰). 세포를 먼저 FACS 염색 완충액(1% 페탈클론 III 혈청을 함유하는 PBS) 중에서 마우스 하이브리도마로부터 정제된 제시된 항체 1㎍과 혼합하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척한 후, PE 접합된 항마우스 Ig 항체(이바이오사이언스)와 함께 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척하고, 100㎕의 FACS 완충액 중에 재현탁시킨 후 YETI 유세포 분석기(프로펠 랩스)로 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo)로 분석하였다. 데이터를 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)에 의해서 게이팅된 총 세포 집단에서 PE 양성인 세포의 백분율로서 나타낸다.
결과
도 15A 및 도 15B는 인간 S15 또는 마우스 S15를 발현하는 세포에 대한 하이브리도마로부터 정제된 S15 mAb의 결합에 대한 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 제시된 항체와 함께 인큐베이션시키고, 그 다음 PE 접합된 항-마우스 Ig 항체와 함께 인큐베이션시킨 세포의 FACS 분석에 의해서 결합을 평가하였다. 세포를 FACS를 통해서 PE+ 집단에 대해서 분석하였다.
실시예 10: 하이브리도마로부터의 정제된 S15 mAb는 막 결합된 S15 매개된 억제를 반전시킨다.
물질 및 방법
총 PBMC T 세포 증식 검정에서 Siglec-15 mAb를 사용한 Siglec-15 Fc 매개된 억제의 반전을 시험하는 방법:
상기 도 14와 동일하지만, 약간의 차이가 있다:
건강한 공여자의 분리반출법 유래된 백혈구-풍부 산물로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(키바이올로직스(KeyBiologics), 미국 테네시주 멤피스 소재)를 표준 피콜 구배 절차, 그 다음 저온보존을 사용하여 수거하였다. 검정 일에, 동결된 PBMC를 해동시키고, RPMI 완전 배지(RPMI-C, RPMI[써모피셔] + 10% 페탈클론 III 혈청[하이클론])로 세척하고, 계수하였다. 세포를 RPMI-C 중에서 5μM CFSE(써모피셔)로 10분 동안 37℃에서 표지하고, 그 다음 RPMI-C로 2회 세척하였다. 총 PMBC(3E05개 세포/웰)를 4℃에서 밤새 항-인간 CD3(OKT3, 50ng/㎖; 이바이오사이언스(eBioScience))으로 미리 코팅된 96-웰 편평 바닥 코닝 코스타(Corning Costar) 플레이트에 플레이팅하였다. Siglec-15 hG1 융합 단백질 5㎍/㎖(최종 농도)로 웰에 첨가하였다. 이어서 제시된 Siglec-15 mAb를 제시된 웰에 12㎍/㎖(최종 농도)로 첨가하였다. 세포를 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 72시간에, 50㎕의 상청액을 웰로부터 수거하고, 사이토카인 수준의 분석을 위해서 즉시 동결시켰다. 이어서 세포를 피펫팅에 의해서 각각의 웰로부터 수거하고, 유세포 분석법 염색 및 분석을 위해서 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. Fc 수용체를 TruStain FcX(2㎕/웰; 바이오레전드(Biolegend))로 차단하고, 그 다음 1시간 동안 4℃에서 CD4 APC-eFluor 780(2㎕/웰; 써모피셔) 및 CD8 eFluor 450(2㎕/웰; 써모피셔)에 대한 항체로 염색하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 FACS 완충액(1% F4etalClone III 혈청을 함유하는 PBS)으로 2회 세척하였다. 세포를 150㎕ 고정 완충액(PBS 중의 3% 폼알데하이드) 중에 재현탁시키고, YETI 유세포 분석기(프로펠 랩스(Propel Labs))로 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo)로 분석하였다. 데이터를 비자극 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 비교하여 CFSE 희석을 기준으로 나눈 세포의 백분율로서 나타낸다. 상청액을 설명서에 따라서 IFN-γ, TNF-α 및 IL-6에 대해서 U-PLEX 키트(메조 스케일 다이아그노스틱스(Meso Scale Diagnostics)[MSD)])를 사용하여 분석하였다. U-PLEX를 메조 퀵플렉스(Meso QuickPlex) SQ 120 장비를 사용하여 판독하였다.
결과
도 16A 및 도 16B는 제시된 항체로 처리된 분할된 CD8+ T 세포의 백분율의 막대 그래프이다. 도 16C 및 도 16D는 제시된 항체로 처리된 분할된 CD4+ T 세포의 백분율의 막대 그래프이다.
실시예 11: 3종의 종양 모델에서 정제된 5G12의 생체내 생물활성도
물질 및 방법
생체내 종양 모델을 위한 방법:
결장직장 종양 모델
도 17A: Siglec-15 과발현을 위해서 형질도입되고 분류된 MC38 종양 세포(ATCC)를 C57BL/6N 마우스 (찰스 리버(Charles River))의 면도한 우측 옆구리에 100㎕ 중의 2E05개 세포로 피하 주사하였다. 5마리 마우스/처리군에 종양 주사 후 6일에 시작하여 200㎍의 대조군 IgG(이노베이티브 리서치) 또는 정제된 엔도톡신-무함유 항-Siglec-15 클론 5G12를 투여하였다. 처리를 총 4회 용량을 위해서 4일마다 계속하였다. 종양을 매주 3회 측정하였다. 종양 체적을 (길이 x 폭^2)*0.5로서 계산하였다. 종양이 2000mm3에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
림프종 종양 모델
도 17B: EG7 종양 세포(ATCC)는 계란 오브알부민(OVA)을 발현하도록 형질주입된 EL4 종양 세포이다. 세포를 10일 동안 배양한 후, C57BL/6N 마우스(찰스 리버)의 면도한 우측 옆구리에 2E05개의 종양 세포를 피하 주사하였다. 10마리 마우스/처리군을 200㎍의 대조군 IgG(이노베이티브 리서치) 또는 정제된 엔도톡신-무함유 항-Siglec-15 클론 5G12로 처리하였다. 처리를 EG7 주사 8일 후에 시작하였고, 마우스를 총 4회 용량을 위해서 4일마다 처리하였다. 종양 체적을 (길이 x 폭^2)*0.5로서 계산하였다. 종양이 2000㎣에 도달하거나 종양이 15㎝의 평균 직경에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
난소암 모델
도 17C: ID8-OVA 종양 세포는 계란 오브알부민(OVA)을 발현하도록 안정하게 형질주입된 뮤린 ID8 난소 암 세포주이다. 세포를 10일 동안 배양한 후 5E06개 세포를 복강내로 주사하였다. 3주 후, 마우스에게 복강내 주사에 의해서 CD8+ T 세포 음성 선택(밀테니이 바이오테크(밀테니이 Biotec))에 의해서 단리된 5E05개의 OT-I Tg/Rag2-/- T 세포를 입양 전달하였다. 처리를 1일 후에 시작하였다(22일; n = 10/군). 마우스에게 총 5회 용량의 대조군 IgG 또는 정제된 엔도톡신-무함유 항-Siglec-15 클론 5G12를 4일마다 200㎍ 제공하였다. 마우스를 종양 주사 30일에 시작하여 칭량하고, 종양 부담을 체중 증가에 의해서 분석하였다. 데이터를 30일에서의 초기 중량으로부터의 마우스당 체중 증가 백분율로서 나타낸다. 중량이 150% 체중 증가 또는 30그램 초과에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
결과
5G12는 결장직장 모델(도 17A) 및 림프종 모델(도 17B)에서 생존율 백분율의 증가를 나타내었다. 5G12는 또한 종양 부담의 감소를 나타내었다(도 17C). 도 18은 생존 백분율 대 ID8/OVA 접종 후 일 수를 나타낸다.
실시예 12: S15 단량체 단백질에 대한 재조합 mAb의 친화도 평가
최적화된 KD 실험을 항-인간 Fc 캡쳐(AHC, 18-5060; 포르테바이오(ForteBio)) 센서를 사용하여 포르테바이오 옥텟(ForteBio Octet) RED96 장비 상에서 수행하였다　검정 완충액은 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS였고, 재생 완충액은 10mM 글리신(pH 1.5)이었다. 먼저 항체를 1㎍/㎖으로 600초 동안 로딩하였다. 그 다음 60초 기준선 단계, S15-세포외 도메인(ECD) 단량체 중에서의 300초 회합 단계, 및 마지막으로 1200초 해리 단계를 수행하였다. 단량체 농도는 2배 희석 시리즈의 100nM 내지 1.56nM 범위였고, 블랭크 웰을 포함시켰다. 포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어 7.0을 사용하여 데이터를 처리하였고; 참조 웰 가감과 함께 글로벌 핏을 사용하였다. 보고된 값은 적어도 3회의 독립적 옥텟 실시의 평균이다.
결과를 표 1에 나타낸다.
실시예 13: S15 mAb 에피토프 비닝(binning)
에피토프 비닝 실험을 스트렙타비딘(SA, 18-5019; 포르테바이오) 센서를 사용하여 포르테바이오 옥텟 RED96 장비 상에서 수행하였다　30초 기준선 단계 후에, 바이오틴 표지된 S15-mG1 융합 단백질을 10㎍/㎖로 600초 동안 센서 상에 로딩하였다. 그 다음 제1 항체(30㎍/㎖)에서 600초 회합 단계, 30초 기준선 및 제2 항체(15㎍/㎖)에서 400초 회합 단계를 수행하였다. 검정 완충액은 PBS였고, 재생은 10mM 글리신(pH 3.0)이었다. 포르테바이오 데이터 분석 소프트웨어 7.0을 사용하여 데이터를 처리하였고, 2차 항체 곡선을 경쟁 결합을 위해서 개별적으로 평가하였다. 제1 회합 단계와 구별되는 제2 회합 단계 동안의 곡선은 점유되지 않은 에피토프에 대한 결합을 나타낸다. 추가적인 결합의 결여는 에피토프 차단을 나타낸다.
결과를 표 2에 나타낸다.
실시예 14: 항-인간 S15 클론 1H3은 시험관내에서 인간 파골세포 형성을 저해한다 .
물질 및 방법
PBMC를 키 바이오로직스, 엘엘씨(Key Biologics, LLC)로부터 구매한 분리반출법 유래된 백혈구-풍부 산물로부터 분리하였다. 백혈구-풍부 산물을 피콜(Ficoll)의 쿠션 상에 적층하고, 30분 동안 400RCF에서 원심분리하였다. 피콜 간기 중의 세포를 제거하고, PBS 중에서 3회 세척하고, 10% DMSO를 갖는 FBS 중에서 동결시켰다. 실험 일에, 동결된 PBMC의 바이알을 액체 질소 저장소로부터 꺼내고, 해동시켰다. 단핵구를 제조사 설명서에 따라서 MACS 단핵구 단리 키트(130-096-537; 밀테니이 바이오테크)를 사용하여 단리하였다. 단리된 세포는 99% 생존하였다. 세포를 96웰 편평 바닥 조직 배양 플레이트에 웰당 3E05개 세포/㎝2, 100㎕의 검정 배지 중의 1E05개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 검정 배지는 10% FBS가 보충된 α-MEM 배지(깁코 32571-036), 1mM 피루브산나트륨, 25ng/㎖의 인간 대식세포 집락 자극 인자(밀테니이, 103-096-491), 및 30ng/㎖의 인간 RANKL(밀테니이, 130-093-988)로 이루어졌다. 세포를 플레이트에 3.5시간 동안 접착시키고, 그 후 10㎕의 50㎍/㎖ S15 항체를 첨가하고 최종 농도는 4.55㎍/㎖였다. 3개 복제 웰을 각각에 항체에 대해서 평가하였다. 3일 인큐베이션시킨 후, 배지를 변경하고, 새로운 항체를 첨가하였다. 7일에, 상청액을 본래 플레이트로부터 둥근 바닥 96웰 플레이트로 옮기고, 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 단핵구/파골세포를 비-브릿지 인터내셔널, 인크.(B-Bridge International, Inc.)(PMC-AK04F-COS)로부터의 TRAP 염색 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 염색하고, 인비트로젠(Invitrogen) EVOS FL 컬러를 사용하여 영상을 찍었다. 상청액 중의 TRAP(타트레이트-내성 산 포스파타제) 수준을 평가하기 위해서, 50㎕의 TRAP 염색 키트 완충액을 9㎕의 상청액과 배합하고, 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 540㎚에서의 각각의 웰의 흡광도를 기록하였다. 남아있는 상청액을 추후 사이토카인 분석을 위해서 -80℃에서 동결시켰다.
결과
도 19A는 제시된 항체와 함께 인간 M-CSF 및 인간 RANKL의 존재 하에서 96-웰 플레이트에서 시딩한 후 미테니이 단핵구 자성 비드를 사용하여 인간 PBMC로부터 수거된 인간 CD14+ 단핵구를 나타낸 개략적인 다이어그램이다. 도 19B는 파골세포를 나타낸 현미경 사진이다. 도 19C는 타트레이트-내성 산 포스포타제 분석을 위해서 7일 후에 수집된 상청액의 흡광도 540㎚의 막대 그래프이다.
실시예 15: 1H3은 인간 단핵구에서 M-CSF 및 RANKL에 의해서 매개된 IL-6 및 TNF-α 생산을 감소시킨다.
물질 및 방법
상기 실험으로부터의 No-RANKL(M-CSF 단독), 대조군 mAB(M-SCF + RANKL + 대조군 mAb) 및 1H3(M-CSF + RANKL + 1H3) 웰로부터의 상청액을 수집하고, 사이토카인 분석을 위해서 시험하였다.
결과
도 20은 INF-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A 및 TNF-α에 대한 사이토카인(pg/㎖)을 나타낸 막대 그래프이다.
실시예 16: 항인간 S15 mAb 1H3은 시험관내에서 마우스 파골세포 형성을 예방한다
물질 및 방법
마우스 RAW 264.7 대식세포 세포를 편평 바닥 96-웰 플레이트에 웰당 1.5E04개 세포/㎝2, 90㎕의 배지 중의 4800개 세포의 밀도로 시딩하였다. 배지는 10% FBS를 갖는 DMEM, 1mM 피루브산나트륨, 및 50ng/㎖ 마우스 RANKL(이바이오사이언스, 14-8612-80)로 이루어졌다. 세포를 2시간 동안 접착시킨 후, 10㎕의 제시된 항체(50㎍/㎖)를 웰에 첨가하여, 5㎍/㎖의 최종 농도를 생성하였고; 항체를 3회 복제 웰에서 평가하였다. 세포를 5일 동안 분화시켰고, 그 때 세포를 염색하고, 상청액을 상기와 같이 TRAP 함량에 대해서 평가하였다.
결과
도 21은 제시된 항체와 함께 RANKL의 존재 하에서 배양된 마우스 RAW 264.7 대식세포 세포의 흡광도 540㎚의 막대 그래프이다.
실시예 17: Siglec-15 발현은 인간 M2 대식세포에서 상향조절된다.
물질 및 방법
Siglec-15의 발현
인간 CD14+ 단핵구를 자성 비드 음성 선택 키트(밀테니이 바이오테크)를 통해서 인간 PBMC롤부터 단리시키고, M-CSF로 3일 동안 처리하고, 이어서 세포를 IL-10(M2 대식세포 편극) 또는 IFN-γ/LipiA(M1 대식세포 편극)의 존재 하에서 3일 더 배양하였다. Siglec-15의 세포 표면 발현을 항-Siglec-15 항체 염색 그 다음 FACS 분석에 의해서 검출하였다.
Siglec-15 발현의 유도
마우스 골수 세포를 Balb/C 마우스로부터 수거하였다. 접착성 세포를 플라스틱 배양 접시에 대한 부착에 의해서 제거하였다. 부유하는 마우스 조혈 세포를 수거하고, M-CSF로 3일 동안 처리하고, 그 다음 4일 동안 스트레이트 M-CSF 처리 또는 M-CSF + IL-10 처리를 수행하였다. 처리된 세포를 수거하고, 골수 세포 마커(CD11b 및 F4/80) 및 PE 표지된 항-S15로 염색한 후 FACS 분석하였다. PE의 평균 형광 강도를 하부 패널에 그래프로 나타낸다. M-CSF는 S15 발현을 약간 증가시켰다.
결과
Siglec-15 발현이 인간 M2 대식세포(도 25A)에서 관찰되며, 인간 M1 대식세포(도 25B)에서는 관찰되지 않는다.
M-CSF 및 IL-10은 마우스 골수-유래된 골수 세포에서 S15 발현을 증가시킨다(도 25C 내지 도 25E).
실시예 18: Siglec-15는 인간 골수 세포 생존을 촉진시키고, 염증전 사이토카인 생산을 증가시킨다.
물질 및 방법
인간 CD14+ 단핵구를 먼저 자성 비드 음성 선택 키트(밀테니이 바이오테크)를 통해서 (2명의 건강한 공여자로부터의) 인간 PBMC로부터 단리시키고, Siglec-15 융합 단백질로 코팅(Siglec-15 코팅)되거나 또는 코팅되지 않고 도면에 제시된 농도로 배양 배지 중의 Siglec-15 융합 단백질(Siglec-15 가용성)이 첨가된 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 6일 후, 컨디셔닝된 상청액을 MSD 키트를 통해서 사이토카인 분석을 위해서 수집하였다. 플레이트에 XTT(써모피셔)를 첨가함으로써 세포 생존력을 평가하였다. 2시간 배양 후, 450㎚에서의 흡광도 판독에 의해서 세포 대사/생존력을 측정하였다.
결과
Siglec-15 Fc로 코팅된 플레이트 및 가용성 Siglec-15 Fc를 갖는 것 둘 모두의 웰에서 더 높은 흡광도가 웰에서 검출되었다. 사이토카인 분석은, S15 용량이 처리된 웰에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 생산을 의존적으로 증가시켰다는 것을 나타내었다(여기에 제시된 가용성 S15 웰로부터의 데이터).
실시예 19: 인간 골수 세포로 처리된 Siglec-15 Fc는 인간 T 세포 기능에 영향을 미친다.
물질 및 방법
도 27A는 하기 실험에 대한 개략적인 다이어그램이다. 인간 CD14+ 단핵구를 자성 비드 음성 선택 키트(밀테니이 바이오테크)를 통해서 (2명의 건강한 공여자로부터의) 인간 PBMC로부터 단리시키고, 상기에 기술된 바와 같이 Siglec-15 Fc로 6일 동안 처리하거나 또는 M2 또는 M1 대식세포로 편극시키거나 또는 GM-CSF 및 IL-4로 처리하여 세포를 미성숙 수지상 세포(imDC)로 분화시켰다. 배양 접수를 살짝 긁어서 세포를 수거하였다. 원심분리 후, 세포를 재현탁시키고, 1 골수 세포 : 2 T 세포의 세포비에서 항-CD3/CD28 비드(1 pan-T 세포 : 2 비드)와 함께 CFSE 표지된 음성적으로 선택된 자가유래 pan-T 세포와 공배양하였다. 5일 후, 컨디셔닝된 상청액을 MSD로부터의 MSD 멀티플렉스 키트를 사용하여 사이토카인 분석을 위해서 수집하였다. 세포를 수거하고, 항-CD4 및 항-CD8 항체로 염색하였다. T 세포 증식을 FACS 분석에 의해서 분석하여 CFSE 희석된 세포 집단을 측정하였다.
결과
데이터는, Siglec-15 Fc 처리된 골수 세포가 이러한 특정 공여자(공여자#1707)로부터의 세포를 사용하여 항-CD3/CD28 비드-매개된 CD4 및 CD8 T 세포 증식을 감소시켰고, 억제는 M2 대식세포만큼 크기는 않았다는 것을 나타내었다(도 27B 내지 도 27G). 사이토카인 분석은, S15 처리된 골수 세포가 항-CD3/CD28 비드-매개된 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-10 생산을 상당히 손상시켰다는 것을 드러내었다. 다른 시험된 공여자로부터의 데이터는, S15 처리된 세포가 T 세포 증식을 제한되게 억제하지만, 대부분의 경우에, 사이토카인 생산을 상당히 억제한다는 것을 나타내었다.
실시예 20: Siglec-15 mAb 용량은 인간 골수 세포에 대한 S15-매개된 생존 효과를 의존적으로 차단하였다.
물질 및 방법
인간 CD14+ 단핵구를 자성 비드 음성 선택 키트(밀테니이 바이오테크)를 통해서 (2명의 건강한 공여자로부터의) 인간 PBMC로부터 단리시키고, 20㎍/㎖로부터 1:2로 연속 희석된, Siglec-15에 대한 mAb와 함께 5㎍/㎖의 S15 Fc 융합 단백질을 갖는 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 7일 동안 배양하였다. 플레이트에 XTT(써모피셔)를 첨가함으로써 세포 생존력/대사를 평가하였다. 2시간 배양 후, 450㎚에서의 흡광도 판독에 의해서 세포 대사/생존력을 측정하였다. S15 Fc 융합 단백질을 갖고 어떠한 항체도 없는(mAb 없음) 웰에서 높은 흡광도가 검출되었다. S15 Fc 융합 단백질이 없는(S15 Fc 없음) 웰에서 낮은 흡광도가 수득되었다.
결과
Siglec-15 mAb 용량은 흡광도를 의존적으로 감소시켰다(하단 선). 대조군 항체(상단 선)는 세포 생존 및 대사에 어떠한 효과도 갖지 않았다. 도 28A(공여자 1709) 및 도 28B(공여자 1713)는 항-S15 mAb 용량이 인간 골수 세포에 대한 S15-매개된 생존 효과를 의존적으로 차단하였다는 것을 나타낸다.
실시예 21: Siglec-15는 파골세포 형성에 중요한 역할을 한다.
골아세포 및 간질 세포 상에서 발현된 M-CSF는 골수 세포 상에서 Siglec-15 발현을 유도하는데, 이것은 시스 또는 트랜스로 Siglec-15 결합 파트너와 상호작용하여 염증전 사이토카인, 예컨대, TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 생산하고 αvβ3 인테그린 발현을 상향조절하는 골수 세포를 자극시킨다. RANKL 신호전달과 함께, 파골세포 전구체 세포는 융합하여 다핵 파골세포를 형성한다(도 29).
실시예 22: Siglec-15는 인간 CD14 + 단핵구에서 α γ β 3 인테그린 발현을 유도한다.
물질 및 방법
인간 CD14+ 단핵구를 자성 비드 음성 선택 키트(밀테니이 바이오테크)를 통해서 인간 PBMC로부터 단리시키고, 5㎍/㎖의 S15 Fc 융합 단백질로 6일 동안 처리하였다. 6일 후, S15 Fc 처리된 골수 세포를 수거하고, 항-αγβ3 인테그린(클론 23C6)으로 염색하였다.
결과
아이소타입 대조군 항체 염색 및 또한 0일에 S15 Fc 처리 전 세포의 염색에 비해서, S15 Fc 처리 골수 세포에서 αγβ3 인테그린 발현이 상향조절되었다(도 30A 및 도 30B).
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 개시된 발명이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 간행물 및 그것이 인용하는 문헌은 참고로 구체적으로 포함된다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식할 것이거나 또는 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NextCure, Inc. Liu, Linda Flies, Dallas B Langermann, Solomon <120> Antibodies for Siglec-15 and Methods of Use Thereof <130> 064467.003US <140> 16/334,409 <141> 2019-03-19 <150> 62/397,794 <151> 2016-09-21 <150> 62/451,271 <151> 2017-01-27 <150> 62/500,578 <151> 2017-05-03 <150> PCT/US17/52714 <151> 2017-09-21 <160> 374 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu 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tacggttttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 92 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 92 caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactattatg taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggaaag attggtcctg aaagtgttag tatttattac 180 agtgagaagt tcaaggccaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagttattac 300 tacgggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 93 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 93 gaagtgcagc tgttggagac tggaggaggc ttggtgcaac cgggggggtc acggggactc 60 tcttgtgaag gctcagggtt cacttttagt ggcttctgga tgagctgggt tcgacagaca 120 cctgggaaga ccctggagtg gattggagac attaattctg atggcagtgc aataaactac 180 gcaccatcca taaaggatcg attcactatc ttcagagaca atgacaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acaatgtgcg atcggaggac acagccacgt atttctgtgt gagatatgat 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gagatatgat 300 gattacgggt acttcgatgt ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 96 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 96 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 97 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile Pro Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 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30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr 65 70 <210> 342 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 342 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 1 5 10 15 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 35 40 45 <210> 343 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 343 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 1 5 10 15 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 35 40 45 <210> 344 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 344 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 345 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 345 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 346 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 346 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 347 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 347 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Val Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 348 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 348 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Gln Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 349 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 349 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Val Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 <210> 350 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 350 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 1 5 10 15 Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 20 25 30 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 35 40 45 <210> 351 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 351 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 1 5 10 15 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 20 25 30 Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 35 40 45 <210> 352 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 352 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Ile Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Cys Gly Ser Asp Thr Met His Tyr 50 55 60 <210> 353 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 353 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Met His Tyr 50 55 60 <210> 354 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 354 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Thr His Tyr 50 55 60 <210> 355 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 355 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Thr His Tyr 50 55 60 <210> 356 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 356 Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser 1 5 10 15 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr 35 40 45 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 50 55 60 <210> 357 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 357 Ala Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr 1 5 10 15 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Trp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr 35 40 45 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 50 55 60 <210> 358 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 358 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Ser Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 50 55 <210> 359 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 359 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 50 55 <210> 360 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 360 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 50 55 <210> 361 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 361 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 Gln Gln Tyr Trp Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys 50 <210> 362 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 362 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 Gln Gln Tyr Trp Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 35 40 45 Glu Ile Lys 50 <210> 363 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 363 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 Gln Gln Tyr Trp Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 35 40 45 Glu Ile Lys 50 <210> 364 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 364 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Val <210> 365 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 365 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Val <210> 366 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 366 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly <210> 367 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 367 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 20 25 30 Met Asn Ser Leu Gln Thr Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 45 <210> 368 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 368 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 45 <210> 369 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 369 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 45 <210> 370 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 370 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 45 <210> 371 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 371 Leu Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 45 <210> 372 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 372 His Pro Tyr Asp Asp Tyr Ser Gly Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 20 25 <210> 373 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 373 His Pro Tyr Asp Asp Tyr Ser Gly Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 20 25 <210> 374 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 374 Asp Ile Tyr Ser Gly Ser Asp Thr Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly

Claims (59)

  1. 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 CDR은 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드, 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체의 3개의 경쇄 CDR, 및
    서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드, 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체의 3개의 중쇄 CDR을 포함하되,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Siglec(Sialic acid-binding Ig-like lectin)-15에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 및 제2항, 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (I) 세포(특히 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나;
    (II) 내생 농도로 세포(특히 살아있는 세포)의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나;
    (III) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하고, 그리고 Siglec-15(서열번호 1 또는 서열번호 2)와, Neu5Acα2-6GalNAcα, LRRC4C, Siglec-15-반대-수용체(S15-CR) 또는 이들의 조합물 간의 결합을 조정하거나;
    (IV) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하고, 그리고 TGF-β 분비를 감소시키거나, 예방하거나 또는 저해하거나;
    (V) 살아있는 세포의 표면 상에 배열된 Siglec-15에 결합하거나; 또는
    (IV) 이들의 조합인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대식세포 또는 수지상 세포인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역(Fc)으로부터의 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 도메인은 인간 불변 도메인인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 불변 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG 불변 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 도메인인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능하게 표지되거나 또는 접합된 독소, 약물, 수용체, 효소, 수용체 리간드를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 단일 쇄 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 감소된 Fc 수용체(FcR) 결합 활성도를 나타내거나 또는 결합 활성도를 나타내지 않도록 변형된, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 향상된 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC) 활성도를 나타내도록 변형된, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 약제학적 조성물로서,
    제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 리간드에 대한 Siglec-15의 결합을 감소시키거나 예방하고/하거나 Siglec-15-매개된 신호 전달을 감소시키거나 예방하는, 상기 항체 또는 이의 결합 단편, 및
    생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 리간드는 시알릴화된(sialylated) 당단백질, 류신-풍부 반복부-함유 단백질 4C(LRRC4C), Siglec-15 반대-수용체, 또는 이들의 조합물인, 약제학적 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 리간드는 종양 세포의 표면 상에서 발현되는, 약제학적 조성물.
  17. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 대상체는 암 또는 감염성 질환을 갖는, 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 대상체는 Siglec-15의 리간드를 발현 또는 과발현하는 세포를 포함하는 암을 갖는, 치료 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 반응을 증가시키거나, 종양 성장을 지연시키거나 예방하거나, 종양-매개된 면역 억제를 저해하거나, 종양을 제거하거나, 활성도를 변경하도록 종양-연관된 대식세포(TAM)의 활성도를 고갈시키거나 차단하거나, TAM-매개된 면역 억제를 감소시키거나, T 세포 억제를 감소시키거나 반전시키거나, 또는 이들의 조합인, 치료 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 Siglec-15를 발현하는 대식세포를 포함하는, 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 대상체에게 유효량으로 투여되어 상기 대식 세포에 의한 TGF-β의 발현 및/또는 분비를 감소시키는, 치료 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 치료 방법.
  24. 질환, 장애 또는 감염의 검출 또는 진단 방법으로서, (a) 제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계, 및 (b) 상기 Siglec-15의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 대조군 수준과 비교하여 Siglec-15의 상기 검정된 수준의 증가는 상기 질환, 장애 또는 감염을 나타내는, 질환, 장애 또는 감염의 검출 또는 진단 방법.
  25. 질환, 장애 또는 감염의 진행을 모니터링하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 제1 시점 및 추후 시점에서 수득된 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 상기 제1 시점 및 상기 추후 시점에서 상기 대상체의 상기 세포 또는 상기 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 상기 제1 시점과 비교된 상기 추후 시점에서의 Siglec-15의 상기 검정된 수준의 증가는 질환, 장애 또는 감염의 진행을 나타내는, 질환, 장애 또는 감염의 진행을 모니터링하는 방법.
  26. 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법으로서, (a) 제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용한 상기 치료 전 및 후에 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 Siglec-15의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 시간에 걸쳐서 Siglec-15의 수준을 비교하는 단계를 포함하되, 이에 의해서 치료 전 Siglec-15의 수준과 비교된 치료 후 Siglec-15의 검정된 수준의 감소는 상기 치료에 대한 선호되는 반응을 나타내는, 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법.
  27. T 세포 억제 감소를 필요로 하는 대상체에서 T 세포 억제를 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, T 세포 억제를 감소시키는 방법.
  28. T 세포에서의 사이토카인 생산의 증가를 필요로 하는 대상체에서, T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 사이토카인은 IFNγ, TNF-α, 또는 이들의 조합물이거나; 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD+ T 세포, 또는 이들의 조합물이거나; 또는 이들의 조합인, T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시키는 방법.
  30. 골 성장의 증가 또는 골 재흡수의 감소를 필요로 하는 대상체에서 골 성장을 증가시키거나 또는 골 재흡수를 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 골 성장의 증가 또는 골 재흡수의 감소를 필요로 하는 대상체에서 골 성장을 증가시키거나 또는 골 재흡수를 감소시키는 방법.
  31. 파골세포 분화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 파골세포 분화를 감소시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 파골세포 분화를 감소시키는 방법.
  32. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이되, 상기 항체는 리간드에 대한 Siglec-15의 결합을 증가시키고/증가시키거나 Siglec-15-매개된 신호 전달을 증가시키거나 향상시키는, 상기 항체 또는 이의 결합 단편, 및
    생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 면역 반응의 감소, 염증의 감소, 염증성 반응의 감소, 자가면역 질환 또는 장애의 치료, 이식편 또는 이식 거부의 감소 또는 이식편대숙주병(GVHD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 감소시키거나, 염증을 감소시키거나, 염증성 반응을 감소시키거나, 자가면역 질환 또는 장애를 치료하거나, 이식편 또는 이식 거부를 감소시키거나, 또는 이식편대숙주병(GVHD)을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제32항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. Siglec-15 폴리펩타이드또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 제1 융합 파트너 및 제2 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제2 융합 파트너는 Fc 도메인인, 융합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1로부터 유래된, 융합 단백질.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 파트너 및 제2 융합 파트너는 링커에 의해서 연결된, 융합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 상기 링커는 힌지 도메인 또는 이의 단편인, 융합 단백질.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Siglec-15 폴리펩타이드는 Siglec-15 세포외 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Siglec-15 폴리펩타이드는 상기 Siglec-15 세포외 도메인 또는 이의 단편으로 이루어진, 융합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 상기 단편은 Siglec-15의 상기 IgV 도메인, IgC 또는 이들의 조합물을 포함하는, 융합 단백질.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 더 포함하는, 융합 단백질.
  43. 서열번호 193 또는 194와 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 포함하는, 융합 단백질.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  45. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제44항의 약제학적 조성물을 투여하여 면역 반응을 촉진시키는, 치료 방법.
  46. 인간화된 항-SIGLEC-15 항체로서, 인간화된 상기 항체는 클론 5G12 또는 1H3으로부터 유래된, 인간화된 항-SIGLEC-15 항체.
  47. 서열번호 195, 197, 199, 201 또는 209의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 경쇄를 갖는, 인간화된 항-SIGLEC-15 항체.
  48. 서열번호 203, 206 또는 207의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄를 갖는, 인간화된 항-SIGLEC-15 항체.
  49. 서열번호 195, 197, 199, 201 또는 209의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 경쇄 및 서열번호 203, 206 및 207의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄를 갖는, 인간화된 항-SIGLEC-15 항체.
  50. 서열번호 209, 195, 207, 199 또는 201의 경쇄 CDR 및 서열번호 203, 206 또는 207의 중쇄 CDR 및 이들의 조합물을 갖는 항체.
  51. 서열번호 209, 210 또는 211에 따른 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체.
  52. 서열번호 212, 213, 215 또는 216에 따른 중쇄 아미노 서열을 갖는 항체.
  53. 서열번호 209, 210 또는 211에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 212, 213, 215 또는 216에 따른 중쇄 아미노 서열을 갖는 항체.
  54. 파골세포형성(osteoclastogenesis)의 저해를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제13항 및 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 항-Siglec 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 파골세포형성을 저해하는 방법.
  55. 파골세포형성을 저해하는 방법으로서, 파골세포형성의 저해를 필요로 하는 대상체에게 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 유효량의 항-Siglec 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 226, 227 및 228로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 220, 221, 223 및 225로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 파골세포형성을 저해하는 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료제 또는 세포독성제를 포함하는, 파골세포형성을 저해하는 방법.
  57. Siglec-15에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성적으로 또는 유도적으로 발현하는 세포로서, 상기 세포는 서열번호 120 내지 132 중 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 133 내지 145 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 핵산들을 포함하는, 세포.
  58. Siglec-15에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성적으로 또는 유도적으로 발현하는 세포로서, 상기 세포는 제1항 내지 제13항 및 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 핵산들을 포함하는, 세포.
  59. 제1항 내지 제13항 및 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 치료제 또는 세포독성제를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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