CN112979761B - 一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向Siglec‑15的噬菌体多肽及其应用，属于生物技术领域。本发明通过噬菌体展示技术获得特异性靶向Siglec‑15的噬菌体多肽，所述多肽与Siglec‑15具有较高的亲和性和特异性。本发明所述的靶向Siglec‑15的噬菌体多肽可广泛应用于生物医学的各个领域，如生物分析检测、肿瘤成像、药物靶向治疗记忆肿瘤细胞的捕获和释放等领域，同时为临床筛选适合用于Siglec‑15靶向治疗的患者提供了前提。

Description

一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽及其应用。

背景技术

癌症(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类，而实体瘤是其常见形式。实体瘤细胞在肿瘤微环境为逃避免疫攻击形成了多种机制，免疫系统的激活如肿瘤特异T细胞的激活不一定就能杀灭肿瘤，最常见的是PD-1/PD-L1机制。所以靶向肿瘤微环境中肿瘤诱导的免疫逃逸是有效杀死肿瘤的关键。阻断PD-L1/PD-1相互作用被认为是减少肿瘤免疫逃逸的关键。最近研究发现，还存在另一种重要的免疫逃逸机制-唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15(Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin15，siglec-15)，决定着不表达PD-L1的肿瘤的生死命运。

通过在线数据库分析发现，siglec-15在肿瘤细胞的表达比正常细胞高，并和癌症预后紧密相关。正常情况下Siglec-15只出现在一些髓系细胞，在肿瘤细胞和肿瘤浸润髓系细胞广泛上调。利用基因组T细胞活性芯片，发现Siglec-15是主要的免疫抑制物，Siglec-15和PD-L1的表达是相互排斥的。这种特征和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的诱导、γ干扰素(IFN-γ)的下调有关。不管是体外还是体内Siglec-15都抑制抗原特定性T细胞的反应，Siglec-15的遗传去除或者抗体阻断增强了肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，并抑制小鼠模型的肿瘤生长。Siglec-15还是关键的预后生物标志物，在肿瘤中发挥免疫调节作用。例如：肺癌病人Siglec-15表达增加则CD20阳性B细胞和星状细胞显著减少、细胞因子实时转录增加，存活时间、无进展存活期显著减少(Li B,ZhangB,WangX,Zetal.Expressionsignature,prognosisvalue,and immune characteristics of Siglec-15identified by pan-cancer analysis.Oncoimmunology.2020Aug 28；9(1):1807291)。非小细胞癌的研究发现腺癌的Siglec-15的表达高于鳞癌，S-15的表达和基质中CD8阳性T细胞密度正相关，而鳞癌的PD-L1的表达高于腺癌。

Siglec-15在遗传和表观遗传水平被调控。Siglec-15糖基化稳定了溶酶体依赖，并促进Siglec-15向细胞膜转运。通过微芯片的研究发现Siglec-15和唾液酸化的多糖结合，而不和唾液酸化的Tn抗原结合或其它相关抗原序列结合。肿瘤相关的多糖(tumor-associated carbohydrates，TACA)通过白细胞上的受体能够抑制抗肿瘤的免疫反应，髓系细胞、自然杀伤细胞和T细胞通过Siglec受体抑制抗肿瘤活性。其它受体如selectins也和肿瘤进展相关。多糖和lectin的相互作用是癌症免疫治疗的另一重要靶点。在肾透明细胞癌中，长非编码RNA LINC00973正调节miR-7109，而miR-710直接作用于Siglec-15，起到癌症免疫抑制作用。LINC00973-miR-7109-Siglec-15在免疫逃逸中起重要作用，可用于癌症的治疗、诊断和预后研究(Liu Y,LiX,ZhangC,et al.LINC00973 is involved in cancerimmune suppression through positive regulation of Siglec-15in clear-cellrenal cell carcinoma.Cancer Sci.2020Aug 11；111(10):3693–704)。

噬菌体展示技术(phage display technology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集，得到可结合特性目标的噬菌体。

Siglec-15单克隆抗体已经用于肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等15种癌症的临床试验，发现对PD-1无效或耐药的患者可能出现肿瘤缩小或完全消失。Siglec-15单克隆抗体的治疗效果和癌细胞上Siglec-15的表达密切相关，而传统的病理活检和免疫组织化学分析具有创伤性。受限于肿瘤的非均一性，活检组织并不一定能代表癌组织整体状况。特别是在治疗中，受体的表达还会随时间而变化。

综上所述，亟需建立一种非侵入性的显像方法用于癌细胞上Siglec-15的实时监测，为癌症患者提供适时治疗。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽及其应用。本发明通过噬菌体展示技术获得特异性结合Siglec-15的多肽，利用该多肽可以制备非侵入性显示癌细胞上Siglec-15表达的实时探针，为临床筛选适合用于Siglec-15靶向治疗的患者提供了前提。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽，所述的噬菌体多肽为噬菌体展示肽。

具体地，所述的噬菌体展示肽中的多肽为环状多肽。

所述的噬菌体展示肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的序列。

进一步具体地，所述的氨基酸序列的第1个氨基酸与第9个氨基酸成环。

进一步具体地，所述的噬菌体展示肽的编码基因序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了上述噬菌体多肽的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)将Siglec-15包被在酶标板上，用5％BSA封闭酶标板，将噬菌体展示随机环九肽库加入包被和封闭后的酶标板中进行亲合筛选，筛选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，共5轮筛选；

(2)经5轮筛选后，挑取阳性克隆进行扩增，质粒提取，测序，得到上述靶向Siglec-15的噬菌体多肽；

(3)采用ELISA方法检测步骤(2)得到的噬菌体多肽与Siglec-15结合的亲和性和特异性。

又一方面，本发明提供了一种检测或鉴定Siglec-15的产品，所述的产品包括上述噬菌体多肽。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、试剂盒、探针、药物或医疗装置。

又一方面，本发明提供了上述噬菌体多肽在制备检测或鉴定Siglec-15产品中的应用。

又一方面，本发明提供了一种检测或鉴定癌症的产品，所述的产品包括上述噬菌体多肽。

具体地，所述的癌症为Siglec-15表达阳性癌症。

进一步具体地，所述的癌症包括但不限于肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质瘤、骨肉瘤、神经内分泌瘤、鼻咽癌、胃癌、胆管癌。

又一方面，本发明提供了一种上述噬菌体多肽在制备检测或鉴定癌症产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明提供的靶向Siglec-15的噬菌体多肽与Siglec-15具有较高的亲和性和特异性，与传统的单克隆相比，从噬菌体展示随机多肽库中筛选与靶标结合的噬菌体展示肽具有操作简单、易制备、便于纯化等优点。

(2)本发明所述的靶向Siglec-15的噬菌体多肽可广泛应用于生物医学的各个领域，如生物分析检测、肿瘤成像、药物靶向治疗记忆肿瘤细胞的捕获和释放等领域。

附图说明

图1为靶向Siglec-15的噬菌体多肽亲和力检测结果图。

图2为靶向Siglec-15的噬菌体多肽特异性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1靶向Siglec-15的噬菌体多肽

本发明所述的靶向Siglec-15的噬菌体多肽为噬菌体展示肽，所述的噬菌体展示肽中的多肽为环状多肽，所述的噬菌体展示肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的序列。所述的氨基酸序列的第1个氨基酸与第9个氨基酸成环。

所述的噬菌体展示肽的编码基因序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

实施例2靶向Siglec-15的噬菌体多肽制备

1.试剂

蛋白胨(OXOID)、酵母提取物(OXOID)、琼脂粉(Aladdin)、IPTG(Aladdin)、Xgal(Aladdin)、PEG8000(FLUKA)、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(GE)，噬菌体展示环九肽库(NEB)。

2.试剂配方：

2.1.PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，趁热混匀，室温储藏；

2.2.IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺(DMF)中，-20℃避光保存；

2.3.四环素贮液：20g/mL，溶于1:1乙醇水溶液中，-20℃避光贮存，使用前摇匀；

2.4.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，高压灭菌，室温储藏；

2.5.LB/IPTG/Xgal平板：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15g/L琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板，平板4℃避光保存；

2.6.LB-Tet平板：LB液体培养基加1.5g/L琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入0.1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光保存；

2.7.封闭液：0.1M NaHCO₃(pH8.6)中溶解5％BSA，过滤除菌，4℃保存。

3.靶向Siglec-15的噬菌体多肽筛选

按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过5轮筛选，具体操作如下：

3.1.将Siglec-15稀释到2μg/mL，加入到6孔板，1000μL/孔，4℃包被过夜；

3.2.取少量大肠杆菌ER2738涂在LB-Tet平板上，37℃培养过夜；

3.3.将Siglec-15包被的6孔板用含0.1％Tween-20的TBST洗涤6次，备用；

3.4.将Siglec-15包被的6孔板加入1000μL(1×10¹¹pfu/mL)的噬菌体，室温轻微震荡1h；

3.5.用含0.1％Tween-20的PBST洗涤6次，3min/次，甩空6孔板，每孔加入洗脱缓冲液(0.2M Gly，pH调至2.2)1000μL室温温和震荡15min，在离心管中加入1M Tris-HCL(pH调至9.1)中和，按150μL/孔加入，将洗脱液吸入到离心管中即为洗脱产物，4℃放置保存；

3.6.取少量洗脱液测定其滴度。

3.7.挑取ER2738单菌落到3mL液体LB培养基中37℃震荡培养4-5h；

3.8.取20mL液体LB培养基加入100mL三角瓶中，加入20μL步骤3.7的ER2738菌液，37℃震荡培养至OD600为0.01-0.05；

3.9.将剩余的洗脱液全部加入，37℃摇床上培养4-4.5h；

3.10.将扩增的噬菌体移入50mL的离心管中，4℃，12000g离心10min，取上清，重复离心一次；

3.11.取上清的80％放入离心管中，加入1/6体积的20％PEG-8000/2.5M NaCl，混匀，4℃静置过夜；

3.12. 4℃，12000g离心15min，去上清，重复一次；

3.13.将沉淀溶于400μL PBS溶解沉淀物，用于下一轮的筛选；

3.14.重复3.1-3.13步骤4次后，进行噬菌体克隆筛选。

4.噬菌体克隆的筛选及其展示多肽序列的测定：

4.1.将培养过夜的大肠杆菌ER2738以1:100用LB液体培养基稀释，并以每管5mL分装在30个试管中，37℃振荡培养1h；

4.2.将第五轮洗脱物稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，5个稀释度，进行LB/IPTG/X-gal平板滴定步骤；

4.3.从蓝斑数小于100个的平板上随机挑取30个蓝斑，分别置于5mL步骤4.1摇的大肠杆菌中，37℃振荡培养4.5h；

4.4. 14000rpm离心1min，将上清的80％转入新的离心管中，4℃保存；

4.5.取4.4上清500μL，加入200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置20min；

4.6. 4℃，14000rpm离心10min，除尽上清，加入100μL碘化钠(10mM Tris-HCLpH8.0，1mM EDTA，4M NaI)，避光，振荡混匀后，加入250μL乙醇，室温放置20min；

4.7. 4℃，14000rpm离心10min，弃上清，加入0.5mL 70％冷乙醇(4℃)；

4.8. 4℃，14000rpm离心10min，通风干燥；

4.9.加入50μL灭菌水溶解，测序。

将上述30个克隆的质粒噬菌体DNA送至测序公司进行测序，测序的引物为5＇-GTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3＇。利用生物学软件对测序结果进行分析，找出噬菌体中插入的序列，插入的序列有6种，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示，该6种核苷酸对应的多肽序列，依次如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示。

实施例3亲和性和特异性测定

1.方法原理

亲和性：采用酶联免疫分析法。将不同浓度的Siglec-15吸附于96孔酶标板上，然后分别加入噬菌体展示多肽，若噬菌体展示肽和Siglec-15具有较高的亲和性，随着Siglec-15浓度增加，与其结合的噬菌体展示肽也相应增多，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体后，显色强OD_450nm值高。

特异性：采用酶联免疫分析法。将特定浓度的Siglec-15、BSA吸附于96孔酶标板上，然后分别加入6种噬菌体展示多肽，若噬菌体展示肽和Siglec-15具有较高的亲和性，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体后，显色强OD_450nm值高，反之与噬菌体展示肽亲和性较低，噬菌体展示肽具有较高的特异性。

2.噬菌体展示肽的工作浓度

噬菌体展示肽的工作浓度的确定采用方阵滴定法，选择OD_450nm值为1-2时的浓度。经实验，噬菌体1×10⁷pfu/mL为最适工作浓度。

3.ELISA法：

3.1.包被：将Siglec-15用NaHCO₃稀释到1μg/mL，3μg/mL，5μg/mL，6μg/mL和7μg/mL，分别加入酶标板，每种浓度2个孔，每孔100μL，并且以5％BSA包被的孔为阴性对照，4℃孵育过夜；

3.2.洗板：0.1％Tween-20的PBS洗涤6次，吸水纸拍干；

3.3.封闭：每孔加入300μL 5％BSA，37℃孵育1h；

3.4.洗板：同步骤3.2；

3.5.每孔分别加入100μL 1×10⁷pfu/mL的噬菌体展示多肽，室温震荡1h；

3.6.洗板：同步骤3.2；

3.7.加入酶标二抗：每孔加入100μL经过稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温震荡1h；

3.8.洗板：同步骤3.2；

3.9.显色：每孔加入100μL现配的TMB显色液，37℃温箱孵育15min；

3.10.终止：每孔加入50μL 2mol/L的H₂SO₄溶液；

3.11.吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长的各孔吸光值。

4.亲和性

将上述筛选到的6种噬菌体展示肽(Lc91、Lc92、Lc93、Lc94、Lc95、Lc96)进行扩增纯化后，将Siglec-15分别稀释到1μg/mL，3μg/mL，5μg/mL，6μg/mL和7μg/mL，然后分别包被酶标板，同时将用5％(50mg/mL)的BSA包被的酶标板作为阴性对照(即Siglec-15浓度为0)，洗板后，然后分别加入6种筛选到的噬菌体展示肽，最后，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体显色，最终在酶标仪波长为450nm处读数，结果如图1，随着Siglec-15浓度的增加，OD_450nm的值也在增加，这表明6种噬菌体展示肽与Siglec-15具有较高的亲和性，同时从图1还可看出在BSA的浓度为50mg/mL(5％)即Siglec-15的浓度为0时，OD_450nm的吸光值较低，这表明6种噬菌体展示肽与BSA的亲和性较低。

5.特异性

将Siglec-15稀释到3μg/mL然后分别包被酶标板，同时将用5％(50μg/mL)的BSA包被的酶标板作为阴性对照(即Siglec-15浓度为0)，然后分别加入筛选到的6种噬菌体展示肽(Lc91、Lc92、Lc93、Lc94、Lc95、Lc96)，最后加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体显色，在酶标仪波长为450nm处读数如图2所示。包被BSA酶标板OD_450nm值小于0.050，而包被Siglec-15的酶标板OD_450nm值大于0.500，明显高于阴性对照，这表明6种噬菌体展示肽与BSA没有交叉反应，特异性较好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 江苏元本生物科技有限公司

<120> 一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽

<130> 20210220

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Cys Ala Pro Asn Asn Arg Leu Gln Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Cys Asn Gln Trp Leu Thr Gln Asn Cys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Cys Thr Ser Tyr Val Pro Arg Met Cys

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Cys Thr Ser Tyr Leu Pro Arg Met Cys

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Cys Ser Gly Ala Ala Ile Ser Val Cys

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Cys Asp Gln Arg Asp Asp Arg Phe Cys

1 5

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

tgtgctccga ataatcgtct tcagtgc 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

tgtaatcagt ggttgacgca gaattgc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

tgtacttctt atgtgccgcg gatgtgc 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tgtacttctt atgtgccgcg gatgtgc 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tgttcgggtg ctgcgatttc tgtgtgc 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tgtgatcagc gggatgatag gttttgc 27

Claims (8)

1.一种靶向Siglec-15的噬菌体多肽，其特征在于：

所述的多肽为噬菌体展示肽；

所述的噬菌体展示肽中的多肽为环状多肽；

所述的噬菌体展示肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列；

所述的氨基酸序列的第1个氨基酸与第9个氨基酸成环。

2.根据权利要求1所述的噬菌体多肽，其特征在于：所述的噬菌体展示肽的编码基因序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

3.一种检测或鉴定Siglec-15的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1-2任一项所述的噬菌体多肽。

4.权利要求1-2任一项所述的噬菌体多肽在制备检测或鉴定Siglec-15产品中的应用。

5.一种检测或鉴定癌症的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1-2任一项所述的噬菌体多肽。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述的癌症为Siglec-15表达阳性癌症。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述的癌症包括肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质瘤、骨肉瘤、神经内分泌瘤、鼻咽癌、胃癌、胆管癌。

8.权利要求1-2任一项所述的噬菌体多肽在制备检测或鉴定癌症产品中的应用。

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