CN104321430A - 新颖的抗-siglec-15抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的药物组合物，其靶向在破骨细胞中强烈表达的基因所编码的蛋白。具体地，提供了一种含有抗体的药物组合物，所述抗体特异性地识别人Siglec-15且展示抑制破骨细胞形成的活性等。

Description

新颖的抗-SIGLEC-15抗体
技术领域
本发明涉及可用作异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂的物质以及治疗和/或预防异常骨代谢的方法。
背景技术
已知骨骼为动态性器官，其通过重复形成和吸收，进行持续重建，从而改变其本身的形态并维持血钙水平。健康的骨骼维持由成骨细胞进行的骨形成和由破骨细胞进行的骨吸收之间的平衡关系，从而骨量保持恒定。然而，当骨形成和骨吸收之间的平衡被破坏时，则发生诸如骨质疏松症等异常骨代谢(参见，例如，非专利文献1和2)。
作为调节骨代谢的因子，报道了很多全身性激素以及局部性细胞因子，且这些因子互相合作以形成和维持骨(参见，例如，非专利文献1和3)。作为因衰老导致的骨组织的变化，骨质疏松症的发病众所周知，但是其发病机理包含各种因素，如性激素的分泌降低以及该激素受体异常、骨局部细胞因子表达变动、老化基因的表达、破骨细胞或成骨细胞的分化衰退或功能不全，因此，难以将它理解为单纯的年龄相关的生理现象。原发性骨质疏松症主要分为由雌激素分泌降低导致的绝经后骨质疏松症和由老龄化导致的老年性骨质疏松症，但为了阐明其发病机理和开发针对它的治疗剂，在骨形成和骨吸收的调节机制方面的基础研究的进展很重要。
破骨细胞是源自造血干细胞的多核细胞，通过在破骨细胞粘附的骨表面上释放氯离子和氢离子，破骨细胞使骨表面与破骨细胞之间的间隙成为酸性，并且还分泌作为酸性蛋白酶的组织蛋白酶K等(参见，例如，非专利文献4)。这引发磷酸钙的降解、酸性蛋白酶的活化以及骨基质蛋白的降解，导致骨吸收。
业已发现破骨细胞前体细胞通过存在于骨表面上的成骨细胞/基质细胞的细胞膜上表达的RNAKL（NF-κB配体的受体活化因子）的刺激，分化为破骨细胞(参见，例如，非专利文献5和6)。已发现RNAKL是成骨细胞/基质细胞所产生的膜蛋白，其表达受骨吸收因子的调节，RNAKL诱导破骨细胞前体细胞向成熟的多核破骨细胞的分化等(参见，例如，非专利文献5和7)。此外，已经发现敲除RNAKL的小鼠发生（develop）骨硬化病样疾病，并因此，已经证明RNAKL是生理性的破骨细胞分化诱导因子(参见，例如，非专利文献8)。
使用二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM（选择性雌激素受体调节剂）、依普黄酮、维生素K2（四烯甲萘醌）、PTH和钙制剂等作为治疗骨代谢疾病或缩短治疗时间的药物。但是，这些药物不会总是表现出令人满意的治疗效果，已经需要开发具有更有效的治疗效果的药物。
免疫细胞的细胞膜被多种聚糖（诸如唾液酸化的聚糖）高度覆盖，所述聚糖被各种聚糖结合蛋白识别。结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素（在下文中称为“Siglec”）为识别并结合唾液酸化的聚糖的I型膜蛋白家族。许多Siglec在免疫细胞的细胞膜上表达，并识别类似地存在于免疫细胞的细胞膜上的唾液酸，调节细胞相互作用或细胞功能，并被认为参与免疫应答(参见，例如，非专利文献9)。然而，也有很多尚未阐明其生理功能的Siglec分子。最近报道Siglec-15（结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素15）为属于Siglec的分子(参见，例如，非专利文献10)，其与被称为CD33L3（CD33分子样3）的分子相同。该分子从鱼类到人类是进化高度保守的，业已发现在人脾和淋巴结的树突细胞和/或巨噬细胞中强表达。此外，使用唾液酸探针的结合测试的结果是：已经发现人Siglec-15结合Neu5Acα2-6GalNAc，且小鼠Siglec-15进一步结合Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc等(参见，例如，非专利文献10)。直至最近，还未揭示Siglec-15的生理作用，但业已报道，随着破骨细胞的分化和成熟，Siglec-15的表达增加，通过用RNA干扰使Siglec-15的表达下降，可以抑制破骨细胞的分化(参见，例如，PTL 1)。此外，在PTL 2 (2009年4月16日公开)和PTL 3 (2010年10月14日公开)中已经首次公开了抗-Siglec-15抗体对破骨细胞分化的作用。此外，在PTL 4中也已经公开了抑制破骨细胞分化的抗体，但是，对具有更有效的作用的抗体的寻找仍在继续。
现有技术文件
专利文献
专利文献1: WO 07/093042
专利文献2: WO 09/48072
专利文献3: WO 10/117011
专利文献4: WO 11/041894
非专利文献
非专利文献1: Endocrinological Review, (1992) 13, 第66-80页
非专利文献2: Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996)第87-102页
非专利文献3: Endocrinological Review, (1996) 17, 第308-332页
非专利文献4: American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324
非专利文献5: Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, 第3597-3602页
非专利文献6: Cell, (1998) 93, 第165-176页
非专利文献7: Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222
非专利文献8: Nature, (1999) 397, 第315-323页
非专利文献9: Nature Reviews Immunology, (2007) 7, 第255-266页
非专利文献10: Glycobiology, (2007) 17, 第838-846页。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供：在各种形式的异常骨代谢（可见为骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌的骨转移等）中特异表达的基因；抑制破骨细胞的分化和成熟及其活性的物质；以及异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂。
解决问题的手段
为了找到对异常骨代谢具有治疗和/或预防效果的物质，本发明的发明人以阐明破骨细胞的分化、成熟和活化机制为目标进行了研究。结果本发明的发明人发现随着破骨细胞的分化和成熟，Siglec-15基因的表达增加，还发现特异性地结合Siglec-15的抗体可以抑制破骨细胞的分化。此外，本发明的发明人人源化了已经得到的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗体从而完成了本发明。
具体地，本发明包括下述发明。
(1)一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且所述CDRH1包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述CDRH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述CDRH3包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或在其中包含1-3个氨基酸取代的氨基酸序列；且
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且所述CDRL1包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述CDRL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述CDRL3包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列。
(2)一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且所述CDRH1包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述CDRH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述CDRH3包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列；且
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且所述CDRL1包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述CDRL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述CDRL3包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列。
(3)根据(1)或(2)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸残基1-121的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的氨基酸残基1-109的轻链可变区序列。
(4)根据(1)至(3)所述的抗体的抗原结合片段，所述片段选自：Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
(5)根据(1)至(3)所述的抗体，其特征在于是scFv。
(6)根据(1)至(4)中的任一项所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗体是嵌合抗体。
(7)根据(6)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 8表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(8)根据(1)、(2)或(4)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗体是人源化的。
(9)根据(6)或(8)所述的抗体，其中所述重链具有人免疫球蛋白G2重链的恒定区，且所述轻链具有人免疫球蛋白κ轻链的恒定区。
(10)一种抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞性骨吸收的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：
(a)选自下述氨基酸序列的重链可变区序列：
a1)包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a2)包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a3)包含由SEQ ID NO: 16表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a4)包含由SEQ ID NO: 18表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a5)包含由SEQ ID NO: 20表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a6)包含由SEQ ID NO: 22表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a7)包含由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a8)包含由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a9)包含由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a10)包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a11)与选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
a12)与选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；和
a13)在选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b)选自下述氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1)包含由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2)包含由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3)包含由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4)包含由SEQ ID NO: 30表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5)包含由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6)包含由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b7)与选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
b8)与选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；和
b9)在选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
(11)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(12)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(13)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(14)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(15)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(16)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(17)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
(18)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(19)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(20)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(21)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(22)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(23)根据(10)所述的抗体或抗体的功能片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(24)根据(10)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
(25)根据(11)至(24)中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链，所述重链包括从其羧基端末端的一个至几个氨基酸缺失。
(26)一种药物组合物，其特征在于包含至少一种根据(1)至(25)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
(27)根据(26)所述的药物组合物，其特征在于是异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂。
(28)一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的药物组合物，其特征在于包含至少一种根据(1)至(25)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段和至少一个选自下述的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药、可溶性TNF受体、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。
(29)根据(27)或(28)所述的药物组合物，其中所述异常骨代谢选自：骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、假体关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
(30)根据(29)所述的药物组合物，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、或伴随癌的骨转移的骨破坏。
(31)根据(30)所述的药物组合物，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症。
(32)根据(31)所述的药物组合物，其特征在于所述骨质疏松症是绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
(33)一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的方法，其特征在于施用至少一种根据(1)至(25)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段或根据(27)或(28)所述的药物组合物。
(34)一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的方法，其特征在于同时地或接连地施用至少一种根据(1)至(25)所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段或根据(28)所述的药物组合物和至少一个选自下述的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药、可溶性TNF受体、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。
(35)根据(33)或(34)所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、或伴随癌的骨转移的骨破坏。
(36)根据(35)所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症。
(37)根据(36)所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述骨质疏松症是绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
(38)一种多核苷酸，其编码根据(1)至(25)中的任一项所述的抗体。
(39)根据(38)所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 1表示的核苷酸序列的核苷酸1-363的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列的核苷酸1-327的核苷酸序列。
(40)根据(39)所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 7表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 9表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(41)根据(38)所述的多核苷酸，其特征在于包含：
(a)选自下述核苷酸序列的多核苷酸：
a1)包含由SEQ ID NO: 11表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2)包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a3)包含由SEQ ID NO: 15表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a4)包含由SEQ ID NO: 17表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a5)包含由SEQ ID NO: 19表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a6)包含由SEQ ID NO: 21表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a7)包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a8)包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a9)包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a10)包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a11)与选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
a12)与选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；
a13)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在严谨条件下与包含选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸杂交；
a14)一种核苷酸序列，其包括选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列中的一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加；和
(b)选自下述核苷酸序列的多核苷酸：
b1)包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2)包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3)包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4)包含由SEQ ID NO: 28表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5)包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6)包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b7)与选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
b8)与选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；
b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在严谨条件下与包含选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸杂交；和
b10)一种核苷酸序列，其包括在选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列中的一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加。
(42)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(43)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(44)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(45)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(46)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(47)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(48)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
(49)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(50)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(51)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(52)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(53)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(54)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(55)根据(41)所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
(56)一种载体，其包含根据(38)至(55)所述的任一个多核苷酸。
(57)一种转化的宿主细胞，其包含根据(38)至(55)所述的任一个多核苷酸。
(58)一种转化的宿主细胞，其包含根据(56)所述的载体。
(59)一种生产根据(1)至(25)中的任一项所述的抗体的方法，所述方法包括：培养根据(57)或(58)所述的宿主细胞，和从得到的培养产物纯化所述抗体。
发明效果
根据本发明，可以得到异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂，其作用机制是抑制破骨细胞的分化和成熟及其骨吸收活性。
附图说明
[图1]图1显示了大鼠#24A3重链可变区的克隆核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图2]图2显示了大鼠#24A3轻链可变区的克隆核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图3]图3显示了人嵌合#24A3抗体重链的苷酸序列及其氨基酸序列。
[图4]图4显示了人嵌合#24A3抗体轻链的苷酸序列及其氨基酸序列。
[图5]图5显示了h#24A3-H1的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图6]图6显示了h#24A3-H2的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图7]图7显示了h#24A3-H3的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图8]图8显示了h#24A3-H4的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图9]图9显示了h#24A3-H5的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图10]图10显示了h#24A3-H6的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图11]图11显示了h#24A3-L1的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图12]图12显示了h#24A3-L2的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图13]图13显示了h#24A3-L3的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图14]图14显示了h#24A3-L4的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图15]图15显示了大鼠#24A3抗体的各个CDR序列的氨基酸序列。
[图16]图16显示的图描绘了大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体(N=6)对正常人破骨细胞分化的抑制。
[图17]图17显示了h#24A3-H2b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图18]图18显示了h#24A3-H2c的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图19]图19显示了h#24A3-H2d的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图20]图20显示了h#24A3-H2e的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图21]图21显示了h#24A3-L2b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图22]图22显示了h#24A3-L3b的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[图23]图23显示的图描绘了大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体(N=6)对正常人破骨细胞分化的抑制。
[图24]图24是为了确定h#24A3-H2d/L1抗体的热稳定性而得到的热分析图。
[图25]图25是为了确定h#24A3-H2e/L1抗体的热稳定性而得到的热分析图。
[图26]图26是为了确定h#24A3-H2b/L3b抗体的热稳定性而得到的热分析图。
[图27]图27是为了确定h#24A3-H2c/L2b抗体的热稳定性而得到的热分析图。
具体实施方式
本文使用的术语“基因”不仅包括DNA，还包括mRNA、cDNA以及cRNA。
本文使用的术语“多核苷酸”用于与核酸相同的含义，并且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸以及引物。
本文使用的术语“多肽”和“蛋白”无区别使用。
本文使用的术语“RNA级分”是指包含RNA的级分。
本文使用的术语“细胞”包括动物个体内的细胞和培养的细胞。
本文使用的术语“Siglec-15”以与“Siglec-15蛋白”相同的含义使用。
本文使用的术语“破骨细胞形成”以与“破骨细胞分化”或“破骨细胞成熟”相同的含义使用。
本文使用的术语“抗体的抗原结合片段” 以与“抗体的功能片段”相同的含义使用，并表示具有抗原结合活性的抗体的一部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异抗体、线性抗体、从抗体片段形成的多特异性抗体等。该术语也包括Fab’，其为在还原条件下处理F(ab’)2得到的抗体的可变区的单价片段。但是，该术语不限于这些分子，只要所述片段具有与抗原的结合亲和力。此外，这些抗原结合片段不仅包括用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子得到的片段，还包括使用遗传修饰的抗体基因在适当宿主细胞中产生的蛋白。
本文使用的术语“表位”是指特定的抗-Siglec-15抗体结合的Siglec-15的部分肽或部分三级结构。通过诸如免疫测定法等本领域技术人员熟知的方法，可以确定作为Siglec-15的部分肽的上述表位。但是，例如，可以采用以下的方法。制备Siglec-15的各种部分结构。在制备部分结构时，可使用已知的寡肽合成技术。例如，使用本领域技术人员已知的基因重组技术，制备从Siglec-15的C末端或N末端顺次缩短所得到的具有适当的缩短长度的一系列多肽。此后，检测这些多肽的抗体的反应性，并粗略确定识别位点。然后，合成长度更短的肽，并检测与这些肽的反应性，由此可确定表位。此外，通过X-射线晶体结构分析描述邻近抗体的Siglec-15的氨基酸残基，可以确定作为Siglec-15的部分三级结构的表位（特异性的抗-Siglec-15抗体与其结合）。如果第二抗-Siglec-15抗体结合第一抗-Siglec-15抗体所结合的部分肽或部分三级结构，则可以确定第一抗体与第二抗体共享相同的表位。此外，通过证实第二抗-Siglec-15抗体与第一抗-Siglec-15抗体竞争结合Siglec-15（即第二抗体抑制Siglec-15和第一抗体之间的结合），可以确定第一抗体和第二抗体共享相同的表位，即使尚未确定所述表位的具体序列或结构。此外，当第一抗体和第二抗体结合相同的表位，且第一抗体具有诸如抗原中和活性等特殊效应时，可以预期第二抗体具有相同的活性。
已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个互补性决定区(CDR)。互补性决定区也称作超变结构域，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中。它是在它的一级结构中具有特别高可变性的位点，且在每个重和轻多肽链的一级结构中存在3个单独的CDR。在本说明书中，作为抗体的互补性决定区，重链的互补性决定区由来自重链氨基酸序列的氨基端末端的CDRH1、CDRH2和CDRH3表示，且轻链的互补性决定区由来自轻链氨基酸序列的氨基端末端的CDRL1、CDRL2和CDRL3表示。这些位点在三级结构中彼此邻近，决定了抗体结合的抗原的特异性。
本文使用的短语“在严谨条件下进行杂交”是指在可实现鉴定的条件下进行杂交，其中在市售的杂交溶液ExpressHyb杂交溶液（由Clontech Laboratories, Inc.生产）中，在68℃进行杂交，或者使用其上固定有DNA的滤器，在0.7-1.0M NaCl存在下，在68℃进行杂交，然后使用0.1-2X的SSC溶液（1 x SSC溶液由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成）在68℃进行洗涤，或在与其等同的条件下杂交。
在本说明书中在本文使用的短语“一个至几个”和“一个或几个”中的术语“几个”表示2-10个，优选地10个或更少，5个或6个或更少，或2个或3个。
1. Siglec-15
本发明的发明人已经发现Siglec-15基因在巨细胞瘤中特异性表达，还已经发现当单核细胞-衍生的细胞系分化为破骨细胞时，Siglec-15基因的表达水平增加。
要在本发明中使用的Siglec-15直接地从人、非人哺乳动物（例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛或猴）或鸡的单核细胞或骨髓细胞纯化，并然后可以使用，或者从上述细胞的细胞膜级分制备，并然后可以使用。此外，通过体外合成或通过基因工程在宿主细胞内生产，可以得到Siglec-15。具体地，在这样的基因工程生产中，将Siglec-15 cDNA整合进能表达Siglec-15 cDNA的载体中，并在含有转录和翻译所需的酶、底物和能量物质的溶液中合成Siglec-15，或者转化另一种原核或真核宿主细胞以表达Siglec-15，由此可得到该蛋白。
人Siglec-15 cDNA的核苷酸序列已经以登录号NM_213602登记在GenBank中。小鼠Siglec-15 cDNA的核苷酸序列已经以登录号XM_884636登记在GenBank中。此外，Siglec-15有时被称为CD33抗原-样3、CD33分子-样3、CD33-样3或CD33L3，这些都表示相同的分子。
可以如下得到Siglec-15 cDNA：通过例如所谓的PCR方法，其中使用表达Siglec-15 cDNA的cDNA文库作为模板，并使用特异性扩增Siglec-15 cDNA的引物，进行聚合酶链式反应(在下文中称作“PCR”) (Saiki, R. K., 等人, Science, (1988) 239, 487-49)。
顺便一提，具有下述特征的多核苷酸也视作Siglec-15 cDNA：它在严谨条件下与包含编码人或小鼠Siglec-15的核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且编码具有与Siglec-15相当的生物活性的蛋白。此外，具有下述特征的多核苷酸也视作Siglec-15 cDNA：它是从人或小鼠Siglec-15基因座转录的剪接变体，或与其互补序列在严谨条件下杂交，且编码具有与Siglec-15相当的生物活性的蛋白。
此外，具有下述特征的蛋白也视作Siglec-15：它包含这样的氨基酸序列，所述序列包含在人或小鼠Siglec-15的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，或通过从该序列除去信号序列所得到的氨基酸序列，且具有与Siglec-15相当的生物活性。此外，具有下述特征的蛋白也视作Siglec-15：它包含由从人或小鼠Siglec-15基因座转录的剪接变体编码的氨基酸序列，或包含在其中的一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，且具有与Siglec-15相当的生物活性。
2. 异常骨代谢的检测
对来自各种人骨组织的测试样品组中的Siglec-15基因表达水平的分析显示该基因在巨细胞瘤(GCT)中的表达水平显著增加，所述巨细胞瘤是破骨细胞样多核巨大细胞大量出现的骨肿瘤，且其特征是在临床上发现骨溶解性的骨破坏（Bullough等,Atlas of Orthopedic Pathology第2版, 第17.6-17.8页,Lippincott Williams & Wilkins Publishers（1992））。
还发现，当单核细胞-衍生的细胞系分化为破骨细胞时，Siglec-15基因的表达水平增加。
因此，认为Siglec-15与诸如GCT等其中骨吸收增加的人病理学有关。换而言之，通过测量Siglec-15基因和/或Siglec-15在各细胞和/或各组织中的表达水平，能够确定伴随Siglec-15的过表达的异常骨代谢状态。本文使用的术语“异常骨代谢”是指特征在于净骨流失的障碍，其具体例子包括但不限于：骨质疏松症(绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症)、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、假体关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
在本发明中，用于检测Siglec-15基因和/或Siglec-15的表达水平的“测试样品”是指从测试对象得到的下述组织的样品：骨髓、骨、前列腺、精巢、阴茎、膀胱、肾脏、口腔、咽、唇、舌、牙龈、鼻咽、食道、胃、小肠、大肠、结肠、肝脏、胆囊、胰脏、鼻、肺、软组织、皮肤、乳房、子宫、卵巢、脑、甲状腺、淋巴结、肌肉、脂肪组织等，或从测试对象得到的血液、体液、排泄物等，临床样本等，但是，在本发明中，更优选血液或骨髓。
关于已知与破骨细胞分化有关的RANKL，已经生产了敲除的小鼠，并已经分析了当已经丧失RANKL功能时的表型(Young-Yun Kong, 等人, Nature (1999) 397, 第315-323页)。通过以与上述相同的方式生产缺失Siglec-15的敲除的小鼠，可以分析当已经丧失Siglec-15功能时的表型。
3. 抗-Siglec-15抗体的制备
可以如下获得本发明的抗Siglec-15的抗体：根据常规的方法，用Siglec-15或选自Siglec-15的氨基酸序列的任意多肽免疫动物，并采集和纯化体内产生的抗体。用作抗原的Siglec-15的生物物种不限于人，也可以用从诸如小鼠或大鼠等除人以外的动物得到的Siglec-15免疫动物。在这种情况下，通过测试抗体与得到的异源Siglec-15和人Siglec-15的结合之间的交叉反应性，可以选择可适用于人疾病的抗体。
此外，根据已知的方法（例如，Kohler和Milstein, Nature, (1975) 256, 第495-497页；Kennet,R.编,Monoclonal Antibody, 第365-367页, Prenum Press,N.Y.（1980）），通过使生产抗Siglec-15抗体的抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤，可以得到单克隆抗体。这样的方法的一个具体例子描述在WO 09/48072 (2009年4月16日公开)和WO 10/117011 (2010年10月14日公开)。但是，得到单克隆抗体的方法对应于已经充分确定的领域，并且不限于上述具体例子。
顺便一提，要用作抗原的Siglec-15可以通过基因工程得到，其中使宿主细胞生产Siglec-15基因。具体地，生产能够表达Siglec-15基因的载体，将得到的载体引入宿主细胞中以表达该基因，然后纯化表达的Siglec-15。
如此建立的杂交瘤株的例子包括在本说明书中描述的杂交瘤#24A3。此外，在本说明书中，由杂交瘤#24A3生产的抗体被称作“#24A3抗体”或简称“#24A3”。此外，在本说明书中，除了#24A3抗体以外的抗体也以相同方式用它们的抗体名称来表示。含有#24A3抗体的重链可变区的部分片段具有包含序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸残基1-121的氨基酸序列。此外，含有#24A3抗体的轻链可变区序列的部分片段具有包含序列表中SEQ ID NO: 4的氨基酸残基1-109的氨基酸序列。
本发明的抗体不仅包括上述抗Siglec-15的单克隆抗体，而且包括以降低对人类等的异种抗原性为目的而人工修饰得到的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。使用已知的方法，可以制备这些抗体。
作为嵌合抗体，可以例举这样的抗体，其中抗体可变区和恒定区源自不同的物种，例如，其中使小鼠-或大鼠-衍生的抗体可变区与人-衍生的恒定区相连的嵌合抗体(参见Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984))。作为源自大鼠抗-小鼠抗体#24A3的嵌合抗体的一个例子，可以例举这样的抗体，其包含重链和轻链，所述重链具有包含序列表中的SEQ ID NO: 8的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含序列表中的SEQ ID NO: 10的氨基酸残基21-234的氨基酸序列。
作为人源化抗体，可以例举通过只将互补性决定区(CDR)整合到人-衍生的抗体中所得到的抗体(参见Nature (1986) 321, 第522-525页)；以及通过CDR-移植法将框架的氨基酸残基的一部分和CDR序列移植到人抗体中所得到的抗体(WO 90/07861)。
在本发明的抗体中包括从#24A3抗体衍生出的人源化抗体，只要所述人源化抗体具有#24A3的所有6类CDR序列并且具有抑制破骨细胞形成的活性。此外，#24A3抗体的重链可变区具有：包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列的CDRH1 (RYDVS)，包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列的CDRH2 (VIHPGSGGTGYNEKFKA)，和包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列的CDRH3 (RGLNSGYWFFDF)。此外，#24A3抗体的轻链可变区具有：包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列的CDRL1 (KASQNVGSNVD)，包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列的CDRL2 (ESTNRYT)，和包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列的CDRL3 (MQSNFFPFT)。这些CDR的氨基酸序列也显示在图15中。
此外，在本发明的抗体中也包括这样的CDR修饰的人源化抗体，其包括用另一种氨基酸残基对每个CDR中的1-3个氨基酸残基的取代，只要它具有抑制破骨细胞形成的活性即可。作为CDRH3中的氨基酸的取代的一个例子，可以例举这样的CDRH3，其包括由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列中的一个氨基酸的取代。优选的是包含由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列(RGLNKGYWFFDF)的CDRH3。该CDR的氨基酸序列也显示在图15中。
作为大鼠抗体#24A3的人源化抗体的一个例子，可以例举重链和轻链的任意组合，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含序列表中的SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 22的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 38的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 40的氨基酸残基20-140、SEQ ID NO: 42的氨基酸残基20-140或SEQ ID NO: 44的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129、SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129、SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129、SEQ ID NO: 30的氨基酸残基21-129、SEQ ID NO: 46的氨基酸残基21-129或SEQ ID NO: 48的氨基酸残基21-129。
作为一个优选组合，可以例举：包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；或包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 22的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 30的氨基酸残基21-129。
作为一个更优选的组合，可以例举：包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 16的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 18的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 20的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；或包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 22的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 30的氨基酸残基21-234的氨基酸序列。
作为另一个更优选的组合，可以例举：包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 38的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 48的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 40的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 46的氨基酸残基21-129；包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 42的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129；或包含重链和轻链的抗体，所述重链含有包含如下氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 44的氨基酸残基20-140，且所述轻链含有包含如下氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-129。
作为最优选的组合，可以例举：包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 26的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 14的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 28的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 38的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 48的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 40的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 46的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 42的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列；或包含重链和轻链的抗体，所述重链具有包含SEQ ID NO: 44的氨基酸残基20-466的氨基酸序列，且所述轻链具有包含SEQ ID NO: 24的氨基酸残基21-234的氨基酸序列。
此外，本发明的抗体包括人抗体。人抗-Siglec-15抗体是指仅由源自人染色体的抗体基因序列编码的人抗体。通过使用生产人抗体的小鼠的方法可以获得人抗-Siglec-15抗体，所述小鼠具有含有人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段(参见Tomizuka, K. 等人, Nature Genetics (1997) 16, 第133-143页; Kuroiwa, Y. 等人, Nucl. Acids Res. (1998) 26, 第3447-3448页; Yoshida, H. 等人, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 第69-73页(Kitagawa, Y., Matsuda, T.和Iijima, S.编), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 第722-727页, 等)。
具体地可以如下建立这种生产人抗体的小鼠。通过制备敲除的动物和转基因动物，并使这些动物交配，建立遗传修饰的动物，其中已经破坏了内源免疫球蛋白重链和轻链基因基因座，并替代地，经由酵母人工染色体（YAC）载体等已经导入了人免疫球蛋白重链和轻链基因基因座。
此外，根据基因工程技术，通过使用分别编码这样的人抗体的重链和轻链的cDNA，并优选使用包含该cDNA的载体，转化真核细胞，培养生产重组人单克隆抗体的转化体，由此也可从培养上清液获得该抗体。在这里，例如，可以使用真核细胞、优选哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤细胞作为宿主。
此外，还已知获得从人抗体文库筛选出来的噬菌体展示-衍生的人抗体的方法（参见Wormstone, I. M. 等人, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), 第2301-2308页;Carmen, S. 等人, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), 第189-203页; Siriwardena, D. 等人, Opthalmology (2002) 109 (3), 第427-431页, 等)。
例如，可以使用噬菌体展示法，其中在噬菌体表面上表达人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，并选择结合抗原的噬菌体(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), 第1105-1116页)。通过分析基于与抗原的结合所选择的噬菌体的基因，可以确定编码结合抗原的人抗体的可变区的DNA序列。如果确定了结合抗原的scFv的DNA序列，通过制备具有该序列的表达载体，并将该载体导入适当的宿主中以表达它，可以获得人抗体(WO 92/01047，WO 92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388，Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 第433-455页, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), 第1105-1116页)。
通过在实施例3或10等中所述的方法，可以评价上述抗体的结合抗原的性质，并可以选择优选的抗体。作为对比抗体的性质时的另一个指标的一个例子，可以例举抗体的稳定性。示差扫描量热法(DSC)是能够快速且准确地测量热变性中点温度(Tm)的方法，所述热变性中点温度是蛋白的相对结构稳定性的有利指标。通过使用DSC测量Tm值并对比该值，可以对比热稳定性的差异。已知，抗体的储存稳定性显示出与抗体的热稳定性的某种关联性(Lori Burton, 等人, Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, 第265-273页)，通过使用热稳定性作为指标，可以选择出优选的抗体。用于选择抗体的其它指标的例子如下：在适当宿主细胞中的产量较高，在水性溶液中的聚集性较低。例如，显示出最高产量的抗体不总是显示出高热稳定性，因此，通过基于上述指标做出综合性评价来选择最适合施用给人的抗体是必要的。
此外，还已知这样的方法，其中使用适当的接头，连接抗体的全长重链和轻链序列，由此得到单链免疫球蛋白(Lee, H-S, 等人, Molecular Immunology (1999) 36, 第61-71页; Shirrmann, T. 等人, mAbs (2010), 2, (1)第1-4页)。通过二聚化这样的单链免疫球蛋白，得到的二聚体可以具有与本身是四聚体的抗体类似的结构和活性。此外，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这样的抗体被称作单结构域抗体(sdAb)或纳米体（nanobody），实际上，在骆驼和羊驼中观察到它，且已经报道具有抗原结合亲和力(Muyldemans S. 等人, Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35, Hamers- Casterman C. 等人, Nature (1993) 363 (6428) 446-8)。上述抗体还可以视作根据本发明的抗体的抗原结合片段的类型。
此外，通过控制糖基化（其中聚糖结合到本发明的抗体上），可能增强抗体-依赖性的细胞毒性活性。关于控制抗体的糖基化的技术，已知WO 99/54342、WO 00/61739、WO 02/31140等。但是，所述技术不限于此。
在首先分离抗体基因并然后将该基因导入适当宿主中来制备抗体的情况下，可以使用适当宿主和适当表达载体的组合。抗体基因的具体例子包括编码在本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其轻链序列的基因的组合。当转化宿主细胞时，可能将重链序列基因和轻链序列基因插入相同的表达载体中，且也可能分别插入不同的表达载体中。在使用真核细胞作为宿主的情况下，可使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。作为动物细胞，可以例举(1)哺乳动物细胞，例如，猿COS细胞(Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 第175-182页, ATCC CRL-1650)的二氢叶酸还原酶-缺陷株(Urlaub, G.和Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 第4126-4220页), 鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞; ATCC: CCL-61)。此外，在使用原核细胞的情况下，例如，可以例举大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。通过转化，向这些细胞中导入靶抗体基因，并在体外培养这样转化的细胞，可得到该抗体。在上述的培养方法中，产率有时可能随抗体的序列而变化，因此，有可能通过使用产量作为指标，在具有相当的结合活性的抗体中选择可以容易地生产作为药物的抗体。
本发明的抗体的同种型没有限制，其例子包括IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgA1、IgA2)、IgD和IgE，且其优选的例子包括IgG和IgM，且其更优选的例子包括IgG1和IgG2。
此外，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合位点的抗体抗原结合片段或其修饰的片段。通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体，或根据基因工程技术修饰抗体基因，并在适当的培养细胞中表达修饰的基因，可以得到抗体的片段。在这些抗体片段中，具有全长抗体分子的全部或一些功能的片段可以称为所述抗体的抗原结合片段。作为抗体的功能，通常可以例举抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体-依赖性的细胞毒性活性、补体-依赖性的细胞毒性活性以及补体-依赖性的细胞的细胞毒性活性。根据本发明的抗体的抗原结合片段的功能是对Siglec-15的结合活性，优选抑制破骨细胞形成的活性，更优选抑制破骨细胞的细胞融合过程的活性。
抗体片段的例子包括Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv (scFv，其中重链和轻链的Fv分子通过适当的接头相连)、双抗体、线性抗体、以及由抗体片段组成的多特异性抗体。此外，Fab’（通过在还原条件下处理F(ab’)2而得到的抗体可变区中的单价片段）也视作抗体片段。
此外，本发明的抗体可以是对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。通常，这样的分子结合两种抗原（即，双特异性抗体），但是，本文使用的“多特异性抗体”包括具有对两种或更多种（例如，3种）抗原的特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或这样的抗体的片段（例如，F(ab’)2双特异性抗体）。通过连接两类抗体的重链和轻链（HL对），可以制备双特异性抗体，或者通过融合生产不同单克隆抗体的杂交瘤，以制备生产双特异性抗体的融合细胞，也可以制备双特异性抗体（Millstein等人, Nature (1983) 305, 第537-539页）。
本发明的抗体可以是单链抗体（也称为scFv）。通过经由多肽接头连接抗体的重链可变区和轻链可变区，可以获得单链抗体（Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113（Rosenburg和Moore编，Springer Verlag, New York, 第269-315页（1994），Nature Biotechnology (2005), 23, 第1126-1136页）。此外，通过经由多肽接头连接两个scFv分子生成的BiscFv片段，也可用作双特异性抗体。
制备单链抗体的方法是在本技术领域中已知的(参见，例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513、5,455,030等)。在该scFv中，通过不形成缀合物的接头，优选通过多肽接头，连接重链可变区和轻链可变区(Huston, J. S. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, 第5879-5883页)。在scFv中，重链可变区和轻链可变区可以源自相同抗体或不同抗体。作为用于连接可变区的多肽接头，例如使用由12-19个残基组成的给定单链肽。
可如下获得编码scFv的DNA：使用编码全部氨基酸序列或所需的部分氨基酸序列（选自上述抗体的重链或重链可变区及其轻链或轻链可变区）的DNA作为模板，并使用限定其两端的引物对，通过PCR法进行扩增，并通过组合编码多肽接头部分的DNA和限定其两端的引物对，以便将其两端分别连接重链和轻链，进一步进行扩增。
此外，一旦制备编码scFv的DNA以后，根据常规方法，可以获得包含该DNA的表达载体以及用该表达载体转化的宿主。此外，通过使用获得的宿主，根据常规方法，可以获得scFv。通过以与上述相同的方式获得基因并表达该基因，可以在宿主中生产其抗体片段。
可以使本发明的抗体多聚化，以增加其对抗原的亲和性。待多聚化的抗体可以是一类抗体，或识别相同抗原的多个表位的多个抗体。作为多聚化抗体的方法，可以例举的是使IgG CH3结构域结合两个scFv分子，结合抗生蛋白链菌素，导入螺旋-转角-螺旋基序等。
本发明的抗体可以是多克隆抗体，它是具有不同氨基酸序列的多类抗-Siglec-15抗体的混合物。作为多克隆抗体的一个例子，可以例举具有不同CDR的多类抗体的混合物。培养生产不同抗体的细胞的混合物，并从得到的培养物纯化抗体可用作这样的多克隆抗体(参见WO 2004/061104)。
本发明的抗体可以是与上述抗体的重链和/或轻链相比具有80%至99%同源性的抗体。通过组合与上述重链氨基酸序列具有高同源性的序列以及与上述轻链氨基酸序列具有高同源性的序列，可能选择这样的抗体：其具有与上述抗体中的每一种相当的抗原结合亲和力、抑制破骨细胞形成的活性和/或抑制破骨细胞性骨吸收的活性。所述同源性通常是80%或更多的同源性，优选地90%或更多的同源性，更优选地95%或更多的同源性，和最优选地99%或更多的同源性。此外，通过组合包括重链和/或轻链氨基酸序列中的一个至几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，也可能选择具有与上述抗体中的每一种相当的所有种类活性的抗体。要取代、缺失和/或添加的氨基酸残基的数目通常是10个或更少，优选地5-6个或更少，更优选地2-3个或更少，和最优选地1个。
顺便一提，已知的是，缺失由哺乳动物培养细胞生产的抗体的重链的羧基端处的任意赖氨酸残基(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))，且还已知的是，缺失下述2个氨基酸残基：在这样的重链的羧基端处的甘氨酸和赖氨酸，并将位于羧基端处的任意脯氨酸残基新酰胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。但是，重链序列的这样的缺失和修饰不会影响抗体的抗原结合亲和力和效应子功能(补体激活、抗体依赖性的细胞毒性活性等)。因此，本发明还包括进行上述修饰的抗体，并且可以例举其中已经缺失了重链羧基端处的1个或2个氨基酸的缺失变体，通过它们的酰胺化得到的缺失变体(例如，其中在羧基端位点处的脯氨酸残基已经被酰胺化的重链)，等。但是，其中根据本发明的抗体的重链的羧基端残基已经被缺失的缺失变体不限于上述变体，只要它具有抗原结合亲和力和效应子功能即可。构成本发明的抗体的2个重链可以包含全长重链和选自上述缺失变体的任意一个重链，或可以包含从其中选择的相组合的任意2个重链。每个缺失变体的相对量可以被在根据本发明的抗体的生产中使用的哺乳动物培养细胞的类型和培养条件影响，但是，一个实施例是这样的情况：作为根据本发明的抗体的主要组分，2条重链两者均包括在羧基端处的1个氨基酸残基的缺失。
使用Blast算法2.2.2版(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)，使用默认参数，可以确定2个氨基酸序列之间的同源性。通过访问网站www.ncbi.nlm.nih.gov/blast，也可以通过因特网使用Blast算法。顺便一提，通过Blast算法，计算同一性和确定性(positivity)的2类百分比值。所述同一性是，当要确定其同源性程度的2个氨基酸序列中的氨基酸残基彼此匹配时的值，所述确定性是还考虑具有类似化学结构的氨基酸残基所得到的值。在本说明书中，将当氨基酸残基彼此匹配时的同一性值用作同源性值。
还可以使用与不同类型的分子（诸如聚乙二醇(PEG)，作为抗体的修饰物质）中的任一种结合的抗体。
此外，本发明的抗体可以是任一种这样的抗体和另一种药物之间形成的缀合物的形式（免疫缀合物）。这样的抗体的例子包括其中抗体缀合到放射性物质或具有药理作用的化合物上的那些（Nature Biotechnology (2005) 23, 第1137-1146页）。
可以将所得抗体纯化至同质。使用常规的蛋白分离和纯化方法，可以进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当地选择和组合柱色谱法、过滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等，可以分离和纯化抗体（Strategies for protein Purification and Charcterization:A Laboratoy Course Manual,Daniel R.Marshak等人编, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies:A Laboratory Manual. Harlow and David Lane编,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）），但是方法不限于此。
这些色谱法的例子包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法和吸附色谱法。
使用液相色谱法，诸如HPLC或FPLC，可以进行这些色谱法。
作为用于亲和色谱法的柱子，可以例举蛋白A柱和蛋白G柱。
例如，作为使用蛋白A柱的柱子，可以例举Hyper D、POROS、琼脂糖FF (Pharmacia)等。
此外，通过使用其上固定有抗原的载体，利用抗体对抗原的结合活性，也可纯化抗体。
4. 含有抗-Siglec-15抗体的药物
从在上面的“3. 抗-Siglec-15抗体的制备”部分中所述的方法得到的抗-Siglec-15抗体，可以获得中和Siglec-15的生物活性的抗体。这些中和Siglec-15的生物活性的抗体会在体内抑制Siglec-15的生物活性，即，破骨细胞的分化和/或成熟，因此可用作药物，用作由破骨细胞的异常分化和/或成熟造成的异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂。异常骨代谢可以是任何以净骨流失(骨质减少或骨质溶解)为特征的障碍。一般而言，用抗-Siglec-15抗体的治疗和/或预防应用于需要抑制骨吸收的情况。可用抗-Siglec-15抗体治疗和/或预防的异常骨代谢的例子包括：骨质疏松症(绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症、或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症)、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、假体关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全，但是，异常骨代谢不限于此，只要它是伴有破骨细胞造成的净骨流失的疾病即可。作为上述药物使用的抗-Siglec-15抗体的例子包括通过在“3. 抗-Siglec-15抗体的制备”中所述的方法从#24A3抗体制备的嵌合抗体和人源化抗体。此外，共享与#24A3抗体相同表位的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体也可用作药物。通过观察这些抗体是否结合Siglec-15的相同的特定部分肽，可以证实某种抗-Siglec-15抗体是否共享与#24A3抗体相同的表位。此外，如果某种抗-Siglec-15抗体与#24A3抗体竞争结合Siglec-15，则也可确定这些抗体共享相同的表位。
通过例如抑制过表达Siglec-15的细胞分化成破骨细胞的活性，可以确定抗-Siglec-15抗体的中和Siglec-15的生物活性的体外活性。例如，在不同的浓度，向小鼠单核细胞-衍生的细胞系RAW 264.7细胞或RAW 264细胞添加抗-Siglec-15抗体，并可以确定抑制通过RANKL或TNF-α的刺激向破骨细胞分化的活性。此外，在不同的浓度，向骨髓-衍生的原代培养细胞添加抗-Siglec-15抗体，可以确定抑制通过RANKL、TNF-α或活性维生素D3的刺激向破骨细胞分化的活性。此外，在不同的浓度，向正常人破骨细胞前体细胞（Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，可从Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号2T-110得到）添加抗-Siglec-15抗体，可以确定抑制通过RANKL和M-CSF的刺激向破骨细胞分化的活性。通过使用酒石酸盐-抗性的酸性磷酸酶(TRAP)活性的抑制为指标，可以确定这样的对破骨细胞分化的抑制效应。此外，通过使用TRAP-阳性的多核破骨细胞形成的抑制（即破骨细胞的细胞融合的抑制）为指标，也可以确定对破骨细胞分化的抑制效应。此外，在使用股骨-和/或胫骨-衍生的细胞的陷窝测定实验(Takada等人, Bone和Mineral, (1992) 17, 347-359)中，通过以不同浓度向股骨-和/或胫骨-衍生的细胞添加抗-Siglec-15抗体，并观察牙质切片上的陷窝形成，可以确定抑制破骨细胞的骨吸收的体外活性。作为用于确定抑制破骨细胞导致的骨吸收的体外活性的系统，也可以使用涂有铕-缀合的人胶原的板。可以如下使用实验动物确认抗-Siglec-15抗体对异常骨代谢的体内治疗或预防效应：例如，将抗-Siglec-15抗体施用给骨质疏松症的动物模型或过表达Siglec-15的转基因动物，并测量破骨细胞的任何变化。作为骨质疏松症的动物模型，可以例举切除卵巢的大鼠和切除卵巢的猴。可以如下确定抗-Siglec-15抗体对骨吸收活性的抑制作用：将抗-Siglec-15抗体施用给这样的实验动物，然后测量骨矿物质密度或骨代谢标志物。骨代谢标志物的例子包括、但不限于：骨吸收标志物诸如尿的脱氧吡啶啉、尿的I型胶原的N-端肽(NTX)、尿的I型胶原的C-端肽(CTX)、血液NTX、血液CTX和血液酒石酸盐抗性的酸性磷酸酶(TRAP5b)，以及骨形成标志物诸如血液骨碱性磷酸酶(BAP)、血液骨钙素(BGP)和前胶原I型C-肽(P1NP)。
这样得到的中和Siglec-15的生物活性的抗体可用作药物，特别是用作治疗或预防异常骨代谢的药物组合物，所述异常骨代谢例如骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、或伴随癌的骨转移的骨破坏，或用作这样的疾病的免疫学诊断的抗体。
在类风湿性关节炎（RA）的治疗中，一个主要的难题是伴随该疾病的发生的骨流失。业已报道在伴随RA的这种骨流失中破骨细胞起主要作用。认为作为破骨细胞诱导(分化和成熟)和活化以及RA中的骨破坏的原因最重要的细胞因子是RANKL和TNF-α(Romas E. 等人, Bone 30, 第340-346页, 2002)。作为RANKL的诱饵受体的OCIF/OPG可抑制由RANKL诱导的破骨细胞形成，但是不抑制由TNF-α诱导的破骨细胞形成。另一方面，根据本发明的抗-Siglec-15抗体会有效地抑制由RANKL和TNF-α两者诱导的破骨细胞形成。因此，预期本发明的抗-Siglec-15抗体可以比RANKL阻滞剂(OCIF/OPG、抗-RANKL抗体等)更强烈地抑制RA等中的TNF-α诱导的骨流失和骨破坏。
作为一个例子，对于异常骨代谢的治疗或预防，抗-Siglec-15抗体可以单独施用或与骨疾病的至少一种其它治疗剂组合施用。作为另一个例子，抗-Siglec-15抗体可以与治疗有效量的异常骨代谢的治疗剂组合施用。可与抗-Siglec-15抗体组合施用的其它治疗剂的例子包括但不限于：二膦酸盐(例如，阿屈膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、帕米膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐)、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药(例如，塞来考昔和罗非昔布)、可溶性的TNF受体(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗)、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，托珠单抗)、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，地舒单抗)和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。根据异常骨代谢的状态或希望的治疗和/或预防程度，可以施用2或3或更多种其它治疗剂，并且这些其它治疗剂可以通过封装在同一制剂中全部一起施用。其它治疗剂和抗-Siglec-15抗体还可以通过封装在同一制剂中全部一起施用。另外，抗-Siglec-15抗体和其它治疗剂还可以通过封装在分开制剂中全部一起施用。此外，其它药物剂和抗-Siglec-15抗体还可以接连地分开施用，也就是说，在施用其它治疗剂以后，可以施用含有抗-Siglec-15抗体或所述抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂，或者在施用含有抗-Siglec-15抗体或所述抗体的抗原结合片段作为活性成分的治疗剂以后，可以施用其它治疗剂。在基因治疗中施用的情况下，可以将蛋白性的骨疾病治疗剂的基因和抗-Siglec-15抗体的基因插入到相同启动子区或不同启动子区的下游，且可以导入到相同载体或不同载体中。
通过使骨疾病治疗剂与抗-Siglec-15抗体或其片段缀合，可以制备如在M. C. Garnet“Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216中所述的靶向药物缀合物。为达到该目的，可使用除抗体分子外的任何抗体片段，只要其没有完全失去识别破骨细胞的能力，其例子包括诸如Fab、F(ab’)2和Fv等片段。在本发明中，也可以以相同的方式使用抗体和片段。抗-Siglec-15抗体或其片段与骨疾病治疗剂形成的缀合物可以是在下述文献中所述的多种形式中的任一种：M. C. Garnet“Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson“Bioconjugate Techniques”Academic Press, California (1996), Putnam和J. Kopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123等。也就是说，可以例举这样的缀合物，其中抗-Siglec-15抗体和骨疾病治疗剂彼此化学地直接缀合，或经由诸如寡肽等间隔物缀合，以及经由适当的药物载体而形成的缀合物。药物载体的例子包括脂质体和水溶性聚合物。经由这种药物载体形成的缀合物的更具体例子包括：这样的缀合物，其中将抗体和骨疾病治疗剂掺入脂质体中，并将脂质体与抗体彼此缀合；和这样的缀合物，其中骨疾病治疗剂与水溶性聚合物（分子量为约1,000-100,000的化合物）化学地直接缀合，或经由诸如寡肽等间隔物缀合，并将抗体与水溶性聚合物缀合。通过本领域技术人员已知的方法可以实现抗体（或其片段）与骨疾病治疗剂或药物载体（诸如脂质体或水溶性聚合物）的缀合，所述方法例如描述在下述文献中的方法：G. T. Hermanson“Bioconjugate Techniques”Academic Press, California (1996), Putnam和J. Kopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123。通过本领域技术人员已知的方法，可以实现骨疾病治疗剂在脂质体中的掺入，所述方法例如描述在下述文献中的方法：D. D. Lasic“Liposomes:From Physics to Applications”Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993)等。通过本领域技术人员已知的方法，可以实现骨疾病治疗剂与水溶性聚合物的缀合，所述方法例如描述在下述文献中的方法：D. Putnam和J. Kopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science（1995）122,55-123。除上述方法外，通过本领域技术人员已知的方法，通过基因工程，可以制备抗体（或其片段）与蛋白性的骨疾病治疗剂（或其片段）的缀合物。
本发明也提供了药物组合物，其含有治疗和/或预防有效量的抗-Siglec-15抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
本发明也提供了药物组合物，其含有治疗和/或预防有效量的抗-Siglec-15抗体、治疗和/或预防有效量的至少一种骨疾病治疗剂和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。骨疾病治疗剂的例子包括但不限于：二膦酸盐(例如，阿屈膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、伊卡膦酸盐、帕米膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐)、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药(例如，塞来考昔和罗非昔布)、可溶性的TNF受体(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗)、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，托珠单抗)、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段(例如，地舒单抗)和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。
在根据本发明的药物组合物中可接受的、用于制剂中的物质优选地在其施用量和施用浓度对被施用药物组合物的人没有毒性。
本发明的药物组合物可以包含能改变或维持其pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等张性、无菌状态、稳定性、溶解度、释放速率、吸收速率或渗透性的药用物质。这样的药用物质的例子包括但不限于：氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充剂诸如甘露醇和甘氨酸；螯合剂诸如四乙酸乙二胺(EDTA)；络合剂诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；增量剂诸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物诸如单糖类和二糖类；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷；防腐剂诸如低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂诸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇诸如甘露醇和山梨醇；助悬剂；表面活性剂诸如脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯(诸如聚山梨酯20和聚山梨酯80)、三硝基甲苯（Triton）、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂诸如蔗糖和山梨醇；弹性增强剂诸如氯化钠、氯化钾和甘露醇和山梨醇；转运剂；赋形剂；和/或药物佐剂。这些为了药用加入的物质的量优选为抗-Siglec-15抗体重量的0.01-100倍，特别优选0.1-10倍。根据组合物应用的疾病、应用的施用途径等，本领域技术人员可以适当地确定制剂中药物组合物的优选配方。
药物组合物中的赋形剂和载体可以是液体或固体形式。适当的赋形剂或载体可以是注射用水、生理盐水、人工脑脊液或肠胃外施用中常用的其它物质。此外，中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水也可以用作载体。药物组合物可以含有pH7.0-8.5的Tris缓冲液、pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或pH 3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液。此外，这样的缓冲液可以补充山梨醇或其它化合物。本发明的药物组合物的例子包括含有抗-Siglec-15抗体的药物组合物、以及含有抗-Siglec-15抗体和至少一种骨疾病治疗剂的药物组合物。将本发明的药物组合物制成冻干产品或液体形式，作为具有所选择的组成和所需的纯度的药物。也可以使用适当的赋形剂（如蔗糖），使含有抗-Siglec-15抗体的药物组合物以及含有抗-Siglec-15抗体和至少一种异常骨代谢治疗剂的药物组合物形成冻干产品。
本发明的药物组合物可以制成用于肠胃外施用或用于经口服施用的胃肠道吸收。制剂的组成和浓度可根据施用方法确定。本发明的药物组合物中所含的抗-Siglec-15抗体对Siglec-15的亲和力越高，也就是说，其对Siglec-15的解离常数(Kd值)越低，则抗-Siglec-15抗体可以表现出的药物效能越多（甚至在减少给人的剂量时）。因此，基于该考虑，也可以确定本发明的药物组合物对人的剂量。对于剂量，在给人施用人抗-Siglec-15抗体的情况下，可以以约0.1-100 mg/kg（每1~180天一次）的剂量施用抗体。
本发明的药物组合物的剂型的例子包括：包括输注在内的注射剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂和经皮吸收剂。
实施例
在下文中，参考实施例更具体地描述本发明，然而，本发明不限于此。应当指出，除非另有说明，在下述实施例中的与基因操作有关的各个操作均根据在“Molecular Cloning”（Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T.著, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年出版）中所述的方法进行，或在使用市售的试剂或试剂盒的情况下，根据附随的说明书使用它们。
实施例1
含有可溶性人Siglec-15蛋白的培养溶液的制备及其纯化
通过用PCR法扩增人Siglec-15细胞外结构域cDNA，并将所述cDNA整合进pDNOR221载体(由Invitrogen Corporation制造)中，制备输入克隆。从该输入克隆，通过重组进pDONM中而得到表达质粒(可溶性人Siglec-15/pDONM)，所述pDONM是被设计成使得V5表位标签和6 x His标签添加至插入物的C端的目标载体。将可溶性人Siglec-15/pDONM转染进293-F细胞中，并对所述细胞在6-12%的CO2浓度在37℃进行旋动培养96小时(4天)。将培养溶液收集并离心，以制备含有可溶性人Siglec-15蛋白的培养物上清液。对如此得到的培养物上清液使用Ni-Sepharose HP柱(由Amersham Biosciences, Inc.制造)进行部分纯化，随后使用Resource Q柱(由Amersham Biosciences, Inc.制造)进行分级分离。然后，通过进行SDS-聚丙烯酰胺电泳(在还原条件下)和银染色，进行可溶性人Siglec-15蛋白的检测和纯度测定。所以，经证实，具有约35 kDa的分子量的蛋白(可溶性人Siglec-15蛋白)被有效地纯化并浓缩在没有吸附至Resource Q柱的蛋白级分中。
实施例2
生产大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的杂交瘤的建立和纯化的抗体的制备
用在实施例1中生产的纯化的可溶性人Siglec-15蛋白免疫大鼠。收集用于试验的血液并证实抗体滴度增加以后，将大鼠安乐死，然后切离脾。根据融合小鼠(大鼠)脾细胞和骨髓瘤细胞的普通方法，进行细胞融合。通过筛选选择35个具有高抗体滴度的克隆，然后进行第一个和第二个克隆规程。所以，本发明的发明人成功地建立了#24A3作为具有高抗体滴度的杂交瘤。将建立的杂交瘤以1 x 107个细胞/小鼠腹膜内地植入裸鼠中。植入以后，当观察到腹水的充分积累时，收集腹水，并对IgG级分进行纯化。通过上述操作，制备了大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3。
实施例3
评价大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3对人Siglec-15蛋白的结合活性
3-1)人Siglec-15 V-组结构域的表达和纯化
将编码蛋白的DNA整合进载体pDEST14 (Invitrogen, Corporation, 目录号11801-016)中，在所述蛋白中，His标签和因子Xa识别序列被连接至人Siglec-15 V-组结构域(一种多肽，其包含具有登录号NP_998767的NCBI蛋白数据库中的氨基酸序列的氨基酸残基39-165)的N-端侧。使用该质粒，转化大肠杆菌Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, Inc., 目录号71136-4)，并在TB培养基(Invitrogen, Corporation, 目录号22711-022)中培养。培养后，通过超声，将细菌细胞匀浆化，将得到的匀浆离心，并使用HisTrap HP柱(GE Healthcare Ltd., 目录号17-5247-01)纯化上清液。此后，用因子Xa (New England BioLabs Inc., 目录号P8010L)切割His标签，并然后使用Mono S5/50 GL柱(GE Healthcare Ltd., 目录号17-5168-01)和Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare Ltd., 目录号17-5174-01)纯化人Siglec-15 V-组结构域，直到通过电泳得到分子量为14 kDa的单条带。
3-2)大鼠#32A3和人Siglec-15 V-组结构域之间的解离常数的测量
使用Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，如下测量大鼠#24A3抗体和人Siglec-15 V-组结构域之间的解离常数：将所述抗体固定化为配体，并使用所述抗原作为分析物。此外，将大鼠#32A1抗体用作对照抗体。关于其制备方法和其重链和轻链序列的信息，在WO 09/48072和WO 10/117011中描述了大鼠#32A1抗体。顺便一提，生产大鼠#32A1抗体的杂交瘤#32A1于2008年8月28日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心（International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，位于: Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, 日本），并已经在抗-Siglec-15杂交瘤#32A1的名称下获得登录号FERM BP-10999。
通过胺偶联方法，以约50 RU，将#32A1或#24A3抗体结合至传感器芯片CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，这经由固定化在其上面的抗-小鼠IgG抗体(GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)实现。使用HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%表面活性剂P20)作为运行缓冲液。在具有与其结合的抗体的芯片上，以90 μL/min的流速添加抗原溶液的稀释系列(0.003-2 nM)进行233秒，随后，监测解离相3600秒。作为再生溶液，以10 μL/min的流速加入3 M MgCl2进行30秒。在数据分析中，使用分析软件(Biacore T200 Evaluation软件，1.0版)的1:1结合模型，并计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(KD; KD = koff/kon)。根据结果，#32A1具有1.5E-10 [M]的KD值，且#24A3具有7.0E-11 [M]的KD值，因此，#24A3具有比#32A1大约2倍的亲和力。
实施例4
编码大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的可变区的cDNA的扩增及其碱基序列分析
4-1)#24A3的重链和轻链的N-端氨基酸序列的鉴别
为了鉴别#24A3的重链和轻链的N-端氨基酸序列，通过SDS-PAGE分离在实施例2中制备的#24A3。将凝胶中的蛋白从分离以后的凝胶转移至Sequi-Blot PVDF膜(Bio-Rad Laboratories, Inc.)。将膜用洗涤缓冲液(25 mM NaCl, 10 mM硼酸钠缓冲液pH 8.0)洗涤，此后通过浸入染料溶液(50%甲醇, 20%乙酸, 0.05%考马斯亮蓝)中保持5分钟进行染色，随后用90%甲醇脱色。将在PVDF膜上显影的与重链对应的带(具有较小迁移率的带)和与轻链对应的带(具有较大迁移率的带)的部分切离。将与重链对应的带在少量0.5%聚乙烯吡咯烷酮/100 mM乙酸溶液中在37℃温育30分钟，随后用水洗涤。随后，使用Pfu焦谷氨酸氨基肽酶试剂盒(TaKaRa Bio, Inc.)除去经修饰的N-末端残基，随后用水洗涤并风干。然后，尝试通过自动Edman方法(参见Edman等人(1967) Eur. J. Biochem. 1, 80)使用Procise cLC Protein Sequencer Model 492cLC (Applied Biosystems, Inc.)来鉴别它们各自的N-端氨基酸序列。根据结果，与#24A3的重链对应的带的N-端氨基酸序列为VQLQQSGAELTKP，与其轻链对应的带的N-端氨基酸序列为DIVMTQSPTSMSIS。
4-2)从生产#24A3的杂交瘤制备mRNA
为了扩增含有#24A3的可变区的cDNA，使用mRNA分离试剂盒(Roche Applied Science, Inc.)从生产#24A3的杂交瘤制备mRNA。
4-3)cDNA (5’-RACE-Ready cDNA)的合成
使用100 ng在上面4-2)中制备的mRNA，用SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)，进行cDNA (5’-RACE-Ready cDNA)的合成。
4-4)通过5'-RACE PCR扩增含有#24A3重链可变区的cDNA和序列确定
作为用于通过PCR法扩增#24A3重链基因可变区的cDNA的引物，使用UPM (通用引物 A 混合物，SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒附带)和具有序列5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3)的寡核苷酸。作为UPM，使用SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)附带的一个，并基于数据库中的大鼠重链(IgG2a)恒定区的序列来设计RG2AR3。
使用该引物组合和在上面4-3)中合成的cDNA (5’-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR来扩增含有#24A3重链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)附带的方案，使用Touchdown PCR程序，使用KOD -Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)作为聚合酶进行PCR。
将通过5'-RACE PCR扩增的含有重链可变区的cDNA使用MinElute PCR 纯化试剂盒 (QIAGEN, Inc.)进行纯化，并然后使用Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒 (Invitrogen Corporation)进行克隆，并进行含有重链可变区的克隆cDNA的核苷酸序列的序列分析。
作为序列引物，使用具有序列5’-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3’(RG2AR3)的寡核苷酸和NUP (巢式通用引物 A: SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒附带)，所述RG2AR3基于数据库中的大鼠重链恒定区的序列而设计。
使用基因测序仪(ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)或Applied Biosystems 3730xl Analyzer (Applied Biosystems))进行序列分析，并且在序列反应中使用GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。
编码#24A3重链可变区的cDNA的经确定的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 1表示，并且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 2表示。SEQ ID NO: 1的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列也显示在图1中。
从核苷酸序列确定的#24A3重链可变区的氨基酸序列与在上面4-1)中确定的N-端氨基酸序列匹配。
4-5)通过5'-RACE PCR来扩增含有#24A3轻链可变区的cDNA和序列确定
作为用于通过PCR法扩增#24A3轻链基因可变区的cDNA的引物，使用UPM (通用引物 A 混合物，SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒附带)和具有序列5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5)的寡核苷酸。作为UPM，使用SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)附带的一个，并基于数据库中的大鼠轻链恒定区的序列来设计RKR3。
使用该引物组合和在上面4-3)中合成的cDNA(5’-RACE-Ready cDNA)作为模板，通过5'-RACE PCR来扩增含有#24A3轻链可变区的cDNA。根据SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (ClontechH Laboratories, Inc.)附带的方案，使用Touchdown PCR程序，使用KOD -Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)作为聚合酶进行PCR。
将通过5'-RACE PCR扩增的含有轻链可变区的cDNA使用MinElute PCR 纯化试剂盒 (QIAGEN, Inc.)进行纯化，并然后使用Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒 (Invitrogen Corporation)进行克隆，并进行含有轻链可变区的克隆cDNA的核苷酸序列的序列分析。
作为序列引物，使用具有序列5’-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3’(RKR5)的寡核苷酸和NUP (巢式通用引物 A: SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒附带)，所述RKR5基于数据库中的大鼠轻链恒定区的序列而设计。
使用基因测序仪(ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems)或Applied Biosystems 3730xl Analyzer (Applied Biosystems))进行序列分析，并且在序列反应中使用GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。
编码#24A3轻链可变区的cDNA的经确定的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3表示，并且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 4表示。SEQ ID NO: 3的核苷酸序列和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列也显示在图2中。从核苷酸序列确定的#24A3轻链可变区的氨基酸序列与在上面4-1)中确定的N-端氨基酸序列匹配。
实施例5
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体的基因表达构建体的制备
5-1)嵌合的和人源化的轻链表达载体pCMA-LK的构建
用限制性酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corporation)得到的约5.4 kb的片段使用In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)连接到含有编码人κ链分泌信号的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 5表示的人κ链恒定区的DNA片段，由此制备pcDNA3.3/LK。
通过使用pcDNA3.3/LK作为模板以及还使用下述引物集合，进行PCR，并将得到的约3.8 kb的片段磷酸化，随后自我连接，由此构建嵌合的和人源化的轻链表达载体pCMA-LK，其具有信号序列、克隆位点和在CMV启动子下游的人κ链恒定区。
5-2)嵌合的和人源化的IgG2型重链表达载体pCMA-G2的构建
使用In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)连接通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK并除去κ链分泌信号和人κ链恒定区而得到的DNA片段以及含有编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的核苷酸序列的DNA片段(SEQ ID NO: 6)，由此构建嵌合的和人源化的IgG2型重链表达载体pCMA-G2，其具有信号序列、克隆位点和在CMV启动子下游的人IgG2重链恒定区。
5-3)人嵌合#24A3轻链表达载体的构建
通过使用在实施例4)中得到的含有#24A3轻链可变区的cDNA作为模板，并且也使用KOD -Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)和下述引物集合，扩增含有编码轻链可变区的cDNA的DNA片段，然后使用In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)插入用于通用用途的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pCMA-LK中的用限制性酶BsiWI切割的位点处，由此构建人嵌合#24A3轻链表达载体。如此得到的表达载体被命名为“pCMA-LK/#24A3”。制备的人嵌合#24A3轻链基因具有由序列表中的SEQ ID NO: 9表示的核苷酸序列，并编码由序列表中的SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列。包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。由SEQ ID NO: 10的氨基酸编号1-20表示的氨基酸序列对应于分泌信号，SEQ ID NO: 21-129的氨基酸序列对应于轻链可变区，且由其氨基酸编号130-234表示的氨基酸序列对应于轻链恒定区。SEQ ID NO: 9的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列也显示在图4中。
5-4)人嵌合#24A3重链表达载体的构建
通过使用在实施例4)中得到的含有#24A3重链可变区的cDNA作为模板，并且也使用KOD -Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)和下述引物集合，扩增含有编码重链可变区的cDNA的DNA片段，然后使用In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒 (Clontech Laboratories, Inc.)插入嵌合的和人源化的IgG2型重链表达载体pCMA-G2中的用限制性酶BlpI切割的位点处，由此构建人嵌合#24A3重链表达载体。如此得到的表达载体被命名为“pCMA-G2/#24A3”。制备的人嵌合#24A3重链基因具有由序列表中的SEQ ID NO: 7表示的核苷酸序列，并编码由序列表中的SEQ ID NO: 8表示的氨基酸序列。包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。由SEQ ID NO: 8的氨基酸编号1-19表示的氨基酸序列对应于分泌信号，由其氨基酸编号20-140表示的氨基酸序列对应于重链可变区，且由其氨基酸编号141-466表示的氨基酸序列对应于重链恒定区。SEQ ID NO: 7的核苷酸序列和SEQ ID NO: 8的氨基酸序列也显示在图3中。
实施例6
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体的制备
6-1)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体的制备
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)根据方案进行传代培养和培养。将1.2 x 109个处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)接种在3-L Fernbach锥形瓶(Corning Incorporated)中，并通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corporation)稀释制备成1.0 x 106个细胞/ml，然后在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃进行振荡培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polyscience #24765)溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。随后，将使用NucleoBond Xtra (TaKaRa Bio, Inc.)制备的重链表达载体(0.4 mg)和轻链表达载体(0.8 mg)悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。然后，将20 ml得到的表达载体/Opti-Pro SFM混合物加入20 ml得到的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合物中，并将得到的混合物轻轻搅拌，然后静置5分钟。此后，将混合物添加到FreeStyle 293F细胞，并在8%CO2培养箱中在37℃在90 rpm进行振荡培养7天。将得到的培养物上清液穿过一次用弃的囊式过滤器(Advantec #CCS-045-E1H)进行过滤。
将通过pCMA-G2/#24A3和pCMA-LK/#24A3的组合得到的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体命名为“c#24A3”。
6-2)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人嵌合抗体的纯化
通过两步法从上面6-1)得到的培养物上清液纯化抗体，所述两步法包括rProtein A亲和色谱法(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)。在4-6℃进行在rProtein A亲和色谱法纯化以后和在陶瓷羟磷灰石纯化以后的缓冲液替换步骤。首先，将培养物上清液施加于用PBS平衡过的MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.制造, HiTrap柱)。在将所有培养溶液倒入柱中以后，将柱用柱体积的2倍或更多倍的量的PBS洗涤。随后，用2 M盐酸精氨酸溶液(pH 4.0)进行洗脱，并收集含有抗体的级分。在对收集的级分通过透析(Thermo Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用PBS进行缓冲液替换以后，将通过用含有5 mM磷酸钠和50 mM MES的缓冲液（pH 7.0）稀释5倍制备的抗体溶液施加于陶瓷羟磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. (Japan), Bio-Scale CHT Type-I羟磷灰石柱)，该柱用含有5 mM NaPi、50 mM MES和30 mM NaCl的缓冲液（pH 7.0）平衡过。然后，进行氯化钠的线性浓度梯度洗脱，并收集含有抗体的级分，并对收集的级分通过透析(Thermo Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨醇, pH 6.0)进行缓冲液替换。最后，使用Centrifugal UF 过滤装置 VIVASPIN 20 (分级分子量UF: 10 K, Sartorius Co., Ltd.，在4℃)浓缩得到的溶液，并将IgG的浓度调至10 mg/ml，并将如此得到的溶液用作纯化的样品。
实施例7
大鼠抗-小鼠Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的设计
a)#24A3的人源化形式的设计
a)-i)#24A3的可变区的分子建模
通过通常称作同源性建模的方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))，进行#24A3的可变区的分子建模。将在蛋白数据库(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(可以得到从X-射线晶体结构衍生出的三维结构)与上面确定的#24A3的可变区进行对比。结果，在具有框架中的类似缺失的抗体中，选择12E8作为与#24A3的轻链可变区具有最高序列同源性。此外，选择2OSL作为与#24A3的重链可变区具有最高序列同源性。通过组合分别与#24A3的轻链和重链相对应的12E8和2OSL的坐标（coordinate），得到“框架模型”，从而产生框架区的三维结构。然后，将各个CDR的代表性构象整合进框架模型中。
最后，为了在能量方面得到#24A3的可变区的可能分子模型，进行能量计算，以排除不利的原子间接触。使用市售的蛋白构象分析程序Discovery Studio (Accelrys, Inc.)，执行上述规程。
a)-ii)人源化的#24A3的氨基酸序列的设计
根据通常称作CDR移植的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))，构建人源化的#24A3抗体。基于框架区内的氨基酸同源性，以两种方式选择受体抗体。将#24A3的框架区序列与Kabat数据库中的所有人框架的氨基酸序列进行对比(Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))。结果，基于框架区中的74%的序列同源性，选择HuMc3抗体作为受体。将HuMc3的框架区中的氨基酸残基与#24A3的氨基酸残基相比对，并鉴别出其中使用不同氨基酸的位置。使用上面构建的#24A3的三维模型，分析这些残基的位置。然后，根据Queen等人提供的标准(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))，选择要移植到受体上的供体残基。通过将一些选定的供体残基转移给受体抗体，如在下述实施例中所述构建人源化的#32A1序列。此外，还如在下述实施例中所述，构建CDR修饰的人源化的#24A3序列，其包括用其它氨基酸残基对#24A3的每个CDR中的1-3个氨基酸残基的取代。
b)#24A3重链的人源化
b)-i)h#24A3-H1-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H1-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用苏氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号49)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用甲硫氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号67)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用缬氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号87)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号91)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H1-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 12表示。包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 11表示。包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 11的核苷酸序列和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列也显示在图5中。
b)-ii)h#24A3-H2-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H2-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用甲硫氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号67)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用缬氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号87)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号91)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H2-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 14表示。包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 13表示。包含SEQ ID NO: 13的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 13的核苷酸序列和SEQ ID NO: 14的氨基酸序列也显示在图6中。
b)-iii)h#24A3-H3-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H3-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H3-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 16表示。包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 15表示。包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 15的核苷酸序列和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列也显示在图7中。
b)-iv) h#24A3-H4-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H4-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H4-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 18表示。包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 17表示。包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 17的核苷酸序列和SEQ ID NO: 18的氨基酸序列也显示在图8中。
b)-v) h#24A3-H5-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H5-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、和用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)。
h#24A3-H5-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 20表示。包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 19表示。包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 19的核苷酸序列和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列也显示在图9中。
b)-vi) h#24A3-H6-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H6-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、和用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)。
h#24A3-H6-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 22表示。包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 22的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 21表示。包含SEQ ID NO: 21的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 21的核苷酸序列和SEQ ID NO: 22的氨基酸序列也显示在图10中。
c) #24A3轻链的人源化
c)-i) h#24A3-L1-型轻链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L1-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用脯氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号60)、用脯氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号63)、用丝氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号83)、用亮氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号93)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用谷氨酰胺取代丝氨酸(氨基酸编号120)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L1-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 24表示。包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 23表示。包含SEQ ID NO: 23的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 23的核苷酸序列和SEQ ID NO: 24的氨基酸序列也显示在图11中。
c)-ii) h#24A3-L2-型轻链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L2-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用脯氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号60)、用丝氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号83)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用谷氨酰胺取代丝氨酸(氨基酸编号120)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L2-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 26表示。包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 25表示。包含SEQ ID NO: 25的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 25的核苷酸序列和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列也显示在图12中。
c)-iii) h#24A3-L3-型轻链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L3-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用脯氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号60)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用谷氨酰胺取代丝氨酸(氨基酸编号120)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L3-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 28表示。包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 27表示。包含SEQ ID NO: 27的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 27的核苷酸序列和SEQ ID NO: 28的氨基酸序列也显示在图13中。
c)-iv) h#24A3-L4-型轻链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L4-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L4-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 30表示。包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 29表示。包含SEQ ID NO: 29的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 29的核苷酸序列和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列也显示在图14中。
d) h#24A3重链(2)的人源化
d)-i) h#24A3-H2b-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H2b-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用甲硫氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号67)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用缬氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号87)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号91)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、用赖氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号122)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H2b-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 38表示。包含SEQ ID NO: 38的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 38的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 37表示。包含SEQ ID NO: 37的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 37的核苷酸序列和SEQ ID NO: 38的氨基酸序列也显示在图17中。
d)-ii) h#24A3-H2c-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H2c-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用缬氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号87)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号91)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、用赖氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号122)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H2c-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 40表示。包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 40的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 39表示。包含SEQ ID NO: 39的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 39的核苷酸序列和SEQ ID NO: 40的氨基酸序列也显示在图18中。
d)-iii) h#24A3-H2d-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H2d-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用甲硫氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号67)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号91)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、用赖氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号122)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H2d-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 42表示。包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 41表示。包含SEQ ID NO: 41的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 41的核苷酸序列和SEQ ID NO: 42的氨基酸序列也显示在图19中。
d)-iiii) h#24A3-H2e-型重链：
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 8表示的人嵌合#24A3重链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3重链命名为“h#24A3-H2e-型重链”：用缬氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号24)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号30)、用赖氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号35)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号39)、用丙氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号43)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号56)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号57)、用丙氨酸取代精氨酸(氨基酸编号59)、用甘氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号63)、用甲硫氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号67)、用精氨酸取代赖氨酸(氨基酸编号86)、用缬氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号87)、用异亮氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号89)、用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号90)、用苏氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号95)、用酪氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号99)、用谷氨酸取代谷氨酰胺(氨基酸编号101)、用精氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号106)、用丝氨酸取代脯氨酸(氨基酸编号107)、用赖氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号122)、和用谷氨酰胺取代脯氨酸(氨基酸编号132)。
h#24A3-H2e-型重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 44表示。包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的氨基酸残基1-19的序列、包含其氨基酸残基20-140的序列、和包含其氨基酸残基141-466的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 43表示。包含SEQ ID NO: 43的核苷酸序列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列、和包含其核苷酸421-1398的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。SEQ ID NO: 43的核苷酸序列和SEQ ID NO: 44的氨基酸序列也显示在图20中。
e) h#24A3轻链(2)的人源化
e)-i) h#24A3-L2b-型轻链
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L2b-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用脯氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号60)、用丝氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号83)、用亮氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号93)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用谷氨酰胺取代丝氨酸(氨基酸编号120)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L2b-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 46表示。包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 46的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 45表示。包含SEQ ID NO: 45的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 45的核苷酸序列和SEQ ID NO: 46的氨基酸序列也显示在图21中。
e)-ii) h#24A3-L3b-型轻链
将通过分别用下述氨基酸残基取代序列表中由SEQ ID NO: 10表示的人嵌合#24A3轻链的下述氨基酸残基(氨基酸编号)而设计的人源化的#24A3轻链命名为“h#24A3-L3b-型轻链”：用天冬氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号29)、用亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号31)、用丙氨酸取代丝氨酸(氨基酸编号32)、用缬氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号33)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号35)、用谷氨酸取代天冬氨酸(氨基酸编号37)、用丙氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号39)、用异亮氨酸取代甲硫氨酸(氨基酸编号41)、用脯氨酸取代苏氨酸(氨基酸编号60)、用亮氨酸取代苯丙氨酸(氨基酸编号93)、用丝氨酸取代天冬酰胺(氨基酸编号97)、用亮氨酸取代缬氨酸(氨基酸编号98)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号103)、用谷氨酰胺取代丝氨酸(氨基酸编号120)、用苏氨酸取代异亮氨酸(氨基酸编号122)、用缬氨酸取代亮氨酸(氨基酸编号124)、和用苏氨酸取代丙氨酸(氨基酸编号129)。
h#24A3-L3b-型轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 48表示。包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的氨基酸残基1-20的序列、包含其氨基酸残基21-129的序列、和包含其氨基酸残基130-234的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码SEQ ID NO: 48的氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 47表示。包含SEQ ID NO: 47的核苷酸序列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-387的序列、和包含其核苷酸388-702的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。SEQ ID NO: 47的核苷酸序列和SEQ ID NO: 48的氨基酸序列也显示在图22中。
实施例8
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的表达载体的制备
8-1)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的重链的表达载体的构建
合成含有编码在实施例7-b)中描述的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的任一个重链可变区的基因的DNA (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service)，并插入用于通用用途的嵌合的和人源化的IgG2型重链表达载体(pCMA-G2)中的用限制性酶BlpI切割的位点处，由此构建大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的重链的表达载体。
8-2)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的轻链的表达载体的构建
合成含有编码在实施例7-c)中描述的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的任一个轻链可变区的基因的DNA (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service)，并插入用于通用用途的嵌合的和人源化的轻链表达载体(pCMA-LK)中的用限制性酶BsiWI切割的位点处，由此构建大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的轻链的表达载体。
8-3)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3 (2)的人源化抗体的重链的表达载体的构建
8-3-1) #24A3-H2b-型重链表达载体的构建
使用在8-1)中制备的#24A3-H2-型重链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-H2b-型重链表达载体。
8-3-2) h#24A3-H2c-型重链表达载体的构建
使用在8-3-1)中制备的h#24A3-H2b-型重链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-H2c-型重链表达载体。
8-3-3) h#24A3-H2d-型重链表达载体的构建
使用在8-3-1)中制备的h#24A3-H2b-型重链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-H2d-型重链表达载体。
8-3-4) h#24A3-H2e-型重链表达载体的构建
使用在8-3-1)中制备的h#24A3-H2b-型重链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-H2d-型重链表达载体。
8-4)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3 (2)的人源化抗体的轻链的表达载体的构建
8-4-1) h#24A3-L2b-型轻链表达载体的构建
使用在8-2)中制备的h#24A3-L2-型轻链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-L2b-型轻链表达载体。
8-4-2) h#24A3-L3b-型轻链表达载体的构建
使用在8-2)中制备的h#24A3-L3-型轻链表达载体作为模板，并且还使用下述引物集合和KOD -Plus- 突变试剂盒(TOYOBO Co., Ltd.)，引入突变，由此构建h#24A3-L3b-型轻链表达载体。
实施例9
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的制备
9-1)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的制备
可以将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)根据方案进行传代培养和培养。将1.2 x 109个处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)接种在3-L Fernbach锥形瓶(Corning Incorporated)中，并通过用FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corporation)稀释制备成1.0 x 106个细胞/ml，然后在8%CO2培养箱中在90 rpm在37℃进行振荡培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polyscience #24765)溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。随后，将使用NucleoBond Xtra (TaKaRa Bio, Inc.)制备的重链表达载体(0.4 mg)和轻链表达载体(0.8 mg)悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。然后，将20 ml得到的表达载体/Opti-Pro SFM混合物加入20 ml得到的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合物中，并将得到的混合物轻轻搅拌，然后静置5分钟。此后，将混合物加给FreeStyle 293F细胞，并在8%CO2培养箱中在37℃在90 rpm进行振荡培养7天。将得到的培养物上清液穿过一次用弃的囊式过滤器(Advantec #CCS-045-E1H)进行过滤。
通过将在实施例8-1和8-3中制备的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的重链的任意表达载体与在实施例8-2和8-4中制备的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的轻链的任意表达载体组合，得到大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体。
9-2)大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的纯化
通过两步法从上面9-1)得到的培养物上清液纯化抗体，所述两步法包括rProtein A亲和色谱法(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)。在4-6℃进行在rProtein A亲和色谱法纯化以后和在陶瓷羟磷灰石纯化以后的缓冲液替换步骤。首先，将培养物上清液施加于用PBS平衡过的MabSelect SuRe (由GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.制造, HiTrap柱)。在将所有培养溶液倒入柱中以后，将柱用柱体积的2倍或更多倍的量的PBS洗涤。随后，用2 M盐酸精氨酸溶液(pH 4.0)进行洗脱，并收集含有抗体的级分。在对收集的级分通过透析(Thermo Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用PBS进行缓冲液替换以后，将通过用含有5 mM磷酸钠和50 mM MES的缓冲液（pH 7.0）稀释5倍制备的抗体溶液施加于陶瓷羟磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. (Japan), Bio-Scale CHT Type-I羟磷灰石柱)，该柱用含有5 mM NaPi、50 mM MES和30 mM NaCl的缓冲液（pH 7.0）平衡过。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，并收集含有抗体的级分。对收集的级分通过透析(Thermo Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)用HBSor (25 mM组氨酸/5%山梨醇, pH 6.0)进行缓冲液替换。最后，使用Centrifugal UF 过滤装置 VIVASPIN 20 (分级分子量UF: 10 K, Sartorius Co., Ltd.，在4℃)浓缩得到的溶液，并将IgG的浓度调至20 mg/ml，并将如此得到的溶液用作纯化的样品。
此外，在本说明书中，例如，具有h#24A3-H1重链和h#24A3-L1轻链的抗体被称作“h#24A3-H1/L1”或“h#24A3-H1/L1抗体”。根据上面9-1)和9-2)的方法制备的抗体的具体例子包括h#24A3-H1/L1、h#24A3-H1/L2、h#24A3-H1/L3、h#24A3-H2/L1、h#24A3-H2/L2、h#24A3-H2/L3、h#24A3-H3/L1、h#24A3-H3/L2、h#24A3-H3/L3、h#24A3-H4/L1、h#24A3-H4/L2、h#24A3-H4/L3、h#24A3-H5/L1、h#24A3-H5/L2、h#24A3-H5/L3、h#24A3-H6/L4、h#24A3-H2b/L1、h#24A3-H2b/L2b、h#24A3-H2b/L3b、h#24A3-H2c/L1、h#24A3-H2c/L2b、h#24A3-H2c/L3b、h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2d/L2b、h#24A3-H2d/L3b、h#24A3-H2e/L1、h#24A3-H2e/L2b和h#24A3-H2e/L3b。
实施例10
嵌合抗体和大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体对小鼠Siglec-15蛋白的结合活性的评价
10-1)嵌合抗体的结合活性的评价
使用Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，如下测量人嵌合#24A3抗体和人Siglec-15 V-组结构域之间的解离常数：将所述抗体固定化为配体，并使用所述抗原作为分析物。顺便一提，将人嵌合#32A1抗体用作对照抗体。关于其制备方法和其重链和轻链序列的信息，在WO 10/117011中描述了人嵌合#32A1抗体。通过胺偶联方法，以约50 RU，将人嵌合#24A3抗体或人嵌合#32A1抗体结合至传感器芯片CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)，这经由固定化在其上面的抗-人IgG抗体(GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)实现。使用HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%表面活性剂P20)作为运行缓冲液。在具有与其结合的抗体的芯片上，以90 μL/min的流速添加抗原溶液的稀释系列(0.003-2 nM)进行233秒，随后，监测解离相3600秒。作为再生溶液，以10 μL/min的流速加入3 M MgCl2进行30秒。在数据分析中，使用分析软件(Biacore T200 Evaluation软件，1.0版)的1:1结合模型，并计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(KD; KD = koff/kon)。根据结果，人嵌合#24A3抗体具有1.7E-11 [M]的KD值，且人嵌合#32A1抗体具有1.4E-10 [M]的KD值。人嵌合#24A3抗体具有与大鼠#24A3抗体相当或更高的亲和力。此外，人嵌合#32A1抗体具有与大鼠#32A1抗体相当的亲和力。
10-2)人源化抗体的结合活性的评价
以与上面10-1)相同的方式，评价大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体对小鼠Siglec-15蛋白的结合活性。结果显示在表1中。
人源化的#24A3抗体具有与人嵌合#24A3抗体相当或更高的亲和力。
实施例11
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的嵌合抗体和人源化抗体对正常人破骨细胞的分化的影响
11-1)嵌合抗体对正常人破骨细胞的分化的影响
酒石酸盐抗性的酸性磷酸酶(TRAP)是其表达随着破骨细胞分化而增加的标志物，并且被认为从成熟的破骨细胞分泌。因此，通过测量破骨细胞的培养物上清液中的TRAP的活性，可以在体外评价试验物对破骨细胞的分化的影响。
根据细胞附带的方案，将正常人破骨细胞前体细胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号2T-110)以1 x 104个细胞/孔接种在96-孔板中。顺便一提，使用补充了OPGM补充集合(购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号PT-9501)的破骨细胞前体细胞的基础培养基(OPBM，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号PT-8201)作为培养基，含有胎牛血清(终浓度: 10%)、人RANKL (终浓度: 68.4 ng/ml)、人M-CSF (终浓度: 33 ng/ml)等。向该培养物上清液中，加入在实施例2中得到的大鼠#24A3抗体和在实施例6中制备的人嵌合#24A3抗体中的每一种，得到4、20、100或500 ng/ml的终浓度，并将细胞在CO2培养箱中培养5天。收集培养物上清液的75- μL等分试样，并向其中加入75 μL底物溶液(含有11 mg/ml磷酸对硝基苯酯和100 mM酒石酸钠的0.2 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0))，并将得到的混合物在室温温育30分钟。然后，向其中加入50 μL 2 N氢氧化钠溶液以停止酶反应，并测量在405 nm的吸光度，并用作TRAP活性的指标(图16)。结果，在4 ng/ml至500 ng/ml范围内的人嵌合#24A3抗体以浓度依赖性的方式抑制TRAP活性，并因而证实了人嵌合#24A3抗体会抑制人破骨细胞的分化。此外，该人嵌合抗体的抑制活性与原始大鼠#24A3抗体的抑制活性相当或比后者更高，且因此认为，与人源的嵌合没有造成活性的降低。
11-2)人源化抗体对正常人破骨细胞的分化的影响
通过在上面11-1)中描述的方法，可以检查大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的嵌合抗体和人源化抗体对正常人破骨细胞的分化的影响。
将正常人破骨细胞前体细胞以1 x 104个细胞/孔接种在96-孔板中。顺便一提，制备在培养基中的人RANKL，以产生66 ng/ml的终浓度。在该培养物上清液中，加入实施例9中得到的人源化的#24A3抗体(h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2e/L1、h#24A3-H2b/L3b和h#24A3-H2c/L2b)和在实施例6中制备的人嵌合#24A3抗体中的每一种，以得到4、20、100或500 ng/ml的终浓度，并将细胞在CO2培养箱中培养6天。收集培养物上清液的75- μL等分试样，并向其中加入75 μL底物溶液(含有11 mg/ml磷酸对硝基苯酯和100 mM酒石酸钠的0.2 M醋酸钠缓冲液(pH 5.0))，并将得到的混合物在室温温育20分钟。然后，向其中加入50 μL 2 N氢氧化钠溶液以停止酶反应，并测量在405 nm的吸光度，并用作TRAP活性的指标(图23)。结果，在20 ng/ml至500 ng/ml范围内的h#24A3-H2d/L1、h#24A3-H2e/L1和h#24A3-H2b/L3b，以及在4 ng/ml至500 ng/ml范围内的h#24A3-H2c/L2b，以浓度依赖性的方式抑制TRAP活性。此外，这些抗体的抑制活性与人嵌合#24A3抗体的抑制活性几乎相当，且因此认为，通过人源化几乎没有造成活性的降低。上面结果指示，人源化的#24A3抗体会抑制人破骨细胞的分化。
实施例12
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体对正常人破骨细胞的骨吸收活性的影响(生物活性的体外评价)
已知破骨细胞会释放诸如组织蛋白酶K等蛋白酶，并降解作为骨组织的构成成分的I型胶原。OsteoLyse 测定试剂盒 (由Lonza, Inc. 制造, 目录号PA-1500)提供了包被有铕-缀合的人胶原的96孔板(96-孔OsteoLyse细胞培养板)，通过测量当在板中培养破骨细胞时释放到上清液中的荧光胶原片段的量，有可能在体外评价破骨细胞的骨吸收活性。通过下面显示的方法，可以评价大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体对正常人破骨细胞的骨吸收活性的抑制作用。
根据细胞附带的方案，将正常人破骨细胞前体细胞(Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号2T-110)以1 x 104个细胞/孔接种在96-孔OsteoLyse细胞培养板中。顺便一提，使用补充了OPGM补充集合(购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号PT-9501)的破骨细胞前体细胞的基础培养基(OPBM，购自Sanko Junyaku Co., Ltd., 目录号PT-8201)作为培养基，含有胎牛血清(终浓度: 10%)、人RANKL (终浓度: 63.8 ng/ml)、人M-CSF (终浓度: 33 ng/ml)等。向该培养物上清液中，加入在实施例10中制备的大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体，得到0.8-500 ng/ml的终浓度，并将细胞在CO2培养箱中培养3-7天。收集培养物上清液的10- μL等分试样，并向其中加入200μL的荧光团释放试剂（包含在OsteoLyse 测定试剂盒中），并使用荧光平板读数器(ARVO MX，Perkin Elmer Inc. 制造)测量荧光强度(激发: 340 nm, 发射: 615 nm)，由此确定在培养物上清液中释放的游离荧光胶原片段的量。
实施例13
使用切除卵巢的大鼠对大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的生物学评价
通过下面描述的方法，可以评价在实施例9中得到的人源化抗体对切除卵巢的大鼠中的骨矿物质密度和骨吸收活性的下降的抑制作用
a)动物实验方案
从12周龄的雌性F344大鼠(得自Charles River Laboratories Japan, Inc.)切除2侧的卵巢，并将大鼠分成媒介物施用组和大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体施用组。此外，还准备一个组作为假手术组。在抗体施用组中，从手术次日开始以0.1-30 mg/kg的剂量单次地或重复地皮下施用抗体。从施用开始计起4周以后，在禁食条件下收集24小时的尿，并将尿样品在-80℃保存直至测量。尿收集结束以后，将大鼠安乐死，并从每只大鼠切离腰椎。
b)腰椎骨矿物质密度的测量
将附着于切离的腰椎的软组织除去，并提取第4节至第6节腰椎骨。使用骨光密度计(DCS-600EX，Aloka Co., Ltd.制造)测量骨矿物质密度，并与媒介物施用组和假手术组的骨矿物质密度进行对比，由此确定人源化抗体的作用。
c)尿脱氧吡啶啉排泄的测量
多种I型胶原交联的代谢物突出地反映了骨代谢更新，尤其是骨吸收。最重要的是，脱氧吡啶啉主要定位于骨胶原中，并因此被认为是骨吸收的非常可靠的指标。
融化冷冻保藏的尿样品，通过离心操作沉淀出不溶物，由此得到上清液。使用Osteolinks“DPD”(DS Pharma Biomedical Co., Ltd. 制造)测量在该上清液中含有的脱氧吡啶啉的量。此外，也测量上清液中的肌酸酐含量，并计算对于肌酸酐校正过的脱氧吡啶啉的量。将计算的脱氧吡啶啉的量与媒介物施用组和假手术组的量进行对比，由此确定人源化抗体的作用。
实施例14
大鼠抗-人Siglec-15单克隆抗体#24A3的人源化抗体的热稳定性的确定
使用示差扫描量热法(DSC)进行热稳定性的确定。将样品以0.5 mg/ml的浓度溶解在HBSor缓冲液(制备成含有25 mM组氨酸和5%山梨醇，pH 6.0)中，并将其400 μl等分试样用作用于DSC测量的样品溶液。DSC测量的条件设定如下。也就是说，将最初温度设定为20℃，将最终温度设定为100℃，将温度增加速率设定为200℃/小时，将过滤时间设定为2秒，并将反馈模式设定为低。使用HBSor作为参照溶液。使用GE Healthcare Bio-Sciences Ltd. (USA)制造的VP-Capillary DSC平台作为进行所有样品的DSC测量的仪器。从为每个样品溶液得到的扫描曲线减去基线(通过也在样品池中装填参照溶液所得到的扫描曲线)，由此进行基线校正。随后，使用从每个样品的分子量计算出的摩尔浓度，校准浓度。图24显示了h#24A3-H2d/L1抗体的热分析图，图25显示了h#24A3-H2e/L1抗体的热分析图，图26显示了h#24A3-H2b/L3b抗体的热分析图，图27显示了h#24A3-H2c/L2b抗体的热分析图。当将显示就每个热分析图中的最高峰而言的峰顶的温度用作热变性中点温度(Tm)时，h#24A3-H2d/L1抗体的Tm值为87.9℃，h#24A3-H2e/L1抗体的Tm值为89.3℃，h#24A3-H2b/L3b抗体的Tm值为88.9℃，且h#24A3-H2c/L2b抗体的Tm值为91.0℃。
工业适用性
本发明的嵌合的或人源化的抗-Siglec-15抗体具有抑制破骨细胞分化或骨吸收活性的能力，并且含有所述抗-Siglec-15抗体的药物组合物可以是异常骨代谢疾病的治疗剂或预防剂。
序列表自由正文
SEQ ID NO: 1: 编码#24A3重链可变区的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO: 2: #24A3重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 3: 编码#24A3轻链可变区的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID NO: 4: #24A3轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO: 5: 编码人κ链分泌信号和人κ链恒定区的核苷酸序列
SEQ ID NO: 6: 编码人重链分泌信号和人IgG2恒定区的核苷酸序列
SEQ ID NO: 7: 人嵌合#24A3抗体重链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 8: 人嵌合#24A3抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 9: 人嵌合#24A3抗体轻链的核苷酸序列
SEQ ID NO: 10: 人嵌合#24A3抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO: 11: h#24A3-H1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 12: h#24A3-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 13: h#24A3-H2的核苷酸序列
SEQ ID NO: 14: h#24A3-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 15: h#24A3-H3的核苷酸序列
SEQ ID NO: 16: h#24A3-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 17: h#24A3-H4的核苷酸序列
SEQ ID NO: 18: h#24A3-H4的氨基酸序列
SEQ ID NO: 19: h#24A3-H5的核苷酸序列
SEQ ID NO: 20: h#24A3-H5的氨基酸序列
SEQ ID NO: 21: h#24A3-H6的核苷酸序列
SEQ ID NO: 22: h#24A3-H6的氨基酸序列
SEQ ID NO: 23: h#24A3-L1的核苷酸序列
SEQ ID NO: 24: h#24A3-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 25: h#24A3-L2的核苷酸序列
SEQ ID NO: 26: h#24A3-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 27: h#24A3-L3的核苷酸序列
SEQ ID NO: 28: h#24A3-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 29: h#24A3-L4的核苷酸序列
SEQ ID NO: 30: h#24A3-L4的氨基酸序列
SEQ ID NO: 31: #24A3抗体的CDRH1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 32: #24A3抗体的CDRH2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 33: #24A3抗体的CDRH3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 34: #24A3抗体的CDRL1的氨基酸序列
SEQ ID NO: 35: #24A3抗体的CDRL2的氨基酸序列
SEQ ID NO: 36: #24A3抗体的CDRL3的氨基酸序列
SEQ ID NO: 37: h#24A3-H2b的核苷酸序列
SEQ ID NO: 38: h#24A3-H2b的氨基酸序列
SEQ ID NO: 39: h#24A3-H2c的核苷酸序列
SEQ ID NO: 40: h#24A3-H2c的氨基酸序列
SEQ ID NO: 41: h#24A3-H2d的核苷酸序列
SEQ ID NO: 42: h#24A3-H2d的氨基酸序列
SEQ ID NO: 43: h#24A3-H2e的核苷酸序列
SEQ ID NO: 44: h#24A3-H2e的氨基酸序列
SEQ ID NO: 45: h#24A3-L2b的核苷酸序列
SEQ ID NO: 46: h#24A3-L2b的氨基酸序列
SEQ ID NO: 47: h#24A3-L3b的核苷酸序列
SEQ ID NO: 48: h#24A3-L3b的氨基酸序列
SEQ ID NO: 49: #24A3抗体的突变CDRH3的氨基酸序列。

Claims (59)

1.一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且所述CDRH1包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述CDRH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述CDRH3包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或在其中包含1-3个氨基酸取代的氨基酸序列；且
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且所述CDRL1包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述CDRL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述CDRL3包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列。
2.一种抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于：
重链序列含有具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，且所述CDRH1包含由SEQ ID NO: 31表示的氨基酸序列，所述CDRH2包含由SEQ ID NO: 32表示的氨基酸序列，且所述CDRH3包含由SEQ ID NO: 33表示的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列；且
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，且所述CDRL1包含由SEQ ID NO: 34表示的氨基酸序列，所述CDRL2包含由SEQ ID NO: 35表示的氨基酸序列，且所述CDRL3包含由SEQ ID NO: 36表示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸残基1-121的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的氨基酸残基1-109的轻链可变区序列。
4.根据权利要求1-3所述的抗体的抗原结合片段，所述片段选自：Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
5.根据权利要求1-3所述的抗体，其特征在于是scFv。
6.根据权利要求1-4中的任一项所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗体是嵌合抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 8表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
8.根据权利要求1、2或4所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于所述抗体是人源化的。
9.根据权利要求6或8所述的抗体，其中所述重链具有人免疫球蛋白G2重链的恒定区，且所述轻链具有人免疫球蛋白κ轻链的恒定区。
10.一种抑制破骨细胞形成和/或破骨细胞性骨吸收的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：
(a)选自下述氨基酸序列的重链可变区序列：
a1)包含由SEQ ID NO: 12表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a2)包含由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a3)包含由SEQ ID NO: 16表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a4)包含由SEQ ID NO: 18表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a5)包含由SEQ ID NO: 20表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a6)包含由SEQ ID NO: 22表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a7)包含由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a8)包含由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a9)包含由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a10)包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的氨基酸序列；
a11)与选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
a12)与选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；和
a13)在选自a1)至a10)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和
(b)选自下述氨基酸序列的轻链可变区序列：
b1)包含由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b2)包含由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b3)包含由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b4)包含由SEQ ID NO: 30表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b5)包含由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b6)包含由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的氨基酸序列；
b7)与选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列具有具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
b8)与选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列具有具有至少99%的同源性的氨基酸序列；和
b9)在选自b1)至b6)的任一个氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
12.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
13.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
14.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
15.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
16.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
17.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-140的重链可变区序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-129的轻链可变区序列。
18.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
19.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 26表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
20.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 28表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
21.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 38表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
22.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 40表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
23.根据权利要求10所述的抗体或抗体的功能片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 42表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
24.根据权利要求10所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的氨基酸残基20-466的重链序列和含有由SEQ ID NO: 24表示的氨基酸序列的氨基酸残基21-234的轻链序列。
25.根据权利要求11-24中的任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链，所述重链包括从其羧基端末端的一个至几个氨基酸缺失。
26.一种药物组合物，其特征在于包含至少一种根据权利要求1-25所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于是异常骨代谢的治疗剂和/或预防剂。
28.一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的药物组合物，其特征在于包含至少一种根据权利要求1-25所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段和至少一个选自下述的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药、可溶性TNF受体、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。
29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中所述异常骨代谢选自：骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、癌性高钙血症、伴随多发性骨髓瘤或癌的骨转移的骨破坏、巨细胞瘤、骨质减少、牙周炎导致的牙缺失、假体关节周围的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破坏、骨佩吉特病、肾性骨营养不良和成骨不全。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、或伴随癌的骨转移的骨破坏。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其特征在于所述骨质疏松症是绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
33.一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的方法，其特征在于施用至少一种根据权利要求1-25所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段或根据权利要求27或28所述的药物组合物。
34.一种用于治疗和/或预防异常骨代谢的方法，其特征在于同时地或接连地施用至少一种根据权利要求1-25所述的抗体或所述抗体的抗原结合片段或根据权利要求27所述的药物组合物和至少一个选自下述的成员：二膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K2 (四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH (甲状旁腺激素)、非甾体类抗炎药、可溶性TNF受体、抗-TNF-α抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-PTHrP (甲状旁腺激素相关的蛋白)抗体或所述抗体的抗原结合片段、IL-1受体拮抗剂、抗-IL-6受体抗体或所述抗体的抗原结合片段、抗-RANKL抗体或所述抗体的抗原结合片段和OCIF (破骨细胞生成抑制因子)。
35.根据权利要求33或34所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症、伴随类风湿性关节炎的骨破坏、或伴随癌的骨转移的骨破坏。
36.根据权利要求35所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述异常骨代谢是骨质疏松症。
37.根据权利要求36所述的治疗和/或预防方法，其特征在于所述骨质疏松症是绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症、由使用诸如类固醇或免疫抑制剂等治疗剂导致的继发性骨质疏松症或伴随类风湿性关节炎的骨质疏松症。
38.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-25中的任一项所述的抗体。
39.根据权利要求38所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 1表示的核苷酸序列的核苷酸1-363的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列的核苷酸1-327的核苷酸序列。
40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其特征在于包含：含有由SEQ ID NO: 7表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列和含有由SEQ ID NO: 9表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
41.根据权利要求38所述的多核苷酸，其特征在于包含：
(a)选自下述核苷酸序列的多核苷酸：
a1)包含由SEQ ID NO: 11表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a2)包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a3)包含由SEQ ID NO: 15表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a4)包含由SEQ ID NO: 17表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a5)包含由SEQ ID NO: 19表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a6)包含由SEQ ID NO: 21表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a7)包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a8)包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a9)包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a10)包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；
a11)与选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
a12)与选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；
a13)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在严谨条件下与包含选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸杂交；和
a14)核苷酸序列，其包括选自a1)至a10)的任一个核苷酸序列中的一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加；和
(b)选自下述核苷酸序列的多核苷酸：
b1)包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b2)包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b3)包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b4)包含由SEQ ID NO: 28表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b5)包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b6)包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列；
b7)与选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列；
b8)与选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列具有至少99%的同源性的氨基酸序列；
b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在严谨条件下与包含选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸杂交；和
b10)核苷酸序列，其包括在选自b1)至b6)的任一个核苷酸序列中的一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加。
42.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
43.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
44.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
45.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
46.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
47.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
48.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-387的核苷酸序列。
49.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
50.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 25表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
51.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 13表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 27表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
52.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 37表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 47表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
53.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 39表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 45表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
54.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 41表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
55.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于包含：多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 43表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 23表示的核苷酸序列的核苷酸61-702的核苷酸序列。
56.一种载体，其包含根据权利要求38-55所述的任一个多核苷酸。
57.一种转化的宿主细胞，其包含根据权利要求38-55所述的任一个多核苷酸。
58.一种转化的宿主细胞，其包含根据权利要求56所述的载体。
59.一种生产根据权利要求1-25中的任一项所述的抗体，所述方法包括：培养根据权利要求57或58所述的宿主细胞，和从得到的培养产物纯化所述抗体。
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