CN113185579B - 一种fmod拮抗多肽及其衍生物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用，具体公开了一种FMOD拮抗多肽。所述FMOD拮抗多肽HL12‑FP1的氨基酸残基序列如SEQ ID No：1所示，Asp‑Tyr‑Thr‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Lys‑Phe‑Tyr‑Gly‑His SEQ ID No：1。该结合肽及其衍生物能结合FMOD，通过与FMOD的结合阻断其下游信号通路从而抑制结直肠癌的细胞的增殖、迁移和侵袭，为结直肠癌等提供有效的治疗小分子药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

Description

一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，涉及结直肠癌靶点FMOD受体拮抗多肽HL12-FP1及其衍生物与应用。

背景技术

1.1结直肠癌

结直肠癌作为最常见的恶行肿瘤之一，每年占据了癌症确诊率的10％。根据流行病学报告表明，结直肠癌的死亡率位列第四，位于肺癌、肝癌和胃癌之后。从1990年到2017年，全球结直肠癌的年龄标准化发病率增加了9.5％，而结直肠癌筛查措施的引入使得死亡率下降了13.5％。但是中国的中国的结直肠癌发病率和死亡率增幅都明显高于世界平均水平，中国结直肠癌发病数分别为10.7万和43.2万，发病率升高了84.1％。中国结直肠癌死亡数分别为7.6万和18.7万，死亡率升高了8.2％，而结直肠癌已经增长为中国的第三大癌症。目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，结直肠癌的病变过程可归纳为三种类型，其中染色体不稳定是主要的病变类型，基因APC的突变引起RAS激活和TP53丢失造成结直肠癌的形成。遗传和环境因素对结直肠癌的发生均具有重要的影响。日常生活中吸烟、饮酒过量，体重增加，以及红类和加工肉类的摄入会加速结直肠癌的发生

结直肠癌的治疗方法主要以内镜治疗、外科手术、放射疗法、化学疗法等为主，其中外科手术为结直肠癌治疗的基础和主要手段。但是仅适用于早期阶段，对于中晚期患者，手术治疗效果不佳。所以其他新兴的治疗方式：靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对CRC患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。

1.2FMOD与结直肠癌

FMOD中文名为纤调蛋白，属于富含亮氨酸重复序列蛋白聚糖家族(small-leucine-rich-proteoglycan，SLRP)。SLRP共包含了18种蛋白成员，根N末端富含半胱氨酸簇的空间结构，C末端富含半胱氨酸簇基序，基因在染色体上的分布位点划分为五类。其中FMOD的基因定位于1q32，编码的蛋白为大小59kDa的分泌型细胞外基质，归于SLRP第二类成员。作为细胞外基质的重要组成部分，FMOD参与多种生物学过程，例如：血管生成、细胞凋亡以及迁移侵袭。大量研究发现FMOD能够直接作用于TGF-β，并且局部调节该生长因子在局部基质中的功能作用。TGF-beta是一种重要的多功能细胞因子，大量临床数据表明它和肿瘤不良预后有重要关系，被认为是肿瘤发展过程中的重要因素。在正常组织中，FMOD是一种重要的血管生成因子，增强ANG2 and VEGF的表达，抑制ANG1的生成，从而促进伤口愈合以及血管再生。小细胞肺癌中是一种侵袭能力极高的恶性肿瘤，有研究发现FMOD在小细胞肺癌中出现异常表达，并且参与肿瘤血管的形成。同时在前列腺癌中，FMOD可能是一种潜在的肿瘤标志物。在结直肠癌中，从细胞和临床水平发现FMOD有高表达的趋势。

1.3噬菌体展示技术

噬菌体展示技术(phage display technology)是由Smith等人于1985年提出，并于1989年成功构建。噬菌体展示是一种选择技术，将多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合并展示在病毒粒子表面。噬菌体显示随机多肽库能够对多肽进行功能访问，并在显型(显示的肽)和基因型(编码DNA)之间提供物理连接；这些库可用于筛选过程中，结合克隆从非结合克隆通过亲和纯化分离。

噬菌体展示技术的原理，是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达，从而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面。被展示的蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于靶蛋白的结合，因而可以利用靶蛋白快速的进行噬菌体展示文库的筛选。在展示文库构建完成后，以靶蛋白为固定相，和展示文库共同孵育一段时间，洗去未结合噬菌体，再以竞争受体洗脱吸附的噬菌体。洗脱得到的噬菌体感染宿主菌繁殖扩增，然后进行下一轮洗脱。经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后(对于某些亲和力弱的抗体需经过更多轮的洗脱)，便可以得到能与靶蛋白特异性结合的噬菌体的高度富集。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。噬菌体展示技术适合用于全人源抗体药物的制备。治疗类风湿关节炎的抗肿瘤坏死因子α的Humira是第一个应用噬菌体抗体库技术生产的并被美国食品药品管理局批准的全人源抗体药物。到2014为止，被美国食品药品管理局批准的应用噬菌体抗体库技术生产的抗体有6个，且同时有30种以上的相关药物处于临床试验阶段。除筛选制备型抗体外，噬菌体抗体库技术也能被用于筛选相应抗原。因此，噬菌体展示技术抗体库因其具有的高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域正越来越受到的重视。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种FMOD拮抗多肽，该拮抗多肽与受体FMOD具有特异性高亲和力，能够通过与FMOD的结合来阻断FMOD的信号通路，证明该多肽在靶向抑制结直肠癌细胞增殖和迁移促进结直肠癌细胞凋亡等方面起着重要的作用，其在结直肠癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。

本发明的另一目的在于提供上述FMOD受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与FMOD受体具有特异性高亲和力，且特异性与FMOD结合。

本发明的再一目的在于提供上述FMOD拮抗多肽及其衍生物的应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

本发明一个方面提供了一种FMOD拮抗多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，

Asp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-His SEQ ID No：1。

上述FMOD拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用FMOD质粒转染293T细胞，获得永久高表达FMOD的稳定细胞系，以野生型293T细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取60个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链DNA测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。

本发明另一个方面提供了一种FMOD拮抗多肽的衍生物，所述的FMOD拮抗多肽的衍生物为FMOD拮抗多肽氨基酸侧链基团上、FMOD拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为FMOD拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；所述的标签优选为His、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。

所述的FMOD拮抗多肽的衍生物优选为：上述FMOD拮抗多肽末端进行酰胺化修饰。

亲水性分析表明，HL12-FP1为亲水性多肽；

所述的FMOD拮抗多肽及其衍生物可以来源于哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物(人类)；啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠，兔，马，牛，犬类，猫等。

所述的FMOD拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。

本发明再一个方面提供了一种多聚核苷酸，其编码SEQ ID No.1所述多肽。

本发明再一个方面提供了一种载体，其包含了本发明所述的核苷酸，可以通过基因技术手段与启动子序列链接。

本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，其转染了本发明所述的载体。

本发明再一个方面提供了一种药物，所述药物包含FMOD拮抗多肽或其衍生物。

在本发明的技术方案中，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

在本发明的技术方案中，所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。

在本发明的技术方案中，所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含FMOD拮抗多肽或其衍生物。

本发明再一个方面提供了前述FMOD拮抗多肽或FMOD拮抗多肽的衍生物的抗体。

本发明再一个方面提供了本发明所述的FMOD拮抗多肽、FMOD拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达FMOD的肿瘤细胞增殖的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了本发明所述的FMOD拮抗多肽、FMOD拮抗多肽的衍生物在制备促进高表达FMOD的肿瘤细胞凋亡药物中的用途。

本发明再一个方面提供了本发明所述的FMOD拮抗多肽、FMOD拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达FMOD的肿瘤细胞迁移的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，高表达FMOD的肿瘤细胞选自直肠癌细胞、结肠癌细胞、小细胞肺癌细胞、前列腺癌细胞、胆管癌细胞、胶质瘤细胞、子宫内膜癌细胞、肺癌细胞、胃腺癌细胞。

本发明再一个方面提供了本发明所述的FMOD拮抗多肽、FMOD拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达FMOD的肿瘤疾病的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，高表达FMOD的肿瘤疾病选自直肠癌、结肠癌、胆管癌、胶质瘤、子宫内膜癌、肺癌、胃腺癌。

在本发明的具体实验中，利用FMOD拮抗多肽HL12-FP1可以特异性的与高表达FMOD的细胞293T FMOD+/+结合。

在进一步试验中，利用高表达FMOD的结直肠癌细胞HCT-116作为细胞模型验证了FMOD拮抗多肽HL12-FP1的功能，与对照组相比，发现HL12-FP1可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116、LoVo等的增殖。

在本发明的另一具体实验中，采用transwell迁移实验检测发现FMOD拮抗多肽HL12-FP1抑制结直肠癌细胞迁移。

有益效果

(1)本发明提供了一种FMOD拮抗多肽HL12-FP1及其衍生物，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与FMOD结合，并特异性与FMOD结合抑制FMOD信号通路。

(2)本发明筛选得到的FMOD拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断FMOD的信号通路抑制结直肠癌细胞增殖和迁移，促进结直肠癌细胞发生凋亡，可以作为FMOD结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和/或治疗FMOD高表达的肿瘤药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

附图说明

图1：HL12-FP1多肽的质谱分析以及高效液相色谱分析结果图；

图2：HL12-FP1多肽和FMOD结合分析；

图3：HL12-FP1对结直肠癌细胞等增殖抑制分析；

图4：HL12-FP1对结直肠癌细胞等增殖抑制分析；

图5：HL12-FP1对结直肠癌细胞等迁移能力的抑制分析。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1进行FMOD拮抗多肽HL12-FP1的淘选、扩增、纯化、测序及合成。

本实施例主要是为了筛选获得与FMOD特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链DNA(ssDNA)进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽HL12-FP1。

具体如下：

1.建立永久高表达FMOD的293T细胞系：293T-FMOD^+/+

①选取生长旺盛的可发光的人293T细胞，在转染前一天以5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；

②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；

③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600uL的opti-MEM培养基；

④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；

⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；

⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达FMOD的293T细胞系。

⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μgRNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。

所用特异引物序列为Hu-FMOD引物序列：

Fw 5’-GTTCCCTCCCGCATGAAGTAT-3’SEQ ID No：2

Rv 5’-TGGCATTGTCAAAGACGCCT-3’SEQ ID No：3

⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble RNA的做比较，检测FMOD的高表达水平，并命名为：293T-FMOD^+/+，即可以用于阳性噬菌体筛选。

2.进行FMOD拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成

①ER2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μL LB-Tet液体培养基于1.5mL灭菌离心管中，再从E.coli ER2738的甘油冻存物中取0.2μL菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于LB-Tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3mL LB-Tet液体培养基的10mL灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10mL灭菌离心管，无菌操作加入3mL LB-Tet液体培养基，取30μL过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(OD₆₀₀～0.5)。

②FMOD拮抗肽的淘选：将高表达FMOD细胞按10⁵个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60×15mm²培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达FMOD的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μL测滴度，剩下的将其加入到20mL LB培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于-20℃保存。

③测定噬菌体的滴度：取4支灭菌的10mL离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(Agarose Top)，每管加入3mL顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块LB/IPTG/Xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将OD₆₀₀～0.5的E.coli ER2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μL/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5mL离心管，分别盛有100μL、90μL、90μL、90μLLB-Tet培养基，将待测噬菌体吸取1μL入100μL LB-Tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μL待滴定的各稀释度的噬菌体与200μLE.coli ER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LB/IPTG/Xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

④洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250mL的锥形瓶，按1∶100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至20mL LB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50mL离心管中，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃10,000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的PEG/NaCl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃，12000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1mLTBS重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2mL离心管中，4℃10000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的PEG/NaCl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12000rpm离心20min，去掉上清；用200μL TBS重悬沉淀，4℃10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括(1)按1∶100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至2mLLB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10,000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。

⑤琼脂糖凝胶电泳鉴定M13噬菌体ssDNA：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取DNA电泳用琼脂糖1g放入250mL的三角烧瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μL，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100mL；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用Loading buffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。

⑥ssDNA测序及序列分析：将提取的M13噬菌体ssDNA送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行DNA测序。测序以后用Bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，序列为Asp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-His，以HL12-FP1表示，最后短肽由合肥国肽生物科技有限公司。

图1为HL12-FP1多肽的质谱分析以及高效液相色谱分析结果图，该多肽分子质量为1885.01，合成纯度＞95％。

实施例2免疫荧光检测噬菌体单克隆和FMOD结合

①在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

②用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

③0.5％TritonX-100(PBS配制)室温通透20min；

④PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

⑤吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

⑥加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；

⑦加稀释好的HL12-FP1-FITC，，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。

⑧复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min 4次洗去多余的DAPI；⑨用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

在本实施例中，选用的细胞为人结直肠癌细胞Lovo细胞、小鼠结直肠癌细胞CT26细胞、人克隆结肠腺癌细胞Caco细胞、人结肠癌细胞HCT116细胞以及人肾上皮细胞293T细胞。

图2为共聚焦结果，FICT(激发光为488nm)为标记结直肠癌细胞，TRITC为靶向FMOD一抗的荧光二抗(激发光为555nm)，DAPI(激发光为405nm)显示为细胞核，MERGE图片中的橙黄色部分为FITC和TRITC重合部位。

该结果证明HL12-FP1多肽与高表达HCT116细胞、Lovo细胞、CT26细胞等结直肠癌细胞通过FMOD有效结合，并且对293T细胞不具有明显的结合能力。

实施例3HL12-FP1可以显著抑制结直肠癌细胞的增殖

①将结直肠癌细胞HCT-116以5×10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(2mM，1.5mM，1mM，0.8μM，0.4μM，0.2μM，0.1μM)的HL12-FP1多肽分别培养48小时；

③每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μLDMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

发明人实验室在前期工作中，通过westernblot试验检测发现结直肠癌细胞HCT-116高表达FMOD。

采用相同的方法测试293T细胞、293T FMOD⁺细胞、LoVo细胞、CT26细胞。

图3显示HL12-FP1对结直肠癌细胞的增殖抑制能力要显著性高于293T细胞。

图4显示，不同浓度的HL12-FP1短肽可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖，并且随着作用浓度的增加，短肽抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖的作用也更为显著。ABCD分别为HL12-FP1短肽对293T-FMOD^+/+、HCT116、LoVo、CT26四种细胞的增殖抑制能力分析。

实施例4HL12-FP1可以显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1-2遍)，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×10⁵/mL；

③取细胞悬液100μL加入Transwell小室；

④24孔板下室一般加入600μL的培养基，并加入一定浓度的HL12-FP1；

⑤培养细胞：常规培养48h

⑥取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。10倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

图5显示一定浓度的HL12-FP1多肽可以显著抑制HCT116等结直肠癌细胞的迁移能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用

<130> CP121010290C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Lys Phe Tyr Gly His

1               5                   10

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttccctccc gcatgaagta t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcattgtc aaagacgcct 20

Claims (15)

1.一种FMOD拮抗多肽，其特征在于：所述FMOD拮抗多肽的氨基酸残基序列如SEQ IDNo:1所示，

Asp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-His SEQ ID No：1。

2.一种多聚核苷酸，其编码权利要求1所述的FMOD拮抗多肽。

3.一种载体，其包含了权利要求2所述的多聚核苷酸。

4.一种宿主细胞，其转染了权利要求3所述的载体。

5.一种药物，所述药物包含权利要求1所述的FMOD拮抗多肽。

6.根据权利要求5所述的药物，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物，所述药学上可以接受的载体为赋形剂。

8.根据权利要求6所述的药物，所述药学上可以接受的载体为崩解剂、表面活性剂。

9.根据权利要求6所述的药物，所述药学上可以接受的载体为湿润剂、粘合剂、稀释剂、吸附载体、吸收促进剂、润滑剂。

10.根据权利要求6所述的药物，所述药学上可以接受的载体为填充剂。

11.一种检测试剂，所述检测试剂中包含权利要求1所述的FMOD拮抗多肽。

12.权利要求1所述的FMOD拮抗多肽在制备抑制高表达FMOD的肿瘤细胞增殖、迁移的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，高表达FMOD的肿瘤细胞选自直肠癌细胞、结肠癌细胞。

14.权利要求1所述的FMOD拮抗多肽在制备治疗高表达FMOD的肿瘤疾病的药物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，高表达FMOD的肿瘤疾病选自直肠癌、结肠癌、胆管癌、胶质瘤、子宫内膜癌、肺癌、胃腺癌。

Images