CN113480603B - 一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，属于生物医药技术领域，所述短肽的氨基酸序列如SEQ I D NO：1所示。所述短肽可有效识别并特异性结合脑胶质瘤细胞系U251，具备作为靶向配体用于传递药物至脑胶质瘤部位的可行性。本发明还提供了一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因及其在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用。

Description

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽、编码基因及其应用。

背景技术

脑胶质瘤是原发性最常见的颅内瘤，占中枢神经系统肿瘤的30％以上，其发病率和致死率均较高。脑胶质瘤是大脑和脊髓的侵袭性肿瘤，起源于神经外胚层间叶，它们可以在脑实质中生长，并干扰正常的脑组织，根据统计2000-2017年期间，在美国每10万人中大约有6人患此病。目前常用的治疗方式包括手术切除及放化疗。然而由于其生长部位在脑部，并且脑部特有的血脑屏障可屏蔽大部分的治疗药物，手术切除受限,药物治疗的局限性及残余肿瘤细胞的潜在复发性，导致其中位生存率低，复发率高。目前一种新的治疗方案，靶向治疗已经出现，它依赖于识别特定的肿瘤靶向，并有效地传递药物到肿瘤部位，并且最近报道了靶点治疗的可行性研究，它可减低药物毒性，加强术后的恢复和减少复发的几率。靶点治疗依赖于肿瘤特异性结合，但已知的天然受体-配体对非常的有限。

噬菌体展示肽库中可包含多达10¹⁴个噬菌体，用来通过与目标结合、筛选确定最具特异性的多肽。这项技术在2018年获得了诺贝尔化学奖。噬菌体展示肽库由大量的特定片段插入特定DNA片段的噬菌体组成，其表面可展示不同的肽或蛋白，从而与各种靶分子的多肽配体可通过体外或体内筛选得以快速鉴定。这项技术为寻找目前没有的天然特异性配体打开了大门。目前已经有大量的用于靶点治疗和体内成像领域的多肽，通过噬菌体展示肽库技术被筛选出来。目前有Ivy A.W.Ho和Kam M.Hui利用此技术得到的靶向到胶质母瘤细胞的多肽GL1(Peptides 31(2010)644–650)，Maija Hyvonen、Juulia Enback等人得到可靶向到恶性胶质母瘤的多肽MDGI(Models and Technologies 3(2014)10.1158/1535-7163)，但以上研究均侧重对胶质母瘤的靶向配体的淘选，针对脑胶质瘤U251细胞系所淘选出来的天然配体还未有报道。

发明内容

为了解决脑胶质瘤U251细胞的靶向治疗问题，本发明提供了一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，可有效识别并特异性结合脑胶质瘤细胞系U251，具备作为靶向配体用于传递药物至脑胶质瘤部位的可行性。

本发明还提供了一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，所述短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体氨基酸序列为：WTWEYTK。

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因。

进一步的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码基因的核苷酸序列具体为：TGGACGTGGGAGTATACGAAG。

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用。

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽在制备脑胶质瘤靶向药物递送系统中的应用。

一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用。

一种表面展示靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的噬菌体，所述噬菌体为含有所述短肽的噬菌体单克隆。

一种试剂盒，所述试剂盒包含所述短肽和/或所述编码基因。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1.本发明一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，该短肽可有效识别并特异性结合脑胶质瘤细胞系U251，而对正常细胞bEnd.3，M1800-57，HUVEC和其他肿瘤细胞U87，SKOV-3，HepG2的结合能力弱，表现出针对脑胶质瘤精准的识别和结合能力。

2.本发明一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，在原位脑胶质瘤荷瘤裸鼠体内可以选择性地富集在脑肿瘤部位，表现出良好的体内靶向特性，具备靶向传递药物及基因至脑胶质瘤病灶区域的能力，且短肽具有分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力的普遍特点，结合该短肽对脑胶质瘤体外体内良好的靶向能力，是一种能穿透血脑屏障而到达脑胶质瘤的靶向传递系统，可应用于制作预防或治疗脑胶质瘤的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1噬菌体单克隆与U251细胞体外结合实验滴度图；

图2候选短肽的噬菌体单克隆与其他细胞的体外结合实验及ELISA实验结果图：其中，A部分为候选短肽的噬菌体单克隆与其他细胞的体外结合实验，噬菌体的相对结合力＝TU_{待测噬菌体克隆}/TU_{空白对照噬菌体})，B部分为ELISA酶联免疫吸附实验，OD噬菌体的相对结合力＝

OD_{待测噬菌体克隆/}OD_{空白对照噬菌体})；

图3荧光短肽及荧光分子与U251细胞和bEnd.3细胞的免疫荧光检测图：其中，A部分为荧光短肽及荧光分子与U251细胞的免疫荧光检测图，B部分为荧光短肽及荧光分子与bEnd.3细胞的免疫荧光检测图；

图4流式细胞仪检测短肽的荧光强度图；

图5短肽在荷瘤裸鼠体内不同时间的分布图；

图6短肽在裸鼠各组织器官中的分布图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽进行详细说明。

实施例1

噬菌体展示随机七肽库的体外筛选及噬菌体单克隆DNA的测序及分析

(1)以脑胶质瘤细胞U251为靶标的噬菌体展示七肽库筛选实验流程

取出已培养好的脑胶质瘤细胞系U251细胞，在无血清培养基中培养2h。孵育结束之前，将原始七肽库10μL(2×10¹¹pfu)稀释到990μL PBS+-BSA中，制备噬菌体肽库液，随后加入到细胞中，放置在细胞培养箱中孵育2h。除去未与细胞结合或非特异性结合的噬菌体，将细胞完全消化下来，加入裂解液和灭菌甘油-20℃保存。取10μL进行噬菌体滴度测定，取一半洗脱液进行扩增。逐轮增加洗涤强度有利于洗脱非特异性结合噬菌体，保留有较强结合力的噬菌体。通过滴度测定分别统计五轮筛选后回收噬菌体的量。

(2)噬菌体单克隆扩增及DNA的提取及测序

取一部分回收噬菌体与过夜菌加入到LB-tet液体培养基中，在37℃恒温空气震荡培养箱中避光震荡培养，进行扩增并测滴度。在回收噬菌体的滴度板上，选取蓝斑数不到100的平板，用枪头挑取一颗蓝斑放入以震荡培养1h的菌液中，确保蓝斑在液体中进行扩增。培养物就是扩增的噬菌体单克隆，其DNA提取通过M13噬菌体DNA提取试剂盒完成，提取好的DNA放置-20℃冰箱保存。待测噬菌体单克隆DNA模板样品，送至上海生工生物有限公司测序部进行DNA的测序。测序过程使用噬菌体展示肽库试剂盒中的-96gⅢ测序引物，所用测序仪器为ABI-PRISM3730，测序试剂为BigDyeterminator v3.1。

结果1

经过五轮体外淘选，噬菌体在第三轮开始明显富集，是第一轮58倍的，到第四轮富集最多，达到第一轮富集的408倍，到第五轮的时候富集有所降低，但仍然是第一轮的367倍(图1)。在第三、四、五轮的回收噬菌体滴度板上，随机挑取蓝斑进行噬菌体单克隆的扩增、纯化、DNA的提取及测序。其中展示肽WSLGYTG短肽序列的相应噬菌体单克隆P3-1在第三、四、五轮中出现率最高，重复率为50％，而携带WTWEYTK展示短肽的噬菌体单克隆P4-2和携带GNHLMYV展示短肽的噬菌体单克隆P4-3均在第四轮出现，并重复率都为3.7％。此外第四轮扩增及第五轮回收噬菌体板上出现大量的透明斑污染，故第五轮的测序结果就忽略不计。

实施例2

噬菌体单克隆的体外靶向性鉴定

(1)酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定噬菌体单克隆对不同细胞的亲和力

将细胞接种于96孔板中，在无血清培养基中37℃孵育。用PBS清洗两遍，再加入4％多聚甲醛，常温固定后用PBS清洗三遍，加入3％BSA-PBS,4℃下封闭细胞。先将噬菌体稀释到10¹⁰TU，细胞中加入稀释噬菌体，37℃下孵育，每组设置4个平行，进行2-3次重复实验以M13空白噬菌体组作为对照组。用PBST清洗未结合的噬菌体，清洗后加入用3％BSA-PBS稀释的HRP/M13噬菌体单抗复合物，37℃孵育。用PBS清洗两遍，每孔加入即用型TMB显色液，避光室温孵育，颜色显到预期深浅。加入H₂SO₄溶液终止反应，酶标仪设置在450nm波长下测定各孔吸光值。

(2)体外结合实验鉴定噬菌体克隆对不同细胞的结合特异性

将细胞接种在24孔板上，与无血清培养基在37℃孵育。孵育后用PBS清洗两遍，加入3％BSA-PBS稀释的10¹⁰TU噬菌体单克隆。每组设置2-3个平行，进行2-3次重复实验，以M13空白噬菌体组作为对照。用PBST漂洗后加入EDTA将细胞彻底消化下来。转入微量离心管中离心后，弃去上层液体，加入裂解液和同等体积的灭菌甘油保存，待测滴度，-20℃保存。

结果2

将第四轮中的噬菌体单克隆与U251细胞进行体外结合实验，得到三个结合能力最强的噬菌体单克隆(图1)，分别是P3-1，P4-2，P4-2。再将P3-1，P4-2，P4-3噬菌体单克隆进行ELISA酶联免疫吸附实验及与其他细胞的体外结合实验，来鉴定其对靶细胞的选择特异性(图2)，ELISA和体外结合实验结果中，P4-2对U251细胞结合能力最强而对其他癌细胞及正常细胞的的结合能力较弱。

通过竞争抑制实验发现，低浓度0.01μM的两条短肽WSLGYTG和GNHLMYV即可抑制20％-30％的相应噬菌体单克隆的结合，浓度达到1000μM时，两条短肽的抑制能力可以达到95％左右。WTWEYTK(对应于图1中P4-2)短肽的抑制能力相较其他两条短肽比较弱，但也可明显的抑制噬菌体单克隆的结合，随着短肽浓度的逐渐变大，抑制能力也随之更明显，在短肽浓度达到1000μM时，WTWEYTK短肽对噬菌体单克隆的抑制能力达到80％左右。竞争抑制实验结果表明，结合在靶细胞上配体位置的是所携带的DNA序列片段而不是噬菌体本身。

实施例3

短肽的体外靶向结合能力

由上海波泰生物技术公司合成三条候选短肽及随机短肽，并在短肽N末端修饰FAM荧光基团，用于免疫荧光及流式细胞实验。将U251细胞10⁴个接种在玻底皿中，待细胞完全贴壁生长后，可用于体外靶向性的鉴定实验。将玻底皿中的细胞在无血清培养基中孵育后再加入3％BSA+PBS封闭，加入0.1％Triton通透后，与荧光短肽避光共孵育1h，再加入DAPI进行细胞核的复染，激光共聚焦显微镜上进行观察。

流式细胞的实验过程也需要将U251细胞接种在6孔板上，在无血清培养基中培养后再与荧光短肽孵育，将细胞消化下来离心，再加入250μLPBS后在流式细胞仪上进行计数。

结果3

荧光短肽FAM-WTWEYTK与U251细胞作用，相较与其他几条荧光短肽FAM-WSLGYTG，FAM-GNHLMYV，FAM-CONTROL(随机从NO.3轮中选出)和FAM染料(图3)，表现有最强的荧光染色，同时对正常细胞bEnd.3细胞的染色弱。流式细胞计算细胞上所结合的短肽的荧光强度结果(图4)，也表明WTWEYTK短肽表现出对U251细胞的更强的特异性结合能力。

实施例4

短肽的体内靶向能力鉴定

在4周龄裸鼠头部接种10⁶个U251细胞，并用骨蜡封好头骨，饲养一周后，原位脑胶质瘤荷瘤裸鼠模型成功建立。将100mM的FAM和FAM-WTWEYTK短肽通过尾部静脉注射到裸鼠体内，利用IVIS小动物活体荧光检测仪器在不同时间点测定荧光强度，24h后将裸鼠解剖，分别测定脑及其他组织器官的荧光强度。

结果4

FAM及FAM-WTWEYTK荧光短肽在尾部静脉注射入裸鼠体内(图5)1h时，均表现出全身的弥散，而随着时间增长，FAM表现出在体内的快速代谢，而FAM-WTWEYTK短肽可以在体内更长时间的存留；24h后脑肿瘤部位(图6)的FAM-WTWEYTK也表现出更高的聚集，可见WTWEYTK短肽在体内也具有很好的靶向到脑胶质瘤的能力。

附图1的详细说明：

图1为在NO.4轮筛选得到的携带DNA片段的噬菌体单克隆中，随机挑选8条进行与U251细胞的结合能力测定，因为P3-1与P4-1为携带同一DNA片段的噬菌体单克隆，故此实验用P3-1进行；P4-2到P4-8分别为NO.4轮中随机挑选出的噬菌体单克隆。

综上所述，本发明利用噬菌体展示肽库技术体外淘选得到一条可靶向到脑胶质瘤U251细胞系的七肽，并对此短肽的体外和荷瘤裸鼠体内靶向特性进行了鉴定，考察得出其具有作为靶向配体用于传递药物至脑胶质瘤部位的可行性。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因。

3.根据权利要求2所述的一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种如权利要求1所述的靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽在制备脑胶质瘤靶向药物递送系统中的应用。

5.一种如权利要求2所述的编码基因在制备脑胶质瘤靶向药物递送系统中的应用。

6.一种表面展示靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为含有如权利要求1所述的短肽的噬菌体单克隆。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的短肽和/或如权利要求2所述的编码基因。

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