CN108752425A - 利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。选用Ph.D.‑C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库。本发明方法所构建的文库阳性克隆率远高于随机多肽文库，筛选和验证所需时间周期大大缩短，具有高通量的优势。

Description

利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及噬菌体展示、细胞培养技术、原核表达文库构建和分子荧光技术，具体涉及利用噬菌体展示技术筛选细胞穿透多肽的方法以及利用筛选得到的多肽构建原核表达文库，从而对多肽的穿透能力进行验证和比较的方法。
技术背景
细胞膜是一种具半透性的生物膜，其特性构成了细胞内外物质选择性交换的基础，因而对于维持细胞的生存和正常功能的发挥具有关键性作用。然而，由于存在着这一天然的有效屏障，一些被证明具有良好治疗效果和疾病诊断价值的生物大分子和传感分子，例如非脂溶性的蛋白、抗体、多肽、核酸、极性药物分子、探针以及显像剂等却很难到达细胞内发挥应有的作用。尤其在目前肿瘤药物靶向的治疗研究中，已开发出来的肿瘤单克隆抗体由于只能与细胞膜表面的特异性表位结合，难以携带药物分子进入细胞内部，从而使得细胞内输送载体的研究也成为该领域关注的焦点。目前已得到应用的显微注射、脂质体转染、病毒包被、化学修饰等方法，虽然能够将物质导入细胞，但是都不同程度地存在着分子活性下降、导入效率低下、细胞种类受限以及造成细胞损伤等问题，多停留在实验室研究阶段，难以推广和应用于临床治疗。
上世纪末以来，细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)得到了陆续发现和深入研究，这一领域开启了细胞内输送载体研究的新纪元，细胞穿透肽亦被证明是目前实现细胞内运输最为有效的手段之一(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。关于CPPs的首次报道出现在1988年，Frankel等发现来源于人免疫缺陷病毒HIV-1转录激活因子的蛋白Tat具有穿透细胞膜和核膜，并锚定于特异基因调控区的能力(Cell,1988,55:1189-1193)。随后研究还发现，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR发挥了蛋白转运的作用(JBiol Chem,1997,272:16010-16017)。此后，来源于果蝇触角蛋白(antennapediaprotein ofDrosophila)的多肽penetratin被首次成功地运用于外源性肽类的细胞内输送(J Biol Chem,1994,269:10444-10450)。后续的研究证实，CPPs可以有效的将亲水性蛋白质、多肽、核酸片段大分子物质，极性化学分子甚至量子点等，导入种类广泛的细胞中，不仅能够保证活性分子正常发挥作用，并且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。尤其是某些CPPs能够携带货物分子穿过血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等人体重要的屏障系统发挥作用(Chem Commun,(Camb.)2005,3144-3146)。因而，CPPs作为有效的生物活性分子细胞内外转运工具，在细胞生物学、细胞免疫学、药物开发、基因生物治疗以及肿瘤靶向治疗等研究领域，均具有广阔而重要的应用前景(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。
目前，已经得到报道的CPPs已有上百条之多，其来源主要包括来自于转录因子、病毒蛋白肽段的天然分子以及人为设计合成等几大类。由于部分天然的CPPs具有效率差异、缺乏细胞特异性等缺点，利用现代生物信息学方法，借鉴CPPs的天然结构，通过分子模拟和分子设计对其进行改造，已经成为CPPs研究的一项重要方向。已有一些实验室依据某类CPPs的结构，合成得到了较原有分子穿膜性能更强的序列(Cancer Res,2001,61:474-477)。但是从总体上来看，已发现的CPPs具有分布广泛、长度不一、序列特征各异等结构特点。迄今为止，对于CPPs结构特征的规律性认识仅仅停留在：大多数分子含有精氨酸和赖氨酸，从而在生理条件下带有相当数量的正电荷；分子中含有一定的α-Helix结构等。鉴于对CPPs结构特征认识的局限性，使得对于CPPs分子改造以及预测工作缺乏有效的依据和明确的方向。
由于CPPs的发现为细胞膜的结构和功能提供了极佳的研究工具，因而对于CPPs的穿膜机制的研究也得到了大量的开展。现有的结果显示，CPPs内化的机制主要涉及三条途径(Cell Mol Life Sci.2005,62:1839-1849)：一是CPPs通过细胞脂质双分子层直接进入细胞内；二是CPPs在细胞表面形成特定的跨膜结构实现转运，比如微团模式，打孔模式等；三是内吞介导的内化模式，其中又可能涉及网格蛋白、胞膜窖和巨胞饮介导等具体内吞方式。上述三种途径中，内吞介导的内化模式目前被认为是大多数CPPs进入细胞的主要途径，也是研究最深入的一条途径。但是对于某一条CPPs(例如研究最为透彻的Tat)的穿膜途径而言，由于实验方法和条件的不一致，不同的研究机构和组织往往得到了不同的结论。另外，有研究发现，CPPs乃至货物分子的长度、电荷等都会对其具体的穿膜机制产生影响。由于上述因素的存在，加之研究手段的落后和实验条件的差异，使得对于CPPs的穿膜机制这一问题尚未取得统一的认识。
综上所述，目前CPPs的研究存在如下不足：
首先，已知CPPs的数量还比较有限，其结构特点呈现复杂性，二者加大了对其结构共性和规律性寻找的难度；
其次，CPPs来源广泛，现有的序列多来自于分散而独立报道，研究时间周期较长，且数据来源缺乏系统性；
再次，研究手段的有限、实验条件的差异以及影响因素的多样化，使得关于CPP穿膜机制的问题至今还广存争议；
最后，现有知识提示CPPs的存在具有普遍性，大量的成员仍然未知。已报道的CPPs的穿膜能力大多缺乏细胞特异性，细胞内稳定性差，不利于靶向性治疗的应用。
因此，针对CPPs开展高通量的筛选工作，一方面可以快速获取大量关于CPPs序列结构的特征，加快对CPPs作用机制和结构功能研究，另一方面能够快速获取具有更优越载体性能的CPPs，对CPPs在临床药物开发领域的应用将具有重大的意义。
噬菌体展示是一种用于筛选功能性多肽的蛋白质组学生物技术，通过将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白相融合表达，实现了表现型(蛋白质)与基因型(DNA)的有效统一，近年来这项技术不断得到创新性发展。利用噬菌体随机肽库，筛选包含具有某种功能特征多肽的噬菌体，可以模拟DNA分子序列进化达到优化筛选过程的目的。利用该技术将CPPs穿膜特性活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，通过全细胞淘选模式，可以有效富集具有穿透细胞膜特性的多肽，并在此基础上构建得到具有信息多样性的CPPs文库。另外，CPPs与生物大分子的结合常可采用三种不同的方式：一是将货物分子即目的基因的cDNA连接于穿透肽基因的N末端，以携带有该融合基因的表达载体转染真核细胞，利用真核细胞自身的蛋白表达系统表达转染的融合蛋白，然后再将这些蛋白分泌到胞外，转导至周围细胞，但该方法中蛋白的表达和转导效率较低；二是利用多肽合成法，将穿透肽与目的多肽、蛋白质等分子体外共价结合，以获得较高纯度的融合蛋白，但该方法成本相对较大，不适用于大规模的筛选和验证；三是将货物蛋白的cDNA克隆入含CPPs基因的原核表达载体，通过原核细胞的蛋白表达系统表达融合蛋白，这种方法具有操作简便，实验花费少，转导效率高，适合于大量制备的优点。因此，通过构建原核表达文库，借助融合标签标准化操作表达纯化蛋白能够快速低廉地获取大量多种重组蛋白，借助绿色荧光蛋白的失踪作用能够方便对蛋白的定位进行观察，特别适合于大量CPPs穿膜功能的验证和研究。但是我们前期的工作证实，针对随机原核表达文库的筛选验证，存在着阳性率很低，耗费大量人力和时间的突出问题。
发明内容
本发明目的是提供一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，文库阳性克隆率远高于随机多肽文库，筛选和验证所需时间周期大大缩短，具有高通量的优势。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现：
提供一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。
本发明所述的噬菌体展示技术，其原理是将编码多肽的DNA片段与噬菌体衣壳蛋白编码基因进行重组，并以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。基于生物分子与靶分子的亲和力，通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，将含有能与靶分子特异结合的噬菌体从表达各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，然后进行富集、扩增及基因序列测定，从而获得外源蛋白的氨基酸组成。
优选的，上述利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，选用Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库；
所述全细胞筛选模式是指以培养细胞为对象，加入噬菌体随机环七肽库进行的筛选。
本发明所述的筛选具有细胞膜穿透活性的多肽是指该筛选的基础并非如常规的是利用生物分子与靶分子(抗体，受体，抗原，酶的底物等)的亲和力，而是基于多肽文库中的CPPs携带噬菌体颗粒穿透细胞膜进入细胞内的能力。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，包括如下步骤：
0.以噬菌体随机环七肽库作为噬菌体筛选基，令筛选次数n＝1，进入步骤a；
a.将噬菌体筛选基加入培养细胞上清中孵育1-2小时；
b.冰上终止反应，弃去上清中未结合噬菌体；
c.培养基洗涤细胞10次以上，以去除细胞表面噬菌体；
d.胰酶消化细胞至圆缩，再进行离心处理，之后反复洗涤细胞3-5次，以去除与细胞膜有特异性结合的噬菌体；
e.细胞沉淀置于液氮和37℃恒温水浴锅中反复冻融5-10次，在每次冻融过程中分别震荡30秒；然后
向冻融物中加入含表面活性剂的缓冲液，于室温作用1小时以上，以裂解细胞；
f.离心后的裂解上清即为淘选分离液，取100μl淘选分离液测定噬菌体滴度；向其余裂解液中加入对数期大肠杆菌以及含有抗生素的LB培养基10-50ml，再于37℃剧烈振摇培养4-6小时；
g.离心培养物，将70％-90％的上清液上部转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，并于4℃沉淀过夜；
h.沉淀物重悬于含0.02％NaN3/TBS缓冲液中，离心上清，再用1/6体积的PEG/NaCl二次沉淀；
i.沉淀物重悬后离心，上清转入新的离心管，即得到噬菌体扩增液，测定噬菌体滴度；
j.判断筛选次数n是否小于或者等于筛选截止次数s，s为自然数，如果是，则进入步骤l；如果否则进入步骤k；
k.以步骤i得到的噬菌体扩增液作为噬菌体筛选基，令n＝n+1，返回步骤a；
l.提取经过筛选过后的噬菌体总DNA；
m.用含有酶切位点的上下游引物，以提取的噬菌体单链DNA为模板，扩增目的片段，插入带有荧光蛋白DNA的原核表达载体中；
n.将连接产物转化入原核表达菌株中，即得到细胞穿透肽原核表达文库。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，噬菌体滴度测定方法为：
1).接种大肠杆菌菌落于培养基中，37℃剧烈振摇，培养至对数中期；
2).取噬菌体淘选分离液和扩增液，在培养集中进行10倍系列稀释，稀释范围为109-1011；
3).当细菌培养物达对数中期时，分成100-200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管；
4).向离心管中每管加入10-20μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育感染；
5).将感染的细菌加入预温的顶层琼脂玻璃试管中，每次一管，快速混匀，在6分钟内倾注于37℃预温的筛选平板上，倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；
6).待平板冷却凝固，倒置于37℃培养箱培养过夜；检查平板，计数102数量级噬菌斑平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释因子即得到噬菌体的滴度，即空斑形成单位。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，筛选截止次数s为3或4。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，细胞穿透肽原核表达文库中，任何一个克隆经过诱导表达、纯化后得到的产物为融合蛋白；
所述融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和经过噬菌体筛选富集过后的多肽序列；
用于纯化融合蛋白的标签为组氨酸标签或者谷胱甘肽巯基转移酶标签；
示踪蛋白为绿色荧光蛋白，示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的N端或C端；
原核表达文库中的多肽序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库。
编码组氨酸标签(His-tag)基因序列为Novagen公司提供的pET-14b载体所固有，其编码序列为：CATCATCATCATCATCAC。绿色荧光蛋白的特点是受到一定的激发光激发后，在荧光显微镜下发出可见明亮的绿色荧光。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，原核表达载体pET-14bMCStop/EGFP是由pET14b载体改造得到。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，pET14b载体改造方法如下：使用突变技术在多克隆位点区域引入4个限制性内切酶酶切位点，再采用聚合酶链反应技术扩增示踪蛋白的基因片断，插入pET14b载体中。
本发明所述原核表达文库中的多肽序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库。经过验证，该文库中大约有60％-70％的多肽序列能够有效介导融合蛋白进入细胞内部，即确为CPPs。该多肽文库容量达到3.97×105，能够较好满足筛选验证的要求，体现在：一方面，该信息量的已能很好满足获取大量穿透肽序列的目的；另一方面，由于通过噬菌体展示技术的筛选，已将大量无内化能力或是与细胞膜有结合的多肽序列淘汰，并将高效的穿透肽序列进行了富集。因而，获得的原核表达文库中重组克隆的数量亦不致过大，能够大大减轻和缩短后续验证实验的压力和时间。本发明以噬菌体展示技术为基础，建立了以增强型的绿色荧光蛋白为示踪的细胞穿透肽原核表达文库。文库阳性克隆率远远高于随机多肽文库，筛选和验证所需周期大大缩短，具有高通量的优势。
本发明从原核表达文库中验证细胞穿透多肽的方法，含有以下步骤：首先将本发明所述的原核表达文库进行铺板，得到独立克隆，对其进行扩大诱导，表达并纯化蛋白。然后将纯化蛋白加入培养细胞孵育2小时。细胞经过洗涤后，在荧光显微镜下进行观察，如果出现绿色荧光在细胞内聚集，即可认定融合蛋白中的多肽为细胞穿透肽。
发明从原核表达文库中验证细胞穿透多肽的方法以已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白作为阳性对照。本发明所述的已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白为HIV-1Tat蛋白中的一段碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR(tat)。
验证中所使用的培养细胞可以是用来进行噬菌体筛选时的细胞，亦可以是其它的哺乳动物细胞，进而通过对不同细胞的比较，能够考察待验证多肽穿膜能力的细胞特异性。
附图说明
结合附图对本发明作进一步说明，但附图不构成对本发明的限制。
图1融合蛋白组成示意图。
图2噬菌体滴度测定结果实例：1/108、1/109和1/1010分别表示不同稀释比例。
图3pET14b载体改造(pET-14bMCStop/EGFP)示意图。
图4细胞穿透肽原核表达文库构建示意图。
图5Tat融合蛋白在细胞内定位荧光图(×400)。
图6编号为CPP1的融合蛋白在细胞内的定位荧光图(×400)。
图7编号为CPP2的融合蛋白在细胞内的定位荧光图(×400)。
图8编号为CPP3的融合蛋白在细胞内的定位荧光图(×400)。
具体实施方式
以下是本发明的实施例，但不以任何形式限制本发明。
实施例1。
一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。
本发明所述的噬菌体展示技术，其原理是将编码多肽的DNA片段与噬菌体衣壳蛋白编码基因进行重组，并以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。基于生物分子与靶分子的亲和力，通过吸附-洗脱-扩增的重复过程，将含有能与靶分子特异结合的噬菌体从表达各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，然后进行富集、扩增及基因序列测定，从而获得外源蛋白的氨基酸组成。
本实施例的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，选用Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库；所述全细胞筛选模式是指以培养细胞为对象，加入噬菌体随机环七肽库进行的筛选。
本发明所述的筛选具有细胞膜穿透活性的多肽是指该筛选的基础并非如常规的是利用生物分子与靶分子(抗体，受体，抗原，酶的底物等)的亲和力，而是基于多肽文库中的CPPs携带噬菌体颗粒穿透细胞膜进入细胞内的能力。
具体的，该利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，包括如下步骤：
0.以噬菌体随机环七肽库作为噬菌体筛选基，令筛选次数n＝1，进入步骤a；
a.将噬菌体筛选基加入培养细胞上清中孵育1-2小时；
b.冰上终止反应，弃去上清中未结合噬菌体；
c.培养基洗涤细胞10次以上，以去除细胞表面噬菌体；
d.胰酶消化细胞至圆缩，再进行离心处理，之后反复洗涤细胞3-5次，以去除与细胞膜有特异性结合的噬菌体；
e.细胞沉淀置于液氮和37℃恒温水浴锅中反复冻融5-10次，在每次冻融过程中分别震荡30秒；然后
向冻融物中加入含表面活性剂的缓冲液，于室温作用1小时以上，以裂解细胞；
f.离心后的裂解上清即为淘选分离液，取100μl淘选分离液测定噬菌体滴度；向其余裂解液中加入对数期大肠杆菌以及含有抗生素的LB培养基10-50ml，再于37℃剧烈振摇培养4-6小时；
g.离心培养物，将70％-90％的上清液上部转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，并于4℃沉淀过夜；
h.沉淀物重悬于含0.02％NaN3/TBS缓冲液中，离心上清，再用1/6体积的PEG/NaCl二次沉淀；
i.沉淀物重悬后离心，上清转入新的离心管，即得到噬菌体扩增液，测定噬菌体滴度；
j.判断筛选次数n是否小于或者等于筛选截止次数s，s为自然数，如果是，则进入步骤l；如果否则进入步骤k；
k.以步骤i得到的噬菌体扩增液作为噬菌体筛选基，令n＝n+1，返回步骤a；
l.提取经过筛选过后的噬菌体总DNA；
m.用含有酶切位点的上下游引物，以提取的噬菌体单链DNA为模板，扩增目的片段，插入带有荧光蛋白DNA的原核表达载体中；
n.将连接产物转化入原核表达菌株中，即得到细胞穿透肽原核表达文库。
优选的，上述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，噬菌体滴度测定方法为：
1).接种大肠杆菌菌落于培养基中，37℃剧烈振摇，培养至对数中期；
2).取噬菌体淘选分离液和扩增液，在培养集中进行10倍系列稀释，稀释范围为109-1011；
3).当细菌培养物达对数中期时，分成100-200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管；
4).向离心管中每管加入10-20μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育感染；
5).将感染的细菌加入预温的顶层琼脂玻璃试管中，每次一管，快速混匀，在6分钟内倾注于37℃预温的筛选平板上，倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；
6).待平板冷却凝固，倒置于37℃培养箱培养过夜；检查平板，计数102数量级噬菌斑平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释因子即得到噬菌体的滴度，即空斑形成单位。噬菌体滴度测定结果如图2所示。
实践发现，利用噬菌体展示技术进行细胞穿透肽的筛选，在筛选次数3次的结果最佳，以不超过4此为准，超过4此后结果会出现一定的丢失。
该利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，细胞穿透肽原核表达文库中，任何一个克隆经过诱导表达、纯化后得到的产物为融合蛋白，如图1所示；
所述融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和经过噬菌体筛选富集过后的多肽序列；用于纯化融合蛋白的标签为组氨酸标签或者谷胱甘肽巯基转移酶标签；示踪蛋白为绿色荧光蛋白，示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的N端或C端；原核表达文库中的多肽序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库。
编码组氨酸标签(His-tag)基因序列为Novagen公司提供的pET-14b载体所固有，其编码序列为：CATCATCATCATCATCAC。绿色荧光蛋白的特点是受到一定的激发光激发后，在荧光显微镜下发出可见明亮的绿色荧光。
本实施例中，原核表达载体pET-14bMCStop/EGFP是由pET14b载体改造得到。pET14b载体改造方法如下：使用突变技术在多克隆位点区域引入4个限制性内切酶酶切位点，再采用聚合酶链反应技术扩增示踪蛋白的基因片断，插入pET14b载体中。
本发明所述原核表达文库中的多肽序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库。经过验证，该文库中大约有60％-70％的多肽序列能够有效介导融合蛋白进入细胞内部，即确为CPPs。该多肽文库容量达到3.97×105，能够较好满足筛选验证的要求，体现在：一方面，该信息量的已能很好满足获取大量穿透肽序列的目的；另一方面，由于通过噬菌体展示技术的筛选，已将大量无内化能力或是与细胞膜有结合的多肽序列淘汰，并将高效的穿透肽序列进行了富集。因而，获得的原核表达文库中重组克隆的数量亦不致过大，能够大大减轻和缩短后续验证实验的压力和时间。本发明以噬菌体展示技术为基础，建立了以增强型的绿色荧光蛋白为示踪的细胞穿透肽原核表达文库。文库阳性克隆率远远高于随机多肽文库，筛选和验证所需周期大大缩短，具有高通量的优势。
本发明从原核表达文库中验证细胞穿透多肽的方法，含有以下步骤：首先将本发明所述的原核表达文库进行铺板，得到独立克隆，对其进行扩大诱导，表达并纯化蛋白。然后将纯化蛋白加入培养细胞孵育2小时。细胞经过洗涤后，在荧光显微镜下进行观察，如果出现绿色荧光在细胞内聚集，即可认定融合蛋白中的多肽为细胞穿透肽。
发明从原核表达文库中验证细胞穿透多肽的方法以已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白作为阳性对照。本发明所述的已知能将示踪蛋白带入细胞的多肽或蛋白为HIV-1Tat蛋白中的一段碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR(tat)。
验证中所使用的培养细胞可以是用来进行噬菌体筛选时的细胞，亦可以是其它的哺乳动物细胞，进而通过对不同细胞的比较，能够考察待验证多肽穿膜能力的细胞特异性。
本发明的方法在对噬菌体随机肽库筛选的基础上，先对展示有穿膜功能多肽的噬菌体进行富集，然后获取多肽序列的DNA集合，将其与绿色荧光蛋白融合表达的形式构建CPPs的原核表达文库。该文库不仅能够获得包含大量序列信息的CPPs集合体，并且通过表达纯化融合蛋白结合荧光显微观察这一简单流程，能够实现短时间内获取大量CPPs的目的，同时还能在相同的实验条件下对大量多肽的穿膜表现和机制进行比较和研究。
本发明的方法建立起了一个高通量、系统地寻找CPPs和高效、简便验证其穿膜能力的技术。其意义在于一方面可以从组学研究的视角，利用生物信息学工具，对CPPs的序列特点、内化方式进行研究、分类并分析寻找共性，从而为CPPs的结构改造以及预测提供有力的指导；一方面能够发现更多新的在效率和特异性方面具有优势的CPPs分子，加速CPPs由基础研究向临床药物载体领域的转化研究。
以下通过一具体实验操作对本发明作进一步说明。
实施例2：噬菌体展示技术筛选细胞穿透肽
第一步噬菌体展示环七肽库的滴度测定
接种E.coli(大肠杆菌)ER2738单菌落于5ml LB培养基中，37℃剧烈振摇(225rpm)，培养至对数中期(OD600值约0.5)。在微波炉中融化顶层琼脂，保存于45℃备用。待使用时分成3-4ml等份，倒于灭菌玻璃试管中，每个噬菌体稀释度一管。取噬菌体随机环七肽库1μl，在LB中进行10倍系列稀释，稀释范围为109-1011(筛选过程中每轮次的稀释范围为：扩增的噬菌体培养物上清109-1011；未扩增的淘选分离物102-104)。当细菌培养物达对数中期时，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育3分钟。将感染的细菌加入上述45℃预温的顶层琼脂玻璃试管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)/X-gal(溴-4-氯-3-吲哚-β-硫代半乳糖苷)平板上，适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。5分钟后待平板冷却凝固，倒置于37℃培养箱培养过夜。检查平板，计数102数量级噬菌斑平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释因子(倍数)即得到噬菌体的滴度，即每10μl的空斑形成单位(plaque forming unit,pfu)。本发明所用的原噬菌体展示环七肽库经滴度测定，在109稀释度平皿上有176个噬菌斑，如图4所示，说明原库噬菌体滴度为1.76×1011pfu/10μl，也即原库的库容为1.76×1013pfu/ml，与试剂盒所给的数据(2.0×1013pfu/ml)基本吻合。
第二步筛选细胞的准备
Hela(人宫颈腺癌)细胞培养在含5％BSA(胎牛血清)－DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)完全培养基中，37℃，5％CO2培养箱里培养。筛选前一天接种于10cm皿中，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底即可用于筛选。
第三步筛选进入Hela细胞的噬菌体
弃去10cm皿中的培养液，用DMEM培养基冲洗贴壁的Hela细胞3次，加入含0.1％BSA的DMEM培养基于37℃孵育1小时。加入Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库原液10μl(滴度1.76×1011pfu)，放入37℃摇床，70rpm温和振摇孵育15分钟，继续在细胞培养箱中孵育1.5小时。立即将培养板于冰上放置5分钟，终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上清，用含0.1％BSA的5ml的DMEM培养基室温洗涤细胞10次。用1.5ml PBS(9.0g/LNaCl，0.15g/LNa2HPO4·12H2O，0.2g/LKH2PO4,pH7.2)和1.5ml 0.25％胰酶混合液消化Hela细胞，置于培养箱中保温，至镜下观察细胞圆缩脱离皿壁。4℃，1,000rpm离心2分钟，去上清，再加入3ml PBS轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞5次。细胞沉淀置于液氮和37℃恒温水浴锅中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％Triton X-100(曲拉通X-100)的PBS，室温作用2小时，以裂解细胞。4℃，5,000rpm离心10分钟。离心后的上清即为淘选分离液。取100μl淘选分离液测定噬菌体滴度(其方法如实施例1的第一步所述)，其余裂解液加入锥形瓶中对数期大肠杆菌中，再加入50ml LB(含1/1000四环素)，37℃剧烈振摇培养4.5小时，将培养物转入一新离心管中，4℃，10,000rpm离心10分钟。上清液转入另一离心管中，再次离心。将80％的上清液上部转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，4℃沉淀过夜。沉淀于4℃，10,000离心15分钟，弃上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。沉淀物重悬于1ml TBS(Tris缓冲盐溶液)中，悬液转入离心管中，4℃，10,000rpm离心5分钟。上清转入另一新离心管，用1/6体积的PEG/NaCl进行二次沉淀。冰上孵育40分钟，4℃，10,000rpm离心10分钟，弃上清，再短暂离心，吸去残余上清。沉淀物重悬于200μl含0.02％NaN3(叠氮钠)/TBS缓冲液中。4℃，1,0000rpm离心5分钟，上清转入新离心管，此即为噬菌体扩增液。
利用第1轮噬菌体扩增液重复以上步骤进行第2轮筛选，然后依次进行3、4轮筛选。各轮筛选得到的淘选分离液和扩增液均用LB/IPTG/X-gal平皿培养测定噬菌体滴度(其方法如实施例1的第一步所述)。通过统计每轮淘选前加入的噬菌体量与洗脱后的噬菌体量，计算回收率，比较4轮淘选后噬菌体回收率，并计算富集程度。通过比较，可以看出从第1轮至第4轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，穿膜进入子宫颈腺癌细胞中的噬菌体数目在第2、3和4轮筛选后分别较上一轮次升高4.63、10.35和8.44倍，如表1所示。因此，可以证实通过4轮的全细胞筛选，高效和高特异性的Hela细胞穿透肽得到了明显富集。
表1利用Hela细胞对噬菌体随机环七肽库进行淘选的富集结果
实施例3：细胞穿透肽原核表达文库的构建
本发明所述原核表达文库中的多肽DNA序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库总DNA。通过对4轮全细胞筛选对噬菌体随机七肽库的回收率和富集倍数进行比较，我们发现在第3轮筛选后富集倍数达到最大值。第4轮富集倍数的下降暗示着筛选已趋近于饱和，继续的筛选可能导致多样性的降低和数据的丢失。因此选择提取第3轮筛选得到的噬菌体DNA进行Hela细胞穿透肽原核表达文库的构建。这一步在本方法的建立中是需要着重加以考虑的关键控制点。
第一步：pET-14bMCStop载体的构建。
该载体是在pET14b载体多克隆位点Nde I和Xho I之间加入四个酶切位点Apa I(GGGCCC)、Kpn I(GGTACC)、Sma I(CCCGGG)和Not I(CGGCCG)所改造完成。使用PCR引入突变的方法完成载体构建，其上游引物为5'-GGGCGGCCGCTCGAGGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCG-3'；下游引物为5'-GGGGGTACCGGGCCCCATATGGCTGCCGCGCGGCAC CAG-3'。以pET14b质粒为模板，用Pyrobest高保真聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR反应，反应条件为：95℃30s、56℃30s、72℃5min，共进行10个循环。对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。依照TaKaRaMutanBEST Kit的操作指南，将目的片段17μl、10×Blunting Kination Buffer 2μl、Blunting Kination Enzyme Mix 1μl，37℃反应10min。对反应液进行酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，无菌纯水溶解沉淀。取5μl上述溶液加入等量的连接液solution I，16℃反应1小时，全量反应液化学转化DH5α感受态细菌，氨苄青霉素(Amp+)(100μg/ml)平板筛选。挑取阳性克隆，37℃过夜摇菌，提取质粒。由于在Nde I和Xho I之间加入了Apa I(GGGCCC)、Kpn I(GGTACC)、Sma I(CCCGGG)和Not I(CGGCCG)4个酶切位点，因此，改造后的pET-14bMCStop载体的多克隆位点处存在7个限制性内切酶酶切位点，如图3所示，更加便于克隆操作。
第二步：pET-14bMCStop/EGFP载体的构建。
该载体用于构建细胞穿透肽原核表达文库，是在pET-14bMCStop载体中亚克隆入EGFP序列改造完成。EGFP的DNA片段是由BD Biosciences公司的载体pEGFP-C2作为模板，通过PCR方法得到。其上游引物为5'-TAGGTACCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3'，其中GGTACC为KpnⅠ的酶切位点；下游引物为5'-ATATCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3'，其中CTCGAG为Xho I酶切位点。以pEGFP-C2为模板，用KOD Plus DNA聚合酶进行PCR的反应条件为：94℃30s、56℃30s、68℃1min，共进行30个循环。将PCR产物和载体pET14b-MCS分别用Kpn I和XhoI进行双酶切，凝胶电泳并回收酶切产物。回收产物按照载体和目的片段1:6摩尔比混合，用T4DNA连接酶于16℃连接16小时，转化DH5α感受态细胞，Amp+(100μg/ml)平板筛选。挑取阳性克隆，37℃过夜摇菌，提取质粒，分别进行PCR和酶切鉴定，经测序无误后，命名为pET-14bMCStop/EGFP载体。
第三步：细胞穿透肽原核表达文库的构建。
(1)噬菌体总DNA的提取
选择第3轮筛选得到的噬菌体进行噬菌体总DNA的提取，以作为构建细胞穿透肽原核表达文库的扩增模板。具体操作为：将经过纯化的噬菌体离心，取100μl上清转入离心管中，加入40μl PEG/NaCl，混匀后冰上放置1小时。于4℃，10,000rpm，离心10分钟，弃上清。10秒钟短暂离心，小心吸去残余上清。将沉淀彻底重悬于1ml碘化物缓冲液中，加入2.5ml无水乙醇，室温温育10分钟。于4℃，10,000rpm，离心10分钟，弃上清。用70％乙醇洗涤沉淀，短暂干燥，沉淀重悬于30μl TBS中。
(2)连接产物的获得
用含有酶切位点的上下游引物，以提取的噬菌体总DNA为模板，扩增目的片段，插入载体pET-14bMCStop/EGFP中。上游引物为5'-CCCGGCCCATATGGTGGTGCCTTTCTATTCCACTCTGCTTGT-3'，其中CATATG为Nde1酶切位点，GTGGTGCCTTTCTATTCCACTCTG CTTGT为噬菌体载体上的共有序列；下游引物为5'-TTAGGTACCAGTT TCGGCAGAACCTCCACCGCA-3'，其中GGTACC为Kpn1酶切位点，AGTTTCGGCAGAACCTCCACCGCA为噬菌体载体上的共有序列。用Taq酶进行PCR反应的条件为：94℃30s、58℃30s、72℃30s，共进行18个循环。将PCR产物和载体pET14b-MCS-EGFP分别用Nde I和KpnI进行双酶切，凝胶电泳并回收酶切产物。回收产物用T4DNA连接酶于16℃连接16小时，-20℃保存连接产物。
(3)电转感受态的制备
从新鲜的琼脂板上挑取一个大肠杆菌BL21(DE3)单菌落，接种于50ml的LB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜。过夜培养物以1:50接种于500ml预热的新鲜LB液体培养基中(置于2L的锥形瓶中)，于37℃剧烈震荡(275rpm)培养，每隔20分钟测量一次OD600值。当OD600值达到0.4-0.5左右时，迅速将培养基置于冰水浴中30分钟，同时不断缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。并将离心管置于冰上预冷。将细菌转移至冰冷的离心管中，4℃，1,000rpm，离心15分钟，收集细胞。弃去上清，沉淀菌体用500ml含10％甘油的冰冷去离子水重悬。4℃，1,000rpm，离心20分钟收集细胞。弃去上清，沉淀菌体用250ml含10％甘油的冰冷去离子水重悬。4℃，1,000rpm，离心20分钟收集细胞。弃去上清，沉淀菌体用0.5ml冰冷的10％甘油重悬。100倍稀释上述悬液后，测量OD600值，用冰冷的10％甘油将其稀释至浓度为2×1010-3×1010个细胞/ml，按40μl/管分装至PCR管中。
(4)电击转化
每40μl细胞悬液中加入1μl对照质粒或者连接产物，轻柔吹打混匀后，转入预冷后的电转杯中，轻击液体以确保细菌与DNA悬液位于电转杯的底部。混合后冰浴不超过5分钟。用卷纸擦干电转槽及电转杯外次的冷凝水，将电转杯置于电转仪中。调节电转仪参数：电脉冲为25μF，电压为2.5/2.0kV，电阻为200Ω。启动电脉冲，仪器应显示4-5ms具有12.5Kv/cm的电场强度。电击结束后，室温下立即向电转杯中加入800ml温热的LB培养基，用移液器混匀，尽量吸出杯中的菌液，装于干净无菌的EP管中。于37℃，轻柔复苏细胞1小时。转化产物分成两部分，大部分作为文库保存液，以50μl/管分装保存于25％甘油中，-80℃保存；另取一小部分涂布于Amp+(100μg/ml)的LB琼脂平板上。室温下待液体被完全吸收后，倒置平板于37℃培养，用于计算质粒转化效率文库容量。本实施例中电转化BL21(DE3)的效率为753×103/30＝2.51×104cfu(菌落形成单位)/ng质粒，文库总容量为397×5×10×20＝3.97×105cfu，文库容量符合穿透肽原核表达文库对序列多样性的需要。基于噬菌体展示技术构建细胞穿透肽原核表达文库构建流程见图4。
实施例4：pET-14bMCStop/EGFP-Tat的构建与表达
来源于人免疫缺陷病毒HIV-1转录激活因子的蛋白Tat是已知的研究最广泛的细胞穿透肽，已经明确，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR能将包括融合蛋白在内的多种货物分子携带进入细胞。本发明采用该蛋白的转导域与绿色荧光蛋白进行融合表达，作为细胞穿透肽原核表达文库验证的阳性对照，其携带融合蛋白在细胞内定位荧光图如图5所示。
第一步：pET-14bMCStop载体的构建。其构建方法如实施例3第一步所述。
第二步：pET-14bMCStop/EGFP载体的构建。其构建方法如实施例3第二步所述。
第三步：pET-14bMCStop/EGFP-Tat载体的构建。
该载体用于克隆表达阳性对照His-EGFP-Tat融合蛋白，是在pET-14bMCStop/EGFP载体中亚克隆入Tat蛋白转导域的基因序列TAT构建完成。通过退火来形成两端带有限制性内切酶BamH I粘性末端的双链TAT全长序列，与经BamH I酶切后含有互补粘端的载体pET-14bMCStop/EGFP连接完成pET-14bMCStop/EGFP-Tat载体的构建。完成退火的上游引物为：5'-GATCCTATGGCCGCAAGAAACG CCGTCAGCGTCGCCGTG-3'；下游引物为5'-GATCCACGGCGACGCTGACGGCGTTTCTTGCGGCCATAG-3'。退火条件为：95℃变性5min，逐渐降温至室温。回收产物按照载体和目的片段1:100摩尔比混合，用T4DNA连接酶于16℃连接16小时，转化DH5α感受态细胞，Amp+(100μg/ml)LB琼脂平板筛选。挑取阳性克隆，37℃过夜摇菌，提取质粒，分别行PCR和酶切鉴定，经测序无误后，命名为pET-14bMCStop/EGFP-Tat载体。
第四步：pET-14bMCStop/EGFP-Tat载体的表达及其融合蛋白纯化。
用pET-14bMCStop/EGFP-Tat质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，Amp+(100μg/ml)的LB琼脂平板37℃过夜培养，次晨挑取单克隆加入5ml的Amp+(100μg/ml)LB液体培养基中，于37℃振摇培养至OD600约为0.6，然后向菌液中加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导蛋白表达，25℃过夜培养。4℃，6,000rpm，离心6min收集细菌，弃上清，细菌沉淀用170μl结合缓冲液(0.6mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LTris-HCl，pH8.0)重悬。冰上超声裂解细菌，4℃，10,000rpm，离心20分钟，收集上清。将上清与Ni2+-NTA-agrose微珠(购自德国Qiagen公司)置于冰上，结合1小时。4℃，3,000rpm，离心5分钟，收集蛋白结合后的微珠。弃上清，用2ml洗涤缓冲液(5mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LTris-HCl，pH 8.0)离心洗涤微珠2次，再用50μl洗脱缓冲液(30mmol/L咪唑，250mol/LNaCl，80mmol/LTris-HCl，pH 8.0)洗脱蛋白，即得到纯化后的蛋白。
实施例5：细胞穿透肽的验证
第一步：噬菌体展示技术筛选细胞穿透肽。其筛选方法如实施例2所述。
第二步：细胞穿透肽原核表达文库的构建。其构建方法如实施例3所述。
第三步：细胞穿透肽的验证。
(1)细胞穿透肽原核表达文库克隆的表达纯化
取实施例2中经电转化得到的文库分装保存液一支，加入5ml LB液体培养基，37℃轻柔复苏1小时。取200μl培养物涂布于Amp+(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养10小时。次晨挑取若干个单克隆分别扩大培养并表达纯化蛋白，其方法如实施例3中第四步所述。
(2)细胞穿透肽穿膜能力的验证
验证实验的前一天，将Hela细胞接种于96孔板中，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底即可。将纯化好的蛋白分别加入96孔板的细胞内，37℃孵育2小时，预热的PBS洗涤细胞2次后，使用Zeiss显微镜观察。以His-EGFP-Tat融合蛋白为阳性对照，观察指标为荧光显微镜下肉眼可见细胞内任何部位包括细胞浆以及细胞器等有绿色荧光聚集，即可认定为阳性结果。
该实施例筛选出的阳性克隆编号为CPP1。包含有该多肽的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：与细胞孵育2小时后，细胞中出现弥散的绿色荧光，并且主要定位在细胞浆中，呈弥散和颗粒状分布，如图6所示。
实施例6：细胞穿透肽的验证
第一步：噬菌体展示技术筛选细胞穿透肽。其筛选方法如实施例2所述。
第二步：细胞穿透肽原核表达文库的构建。其构建方法如实施例3所述。
第三步：细胞穿透肽的验证。其方法如实施例5所述。
该实施例筛选出的阳性克隆编号为CPP2。包含有该多肽的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：与细胞孵育2小时后，细胞中出现颗粒状的绿色荧光，并且主要定位在细胞浆中，核区则形成暗区，如图7所示。
实施例7：细胞穿透肽的验证
第一步：噬菌体展示技术筛选细胞穿透肽。其筛选方法如实施例2所述。
第二步：细胞穿透肽原核表达文库的构建。其构建方法如实施例3所述。
第三步：细胞穿透肽的验证。其方法如实施例5所述。
该实施例筛选出的阳性克隆编号为CPP3。包含有该多肽的融合蛋白在荧光显微镜下的表现为：与细胞孵育2小时后，细胞中出现颗粒状的绿色荧光，主要定位于细胞浆，胞核区域亦有少量分布，如图8所示。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。
2.根据权利要求1所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，选用Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库；
所述全细胞筛选模式是指以培养细胞为对象，加入噬菌体随机环七肽库进行的筛选。
3.根据权利要求2所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
0.以噬菌体随机环七肽库作为噬菌体筛选基，令筛选次数n＝1，进入步骤a；
a.将噬菌体筛选基加入培养细胞上清中孵育1-2小时；
b.冰上终止反应，弃去上清中未结合噬菌体；
c.培养基洗涤细胞10次以上，以去除细胞表面噬菌体；
d.胰酶消化细胞至圆缩，再进行离心处理，之后反复洗涤细胞3-5次，以去除与细胞膜有特异性结合的噬菌体；
e.细胞沉淀置于液氮和37℃恒温水浴锅中反复冻融5-10次，在每次冻融过程中分别震荡30秒；然后
向冻融物中加入含表面活性剂的缓冲液，于室温作用1小时以上，以裂解细胞；
f.离心后的裂解上清即为淘选分离液，取100μl淘选分离液测定噬菌体滴度；向其余裂解液中加入对数期大肠杆菌以及含有抗生素的LB培养基10-50ml，再于37℃剧烈振摇培养4-6小时；
g.离心培养物，将70％-90％的上清液上部转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，并于4℃沉淀过夜；
h.沉淀物重悬于含0.02％NaN3/TBS缓冲液中，离心上清，再用1/6体积的PEG/NaCl二次沉淀；
i.沉淀物重悬后离心，上清转入新的离心管，即得到噬菌体扩增液，测定噬菌体滴度；
j.判断筛选次数n是否小于或者等于筛选截止次数s，s为自然数，如果是，则进入步骤l；如果否则进入步骤k；
k.以步骤i得到的噬菌体扩增液作为噬菌体筛选基，令n＝n+1，返回步骤a；
l.提取经过筛选过后的噬菌体总DNA；
m.用含有酶切位点的上下游引物，以提取的噬菌体单链DNA为模板，扩增目的片段，插入带有荧光蛋白DNA的原核表达载体中；
n.将连接产物转化入原核表达菌株中，即得到细胞穿透肽原核表达文库。
4.根据权利要求3所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，噬菌体滴度测定方法为：
1).接种大肠杆菌菌落于培养基中，37℃剧烈振摇，培养至对数中期；
2).取噬菌体淘选分离液和扩增液，在培养集中进行10倍系列稀释，稀释范围为109-1011；
3).当细菌培养物达对数中期时，分成100-200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管；
4).向离心管中每管加入10-20μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育感染；
5).将感染的细菌加入预温的顶层琼脂玻璃试管中，每次一管，快速混匀，在6分钟内倾注于37℃预温的筛选平板上，倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；
6).待平板冷却凝固，倒置于37℃培养箱培养过夜；检查平板，计数102数量级噬菌斑平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释因子即得到噬菌体的滴度，即空斑形成单位。
5.根据权利要求4所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，筛选截止次数s为3或4。
6.根据权利要求5所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，细胞穿透肽原核表达文库中，任何一个克隆经过诱导表达、纯化后得到的产物为融合蛋白；
所述融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和经过噬菌体筛选富集过后的多肽序列；
用于纯化融合蛋白的标签为组氨酸标签；
示踪蛋白为绿色荧光蛋白，示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的N端或C端；
原核表达文库中的多肽序列来源于经过噬菌体展示技术筛选的随机环七肽库。
7.根据权利要求6所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，原核表达载体pET-14bMCStop/EGFP是由pET14b载体改造得到。
8.根据权利要求7所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，pET14b载体改造方法如下：使用突变技术在多克隆位点区域引入4个限制性内切酶酶切位点，再采用聚合酶链反应技术扩增示踪蛋白的基因片断，插入pET14b载体中。
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