CN114874990A - 一种功能化外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种功能化外泌体及其制备方法和应用。所述功能化外泌体同时表达低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽包括Angiopep‑2，所述细胞穿膜肽包括TAT多肽。本发明的功能化外泌体中，低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽协同发挥作用，不仅能够增强功能化外泌体对血脑屏障和胶质瘤细胞的双重主动选择性，还能提高功能化外泌体的穿越细胞膜效率，进而提高疾病治疗效果。

Description

一种功能化外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种功能化外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见、恶性程度较高的原发性肿瘤之一，具有侵袭性生长、不易早期诊断、治疗效果差、易复发和高死亡率等特点。
手术、放疗和化学疗法是目前临床常用的治疗手段。由于脑胶质瘤自身的生物学特性以及中枢神经系统的复杂性，手术难以将肿瘤细胞切除干净，另一方面肿瘤细胞呈浸润生长，术后容易复发。脑胶质瘤的放疗和化疗药物会受到血脑屏障的阻碍，难以从外周血液循环进入病变脑组织发挥治疗效果。血脑屏障是由脑毛细血管内皮细胞组成的一个多样复杂的动态系统。其中，毛细血管内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的主要形态学基础。血脑屏障在维护中枢神经组织内环境稳定的同时也限制了药物进入中枢神经系统，阻碍了大部分具有抗肿瘤活性的药物从外周血液循环进入病变脑组织。研究认为，超过98％的小分子药物和几乎100％的大分子药物不能透过血脑屏障。局部脑病变组织无法达到有效的药物作用浓度，使得绝大部分药物失去应有的治疗能力。
外泌体(Exosomes)是一类细胞分泌的纳米级囊泡状小体，直径为30～150nm，可携带蛋白质、核酸和脂质等多种生物活性成分，参与细胞间的物质交换与信息传递。外泌体因其纳米尺度的粒径和具备来自细胞的双层生物膜结构等特点，在跨血脑屏障中具有重要优势，此外，外泌体还具有较强的负载能力，可以包裹多种化学药物和生物活性分子，因此，外泌体不仅可以通过内含物组分调控肿瘤细胞的生物学行为，也可以通过装载外源性化学药物发挥治疗作用，具有作为新型脑靶向递送载体的潜力。
然而，尾静脉注射外泌体进行系统性治疗过程中，绝大多数的外泌体被肺和肝脏等器官摄取，只有很少一部分才能通过外周血循环进入脑部，且野生型外泌体缺乏对肿瘤细胞的主动靶向性，在肿瘤部分有效富集率低。此外，外泌体具有与机体细胞相似的双层生物膜结构，外泌体从外周血液循环进入脑胶质瘤局部需要穿越多层细胞膜结构，容易与细胞膜融合而被细胞所摄取，因此，将外泌体作为载药系统仍存在障碍。
CN110934851A提供一种靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法，所述外泌体纳米载药系统包括负载亲脂性融合多肽的外泌体和超顺磁纳米铁，所述融合多肽通过基因工程融合多肽药物与穿膜肽得到，并通过穿膜肽的亲脂性分布到外泌体膜表面；所述超顺磁纳米铁分布在外泌体表面，通过转铁蛋白与外泌体表面的转铁蛋白受体结合而连接到外泌体上；超顺磁纳米铁在外部磁场作用下能使外泌体载体具有靶向能力，但所述外泌体纳米载药系统的穿越细胞膜效率较低，难以高效在肿瘤部位富集。
综上所述，提供一种能够同时具备高血脑屏障靶向性和肿瘤靶向性以及高穿膜效率的外泌体，能够有效在脑部肿瘤部位富集，对于治疗脑损伤领域也具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种功能化外泌体及其制备方法和应用，所述功能化外泌体的膜表面修饰有低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽，能够高效靶向血脑屏障并穿过血脑屏障，并靶向性在脑胶质瘤部位聚集，进而提高治疗效果。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种功能化外泌体，所述功能化外泌体膜表面同时表达低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽包括Angiopep-2，所述细胞穿膜肽包括TAT多肽。
本发明中，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽能够使得所述功能化外泌体通过血脑屏障上表达的低密度脂蛋白受体介导在血脑屏障上聚集；所述细胞穿膜肽使得所述功能化外泌体高效率穿越血脑屏障所属细胞膜，避免功能化外泌体被血脑屏障细胞摄取；进一步地，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽能够使得进入脑组织的所述功能化外泌体通过脑胶质瘤上表达的低密度脂蛋白受体介导在脑部肿瘤部位富集；低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽协同发挥作用，不仅能够增强功能化外泌体对血脑屏障和胶质瘤细胞的主动选择性，还能提高功能化外泌体的穿越细胞膜效率，进而提高治疗效果。
优选地，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽分别与外泌体的膜蛋白融合表达。
优选地，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽分别连接在外泌体的膜蛋白的氨基端，即可以表达呈现在外泌体的膜外。
优选地，所述膜蛋白包括Lamp2b蛋白。
优选地，所述Angiopep-2包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1：
TFFYGGSRGKRNNFKTEEY。
优选地，所述TAT多肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2：
AYGRKKRRQRRR。
优选地，所述Lamp2b蛋白包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3：
MVCFRLFPVPGSGLVLVCLVLGAVRSYALELNLTDSENATCLYAKWQMNFTVRYETTNKTYKTVTISDHGTVTYNGSICGDDQNGPKIAVQFGPGFSWIANFTKAASTYSIDSVSFSYNTGDNTTFPDAEDKGILTVDELLAIRIPLNDLFRCNSLSTLEKNDVVQHYWDVLVQAFVQNGTVSTNEFLCDKDKTSTVAPTIHTTVPSPTTTPTPKEKPEAGTYSVNNGNDTCLLATMGLQLNITQDKVASVININPNTTHSTGSCRSHTALLRLNSSTIKYLDFVFAVKNENRFYLKEVNISMYLVNGSVFSIANNNLSYWDAPLGSSYMCNKEQTVSVSGAFQINTFDLRVQPFNVTQGKYSTAQECSLDDDTILIPIIVGAGLSGLIIVIVIAYVIGRRKSYAGYQTL。
第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白融合蛋白的编码基因，优选为Angiopep-2-Lamp2b融合蛋白的编码基因；
或所述表达载体包括细胞穿膜肽外泌体膜蛋白融合蛋白的编码基因，优选为TAT多肽-Lamp2b融合蛋白的编码基因。
优选地，所述Angiopep-2-Lamp2b融合蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
SEQ ID NO:4：
gaattcgccaccatggtctgcttcagactgttccctgtgcctggctctggactggtgcttgtgtgtctggtgctgggcgctgtgcggtcttatgccggcaatagcacaatgggcagcggcacattcttctacggcggcagccggggcaagagaaacaacttcaagaccgaggaatacggcagcggctctggcagcggaggatctagcctggaactgaacctgaccgacagcgagaacgccacctgtctgtatgccaagtggcagatgaacttcaccgtccgctacgaaaccaccaacaagacctacaagaccgtgaccatcagcgaccacggcaccgtgacatacaacggcagcatctgtggcgacgaccagaacggacctaagatcgccgtgcagttcggccctggctttagctggatcgccaactttacaaaggccgccagcacctacagcatcgacagcgtgtccttcagctacaacaccggcgacaacaccacctttccagacgccgaggataagggcatcctgaccgtggatgagctgctggccatcagaatccctctgaacgacctgttccggtgcaacagcctgagcaccctggaaaagaacgacgtggtgcagcactactgggacgtgctggtgcaggcctttgtgcagaatggcaccgtgtccaccaacgagtttctgtgcgacaaggacaagaccagcacagtggcccctaccatccacaccacagtgccctctccaaccaccacacctacacctaaagagaagcctgaggccggcacctactccgtgaacaacggcaatgatacctgcctgctggctaccatgggcctgcagctgaacatcacccaggataaggtggccagcgtgatcaacatcaaccccaacaccacacacagcaccggcagctgcagatctcatacagccctgctgagactgaacagcagcaccatcaagtacctggacttcgtgttcgccgtgaagaacgagaaccgcttctacctgaaagaagtgaacatcagcatgtacctcgtgaacggcagcgtgttctctatcgccaacaacaacctgagctactgggatgcccctctgggcagcagctacatgtgcaacaaagaacagaccgtgtccgtgtccggcgccttccagatcaacaccttcgacctgagagtgcagcccttcaacgtgacccagggcaagtacagcacagcccaagagtgtagcctggacgacgacaccattctgatccccatcatcgttggagccggcctgtctggcctgatcatcgtgatcgtgattgcctacgtgatcggcagaagaaagagctacgccggctaccagacactcggcagcggatacccttacgacgtgcccgattatgcctgaggatcc。
优选地，所述TAT多肽-Lamp2b融合蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列。
SEQ ID NO:5：
gaattcgccaccatggtctgcttcagactgttccctgtgcctggctctggactggtgcttgtgtgtctggtgctgggcgctgtgcggtcttatgccggcaatagcacaatgggcagcggctacggccggaagaagcggagacagagaagaagaggcagcggctctggcagcggaggatctagcctggaactgaacctgaccgacagcgagaacgccacctgtctgtatgccaagtggcagatgaacttcaccgtccgctacgaaaccaccaacaagacctacaagaccgtgaccatcagcgaccacggcaccgtgacatacaacggcagcatctgtggcgacgaccagaacggacctaagatcgccgtgcagttcggccctggctttagctggatcgccaactttacaaaggccgccagcacctacagcatcgacagcgtgtccttcagctacaacaccggcgacaacaccacctttccagacgccgaggataagggcatcctgaccgtggatgagctgctggccatcagaatccctctgaacgacctgttccggtgcaacagcctgagcaccctggaaaagaacgacgtggtgcagcactactgggacgtgctggtgcaggcctttgtgcagaatggcaccgtgtccaccaacgagtttctgtgcgacaaggacaagaccagcacagtggcccctaccatccacaccacagtgccctctccaaccaccacacctacacctaaagagaagcctgaggccggcacctactccgtgaacaacggcaatgatacctgcctgctggctaccatgggcctgcagctgaacatcacccaggataaggtggccagcgtgatcaacatcaaccccaacaccacacacagcaccggcagctgcagatctcatacagccctgctgagactgaacagcagcaccatcaagtacctggacttcgtgttcgccgtgaagaacgagaaccgcttctacctgaaagaagtgaacatcagcatgtacctcgtgaacggcagcgtgttctctatcgccaacaacaacctgagctactgggatgcccctctgggcagcagctacatgtgcaacaaagaacagaccgtgtccgtgtccggcgccttccagatcaacaccttcgacctgagagtgcagcccttcaacgtgacccagggcaagtacagcacagcccaagagtgtagcctggacgacgacaccattctgatccccatcatcgttggagccggcctgtctggcctgatcatcgtgatcgtgattgcctacgtgatcggcagaagaaagagctacgccggctaccagacactcggcagtggatctggatccggtggctcgagtatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatgatggacgagctgtacaagtgaggatcc。
优选地，所述表达载体包括慢病毒载体。
第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第二方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的功能化外泌体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白的表达载体和细胞穿膜肽-外泌体膜蛋白的表达载体，并进行慢病毒包装，获得低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒；
(2)使用所述低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒转染细胞，并对转染后细胞进行培养，收集培养液，提取外泌体，得到所述功能化外泌体。
优选地，步骤(2)所述细胞包括哺乳动物间充质干细胞，优选为大鼠骨髓间充质干细胞。
作为优选的技术方案，所述功能化外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)将低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白的核酸序列和细胞穿膜肽-外泌体膜蛋白的核酸序列分别插入pLVX质粒中构建表达载体，并进行慢病毒包装，获得低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒；
(2)使用所述低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，并对转染后细胞进行培养，收集培养液，提取外泌体，得到所述功能化外泌体。
第五方面，本发明提供一种载药系统，所述载药系统包括第一方面所述的功能化外泌体和负载于所述功能化外泌体内腔中的药物。
优选地，所述药物包括抗肿瘤药物。
优选地，所述载药系统还包括药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
第六方面，本发明提供第一方面所述的功能化外泌体、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的载药系统在制备药物中的应用。
优选地，所述药物包括脑部疾病药物，优选为脑胶质瘤治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中，低密度脂蛋白受体靶向多肽能够使得功能化外泌体在血脑屏障上聚集，细胞穿膜肽使得功能化外泌体高效率穿越血脑屏障进入脑组织，随后，低密度脂蛋白受体靶向多肽又能够介导进入脑组织的功能化外泌体在脑部肿瘤部位富集，因此，低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽协同发挥作用，不仅能够增强功能化外泌体对血脑屏障和胶质瘤细胞的主动选择性，还能提高功能化外泌体的穿越细胞膜效率，进而提高治疗效果；本发明的功能化外泌体的膜表面同时含有Angiopep-2和TAT多肽；
(2)本发明的功能化外泌体能够有效通过血脑屏障细胞bEnd.3并在脑胶质瘤细胞U87MG部位富集。
附图说明
图1为Lamp2b-Angiopep-2质粒图谱；
图2为Lamp2b-TAT质粒图谱；
图3A为Lamp2b mRNA表达结果；
图3B为pLVX表达结果；
图3C为Angiopep-2表达结果；
图3D为TAT多肽表达结果；
图4为免疫印迹法检测细胞中Angiopep-2和TAT多肽的表达结果；
图5为实施例1制备的功能化外泌体的透射电子显微镜图；
图6为实施例1制备的功能化外泌体的粒径分布图；
图7为外泌体免疫印迹技术检测结果图；
图8A为血脑屏障细胞bEnd.3摄取实施例1制备的功能化外泌体；
图8B为脑胶质瘤细胞U87MG摄取实施例1制备的功能化外泌体。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种功能化外泌体，所述功能化外泌体表达低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽为Angiopep-2，所述细胞穿膜肽为TAT多肽。
所述功能化外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)根据Angiopep-2、TAT多肽和Lamp2b蛋白的氨基酸序列合成相应Angiopep-2-Lamp2b融合蛋白的编码基因片段和TAT多肽-Lamp2b融合蛋白的编码基因片段，分别将上述基因片段构建到pLVX慢病毒载体上，得到Lamp2b-Angiopep-2质粒(图谱如图1所示)和Lamp2b-TAT质粒(图谱如图2所示)，Angiopep-2多肽氨基酸序列与TAT多肽氨基酸序列均分别位于Lamp2b蛋白质氨基酸序列的N端；
酶切反应体系如表1所示，酶切条件为37℃酶切3h；
表1
试剂 用量
pLVX慢病毒载体 1μg
10×Buffer Tango 2μL
DTT(20mM) 1μL
BsmBI 1μL
ddH<sub>2</sub>O 补至20μL
连接反应体系如表2所示，连接条件为16℃酶切3h；
表2
试剂 用量
线性化的载体DNA(50ng/μL) 2μL
退火的双链DNA 0.5μL
10×T4 Buffer 1μL
pEG4000 1μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 补至10μL
(2)取TOP10感受态(100μL)置于冰上，待其融化完全后加入10μL连接液，轻弹管壁以混匀，在冰中静置30min，42℃水浴热激90s，快速将感受态转移到冰上，冰浴2～5min；
每管加入500μL LB培养基(可先用水浴将培养基加热至37℃)，然后将感受态转移到37℃摇床中，恒温培养1h；
5000rpm离心1min，去除500μL上清液后吹打混匀，均匀涂布在Amp抗性的LB固体培养基上；
倒置平皿，置于37℃恒温培养箱中培养过夜，次日，进行菌落PCR验证，PCR验证体系如表3所示，PCR程序如表4所示；
表3
试剂 用量
2×Taq plus master mix 10μL
Primer(+) 0.5μL
Primer(-) 0.5μL
待验证菌落 10μL枪头沾一下
ddH<sub>2</sub>O 补足20μL
表4
Figure BDA0002937172180000111
Figure BDA0002937172180000121
(3)将阳性菌落加入20mL LB液体培养基中，加入20μL 100mg/mL氨苄西林，37℃恒温摇床180rpm孵育12～16h，根据质粒提取说明书提取质粒，并检测其质量与浓度；
(4)体外培养293T细胞，待细胞融合度达到80％左右进行质粒转染，转染前20min，更换无血清培养基，分别将Lamp2b-Angiopep-2质粒和Lamp2b-TAT质粒与转染试剂加入1.5mL EP管中吹打混匀，将混合物滴加到293T细胞表面，8h后更换正常培养基，转染48h后培养基呈清亮的黄色，收集上清毒液，1000rpm离心5min，取上清，分别得到Lamp2b-Angiopep-2慢病毒和Lamp2b-TAT慢病毒，-80℃保存或直接使用；
(5)取6周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％的医用乙醇中5～10min，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，剔除表面肌肉及结蹄组织，使用含双抗PBS溶液冲洗两遍；
破坏股骨两端骨质，使干骺端腔对外暴露，使用5mL无菌注射器吸取含双抗的DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，制作细胞悬液；
将制作的细胞悬液过44μm筛网，1000r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，以106个/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中，置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养；
培养8h首次换液，轻轻晃动，移除所有未贴壁细胞，加入新鲜培养基，24h再次换液，弃去培养液，PBS冲洗2～3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养，之后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合；
(6)接种细胞：用完全培养基制备密度为4×104个/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液，接种到6孔细胞培养板中，培养16～24h，至细胞融合度为20～30％；
转染：更换培养基并加入相应的感染增强液，根据细胞MOI及病毒滴度，加入Lamp2b-Angiopep-2慢病毒和Lamp2b-TAT慢病毒，病毒量计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度，继续培养12～16h，更换为常规培养基，继续培养；
继续培养：中途可对细胞换液，保持细胞活性；
筛选稳定细胞株：感染约72h后，加入含2μg/mL Puromycin的培养基，继续培养，根据死细胞数量，更换含Puromycin的培养基，继续培养；
待无明显死细胞后，提取细胞总RNA及总蛋白进行相关基因与蛋白水平表达；
(7)扩增培养稳定表达Angiopep-2和TAT多肽的大鼠骨髓间充质干细胞，分离收集培养上清液；
超速离心法获取外泌体：4℃、200×g离心5min去除死细胞，4℃、2000×g离心5min去除细胞碎片，4℃、10000×g离心5min去除细胞外囊泡，4℃、100000×g离心5min，收集沉淀即所述功能化外泌体，使用PBS重悬，重复离心2次。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于所述步骤(6)中仅使用空载慢病毒pLVX转染大鼠骨髓间充质干细胞，其它与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于所述步骤(6)中仅使用Lamp2b-Angiopep-2慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于所述步骤(6)中仅使用Lamp2b-TAT慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，其它与实施例1相同。
试验例1
分别对实施例1中转染后细胞(稳定表达Angiopep-2多肽片段的293-T细胞，Ang-2/TAT)、对比例1中转染后细胞(空载慢病毒pLVX转染大鼠骨髓间充质干细胞，pLVX)、对比例2中转染后细胞(稳定表达Angiopep-2多肽片段的大鼠骨髓间充质干细胞，Ang)和对比例3中转染后细胞(稳定表达TAT多肽片段的大鼠骨髓间充质干细胞，TAT)进行real-time PCR及免疫印迹分析。
real-time PCR结果如图3A、图3B、图3C和图3D所示，实施例1中转染后细胞能同时表达Angiopep-2和TAT多肽；免疫印迹分析结果如图4所示，实施例1中转染后细胞能同时表达标签蛋白HA和EGFP，在本发明中HA与Angiopep-2同时表达，EGFP与TAT多肽同时表达；综合上述可知本发明成功获得同时过表达Angiopep-2和TAT多肽的细胞。
试验例2
取实施例1获得的功能化外泌体(Ang/TAT-Exo)、对比例1获得的外泌体(pLVX-Exo)、对比例2获得的外泌体(Ang-Exo)和对比例3获得的外泌体(TAT-Exo)，通过透射电子显微镜观察外泌体形貌特征及粒径大小，纳米颗粒示踪技术检测外泌体浓度及粒径分布范围，免疫印迹法检测外泌体标志物蛋白表达情况。
实施例1中功能化外泌体形貌如图5所示，粒径分布如图6所示，可知，本发明成功提取外泌体。
免疫印迹法检测结果如图7所示，Alix、CD9和CD63均为外泌体(Exo)标志物蛋白，HA和EGFP分别为Angiopep-2和TAT多肽的标志物蛋白，因此，实施例1制备的功能化外泌体同时含有Angiopep-2和TAT多肽。
试验例3
取实施例1制备的功能化外泌体进行血脑屏障细胞bEnd.3及脑胶质瘤细胞U87MG摄取试验，以亲脂性染料DiO(绿色)标记功能化外泌体，结果如图8A和图8B所示。
由图8A和图8B可知，bEnd.3为脑微血管内皮细胞，模拟血脑屏障中的血管内皮细胞，U87MG为脑胶质瘤细胞，可以观察到两种细胞上有绿色荧光，说明两种细胞可以摄取功能化外泌体，即本发明的功能化外泌体能够有效通过血脑屏障并在脑胶质瘤细胞部位富集。
综上所述，本发明将Angiopep-2和TAT多肽同时修饰在外泌体表面，能够使得外泌体有效通过血脑屏障并在脑胶质瘤细胞部位富集。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 一种功能化外泌体及其制备方法和应用
<130> 20210203
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn
20 25 30
Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met
35 40 45
Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val
50 55 60
Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly
65 70 75 80
Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe
85 90 95
Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp
100 105 110
Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp
115 120 125
Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg
130 135 140
Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu
145 150 155 160
Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe
165 170 175
Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp
180 185 190
Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro
195 200 205
Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser
210 215 220
Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln
225 230 235 240
Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro
245 250 255
Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu
260 265 270
Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val
275 280 285
Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr
290 295 300
Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr
305 310 315 320
Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr
325 330 335
Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val
340 345 350
Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys
355 360 365
Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly
370 375 380
Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg
385 390 395 400
Arg Lys Ser Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr Leu
405 410
<210> 4
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaattcgcca ccatggtctg cttcagactg ttccctgtgc ctggctctgg actggtgctt 60
gtgtgtctgg tgctgggcgc tgtgcggtct tatgccggca atagcacaat gggcagcggc 120
acattcttct acggcggcag ccggggcaag agaaacaact tcaagaccga ggaatacggc 180
agcggctctg gcagcggagg atctagcctg gaactgaacc tgaccgacag cgagaacgcc 240
acctgtctgt atgccaagtg gcagatgaac ttcaccgtcc gctacgaaac caccaacaag 300
acctacaaga ccgtgaccat cagcgaccac ggcaccgtga catacaacgg cagcatctgt 360
ggcgacgacc agaacggacc taagatcgcc gtgcagttcg gccctggctt tagctggatc 420
gccaacttta caaaggccgc cagcacctac agcatcgaca gcgtgtcctt cagctacaac 480
accggcgaca acaccacctt tccagacgcc gaggataagg gcatcctgac cgtggatgag 540
ctgctggcca tcagaatccc tctgaacgac ctgttccggt gcaacagcct gagcaccctg 600
gaaaagaacg acgtggtgca gcactactgg gacgtgctgg tgcaggcctt tgtgcagaat 660
ggcaccgtgt ccaccaacga gtttctgtgc gacaaggaca agaccagcac agtggcccct 720
accatccaca ccacagtgcc ctctccaacc accacaccta cacctaaaga gaagcctgag 780
gccggcacct actccgtgaa caacggcaat gatacctgcc tgctggctac catgggcctg 840
cagctgaaca tcacccagga taaggtggcc agcgtgatca acatcaaccc caacaccaca 900
cacagcaccg gcagctgcag atctcataca gccctgctga gactgaacag cagcaccatc 960
aagtacctgg acttcgtgtt cgccgtgaag aacgagaacc gcttctacct gaaagaagtg 1020
aacatcagca tgtacctcgt gaacggcagc gtgttctcta tcgccaacaa caacctgagc 1080
tactgggatg cccctctggg cagcagctac atgtgcaaca aagaacagac cgtgtccgtg 1140
tccggcgcct tccagatcaa caccttcgac ctgagagtgc agcccttcaa cgtgacccag 1200
ggcaagtaca gcacagccca agagtgtagc ctggacgacg acaccattct gatccccatc 1260
atcgttggag ccggcctgtc tggcctgatc atcgtgatcg tgattgccta cgtgatcggc 1320
agaagaaaga gctacgccgg ctaccagaca ctcggcagcg gataccctta cgacgtgccc 1380
gattatgcct gaggatcc 1398
<210> 5
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaattcgcca ccatggtctg cttcagactg ttccctgtgc ctggctctgg actggtgctt 60
gtgtgtctgg tgctgggcgc tgtgcggtct tatgccggca atagcacaat gggcagcggc 120
tacggccgga agaagcggag acagagaaga agaggcagcg gctctggcag cggaggatct 180
agcctggaac tgaacctgac cgacagcgag aacgccacct gtctgtatgc caagtggcag 240
atgaacttca ccgtccgcta cgaaaccacc aacaagacct acaagaccgt gaccatcagc 300
gaccacggca ccgtgacata caacggcagc atctgtggcg acgaccagaa cggacctaag 360
atcgccgtgc agttcggccc tggctttagc tggatcgcca actttacaaa ggccgccagc 420
acctacagca tcgacagcgt gtccttcagc tacaacaccg gcgacaacac cacctttcca 480
gacgccgagg ataagggcat cctgaccgtg gatgagctgc tggccatcag aatccctctg 540
aacgacctgt tccggtgcaa cagcctgagc accctggaaa agaacgacgt ggtgcagcac 600
tactgggacg tgctggtgca ggcctttgtg cagaatggca ccgtgtccac caacgagttt 660
ctgtgcgaca aggacaagac cagcacagtg gcccctacca tccacaccac agtgccctct 720
ccaaccacca cacctacacc taaagagaag cctgaggccg gcacctactc cgtgaacaac 780
ggcaatgata cctgcctgct ggctaccatg ggcctgcagc tgaacatcac ccaggataag 840
gtggccagcg tgatcaacat caaccccaac accacacaca gcaccggcag ctgcagatct 900
catacagccc tgctgagact gaacagcagc accatcaagt acctggactt cgtgttcgcc 960
gtgaagaacg agaaccgctt ctacctgaaa gaagtgaaca tcagcatgta cctcgtgaac 1020
ggcagcgtgt tctctatcgc caacaacaac ctgagctact gggatgcccc tctgggcagc 1080
agctacatgt gcaacaaaga acagaccgtg tccgtgtccg gcgccttcca gatcaacacc 1140
ttcgacctga gagtgcagcc cttcaacgtg acccagggca agtacagcac agcccaagag 1200
tgtagcctgg acgacgacac cattctgatc cccatcatcg ttggagccgg cctgtctggc 1260
ctgatcatcg tgatcgtgat tgcctacgtg atcggcagaa gaaagagcta cgccggctac 1320
cagacactcg gcagtggatc tggatccggt ggctcgagta tggtgagcaa gggcgaggag 1380
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 1440
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 1500
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 1560
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 1620
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 1680
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 1740
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 1800
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 1860
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 1920
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 1980
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 2040
gccgggatca ctctcggcat gatggacgag ctgtacaagt gaggatcc 2088

Claims (10)

1.一种功能化外泌体，其特征在于，所述功能化外泌体膜表面同时表达低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽；
所述低密度脂蛋白受体靶向多肽包括Angiopep-2；
所述细胞穿膜肽包括TAT多肽。
2.根据权利要求1所述的功能化外泌体，其特征在于，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽分别与外泌体的膜蛋白融合表达；
优选地，所述低密度脂蛋白受体靶向多肽和细胞穿膜肽分别连接在外泌体的膜蛋白的氨基端；
优选地，所述膜蛋白包括Lamp2b蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的功能化外泌体，其特征在于，所述Angiopep-2包括SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述TAT多肽包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述Lamp2b蛋白包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白融合蛋白的编码基因，优选为Angiopep-2-Lamp2b融合蛋白的编码基因；
或所述表达载体包括细胞穿膜肽外泌体膜蛋白融合蛋白的编码基因，优选为TAT多肽-Lamp2b融合蛋白的编码基因；
优选地，所述Angiopep-2-Lamp2b融合蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
优选地，所述TAT多肽-Lamp2b融合蛋白的编码基因包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
优选地，所述表达载体包括慢病毒载体。
5.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求4所述的表达载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的功能化外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白的表达载体和细胞穿膜肽-外泌体膜蛋白的表达载体，并进行慢病毒包装，获得低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒；
(2)使用所述低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒转染细胞，并对转染后细胞进行培养，收集培养液，提取外泌体，得到所述功能化外泌体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞包括哺乳动物间充质干细胞，优选为大鼠骨髓间充质干细胞。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将低密度脂蛋白受体靶向多肽-外泌体膜蛋白的核酸序列和细胞穿膜肽-外泌体膜蛋白的核酸序列分别插入pLVX质粒中构建表达载体，并进行慢病毒包装，获得低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒；
(2)使用所述低密度脂蛋白受体靶向多肽慢病毒和细胞穿膜肽慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞，并对转染后细胞进行培养，收集培养液，提取外泌体，得到所述功能化外泌体。
9.一种载药系统，其特征在于，所述载药系统包括权利要求1-3任一项所述的功能化外泌体和负载于所述功能化外泌体内腔中的药物；
优选地，所述药物包括抗肿瘤药物；
优选地，所述载药系统还包括药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
10.权利要求1-3任一项所述的功能化外泌体、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的重组慢病毒或权利要求9所述的载药系统在制备药物中的应用；
优选地，所述药物包括脑部疾病药物，优选为脑胶质瘤治疗药物。
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