CN108623657B

CN108623657B - 多肽、重组dna分子、重组载体、外泌体及其应用

Info

Publication number: CN108623657B
Application number: CN201810447876.9A
Authority: CN
Inventors: 李杨欣; 邵联波; 沈振亚
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN108623657A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用。本发明提供了肽段，通过基因工程技术将筛选出的靶向肽与外泌体膜蛋白lamp2b构建成重组蛋白并表达在外泌体表面，从而保证外泌体的心肌靶向性，为外泌体治疗心梗奠定基础。

Description

多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用。

背景技术

心力衰竭是人类健康的头号杀手，其中心肌梗死（myocardial infarction, MI）是造成心力衰竭的主要原因。心梗发生后，大量心肌细胞死亡，炎症反应加剧，成纤维细胞向成肌纤维细胞转化，继而引发心肌纤维化，最终导致心力衰竭。

目前药物治疗心血管疾病方面主要存在以下问题：（1）药物的毒性以及非靶向性；（2）易被人体清除，体内循环的半衰期很短。由于缺乏组织特异性，为在病变部位达到有效浓度，因此药物用量大，甚至还会引起毒副作用。因此，发展靶向性药物载体，特异性将药物导入心血管病变部位，是国内外心血管药物研究的一个重大课题。

近年来，干细胞及其分泌的外泌体（exosomes）移植为治疗心梗提供了一个崭新的策略。细胞来源的外泌体是细胞间运输生物分子的天然载体，也是用于药物治疗的很有前途的运载工具。采用外泌体运输药物，可以提高药物体系的水溶性，降低药物对人体的毒性以及避免被网状内皮系统捕获，从而延长其循环时间。间充质干细胞能够在体外大量培养，产生相对较大量的外泌体来提供个性化治疗；外泌体的安全性已经在不同的动物体内实验中证实。外泌体中富含功能性的ncRNA，加上其本身具有稳定、可定量等特性，并且与干细胞移植相比，外泌体移植可避免细胞在体内的异常分化、潜在致瘤性等风险，因此外泌体移植治疗心梗更备受研究者的青睐。虽然，外泌体移植是当前临床上治疗心血管疾病最新的研究方向，但由于其内含物不明确，靶向特异性差，在心梗区驻留时间短，作用机制尚不清楚，使得其在临床上的应用备受限制。外泌体治疗心梗，最佳选择是无创伤的静脉输入。在这种方式的治疗过程中，外泌体的靶向性是迫切需要解决的问题。因此，为了提高外泌体治疗心梗的疗效，研究如何获得修复效果更好的外泌体，提高外泌体的靶向性和驻留率，是目前亟待解决的科学问题。

在MSCs等多种细胞中，外泌体是其分泌的主要功能因子，而且在细胞通讯网络中具有介导作用。外泌体是一种由细胞分泌至胞外，直径在40-100 nm之间的纳米级、膜性囊泡样小体，可携带mRNAs、ncRNA （例如miRNAs、lncRNA）等多种生物学功能分子，在细胞信号传导、表观遗传学调控、免疫调节、器官修复等过程中起调控作用。作为细胞间运送核酸的天然载体，外泌体具有不易降解、稳定性强等特性。此外，人工合成的外源RNA进入体内后会被血浆中高活性的核酸酶迅速降解而失去功效，而利用外泌体作为ncRNA载体，能解决这一难题。同时，外泌体在移植治疗中还具有可定量的优势。因此，可以说外泌体是一种运送ncRNA治疗疾病的新型载体。

噬菌体展示技术是一种蛋白质组学技术，可以通过基因工程改造噬菌体表面上展示随机多肽文库。为了保证外泌体的靶向性，可以将配体分子表达在外泌体的膜表面，但天然配体大多数是一些大分子，与膜蛋白融合后会影响膜蛋白的表达及正确折叠，进而影响其在膜上的正确展示。天然配体的核心片段仅由几十个氨基酸组成，所以在外泌体上表达配体的核心片段以提高其靶向性是一个发展趋势。另外，噬菌体展示技术也可以筛选出未知受体的归巢肽。这些归巢肽通常是只含有8-20个氨基酸残基的小肽，这些小肽可以很容易地被展示在外泌体表面。因此，寻找针对已知受体的核心配体片段或者未知受体的心肌细胞归巢肽，是提高外泌体靶向性治疗心梗的关键环节。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用。本发明提供了肽段，通过基因工程技术将筛选出的靶向肽与外泌体膜蛋白lamp2b构建成重组蛋白并表达在外泌体表面，从而保证外泌体的心肌靶向性，为外泌体治疗心梗奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种多肽，其具有Ⅰ、Ⅱ或III所示的氨基酸序列中任意一个：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

Ⅱ、具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

III、与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80%一致性的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个或5个氨基酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。

本发明还提供了所述的多肽作为心肌缺血后心肌细胞的靶向肽的应用。

本发明还提供了所述的多肽在制备检测心肌缺血的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种编码所述的多肽的DNA分子。

本发明还提供给了重组DNA分子，包括所述的DNA分子和编码外泌体膜蛋白的DNA分子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体膜蛋白为lamp2b。

本发明还提供了一种重组载体，其包含所述的重组DNA分子和可接受的载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述可接受的载体为pRRL-VENUS慢病毒载体。

在本发明的一些具体实施方案中，其具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅷ、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

Ⅸ、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

Ⅹ、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%同源性的序列；

Ⅺ、如Ⅷ、Ⅸ或Ⅹ所示序列的互补序列。

本发明还提供了转化体，其由所述的重组载体转入宿主细胞获得。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为间充质干细胞，但不限于间充质干细胞，也包括其他宿主细胞如293T等。

本发明还提供了外泌体，其由所述的转化体分泌获得。

本发明还提供了所述的外泌体在制备检测和/或治疗心肌缺血和/或心肌梗死的药物中的应用。

本发明还提供了用于检测和/或治疗心肌缺血和/或心肌梗死的药物，包括所述的外泌体和药学上可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体的有效浓度为300μg~1500μg/kg大鼠体重或48~240μg/kg人体重。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、擦剂、膜剂、贴剂、膏剂、软膏剂、橡胶膏剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂、滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、栓剂、气雾剂、吸入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、灌肠剂或栓剂。

缺血损伤后的心肌组织中的蛋白表达和分布发生变化。在体内筛选中，噬菌体显示可以识别对缺血性心脏组织具有优先结合作用的多肽。本发明使用噬菌体体内展示技术，依照结合力从强到弱，从多肽文库中筛选出与心肌细胞特异性结合的肽段，然后通过基因工程技术将筛选出的靶向肽与外泌体膜蛋白lamp2b构建成重组蛋白并表达在外泌体表面，从而保证外泌体的心肌靶向性，为外泌体治疗心梗奠定基础。已证实脐带间充质干细胞来源的外泌体具有修复心肌梗死的作用，因此本发明以脐带间充质干细胞来源的外泌体为例，比较心肌靶向性外泌体对心肌梗死的修复作用。

本发明中的心肌靶向性的外泌体还可以作为靶向缺血损伤后的心肌细胞的药物载体发挥作用，可以将小分子化合物或者核酸药物导入到该外泌体中后，再经静脉注射外泌体，通过该外泌体将药物特异性运送到缺血的心肌组织，进而达到靶向性治疗心肌梗死或缺血性心肌病的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示构建心肌靶向性外泌体技术路线图；

图2示经过筛选后噬菌体在不同组织中的富集程度；

图3示外泌体膜蛋白（Lamp2b）对应的DNA序列+心肌细胞归巢肽（CM-peptide）对应的DNA序列（首尾分别加上BamH I和Not I的内切酶酶切位点）；

图4示心肌靶向性外泌体的鉴定；其中，图4（A）透射电镜下可观察到，转染CMP-Lamp2b-VENUS重组表达载体后，UMSCs细胞来源的外泌体，直径在30-100nm，呈典型的杯托样结构，膜内为低电子密度成分；图4（B）流式细胞术对外泌体的表面标志进行检测，检测结果均表明CD63分子在外泌体中高表达；

图5示CMP-Exo靶向性验证；

图6示不同的外泌体对心肌梗死修复效果；其中，图6（A）示小动物心脏超声系统检测移植不同外泌体后1天、7天、14天对心功能的影响；图6（B）心超结果统计图，与blank-Exo相比，CMP-Exo修复效果明显（n=4, P<0.01）；

图7示Masson染色显示心肌梗死后的纤维化面积；

图8示检测心肌组织中调亡相关蛋白Bim的表达；不同的外泌体移植到大鼠心梗模型中，3天后Western blot检测组织中Bim的表达量，CMP-Exo组Bim的表达明显减少，说明凋亡细胞减少。

具体实施方式

本发明公开了多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明利用噬菌体展示技术筛选出靶向缺血损伤后心肌细胞的靶向肽，序列为CTSSMLKEC的多肽。此外，还提供了所述的多肽的对应DNA序列与外泌体膜蛋白lamp2b对应的DNA构成的重组DNA序列。在本发明的另一些实施例中，将所述DNA序列插入到pRRL-VENUS慢病毒载体中构建的Lamp2b-CM-Peptide-VENUS重组表达载体过表达重组质粒。在另一些具体实施例中，将所述的重组表达载体转染间充质干细胞或者其他细胞来源的可以靶向缺血心肌细胞的靶向性外泌体。由于UMSCs来源的外泌体本身具有修复心肌梗死的效果，因此本发明中以UMSCs细胞作为母代细胞来制备心肌细胞特异性的外泌体，但是本发明的应用范围不仅限于UMSCs细胞。

本发明提供的多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 噬菌体筛选心肌细胞特异性靶向肽

①筛选心肌细胞归巢肽：在大鼠心梗术后40分钟，经心尖向左心室注射1× 10¹¹噬菌体克隆 (Ph.D.-C7C, New England Biolabs)，体内循环10分钟后，再次经心尖注射PBS洗脱未结合的噬菌体，处死大鼠，提取左室心梗区和其他器官（肺、肝、肾）组织各40 mg。与此同时，向另一组心梗大鼠心脏中注射野生型的M13KE 噬菌体文库(New EnglandBiolabs)。此野生型的噬菌体是没有插入肽段的噬菌体，其衣壳蛋白不表达多肽。进行蓝白斑筛选时，野生型为白色斑点，所以筛选时用作阴性对照。

②富集心肌细胞归巢肽：向提取的组织中加入含蛋白酶抑制剂的DMEM培养基，匀浆制备成悬液，离心后收集并洗涤沉淀。用收集得到的噬菌体转染处于生长中期的大肠杆菌ER2738，并扩增从左室心梗组织中筛选到的噬菌体，即为第一轮富集的噬菌体。将第一轮富集的噬菌体再次扩增后注射到大鼠心梗模型中，进行第二轮的筛选。同理，将第二轮富集的噬菌体扩增后，进行第三轮筛选。在每轮筛选中，均使用野生型噬菌体作为对照（图2、表1）。

③推断心肌细胞归巢肽序列：经过三轮筛选后，收集结合到心梗部位的噬菌体克隆200个。为了确定筛选出的噬菌体所展示的氨基酸序列，用下列引物通过PCR方法扩增插入噬菌体中的DNA片段。Forward primer：5′-TGTCGGCGCAACTATCGGTATCAA-3′（如SEQ IDNO.4所示），Reverse primer：5′-TAGCATTCCACAGACAGCCCTCTA-3′（如SEQ ID NO.5所示），并将扩增的DNA片段送公司进行高通量测序。

筛选靶向心肌细胞的归巢肽：人工合成这些靶向心肌细胞的归巢肽，选择具有组织穿透能力好，受背景干扰小，发射波长在650-900 nm的Cy5.5荧光基团标记多肽（InnovaBiosciences的标记试剂盒），经尾静脉注射到大鼠心梗模型中，体内循环10分钟后，处死大鼠，并根据荧光强度及与心肌细胞的共定位情况，选出特异性最强的心肌细胞归巢肽，把它定义为CM-peptide，根据共定位情况我们发现，与非缺血区相比，序列为CTSSMLKEC的多肽（如SEQ ID NO.1所示）在心肌缺血部位富集程度较高。

表1

实施例2 外泌体膜蛋白与归巢肽的重组表达质粒构建

人工合成外泌体膜蛋白（Lamp2b）对应的DNA序列+实施例1获得的心肌细胞归巢肽（CM-peptide，CMP）对应的DNA序列，插入到pRRL-VENUS慢病毒载体中，构建成Lamp2b-CMP-VENUS重组表达载体，人工合成的序列具体如下（如SEQ ID NO.3所示）：

ggatccatgg tgtgcttccg cctcttcccg gttccgggct cagggctcgt tctggtctgc

ctagtcctgg gagctgtgcg gtcttatgca ttggaactta atttgacaga ttcagaaaat

gccacttgcc tttatgcaaa atggcagatg aatttcacag tacgctatga aactacaaat

aaaacttata aaactgtaac catttcagac catggcactg tgacatataa tggaagcatt

tgtggggatg atcagaatgg tcccaaaata gcagtgcagt tcggacctgg cttttcctgg

attgcgaatt ttaccaaggc agcatctact tattcaattg acagcgtctc attttcctac

aacactggtg ataacacaac atttcctgat gctgaagata aaggaattct tactgttgat

gaacttttgg ccatcagaat tccattgaat gaccttttta gatgcaatag tttatcaact

ttggaaaaga atgatgttgt ccaacactac tgggatgttc ttgtacaagc ttttgtccaa

aatggcacag tgagcacaaa tgagttcctg tgtgataaag acaaaacttc aacagtggca

cccaccatac acaccactgt gccatctcct actacaacac ctactccaaa ggaaaaacca

gaagctggaa cctattcagt taataatggc aatgatactt gtctgctggc taccatgggg

ctgcagctga acatcactca ggataaggtt gcttcagtta ttaacatcaa ccccaataca

actcactcca caggcagctg ccgttctcac actgctctac ttagactcaa tagcagcacc

attaagtatc tagactttgt ctttgctgtg aaaaatgaaa accgatttta tctgaaggaa

gtgaacatca gcatgtattt ggttaatggc tccgttttca gcattgcaaa taacaatctc

agctactggg atgcccccct gggaagttct tatatgtgca acaaagagca gactgtttca

gtgtctggag catttcagat aaataccttt gatctaaggg ttcagccttt caatgtgaca

caaggaaagt attctacagc ccaagagtgt tcgctggatg atgacaccat tctaatccca

attatagttg gtgctggtct ttcaggcttg attatcgtta tagtgattgc ttacgtaatt

ggcagaagaa aaagttatgc tggatatcag actctgtgca cttcctcgat gttaaaggagtgttaagcgg ccgc

实施例3 重组质粒转染母代细胞

①磷酸钙—DNA共沉淀法转染293T细胞，包装慢病毒质粒（实施例2制得的Lamp2b-CMP-VENUS重组表达载体）。以d 10 cm的培养皿为例，质粒的用量如下：

质粒名称	质量
		慢病毒重组质粒	10μg
△R2辅助质粒	6.5μg
		VSV-G辅助质粒	3.5μg
Rev辅助质粒	2.5μg

②病毒侵染靶细胞

由于UMSCs来源的外泌体本身具有修复心肌梗死的效果，因此本发明中以UMSCs细胞作为母代细胞来制备心肌细胞特异性的外泌体，但是本发明的应用范围不仅限于UMSCs细胞，也适用于其他细胞。将生长状态良好的UMSCs细胞，按照1:2的比例传代到d 10 cm的细胞培养皿中，培养过夜，第二天密度约为50%。感染前2 h，将细胞从培养箱中取出，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，37℃，5% CO₂感染4 h。感染后第二天（约 24 h），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，5% CO₂、37℃继续培养。感染后48 h，换上2ug/mL浓度的嘌呤霉素的选择培养基进行加压筛选，观察到不再有细胞死亡为止。

实施例4 外泌体的收集与鉴定

（1）外泌体的收集

①取生长状态良好的转染的UMSCs细胞（实施例3获得的），用含15% Exo-free FBS的α-MEM培养基培养细胞48 h后，收集培养上清。

②2000g 离心30min，去除死细胞及细胞碎片。

③将上清移入新的离心管中，并加入0.5倍体积的外泌体分离试剂，上下颠倒，充分混匀后，置于4℃孵育过夜。

④第二日，4℃条件下10,000g 离心60 min，管壁可见白色沉淀条带。弃上清后，用适量PBS重悬沉淀，然后BCA法检测外泌体浓度。

⑤将重悬的外泌体分装后置于-80℃保存。

（2）外泌体的鉴定（图4）

透射电镜观察

①分离出外泌体后，用1× PBS重悬并调整浓度至500μg/mL，2.5%戊二醛固定。

②取20-30μL固定好的外泌体悬液滴于碳膜包被的铜网上，室温静置1 min。

③用滤纸将铜网边缘的液体轻轻吸去，红外灯下烘干5 min。

④滴加一滴1%磷钨酸溶液(PH值6.8)于铜网上，室温下染色5 min。

⑤滤纸吸干磷钨酸溶液，铜网放置红外灯灯下烤干约10 min。

⑥透射电镜下观察并采集照片。

流式细胞术的鉴定

取BCA定量后，蛋白含量10μg的外泌体到1.5 mL EP管中用于流式测定，具体操作如下：

①将乳胶微球混匀后，取10μL的微球悬液加入到外泌体中，用移液枪吹打混匀，室温孵育15 min。

②向EP管中加入PBS至1mL，继续在室温下孵育2 h，间断混匀。

③加110μL 1M 甘氨酸溶液至EP管中，至终浓度为0.1M，混匀后室温孵育30 min。

④4000 rpm离心3 min，弃上清，去除未结合的外泌体。

⑤用1 mL含0.5% BSA的PBS重悬免疫微球沉淀，再次4000 rpm离心3 min，弃上清，重复洗涤2次。

⑥用100 μL含0.5% BSA的PBS重悬微球沉淀，加入10μL FITC标记的CD63流式抗体（Abcam，英国），4℃避光孵育 30min。

用含0.5% BSA的PBS 洗涤2遍。然后用200 μL含0.5% BSA的PBS重悬后，上机检测。

实施例5 外泌体靶向性检测

①使用外泌体分离试剂盒，将2 mg的外泌体（实施例4获得的）再次沉淀、分离出外泌体。

②向外泌体中，加入500 μL PKH26荧光标记试剂盒中的稀释液C，然后用移液器反复吹打，保证外泌体完全离散，无块状沉淀。

③染色前，将500 μL的稀释液C加入到1新的EP管中，然后向EP管中加入将2 μL的PKH26染液，配制成2×的染色液。

④尽快将500 μL的外泌体悬液加入到500 μL配制好的2×染色液中，立即用移液枪均匀快速混合样品。

⑤室温反应4 min，向反应体系中加入1 mL的Exo-free的血清孵育1 min，终止反应。

⑥再次用外泌体分离试剂盒分离、沉淀外泌体。

将PKH-26标记的外泌体200 μg尾静脉注射到心梗大鼠模型中，体内循环30min后，常规方法取组织材料，固定、脱水、包埋后，进行冰冻切片，再进行免疫荧光染色后，荧光显微镜下观察，经过改造后的CMP-Exo经静脉注射后可以归巢到缺血损伤的心肌组织（图5）。

实施例6 外泌体治疗心肌梗死效果检测

（1）大鼠心梗模型制作用10%水合氯醛按照0.3mL/100g体重的比例腹腔注射麻醉大鼠，按捏脚趾确认麻醉深度状态。脱毛膏除去颈部和胸前部区域毛发，然后将大鼠固定于手术平台上，橡皮筋牵拉上门牙以保持颈部张力。75％的酒精三次消毒颈部和胸前部区域。在下颚和胸骨在颈部的前部区域之间用剪刀作0.8 cm的切口。钝性分离皮肤、肌肉结缔组织暴露胸锁乳头肌肉和气管，横切剪开气管，行气管插管。立即气管导管连接呼吸机，呼吸机参数置于呼吸频率85次/min，呼吸比1：1，潮气量6-8mL。然后沿左侧胸骨逐层的剪开皮肤、肌肉层暴露肋骨，于第3、4 肋间钝性离断肋间肌并进入心包腔。牵拉暴露心脏后，钝性分离包膜，完全暴露心脏，并确保视野良好。在左心耳与肺动脉圆锥之间，找到行于心肌内与心大静脉走向一致的冠状动脉左前降支（LAD）后用6-0 丝线缝合结扎。LAD 阻断后对应供血区域颜色变白，同时心电图可显示ST 段抬高等心梗表现。充分止血后清理胸腔内积液，4-0 线连续逐层缝合关闭胸腔，待大鼠自主呼吸恢复后拔出气管导管。

（2）分别将200 μg的blank-Exo（即不表达靶向肽的外泌体，作为对照）和CMP-Exo（表面表达靶向肽CMP的外泌体）经尾静脉移植到大鼠心梗模型以后，分别在心梗后1天、7天、14天使用Vevo 2100小动物超声成像系统检测大鼠的心功能。大鼠预先用4%的异氟烷诱导麻醉，待意识丧失后，用2.5%的异氟烷持续麻醉进行心超检测。将大鼠仰卧位固定在恒温板上，通过金属电极同步记录体表温度、心电图与呼吸曲线。在二维超声心动图下根据左室流出道找到乳头肌，在乳头肌切面，采集“M”模式和“B”模式下二维超声心动图。通过Ｍ型超声心动图测量至少连续３个心动周期的左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室收缩末期内径(LVESD），并依据公式计算出相应的EF和FS数值（图6、表2、表3）。术后1天EF、FS组间无明显差异，心梗手术后14天，CMP-Exo组与blank-Exo相比EF、FS明显增加(EF=65.29±6.76%vs.46.26±4.27%，P<0.01；FS=32.55±4.14%vs.22.68±2.21%，P<0.01)，具有统计学意义。

（3）瘢痕面积检测我们选Masson‘s trichrome染色来评价心肌梗死面积。实验终点，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，取心脏组织，固定、脱水、包埋后，进行冰冻切片。Masson’strichrome染色具体步骤如下：

①将切片恢复至室温。

②Weigert铁苏木素染色3min。

③酸性乙醇分化液分化2s，充分水洗。

④Masson蓝化液返蓝10s，蒸馏水洗1min。

⑤丽春红品红染色液染色8min，弱酸工作液洗1min。

⑥磷钼酸溶液洗2min，弱酸工作液洗1min。

⑦苯胺蓝染色液染色2min，弱酸工作液洗1min。

⑧95%乙醇快速脱水；100%乙醇脱水3次，每次10s；二甲苯透明3次，每次2min。中性树胶封固。

CMP-Exo组和blank-Exo组相比瘢痕面积明显减小（CMP-Exo vs. blank-Exo=23.14±5.33%vs. 41.62±7.39%，P<0.01），具有统计学意义，与心超检测结果相符（图7、表4）。

（4）检测心肌组织中调亡相关蛋白Bim的表达

间充质干细胞来源的外泌体能够抑制心肌细胞的凋亡，因此外泌体移植3天后，检测梗死心肌组织中凋亡相关蛋白Bim的表达情况。术后3天处死大鼠，用1×PBS灌洗后取大鼠心脏，取其左心室心肌组织，提取组织的总蛋白后，Western blot对Bim的表达情况进行检测。检测结果发现，带有靶向肽的CMP-Exo组，Bim蛋白的表达量明显减少，说明改造后的外泌体能够有效的靶向到缺血损伤的心肌组织上，并在抑制心肌细胞的凋亡，进而发挥心肌保护作用（图8）。

表2 EF

表3 FS

表4

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 多肽、重组DNA分子、重组载体、外泌体及其应用

<130> MP1806886

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Thr Ser Ser Met Leu Lys Glu Cys

1 5

<210> 3

<211> 1274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgg tgtgcttccg cctcttcccg gttccgggct cagggctcgt tctggtctgc 60

ctagtcctgg gagctgtgcg gtcttatgca ttggaactta atttgacaga ttcagaaaat 120

gccacttgcc tttatgcaaa atggcagatg aatttcacag tacgctatga aactacaaat 180

aaaacttata aaactgtaac catttcagac catggcactg tgacatataa tggaagcatt 240

tgtggggatg atcagaatgg tcccaaaata gcagtgcagt tcggacctgg cttttcctgg 300

attgcgaatt ttaccaaggc agcatctact tattcaattg acagcgtctc attttcctac 360

aacactggtg ataacacaac atttcctgat gctgaagata aaggaattct tactgttgat 420

gaacttttgg ccatcagaat tccattgaat gaccttttta gatgcaatag tttatcaact 480

ttggaaaaga atgatgttgt ccaacactac tgggatgttc ttgtacaagc ttttgtccaa 540

aatggcacag tgagcacaaa tgagttcctg tgtgataaag acaaaacttc aacagtggca 600

cccaccatac acaccactgt gccatctcct actacaacac ctactccaaa ggaaaaacca 660

gaagctggaa cctattcagt taataatggc aatgatactt gtctgctggc taccatgggg 720

ctgcagctga acatcactca ggataaggtt gcttcagtta ttaacatcaa ccccaataca 780

actcactcca caggcagctg ccgttctcac actgctctac ttagactcaa tagcagcacc 840

attaagtatc tagactttgt ctttgctgtg aaaaatgaaa accgatttta tctgaaggaa 900

gtgaacatca gcatgtattt ggttaatggc tccgttttca gcattgcaaa taacaatctc 960

agctactggg atgcccccct gggaagttct tatatgtgca acaaagagca gactgtttca 1020

gtgtctggag catttcagat aaataccttt gatctaaggg ttcagccttt caatgtgaca 1080

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attatagttg gtgctggtct ttcaggcttg attatcgtta tagtgattgc ttacgtaatt 1200

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tgttaagcgg ccgc 1274

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtcggcgca actatcggta tcaa 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagcattcca cagacagccc tcta 24

Claims

1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.重组载体，其特征在于，其具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。

3.转化体，其特征在于，其由如权利要求2所述的重组载体转入宿主细胞获得。

4.外泌体，其特征在于，其由如权利要求3所述的转化体分泌获得。

5.如权利要求4所述的外泌体在制备治疗心肌缺血和/或心肌梗死的药物中的应用。

6.用于治疗心肌缺血和/或心肌梗死的药物，其特征在于，包括如权利要求4所述的外泌体和药学上可接受的辅料。