CN114712526A - 一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统及其应用 - Google Patents

一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术技术领域，具体涉及一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统及其应用。所述脑胶质瘤靶向系统包括：磁性纳米颗粒以及工程化外泌体，所述磁性纳米颗粒与工程化外泌体通过抗原抗体反应连接。本发明设计的靶向胶质瘤铁死亡的复合靶向系统，将磁性纳米颗粒(MNPs)的磁靶向特性与药物结合能力和工程化外泌体的血脑屏障(BBB)穿透能力和小干扰RNA封装能力结合起来。本发明通过联合靶向DHODH及GPX4通路并与Fe3O4释放的Fe2+离子协同作用，共同促进了胶质瘤的铁死亡，实现靶向治疗脑胶质瘤的目的，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系 统及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术技术领域，具体涉及一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵略性的脑肿瘤之一，预后不佳。目前，胶质母细胞瘤的标准治疗措施包括手术，然后同步口服替莫唑胺化疗及放射治疗，其他治疗方式如基因治疗，免疫治疗，甚至肿瘤电场治疗(TTFields)都没有大大延长患者的生存时间。胶质母细胞瘤患者的中位生存时间大约为14个月。因此，胶质瘤迫切需要新的治疗手段。
外泌体是一类大约50-150nm的细胞外囊泡，含有脂质、蛋白质和核酸等，它的作用主要是参与细胞间交流及基因的传递。最近研究表明，我们可以使用融合基因的方式来修饰外泌体，以产生工程外泌体，并通过超声甚至电转染的方式将药物或基因包裹在外泌体内，用于后续的药物或基因递送。且外泌穿体本身的生物相容性及穿透血脑屏障的能力，使其成为了一种有前景的胶质瘤治疗载体。
除此之外，以氧化铁介孔二氧化硅为首的磁性纳米颗粒在生物工程领域也有着广泛的应用。氧化铁颗粒的Fe3O4核心具有磁场下的靶向性，可在外部磁场的作用下传递到肿瘤位置，是很好的肿瘤靶向材料；且介孔二氧化硅由于其表面的孔隙特性，又可作为很好的药物运输载体。因此，将磁性纳米颗粒与工程化外泌体的结合，可以穿透血脑屏障靶向肿瘤，用于后续的药物及基因传递。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统及其应用。本发明通过合成具有磁性的以氧化铁颗粒为核心，表面可包裹药物的介孔二氧化硅纳米颗粒材料，并在颗粒最面层给与CD63抗体修饰，用于结合外泌体的CD63抗原；介孔二氧化硅的表面可以包裹小分子的药物；同时构建工程化的外泌体，将携带了Angiopep2-LAMP2B的融合基因转入人的骨髓来源间充质干细胞(hMSC)细胞，ANG肽修饰的外泌体可以通过靶向血脑屏障及肿瘤细胞表面的LRP1受体进而穿透血脑屏障并进一步靶向肿瘤细胞，后续通过电穿孔的办法，将基因治疗的siRNA或者先关药物导入外泌体中。最终将磁性纳米颗粒表面的CD63抗体结合工程化外泌体表面的CD63抗原，获得了一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的第一个方面，提供一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统，所述脑胶质瘤靶向系统包括：磁性纳米颗粒以及工程化外泌体，所述磁性纳米颗粒与工程化外泌体通过抗原抗体反应连接。
其中，所述磁性纳米颗粒具有核壳结构，更具体的，以氧化铁颗粒为核心，表面包覆有介孔二氧化硅；
所述工程化外泌体修饰有脑部靶向肽；
所述磁性纳米颗粒表面还可包裹有药物，具体的，可通过介孔二氧化硅的介孔结构包裹药物，所述药物可以是小分子化疗药物；如布喹那(Brequinar，CAS：96187-53-0)；
所述磁性纳米颗粒表面还修饰有抗体(可采用枝接方式连接修饰)，如CD63抗体，从而可于工程化外泌体上的CD63抗原进行结合。
所述脑部靶向肽可以为Angiopep-2(ANG肽)；ANG肽通过识别脑部血管中的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein)LRP受体穿过血脑屏障，LRP受体在胶质瘤细胞表面也高度表达，最终复合纳米颗粒通过识别肿瘤细胞中的LRP受体；更具体的，所述脑部靶向肽可以为ANG肽和溶酶体相关膜蛋白2B(LAMP2B)。
所述工程化外泌体还可以包覆有药物，具体的，所述药物可以为小干扰RNA(siRNA)；如siGPX4。上述小干扰RNA可通过电穿孔的方式转入工程化外泌体中。
经试验证明，当药物选用布喹那和siGPX4时，则本发明可通过联合瓦解二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)及GPX4铁死亡通路用于胶质瘤的靶向治疗。
本发明的第二个方面，提供上述脑胶质瘤靶向系统的制备方法，所述制备方法包括：
S1、构建磁性纳米颗粒；
S2、构建工程化外泌体；
S3、将磁性纳米颗粒与工程化外泌体进行结合形成复合物。
本发明的第三个方面，提供上述脑胶质瘤靶向系统在制备脑胶质瘤药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种药物，所述药物至少包含上述脑胶质瘤靶向系统。
本发明的第五个方面，提供一种脑胶质瘤靶向装置，所述装置包含：
a)上述脑胶质瘤靶向系统或药物；
b)具磁性的头盔。
所述头盔可以使得受试者佩戴使用，更具体的，所述头盔可以为光敏树脂材料制成，并含有磁铁(如钕铁硼磁铁)，则受到外部磁场引力作用，上述脑胶质瘤靶向系统或药物更易靶向受试者脑部血管区域。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统，所述脑胶质瘤靶向系统包括磁性纳米颗粒以及工程化外泌体，所述磁性纳米颗粒与工程化外泌体通过抗原抗体反应连接。上述技术方案在在外部磁场的作用下，脑胶质瘤靶向系统富集在脑部的血管中，进而ANG肽通过识别脑部血管中的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein)LRP受体穿过血脑屏障，LRP受体在胶质瘤细胞表面也高度表达，最终复合纳米颗粒通过识别肿瘤细胞中的LRP受体，将DHODH抑制剂及GPX4小干扰递送到胶质瘤细胞，通过联合靶向DHODH及GPX4通路并与Fe3O4释放的Fe2+离子协同作用，共同促进了胶质瘤的铁死亡，实现靶向治疗脑胶质瘤的目的，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中纳米颗粒系统整体构建模式图。
图2为本发明实施例中磁性纳米颗粒Fe3O4@mSiO2透射电镜(TEM)图。
图3为本发明实施例中ANG肽修饰的工程化外泌体制备流程图。
图4为本发明实施例中纳米颗粒与外泌体结合图。
图5为本发明实施例中3D小鼠头盔模型图。
图6为本发明实施例中小鼠模型应用示意图。
图7为本发明实施例中siRNA电转染示意图。
图8为本发明实施例中纳米颗粒被细胞吞噬验证图。
图9为本发明实施例中脑部靶向验证图。
图10为本发明实施例中小干扰RNA电转进外泌体图。
图11为本发明实施例中不同搭配体系脂质氧化验证图。
图12为本发明实施例中不同搭配体系细胞内GSH水平验证图。
图13为本发明实施例中不同搭配体系细胞内ROS水平流式细胞仪检测验证图。
图14为本发明实施例中不同搭配体系细胞内Fe2+水平流式细胞仪检测验证图。
图15为本发明实施例中不同搭配体系细胞活性检测图(CCK8)。
图16为本发明实施例中不同搭配体系小动物成像验证图。
图17为本发明实施例中不同搭配体系裸鼠生存期图。
图18为本发明实施例中外泌体及磁性纳米颗粒的粒径分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
铁死亡是近些年新发现的细胞程序化死亡新方式，在其他肿瘤中发展迅速，并筛选出了一系列的针对铁死亡的诱导药物。但是在胶质瘤中由于血脑屏障的存在，限制了铁死亡诱导剂的疗效。既往针对铁死亡的药物主要是针对谷胱甘肽过氧化物酶GPX4分子。铁死亡的本质是谷胱甘肽(GSH)的消耗和GPX4活性的下降，使脂质氧化物不能被代谢，最终这些Fe2+会产生活性氧并导致脂质氧化。最新研究发现，在线粒体中存在并与GPX4分子平行的铁死亡防御体系，二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)，在GPX4被抑制后，DHODH的水平代偿性升高，以抵消细胞的整体铁死亡程度，简言之，一个防御体系的消失将会使细胞依赖于另一体系，因此同时靶向这两个防御轴，将是促进细胞铁死亡的新方法。
因此，本发明针对这一现象，本发明设计了靶向胶质瘤铁死亡的复合靶向系统，将磁性纳米颗粒(MNPs)的磁靶向特性与药物结合能力和工程化外泌体的血脑屏障(BBB)穿透能力和小干扰RNA封装能力结合起来。该磁性纳米颗粒由一个四氧化三铁Fe3O4核心和一个中空的介孔二氧化硅SiO2外壳组成，该外壳与CD63抗体枝接。CD63抗体与EVs表面的CD63抗原结合。在介孔二氧化硅的表面，将DHODH的抑制剂Brequinar(BQR，FDA认证)封装在介孔二氧化硅表面。工程化外泌体来源于人的间充质干细胞(hMSCs)，通过将ANG肽与Lamp2b融合基因方式包装到外泌体膜中，GPX4的小干扰RNA通过电转染的方式封装到外泌体中。最终，将得到了磁性纳米颗粒与工程化外泌体在4℃过夜，得到最终的靶向系统MNPs@BQR@ANG-EXO-siGPX4。在外部磁场的作用下，该系统首先富集在脑部的血管中，然后ANG肽通过识别脑部血管中的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-relatedprotein)LRP受体穿过血脑屏障，LRP受体在胶质瘤细胞表面也高度表达，最终复合纳米颗粒通过识别肿瘤细胞中的LRP受体，将DHODH抑制剂及GPX4小干扰递送到胶质瘤细胞，通过联合靶向DHODH及GPX4通路并与Fe3O4释放的Fe2+离子协同作用，共同促进了胶质瘤的铁死亡。
具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统，所述脑胶质瘤靶向系统包括：磁性纳米颗粒以及工程化外泌体，所述磁性纳米颗粒与工程化外泌体通过抗原抗体反应连接。
本发明的又一具体实施方式中，所述磁性纳米颗粒具有核壳结构，更具体的，以氧化铁颗粒为核心，表面包覆有介孔二氧化硅；
本发明的又一具体实施方式中，所述工程化外泌体修饰有脑部靶向肽；
本发明的又一具体实施方式中，所述磁性纳米颗粒表面还可包裹有药物，具体的，可通过介孔二氧化硅的介孔结构包裹药物，所述药物可以是小分子化疗药物；如布喹那(Brequinar，CAS：96187-53-0)；
本发明的又一具体实施方式中，所述磁性纳米颗粒表面还修饰有抗体(可采用枝接方式连接修饰)，如CD63抗体，从而可于工程化外泌体上的CD63抗原进行结合。
本发明的又一具体实施方式中，所述脑部靶向肽可以为Angiopep-2(ANG肽)；ANG肽通过识别脑部血管中的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoproteinreceptor-related protein)LRP受体穿过血脑屏障，LRP受体在胶质瘤细胞表面也高度表达，最终复合纳米颗粒通过识别肿瘤细胞中的LRP受体；更具体的，所述脑部靶向肽可以为ANG肽和溶酶体相关膜蛋白2B(LAMP2B)。
所述工程化外泌体还可以包覆有药物，具体的，所述药物可以为小干扰RNA(siRNA)；如siGPX4。上述小干扰RNA可通过电穿孔的方式转入工程化外泌体中。
经试验证明，当药物选用布喹那和siGPX4时，则本发明可通过联合瓦解二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)及GPX4铁死亡通路用于胶质瘤的靶向治疗。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述脑胶质瘤靶向系统的制备方法，所述制备方法包括：
S1、构建磁性纳米颗粒；
S2、构建工程化外泌体；
S3、将磁性纳米颗粒与工程化外泌体进行结合形成复合物。
其中，所述步骤S1中，方法包括：构建以氧化铁颗粒为基核，介孔二氧化硅为壳的磁性纳米颗粒；
具体方法包括：
S1.1合成氧化铁纳米颗粒：将三氯化铁和油酸溶于无水乙醇、去离子水和正己烷混合溶液中，在60-80℃恒温反应1-5h(优选70℃恒温反应4h)；萃取产物并干燥后得固体油酸铁混合物，将油酸铁和油酸混合，在氮气环境中溶于1-十八烯，上述反应体系以恒定速度升温至300-350℃，恒温10-60min(优选为320℃恒温30min)，溶液由最初透明变为棕黑色；冷却至室温；离心沉淀即得；
S1.2合成氧化铁-二氧化硅纳米颗粒：将步骤S1.1制得的氧化铁纳米颗粒加入三氯甲烷与CTAB混合物中，超声混匀；向上述溶液中加入水，恒温60-80℃(优选70℃)搅拌；顺次向反应体系中加入氢氧化钠溶液、正硅酸四乙酯，恒温1-3h(优选2h)；离心，洗涤即得；
本发明的又一具体实施方式中，构建成功的磁性纳米颗粒修饰有抗体，采用接枝方式进行修饰连接，具体的，将步骤S1.2制得的氧化铁-二氧化硅纳米颗粒溶于PBS，加入EDC、sulfo-NHS，静置后加入氢氧化钠溶液，再加入CD63抗体，孵育，离心洗涤后重分散于PBS中即得。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，方法包括：
将pcDNA GNSTM-3-RVG-10-Lamp2B-HA质粒其中的RVG肽点突变为Angiopep-2肽(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)，从而构建N端携带GNSTM糖基化基序，C端携带HA标签的ANG-LAMP2B的融合基因；
将携带上述融合该基因的质粒转染(可通过诸如Lipo2000或Lipo3000转染试剂)进入人间充质干细胞hMSC，随后用超速离心的办法获取携带ANG肽修饰的工程化外泌体；
所述“用超速离心的办法获取携带ANG肽修饰的外泌体”的具体方法为：将含人间充质干细胞hMSC的细胞培养基低速离心(如500g)取上清液，对上清液继续高速离心(如20,000g)；过滤后，超高速离心(如100,000g)，外泌体颗粒在PBS中清洗，最后超高速(如100,000g)下离心进行回收外泌体。
优选的，所述工程化外泌体还含有药物，所述药物可以为小干扰RNA，具体为siGPX4，具体的，可采用电穿孔方式处理工程化外泌体，从而使得小干扰RNA进入工程化外泌体中。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述脑胶质瘤靶向系统在制备脑胶质瘤药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物，所述药物至少包含上述脑胶质瘤靶向系统；
本发明的又一具体实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。所述药学上可接受的载体或辅料选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、渗透压调节剂或表面活性剂中的一种或几种。
所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种脑胶质瘤靶向装置，所述装置包含：
a)上述脑胶质瘤靶向系统或药物；
b)具磁性的头盔。
所述头盔可以使得受试者佩戴使用，更具体的，所述头盔可以为光敏树脂材料制成，并含有磁铁(如钕铁硼磁铁)，则受到外部磁场引力作用，上述脑胶质瘤靶向系统或药物更易靶向受试者脑部血管区域。
其中，所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。具体的，所述受试者为脑胶质瘤患者。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统，其构建方法如下：
磁性纳米颗粒的构建：构建以氧化铁颗粒为基核，二氧化硅为壳的磁性纳米颗粒。Fe3O4纳米颗粒的合成：合成氧化铁纳米颗粒：将10.8g三氯化铁和36.5g油酸钠溶于80mL无水乙醇、60mL去离子水和140mL正己烷混合溶液中，在70℃恒温反应4h；萃取产物并干燥后得固体油酸铁混合物，将制得油酸铁和5.7g油酸混合，在氮气环境中溶于200g 1-十八烯，上述反应体系以恒定速度升温至320℃恒温30min，溶液由最初透明变为棕黑色；冷却至室温；离心沉淀即得；
Fe3O4-SiO2纳米颗粒的合成:将上述制得的Fe3O4纳米颗粒称取200mg加入30ml三氯甲烷，4g CTAB与200ml去离子水混合物中，超声混匀，获得1mg/mL氧化铁水溶液；取40mL上述溶液稀释至200ml，恒温60-80℃(优选70℃)搅拌；顺次向反应体系中加入2mol/L氢氧化钠溶液1.5mL，正硅酸四乙酯1.5mL，恒温2h；离心，乙醇洗涤即得。
将Fe3O4@SiO2重新分散于PBS溶液中，形成终浓度1mg/mL的溶液。加入200微升EDC溶液，200微升sulfo-NHS溶液，静置20min，加入20微升0.1M氢氧化钠，加入10μlCD63流式抗体后，4℃孵育2h，离心洗涤两次后重悬于去离子水中。Brequinar是通过混合孵育的方式，结合在纳米颗粒介孔二氧化硅的介孔结构孔隙内，具体结合方式为：将已经枝接CD63抗体的1mg/ml的纳米颗粒与1mg/ml的Brequinar药物于4℃在50rpm的摇床上混合孵育过夜，得到包裹了药物的纳米颗粒。
携带ANG肽修饰外泌体的合成：购买Addgene(Watertown,MA)公司的pcDNA GNSTM-3-RVG-10-Lamp2B-HA质粒，并将其中的RVG肽点突变为Angiopep-2肽(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)，从而构建了N端携带GNSTM糖基化基序，C端携带HA标签的ANG-LAMP2B的融合基因。将该基因通过Lipo2000或Lipo3000转染试剂转染进人间充质干细胞hMSC，随后用超速离心的办法获取携带ANG肽修饰的外泌体。具体方法为将细胞培养基在500g下离心10分钟，然后将上清液在20,000g下离心20分钟。将上清液转移到一个新的试管中，用0.22μm的过滤器过滤，在100,000g下离心70分钟，外泌体颗粒在大量的PBS中清洗，最后在100,000g下离心70分钟进行回收外泌体。
复合磁性纳米颗粒的构建：将磁性纳米颗粒及工程化外泌体在4℃孵育过夜，磁性纳米颗粒表面的CD63抗体可以结合外泌体上的CD63抗原，两者形成复合物。外泌体及磁性纳米颗粒的粒径分析，见图18；图2为单纯纳米颗粒的TEM图像。图4为纳米颗粒与外泌体复合结构的激光共聚焦图。
工程化外泌体内小干扰基因的包装：使用一个4毫米的比色皿和LonzaNucleofector 2B仪器对外泌体进行电穿孔，使得siGPX4进入外泌体。电穿孔后，用RNase处理外泌体，以去除可能结合在外泌体膜上的任何siRNA。然后，用冷的PBS稀释外泌体，在100,000g下离心70分钟，以去除未结合的siRNA。
配套的小鼠靶向磁性头盔：通过3D打印技术，设计适合小鼠头部大小的基于光敏树脂材料头盔，并将直径约为8mm*2mm(2000gs)的钕铁硼磁铁放入头盔顶部，用于尾静脉注射纳米颗粒后的小鼠脑部区域靶向。
效果验证：
1、纳米颗粒被细胞吞噬验证
如图8所示，将磁性纳米颗粒与LN229胶质瘤细胞共同孵育6h后，通过激光共聚焦拍摄，通过PKH26红色荧光标记的外泌体及FITC绿色荧光标记的磁性纳米颗粒共同被细胞所吞噬。
2、脑部靶向验证：
如图9所示，我们使用LN229 GBM细胞构建了一个人类衍生的肿瘤异种移植GBM模型，以验证这些NPs的肿瘤靶向能力。首先，将5*105个LN229细胞稀释在10微升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并注射到每只雄性无胸腺裸鼠的右额叶中。我们在第7天用一个小动物荧光成像设备验证了肿瘤的成功植入。在确认肿瘤的大小大致相同后，我们在每只小鼠身上放置了一个带有永久磁铁(由钕铁硼制成)的头盔，将血管NPs富集到小鼠的头部。并在24h后对小鼠的器官进行成像，结果提示加入了MNP@ANG-exo后脑部富集程最多，实现了脑部靶向。
3、小干扰RNA电转进外泌体：
如图7所示，将总共109个外泌体(通过NTA测量)与1.5μg FAM标记的siGPX4在电穿孔缓冲液(PBS,pH 7.3)中混合。使用一个4毫米的比色皿和Lonza Nucleofector 2B系统对外泌体进行电穿孔。电穿孔后，用RNase处理外泌体，以去除可能结合在外泌体膜上的任何siRNA。然后，用冷的PBS稀释外泌体，在100,000g下离心70分钟，以去除未结合的siGPX4。
如图10所示，通过激光共聚焦拍摄验证siRNA与外泌体的电转情况。PKH26红色荧光标记的外泌体及FAM绿色荧光标记的小干扰RNA存在明显的共定位现象并共同被细胞所吞噬
4、细胞内铁死亡疗效验证
4.1不同搭配体系脂质氧化验证
如图11所示，通过MDA脂质氧化检测试剂盒检测不同搭配体系脂质氧化程度。结果提示，当LN229细胞被复合NPs刺激48小时后，与正常细胞和那些单独用药物或siGPX4处理的细胞相比，整体细胞MDA水平增加了约5倍。
4.2不同搭配体系细胞内GSH水平验证
如图12所示，通过GSH检测试剂盒检测不同搭配体系细胞的GSH水平。结果提示，复合NPs刺激后，细胞的整体GSH水平明显下降。
4.3不同搭配体系细胞内ROS水平流式细胞仪检测验证
如图13所示，通过DCFH-DA探针的流式检测仪来检测不同搭配体系细胞内ROS水平验证。如图所示，单独用MNP、BQR或siGPX4处理，在一定程度上增加了细胞内的ROS水平，但在MNP@BQR@ANG-EXO-siGPX4处理的细胞中，ROS水平达到最大值。
4.4不同搭配体系细胞内Fe2+水平流式细胞仪检测验证
如图14所示，FerroOrang是一种新型的荧光探针，可以对活细胞中的Fe2+进行荧光成像。我们用流式细胞仪检测了细胞内的Fe2+，结果显示，随着MNPs加入LN229细胞，细胞内的Fe2+浓度逐渐增加，用MNP@BQR@ANG-EXO-siGPX4处理后，Fe2+达到最高水平。
5、动物实验验证
5.1不同搭配体系小动物成像验证
如图16所示，我们用Luci+LN229细胞构建了一个人源性肿瘤异种移植GBM模型，以评估NPs的抗肿瘤效果。裸体小鼠在肿瘤植入后的第7天被随机分组，随后每三天通过尾静脉注射不同浓度的NPs，运用图5、图6中显示了3D打印小鼠头盔模型进行磁靶向治疗。并在第7,14,21天对小鼠进行生物发光实验结果提示，MNP@BQR@ANG-EXO-siGPX4处理对肿瘤的再生发挥了最强的抑制作用。
5.2不同搭配体系裸鼠生存期
如图17所示，对裸鼠进行生存期验证。结果提示，在注射MNP@BQR@ANG-EXO-siGPX4的组别中，裸鼠的Kaplan-Meier生存曲线最长，有三只小鼠在第60天仍然活着。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于磁性纳米颗粒复合工程化外泌体的脑胶质瘤靶向系统，其特征在于，所述脑胶质瘤靶向系统包括：磁性纳米颗粒以及工程化外泌体，所述磁性纳米颗粒与工程化外泌体通过抗原抗体反应连接；
其中，所述磁性纳米颗粒具有核壳结构，其以氧化铁颗粒为核心，表面包覆有介孔二氧化硅；
所述工程化外泌体修饰有脑部靶向肽。
2.如权利要求1所述的脑胶质瘤靶向系统，其特征在于，所述磁性纳米颗粒表面还包裹有药物，优选的，其通过介孔二氧化硅的介孔结构包裹药物；
优选的，所述药物为小分子化疗药物；包括布喹那；
优选的，所述磁性纳米颗粒表面还修饰有抗体；优选的，所述抗体为CD63抗体。
3.如权利要求1所述的脑胶质瘤靶向系统，其特征在于，所述脑部靶向肽为Angiopep-2(ANG肽)；
优选的，所述工程化外泌体还包覆有药物，进一步优选的，所述药物为小干扰RNA，包括siGPX4。
4.权利要求1-3任一项所述脑胶质瘤靶向系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、构建磁性纳米颗粒；
S2、构建工程化外泌体；
S3、将磁性纳米颗粒与工程化外泌体进行结合形成复合物。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，方法包括：构建以氧化铁颗粒为基核，介孔二氧化硅为壳的磁性纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体方法包括：
S1.1合成氧化铁纳米颗粒：将三氯化铁和油酸溶于无水乙醇、去离子水和正己烷混合溶液中，在60-80℃恒温反应1-5h(优选70℃恒温反应4h)；萃取产物并干燥后得固体油酸铁混合物，将油酸铁和油酸混合，在氮气环境中溶于1-十八烯，上述反应体系以恒定速度升温至300-350℃，恒温10-60min(优选为320℃恒温30min)，溶液由最初透明变为棕黑色；冷却至室温；离心沉淀即得；
S1.2合成氧化铁-二氧化硅纳米颗粒：将步骤S1.1制得的氧化铁纳米颗粒加入三氯甲烷与CTAB混合物中，超声混匀；向上述溶液中加入水，恒温60-80℃(优选70℃)搅拌；顺次向反应体系中加入氢氧化钠溶液、正硅酸四乙酯，恒温1-3h(优选2h)；离心，洗涤即得；
优选的，构建成功的磁性纳米颗粒修饰有抗体，采用接枝方式进行修饰连接，具体的，将步骤S1.2制得的氧化铁-二氧化硅纳米颗粒溶于PBS，加入EDC、sulfo-NHS，静置后加入氢氧化钠溶液，再加入CD63抗体，孵育，离心洗涤后重分散于PBS中即得。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体方法包括：
所述步骤S2中，方法包括：
将pcDNA GNSTM-3-RVG-10-Lamp2B-HA质粒其中的RVG肽点突变为Angiopep-2肽，从而构建N端携带GNSTM糖基化基序，C端携带HA标签的ANG-LAMP2B的融合基因；
将携带上述融合该基因的质粒转染进入人间充质干细胞hMSC，随后用超速离心的办法获取携带ANG肽修饰的工程化外泌体；
优选的，所述工程化外泌体还含有药物，所述药物为小干扰RNA，具体为siGPX4；进一步优选的，采用电穿孔方式处理工程化外泌体，从而使得小干扰RNA进入工程化外泌体中。
8.权利要求1-3任一项所述脑胶质瘤靶向系统在制备脑胶质瘤药物中的应用。
9.一种药物，其特征在于，所述药物至少包含上述脑胶质瘤靶向系统；优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
10.一种脑胶质瘤靶向装置，其特征在于，所述装置包含：
a)权利要求1-3任一项所述脑胶质瘤靶向系统或权利要求9所述药物；
b)具磁性的头盔。
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