CN101289760A - 一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用 - Google Patents

一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于：所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，并将其应用于农药残留免疫测定中。其优点是：可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。

Description

一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用
技术领域：
本发明涉及一种噬菌体抗体库及其应用，尤其是一种能检测十六元大环内酯类农药小分子特异性的抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用，属于一种利用噬菌体展示技术构建的抗体库并将其用于农药残留免疫测定的范畴。
背景技术：
痕量农药免疫测定技术是一项目前国内外广泛研究和大量使用的农药残留筛选测定技术。它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一体，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、样品需要量少等优点，在农药的痕量检测方面取得了丰硕的成果。其中，小分子农药的抗体制备是核心内容，目前正呈现和快速发展的分子生物学技术相融合的形势。
从天然的或免疫的小鼠脾细胞或杂交瘤细胞提取抗体基因，以改建的噬菌体为载体构建抗体库，与ELISA法相结合，从已构建的展示库中筛选具有针对农药小分子半抗原的特异性抗体已成为研发热点，即对农药小分子半抗原进行设计和改造，合成人工抗原，将抗原包被在酶标板上，然后加入已构建好的待筛选的噬菌体，根据抗原抗体亲和性的大小，经过吸附-洗脱-扩增的筛选过程，从而得到针对农药小分子的高亲和抗体。利用噬菌体展示技术构建的抗体库可用于农药小分子抗体的筛选，或从特异性较高的偏向性库中筛选具有相同结构的一类小分子抗体。Carlos等1993年就报道了从半合成抗体库中筛选三种小分子半抗原的高亲和力抗体；Yi Li等在也在混合小分子抗体库中筛选出阿特拉津，西玛津，异丙隆，2甲4氯丙酸等四种除草剂小分子半抗原的高亲和力抗体；J.Bricheta等也从构建的天然抗体库中筛出除草剂2，4-D的抗体。而目前针对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，并以此构建的抗体库还未见报道。
目前国内外农药免疫检测技术已发展到通用型免疫检测，即制备得到的共性结构抗体(Generic structure antibody)。该种抗体利用抗体针对某些含有共有基团的农药产生交叉反应，制备一种抗体来检测多种农药，在农药残留的定性筛选检测中有独特的优势，尤其是针对一类农药品种的定性检测。Alococer等用有机磷的通用结构瞵酸做半抗原制备了广谱性的多克隆抗体，对10种以上的有机磷农药有特异性识别，将其应用于传感器分析中取得了较好的效果。Goodrow利用均三氮苯类除草剂的通用结构作半抗原制备的抗体对莠去津、扑草津、扑灭津均有特异性识别。但还没有采用共性抗体库技术的报道，本研究利用共性结构抗体库筛选的到的抗体其最低检测限及检测灵敏度较传统的多抗均有一定的优越性。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前利用噬菌体展示技术构建的抗体库中没有对十六元大环内酯类农药具有特异性识别的抗体，而提供一种新的噬菌体抗体库及其在农药残留免疫中的应用。
本发明的目的是这样实现的：一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于：所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中：所述的ScFv基因片段是这样构建的：
a)MILO-BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为模板，Oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链；
b)根据设计的多组简并性引物经RT-PCR法分别扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因；
c)分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH和VL合并片段为模板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension，SOE)将二者拼接成ScFv基因，大小在750bp左右，再分别将等量的VHB和VLF各条引物混合并以二者为引物进一步PCR扩增ScFv基因；
将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中：ScFv基因片段的核苷酸和氨基酸序列为：
atg gcc gag gtg caa ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tca ttg     60
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu
1               5                   10                  15                  20
aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc    120
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
21              25                  30                  35                  40
cag gct cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt gct cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat    180
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr
41              45                  50                  55                  60
gca aca tat tat gcc gat tca gtg aag gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa    240
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
61              65                  70                  75                  80
agc atg ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt    300
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
81              85                  90                  95                  100
gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc att ctc aca gtc tcc tcg ggt    360
Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser Gly
101             105                 110                 115                 120
ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc gac att gtg atg act cag    420
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
121             125                 130                 135                 140
tct cca tcc tcc ctg agt gtg tca gca gga gag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt    480
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
141             145                 150                 155                 160
cag agt cta ttc aac agt gga agt caa aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca    540
Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
161             165                 170                 175                 180
ggg cag cct cct aaa ttg ttg atc tac ggg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc cct gat    600
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
181             185                 190                 195                 200
cgc ttc aca ggc agt gga tct gga acc gat ttc act ctt acc atc agc agt gtg cag gct    660
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
201             205                 210                 215                 220
gaa gac ctg gca gtt tac tac tgt cag gat gac cat agt tat cca ttt acg ttc ggc tcg    720
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
221             225                 230                 235                 240
ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt gcg gcc gca gaa tga                                759
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu ＊＊＊
241             245                 250
该核苷酸和氨基酸序列命名为SEQ ID NO：1。
其中，VH基因的核苷酸和氨基酸序列为：
atg gcc gag gtg cag ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tca ttg     60
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va1 Gln Pro Lys Gly Ser Leu
1               5                   10                  15                  20
aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc    120
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
21              25                  30                  35                  40
cag gct cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt gct cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat    180
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr
41              45                  50                  55                  60
gca aca tat tat gcc gat tca gtg aag gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa    240
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
61              65                  70                  75                  80
agc atg ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt    300
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
81              85                  90                  95                  100
gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc att ctc aca gtc tcc tcg        357
Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser
101             105                 110                 115
该核苷酸和氨基酸序列命名为SEQ ID NO：2；
VL基因的核苷酸和氨基酸序列为：
gac att gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg agt gtg tca gca gga gag aag gtc act     60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr
1               5                   10                  15                  20
atg agc tgc aag tcc agt cag agt cta ttc aac agt gga agt caa aag aac tac ttg gcc    120
Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala
21              25                  30                  35                  40
tgg tac cag cag aaa cca ggg cag cct cct aaa ttg ttg atc tac ggg gca tcc act agg    180
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg
41              45                  50                  55                  60
gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct gga acc gat ttc act ctt acc    240
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
61              65                  70                  75                  80
atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tac tac tgt cag gat gac cat agt tat    300
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Asp His Ser Tyr
81              85                  90                  95                  100
cca ttt acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt                            342
Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
101             105                 110
该核苷酸和氨基酸序列命名为SEQ ID NO：3。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中：所述的分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH和VL合并片段为模板是指：将12条引物扩增的VH基因产物合并作为一个模板，将11条引物扩增的VL基因产物合并作为一个模板；所述的VLB和VHF引物含部分Linker序列，所述的VLF引物含NotI酶切位点，所述的VHB引物含SfiI酶切位点。
在本发明涉及的噬菌体抗体库中：所述构建的ScFv基因与pCANTAB5E载体连接是指：将纯化定量后的ScFv基因分别以SfiI和NotI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pCANTAB5E载体连接；所述的转化是指：a)0.2cm电转杯，25μF，2.5kV，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌TG1；b)转化产物加入2×YT后37℃振荡培养2h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养；c)次日计算平板上的克隆数，估算库容为2.4×106；d)将电转化后菌液加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2×YT-AK重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。
一种如本发明所述噬菌体抗体库在农药残留免疫中的应用，其特征在于：
a)用十六元大环内酯类农药的抗原包被固相筛选ELISA板，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；
b)将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取96个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μl菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株；
c)将阳性单克隆噬菌体感染非抑制型E.coliHB2151细胞在含IPTG和Amp的2×YT培养基中培养，其上清中富含抗体分子，获得可溶性单链抗体；
d)表达的可溶性单链抗体对a步骤中抗原相对应的十六元大环内酯类农药具有亲和性。
本发明所述噬菌体抗体库在农药残留免疫中的应用中：所述的十六元大环内酯类农药是指含有十六元大环内酯类共性结构小分子的农药
本发明的优点在于：可以不经动物免疫获得高亲和力抗体，试验周期短，此抗体库以十六元大环内酯共性结构小分子米尔比霉素肟化物为免疫原构建的噬菌体抗体库，理论上经过筛许可以直接获得十六元大环内酯类化合物的特异性抗体库，其筛选通量高、效率高、特异性强及亲和选择范围广，使其在农药抗体制备和检测技术发展等方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点组装ScFv基因片段的构件示意图；
图2是VH，VL，ScFv基因的PCR扩增结果的电泳图；
图3是重组噬菌体载体的PCR鉴定；
图4是MILO标准抑制曲线。
具体实施方式
实施例1
噬菌体抗体库的构建
材料：
噬菌粒pCANTAB5E，E.coli TG1冻干菌株，M13K07辅助噬菌体均为Pharmacia公司产品。试剂盒SV Total RNA Isolation System；ReverseTranscription System；各种限制性内切酶，连接酶均购自Promega公司。免疫原milbemycin oxime(A4、A3)-BSA(MILO-BSA)实验室保存，雌性7周龄Balb/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。
引物设计
在抗体分子轻、重链框架区FR1和FR4设计多组简并性引物如下所示：并在引物的两端分别加上连接肽(Gly4Ser)3(Linker)的部分序列和酶切位点，其中，VLF引物含NotI酶切位点，VHB引物含SfiI酶切位点。VHF引物含部分Linker序列，VLB引物含部分Linker序列，两个Linker序列有21个碱基序列相重叠。
VLB引物(含部分Linker序列)
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GTG MTM ACT CAGTC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT CAG ATG AYD CAGTC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GWG CTS ACC CAATC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAC ATT GTG ATG ACB CAGKC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATC CAG CTG ACT CAGCC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT MAG ATR AMC CAGTC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT GTT CTC AWC CAGTC-3’；
5’-tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc GAY ATT GTG ATG ACC CAGWT-3’。
VLF引物(含NotI酶切位点)
5’-cag tca ttc tgc ggc cgc ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG-3’；
5’-cag tca ttc tgc ggc cgc ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG-3’。
VHB引物(含SfiI酶切位点)
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAV GTG AWG STG GTG GAGTC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAK GTG CAM CTG GTG GARTC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAA GTG AAR STT GAG GAR TC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTB CAG CTB CAG CAGTC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG CAR CTT GTT GARTC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc CAG GTC CAA CTV CAG CARCC-3’；
5’-tta ctc gcg gcc cag ccg gcc atg gcc GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC-3’。VHF引物(含部分Linker序列)
5’-acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGA GGA GAC TGT GAGAAT GGT-3’；
5’-acc gga gcc gcc gcc gcc aga acc acc acc acc CGC AGA GAC AGT GACCAG AGT-3’。
载体特异性引物(用于连接片段的PCR鉴定)：
R1：5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’；
R2：5’-CGA TCT AAA GTT TTG TCG TCT TTC C-3’。
以上所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
[注：W＝A/T(W代表A或T)；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G；Y＝C/T；B＝C/G；K＝G/T；D＝A/G/T；V＝A/C/G]
(一)免疫动物
用免疫原MIOL-BSA免疫5只雌性7周龄Balb/c小鼠，初次免疫，0.2mg/只，腹腔注射；第4周开始每隔2周进行一次加强免疫，0.2mg/只，腹腔注射，共4次；最后一次加强免疫后进行冲击免疫，0.4mg/只，腹腔注射；10天后处死小鼠取其脾脏。
(二)提取小鼠脾细胞总RNA，全套VH，VL基因的扩增
提取免疫小鼠脾细胞总RNA，并以总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链。根据设计的多组简并性引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段，采用多个PCR条件，以使尽可能多的引物产生扩增条带(参见图2)。
(三)ScFv基因的构建
分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH，VL合并片段为模板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension，SOE)将二者拼接成ScFv(Single-chain variable fragments)基因。再以VHB合(将等量的VHB各条引物混合)，VLF合(将等量的VLF各条引物混合)为引物进行PCR扩增(参见图2)，获得大量的ScFv基因。
(四)ScFv基因与pCANTAB5E载体的连接与转化
将纯化定量后的ScFv基因分别以SfiI和NotI内切酶进行双酶切消化。纯化、定量后与同样双酶切pCANTAB5E载体连接(参见图1)。0.2cm电转杯，25μF，2.5kV，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌TG1。转化产物加入2×YT后37℃振荡培养2h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养。次日计算平板上的克隆数，估算库容。
(五)转化子及噬菌体抗体库多样性的鉴定
从平板上随机挑选10个菌落，扩大培养后提取质粒以含有SfiI、NotI酶切位点的单链抗体引物R1、R2进行PCR扩增进行鉴定是否含插入片段(参见图3)。将含有目的基因的质粒交由上海英骏公司测序并与已发表的序列进行同源性比较。用六碱基内切酶BamHI与KpnI对所提质粒双酶切进行噬菌体抗体库多样性鉴定。
(六)噬菌体单链抗体表面展示文库的构建
用2×YT-AG洗下10块SOBAG平板上所有转化菌落制成悬液，用2×YT-AG稀释至A600约为0.2，取10mL 37℃、250rpm振摇培养至A600为0.4，加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2×YT-AK重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。
实施例2
以米尔比霉素农药为例筛选可溶性单链抗体
(一)富集筛选MILO-BSA噬菌体抗体
(1)用4ml纯化MILO-BSA为抗原(100μg/ml)包被免疫管，包被液为PBS(pH7.4)，4℃包板过夜，PBS洗涤免疫管3次，每次5min。
(2)在免疫管中加满2％MPBS，37℃封闭2h。
(3)去除封闭液，加入扩增的噬菌体抗体，37℃孵育2h。
(4)去除未结合的噬菌体抗体，PBST缓冲液洗涤免疫管10次(第一轮洗涤10次，以后每轮洗涤20次)。
(5)1mg/ml胰蛋白酶500μl加入免疫管，37℃孵育30min，反复吹打，洗脱特异性结合的噬菌体抗体。
(6)500μl洗脱液感染3.5ml对数生长期E.coli TG1，37℃水浴30min。
(7)将感染后菌液以10 800g离心5min，去上清，沉淀用1ml 2×TY培养基(含终浓度100μg/ml Amp+1％葡萄糖)重悬，混匀后铺于TYE培养板上，37℃培养过夜。次日，TYE培养板上加入2ml 2×TY培养基，用玻璃推子轻刮下所有菌落，混匀。
(8)取50μl菌液加入50ml 2×TY培养基(含终浓度100μg/ml Amp+1％葡萄糖)，250rpm，37℃振摇培养至OD600nm约为0.4。其余菌液加入终浓度15％甘油，-70℃保存。
(9)从50ml 2×TY培养基中取10ml，加入5×1010pfu辅助噬菌体M13K07，37℃水浴30min，3 300g离心30min，去上清，沉淀用50ml 2×TY培养基(含终浓度100μg/ml Amp+50μg/ml Kana+0.1％葡萄糖)重悬，250rpm，30℃振摇培养过夜。
(10)3 300g离心15min，收集上清约40ml，加入10ml PEG/Nacl溶液，混匀后置于冰上1h，3 300g离心30min，沉淀用2ml PBS重悬，充分混匀。
(11)10 800g离心10min，取上清约2ml。1ml上清用于下一轮筛选，剩余约1ml上清置于4℃保存。
(12)重复以上筛选步骤，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。
(二)ELISA鉴定抗MILO-BSA噬菌体抗体
(1)最后一轮筛选至方法1(6)，得到的细菌稀释后铺于TYE培养板上(含终浓度100μg/ml Amp)，37℃培养过夜。
(2)96孔板中每孔加入2×TY培养基100μl(含终浓度100μg/ml Amp+1％葡萄糖)，从TYE培养板上随机挑取90个菌落接种于96孔板(剩余6个孔不加细菌)，250rpm，37℃振摇培养过夜。
(3)再取一块96孔板，每孔加入2×TY培养基200μl(含终浓度100μg/mlAmp+1％葡萄糖)，从第一块96孔板各孔中分别转移5μl菌液至第二块板，250rpm，37℃振摇培养2h。第一块96孔板每孔加甘油至终浓度为15％，-70℃保存。
(4)第二块96孔板每孔加入2×TY培养基25μl(含终浓度100μg/ml Amp+1％葡萄糖)，每孔再加1×109pfu辅助噬菌体M13K07超感染，250rpm，37℃振摇培养1h。
(5)1 800g离心10min，沉淀用200μl 2×TY培养基(含终浓度100μg/mlAmp+50μg/ml Kana)重悬，250rpm，30℃振摇培养过夜。
(6)1 800g离心10min，取上清进行ELISA检测。
(7)用100μl纯化MILO-BSA(100μg/ml)为抗原包被第三块96孔板，包被液为PBS(pH7.4)，4℃包板过夜。
(8)PBS洗涤96孔板3次，每孔加满2％MPBS，37℃封闭2h。
(9)去除封闭液，96孔板每孔加入2％MPBS 150μl，90个孔再分别加入方法5(6)的上清50μl(剩余6个孔不加细菌，加50μl 3％BSA作对照)，混匀，37℃孵育2h。
(10)PBST缓冲液洗涤3次，去除未结合的噬菌体抗体。
(11)每孔加入1∶5000稀释的HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育1h。
(12)PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入100μl TMB显色液，室温放置10min。
(13)显色清晰后每孔加入50μl 1mol/L的硫酸终止反应。
(14)测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值。阳性标准为P/N值(Positive/Negative)大于2.1。
(15)阴性对照为3％BSA替代一抗。
(三)可溶性单链抗体的制备
(1)取10μl梯度稀释的阳性克隆噬菌体感染200μl E.coliHB2151(OD600＝0.4)宿主菌。
(2)当OD600值达到0.9时加入IPTG(1mM)诱导其抗体表达，30℃振摇培养过夜。
(3)1800g离心10min，上清用于抗体分子灵敏度及特异性的测定。
(四)IC-ELISA(间接竞争ELISA)鉴定抗MILO-BSA噬菌体抗体
(1)用纯化MILO-BSA为抗原(100μg/ml)包被96孔板，包被液为CBS，4℃包板过夜，PBS洗涤96孔板3次，每次5min。
(2)每孔加满3％BSA，4℃封闭过夜。
(3)去除封闭液，每孔加入100μl ELISA鉴定阳性的抗MILO-BSA噬菌体抗体(阴性对照每孔加3％BSA 100μl)，37℃孵育2h。
(4)PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入1∶3000稀释的HRP标记的A蛋白，37℃孵育1h。
(5)PBST缓冲液洗涤3次，每孔加入100μl TMB显色液，室温放置10min。
(6)显色清晰后加2M H2SO4终止反应，450nm下读取吸光值(参见图4)。
以上实施例不是对本发明的具体限制，只要在构建的噬菌体抗体库中，pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点组装的ScFv基因片段能够与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体，以及在将该噬菌体抗体库通过权利要求6的方式与十六元大环内酯类农药的抗原富集筛选，获得与该农药具有亲和性的可溶性单链抗体，都属于本发明的技术内容。
核苷酸和氨基酸序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种噬菌体抗体库及其在农药残留免疫测定中的应用
<160>3
<210>1
<211>759
<212>DNA
<213>Balb/c小鼠(mus musculus)
<400>1
atg gcc gag gtg caa ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tca ttg     60
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu
1               5                   10                  15                  20
aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc    120
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
21              25                  30                  35                  40
cag gct cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt gct cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat    180
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr
41              45                  50                  55                  60
gca aca tat tat gcc gat tca gtg aag gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa    240
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
61              65                  70                  75                  80
agc atg ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt    300
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
81              85                  90                  95                  100
gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc att ctc aca gtc tcc tcg ggt    360
Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser Gly
101             105                 110                 115                 120
ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga tcc gac att gtg atg act cag    420
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
121             125                 130                 135                 140
tct cca tcc tcc ctg agt gtg tca gca gga gag aag gtc act atg agc tgc aag tcc agt    480
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
141             145                 150                 155                 160
cag agt cta ttc aac agt gga agt caa aag aac tac ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca    540
Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
161             165                 170                 175                 180
ggg cag cct cct aaa ttg ttg atc tac ggg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc cct gat    600
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
181             185                 190                 195                 200
cgc ttc aca ggc agt gga tct gga acc gat ttc act ctt acc atc agc agt gtg cag gct    660
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
201             205                 210                 215                 220
gaa gac ctg gca gtt tac tac tgt cag gat gac cat agt tat cca ttt acg ttc ggc tcg    720
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser
221             225                 230                 235                 240
ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt gcg gcc gca gaa tga                                759
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu ＊＊＊
241             245                 250
<210>2
<211>357
<212>DNA
<213>Balb/c小鼠(mus musculus)
<400>2
atg gcc gag gtg cag ctt gtt gaa tct ggt gga gga ttg gtg cag cct aaa ggg tca ttg     60
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu
1               5                   10                  15                  20
aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aat acc tac gcc atg aac tgg gtc cgc    120
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
21              25                  30                  35                  40
cag gct cca gga aag ggt ttg gaa tgg gtt gct cgc ata agg agt aaa agt aat aat tat    180
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr
41              45                  50                  55                  60
gca aca tat tat gcc gat tca gtg aag gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca caa    240
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
61              65                  70                  75                  80
agc atg ctc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca gcc atg tat tac tgt    300
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
81              85                  90                  95                  100
gtg aga cgt gat cgc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc att ctc aca gtc tcc tcg        357
Val Arg Arg Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser
101             105                 110                 115
<210>3
<211>342
<212>DNA
<213>Balb/c小鼠(mus musculus)
<400>3
gac att gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg agt gtg tca gca gga gag aag gtc act   60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr
1               5                   10                  15                  20
atg agc tgc aag tcc agt cag agt cta ttc aac agt gga agt caa aag aac tac ttg gcc  120
Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala
21              25                  30                  35                  40
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg
41              45                  50                  55                  60
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Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
61              65                  70                  75                  80
atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tac tac tgt cag gat gac cat agt tat  300
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Asp His Ser Tyr
81              85                  90                  95                  100
cca ttt acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgt                          342
Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
101             105                 110

Claims (7)

1、一种噬菌体抗体库，是在pCANTAB5E载体的SfiI和NotI酶切位点间组装ScFv基因片段，其特征在于：所述的ScFv基因片段可以与十六元大环内酯类农药的抗原亲和富集，形成可溶性单链抗体。
2、根据权利要求1所述的噬菌体抗体库，其特征在于：所述的ScFv基因片段是这样构建的：
a)MILO-BSA免疫Balb/c小鼠后，提取小鼠脾细胞总RNA，以其为模板，Oligo(dT)15为引物合成cDNA第一链；
b)根据设计的多组简并性引物经RT-PCR法分别扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因；
c)分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH和VL合并片段为模板，采用重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension，SOE)将二者拼接成ScFv基因，大小在750bp左右，再分别将等量的VHB和VLF各条引物混合并以二者为引物进一步PCR扩增ScFv基因；
将构建的ScFv基因片段与pCANTAB5E载体连接与转化。
3、根据权利要求1或2所述的噬菌体抗体库，其特征在于：ScFv基因片段的一条核苷酸和氨基酸序列为：SEQ ID NO：1，其中，VH基因核苷酸和氨基酸序列为：SEQ ID NO：2，VL基因核苷酸/氨基酸序列为：SEQID NO：3。
4、根据权利要求3所述的噬菌体抗体库，其特征在于：所述的分别以近等摩尔量的所有引物扩增条带的VH和VL合并片段为模板是指：将12条引物扩增的VH基因产物合并作为一个模板，将11条引物扩增的VL基因产物合并作为一个模板；所述的VLB和VHF引物含部分Linker序列，所述的VLF引物含NotI酶切位点，所述的VHB引物含SfiI酶切位点。
5、根据权利要求3所述的噬菌体抗体库，其特征在于：所述构建的ScFv基因与pCANTAB5E载体连接是指：将纯化定量后的ScFv基因分别以SfiI和NotI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pCANTAB5E载体连接；所述的转化是指：a)0.2cm电转杯，25μF，2.5kV，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌TG1；b)转化产物加入2xYT后37℃振荡培养2h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养；c)次日计算平板上的克隆数，估算库容为2.4×106；d)将电转化后菌液加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用2×YT-AK重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为ScFv噬菌体表面展示文库。
6、一种如权利要求1所述噬菌体抗体库在农药残留免疫测定中的应用，其特征在于：
a)用十六元大环内酯类农药的抗原包被固相筛选ELISA板，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行四轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；
b)将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取96个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μl菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株；
c)将阳性单克隆噬菌体感染非抑制型E.coliHB2151细胞在含IPTG和Amp的2×YT培养基中培养，其上清中富含抗体分子，获得可溶性单链抗体；
d)表达的可溶性单链抗体对a步骤中抗原相对应的十六元大环内酯类农药具有亲和性。
7、根据权利要求6所述的噬菌体抗体库在农药残留免疫测定中的应用，其特征在于：所述的十六元大环内酯类农药是指含有十六元大环内酯类共性结构小分子的农药。
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