CN102453093A - 抗伏马菌素单链抗体的筛选及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗伏马菌素单链抗体的筛选及其在伏马菌素免疫学检测方面的应用。直接从偶联的抗原FB1-KLH免疫的小鼠脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗伏马菌素单链抗体及其编码基因，命名为FB-Mu 1H3。该单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于伏马菌素的检测，包括在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素污染中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗伏马菌素单链抗体的筛选及应用，与抗体筛选技术有关。
背景技术
伏马菌素(Fumonisin)是上世纪80年代末发现的一种由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等真菌产生的水溶性霉菌毒素，是一类由不同多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物。1988年Gelderblom首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马菌素。随后，Laurenf等在1989年又从伏马菌素中分离出伏马菌素B1(FB1)和伏马菌素B2(FB2)。伏马菌素是一组相关的极性代谢产物，到目前为止，已发现的伏马菌素有11种，分为A、B、C、P组，其中B组分布最广，毒性最强。
伏马菌素B1(英文简称：FB1，下同)的产生菌串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和多育镰刀菌(Fusarium proliferatum)等真菌为非专性、非宿主特异性的病原菌，能够污染玉米、高粱、小麦、水稻和豆类等粮食作物及某些饲料，因而伏马菌素的污染广泛存在于粮食作物的籽粒或饲料中。研究表明，伏马菌素能够引起多种动物疾病，如马脑白质软化症和猪肺水肿等。在大鼠、兔和羔羊等许多动物的急性实验中发现，伏马菌素具有肝毒性和肾毒性。伏马菌素的分子结构类似于动物体内的神经鞘氨醇(sphingosine，So)和二氢神经鞘氨醇(sphinganine，Sa)等神经鞘脂类物质，可通过抑制神经鞘脂类的生物合成，导致动物组织、血、尿中二氢神经鞘氨醇/神经鞘氨醇(Sa/So)比值升高，促进细胞凋亡、干扰细胞生长和分化，具有明显的细胞毒性。伏马菌素还具有生殖毒性、胚胎毒性、免疫毒性和大鼠致癌性。因而伏马菌素的研究得到国际社会的广泛关注，成为继黄曲霉毒素(Aflatoxin)之后新的研究热点。调查发现，FB1还可能是人类食管癌高发的诱因，在我国和南非部分食管癌高发地区玉米的FB1含量都高于低发区，国际癌症研究机构(International Agency ofResearch Cancer，IARC)将伏马菌素B1列为2B类，即可疑人类致癌物。另外，伏马菌素不能在动物体内分解成无毒的物质，能够通过鸡蛋、牛奶和动物组织等食物在人体内积累。因此，粮食和饲料作物中污染的伏马菌素严重威胁着食品安全及人畜健康，美国、欧盟等许多国家已经制定了伏马菌素在食品和饲料及其制品中的限量标准。
鉴于FB1对食品安全的危害性，测定和调查其在玉米等粮食及其制品中的含量，并对FB1污染进行风险性评估，规定食品和饲料中的限量标准，以保障人类的健康显得尤为重要。目前，伏马菌素的检测分析方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质谱联用法(GC-MS)、液-质谱联用法(LC-MS)和毛细管电泳法等，这些方法虽具较高的灵敏度和特异性，但需繁杂的提纯净化步骤和较贵重的仪器设备，不易推广使用。而应用ELISA等免疫学检测方法，则具备简单、快速、灵敏的特点，可同时检测大量样品，因而受到各国学者的重视。目前，国外报道的用于伏马菌素免疫检测的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和单链抗体，而国内报道的都是通过杂交瘤融合细胞筛选得到的单克隆抗体。多克隆和单克隆抗体的制备都需要涉及动物，而且多克隆抗体的特异性较差，单克隆抗体筛选需要专门的细胞培养设备，细胞保存需要专门的超低温保存设备，生产过程耗时费力，成本高。国外报道的有两篇关于抗伏马菌素单链抗体的制备的文献，Zhou等(1996)分别通过噬菌体展示筛选免疫抗体基因文库和杂交瘤细胞转化获得单链抗体(Zhou，H.R.；Pestka，J.J.；Hart，L.P.Molecular cloning andexpression of recombinant phage antibody against fumonisin B1.J.Food Prot.1996，59，1208-1212.)，但其免疫小鼠和筛选抗体所用抗原为偶联的FB1-BSA和FB1-OA，与本发明所用抗原不相同，抗体筛选方法和过程差别较大，且文章中说明得到的单链抗体亲和力较低，需要进一步改善其亲和力后才能够用于伏马菌素检测；Lauer等(2005)通过噬菌体展示筛选抗体基因文库得到抗FB1的单链抗体可用于伏马菌素检测(Lauer，B.；Ottleben，I.；Jacobsen，H，J.；Reinard，T.Production of a single-chain variable fragment antibodyagainst fumonisin B1.J.Agric.Food Chem.2005，53，899-904.)，但其抗体基因来源为人工合成的抗体基因文库，完全不同于本发明构建的免疫抗体基因文库。更重要的是，这两篇国外报道的文献虽获得了抗伏马菌素的单链抗体，但并未公布其核苷酸或氨基酸序列，而且国内市场上也未有相关检测产品出售。因此，本发明通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得抗伏马菌素单链抗体，可为检测和调查粮食作物及其制品中伏马菌素的污染情况提供可靠有效的检测手段。
发明内容
本发明目的在于克服现有检测技术存在的缺陷和不足，利用噬菌体抗体库技术获得一种抗伏马菌素单链抗体，用于镰刀菌菌株本身产生的毒素以及粮食、饲料或食品中伏马菌素污染的免疫检测，为保障食品安全提供可靠有效的检测手段。
本发明是这样实现的：直接从偶联的抗原FB1-KLH免疫的小鼠脾脏细胞出发，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、表达ELISA鉴定及序列测定，最后获得一个高亲和力的抗伏马菌素单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FB-Mu 1H3，该单链抗体基因可在大肠杆菌中进行可溶性表达。
本发明的抗伏马菌素单链抗体由819个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体由272个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体主要由抗体重链可变区VH、抗体轻链可变区VL和连接肽组成，抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL通过连接肽(Gly4 Ser)3连接共同完成伏马菌素的识别和结合。
本发明的抗伏马菌素单链抗体的重链可变区VH由363个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体的重链可变区VH由121个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：4所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体的抗体轻链可变区VL由327个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体的抗体轻链可变区VL由109个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。
本发明的抗伏马菌素单链抗体在大肠杆菌中进行大量表达纯化后可直接应用于伏马菌素的检测，所述的应用包括在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素污染中的应用，也可以作为在制备ELISA检测试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明的有益效果之一是利用噬菌体抗体库技术，构建了抗伏马菌素单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选获得一个高亲和力的抗伏马菌素单链抗体及其编码基因。
2、本发明的有益效果之二是提供的单链抗体可用于在粮食作物的籽粒、饲料或食品中的因潜在的伏马菌素污染的生物材料或产品的快速检测。本发明所提供的抗伏马菌素单链抗体通过重组大肠杆菌表达纯化后可直接用于伏马菌素的检测。
3、本发明的有益效果之三是提供的单链抗体生产成本低。目前国内的报道主要集中于单克隆抗体的制备，但这需要使用动物和专门的细胞培养设备，细胞保存需要专门的超低温保存设备，生产过程费用昂贵、耗时耗力。而本发明所提供的抗伏马菌素单链抗体可在重组大肠杆菌中进行大量可溶性表达，不需要贵重的仪器和繁锁的操作，成本低，适合大规模的生产。
4、本发明的有益效果之四是提供的单链抗体基因易于通过基因工程操作，如碱基突变等改变基因特性，提高单链抗体的稳定性或亲和力。
附图说明
SEQ ID NO：1是本发明的抗伏马菌素单链抗体的核苷酸序列，序列全长为819bp。
SEQ ID NO：2是本发明的抗伏马菌素单链抗体的氨基酸序列，由272个氨基酸组成。
SEQ ID NO：3是本发明的抗伏马菌素单链抗体重链可变区VH的核苷酸序列，序列全长为363bp。
SEQ ID NO：4是本发明的抗伏马菌素单链抗体重链可变区VH的氨基酸序列，由121个氨基酸组成。
SEQ ID NO：5是本发明的抗伏马菌素单链抗体轻链可变区VL的核苷酸序列，序列全长为327bp。
SEQ ID NO：6是本发明的抗伏马菌素单链抗体轻链可变区VL的氨基酸序列，由109个氨基酸组成。
图1：是本发明的技术流程图。
图2：是本发明VH和VL片段PCR扩增产物凝胶电泳图。
图中：M：DNA分子量标准；VH1：IgG1型重链可变区片段；VH2：IgG2a/2b型重链可变区片段；Vκ：κ链(轻链)可变区片段；Vλ：λ链(轻链)可变区片段；CK：水对照。
图3：是本发明scFv片段PCR扩增产物凝胶电泳图。
图中：M：DNA分子量标准；scFv：单链抗体片段。
图4：是本发明载体pHENHi结构图。
图5：是本发明检测抗体基因文库阳性克隆率提取的质粒DNA凝胶电泳图。
图中：M：DNA分子量标准；泳道1～20：20个单克隆菌编号。
图6：是本发明检测抗体基因文库阳性克隆率PCR扩增产物凝胶电泳图。
图中：M：DNA分子量标准；泳道1～20：20个单克隆菌编号；PK：阳性对照；NK：阴性对照。
图7：是本发明检测抗体基因文库多样性BstN I限制性内切酶酶切产物凝胶电泳图。
图中：M：DNA分子量标准；泳道1～20：20个单克隆菌编号；PK：阳性对照；NK：阴性对照。
图8：是本发明纯化的FB-Mu 1H3单链抗体SDS-PAGE电泳检测图。
图中：M：蛋白分子量标准；泳道1～3：缓冲液B1、B2和B3洗脱液(杂蛋白)；泳道4～6：缓冲液C1、C2和C3洗脱液(目的蛋白)。
图9：是本发明纯化的FB-Mu 1H3单链抗体Western blot分析图。
图中：M：蛋白分子量标准：泳道1～2：纯化的FB-Mu 1H3单链抗体。
具体实施方式
实施例1：抗原制备
采用戊二醛一步偶联法(Azcona-Olivera，J.I.；Abouzied，M.M.；Plattner，R.D.；Norred，W.P.；Pestka，J.J.Generation of antibodies reactive with fumonisins B1，B2，and B3 by using cholera toxin as the carrier-adjuvant.Appl.Environ.Microbiol.1992，58，169-173.)将伏马菌素FB1(购自Sigma公司)与钥孔嘁蓝蛋白(KLH，购自Sigma公司)偶联(KLH-NH2+OHC-(CH2)3-CHO+FB1-NH2→KLH-N＝HC-(CH2)3-CH＝N-FB1)后作为免疫抗原(FB1-KLH)，将伏马菌素FB1与小牛血清白蛋白(BSA，购自Sigma公司)偶联(BSA-NH2+OHC-(CH2)3-CHO+FB1-NH2→BSA-N＝HC-(CH2)3-CH＝N-FB1)后作为筛选抗原(FB1-BSA)。
实施例2：动物免疫
用制备的抗原FB1-KLH免疫两只BALB/c小鼠(中国科学院武汉病毒研究所实验动物中心)4次，每次间隔10天。第一次取250μl免疫抗原与等体积弗氏完全佐剂混合后免疫，后三次取250μl免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后第5天取血清从1∶103倍比稀释至1∶128×103，参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》，浙江大学出版社，2006年出版介绍的间接ELISA法检测免疫小鼠血清中抗体的水平。检测结果显示被免疫后的小鼠血清中都产生了较高的抗体滴度(稀释度＞1∶105)。
实施例3：免疫小鼠脾脏RNA提取、mRNA纯化及cDNA第一链合成
1)对产生了较高抗体滴度的免疫小鼠再加强免疫一次，7天后取免疫小鼠的脾脏。
2)利用TRNzol-A+总RNA提取试剂(购自天根生化科技(北京)有限公司产品，按照该试剂的说明书操作)提取脾脏总RNA。
3)用mRNA纯化试剂盒(购自QIAGEN公司，按该试剂盒的说明书操作)对步骤2)提取的总RNA进行纯化。
4)用SuperScriptTM III反转录酶(购自Invitrogen公司，按照该酶的说明书操作)反转录步骤3)得到的纯化mRNA，分别合成抗体重链(IgG1和IgG2a/2b)和轻链(κ链和λ链)的可变区cDNA第一链。其中用表1所述的引物Primer 1反转录合成IgG1的可变区cDNA第一链，用表1所述的引物Primer 2反转录合成IgG2a/2b的可变区cDNA第一链，用表1所述的引物Primer 3反转录合成κ链的可变区cDNA第一链，用表1所述的引物Primer 4反转录合成λ链的可变区cDNA第一链。
实施例4：PCR扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)及单链抗体(scFv)基因
1)PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因
以实施例3反转录合成的IgG1或IgG2a/2b的可变区cDNA为模板，利用表1所述的正向混合引物Primer5～14和反向混合引物Primer 15～18分别进行PCR扩增，获得IgG1和IgG2a/2b的重链可变区片段(VH)；以实施例3反转录合成的κ链可变区cDNA为模板，用表1所述的正向混合引物Primer 19～23和反向混合引物Primer 25～27进行PCR扩增，获得κ链可变区片段(Vκ)；以实施例3反转录合成的λ链可变区cDNA为模板，用表1所述的正向引物Primer 24和反向引物Primer 28进行PCR扩增，获得λ链可变区片段(Vλ)。在50μl PCR反应液中，含有4μl cDNA，5μl PCR缓冲液(含Mg2+)，8μl 1.25mM dNTPs，2μl正向(混合)引物(10μM)，2μl反向(混合)引物(10μM)，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃80sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，VH(VH1和VH2)和VL(Vκ和Vλ)片段大小与预期相一致。
2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)分别纯化步骤1)扩增得到的VH和VL片段。
3)SOE-PCR扩增单链抗体(scFv)基因
加入近等摩尔的VH(IgG1和IgG2a/2b按摩尔比50∶50混合)和VL(Vκ和Vλ按摩尔比95∶5混合)片段作为模板，用表1所述的正向混合引物Primer 5～14和反向混合引物Primer 25～28进行SOE-PCR扩增，获得scFv基因。SOE-PCR分两步反应完成，第一步反应在50μl PCR反应液中，含有VH和VL片段各400ng，5μl PCR缓冲液(含Mg2+)，8μl 1.25mM dNTPs，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min，55℃2min，72℃15min，7个循环；第二步反应在50μl PCR反应液中，含有10μl第一步反应PCR产物，4μl PCR缓冲液(含Mg2+)，8μl 1.25mM dNTPs，2μl正向混合引物(10μM)，2μl反向混合引物(10μM)，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃80sec，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图3所示，scFv片段大小与预期相一致。
4)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化回收步骤3)获得的scFv片段。
实施例5：载体pHENHi及scFv片段酶切、连接
1)分别用Sfi I和Not I限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)双酶切载体pHENHi(德国弗朗霍夫分子生物与应用生态学研究所赠送)和实施例4得到的scFv片段。
2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化步骤1)酶切后的pHENHi载体和scFv片段。
3)用T4DNA连接酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)连接步骤2)回收的pHENHi载体和scFv片段，得到酶切连接产物pHENHi-scFv。
4)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法对步骤3)得到的酶切连接产物pHENHi-scFv进行乙醇沉淀除盐。
实施例6：单链抗体基因文库构建
1)大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞制备
用无菌牙签蘸取-80℃冰箱保存的大肠杆菌XL1-Blue MRF’株，在LB固体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋自胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂，pH 7.0)平板上划线，于37℃培养箱培养16h后，挑取一单克隆菌落接种到5ml LB液体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl，pH 7.0)中，37℃，200r/min振荡过夜培养16h。取1.6ml菌液加入到160ml LB液体培养基中，37℃，230r/min振荡培养至OD600达到0.45左右时，取出培养菌的三角瓶置于冰上冷却30min后，将菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，然后用30ml预冷的10％(WV)甘油洗涤菌体沉淀两次(4℃，4000r/min离心15min后弃上清)。最后每个离心管中加入100μl预冷的GYT培养基(成分：0.25％(W/V)胰蛋白胨，0.125％(W/V)酵母提取物，10％(V/V)甘油)悬浮菌体，分装成100μl/管，立即保存于-80℃冰箱。
2)电转化酶切连接产物
将-80℃保存的大肠杆菌XLl-Blue MRF’感受态细胞取出，置冰上溶化后，每管感受态细胞(100μl)中加入5μl酶切连接产物pHENHi-scFv，小心轻微地混匀后放冰上静置3min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯(0.2mm)(购自BIO-RAD公司)中，用BIO-RAD公司的MicroPulserTM电转化仪进行电转化(设置BacteriaEc2程序)。转化后立即加入1ml SOC培养基(成分：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH 7.0)到电转化杯中，并将菌液转移至离心管中，37℃，200r/min振荡培养1h使细菌复苏。
3)电转化感受态细胞涂布平板培养
取出复苏后的感受态细胞，取100μl涂布于LB固体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素(Amp))平板用于计算单克隆菌落数。其余的菌液通过6000r/min离心1min后吸取部分上清丢弃，每管保留约100～150μl上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/mlAmp)平板。培养基平板放置于37℃恒温箱过夜培养12～16h至单克隆菌落长出。
4)抗体基因文库收集保存
计算电转化感受态细胞涂布平板培养后长出的单克隆菌落数量，估算抗体基因文库容量。收集LB固体培养基平板上长出的菌落，加入等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。
通过以上步骤操作，最后构建的抗伏马菌素单链抗体基因文库容量约为2×106cfu。
实施例7：单链抗体基因文库鉴定
1)从实施例6平板上长出的转化子中随机挑取20个单克隆菌落接种到LB液体培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，220r/min振荡过夜培养16h。
2)参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的煮沸裂解法提取质粒DNA，通过0.8％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。
3)以步骤2)得到的质粒DNA为模板，用表1所述的正向引物Primer 29和反向引物Primer 30进行PCR扩增。在25μl PCR反应液中，含有50ng质粒DNA，2.5μl PCR缓冲液(含Mg2+)，2μl 1.25mM dNTPs，1μl正向引物(10μM)，1μl反向引物(10μM)，1.25U Taq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃50sec，48℃90sec，72℃90sec，35个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。
4)用BstN I限制性内切酶(购自NEB公司，按照该酶的说明书操作)酶切步骤3)扩增的PCR产物，酶切产物通过1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的多样性。
鉴定结果如图5～7所示，构建的抗体基因文库阳性率100％，多样性高于85％。
实施例8：噬菌体展示筛选单链抗体基因文库
1)取实施例6收集保存的菌液(抗体基因文库)800μl加入到50ml 2TY培养基(成分：1.6％(W/V)胰蛋白胨，1％(W/V)酵母提取物，0.5％(W/V)NaCl，pH 7.0)(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，230r/min振荡培养至OD600达到0.5。
2)取5ml菌液于50ml离心管中，加入0.5μl M13KO7辅助噬菌体(购自Amersham Biosciences公司，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备保存，其中：噬菌体的量为大肠杆菌的20倍)，混匀后于37℃水浴静置30min。
3)4000r/min离心10min，去上清，然后重悬于140ml 2TY培养基中(含100μg/ml Amp，25μg/ml卡那霉素(Kan))，30℃，200r/min振荡过夜培养至少15h。
4)将过夜培养的菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心30min。
5)取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液(20％(W/V)聚乙二醇(PEG)6000，2.5M NaCl)，充分混匀后置冰上沉淀1h。
6)4℃，8000r/min离心30min，去上清，将沉淀重悬于40ml灭菌水中，并立即加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，充分混匀后4℃放置20min。
7)4℃，4000r/min离心30min，去上清。
8)轻微离心，去除残留的PEG/NaCl溶液。
9)加入1.6ml灭菌水重悬沉淀，并4℃，4000r/min离心10min，取上清于4℃保存(取10μl采用10-2～10-11梯度稀释来测定滴度)。
10)用抗原FB1-BSA(20ng/μl)包被ELISA板(共20孔，每孔100μl)，37℃水浴2h。
11)用磷酸盐缓冲液(PBS)(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.2～7.4)洗涤3次。
12)每孔加入150μl封闭液(含3％(W/V)BSA的PBS溶液)，37℃水浴封闭2h(用封闭液封闭一空白孔作为阴性对照)。
10)用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。
11)每孔中加入100μl取步骤9)保存的上清(噬菌体)，37℃水浴2h。
12)用200μl PBST(含0.1％(V/V)Tween 20的PBS)和PBS分别洗涤5次，每次3min(第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次)。
13)每孔加入100μl三乙胺溶液(100mM)，室温放置10min。
14)立即加入50μl Tris-HCl溶液(1M，pH 7.4)中和，并转移至50ml离心管中。
15)取6ml在37℃，230r/min振荡培养条件下生长到OD600为0.5～0.9的大肠杆菌XLl-Blue MRF’加入到50ml离心管中，37℃水浴侵染30min。
16)4000r/min离心10min，去上清。
17)加入800μl LB培养基重悬菌体后涂布于TYE固体培养基(成分：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.8％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂，pH 7.0)平板上(涂板时采用10-2～10-6梯度稀释来测定滴度)，37℃恒温箱过夜培养12～16h至菌落长出。
18)收集TYE固体培养基平板上长出的菌落，进行下一轮淘选或加入等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。
实施例9：小量表达ELISA鉴定淘选抗体库
1)实施例8完成三轮淘选后，用灭菌牙签从TYE固体培养基平板上随机挑取48个单克隆菌接种到装有180μl 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)的96孔培养板中，将培养板于37℃，150r/min振荡过夜培养16h。
2)从每孔中取20μl菌液加入到新的装有180μl 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)的96孔培养板中，37℃，150r/min振荡培养6h。
3)4℃，1800r/min离心10min，弃上清。
4)加入180μl新的2TY培养基(含100μg/ml Amp和1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))至培养板中，25℃，150r/min振荡过夜诱导表达12～16h。
5)4℃，1800r/min离心10min，每孔中取100μl上清用于伏马菌素ELISA鉴定。
6)在ELISA板孔中加入100μl FB1-BSA(1ng/μl)，37℃水浴包被2h。
7)用200μl PBS洗涤3次。
8)用FB1-BSA包被的孔及其对照孔中分别加入150μl封闭液(含3％(W/V)BSA的PBS溶液)，于37℃水浴封闭2h。
9)用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。
10)用FB1-BSA包被的孔及对照孔中分别加入50μl步骤5)收集的上清，并加入50μl封闭液，37℃反应2h。
11)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
12)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。
13)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
14)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。
15)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
16)每孔加入100μl显色液(0.1％(W/V)对硝基苯磷酸二钠溶液)，黑暗条件下反应15～30min。
17)每孔加入50μl NaOH溶液(3M)终止反应，用酶标仪测OD405读值。
小量表达ELISA鉴定结果显示，48个单克隆样品中有45个显色，样品OD405值与阴性对照OD405值之比P/N值最高达到35.4，说明筛选得到了对伏马菌素亲和力高的单链抗体。选取其中16个OD405读值较高的单克隆培养菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，结果显示16个单克隆菌中所含的单链抗体基因完全相同，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，并将该单链抗体命名为FB-Mu 1H3。含有该基因的大肠杆菌命名为重组大肠杆菌XL1-BlueMRF’/pHENHi-1H3，单克隆培养菌液加等体积50％(V/V)甘油保存于-80℃冰箱。
实施例10：重组大肠杆菌大量表达单链抗体FB-Mu 1H3及抗体回收
1)取5μl甘油保存的重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-1H3接种于20ml 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，200r/min振荡过夜培养12h。
2)取8ml过夜培养菌液加入160ml 2TY培养基(含1％(W/V)葡萄糖，100μg/ml Amp)中，37℃，200r/min振荡培养至OD600达到0.5左右。
3)加入终浓度为1mM的IPTG，置于30℃，200r/min诱导表达8h。
4)取培养菌液分装到50ml离心管中，4℃，3000g离心10min。
5)每管中加入500μl PPB溶液(30mM Tris-HCl，20％(W/V)蔗糖，pH 8.0)重悬菌体，再加入1μl乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(终浓度1mM)，冰上放置15min，弃上清。
6)4℃，3000g离心15min，上清装入另一离心管中。
7)每管中加入1ml MgCl2溶液(终浓度5mM)，再加入2μl EDTA溶液(终浓度1mM)，冰上放置15min。
8)4℃，3000g离心15min，上清与步骤6)上清合并。
9)取收集步骤6)和8)上清的离心管于4℃，12000r/min离心15min。
10)取上清用PBS透析。
实施例11：用Ni-NAT柱纯化大量表达的单链抗体FB-Mu 1H3
1)安装纯化柱(购自BIO-RAD公司)，加入400μl充分混匀的基质(购自QIAGEN公司)，使其固定2h以上。
2)剪去下端封口，使液体流下，用5ml PBS进行平衡。
3)加入实施例2回收的单链抗体样品过柱，收集保存过柱后的样品流出液。
4)加1ml缓冲液B(50mMNa2 HPO4，20mM咪唑)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为B1、B2、B3(杂蛋白)。
5)加400μl缓冲液C(50mM Na2HPO4，250mM咪唑)洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为C1、C2、C3(目的蛋白)。
6)加5ml PBS平衡纯化柱，加入1ml 30％(V/V)酒精4℃保存纯化柱。
7)目的蛋白(单链抗体)通过SDS-PAGE电泳检测后用PBS透析。
实施例12：SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析表达纯化的单链抗体FB-Mu 1H3
1)SDS-PAGE电泳检测：取10μL实施例11纯化的单链抗体FB-Mu 1H3，加入2.5μL 5×十二烷基硫酸钠(SDS)加样缓冲液(250mM Tris-HCl(pH 6.8)，10％(W/V)SDS(电泳级)，0.5％(W/V)溴酚蓝，50％(V/V)甘油，5％(W/V)β-巯基乙醇)，充分混匀，水浴煮沸5min，然后置于冰上备用。参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和浓缩胶，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％(W/V)SDS)，取放置在冰上的样品上样，先用80伏电压电泳20min，再用120伏电压电泳80～120min至溴酚蓝跑至分离胶外。取下凝胶，去掉浓缩胶后用染色液(0.1％(W/V)考马斯亮蓝R-250，25％(V/V)异丙醇，10％(V/V)冰醋酸)染色30min，然后用脱色液(5％(V/V)甲醇，7.5％(V/V)冰醋酸)脱色3～5次，即可观察照相，结果如图8所示，可见约28kD和30kD大小的两条目的蛋白，出现两条大小不同的目的蛋白条带可能是表达抗体的不同构象造成的。
2)Western blot分析：按SDS-PAGE检测所述方法进行SDS-PAGE电泳后的凝胶不经染色液染色，直接用BIO-RAD公司
SD Semi-Dry Transfer Cell半干转印装置将凝胶中的蛋白转印到尼龙膜上，于200mA恒定电流转膜25min。转印结束后，将尼龙膜转移到含有封闭液(5％(W/V)脱脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)的杂交盒中，室温平缓摇动15～20min后放置37℃2h或4℃过夜。然后倒掉封闭液，加入10ml TBST(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，0.1％(V/V)Tween20)洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。再加入10ml经TBST缓冲液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，室温平缓摇动2h后倒掉，用10ml TBST和TBS(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl)分别洗涤5次，每次5min。最后用BCIP/NBT显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司，按照试剂盒说明书操作)显色10～20min后，用蒸馏水终止反应，即可观察并照相。结果如图9所示，在约33kD和36kD大小处出现特异性条带，表明表达的抗体完整性较好，能够在重组大肠杆菌中正常表达。特异条带大小与SDS-PAGE电泳条带大小不一致，可能是由于预染蛋白分子量标准因与染料共价偶联而在SDS-PAGE电泳时的迁移特性发生某些改变的缘故而造成的。
实施例13：纯化的单链抗体FB-Mu 1H3用于伏马菌素检测
1)在ELISA板孔中加入100μl FB1-BSA(2.5ng/μl)，37℃水浴包被2h。
2)用200μl PBS洗涤3次。
3)用FB1-BSA包被的孔及其对照孔中分别加入150μl封闭液(3％(W/V)BSA溶液)，37℃水浴封闭2h。
4)用200μl PBS洗涤3次，每次3min。
5)每孔加入100μl封闭液稀释的实施例11纯化的单链抗体FB-Mu 1H3(200～500nM)，37℃反应2h。
6)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
7)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的抗His单克隆抗体(购自天根生化科技(北京)有限公司)，37℃反应1.5h。
8)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
9)每孔加入100μl封闭液稀释(体积比为1∶5000)的AP标记的羊抗鼠Fc特异抗体(购自Sigma公司)，37℃反应1.5h。
10)用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。
11)每孔加入100μl显色液(0.1％(W/V)对硝基苯磷酸二钠溶液)，黑暗条件下反应15～30min。
12)每孔加入50μl NaOH溶液(3M)终止反应，用酶标仪测OD405读值。
加入显色液显色30min后，样品OD405值与阴性对照OD405值之比P/N＝24.5，说明重组大肠杆菌大量表达纯化的单链抗体FB-Mu 1H3对伏马菌素仍有很高的亲和力。
表1cDNA第一链合成及PCR扩增所用引物序列表
| 引物名称 | 引物序列 |
| Primer 1 | GGCCAGTGGATAGACAGA |
| Primer 2 | TAACCCTWGACCAGGCATCC |
| Primer 3 | GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCGTCGACGCGGCCGCGACTAGT |
| Primer 4 | TTTCCACCTTCCTCTGARGAGCTTGTCGACGCGGCCGCGACTAGT |
| Primer 5 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTRCAGCTTCAGGAGTCRGGA |
| Primer 6 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSAGTCWGGM |
| Primer 7 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTGCARCAGTCWGGD |
| Primer 8 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTCCARCTGCAGSARYCTGGR |
| Primer 9 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG |
| Primer 10 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGGTGGARTCTGGR |
| Primer 11 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGA |
| Primer 12 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTKGAKGAGWCTGR |
| Primer 13 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAVGTGMWGCTKGTGGAGTCTGGK |
| Primer 14 | GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTKCAGCAGTCTGGA |
| Primer 15 | TCCAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCGCCACCTGMRGAGACDGTGASMGTRGTC |
| Primer 16 | TCCAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCGCCACCTGMRGAGACDGTGASMGTRGTG |
| Primer 17 | TCCAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCGCCACCTGMRGAGACDGTGASCAGRGTC |
| Primer 18 | TCCAGAACCGCCACCGCCGCTACCGCCGCCACCTGMRGAGACDGTGASTGARGTT |
| Primer 19 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCACAGTC |
| Primer 20 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTGATRTTKTGATGACCCARAC |
| Primer 21 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTRAMATTGTGMTGACCCAATC |
| Primer 22 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTSAAAWTGTKCTSACCCAGTC |
| Primer 23 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTGAYATYCAGATGACMCAGWC |
| Primer 24 | AGCGGCGGTGGCGGTTCTGGAGGCGGCGGTTCTCARSYTGTKSTSACTCAGKMATCT |
| Primer 25 | ACTAGTCGCGGCCGCGTCGACAGCMCGTTTCAGYTCCARYTT |
| Primer 26 | ACTAGTCGCGGCCGCGTCGACAGCMCGTTTKATYTCCARYTT |
| Primer 27 | ACTAGTCGCGGCCGCGTCGACAGCMCGTTTBAKYTCTATCTTTGT |
| Primer 28 | ACTAGTCGCGGCCGCGTCGACCTGRCCTAGGACAGTSASYTTGGT |
| Primer 29 | GCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGC |
| Primer 30 | ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG |
Claims (9)
1.一种抗伏马菌素单链抗体，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.一种抗伏马菌素单链抗体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗伏马菌素单链抗体，其特征在于，所述的抗伏马菌素单链抗体主要由抗体重链可变区VH，抗体轻链可变区VL和连接肽组成，所述的抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL通过连接肽(Gly4 Ser)3连接共同完成伏马菌素的识别和结合，
其中：
所述的抗体重链可变区VH由363个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；
所述的抗体重链可变区VH由121个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；
所述的抗体轻链可变区VL由327个核苷酸组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示；
所述的抗体轻链可变区VL由109个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。
4.权利要求1所述的抗伏马菌素单链抗体在制备伏马菌素检测试剂盒中的应用。
5.权利要求4的应用，其中包括ELISA试剂盒。
6.权利要求1所述的抗伏马菌素单链抗体在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素中的应用。
7.权利要求2所述的抗伏马菌素单链抗体在制备伏马菌素检测试剂盒中的应用。
8.权利要求7的应用，其中包括ELISA试剂盒。
9.权利要求2所述的抗伏马菌素单链抗体在检测田间作物、饲料、粮食或食品伏马菌素中的应用。
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