CN101738479A - 多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片及其试剂盒，该芯片包括基片和阵列式分布的霉菌毒素抗体的点涂层，所述的霉菌毒素抗体点涂层是指在基片上均匀分布的，点阵于基片上的抗-黄曲霉毒素B1、抗-赭曲霉毒素A、抗-伏马菌素、抗-呕吐毒素、抗-玉米赤霉烯酮、抗-T-2毒素和抗-展青霉素共7个霉菌毒素抗体。利用本发明的蛋白芯片仅通过一次反应就可得到多种指标的检测结果，可广泛应用于大宗食品、粮油食品、饲料以及果汁饮料等产品的安全卫生检测，满足现代食品工业对食品安全检测快速、简便、高效的需求。

Description

多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片及其试剂盒

技术领域

本发明涉及蛋白芯片霉菌毒素检测产品，具体地说，涉及一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片及其试剂盒。

背景技术

作为日常消费的大宗食品，粮油食品以及果汁饮料的霉菌毒素问题日益凸现，并受到业内人士的广泛关注。霉菌对食品和饲料的污染十分常见，除了引起变质外，还会产生具有“三致”(致畸、致癌、致突变)效应的霉菌毒素，不仅会使食品和饲料中的营养价值降低，还易导致人和牲畜中毒。据统计，每年全世界有25％的粮油作物污染霉菌菌毒素，联合国粮农组织估算由此造成的经济损失高达数千亿美元。

如何减少、控制霉菌毒素污染？普通的食物处理和烹饪方法不会减少黄曲霉毒素的含量，最佳方法是防止食品受污染或勿食用已污染的食品。而生产厂家在购进原料时就应该注意检测霉菌，以保证食品生产原料的安全、无毒。

鉴于霉菌毒素的毒性及其易污染食品的特性，世界各国相继建立或正在改进检测霉菌毒素的方法，引入了免疫学、生物化学、分子生物学技术，如金标法等。但目前国内检测食品霉菌毒素的试剂盒功能比较单一。专利号为98121677.3的专利“一种食品及饲料中真菌毒素特别是黄曲霉毒素B1的快速检测方法”，公开了一种用乳胶沉淀法测试黄曲霉毒素B1的方法；专利号为200710056557.7的专利“定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法”，公开了用免疫学方法检测赭曲霉毒素A的试剂盒。这两种方法都基于免疫学原理，针对食品中的主要毒素做了检测。但随着食品工业化生产的发展，食品的种类日益增多，原料和成品质量检测处理量也日益增大，处理速度也要求跟上日益增加的生产速度，单一检测功能的试剂盒已经不能满足快速、高效的检测需求。

发明内容

本发明要提供一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片及其试剂盒，能够一次性集成化检测多种霉菌毒素，解决当前食品业检测试剂功能单一，效率慢的问题，满足当前食品业的多元化、工业化发展需求。

本发明的技术方案如下：本发明提供一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的买军毒素检测指标以及对照检测指标涂层组成，所述的霉菌毒素检测指标包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和展青霉素共7个霉菌毒素抗体，以共价键或非共价键固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

上述基片的一个优选例是醛基化玻片。

上述涂层上的每个阵列中霉菌毒素检测指标每个有2-10个重复；阵列的多少和大小与待检样品的数目，基片大小，以及点样直径有关。

上述霉菌毒素检测指标与检测阵列的优选例是：当检测指标点样直径为0.1mm时，点间距0.6mm，阵列大小为6mm×5mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。

本发明还提供包含上述多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片的试剂盒，用纸质模板固定于包装盒内。

上述试剂盒包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液、检测液、标准品、质控品；各试剂为液体瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。不限放置方式，检测时配套使用。

上述的样本稀释液为样本提取浸液，可以由40％甲醇配制而成；

上述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原的单克隆抗体，以及蛋白稳定剂组成；

所述的浓缩洗涤液为中性缓冲液；可以是磷酸盐缓冲液；

所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。

上述的标准品由5-10个不同浓度梯度的霉菌毒素混合液组成，每个霉菌毒素混合液装入一个容器，霉菌毒素混合液由7个霉菌毒素指标按不同浓度混合而成。标准品用于在每次标本检测结束后做标准曲线，可以定量测定样品中的检测指标的浓度。

上述的质控品由2-6个不同浓度的霉菌毒素混合液组成，每个霉菌毒素混合液装入一个容器，霉菌毒素混合液由7个霉菌毒素指标按不同浓度混合而成。质控品可以监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性。

本发明选取了危害最大最广的几种霉菌毒素，包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和展青霉素共7个霉菌毒素抗体，构成检测指标。指标与污染对象、主要危害的对应关系见下表。

序号	检测指标	污染对象	主要危害
				1	黄曲霉毒素B1	粮食、油类及其制品和坚果，其中花生及其制品的含量最高	黄曲霉毒素是一种强列的肝脏毒，对肝脏有特殊亲和性并有致癌作用。它主要强烈抑制肝脏细胞中RNA的合成，破坏DNA的模板作用，阻止和影响蛋白质、脂肪、线粒体、酶等的合成与代谢，干扰动物的肝功能，导致突变、癌症及肝细胞坏死。
2	赭曲霉毒素A	玉米、大豆、可可豆、大麦、柠檬类水果、腌制的火腿、花生、咖啡豆等	赭曲霉毒素是由赭曲霉、纯绿青霉、圆弧青霉和产黄青霉等产生的。现已确认的有赭曲霉毒素A和B两类。赭曲霉毒素A易溶于碱性溶液，可导致多种动物肝肾等内脏器官的病变，故称为肝毒素或肾毒素，此外还可导致肺部病变。
				3	伏马菌素	谷类、大米、大麦、玉米	导致慢性肾脏中毒，致癌；神经系统、肝和肺损伤。
4	呕吐毒素	谷物及饮料	出现恶心、眩晕、腹痛、呕吐、全身乏力等症状；少数伴有腹泻、颜面潮红、头痛等症状；具有致畸、致癌作用
				5	玉米赤霉烯酮	谷类、大米、大麦、玉米	主要侵害生殖系统，城市毒害作用

序号	检测指标	污染对象	主要危害
				6	T-2毒素	谷物及饮料	主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成。产生中枢神经系统和植物神经系统障碍，骨髓抑制、出血、感染等。
7	展青霉素	霉变的面包、香肠、水果、苹果汁、苹果酒和其他产品	可导致神经.呼吸和泌尿等系统的损害，导致神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭，并有致癌作用。

本发明提供的产品检测指标涉及全面，具有广谱性，集成化的优点，大大提高了检测的效率。可广泛用于大宗食品、粮油食品、饲料以及果汁饮料等产品的安全卫生检测，满足现代食品工业对安全卫生检测快速、简便、高效的需求。

附图说明：

图1是多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片的外观图，1为反应区域，底部为点样涂层的基片。

图2是点样阵列示意图，各行分别为霉菌毒素指标点样：抗-黄曲霉毒素B1、抗-赭曲霉毒素A、抗-伏马菌素、抗-呕吐毒素、抗-玉米赤霉烯酮、抗-T-2毒素和抗-展青霉素。每行两个指标，第一行抗-黄曲霉毒素B1、抗-赭曲霉毒素A，第二行抗-伏马菌素、抗-呕吐毒素，第三行抗-玉米赤霉烯酮、抗-T-2毒素，第四行抗-展青霉素，各有5个重复点样。

图3是多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液；3代表1瓶样本稀释液和1瓶酶标工作液；4代表2瓶配套使用的检测试剂；5代表标准品；6代表质控品。

图4为检测样本示意图，其中12个矩形表示所在加样区域加的是标准品，6个标准品每个重复2次；4个多边形表示所在加样区域加的是质控品；其余圆形表示所在加样区域加的是样本。

图5为结果检测为阴性的反应区阵列图，各指标或有微弱信号。

图6为结果检测为部分霉菌毒素阳性的反应区阵列图。第一行5个亮点代表黄曲霉毒素B1阳性；第二行后5个亮点代表呕吐毒素阳性；第三行前后各5个亮点代表玉米赤霉烯酮、T-2毒素阳性。

具体实施方式：

实施例1：

一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片的制备

其步骤主要是：(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤：

1.霉菌毒素检测抗原抗体的确定

检测指标抗原的确定：

选取危害较大及较广泛的7种霉菌毒素作为抗原，从原料中进行提取，纯化。以黄曲霉毒素的提取为例：将确定含黄曲霉毒素的原料，用一定比例的40％甲醇提取液进行提取。经过过滤、稀释后，用免疫亲和柱净化，再用甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，使用免疫亲和柱进行纯化。其他霉菌毒素的提纯方法相同。

检测指标抗体的确定：

所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对，其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。

2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片

用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×5mm；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。

3.蛋白芯片组装

用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。

实施例2：

试剂盒的制备

一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片的试剂盒，由多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，标准品，质控品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图

2)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法：

1.多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。

2.标准品提供6瓶，每瓶0.25ml。

用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置，其中黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和展青霉素标准品的终浓度见下表：

3.质控品提供4瓶，每瓶0.2ml。

质控品分为4个浓度，分别是LL(最低检测浓度)、L(接近正常参考值上限的浓度)、M(界于最低检测浓度和检测上限之间的中间浓度)和H(检测上限)。

质控品是用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制，下表显示黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和展青霉素质控品的终浓度及质控界限。

上述质控品质控界限测定方法如下：

分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品LL、L、M和H，重复4次/板，每天每人重复测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品LL、L、M和H的均值和标准差，质控界限为

4.样本稀释液

由40％甲醇配制而成。提供1瓶，50ml。用于稀释样本(比例为：1g样本∶1ml稀释液)。

5.酶标工作液

由3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，含有HRP标记的7个霉菌毒素特异的单克隆抗体。提供6ml，1瓶。

6.浓缩洗涤液(10×)

为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成：磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-20 10ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。

提供50ml，1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。

7.检测液

使用PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。

实施例3：

蛋白芯片及试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于定量检测多种霉菌毒素的蛋白芯片的应用，主要采用抗体-抗原-酶标二抗方法检测样本中的霉菌毒素，方法是：固体样本如谷物、大豆等，将其碾碎，取1g放入1ml样本稀释液中，充分混匀，使样本与样本稀释液充分反应半小时后，吸取部分加于芯片表面；液体样本如果汁、粮油等，直接区1ml，放入1ml样本稀释液中，充分混匀，使样本与样本稀释液充分反应半小时后，吸取部分加于芯片表面。样本中的霉菌毒素作为类似抗原的成分，分别于固定在芯片上的相对应的特异抗体结合，甩干后加入酶标二抗反应，洗去未结合的二抗，加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与样本中的霉菌毒素的浓度成正比。

在上述用于用于定量检测多种霉菌毒素的蛋白芯片的应用，其反应及检测的具体使用方法如下：

(1)对喷点抗体的芯片用3％BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；

(2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；

(3)在芯片的反应区域，加入经等比例稀释的样本提取液，以及6份标准品的2次重复，4份质控品(加样方式见示意图4)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使霉菌毒素与其特异抗体充分反应；

(4)甩干后，每孔加入酶标二抗100ul，置于恒温反应仪中37℃，振荡反应30分钟，并且用10倍稀释的磷酸缓冲液在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟；

(5)将PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加20ul，进行化学发光；

(6)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。

如5为结果检测为阴性的反应区阵列图，各指标或有微弱信号。

图6为结果检测为部分霉菌毒素阳性的反应区阵列图。第一行5个亮点代表黄曲霉毒素B1阳性；第二行后5个亮点代表呕吐毒素阳性；第三行前后各5个亮点代表玉米赤霉烯酮、T-2毒素阳性。

Claims (8)

1.一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成，其特征在于，所述的蛋白检测指标包括：黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和展青霉素共7个霉菌毒素抗体，以共价键或非共价键固定在基片上面。

2.如权利要求1所述的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

3.如权利要求2所述的的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是带有醛基修饰的载玻片。

4.如权利要求1或2或3所述的的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，其特征在于，所述的对照指标包括1个阳性对照和1个阴性对照；阳性对照为兔IgG抗体，阴性对照为抗体点样所用的稀释液。

5.如权利要求4所述的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，其特征在于，所述的涂层上每个检测指标有2-10个重复，对照指标有1-5个重复。

6.一种多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片，用纸质模板固定于包装盒内。

7.如权利要求6所述的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液、检测液、标准品、质控品；各液体为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内。

8.如权利要求7所述的多种霉菌毒素定量检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，各部分配制方法如下：

所述的样本稀释液为40％甲醇；

所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原的单克隆抗体，以及酶标稀释液组成；

所述的浓缩洗涤液为中性缓冲液；

所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢；

所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的霉菌毒素混合液组成，每个霉菌毒素混合液装入一个容器，霉菌毒素混合液由7个霉菌毒素指标按不同浓度混合而成；

所述的质控品由2-6个不同浓度的霉菌毒素混合液组成，每个霉菌毒素混合液装入一个容器，霉菌毒素混合液由7个霉菌毒素指标按不同浓度混合而成。

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