CN102507938A

CN102507938A - 一种肝癌转移预测定量抗体芯片及试剂盒

Info

Publication number: CN102507938A
Application number: CN2011102979323A
Authority: CN
Inventors: 郭坤; 刘银坤; 康晓楠; 高冬梅; 孙淳
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2011-10-08
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-08
Also published as: CN102507938B

Abstract

本发明提供了一种肝癌转移预测定量抗体芯片及试剂盒，所述的定量检测芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白为OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin。所述的试剂盒包含以OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin为检测对象的定量抗体芯片，含有OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的抗原标准品，OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的生物素化的单克隆检测抗体。本发明成功构建了可用于肝癌患者血清学检测的转移预测定量抗体芯片，用于肝癌转移的预测准确性高达83%，对于肝癌患者预后的判断具有重要的临床意义。

Description

一种肝癌转移预测定量抗体芯片及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肝癌转移预测定量抗体芯片及试剂盒，属于生物技术和医学技术领域。

背景技术

肝癌是恶性程度极高，预后极差的恶性肿瘤。全世界半数左右的肝癌病人集中在中国，其致死率居我国所有肿瘤的第二位。肝癌是我国第二位癌症死因，全球50％以上的原发性肝癌发生在我国。术后高转移复发率（5年复发率达70％，小肝癌也达50％）已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的重要关键。

近年来随着免疫学、分子生物学和生物化学等基础医学领域的研究深入、检测技术的发展和方法学的进步，肿瘤标志物逐步成为临床诊断中可依赖的指标。理想的肿瘤标志物应具有下述特点：特异性强，灵敏度高，检测浓度水平与肿瘤大小及分期有关，能用于疗效监测和预后判断。虽然目前所检测的肿瘤标志物均未达到具有100%的灵敏度和100%的特异性等理想的程度，但由于检测和评价方法的不断改进，使肿瘤标志物的临床应用价值显得越来越重要。然而，由于基于单个分子标记物的癌症诊断分类模型，尚未表现出令人信服的敏感性和特异性，新的癌症相关的组织或血清分子标记物的筛选和鉴定、评估其诊断价值已经成为肿瘤研究的重要领域之一。

过去10年我国已进行了不少工作，在肝癌转移复发方面已取得了一系列标志性成果：建立了国际领先的人肝癌转移裸鼠及细胞模型系统；发现了一批有潜在意义的转移相关分子及治疗靶标；初步建立了肝癌转移的分子预测模型。但尚无足够特异、敏感的肝癌转移预测体系可用于临床转移复发预测。采用多个指标进行联合检测将是今后肝癌转移预测的研究方向。

对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化，为了减少这种相对“误差”，迫切需要一种快捷，有效的蛋白质分析技术。蛋白质芯片技术应运而生。蛋白芯片是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在基片上，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片，带有特殊标记的蛋白质分子（抗体或抗原）与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的高通量互检。该技术所需蛋白质的量极少，检测反应相对较快，具有通量化，稳定性较好，灵敏度较高，而且可进行定量分析。因此，构建多分子体系的定量抗体芯片不仅可以克服单分子标记物敏感性、特异性低的弊端，而且可利用统计分析建立更加客观使用的预测模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较高准确率的肝癌转移预测定量抗体芯片及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种肝癌转移预测定量抗体芯片，包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白为OPN（骨桥蛋白）、ICAM（细胞间黏附因子）、VEGF（血管内皮生长因子）、MMP9（基质金属蛋白酶9）、IL-8（白介素-8）和E-Selectin（E-选择素）。

优选地，所述的OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的特异性抗体的点制浓度依次为0.5mg/ml、0.7mg/ml、1.0mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml及0.5mg/ml。

优选地，所述的特异性抗体为鼠抗人单克隆抗体。

本发明还提供了一种肝癌转移预测试剂盒，其特征在于，包含以OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin为检测对象的定量抗体芯片，含有OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的抗原标准品，OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的生物素化的单克隆检测抗体。

本发明的原理如下：

（1）相关分子的筛选：根据文献调研及前期的血清比较蛋白质组学研究，初选了12个与肝癌分级或转移相关的血清学指标，包括OPN、ICAM-1、VEGF、bFGF、MMP2、MMP9、IL-8、CD44、CK19、E-Selectin、Thrombomodulin与PAI-1。通过ELISA方法对转移性及非转移肝癌患者血清各105例中的上述12个血清学指标进行验证，结果显示OPN、ICAM、VEGF、bFGF、MMP9、E-Selectin、Thrombomodulin水平差异具有显著性；而IL-8、MMP2、CK19、CD44与PAI-1则无显著性差异。但由于近年来免疫炎症在HCC转移中的重要作用，本发明将IL-8重新纳入抗体芯片中。单分子体系建立时，由于Thrombomodulin的检测效果不佳（无论点制抗体浓度多大，其荧光信号非常弱），故剔除该分子；多分子体系建立时，在确定每种指标的检测范围及建立标准曲线的过程中，发现bFGF标准曲线的相关系数不佳，分析原因发现其可能与血清水平低有关，剔除该分子后，最终形成6分子体系（均采购于R&D公司）（OPN[捕获抗体货号MAB14332、标准品货号1433-op-050、检测抗体货号BAF1433]、ICAM[捕获抗体货号MAB720、标准品货号720-IC-050、检测抗体货号BAF720]、VEGF[捕获抗体货号MAB293、标准品货号293-VE-050、检测抗体货号BAF293]、MMP9[捕获抗体货号MAB9111、标准品货号911-MPN-010、检测抗体货号BAF911]、IL-8[捕获抗体货号MAB208、标准品货号208-IL-050、检测抗体货号BAF208]、E-Selectin[捕获抗体货号BBA2、标准品货号ADP1-050、检测抗体货号BBA8]）。

（2）定量抗体芯片的构建及优化：利用美国GeneMachine公司的OmniGrid 100型芯片点样仪将不同浓度的上述6分子体系的鼠抗人单克隆抗体（购自R&D公司，美国）点制于硝酸纤维素基质包被的FAST Slide片基（Whatman Schleicher&Schell公司，英国）上。每种单克隆捕获抗体重复点制8个点，生物素化BSA（牛血清白蛋白）（Invitrogen，美国）作为阳性对照点，PBS（磷酸盐缓冲液）（Invitrogen，美国）为阴性对照点。点制好的芯片置于湿度为50%，温度为25℃的封闭环境中放置2-3天，待用。对于每个分子指标而言，将系列浓度（0.3mg/ml、0.5mg/ml、0.7mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml）捕获抗体点置于片基上，参考文献报道的各指标血清平均浓度，固定标准品浓度（OPN:200ng/ml；ICAM:200ng/ml；VEGF:500pg/ml；MMP9:100ng/ml；IL-8: 200ng/ml；E-selectin:100pg/ml），再加以系列浓度（0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml）检测抗体孵育，经激光共聚焦芯片扫描仪采集荧光信号值，从而确定了捕获抗体与混合生物素化检测抗体之间的最佳配对浓度并排除各抗原、抗体之间交叉反应（图4）。然后以最佳配对浓度捕获抗体与检测抗体，检测系列稀释浓度（0.1 pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、10000pg/ml、100000pg/ml、1000000pg/ml）的混合标准品，建立了双抗体夹心法对每一个分子的检测范围、最低检测限、精密度（片内变异系数[CV]为11.2%；片间CV为14.6%）（图1）。

指标	最佳捕获抗体浓度	最佳检测抗体浓度	检测范围
				OPN	0.5mg/ml	0.5μg/ml	10-1280 ng/ml
ICAM	0.7mg/ml	0.5μg/ml	10-100000 ng/ml
				VEGF	1.0mg/ml	1.0μg/ml	5-1280 ng/ml
MMP9	0.2mg/ml	1.0μg/ml	1.25-10240 ng/ml
				IL-8	0.5mg/ml	2.0μg/ml	1-8000pg/ml
E-selectin	0.5mg/ml	0.5μg/ml	1.25-640 ng/ml

（3）利用定量抗体芯片建立肝癌转移预测模型：收集检测临床资料明确的转移性肝癌血清27例，非转移性肝癌血清60例。每个围栏加入100ul患者血清（1:20稀释）；室温孵育1小时。200ul 1×Gentel wash清洗液（GenTel Biosurfaces公司，美国），轻微震荡后，弃去洗液，3次。加入生物素标记的检测抗体（0.5ug/ml，R&D公司，美国），室温孵育1小时。清洗后，加入含10%山羊血清的cy3标记卵白素（Invitrogen公司，美国）。室温1小时。清洗同上，拆卸装置。1×rinse液冲洗。立即风干。采用北京博奥生物有限公司的晶芯® LuxScan™10K 微阵列及图像数据处理的高分辨激光共聚焦芯片扫描仪，提取芯片上各阵列点的荧光信号强度平均值并进行数据分析，计算出转移组与非转移组肝癌患者血清中各指标的浓度（图2、5）。并采用logistic回归分析建立HCC转移预测数学模型，如下式所示：

Figure 2011102979323100002DEST_PATH_IMAGE001

式中，M1为OPN，M2为E-Selectin，M3为VEGF，M4为IL-8，M5为MMP9，M6为ICAM-1。并确立该模型区分转移与非转移的cutoff值为0.2193，敏感性可达77.78%，特异度达80%。（图3）

（4）利用6分子肝癌转移预测模型在测试集中验证预测准确性。所述的测试集由130例肝癌患者组成，利用上述的定量抗体芯片检测测试集中各样本血清中6分子的水平，参考cutoff值，结果显示成功预测了108例患者，准确率达83%。

本发明成功构建了可用于肝癌患者血清学检测的转移预测定量抗体芯片，该芯片所包含的6个分子（OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8、E-Selectin）是首次联合应用于肝癌转移血清学诊断，而且具有定量信息，其单个分子的检测范围涵盖了现有的报道值。该发明用于肝癌转移的预测准确性高达83%，对于肝癌患者预后的判断具有重要的临床意义。

附图说明

图1为抗体芯片检测血清单分子的标准曲线的相关系数R²及检测范围。

图2为利用抗体芯片检测转移性肝癌及非转移性肝癌血清中分子水平的差异。

图3为抗体芯片血清学检测区分转移性肝癌与非转移性肝癌的特异性及敏感性。

图4为抗体芯片中各分子之间无交叉反应。

图5为肝癌血清的芯片检测展示图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1：肝癌转移预测定量抗体芯片及其制备

一种肝癌转移预测定量抗体芯片，包括基片，所述基片上包含：

（1） OPN的鼠抗人单克隆抗体，0.5mg/ml，（生产厂家R&D、货号MAB14332）；

（2） ICAM的鼠抗人单克隆抗体，0.7mg/ml，（生产厂家R&D、货号MAB720）；

（3） VEGF的鼠抗人单克隆抗体，1.0mg/ml，（生产厂家R&D、货号MAB293）；

（4） MMP9的鼠抗人单克隆抗体，0.2mg/ml，（生产厂家R&D、货号MAB9111）；

（5） IL-8的鼠抗人单克隆抗体，0.5mg/ml，（生产厂家R&D、货号MAB208）；

（6） E-Selectin的鼠抗人单克隆抗体，0.5mg/ml，（生产厂家R&D、货号BBA2）；

（7）阴性对照PBS（浓度0.01mol/l、生产厂家Gibco公司、货号14040-141）；

（8）阳性对照生物素化BSA（浓度5mg/ml、生产厂家sigma公司、货号A00005）；

每个抗体、阴性对照、阳性对照各8个点，共64个点。

上述肝癌转移预测定量抗体芯片的制备方法为：利用美国GeneMachine公司的OmniGrid 100型芯片点样仪，采用常规点样方法，将各种抗体、阴性对照和阳性对照点制于硝酸纤维素基质包被的FAST Slide片基（Whatman Schleicher&Schell公司，英国）上。点制好的芯片置于湿度为50%，温度为25℃的封闭环境中放置2-3天，待用。

实施例2：肝癌转移预测试剂盒

一种肝癌转移预测试剂盒，包含：

（1）实施例1所述的定量抗体芯片；

（2）含有OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的抗原标准品，（储存液浓度均0.5mg/ml，溶解于0.01M PBS中）；

（3） OPN的生物素化的单克隆检测抗体[货号BAF1433]、ICAM的生物素化的单克隆检测抗体[货号BAF720]、VEGF的生物素化的单克隆检测抗体[货号BAF293]、MMP9的生物素化的单克隆检测抗体[货号BAF911]、IL-8的生物素化的单克隆检测抗体[货号BAF208]和E-Selectin的生物素化的单克隆检测抗体[货号BBA8]，均购自R&D公司；

（4）采集血样装置

（5）操作说明书。

实施例3：肝癌转移预测试剂盒的使用方法

1、所用试剂：

（1）实施例2所述的肝癌转移预测试剂盒；

（2） 1×Gentel blocking封闭液，美国GenTel Biosurfaces公司生产货号为（2-1014）；

（3） 1×Gentel wash清洗液，美国GenTel Biosurfaces公司生产货号为（2-1016）；

（4）含10%山羊血清的cy3标记卵白素，美国Invitrogen公司生产，货号为（43-4315）；

（5） 1×rinse液，美国GenTel Biosurfaces公司生产，货号为（2-1018）；

2、所用仪器设备：

（1） SIMplex装置（Whatman Schleicher&Schell公司，英国）；

（2）北京博奥生物有限公司生产的晶芯® LuxScan™10K 微阵列及图像数据处理的高分辨激光共聚焦芯片扫描仪；

3、具体操作步骤：

3.1装好SIMplex装置（Whatman Schleicher&Schell公司，英国），用排枪加200ul 1×Gentel blocking封闭液（GenTel Biosurfaces公司，美国）于每个围栏；室温孵育1小时；吸去封闭液。每个围栏加入100ul患者血清（1:20稀释）；室温孵育1小时。200ul 1×Gentel wash清洗液（GenTel Biosurfaces公司，美国），轻微震荡后，弃去洗液，3次。加入生物素标记的检测抗体（0.5ug/ml，R&D公司，美国），室温孵育1小时。清洗后，加入含10%山羊血清的cy3标记卵白素（Invitrogen公司，美国）。室温1小时。清洗同上，拆卸装置。1×rinse液冲洗。立即风干。采用北京博奥生物有限公司的晶芯® LuxScan™10K 微阵列及图像数据处理的高分辨激光共聚焦芯片扫描仪，提取芯片上各阵列点的荧光信号强度平均值并进行数据分析（图5）。

3.2采用logistic回归分析建立HCC转移预测模型，

（M1：OPN；M2：E-Selectin；M3：VEGF；M4：IL-8；M5：MMP9；M6：ICAM-1）。6分子联合诊断的效能高于单个分子（图4）。确立该模型区分转移与非转移的cutoff值为0.2193，敏感性可达77.78%，特异度达80%。

Claims

1.一种肝癌转移预测定量抗体芯片，包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白为OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin。

2.如权利要求1所述的肝癌转移预测定量抗体芯片，其特征在于，所述的OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的特异性抗体的点制浓度依次为0.5mg/ml、0.7mg/ml、1.0mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml及0.5mg/ml。

3.如权利要求1所述的肝癌转移预测定量抗体芯片，其特征在于，所述的特异性抗体为鼠抗人单克隆抗体。

4.一种肝癌转移预测试剂盒，其特征在于，包含以OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin为检测对象的定量抗体芯片，含有OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的抗原标准品，OPN、ICAM、VEGF、MMP9、IL-8和E-Selectin的生物素化的单克隆检测抗体。