CN104034903A - 血清中抗原类蛋白的荧光蛋白芯片检测方法和试剂盒 - Google Patents

血清中抗原类蛋白的荧光蛋白芯片检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明是一种“血清中抗原类蛋白的荧光蛋白芯片检测方法和试剂盒”，属于医学检测技术。其特征在于本发明结合荧光技术、标准曲线以及蛋白质芯片技术来定量检测血清中的某种抗原类蛋白物质，荧光技术本身的高特异性、灵敏性，以及标准曲线的采用实现定量检测，蛋白质芯片技术实现了多个样品同时检测和分析，使得一套完整的样品检测耗时大为减少，具有可靠性、准确性和低成本的特点；适用于血清中普通抗原类蛋白水平的一般分析以及重大疾病抗原标志物的定量分析，是一项具有重大意义的医学辅助检测手段，本发明还基于该方法提供了配套的试剂盒。

Description

血清中抗原类蛋白的荧光蛋白芯片检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及血清抗原检测技术，特别涉及血清中抗原类蛋白的荧光蛋白芯片方法和试剂盒。
背景技术
肝细胞癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，肝癌的早期诊断成为提高患者长期生存率的最佳有效途径。
在肝癌早期诊断研究领域，血清肿瘤分子标志物一直受到普遍关注。目前基础研究已发现100多种标志物与肝癌相关，AFP仍是目前肝癌定性诊断的最佳标志物，对肝癌的确诊、预后推测、疗效判断及复发转移的监测具有良好的临床价值。
目前用于血清肿瘤分子标志物的检测方法包括：传统的放射免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析系统、荧光免疫分析系统及电化学发光荧光免疫分析系统等。上述检测方法存在着血量大、检测时间长、费用高等问题。以ELISA为例，每次检测需要患者血清50ul,花费3个多小时。荧光蛋白芯片检测方法提供了快速、高效、准确的肿瘤标志物分析方法，对癌症类重大疾病的早期诊断和及时的后续治疗具有重大意义。
发明内容
本发明基于本领域在检测血清中AFP抗原方面的技术需求及缺陷，提供了一种适合于定量定性检测生物样品中抗原类蛋白的方案，该方案不仅仅适合于检测血清中的AFP抗原，对检测抗原类蛋白物质具有通用性，具有省时、经济、准确且微型化的优点。本发明的技术方案如下：
血清中的抗原类蛋白的荧光蛋白质芯片检测方法，其特征在于：
采用以下步骤：
(1)获取标准曲线：
所述标准曲线以目标抗原类蛋白的标准品的梯度浓度为横坐标，以梯度浓度的标准品经荧光检测方法检测到的对应荧光像素值为纵坐标；
(2)样品检测：
采用与上述荧光检测方法相同的程序检测待测血清样品中的目标抗原类蛋白的荧光像素值，带入标准曲线的回归方程式中计算出相应的目标抗原类蛋白浓度，乘以血清样品的稀释倍数得出实际的浓度；
并且所述荧光检测方法采用蛋白质芯片，所述蛋白质芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；
所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；
一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。
所述荧光检测方法的步骤如下：
待测血清样本稀释后滴加在所述蛋白芯片的检测亚区上，孵育后形成抗原特异性抗体复合物；用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的生物素标记的一抗,形成特异性抗体-抗原-一抗(生物素标记)复合物；用PBST洗涤4次，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的CY3标记的链酶亲和素，形成特异性抗体-抗原-一抗(生物素标记)-CY3标记的链酶亲和素复合物，用PBST洗涤未结合的链酶亲和素；
荧光扫描仪进行扫描得到荧光像素值；
其中所述特异性抗体与所述一抗物种来源不同。
所述蛋白芯片具有多个所述检测亚区，每个所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。
以上任一所述的荧光蛋白芯片检测方法，在所述样品检测步骤中，同时以正常血清、目标抗原类蛋白的标准品为对照检验所述标准曲线及所述蛋白质芯片的稳定性和有效性。
所述目标抗原类蛋白为AFP，所述检测斑上固定的特异性抗体为AFP鼠源抗体；所述一抗为生物素标记的兔源一抗。
一种用于分析血清中抗原类蛋白的试剂盒，其特征在于：包括蛋白质芯片和用于荧光检测的通用试剂；所述蛋白质芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；
所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；
一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。
所述蛋白芯片具有多个所述检测亚区，所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。
所述检测亚区之间的分界采用凸起作为物理隔断。
上述任一试剂盒，还包括目标抗原类蛋白的标准品，和/或以所述目标抗原类蛋白的标准品制作的标准曲线或直线回归方程说明书。
上述任一试剂盒中，所述用于荧光检测的通用试剂包括生物素标记的一抗，所述一抗与所述蛋白芯片的检测斑上固定的特异性抗体的物种来源不同。
本发明基于解决如何快速、低成本、可靠地定量检测肝癌血清样本中的标志物蛋白AFP这个技术问题，研发出了一种适合于检测血清中大多数抗原类蛋白物质的检测方法。
特别声明以下两点：
1.只要基于现有技术能够获得该抗原类蛋白物质的特异性抗体，那么本发明的方法就可以检测该抗原类蛋白在血清中的水平。
2.为了符合中国专利法的规定，本发明的方法要求保护的范围排除以本发明的检测方法检测疾病标志物以实现该疾病的诊断目的的检测，即本发明的方法权利要求中所述的目标抗原类蛋白物质不包括那些能明确指示血清样品所属主体的健康状况或疾病程度的标志性抗原蛋白物。
第2条声明不适用于本发明的产品权利要求。
本发明的方法结合了荧光检测方法、标准曲线以及蛋白芯片技术的应用，为本发明检测血清中抗原类蛋白物质保证了高灵敏性，准确性、高效性和低成本。
以下以检测AFP为例，说明本发明的方法原理：
采用购买的AFP抗原标准品，制成梯度浓度，采用荧光检测方法测定每个梯度对应的荧光像素值，以梯度浓度为横坐标，荧光像素值为纵坐标制定标准曲线并得到直线回归方程。
荧光检测方法：将AFP单克隆抗体按斑点状有序的固定在醛基玻片上(蛋白芯片)，利用抗体和抗原(血清中的蛋白标志物)特异性结合的特点，加入血清或者血浆标本进行孵育，然后加入生物素标记的AFP多克隆抗体，最后加入链酶亲和素CY3,通过荧光扫描仪对CY3信号进行扫描量化。将获得的信号值带入直线回归方程中，得到样品中目标抗原AFP的浓度。如图2所示，在本发明的方法中，应用了生物素-亲和素信号放大系统，这使得本发明的检测灵敏度大大提高。一个亲和素可结合多个CY3；将生物素与抗体(一抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。抗原(AFP)与生物素化的抗体结合，继而将CY3标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。生 物素-亲和素具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点该检测信号通过上述反应过程如图2蛋白质芯片的使用有三方面的优势：
一、允许为样品设置正常血清和标准品两种对照，保证待测血清样品与正常血清对照以及标准品血清对照的检测同时同质地真正平行地进行；正常血清对照的设置在于即时地检验蛋白芯片的有效性以免出现假阳性，标准品对照的设置是为了验证本此次操作的可靠性，如果检测结果带入直线回归方程算出的浓度与标准品的浓度在误差允许范围内基本相符，说明本次操作是可信的。这整体上提高了本方法的可靠性。
二、允许同时检测多个样品。多个重复的样品，或者不同时间点取的样品以获得动态值，或者各个不同的样品，总之，实现高通量检测。整体上降低检测成本和提高检测效率。
三、采用本发明的蛋白质芯片需要的血样及抗体量都大为减少，需血清量10ul,而ELISA方法检测需血清50ul；蛋白芯片板抗体点样，5ul至少可以点样20张芯片，检测200份血清,抗体需要量远远低于ELISA方法，大大降低了检测费用。
实验结果证明，本发明的方法不仅可以进行定性检测，还可通过发光强度对AFP进行定量检测。与ELISA方法进行对比，敏感性和特异性均优于ELISA方法，从时间上比较，ELISA检测至少需要3小时，本发明仅需要1.5小时。
综上，本发明提供的检测方法一种可行、可靠、经济，且简单、省时的方法。其成功开发将为检测血清中抗原类蛋白物质的大规模检测提供经济、可靠的检测方法。本发明根据该方法提供了试剂盒，本领域技术人员在本发明的方法的指导下，可是采用该试剂盒毫无疑义地实现本发明的检测目的。
附图说明
图1.蛋白质芯片点样示意图；
图2.抗体夹心法蛋白质芯片流程图；
图3.AFP标准品检测结果扫描图；
检测物分别为1.80ng/ml，2.40ng/ml，3.20ng/ml，4.10ng/ml，5.5ng/ml，6.2.5ng/ml，7.1.25ng/ml，8.空白对照，9.健康血清，10.肝癌血清；
图4.蛋白质芯片检测AFP标准曲线图；
图5.一张芯片上检测AFP抗原、肝癌血清和正常血清检测结果扫描图检测物分别为1.20ng/ml AFP，2.10ng/ml AFP，3.5ng/ml AFP，4.2.5ng/ml AFP，5.空白对照，6.健康血清，7.肝癌血清，8.健康血清，9.肝癌血清，10.肝癌血清；
实施例1.蛋白质芯片制备及使用流程
实验所用试剂和仪器：鼠源单克隆抗体AFP(深圳菲鹏公司)；醛基芯片(上海百傲公司)；生物素标记的兔源一抗(美国abcam公司)；CY3标记的链酶亲和素(美国abcam公司)；荧光扫描仪。(美国Molecular Devices公司)
芯片为醛基芯片(上海百傲公司)，每张芯片包含10个检测方格，每个方格检测一份血清，一次检测10份血清。
每个检测方格内，将鼠源单克隆抗体AFP(深圳菲鹏公司)、依次点在芯片上，点样四次，点样浓度2mg/ml，点成四个检测斑；10％牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，同样点样四次，点成对照斑
蛋白芯片操作流程
用制备好的蛋白质芯片检测健康对照组、非肝癌乙肝对照组和肝癌实验组动态血清标本中的肿瘤标志物。
用血清样本10ul,(或者2.5ul稀释4倍),滴加在芯片上，利用抗原抗体相结合的特性，使血清中的抗原与芯片上相对应的(鼠源)抗体特异性结合，形成抗原抗体(鼠源)复合物。
用PBST洗涤4次，去除非特异结合物后，用PBS稀释生物素标记的兔源一抗(美国abcam公司),再加入稀释好的兔源一抗。兔源抗体与抗原结合，形成(鼠源)抗体-抗原-(兔源)生物素标记抗体复合物。
用PBST洗涤4次，去除非特异结合物，用PBS稀释CY3标记的链酶亲和素(美国abcam公司)。形成抗体-抗原-抗体-CY3标记的链酶亲和素复合物。
用PBST洗涤未结合的链酶亲和素。荧光扫描仪进行扫描。
固相载体上的荧光像素与标本中受检抗原的量成正向相关,此时测定复合物中的像素值，即可确定待测抗原含量。芯片点样抗体(鼠源一抗)和检测用的抗体(兔源一抗)分别取自不同种属的动物。如图2抗体夹心法蛋白芯片流程图。
实施例2.本发明检测方法的建立
步骤1：制定标准曲线
采用购买的AFP抗原(美国abcam公司)，设置成不同的浓度梯度，(1-7)80ng/ml,40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，8空白对照，9健康血清，10肝癌血清。
采用实施例1中的操作流程和蛋白质芯片检测AFP标准品各个浓度梯度，检测扫描结果见图3。检测结果绘制成标准曲线图，以标准物的浓度为横坐标，像素值为纵坐标，在坐标 纸上绘出标准曲线。根据样品的像素值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度，标准曲线及回归方程见图4。
步骤2：样品检测检验本发明的方法的稳定性，准确性和可靠性
样品：
46份肝癌血清、32份正常健康人血清，AFP标准品设有15ng/ml,20ng/ml，30ng/ml40ng/ml,80ng/ml。
检测流程同实施例1.
将样品的像素值代入图4的回归方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
每张芯片10个检测亚区，包括3个不同浓度的AFP抗原标准品，1-2个健康血清样本，其余为肝癌血清样本，部分样品检测结果扫描结果见图5。
计算公式：抗原浓度X＝{(扫描荧光值Y-169.5)/26.65}×稀释倍数。
检测结果如下表
表146份肝癌血清、32份正常健康人血清检验本发明的方法的稳定性和可靠性
检测样品 荧光扫描值均值 AFP浓度 实际血清AFP浓度
CA 2953.25 104.4559099 208.9118199
N 360.25 7.157598499 14.315197
AFP30ng/ml 984 30.56285178
CA 1003.75 31.30393996 62.60787992
AFP15ng/ml 592.25 15.8630394
N 288.25 4.455909944 8.911819887
N 416.25 9.25891182 18.51782364
N 428.5 9.718574109 19.43714822
N 356 6.998123827 13.99624765
CA 1752.25 59.3902439 118.7804878
以上血清稀释2倍后检测
AFP40ng/ml 1265.75 41.13508443 41.13508443
AFP30ng/ml 918.3333333 28.09881176 28.09881176
N 551.5 14.33395872 14.33395872
N 525 13.33958724 13.33958724
N 597.5 16.06003752 16.06003752
N 476.25 11.51031895 11.51031895
N 611.25 16.57598499 16.57598499
N 556.25 14.51219512 14.51219512
CA 915.6666666 27.9987 27.9987
N 594.5 15.94746717 15.94746717
AFP40ng/ml 1171.5 37.5985 37.5985
CA 1290.5 42.06379 42.06379
CA1909 65.27205 65.27205
N591.75 15.84428 15.84428
CA995.25 30.98499 30.98499
CA812.25 24.1182 24.1182
CA1139.25 36.38837 36.38837
CA1733.25 58.6773 58.6773
N602 16.22889 16.22889
CA1595 53.48968 53.48968
CA3276 116.5666041 116.5666041
N407.25 8.92120075 8.92120075
CA2853.75 100.7223265 100.7223265
N602.25 16.23827392 16.23827392
CA1837.25 62.57973734 62.57973734
N500 12.40150094 12.40150094
CA1325.75 43.38649156 43.38649156
N485.25 11.84803002 11.84803002
AFP20ng/ml712 20.3564728 20.3564728
CA5351.75 194.4559099 194.4559099
CA2499.5 87.4296435 87.42964353
N431.5 9.83114447 9.831144465
CA1633.5 54.934334 54.93433396
CA5246.5 190.506567 190.5065666
CA1268.25 41.2288931 41.22889306
N590.5 15.7973734 15.79737336
AFP30ng/ml1040.25 32.673546 32.67354597
CA896.66 27.2858 27.2858
N546 14.1275797 14.12757974
CA1152.5 36.8855535 36.88555347
AFP80ng/ml2255.25 78.26454034 78.26454034
N334.25 6.181988743 6.181988743
AFP40ng/ml1156.5 37.03564728 37.03564728
CA6124.25 223.4427767 223.4427767
AFP20ng/ml714.75 20.45966229 20.45966229
N421.75 9.465290807 9.465290807
N675.25 18.97748593 18.97748593
N688 19.45590994 19.45590994
N670.25 18.78986867 18.78986867
CA2177.75 75.3564728 75.3564728
CA4892 177.2045028 177.2045028
CA17088 634.8405253 634.8405253
CA3436.5 122.5891182 122.5891182
CA19864.5 739.0243902 739.0243902
CA1862.25 63.51782364 63.51782364
CA3208 114.0150094 114.0150094
CA1164 37.31707317 37.31707317
CA17451.25 648.4709193 648.4709193
CA1027.5 32.19512195 32.19512195
N 544.75 14.08067542 14.08067542
CA 4556 164.5966229 164.5966229
AFP40ng/ml 1317.75 43.08630394 43.08630394
CA 3380.75 120.4971857 120.4971857
CA 1052.5 33.13320826 33.13320826
CA 1310.75 42.82363977 42.82363977
CA 5933.25 216.2757974 216.2757974
AFP20ng/ml 764 22.31 22.31
CA 1460.25 48.43339587 48.43339587
N 538.666667 13.85240775 13.85240775
CA 11317 418.2926829 418.2926829
CA 3723.5 133.358349 133.358349
N 650 18.03001876 18.03001876
CA 2394.25 83.48030019 83.48030019
CA 6033.75 220.0469043 220.0469043
CA 1861.25 63.48030019 63.48030019
CA 3433.25 122.467167 122.467167
N 705.75 20.12195122 20.12195122
CA 5521 200.8067542 200.8067542
N 550 14.27767355 14.27767355
N 194.5 0.938086304 0.938086304
目前的AFP检测水平以20ng/ml为分界线，正常人低于20ng/ml。
本芯片的检测结果显示：绝大部分正常人低于20ng/ml，肝癌血清的AFP水平都高于20ng/ml。
标准品的检测浓度与设定值基本没差异，显示本发明的方法灵敏性，特异性和可靠性都非常好。

Claims (10)

1.血清中的抗原类蛋白的荧光蛋白芯片检测方法，其特征在于：
采用以下步骤：
(1)获取标准曲线：
所述标准曲线以目标抗原类蛋白的标准品的梯度浓度为横坐标，以梯度浓度的标准品经荧光检测方法检测到的对应荧光像素值为纵坐标；
(2)样品检测：
采用与上述荧光检测方法相同的程序检测待测血清样品中的目标抗原类蛋白的荧光像素值，带入标准曲线的回归方程式中计算出相应的目标抗原类蛋白浓度，乘以血清样品的稀释倍数得出实际的浓度；
并且所述荧光检测方法采用蛋白芯片，所述蛋白芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；
所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；
一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。
2.根据权利要求1所述的荧光蛋白质芯片检测方法，其特征在于：
所述荧光蛋白芯片检测方法的步骤如下：
待测血清样本稀释后滴加在所述蛋白芯片的检测亚区上，孵育后形成特异性抗原抗体复合物；用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的生物素标记的一抗,形成特异性抗体-抗原-一抗(生物素标记)复合物；用PBST洗涤4次，去除非特异结合物；
加入用PBS稀释的CY3标记的链酶亲和素，形成特异性抗体-抗原-一抗(生物素标记)-CY3标记的链酶亲和素复合物，用PBST洗涤未结合的链酶亲和素；
荧光扫描仪进行扫描得到荧光像素值；
其中所述特异性抗体与所述一抗物种来源不同。
3.根据权利要求1或2所述的荧光蛋白芯片检测方法，其特征在于：所述蛋白芯片具有多个所述检测亚区，每个所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。
4.根据权利要求1～4任一所述的荧光蛋白芯片检测方法，在所述样品检测步骤中，同时以正常血清、目标抗原类蛋白的标准品为对照检验所述标准曲线及所述蛋白芯片的稳定性和有效性。
5.根据权利要求4所述的荧光蛋白芯片检测方法，其特征在于：
所述目标抗原类蛋白为AFP，所述检测斑上固定的特异性抗体为AFP鼠源抗体；所述一抗为生物素标记的兔源一抗。
6.一种用于分析血清中抗原类蛋白的试剂盒，其特征在于：包括蛋白芯片和用于荧光检测的通用试剂；所述蛋白芯片至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；
所检测亚区内按斑点状设置有检测斑和对照斑，所述检测斑上固定有所述目标抗原类蛋白的特异性抗体，所述对照斑上固定有牛血清白蛋白作为阴性对照；
一个所述检测亚区内的所述检测斑至少为两个，且固定的特异性抗体浓度相同。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质芯片具有多个所述检测亚区，所述检测亚区内包括四个检测斑，四个对照斑；检测斑和对照斑各排成一列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测亚区之间的分界采用凸起作为物理隔断。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：还包括目标抗原类蛋白的标准品，和/或以所述目标抗原类蛋白的标准品制作的标准曲线或直线回归方程说明书。
10.根据权利要求6～9任一所述的试剂盒，所述用于荧光检测的通用试剂包括生物素标记的一抗，所述一抗与所述蛋白芯片的检测斑上固定的特异性抗体的物种来源不同。
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