CN101603966A - 一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒,该芯片包括基片和阵列式分布的蛋白标志物与对照的点涂层,所述的基片是玻璃基片或膜基片;所述的肿瘤标志物与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的,点阵于基片上的AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag七个蛋白标志物及阳性对照、阴性对照。利用本发明的蛋白芯片仅通过一次反应就可得到多种指标的反应结果,可以同时筛查下列肿瘤:原发性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌和结肠直肠癌。特别适用于男性无症状人群和高危人群的恶性肿瘤普查。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白芯片疾病检测产品,具体地说,涉及一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤的早期诊断可以提高患者的预后和生存率,男性恶性肿瘤(包括原发性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、结肠直肠癌)的临床诊断方法一般包括影像学检查(如B超、X线钡餐、X线、CT、MRI)、血清肿瘤标志物检测(如tPSA、AFP、CA19-9等)、直肠指诊、内镜检查(食管内镜、纤维胃镜、可折式乙状结肠镜、全结肠镜)和活组织病理检查。尽管影像学检查和内镜检查可以早期发现恶性肿瘤,但由于价格昂贵或具有入侵性,不能应用于一般人群的体检筛查。然而,多数恶性肿瘤早期鲜有临床症状,当出现症状去医院就诊时,已发展为恶性肿瘤中晚期,病人的预后和生存率较低。
越来越多的研究显示:血清肿瘤标志物检测有助于恶性肿瘤的早期发现、提示预后或监测病程,而且血清肿瘤标志物联合检测可以提高恶性肿瘤检测的敏感性和特异性。目前用于血清标志物检测的方法可分为三大类:单指标单人份(如免疫胶体金、自动化免疫分析仪)、单指标多人份(ELISA)和多指标多人份(蛋白芯片)。与单指标检测方法相比,蛋白芯片检测有样本用量少、所需时间短、价廉等优点,更适于多肿瘤标志物的联合检测。
男性,尤其是中年男性是社会的主要劳动力,同时也是最忙碌的群体,往往对身体过于自信,忽视检查。需要一种简便,适应快节奏生活的检查方法用于男性的体检。目前市场上尚没有专门针对男性肿瘤进行检测的多指标蛋白检测产品。另外肿瘤检测指标经报道已经不少,但指标选择不当会产生假阳性或假阴性偏高的问题,从而使临床检测失去意义。所以我们需要一种指标选择合适,专门针对男性作肿瘤检测的多指标蛋白检测产品。
发明内容
本发明要提供一种专门用于男性肿瘤检测,并且指标选择恰当的多肿瘤蛋白标志物检测芯片,以及包含该芯片的试剂盒。本发明涉及的检测指标恰当,应用反应条件一致,避免了交叉反应和酶反应底物的潜在危害和污染,大大提高了检测的效率,降低了假阳性率。本发明可以适用于男性无症状人群和高危人群的恶性肿瘤普查。可同时筛查肿瘤包括:原发性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌和结肠直肠癌。辅助诊断原发性肝癌、前列腺癌和胰腺癌。指标与检测项目对应关系见下表。
本发明目的是这样实现的,发明人根据已报道的肿瘤标志物的临床应用情况以及中国男性肿瘤的流行病学特点,选取AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag七个肿瘤标志物,与阳性指标,阴性指标构成阵列式点样涂层,同时点阵于一张基片上,每个阵列可有多次重复。
本发明涉及的用于男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成,所述的蛋白检测指标包括AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag共7个肿瘤标志物,以共价键盘或非共价键固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基,硝酸纤维素膜或尼龙膜。
上述基片的一个优选例是醛基化玻片。
上述的对照检测指标涂层包括阳性对照和阴性对照;阳性对照为兔IgG抗体,阴性对照为抗体点样所用的稀释液。
上述涂层上的每个阵列中蛋白检测指标每个有2-10个重复,对照指标有1-5个重复。阵列的多少和大小与待检样品的数目,基片大小,以及点样直径有关。
上述蛋白检测指标与检测阵列的优选例是:当蛋白检测指标点样直径为0.1mm时,点间距0.6mm,阵列大小为6mm×5mm,可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。
本发明还提供了包含上述男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的试剂盒,还包括标准品和质控品;标准品与质控品为瓶装,用纸质模板固定于包装盒内。
上述的试剂盒,还包括样本稀释液,酶标工作液,浓缩洗涤液,检测液;各液体为瓶装,与标准品和质控品一起用纸质模板固定于包装盒内。各部分由纸质模具固定于一包装盒内,不限放置方式,检测时配套使用。
上述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成,每个蛋白混合液装入一个容器,蛋白混合液由7个多肿瘤标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。标准品用于在每次标本检测结束后做标准曲线,可以定量测定样品中的检测指标的蛋白浓度。
上述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成,每个蛋白混合液装入一个容器,蛋白混合液由7个多肿瘤标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。质控品可以监测整个检测系统的CV值,保证每次检测结果的有效性。
上述的样本稀释液是一种蛋白稳定剂;可以是由3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成;
上述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原或单克隆抗体,以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成;
上述的浓缩洗涤液是一种中性缓冲液;可以是磷酸盐缓冲液;
上述的检测液指配套使用的两种试剂,一种含有鲁米诺和化学发光增强剂,另一种含有过氧化氢。
附图说明:
图1是男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的外观图,1为反应区域,底部为点样涂层的基片。
图2是点样阵列示意图,第1行为阳性对照兔IgG抗体和阴性对照,各有3个重复点样;其余各行分别为蛋白检测指标点样AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag,每行两个指标,第一行AFP、CEA,第二行NSE、CYFRA21-1,第三行CA19-9、tPSA,第四行SCC-ag,各有5个重复点样。
图3是男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓缩洗涤液;3代表1瓶样本稀释液和1瓶酶标工作液;4代表2瓶配套使用的检测试剂;5代表标准品;6代表质控品。
图4为检测血清示意图,其中12个矩形表示所在加样区域加的是标准品,6个标准品每个重复2次;4个多边形表示所在加样区域加的是质控品;其余圆形表示所在加样区域加的是样本。
图5为结果检测为阴性的反应区阵列图,其中左上角3个亮点是阳性对照的信号,阴性对照和CEA、CYFRA21-1没有信号,其余指标有微弱信号。
图6为结果检测为肝癌阳性的反应区阵列图。左上角3个亮点表示阳性对照的信号,第2排前5个亮点是AFP的信号。
具体实施方式:
实施例1:
一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的制备
其步骤主要是:(1)准备基质硝酸纤维素膜;(2)设计芯片,确定点阵的排列方式和点样位置;(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上;(4)装配硝酸纤维素膜,并且进行封闭、干燥、包装、保存。
上述用于检测男性多肿瘤标志物抗体的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤:
1.肿瘤标志物检测抗原抗体的确定
检测指标抗原的确定:
肿瘤标志物CEA是由六段相似度很高的肽段组合而成,因而选择了其中的A1+B1段进行基因工程表达;PSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-1均为全长基因工程表达;而AFP和CA19-9则为纯化的肿瘤细胞分泌抗原。
检测指标抗体的确定:
所采用的检测抗体对均为小鼠杂交瘤单克隆抗体对,其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。
2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片
用Gesim点样仪喷点,点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上,点阵形式为10×5矩形阵列,当点直径为0.1mm,点横向间距为0.6mm,抗体阵列的大小为6mm×5mm;点样后贴膜,封闭;最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。
3.蛋白芯片组装
用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。
实施例2:
试剂盒的制备
一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片的试剂盒,由男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,标准品,质控品,样本稀释液,酶标工作液,浓缩洗涤液,检测液组成;各部分为瓶装,用纸质模板固定于包装盒内(如图2),不限放置方式,检测时配套使用。以下是各部分的制备方法:
1.男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片为6×8孔板,由硝酸纤维素膜做为片基,组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。
2.标准品提供6瓶,每瓶0.25ml。
用含有3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置,其中AFP、CEA、CA19-9、tPSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-1标准品的终浓度见下表:
3.质控品提供4瓶,每瓶0.2ml。
质控品分为4个浓度,分别是LL(最低检测浓度)、L(接近正常参考值上限的浓度)、M(界于最低检测浓度和检测上限之间的中间浓度)和H(检测上限)。
质控品是用含有3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制,下表显示AFP、CEA、CA19-9、tPSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-1标准品的终浓度及质控界限。
上述质控品质控界限测定方法如下:
分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品LL、L、M和H,重复4次/板,每天每人重复测2块芯片,重复检测10天,分别计算质控品LL、L、M和H的均值和标准差,质控界限为X±2SD。
4.样本稀释液
由3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶,9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。
5.酶标工作液
由3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液,含有HRP标记的7个肿瘤标志物特异的单克隆抗体,以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供6ml,1瓶。
6.浓缩洗涤液(10×)
为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成:磷酸二氢钾6.8g,磷酸氢二钠7.1g,TWEEN-20 10ml,溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。
提供50ml,1瓶。使用前用450ml去离子水稀释,混匀。
7.检测液
实施例3:
蛋白芯片及试剂盒的应用及检测
本发明所述的用于检测男性多肿瘤标志物抗体的蛋白芯片的应用,主要采用抗体-抗原-酶标二抗方法检测人血液中的肿瘤标志物抗体,方法是将人血清加于芯片表面,样本中的抗原分别于固定在芯片上的相对应的抗体结合,甩干后加入酶标二抗反应,洗去未结合的二抗,加入检测液后1分钟,扫描并收集信号,样本点的信号强度与血清中抗原的浓度成正比。
在上述用于检测男性多肿瘤标志物抗体的蛋白芯片试剂盒的应用中,其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下:
(1)对喷点抗体、阳性对照、阴性对照的芯片用3%BSA溶液进行封闭,室温2小时,封闭基片表面非特异性位点;
(2)甩干封闭液后,室温放置4小时,进行干燥;
(3)在芯片的反应区域,加入经等比例稀释的人血清样品,以及6份标准品的2次重复,4份质控品(加样方式见示意图4);每孔加100ul,置于恒温反应仪中37℃,振荡反应1小时,使抗原与抗体充分反应;
(4)甩干后,每孔加入酶标二抗100ul,置于恒温反应仪中37℃,振荡反应30分钟,并且用10倍稀释的磷酸缓冲液在摇床上振荡洗涤三次,每次1分钟;
(5)将PIERCE公司的SuperSignalELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合,加入芯片上各反应区域上,每阵列加20ul,进行化学发光;
(6)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号,依据扫描结果显示分析检测结果。
如图5为结果检测为阴性的阵列图,图6为结果检测为肝癌阳性的阵列图。
Claims (10)
1.一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,其特征在于,由基片和阵列式分布于基片上的蛋白检测指标以及对照检测指标涂层组成,所述的蛋白检测指标包括AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag共7个肿瘤标志物,以共价键或非共价键固定在基片上面。
2.如权利要求1所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,其特征在于,所述的基片可以是玻璃片基,硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3.如权利要求2所述的的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,其特征在于,所述的玻璃片基是带有醛基修饰的载玻片。
4.如权利要求1或2或3所述的的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,其特征在于,所述的对照指标包括1个阳性对照和1个阴性对照;阳性对照为兔IgG抗体,阴性对照为抗体点样所用的稀释液。
5.如权利要求4所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,其特征在于,所述的涂层上每个检测指标有2-10个重复,对照指标有1-5个重复。
6.一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片,标准品和质控品;标准品与质控品为瓶装,用纸质模板固定于包装盒内。
7.如权利要求6所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒,其特征在于,还包括样本稀释液,酶标工作液,浓缩洗涤液和检测液;各液体为瓶装,用纸质模板固定于包装盒内。
8.如权利要求6或7所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒,其特征在于,所述的标准品由5-10个不同浓度梯度的蛋白混合液组成,每个蛋白混合液装入一个容器,蛋白混合液由7个多肿瘤标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
9.如权利要求6或7所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒,其特征在于,所述的质控品由3-6个不同浓度的蛋白混合液组成,每个蛋白混合液装入一个容器,蛋白混合液由7个多肿瘤标志物蛋白检测指标按不同浓度混合而成。
10.如权利要求7所述的男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片试剂盒,其特征在于,各部分配制方法如下:
所述的样本稀释液为蛋白稳定剂;
所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应抗原的单克隆抗体,以及检测抗体HRP-羊抗兔IgG的前述样本稀释液组成;
所述的浓缩洗涤液为中性缓冲液;
所述的检测液指配套使用的两种试剂,一种含有鲁米诺和化学发光增强剂,另一种含有过氧化氢。
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