CN109239344A

CN109239344A - 一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品

Info

Publication number: CN109239344A
Application number: CN201811158356.2A
Authority: CN
Inventors: 王树亮; 史小芹; 郑业焕; 渠海; 付光宇; 吴学炜
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明公开了一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，包括以下组分：pH6~8的缓冲液10~200mmol/L，防腐剂0.1~0.5%，蛋白质类稳定剂1~5%，金属离子类稳定剂0.01~1%（w/v）,神经元特异性烯醇化酶抗原0~500ng/mL。的优点在于：通过金属离子对NSE抗原分子的三级立体结构有支撑的作用，有效地提高了NSE蛋白的稳定性，使得制备的NSE液态校准品稳定性较好，从而使NSE标准品不用冻干，使用时也无需复溶，减少了复溶过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确。

Description

一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品

技术领域

本发明涉及医学检验领域，尤其是涉及一种神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量测定用液态校准品。

背景技术

神经元特异性烯醇化酶 (NSE)是烯醇化酶的一种同工酶，以二聚体的形式存在，特异地定位于神经元及神经内分泌细胞内，分子量为78kDa，等电点为pH4.7，是一种酸性蛋白酶。其三维结构包括大约130个氨基酸的N-端区域，大约300个氨基酸组成8个α/β桶状结构，其中β折叠位于桶状结构的核心部位，为NSE的活性位点所在，周围环绕α螺旋。酶活性中心主要由以下三种碱性氨基酸组成：组氨酸-189、精氨酸-371和赖氨酸-393。NSE所有抗原决定簇都分布在48～96、188～293、399～433氨基酸序列区，位于其三维结构表面，在免疫反应中可刺激机体产生NSE 的单克隆抗体，可用于NSE 的检测。人类的NSE二聚体是不对称的复合物，其中一个亚基含有硫酸根离子和两个镁离子是闭合的构象，可观察到该亚基结合有酶底物或其类似物；而另一个亚基没有结合任何底物或类似物，呈开放的构象。

目前认为NSE是小细胞肺癌 (SCLC)和神经母细胞瘤的敏感指标。

神经母细胞瘤是常见的儿童肿瘤，作为神经母细胞瘤的标志物，NSE对该病的早期诊断有较高的临床应用价值。目前已公认NSE可作为SCLC高相关性，高灵敏性的肿瘤标志物，血清NSE含量改变同SCLC的临床病程具有很好的相关性，监测血清NSE含量，一般在4～12周之前即可预报治疗缓解后SCLC是否复发，显然比X线胸片等检查来得灵敏和方便。NSE水平与其对治疗的反应性之间也有良好的相关性。

NSE是小细胞肺癌细胞株所分泌的一种多肽，小细胞肺癌是一种恶性程度高的神经内分泌系统肿瘤，约占肺癌的25%～30%，SCLC患者血清NSE检出的阳性率可达 65%～100%，NSE被认为是监测小细胞支气管癌的首选标志物。60-81%的小细胞支气管癌患者的NSE升高。血清NSE水平与转移部位或者是否为神经系统转移没关系，与小细胞肺癌的临床进程相平行。NSE是监测小细胞支气管癌疗效与病程的有效标志物，并能提供有价值的预后信息：诊断敏感性为93%，阳性预测值为92%。NSE水平与其对治疗的反应性之间也有良好的相关性。非小细胞肺癌患者如出现血清NSE含量异常增高，则有可能表明患者的预后较差。

2017中国癌症登记年报显示，肺癌是近年发病率和死亡率前三的癌症之一。通过免疫检测定量测定人血浆和血清中的神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量，可辅助用于肺癌的早期诊断、疾病进程检测、治疗效果评价及复发监测等。

目前，国内外知名的体外诊断试剂生产商（如罗氏、康乃格等）提供的神经元特异性烯醇化酶（NSE）校准品主要是冻干品，不仅价格昂贵，而且冻干校准品存在以下缺点：a.复溶给操作者带来了一定麻烦；b. 复溶过程中，水质差异及人为操作误差可能导致校准品复溶后的浓度与靶值有偏差，从而造成临床检测结果的不准确； c. 校准品复溶后不易保存、保存时间短。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定的神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量测定用液态校准品，该液态校准品可在2~8℃冷藏条件下保存1年，对神经元特异性烯醇化酶（NSE）的测定具有良好的检测性能。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品包括以下组分：

pH6~8的缓冲液10~200mmol/L，防腐剂0.1~0.5%，蛋白质类稳定剂1~5%，金属离子类稳定剂0.01~1%（w/v）, 神经元特异性烯醇化酶抗原0~500ng/mL。

实际配制时，缓冲液可以采用Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、Taps缓冲液或Mops缓冲液中的任一种。

防腐剂可以使用Proclin-300、MIT、Bro、IPBC或NaN₃中的一种或两种以上的混合物。

蛋白质类稳定剂可以使用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。

金属离子类稳定剂可以采用 Ca²⁺离子、Mg²⁺离子、CO²⁺离子、Zn²⁺离子的一种或两种以上混合物。

神经元特异性烯醇化酶抗原分为0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL六个浓度梯度。

本发明的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品的配制方法为：先取缓冲液1L，再加入适量的防腐剂和金属离子类稳定剂，搅拌混匀，最后再加入所需量的蛋白质类稳定剂，搅拌混匀后得到的溶液即为校准品稀释液。

利用配制好的校准品稀释液分别添加适量的神经元特异性烯醇化酶抗原配制成0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL六个浓度的校准品。

本发明的优点在于：通过金属离子对NSE抗原分子的三级立体结构有支撑的作用，有效地提高了NSE蛋白的稳定性，使得制备的NSE液态校准品稳定性较好，从而使NSE标准品不用冻干，使用时也无需复溶，减少了复溶过程中可能出现的不可控因素，使得临床检测结果更为准确。

由于人类的NSE二聚体是不对称的复合物，其中一个亚基易失去相应配体而导致不稳定。本发明配制的液态校准品中由于加入了Ca2+离子、Mg2+离子、CO2+ 离子、Zn2+离子等金属离子，有效地提高了神经元特异性烯醇化酶（NSE）分子立体结构的稳定性，使得制备的神经元特异性烯醇化酶（NSE）液态校准品稳定性较好，可在2-8℃冷藏稳定保存12个月。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。

实施例1 配制神经元特异性烯醇化酶（NSE）含量测定用液态校准品

1、采用不同的金属离子（Ca²⁺离子、Mg²⁺离子、CO²⁺ 离子、Zn²⁺离子）配制液态校准品

1.1 Ca²⁺离子：

称取Tris 0.65g（北京益利精细化学品有限公司）、氯化钠0.8g（北京益利精细化学品有限公司），加入80mL纯化水，调节pH=7.4，依次加入牛血清白蛋白3g（sigma）、Proclin 3000.2mL（sigma）、MIT 0.2mL、0.01g Ca²⁺离子，然后定容至100mL，搅拌至溶解备用；

1.2 Mg²⁺离子：

称取Tris 0.65g（北京益利精细化学品有限公司）、氯化钠0.8g（北京益利精细化学品有限公司），加入80mL纯化水，调节pH=7.4，依次加入牛血清白蛋白3g（sigma）、Proclin 3000.2mL（sigma）、MIT 0.2mL、0.01g Mg²⁺离子，然后定容至100mL，搅拌至溶解备用；

1.3 CO²⁺ 离子：

称取Tris 0.65g（北京益利精细化学品有限公司）、氯化钠0.8g（北京益利精细化学品有限公司），加入80mL纯化水，调节pH=7.4，依次加入牛血清白蛋白3g（sigma）、Proclin 3000.2mL（sigma）、MIT 0.2mL、0.01g CO²⁺ 离子，然后定容至100mL，搅拌至溶解备用；

1.4 Zn²⁺离子：

称取Tris 0.65g（北京益利精细化学品有限公司）、氯化钠0.8g（北京益利精细化学品有限公司），加入80mL纯化水，调节pH=7.4，依次加入牛血清白蛋白3g（sigma）、Proclin 3000.2mL（sigma）、MIT 0.2mL、0.01g Zn²⁺离子，然后定容至100mL，搅拌至溶解备用。

2、含不同金属离子的校准品对稳定性的影响

将上面配制的四种液体分别加入不同质量的神经元特异性烯醇化酶抗原配制成对应的六种浓度梯度的校准品（0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL ，称作S0、S1~ S5）。

实施例2 实施例1配制的液态校准品的稳定性测定

各取一套实施例1配制的校准品在37℃条件下放置10天，与相应在2~8℃保存的标准品比较，考核其稳定性降幅，结果见表1。

表1不同金属离子对神经元特异性烯醇化酶（NSE）校准品稳定性的影响

从表1结果可以看出，神经元特异性烯醇化酶（NSE）在四种金属离子溶液中的稳定性相当。

实施例3 实施例1配制的液态校准品的实时稳定性考核

将实施例1配制的神经元特异性烯醇化酶（NSE）液态校准品分装后置于2-8℃保存，分别在0个月、2个月、4个月、6个月、9个月、12个月、14个月时分别取出来一份，使用郑州安图生物工程股份有限公司的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒（化学发光法）检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）的含量，配套本公司的Lumo考核该液态神经元特异性烯醇化酶（NSE）校准品的稳定性。结果见表2。

表2 神经元特异性烯醇化酶（NSE）校准品实时稳定性考核（信号值比值）

由表2可知，2~8℃保存12个月后，校准品中神经元特异性烯醇化酶（NSE）的含量降解小于10%，说明该校准品具有良好的稳定性，可以取代冻干品的校准品使用，大大降低了成本，减少了操作麻烦，提高了临床检测的准确度。

实施例4 实施例1配制的液态校准品的标定

本发明配制的校准品包含六个浓度点S0、S1-S5(理论浓度分别是0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)。使用罗氏公司的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒（电化学发光法）对本校准品的S1-S5进行标定。选取不同的三个实验室的罗氏神经元特异性烯醇化酶（NSE）标定本校准品，每个实验室检测10次，最终校准品各浓度点得到30个数据，求平均值，即为校准品的靶值。结果见表4：

表4 校准品的标定（单位：ng/mL）

从表4可以看出，五个浓度点的S1-S5值分别是4.95ng/mL、25.18ng/mL、50.78ng/mL、100.37ng/mL、200.58ng/mL。表明靶值与理论值非常接近，保证了临床检测结果的准确性。

Claims

1.一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、Taps缓冲液或Mops缓冲液中的任一种。

3.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：所述防腐剂为Proclin-300、MIT、Bro、IPBC或NaN₃中的一种或两种以上的混合物。

4.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：所述蛋白质类稳定剂为酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。

5.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：所述金属离子类稳定剂为 Ca²⁺离子、Mg²⁺离子、CO²⁺离子、Zn²⁺离子的一种或两种以上混合物。

6.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品，其特征在于：所述神经元特异性烯醇化酶抗原包括0ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL六个浓度梯度。