CN106916222B - 甲胎蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲胎蛋白抗原的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生。本发明提供了一种甲胎蛋白检测试剂盒,包括:包被液、由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。本发明获得了保藏编号为CGMCC No.13808的AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株,其产生的抗体可以用于检测AFP抗原,具有较高的灵敏度和准确度,用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域,尤其涉及一种甲胎蛋白检测试剂盒。
背景技术
目前,恶性肿瘤已经排在我国居民主要疾病死亡率的首位,成为影响人们健康的头号杀手。根据我国卫生部统计数据,我国每年新发癌症病例约337万,死亡约211万,河北省肿瘤登记地区恶性肿瘤发病率为224.59/10万。肝癌(特别是原发性肝细胞癌,Hepatocellularcarcinoma,HCC)已经成为仅次于胃癌的第二大癌症。作为一种高死亡率的疾病,肝癌的病因、发生发展、复发、转移以及诊断和治疗都越来越引起人们的关注。
世界卫生组织统计数据表明:80%以上早期恶性肿瘤可得到有效控制。越早确诊,肿瘤的治愈率就越高。目前,甲胎蛋白是肝癌早期诊断唯一的金标准,定期检测甲胎蛋白可以起到预防肝癌的作用。同时,可以作为肝癌手术预后的指标,进行后期的跟踪。
肝癌分原发性和继发性两种,其中继发性肝癌是由于其它脏器的肿瘤经血液、淋巴或直接侵袭到肝脏所致。原发性肝癌又可分为肝细胞型,胆管细胞型和混合型三种类型,其中绝大多数为肝细胞型(Hepatocellular carcinoma,HCC)。值得注意的是世界各地原发性肝癌发病率都有上升趋势,其中中国内地、东南亚及非洲是全球三个肝癌高发地区。据世界卫生组织统计,目前全球每年新发肝癌病例100万至150万例,每年有60万人死于肝癌(中国各占45%左右)。
在我国,肝癌已经成为仅次于胃癌的第二大癌症。作为一种高死亡率的疾病,肝癌的病因、发生发展、复发、转移以及诊断和治疗都越来越引起人们的关注。肝癌的症状在早期很不明显,甚至患者在患病后较长时间毫无感觉,待病情发展到一定程度才会逐步产生一些肝区疼痛、食欲下降、疲乏无力、日渐消瘦等症状,到晚期则会有黄疸、腹水、呕血、昏迷等表现。肝癌病人的上腹部常可摸到巨大的肿块,但此时已到中晚期,甚至已向肺部等处转移。肝癌总的病程大约2年半时间,其中2年时间都是在没有症状的早期阶段,一旦出现症状就只有半年的存活时间。所以早期诊断成为防治肝癌最有效的手段之一。
临床诊断肿瘤的方法可分为物理学、组织细胞学及生物化学三大类。常规的物理诊断如X光、CT、核磁共振、B超、红外扫描等只能发现直径1-2cm以上的肿块,而一个肿瘤倍增至如此大小约需5年甚至更长的时间。细胞病理学的检查需在物理学检查发现的基础上,通过手术取得标本进行检验。所以物理诊断和组织细胞学诊断往往只能发现中晚期病例,难以达到早期发现的目的。生物化学方法是检测肿瘤生长极其复杂的多病因过程的多种基因或/和蛋白等分子标志,该方法对肿瘤的早期诊断、观察评价治疗效果及判断预后具有极大意义。
目前在大中型医院中,肿瘤因子的检测多是以化学发光免疫检测方法为主,该方法速度快、结果准确,但缺点是费用高,必须配备专门的大型检测仪器且检测试剂多为国外产品。而我国的医疗资源分布严重不均衡,广大农村及中西部欠发达地区医疗器械及人员严重不足,大型专门的检测仪器更是缺乏。由于缺医少药,很多疾病得不到有效的诊断和治疗,特别是癌症等疾病往往确诊时已到了晚期,严重影响了这些地区人民的生活质量。刚刚出台的新医保政策中着重强调了要改善农村医疗条件,提高农民健康水平。另外,随着经济的发展及生活水平的提高,人们对自身的健康越来越重视,定期进行身体检查已经成为趋势。因此,开发费用低廉、操作简便的检测仪器成为迫切需要。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种甲胎蛋白检测试剂盒,本发明提供的甲胎蛋白检测试剂盒具有较高的灵敏度和准确度,用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。
本发明提供了一种甲胎蛋白抗原的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生。
本发明提供了一种甲胎蛋白检测试剂盒,包括:包被液、由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。
其中,所述包被液为pH 9.6碳酸盐缓冲液。
其中,所述封闭液为10%小牛血清。
其中,所述洗涤液为0.10mol/L pH 7.6磷酸盐缓冲溶液。
其中,所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本发明获得了保藏编号为CGMCC No.13808的AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株,其产生的抗体可以用于检测AFP抗原,具有较高的灵敏度和准确度,用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。
实验结果表明,本发明提供的试剂盒的最低检测限为2.108ng/mL,准确度和精密度的变异系数均小于10%。
附图说明
图1为本发明提供的检测标准曲线。
保藏说明
AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.13808,保藏日期为2017年3月10日,地址:北京是朝阳区北辰西路1号院3号,邮编:100101。
具体实施方式
实施例1单克隆抗体制备及特性分析
1材料和方法
1.1动物:7~8周龄雌性BALB/c小鼠,购自河北省实验动物中心。
1.2主要试剂和材料:小鼠SP2/0骨髓瘤细胞由本研究室保存。HAT、HT、PEG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。DMEM培养基、细胞培养板为GIBCO公司产品。HRP标记羊抗小鼠IgG为华美生物工程公司产品。所用化学试剂均为国产分析纯。
1.3AFP抗原:Sigma公司产品,纯度>99%。
1.4动物免疫:用三只BALB/c小鼠,首次基础免疫用弗氏完全佐剂与等体积AFP溶液(AFP用量为25μg/只小鼠)混合乳化后颈背部多点注射,7天后作第2次基础免疫,用弗氏完全佐剂与首次相同量抗原乳化后颈背部多点注射,15天后ELISA法测小鼠血清抗AFP效价,选一只最佳免疫小鼠融合前三天尾静脉注射抗原液10μg作加强免疫。
1.5杂交瘤制备和筛选:取对数生长期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按常规方法用50%PEG进行融合。用间接ELISA检测培养上清,选择强阳性克隆,用有限稀释法连续克隆化3次,将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。
1.6单克隆抗体的大量制备
采用小鼠体内诱生腹水的方法,取健康的BALB/c雌性小鼠,每只小鼠体内注射石蜡油0.5mL,备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下,1000r/min离心5min,用不完全培养液悬浮细胞,将细胞个数调整到106/mL,每只小鼠腹腔注射1mL的阳性克隆杂交瘤细胞,7-9天取腹水,-20℃分装保存。
1.7单克隆抗体腹水纯化
采用辛酸-硫酸铵盐析法进行单克隆抗体的纯化,该方法是一个经典方法,辛酸在偏酸性的条件下能够将免疫球蛋白(IgG)以外的蛋白质都沉淀下来,上清中只剩下IgG。硫酸铵主要也是用于除去非IgG的杂蛋白。该种方法IgG的回收率能达到90%以上。
具体操作如下:脱脂,取出的腹水经4℃放置12h后,10000r/min离心15min,去表面脂肪层取上清;取腹水5mL,加入0.06mol/L pH4.0NaAc-HAc缓冲液10mL,搅拌均匀;在室温下调pH值至4.8;向调好pH值的腹水加入165uL正辛酸,边搅拌边加入,搅拌30min,4℃静置2h以上;将腹水溶液4℃,6000r/min离心30min,取上清,调pH值至7.2;向上清溶液中边搅拌边加入等量饱和硫酸铵溶液,边搅拌边加入,至硫酸铵溶液终浓度为50%饱和度,搅拌20min后,4℃6000r/min离心30min,取沉淀,将沉淀溶于5.5mL 0.01mol/LpH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中;将沉淀悬浮液装入透析袋中,4℃条件下,用0.01mol/LpH7.2PBS透析过夜(至少更换2次透析液),取出透析好的溶液-20℃分装保存。
1.8抗体(血清或腹水)效价测定
采用间接ELISA法进行抗体(血清或腹水)效价测定,具体步骤如下:
(1)抗原包被,采用0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液作为包被液,包被抗原浓度为5ug/mL,96孔酶标板每孔100uL,4℃过夜;
(2)封闭,将包被好的酶标板取出,待其恢复至室温后,倾去包被液,每孔加洗液300uL,每次震荡lmin,洗3-4次,拍干;每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡lmin,拍干;
(3)加待测抗体(血清或腹水)样品,用缓冲溶液将待测血清溶液以200倍开始倍比稀释,每孔加入100uL,并且设置空白对照孔(PBS)和阴性孔(阴性血清),37℃放置45min;洗涤,洗涤3次,每次震荡lmin,拍干;
(4)加酶标二抗,每孔加入100uL的l:10000稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG,37℃放置30min;洗涤,洗涤3次,每次震荡1min,拍干;
(5)显色,每孔加底物显色液100uL,37℃保温避光反应15min;
(6)终止反应;每孔加入50uL终止液;
(7)测定OD450nm值:用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。阴性对照孔OD450nm值为N,阳性为P,以P/N≧2.1,为阳性结果。
1.9单克隆抗体蛋白含量测定
采用考马斯亮兰法测定偶联物蛋白浓度。具体步骤如下:首先制作标准曲线,配好六种浓度蛋白标准液,与考马斯亮兰G250试剂反应后在595nm波长下进行比色测定,然后以蛋白标准液含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,标准液配制及加液见表1;
纯化抗体蛋白含量测定,取0.1mL待测样品加入0.9mL PBS缓冲液,加5mL考马斯亮兰G250试剂,混匀后放置5分钟,在595nm波长下进行比色测定,记录吸光度值;结果处理,根据公式计算相应蛋白含量,乘以相应稀释倍数即为所测蛋白浓度。
表1 蛋白浓度测定方案
将AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.13808。
2结果
经过3次亚克隆和两个月的传代,最后建立了稳定分泌抗AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株2株,编号分别为:2C6和3D2。
对2株抗AFP单克隆抗体细胞株分别进行复苏和腹水制备,均获得超过10mL的腹水。经过辛酸-硫酸铵盐析法纯化,蛋白含量测定后,均获得了超过10mg的抗体。将抗体小剂量分装,-20℃保存,以备后续使用。
2.2抗体效价
将各株经过纯化的抗体用磷酸盐缓冲液稀释到蛋白浓度为1mg/mL,用间接ELISA进行效价测定,结果见表2。
表2 AFP小鼠单克隆抗体的效价
将AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.13808。
实施例2双抗夹心法ELISA检测试剂盒研制
2.1生物素标记抗体
原理:SuLfo-NHS-LC-Biotin含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,能够在pH7-9的磷酸缓冲液中与抗体分子中赖氨酸的自由氨基反应,将生物素分子连接在抗体分子上,形成稳定的生物素标记抗体复合物。
操作步骤:将1mg SuLfo-NHS-LC-Biotin溶于360uL超纯水中。取1mg AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2产生的抗体溶解于500uL pH 7.4磷酸缓冲液。将两种溶液混合,室温下反应1小时。反应完毕后,将反应液装入透析袋中,放入0.1M/L pH7.4磷酸缓冲液中,4℃透析过夜。
2.2ELISA检测过程
包被,将AFP抗原以5ug/mL的浓度进行包被。封闭,每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡lmin,拍干;加生物素标记抗体,每孔加入100uL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照),37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡lmin,拍干;加酶标亲和素,每孔加入100uL的l:50000稀释的HRP酶标记的亲和素,37℃放置30min;洗涤,洗涤3次,每次震荡1min,拍干;显色,每孔加底物显色液100uL,37℃保温避光反应15min;终止反应,每孔加入50uL终止液,终止反应;测定OD450nm值,用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。根据OD值确定最适的包被浓度。
2.3检测试剂盒特性分析
2.3.1标准曲线绘制
定量分析的主要特征就是建立计量-反应曲线,通过已知浓度的标准物质和相应的反应量建立计量-反应关系。然后,通过待测样品的反应量计算出待测样品的浓度。
具体过程为,以5ug/mL浓度包被AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2产生的抗体,封闭,每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡lmin,拍干;加入用AFP标准溶液配制的系列浓度抗原液,即0ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;加生物素标记抗体,每孔加入100uL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照),37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;加酶标亲和素,每孔加入100uL的l:10000稀释的HRP酶标记的亲和素,37℃放置30min;洗涤,洗涤3次,每次震荡1min,拍干;显色,每孔加底物显色液100uL,37℃保温避光反应15min;终止反应,每孔加入50uL终止液,终止反应;测定OD450nm值,用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。
重复该实验4次,取平均值。将所得数据利用统计学软件进行线性分析。
2.3.2检测限分析
检测限(limit ofdetection),也称分析灵敏度(analytical sensitivity)是指检测方法可检测出的最低被测量浓度。
具体过程为,以5ug/mL浓度包被AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2产生的抗体,封闭,每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡lmin,拍干;加入空白溶液(添加了保护剂的洗液),37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡1min,拍干;加生物素标记抗体,每孔加入100uL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照),37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡1min,拍干;加酶标亲和素,每孔加入100uL的l:10000稀释的HRP酶标记的亲和素,37℃放置30min;洗涤,洗涤3次,每次震荡1min,拍干;显色、终止反应、测定OD450nm值操作同2.3.1。
测定20个空白溶液的OD值,计算空白对照OD值的平均数(mean)和标准差(SD),以空白对照的mean+2SD为判定标准,根据标准曲线计算该系统的最低检测限,即灵敏度。
2.3.3准确度分析
准确度通常是指测量结果趋近于真值的程度。目前测定准确度的方法主要有三种,分别是与国家(国际)标准品的对比研究;回收率实验研究和方法学对比研究。本项目采用回收率实验研究来确定检测试剂盒的准确度。
具体过程为,以5ug/mL浓度包被AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2产生的抗体,封闭,每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;以一份健康体检血清样品作为基础溶液,分成4份,分别加入相同体积不同浓度的AFP标准品,使得最终的添加浓度分别为5、20、100ng/mL。37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;后续步骤同2.3.2。
重复该实验3次,取平均值。
2.3.4精密度分析
精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结果的能力的指标,包括批内和批间不精密度,通常用重复多次样本测量结果的变异系数(CV%)表示。
批内精密度是众多种类精密度中最基本的一个,它是在严格的相似条件下,所得到的最佳的精密度。测定结果的变异系数(CV%)应不高于10.0%。
批间精密度是指在同一实验室,由同一(组)操作员在同一仪器上,使用同一方法和同种、同一批号试剂,在一段时间内(一般为一个月或20个工作日)对同一测试样品(常用质控品)测量结果的精密度。测定结果的变异系数(CV%)应不高于15.0%。
具体过程为,以5ug/mL浓度包被AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2产生的抗体,封闭,每孔加200uL 10%小牛血清作为封闭液,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;以一份健康体检血清样品作为基础溶液,分成4份,分别加入相同体积不同浓度的AFP标准品,37℃1h;洗涤,恢复至室温,倾去封闭液,洗涤三次,每次震荡l min,拍干;后续步骤同1.2.3.2。
重复该实验3次,取平均值。
批内精密度测定过程为:对四个浓度(5、20、50、100ng/mL)的样品,用同一批次的试剂盒进行20次的重复检测。计算平均值和变异系数。
批间精密度测定过程为:选取20和100ng/mL两个浓度的样品,每天做2个批次的测试,每批测试时,对同一样品作双份测量,共做20天。评估结束时共有40对,即80个测试结果。根据公式计算出批间精密度。
2.3结果
2.3.1生物素标记抗体检测
在上述条件下对抗体标记生物素的效果进行检测,结果见表3,从表中可以看出,未标记的OD450nm值都很低,而经过标记的OD450nm值都高,表明标记成功。
表3 生物素标记检测结果
2.3.2标准曲线绘制
用标准稀释液进行倍比稀释AFP标准品为0ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL,采用前述建立的双抗体夹心ELISA法重复检测4次,结果表明其具有良好线性关系的检测区间为3.125~200ng/mL。标准曲线见图1,图1为本发明提供的额检测标准曲线,检测曲线的回归方程是:y=0.26517*x-0.357,R2=0.991。
2.3.3检测限
根据标准的方法,检测了20个空白溶液的OD值,计算空白对照OD值的平均数(mean)和标准差(SD)。其中平均值为0.096,标准差为0.0127,则以空白对照的mean+2SD为判定标准,即以OD值0.122,带入到标准曲线中,根据标准曲线计算该系统的最低检测限为2.108ng/mL,即灵敏度为2.108ng/mL。
2.3.4准确度
样品中添加不同浓度的AFP标准品,进行回收实验。结果见表4。
表4 准确度结果(添加回收实验)
2.3.5批内精密度
选取一批试剂盒进行批内精密度检测,结果见下表,各个浓度的变异系数(CV%)都小于10%,表明试剂盒的批内精密度满足检测要求。
表5 批内精密度结果
2.3.6批间精密度
选取两批试剂盒进行批间精密度的检测,结果见下表,两个浓度的变异系数(CV%)都小于10%,表明试剂盒的批内精密度满足检测要求。
表6 批间精密度结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.甲胎蛋白抗原的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生。
2.一种甲胎蛋白检测试剂盒,包括:包被液、由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。
3.根据权利要求2所述的甲胎蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述包被液为0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液。
4.根据权利要求2所述的甲胎蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述封闭液为10%小牛血清。
5.根据权利要求2所述的甲胎蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述洗涤液为0.10mol/LpH 7.6磷酸盐缓冲溶液。
6.根据权利要求2所述的甲胎蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
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