CN102321167A - 甲胎蛋白抗原表位肽及核酸及制法、重组载体及宿主细胞、杂交瘤细胞及单抗和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲胎蛋白的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或者对(1)或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变的氨基酸序列；还公开了编码所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列及其制法，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，单抗杂交瘤细胞及单抗，以及包括前述抗原表位肽和/或单抗的甲胎蛋白检测的试剂盒。本发明的甲胎蛋白的抗原表位肽特异性好，由其得到的单抗制成甲胎蛋白检测的试剂盒灵敏度高。

Description

甲胎蛋白抗原表位肽及核酸及制法、重组载体及宿主细胞、杂交瘤细胞及单抗和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种抗原表位肽，编码所述抗原表位肽的核苷酸序列以及所述核苷酸序列的制备方法，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，针对所述抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体，以及包括上述单克隆抗体的蛋白检测的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种甲胎蛋白的抗原表位肽，编码所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列以及所述核苷酸序列的制备方法，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，针对所述甲胎蛋白的抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体，以及包括上述单克隆抗体的甲胎蛋白检测的试剂盒。

背景技术

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是肝细胞癌的特征性蛋白，在体内可运载不饱和脂肪酸至肝癌细胞供其吸收利用，并可抑制T淋巴细胞增殖而保护肿瘤细胞逃脱免疫监视，对维持肝肿瘤细胞生长增殖起着重要作用。甲胎蛋白在分泌释放之前可停留在肝癌细胞表面，成为肝癌细胞的重要标志物，这一特性是利用抗甲胎蛋白抗体进行肿瘤诊断和导向治疗的物质基础。

但是目前用于检测肝癌的甲胎蛋白的抗原表位肽，免疫原性弱、特异性差，因此亟需一种免疫原性强、特异性好的甲胎蛋白的抗原表位肽。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有的甲胎蛋白的抗原表位肽免疫原性弱、特异性差的缺点，提供一种免疫原性强、特异性好的甲胎蛋白的抗原表位肽。

本发明的第二个目的是提供编码所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列及其制备方法。

本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。

本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供针对所述抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体。

本发明的第六个目的是提供包括所述甲胎蛋白的抗原表位肽和/或单克隆抗体的甲胎蛋白检测的试剂盒。

本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，筛选得到本发明具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的甲胎蛋白的抗原表位肽。并且本发明的发明人意外地发现，所得甲胎蛋白的抗原表位肽具有很好的特异性并且免疫原性强。

本发明提供了一种甲胎蛋白的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者

(2)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或者

(3)对(1)或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了针对所述抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体。

本发明还提供了包括所述甲胎蛋白的抗原表位肽和/或单克隆抗体的甲胎蛋白检测的试剂盒。

本发明提供的甲胎蛋白的抗原表位肽具有免疫原性强、特异性好的的优点。包括针对所述抗原表位肽的单克隆抗体的试剂盒，对甲胎蛋白的检测限低，灵敏度高，最低检测限达0.5ng/ml。

本发明获得的针对所述抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞分类命名为杂交瘤细胞3D5，于2011年8月31日保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5193。本发明获得的针对所述抗原表位肽的单克隆抗体杂交瘤细胞分类命名杂交瘤细胞7B11，于2011年8月31日保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5194。

附图说明

图1为大肠杆菌BL21所表达的抗原表位肽SDS-PAGE电泳图片，1为AFP-1抗原表位，2为AFP-2抗原表位肽；

图2为单克隆抗体SDS-PAGE电泳图片，1为纯化AFP-1单抗，2为纯化AFP-2单抗；

图3为AFP标准品曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种甲胎蛋白的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列为(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或者对(1)、或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变的氨基酸序列。

本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：

1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；

2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；

3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；

4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和Pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在甲胎蛋白的抗原表位肽上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。

本发明提供的甲胎蛋白的抗原表位肽还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的甲胎蛋白的抗原表位肽存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

优选情况下，所述甲胎蛋白的抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的甲胎蛋白的抗原表位肽活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述甲胎蛋白的抗原表位肽活性一致的氨基酸序列。

优选情况下，本发明所述核苷酸序列为

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，或者

(3)对SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变。所述核苷酸序列更优选为SEQ ID NO：2和SEQID NO：4所示的核苷酸序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。例如，制备所述的编码甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列的方法包括：

扩增SEQ ID NO：2(AFP-1)所示的核苷酸序列所用引物：

正向引物5’-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3’

扩增SEQ ID NO：4(AFP-2)所示的核苷酸序列所用引物：

正向引物5’-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3’

使用以上引物对并以RT-PCR体外扩增甲胎蛋白基因片段为模板，合成编码甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。

在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域己知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选所述空载体为lac启动子的载体，更优选自由pET-28a(+)、pKK223-3、pEX1/2/3和pUC18所组成的组中。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamH I、EcoR I等，对于pET28a，可用Ndel、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII等，对于pET28b可用EcoRI、Nde I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。

可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化甲胎蛋白的抗原表位肽。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化甲胎蛋白的抗原表位肽。对于分离纯化所得的甲胎蛋白的抗原表位肽的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。

本发明还提供了一种单克隆抗体杂交瘤细胞，其中，所述单克隆抗体杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No.5193或CGMCC No.5194；一种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体是针对权利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.5193或CGMCC No.5194的杂交瘤产生；以及一种包括本发明所述的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或单克隆抗体的试剂盒。可以用本领域常用的方法制备甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉，只要该方法能够得到甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉，并且不破坏甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的甲胎蛋白抗原表位肽的溶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的甲胎蛋白抗原表位肽的溶液；或者使用真空减压干燥器等设备。

本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于测定甲胎蛋白的试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或单克隆抗体可以是液体形式或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，一般可以含有本发明的试剂盒优选含有(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：NaHCO₃1.59克、NaHCO₃2.93克，加蒸馏水至1000ml；(2)洗涤缓冲液(PH7.4磷酸缓冲液)：0.15M即KH₂PO₄0.2克、Na₂HPO₄·12H2O 2.9克、NaCl 8.0克、KCl 0.2克、Tween-200.05％0.5ml，加蒸馏水至1000ml；(3)封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0.2～1.0克，0.5～1.0克酪蛋白，加洗涤缓冲液至100ml。(4)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克，加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。(5)终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。(6)底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸)：0.2M Na₂HPO₄(28.4克/L)25.7ml、0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸馏水50ml。(7)TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml、底物缓冲液(PH5.5)10ml、0.75％H₂O₂32μl；(8)抗原、抗体和酶标记抗体。(9)正常人血清和阳性对照血清。

本发明液体形式的试剂盒组分可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。

适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以是动物体(包括人体)健康状态下以及病理状态下的血液自然凝固后析出的血清、加入肝素的血浆。适于使用本发明所述试剂盒的待测标本还可以是肿瘤组织活检样品。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。

制备实施例1

A)编码甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列的获得

A-1)RT-PCR体外扩增cDNA基因组

取液氮保存的人肝癌细胞hepG2(购自美国标准生物品收藏中心ATCC)100mg，提取总RNA；RT-PCR反应条件：50℃逆转录30min，94℃变性2min，94℃45s，58℃30s，72℃45s，循环33次，72℃延伸7min。PCR大量扩增目的基因cDNA片段，反应条件：94℃2min，94℃30s，61℃30s，72℃30s循环33次，72℃延伸7min。

A-2)编码抗原表位肽的核苷酸序列的获得

由上海生工生物技术有限公司合成以下序列：

AFP-1：

正向引物5’-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3’

AFP-2：

正向引物5’-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3’

以步骤A-1)RT-PCR体外扩增cDNA基因组为模板，用AFP-1和AFP-2的两对序列为引物，PCR合成目的DNA片段即编码抗原表位肽的核苷酸序列。PCR的反应条件为：94℃2min，94℃30s，61℃30s，72℃30s循环33次，72℃延伸7min。

A-3)编码甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列的质粒的获得和扩增取步骤2)得到的2段编码甲胎蛋白的抗原表位肽DNA用Nco I、XhoI双酶切37℃酶切1h，同时以相同条件酶切去磷酸化的载体pET-28a(+)，65℃水浴放置10min灭活内切酶后将两者用纽英伦生物技术有限公司(NEB)的T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α。涂布于含氨苄青霉素的LB平板，获取重组子测序并分析出编码甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列(SEQ IDNos：2和4)。具体操作如下：

挑取在LB固体培养基上37℃培养16h的大肠杆菌DH5α的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16h。取1ml所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以200-250rpm的转速剧烈振荡培养2.5h。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞大肠杆菌DH5α。

取200μl上述感受态的大肠杆菌DH5α置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的连接产物溶液轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热击120秒，迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的氨苄青霉素抗生素抗性基因(Amp^r)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含氨苄青霉素的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20h。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pET-28a(+)重组质粒已经转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取克隆在LB中37℃200rpm培养20h，提取重组质粒，取少部分用Nco I、XhoI双酶切，经电泳初步鉴定后，将重组质粒送至宝生物公司(TaKaRa)进行测序。分析出得到两段分别编码两个甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列(SEQ ID Nos：2和4)。即得到两种重组质粒，其携带的目的基因分别为编码甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列SEQ ID Nos：2和4。

B)重组载体对表达宿主细胞的转化以及所得重组宿主细胞的培养

提取步骤A)获得的重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将上述菌株挑单菌落在LB培养基(蛋白胨：10g/L、酵母粉：5g/L和NaCl：10g/L溶剂为蒸馏水在121℃20min灭菌)中37℃下培养至生长对数生长期(10⁶细胞/毫升)，然后以所得种子液(LB培养基和增殖的大肠杆菌)和新鲜LB培养基体积比为1∶100的比例，接种于新鲜LB培养基中，37℃培养至600nm波长下吸光度(OD)1.0，加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，4小时后收获菌液。

C)多肽产物的分离提纯

将步骤B)得到的发酵液在10000rpm下离心10min，收集重组宿主细胞沉淀。弃去上清，将所得重组宿主细胞重悬于等体积的20mmol/L的pH为8.0的Bis-Tris缓冲液中。用高压匀浆机破碎重悬的细胞，在10000rpm下离心15min，收集上清粗酶液，弃取细胞碎片沉淀。

将上述所得粗酶液用孔径为0.22μm滤膜过滤后，所得滤液在美国通用电子公司(GE公司)的组氨酸标记亲和层析柱上进行亲和层析。其中，上样缓冲液为20mmol/L的pH为8.0的Bis-Tris缓冲液。在流过两个柱体积的上样缓冲液后，使用洗脱缓冲液，其为含有1mol/L NaCl的20mmol/L的pH为6.0的Bis-Tris缓冲液。当8％的洗脱缓冲液洗柱后以25％的浓度洗脱得到目标多肽开始收集多肽，收集实时监测到的多肽单峰结束(其中在洗脱过程中所述的8％和25％是指所述洗脱缓冲液占洗脱缓冲液和上样缓冲液之和的体积百分数)。

向收集到的多肽溶液中加入40％(W/V)硫酸铵沉淀，然后在10000rpm的转速下离心10分钟。收集多肽沉淀，并用0.1mol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶。所得溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，所得滤液再用葡聚糖凝胶G-25层析柱(Sephadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液是0.1mol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液。在用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液(即上述用0.1mol/L的pH为6.0的Bis-Tris缓冲液复溶的多肽溶液)的流速为5ml/min，然后用脱盐缓冲液以15ml/min的流速洗脱2个柱体积。收集洗脱下的液体共500毫升。

所收集的液体在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得多肽的量为10克。冻干多肽在冷冻条件下密封保存。

采用《蛋白质电泳试验技术》(郭尧君，132-145页，科学出版社，1999年)记载的SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的两种多肽的分子量分别为10.6KD、8.2KD，并且根据《生物化学》(王镜岩等，高等教育出版社，2002，见168页)记载的多肽一级结构的测定方法(分肽段测定)，测得本实施例的多肽有93、71个氨基酸残基(参见SEQ ID NO：1和35所示的氨基酸序列)，与由SEQ ID NO：2和4所示的核苷酸序列编码的多肽结果一致。

综上，本发明的发明人得到了一种新的两种甲胎蛋白的抗原表位肽，其来源于甲胎蛋白，分子量分别为10.6KD、8.2KD，分别具有SEQ ID NO：1和3所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO：2和4所示的核苷酸序列。其中，本领域技术人员通过阅读本实施例，可以知晓本发明的核苷酸序列例如SEQ ID NO：2和4，并可以通过化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有该核苷酸序列的核酸后，无需实施本实施例步骤A-1)和A-2)，而是在得到人工合成的SEQ ID NO：2和4所示的核苷酸序列后，直接实施本实施例步骤A-3)以后的步骤重复本实施例；或者可以在得到步骤B)的表达甲胎蛋白的抗原表位肽的重组宿主细胞重复本实施例；或者直接按照SEQ ID NO：1和3合成甲胎蛋白的抗原表位肽的氨基酸序列。

D)用本发明的甲胎蛋白的抗原表位肽免疫动物

选用6周龄、雌性BALB/c小鼠。首次免疫，50μg/只的抗原(两种分别)加等体积完全福氏佐剂，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25μg/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25μg/只的抗原加等体积不完全福氏佐剂，皮下注射，7-10天后，ELISA检测免疫鼠血清效价，效价达到1∶10W时即可准备做细胞融合。如果效价比较低，则2周后继续进行第四次免疫，免疫剂量及方式同第三次免疫一致，直至尾血效价检测达到1∶10W。细胞融合前3天，再用25μg抗原腹腔注射以加强免疫。

E)杂交瘤细胞的制备

取分离的步骤D)两种免疫小鼠的脾脏细胞(1×10⁸个细胞)分别与购自骨髓瘤细胞株Sp2/0(1×10⁷个细胞)，在50％聚乙二醇1450(PEG1450)作用下进行常规融合。融合细胞用HAT培养基作选择性培养，7d后改用HT培养基，14d后改用DMEM培养基培养(20％小牛血清)。采用间接ELISA方法，用抗原(包被浓度为200ng/ml)对融合细胞进行阳性筛选，阳性细胞再进行亚克隆，经过3～5次亚克隆直到达到100％的阳性率。分别得到两种分泌单克隆抗体杂交瘤细胞。

分泌抗AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株得到建立。2个抗原表位肽分别免疫2只BALB/c小鼠，各自进行细胞融合。每个次细胞融合用7块96孔板，平均每孔有1～2株融合细胞生长，融合率为100％。经过对阳性杂交瘤细胞株进行4～5次有限稀释克隆，2种抗原分别筛选到1株单克隆抗体杂交瘤细胞株(3D5和7B11)，这2株抗体除了能和相应的免疫抗原酶联反应呈阳性、还可以与商购AFP抗原酶联反应呈阳性。

F)单克隆抗体的纯化

在预先1周注射石蜡油(0.5ml/只)致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞数为10⁶，7～10天后采集腹水并离心得上清。腹水上清按1∶10稀释于pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，并以0.5ml/min上样于经PBS平衡的HisTrap Protein G亲和层析柱中。用PBS洗脱杂蛋白，再用甘氨酸缓冲液(pH 2.9)洗脱，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定两种单克隆抗体纯度达99.9％，分子量分别为150KD。单一的独立的带无拖尾。得到纯化抗体后，用外购AFP抗原(上海江莱生物科技有限公司)作为包被抗原，ELISA检测抗体效价，两种杂交细胞瘤的抗体的效价分别为：1∶10W、1∶16W。

G)单克隆抗体的标酶

利用改良过碘酸钠氧化法进行抗体标酶。具体地，首先称取5mg辣根过氧化物酶(HRP酶)，溶于0.5ml三蒸水中，加入新近配制的0.06M过碘酸钠溶液0.5ml，混匀后置4℃，30min；加入乙二醇-NaCl溶液(称取22gNaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml，室温，30min；加入步骤F)得到的纯化的单克隆抗体，混匀，调pH值至9.0，放4℃，过夜；加入硼氢化钠，混匀，置4℃，2h；将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃，30min；离心后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜。包被AFP抗原标准品，直接ELISA法测定酶标抗体效价。

H)ELISA法标酶抗体配对及优化

双抗夹心ELISA检测方案：用0.01mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释至5μg/ml包被酶标板，4℃过夜；用PBS/T20洗板3次，每次3min；用含5％小牛血清的PBS/T20封闭，37℃孵育1h，洗板；加入倍比稀释的AFP溶液，37℃孵育45min，洗板；加入HRP-单克隆抗体，37℃，30min，洗板；加入TMB显色液，37℃避光反应15min后，加人终止液；读取波长为450nm时的OD值。

酶标抗体酶标后，两种酶标抗体的效价为1∶1.6K、1∶3K。

通过ELISA法标酶抗体配对成功后的抗体对为：AFP-1抗原表位肽的3D5单株所制备的单抗作为包被抗体、AFP-2抗原表位肽的7B11单株所制备的单抗作为检测抗体，本发明筛选到的2株单克隆抗体杂交瘤细胞，其产生的单抗利用双抗夹心ELISA检测病人血样，可以达到测量范围为0.5-500ng/ml。

制备实施例2

本发明的试剂盒包括以下成分：

(1)包被缓冲液(pH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：NaHCO₃1.59克、NaHCO₃2.93克，加蒸馏水至1000ml；

(2)洗涤缓冲液(PH7.4磷酸缓冲液)：0.15M即KH₂PO₄0.2克、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克、NaCl 8.0克、KCl 0.2克、Tween-200.05％0.5ml，加蒸馏水至1000ml；

(3)封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0.2～1.0克，0.5～1.0克酪蛋白，加洗涤缓冲液至100ml。

(4)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克，加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

(5)终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

(6)底物缓冲液(PH5.0磷酸柠檬酸)：0.2MNa₂HPO₄(28.4克/L)25.7ml、0.1M柠檬酸(19.2克/L)24.3ml，加蒸馏水50ml。

(7)TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml、底物缓冲液(PH5.5)10ml、0.75％H₂O₂32μl；

(8)抗原、抗体和酶标记抗体。

(9)正常人血清和阳性对照血清。

本实施例试剂盒使用步骤：

1)包被：用0.01mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将单克隆抗体(3D5单株纯化的抗体)稀释至5μg/ml包被酶标板，每孔包被100μl，4℃过夜；

2)用PBS/T20洗板3次，每次3min；用含5％小牛血清的PBS/T20封闭150μl，37℃孵育1h，用PBS/T20洗板1次；

3)加入倍比稀释的AFP溶液(AFP标准品外购自上海江莱生物科技有限公司，浓度分别为500ng/ml、200ng/ml、80ng/ml、32ng/ml、12ng/ml、5ng/ml、0ng/ml，检测阳性样本时直接加入样品或者稀释的样品即可)100μl，37℃孵育45min，洗板3次，每次3min；

4)加入已稀释好的HRP-单克隆抗体(7B11单株纯化的抗体经过HRP酶标)100μl，37℃，30min，用PBS/T20洗板5次，每次3min；

5)加入TMB显色液100μl，37℃避光反应15min后，加人终止液50μl；读取波长为450nm时的OD值。

标准品曲线结果如图3和下表1所示：

表1

最低检测限(分析灵敏度)：

0.5ng/ml。

测试20管“0”浓度校准品，计算酶标值，平均值(X)标准差(SD)。将X+2SD带入标准曲线计算的浓度值作为最低检测限。

特异性：

测试不同浓度前列腺特异性抗原(PSA)和癌胚抗原(CEA)样本，无交叉反应(结果见表2)。

表2

测量范围为0.5-500ng/ml：

样本浓度低于0.5ng/ml时，报告为＜0.5ng/ml。样本浓度高于500ng/ml时报告为＞500ng/ml。

精密度：

测试试剂盒配制的已知样本(2个浓度分别为：样本110ng/ml、样本2300ng/ml)每个样本测试检测10管，共测试3次，获得的分析内和分析间变异如下表3所示：

表3

从以上数据可以看出，本发明所获得的两株单克隆抗体可以达到最低检测限是0.5ng/ml，完全超越现有试剂盒的标准(50ng/ml)。满足大量制备抗体，并进行试剂盒研发及生产的要求。由于检测限低，可以更早诊断出肝癌等癌症患者的病情，为及早开始治疗赢得了时间。

Claims (13)

1.一种甲胎蛋白的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者

(2)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或者

对(1)或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

3.一种编码甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1或2所述的甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，或者

(3)对SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的甲胎蛋白抗原表位肽的功能不变。

5.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.一种制备权利要求3-5中任意一项所述的编码甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

扩增SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所用引物：

正向引物5’-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3’

扩增SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所用引物：

正向引物5’-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3’

反向引物5’-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3’

使用以上引物对并以RT-PCR体外扩增甲胎蛋白基因片段为模板，合成编码甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求3-5中任意一项所述的编码甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述空载体选自由pET-28a(+)、pKK223-3、pEX1/2/3和pUC18所组成的组中。

9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求7-8任意一项所述的重组载体。

10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。

11.一种单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No.5193或CGMCC No.5194。

12.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是针对权利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.5193或CGMCC No.5194的杂交瘤产生。

13.一种检测甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

权利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或权利要求12所述的单克隆抗体。

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